JPH102898A - 白血球の選択的調製方法及びポリメラーゼ連鎖反応用キット - Google Patents
白血球の選択的調製方法及びポリメラーゼ連鎖反応用キットInfo
- Publication number
- JPH102898A JPH102898A JP9056289A JP5628997A JPH102898A JP H102898 A JPH102898 A JP H102898A JP 9056289 A JP9056289 A JP 9056289A JP 5628997 A JP5628997 A JP 5628997A JP H102898 A JPH102898 A JP H102898A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- group
- carbon atoms
- target nucleic
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Abstract
(57)【要約】
塩化アンモニウムとカルボン酸又は金属カルボキシレー
トを含有する溶液で赤血球を溶解する工程及び残存する
白血球を洗浄する工程を含む一連の処理を全血試料に施
すことにより、白血球を赤血球から迅速且つ選択的に分
離することができる。得られた白血球細胞は容易に溶解
され、そしてポリメラーゼ連鎖反応に供することにより
標的核酸を増幅して検出することができる。この増幅法
を実施する上で有用な試験キットは、標識化プライマ
ー、ＰＣＲ試薬並びに試料調製用の塩化アンモニウム及
びカルボン酸又は金属カルボキシレートを含有する試薬
混合物を含む。
トを含有する溶液で赤血球を溶解する工程及び残存する
白血球を洗浄する工程を含む一連の処理を全血試料に施
すことにより、白血球を赤血球から迅速且つ選択的に分
離することができる。得られた白血球細胞は容易に溶解
され、そしてポリメラーゼ連鎖反応に供することにより
標的核酸を増幅して検出することができる。この増幅法
を実施する上で有用な試験キットは、標識化プライマ
ー、ＰＣＲ試薬並びに試料調製用の塩化アンモニウム及
びカルボン酸又は金属カルボキシレートを含有する試薬
混合物を含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、白血球を赤血球か
ら分離することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）のための全血試料を調製するための方法に関する。
本発明はまた、調製した白血球から単離された標的核酸
を増幅するための方法、さらには該方法を実施する上で
有用なキットにも関する。
ら分離することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）のための全血試料を調製するための方法に関する。
本発明はまた、調製した白血球から単離された標的核酸
を増幅するための方法、さらには該方法を実施する上で
有用なキットにも関する。
【０００２】
【従来の技術】最近の２０年間にわたり、ＰＣＲのよう
な増幅技法においてプローブを使用する非常に巧妙なハ
イブリダイゼーションアッセイの開発をはじめとし、核
酸の量の検出する技術が急速に進歩してきた。研究者で
あれば、ヒトや動物の被検体の疾患や遺伝的特徴を検出
するこれらの技術の価値を認識することは容易である。
このような技術におけるプローブやプライマーの使用
は、相補性の概念に基づくものである。すなわち、２本
の核酸鎖が相補的なヌクレオチド（ヌクレオチド対とし
ても知られている）の間の水素結合により結合する概念
である。
な増幅技法においてプローブを使用する非常に巧妙なハ
イブリダイゼーションアッセイの開発をはじめとし、核
酸の量の検出する技術が急速に進歩してきた。研究者で
あれば、ヒトや動物の被検体の疾患や遺伝的特徴を検出
するこれらの技術の価値を認識することは容易である。
このような技術におけるプローブやプライマーの使用
は、相補性の概念に基づくものである。すなわち、２本
の核酸鎖が相補的なヌクレオチド（ヌクレオチド対とし
ても知られている）の間の水素結合により結合する概念
である。
【０００３】当該技術分野ではＰＣＲが著しく進歩した
おかげで、極微量の標的核酸を検出することが可能であ
る。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第４，
６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８
３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，９６５，
１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されているが、この
分野では文献の数は急速に増加している。詳細に触れる
つもりはないが、ＰＣＲは、重合剤（例、ＤＮＡポリメ
ラーゼ）及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在
下、標的核酸（「鋳型」とみなされる）の鎖にプライマ
ーを適当な条件下でハイブリダイズさせる工程を含むも
のである。その結果、鋳型に沿ったプライマー伸長生成
物、すなわち、その鋳型に相補的であるヌクレオチドが
付加した生成物が得られる。
おかげで、極微量の標的核酸を検出することが可能であ
る。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第４，
６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８
３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，９６５，
１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されているが、この
分野では文献の数は急速に増加している。詳細に触れる
つもりはないが、ＰＣＲは、重合剤（例、ＤＮＡポリメ
ラーゼ）及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在
下、標的核酸（「鋳型」とみなされる）の鎖にプライマ
ーを適当な条件下でハイブリダイズさせる工程を含むも
のである。その結果、鋳型に沿ったプライマー伸長生成
物、すなわち、その鋳型に相補的であるヌクレオチドが
付加した生成物が得られる。
【０００４】プライマー伸長生成物を変性させ、１コピ
ーの鋳型を調製した後、プライミング、伸長及び変性の
周回を所望の回数遂行することにより、標的核酸と同じ
配列を有する核酸が指数的に増加して得られる。実際
は、標的核酸の検出が容易となるように多数回の複製
（又は「増幅」）が行われる。
ーの鋳型を調製した後、プライミング、伸長及び変性の
周回を所望の回数遂行することにより、標的核酸と同じ
配列を有する核酸が指数的に増加して得られる。実際
は、標的核酸の検出が容易となるように多数回の複製
（又は「増幅」）が行われる。
【０００５】標的核酸を効果的に増幅して検出するため
は、細胞やその他の被検体の破壊屑から当該核酸を分離
しなければならないことが普通である。例えば、当該技
術分野では、赤血球がＰＣＲを阻害することが周知であ
る。様々な溶解手法が知られており、凍結法、プロテア
ーゼ（例、プロテイナーゼＫ）のような消化酵素による
処理、煮沸法及び洗剤の使用（例えば、１９８８年４月
６日出願、Ｈｉｇｕｃｈｉ、米国特許出願第１７８，２
０２号明細書、及び１９９１年５月２２日公開、欧州特
許公開第０４２８１９７号公報）が知られている。
は、細胞やその他の被検体の破壊屑から当該核酸を分離
しなければならないことが普通である。例えば、当該技
術分野では、赤血球がＰＣＲを阻害することが周知であ
る。様々な溶解手法が知られており、凍結法、プロテア
ーゼ（例、プロテイナーゼＫ）のような消化酵素による
処理、煮沸法及び洗剤の使用（例えば、１９８８年４月
６日出願、Ｈｉｇｕｃｈｉ、米国特許出願第１７８，２
０２号明細書、及び１９９１年５月２２日公開、欧州特
許公開第０４２８１９７号公報）が知られている。
【０００６】さらに、全血中の標的核酸の多くは、特定
の細胞集団、例えば、赤血球細胞（erythrocytes）と対
立する白血球細胞（leucocytes）に見い出されることも
知られている。血液細胞集団（及び二次集団）の分離及
び精製のために使用される技術は多くが周知のものであ
る。赤血球から白血球を分離するために最も一般的に用
いられている技法の一つに、赤血球を凝集させてその沈
降速度を高める試薬を含む溶液と全血試料とを単に混合
する方法がある。この沈降流体による白血球への影響は
少ないので、赤血球が沈降した後、該流体の上部から白
血球を収集することができる。
の細胞集団、例えば、赤血球細胞（erythrocytes）と対
立する白血球細胞（leucocytes）に見い出されることも
知られている。血液細胞集団（及び二次集団）の分離及
び精製のために使用される技術は多くが周知のものであ
る。赤血球から白血球を分離するために最も一般的に用
いられている技法の一つに、赤血球を凝集させてその沈
降速度を高める試薬を含む溶液と全血試料とを単に混合
する方法がある。この沈降流体による白血球への影響は
少ないので、赤血球が沈降した後、該流体の上部から白
血球を収集することができる。
【０００７】より最近の技術として、例えば、米国特許
第４，２５５，２５６号明細書（Ｆｅｒｒａｎｔｅら）
に記載されているように、特定の高分子化合物（例、Ｆ
ＩＣＯＬＬ（商標）４００）のような赤血球凝集剤を使
用する方法がある。このＦｅｒｒａｎｔｅらの特許明細
書の記載によると、白血球の特定の二次集団を凝集させ
ることも可能である。分離は、例えば、Ｅｇｇｌｅｔｏ
ｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２１，第１
０５〜１１３頁（１９８９）に記載されているデキスト
ラン勾配法を使用して行うこともできる。
第４，２５５，２５６号明細書（Ｆｅｒｒａｎｔｅら）
に記載されているように、特定の高分子化合物（例、Ｆ
ＩＣＯＬＬ（商標）４００）のような赤血球凝集剤を使
用する方法がある。このＦｅｒｒａｎｔｅらの特許明細
書の記載によると、白血球の特定の二次集団を凝集させ
ることも可能である。分離は、例えば、Ｅｇｇｌｅｔｏ
ｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２１，第１
０５〜１１３頁（１９８９）に記載されているデキスト
ラン勾配法を使用して行うこともできる。
【０００８】しかしながら、赤血球の溶解に用いられる
多くの技法及び試薬はポリメラーゼ連鎖反応を妨害し、
その効率を低下させることが知られている。このこと
は、標的核酸が極微量でしか存在しない場合には特に問
題となる。また、溶解性洗剤のような溶解剤の中には、
白血球の細胞膜を溶解し、細胞分離の際に細胞質ＤＮＡ
を損失せしめるものもある。さらに、各種溶解剤を使用
して調製された細胞は生存しておらず、従って培養する
ことができない。これらの問題を回避するためには、白
血球の一体性を損なうことなく赤血球を選択的に溶解す
る化合物を使用する必要がある。
多くの技法及び試薬はポリメラーゼ連鎖反応を妨害し、
その効率を低下させることが知られている。このこと
は、標的核酸が極微量でしか存在しない場合には特に問
題となる。また、溶解性洗剤のような溶解剤の中には、
白血球の細胞膜を溶解し、細胞分離の際に細胞質ＤＮＡ
を損失せしめるものもある。さらに、各種溶解剤を使用
して調製された細胞は生存しておらず、従って培養する
ことができない。これらの問題を回避するためには、白
血球の一体性を損なうことなく赤血球を選択的に溶解す
る化合物を使用する必要がある。
【０００９】このような選択的溶解性を示す化合物の一
例として塩化アンモニウムがあり、例えば、米国特許第
４，４０７，９４２号明細書（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）及び
ＥｇｇｌｅｔｏｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，１２１，第１０５〜１１３頁（１９８９）に記載さ
れている。典型的には、塩化アンモニウムを使用した
後、溶解した物質を遠心分離で除去して白血球を残存さ
せ、これをさらに処理する。しかしながら、この技法の
おける塩化アンモニウムを使用するためのプロトコルの
教示は必ずしも十分ではない。例えば、Ｅｇｇｌｅｔｏ
ｎらによると、赤血球を氷温の塩化アンモニウムで溶解
した後に白血球をその使用時まで緩衝液で洗浄してい
る。白血球の活性を維持することは重要であるが、Ｅｇ
ｇｌｅｔｏｎらの方法によると白血球もまた溶解を受け
てしまう。
例として塩化アンモニウムがあり、例えば、米国特許第
４，４０７，９４２号明細書（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）及び
ＥｇｇｌｅｔｏｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，１２１，第１０５〜１１３頁（１９８９）に記載さ
れている。典型的には、塩化アンモニウムを使用した
後、溶解した物質を遠心分離で除去して白血球を残存さ
せ、これをさらに処理する。しかしながら、この技法の
おける塩化アンモニウムを使用するためのプロトコルの
教示は必ずしも十分ではない。例えば、Ｅｇｇｌｅｔｏ
ｎらによると、赤血球を氷温の塩化アンモニウムで溶解
した後に白血球をその使用時まで緩衝液で洗浄してい
る。白血球の活性を維持することは重要であるが、Ｅｇ
ｇｌｅｔｏｎらの方法によると白血球もまた溶解を受け
てしまう。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】このような方法は、ポ
リメラーゼ連鎖反応のための標的核酸の単離法としては
有用ではなく、特に白血球集団に含まれる標的核酸の力
価が低い場合には有用ではない。白血球細胞の溶解が早
過ぎると、標的核酸の損失が多大となる恐れがある。そ
の上、Ｅｇｇｌｅｔｏｎらの方法は時間がかかりすぎ
（４０分を超える）、市販品として有用な細胞調製法と
はいえない。
リメラーゼ連鎖反応のための標的核酸の単離法としては
有用ではなく、特に白血球集団に含まれる標的核酸の力
価が低い場合には有用ではない。白血球細胞の溶解が早
過ぎると、標的核酸の損失が多大となる恐れがある。そ
の上、Ｅｇｇｌｅｔｏｎらの方法は時間がかかりすぎ
（４０分を超える）、市販品として有用な細胞調製法と
はいえない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記の問題は本発明によ
る白血球の選択的調製方法によって解決される。本発明
の方法は、（Ａ）少なくとも約５０ｍＭの塩化アンモニ
ウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカル
ボン酸又は金属カルボキシレート約０．００１重量％〜
約０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合
し、（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前
記全血試料から白血球のペレットを形成し、（Ｃ）その
上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の
新鮮な試料中で洗浄し、そして（Ｄ）前記白血球ペレッ
トを遠心分離して単離する白血球の選択的調製方法であ
って、前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記
構造式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、ア
リール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置
換アリールアルキル基を表す）で示され、前記溶解液の
ｐＨは６〜８の間にあり、そして前記（Ａ）〜（Ｄ）を
約２０分以内で遂行する方法である。
る白血球の選択的調製方法によって解決される。本発明
の方法は、（Ａ）少なくとも約５０ｍＭの塩化アンモニ
ウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカル
ボン酸又は金属カルボキシレート約０．００１重量％〜
約０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合
し、（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前
記全血試料から白血球のペレットを形成し、（Ｃ）その
上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の
新鮮な試料中で洗浄し、そして（Ｄ）前記白血球ペレッ
トを遠心分離して単離する白血球の選択的調製方法であ
って、前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記
構造式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、ア
リール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置
換アリールアルキル基を表す）で示され、前記溶解液の
ｐＨは６〜８の間にあり、そして前記（Ａ）〜（Ｄ）を
約２０分以内で遂行する方法である。
【００１２】本発明はまた、 （１）（Ａ）少なくとも約５０ｍＭの塩化アンモニウム
及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン
酸又は金属カルボキシレート約０．００１重量％〜約
０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合
し、（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前
記全血試料から白血球のペレットを形成し、（Ｃ）その
上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の
新鮮な試料中で洗浄し、そして（Ｄ）前記白血球ペレッ
トを遠心分離して単離する方法であって、前記カルボン
酸又は金属カルボキシレートは下記構造式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、ア
リール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置
換アリールアルキル基を表す）で示され、前記溶解液の
ｐＨは６〜８の間にあり、そして前記（Ａ）〜（Ｄ）を
約２０分以内で遂行する方法により、全血試料中の標的
核酸を含有することが疑われる白血球を選択的に調製す
る工程と、 （２）前記洗浄後のペレットの中の白血球を溶解するこ
とにより前記標的核酸を解放させる工程と、 （３）前記標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブ
リダイズし得る一組のプライマーを使用するポリメラー
ゼ連鎖反応によって、前記解放された標的核酸を増幅す
る工程と、 （４）前記増幅された標的核酸を検出する工程とを含
む、標的核酸を増幅して検出するための方法をも提供す
る。
及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン
酸又は金属カルボキシレート約０．００１重量％〜約
０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合
し、（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前
記全血試料から白血球のペレットを形成し、（Ｃ）その
上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の
新鮮な試料中で洗浄し、そして（Ｄ）前記白血球ペレッ
トを遠心分離して単離する方法であって、前記カルボン
酸又は金属カルボキシレートは下記構造式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、ア
リール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置
換アリールアルキル基を表す）で示され、前記溶解液の
ｐＨは６〜８の間にあり、そして前記（Ａ）〜（Ｄ）を
約２０分以内で遂行する方法により、全血試料中の標的
核酸を含有することが疑われる白血球を選択的に調製す
る工程と、 （２）前記洗浄後のペレットの中の白血球を溶解するこ
とにより前記標的核酸を解放させる工程と、 （３）前記標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブ
リダイズし得る一組のプライマーを使用するポリメラー
ゼ連鎖反応によって、前記解放された標的核酸を増幅す
る工程と、 （４）前記増幅された標的核酸を検出する工程とを含
む、標的核酸を増幅して検出するための方法をも提供す
る。
【００１３】（ａ）標的核酸の対向鎖に特異的であり且
つハイブリダイズし得る二種のプライマーであって、そ
の一方又は両方を検出部分で標識した一組のプライマ
ー、及び同一又は別の容器に入れた少なくとも一種の他
のＰＣＲ試薬、並びに（ｂ）別の容器に入れた、少なく
とも約５０ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つ
のカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキ
シレート約０．００５重量％以上を含有する溶液又は水
で再構成する場合にはその乾燥組成物であって、前記カ
ルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、ストール(stole) 炭素原子のアルケニル
基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール
基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリ
ールアルキル基を表す）で示され、そして前記溶解液の
ｐＨは６〜８の間にある前記溶液又は乾燥組成物を含
む、ポリメラーゼ連鎖反応用キット。
つハイブリダイズし得る二種のプライマーであって、そ
の一方又は両方を検出部分で標識した一組のプライマ
ー、及び同一又は別の容器に入れた少なくとも一種の他
のＰＣＲ試薬、並びに（ｂ）別の容器に入れた、少なく
とも約５０ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つ
のカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキ
シレート約０．００５重量％以上を含有する溶液又は水
で再構成する場合にはその乾燥組成物であって、前記カ
ルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、ストール(stole) 炭素原子のアルケニル
基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール
基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリ
ールアルキル基を表す）で示され、そして前記溶解液の
ｐＨは６〜８の間にある前記溶液又は乾燥組成物を含
む、ポリメラーゼ連鎖反応用キット。
【００１４】本発明は、全血試料から、標的核酸を増幅
して検出するために白血球を選択的に調製するための迅
速且つ有効な方法を提供する。この調製法は、標的核酸
が非常に低濃度で存在する場合でも、約２０分以内（好
ましくは１５分以内）で遂行することができる。その
上、この方法は室温で実施することができるが、これは
分離した白血球の活性(viability) がポリメラーゼ連鎖
反応にとって重要ではないからである。本発明の調製法
により、核及び細胞質両方のＤＮＡが保持される。
して検出するために白血球を選択的に調製するための迅
速且つ有効な方法を提供する。この調製法は、標的核酸
が非常に低濃度で存在する場合でも、約２０分以内（好
ましくは１５分以内）で遂行することができる。その
上、この方法は室温で実施することができるが、これは
分離した白血球の活性(viability) がポリメラーゼ連鎖
反応にとって重要ではないからである。本発明の調製法
により、核及び細胞質両方のＤＮＡが保持される。
【００１５】これらの利点は、塩化アンモニウムとカル
ボン酸又は金属カルボキシレートとを含む溶液を用いて
赤血球を選択的に溶解し、そして分離された白血球を同
溶液を用いて洗浄した後に、その白血球を溶解して標的
核酸を解放させることによって得られる。単に塩化アン
モニウム溶液を使用して赤血球を溶解するだけでは、増
幅して検出するために用いられる標的核酸を含有する白
血球の十分な力価を提供するには十分ではない場合が多
い。
ボン酸又は金属カルボキシレートとを含む溶液を用いて
赤血球を選択的に溶解し、そして分離された白血球を同
溶液を用いて洗浄した後に、その白血球を溶解して標的
核酸を解放させることによって得られる。単に塩化アン
モニウム溶液を使用して赤血球を溶解するだけでは、増
幅して検出するために用いられる標的核酸を含有する白
血球の十分な力価を提供するには十分ではない場合が多
い。
【００１６】発明の詳細な説明 本発明は、動物又はヒトから採集した全血試料の中に存
在する一種又は二種以上の標的核酸の抽出及び検出に特
に適している。標的となる核酸は該試料の特定の細胞
（白血球）の中に存在することが典型的であるため、こ
れらの細胞を損なうことなく該試料の残部から分離する
ために本発明による工程が採用される。
在する一種又は二種以上の標的核酸の抽出及び検出に特
に適している。標的となる核酸は該試料の特定の細胞
（白血球）の中に存在することが典型的であるため、こ
れらの細胞を損なうことなく該試料の残部から分離する
ために本発明による工程が採用される。
【００１７】まず初めに、塩化アンモニウム及びカルボ
ン酸又は金属カルボキシレートを含む赤血球溶解性の緩
衝液と全血試料とを適当な容器内で混合する。本発明に
おける使用に適したカルボン酸及び金属カルボキシレー
トは、カルボキシル基を一つ以上有し、下記構造式で示
される。 Ｒ−ＣＯＯＭ 上式中、Ｍは水素又は１価のカチオン（例、ナトリウ
ム、カリウム又はリチウム）を表し、Ｒは炭素原子数１
〜６のアルキル基（例、メチル、エチル、ブチル、イソ
ブチル、プロピル、イソプロピル、等）、炭素原子数１
〜６の置換アルキル基（例、ブロモメチル、クロロメチ
ル、フルオロメチル、１，１−ジクロロメチル、１，
１，１−トリクロロメチル、１，１，１−トリフルオロ
メチル、２，２，２−トリクロロエチル、等のようなハ
ロアルキル）、炭素原子数２〜６のアルコキシアルキル
基（例、メトキシメチル、メトキシエチル、等）、炭素
原子数１〜６のヒドロキシアルキル基（例、ヒドロキシ
メチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチ
ル、２，３−ヒドロキシエチル、等）、炭素原子数１〜
６のアミノアルキル基（例、アミノメチル、２−アミノ
エチル、３−アミノエチル、３−アミノプロピル、２，
４−ジアミノブチル、メチルアミノメチル、４−アミノ
ブチル、等）、炭素原子数２〜６のアルケニル基（例、
エテニル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテ
ニル、等）、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、ア
リール基、置換アリール基（例、フェニル、２−メトキ
シフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェ
ニル、４−アミノフェニル、２−クロロフェニル、４−
クロロフェニル、等）、アリールアルキル基又は置換ア
リールアルキル基を表す。
ン酸又は金属カルボキシレートを含む赤血球溶解性の緩
衝液と全血試料とを適当な容器内で混合する。本発明に
おける使用に適したカルボン酸及び金属カルボキシレー
トは、カルボキシル基を一つ以上有し、下記構造式で示
される。 Ｒ−ＣＯＯＭ 上式中、Ｍは水素又は１価のカチオン（例、ナトリウ
ム、カリウム又はリチウム）を表し、Ｒは炭素原子数１
〜６のアルキル基（例、メチル、エチル、ブチル、イソ
ブチル、プロピル、イソプロピル、等）、炭素原子数１
〜６の置換アルキル基（例、ブロモメチル、クロロメチ
ル、フルオロメチル、１，１−ジクロロメチル、１，
１，１−トリクロロメチル、１，１，１−トリフルオロ
メチル、２，２，２−トリクロロエチル、等のようなハ
ロアルキル）、炭素原子数２〜６のアルコキシアルキル
基（例、メトキシメチル、メトキシエチル、等）、炭素
原子数１〜６のヒドロキシアルキル基（例、ヒドロキシ
メチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチ
ル、２，３−ヒドロキシエチル、等）、炭素原子数１〜
６のアミノアルキル基（例、アミノメチル、２−アミノ
エチル、３−アミノエチル、３−アミノプロピル、２，
４−ジアミノブチル、メチルアミノメチル、４−アミノ
ブチル、等）、炭素原子数２〜６のアルケニル基（例、
エテニル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテ
ニル、等）、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、ア
リール基、置換アリール基（例、フェニル、２−メトキ
シフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェ
ニル、４−アミノフェニル、２−クロロフェニル、４−
クロロフェニル、等）、アリールアルキル基又は置換ア
リールアルキル基を表す。
【００１８】好ましくは、Ｒは炭素原子数１〜４の、よ
り好ましくは１〜３の、置換又は未置換のアルキル基で
ある。さらにより好ましくは、Ｒは置換メチル基、例え
ば、ハロゲンで置換されたメチル基である。最も好まし
いＲはメチル基である。このように、好適なカルボン酸
の例として、モノハロ酢酸、ジハロ酢酸、トリハロ酢酸
及び酢酸並びにこれらの金属カルボキシレートが挙げら
れる。
り好ましくは１〜３の、置換又は未置換のアルキル基で
ある。さらにより好ましくは、Ｒは置換メチル基、例え
ば、ハロゲンで置換されたメチル基である。最も好まし
いＲはメチル基である。このように、好適なカルボン酸
の例として、モノハロ酢酸、ジハロ酢酸、トリハロ酢酸
及び酢酸並びにこれらの金属カルボキシレートが挙げら
れる。
【００１９】赤血球溶解性溶液は約５０ｍＭ〜約１００
ｍＭの塩化アンモニウムを含有する。該溶液中にはカル
ボン酸又は金属カルボキシレートが約０．００１重量％
〜約０．１重量％存在する。該溶解液は、カルボン酸又
は金属カルボキシレートを約０．００５重量％〜約０．
０５重量％含有することが好ましい。
ｍＭの塩化アンモニウムを含有する。該溶液中にはカル
ボン酸又は金属カルボキシレートが約０．００１重量％
〜約０．１重量％存在する。該溶解液は、カルボン酸又
は金属カルボキシレートを約０．００５重量％〜約０．
０５重量％含有することが好ましい。
【００２０】本発明のカルボン酸及び金属カルボキシレ
ートは遊離酸として又は金属カルボキシレートとして一
般に市販されているが、当業者であれば周知の方法で合
成することもできる。本発明のカルボン酸の市販品の例
として、Eastman Organic Chemicals (Kingsport, Tenn
essee)より市販されている下記のものが挙げられる：酢
酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、１，１，１−トリ
クロロ酢酸、２−メトキシ安息香酸、４−クロロフェニ
ル、２−ブロモ−３−メチル酪酸、イソ酪酸、シアノ酢
酸、２−ブテン酸、１，３−ジカルボキシルベンゼン、
２−エチル酪酸、trans-桂皮酸、及びその他。上記のも
の及びその他はまた、当業者であれば周知である別の供
給業者や製造業者、例えば、TCI America (Portland, O
regon)、Sigma Chemical Company (St. Louis, Missour
i)、ICN (Irvine, California)及びその他多数からも入
手可能である。
ートは遊離酸として又は金属カルボキシレートとして一
般に市販されているが、当業者であれば周知の方法で合
成することもできる。本発明のカルボン酸の市販品の例
として、Eastman Organic Chemicals (Kingsport, Tenn
essee)より市販されている下記のものが挙げられる：酢
酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、１，１，１−トリ
クロロ酢酸、２−メトキシ安息香酸、４−クロロフェニ
ル、２−ブロモ−３−メチル酪酸、イソ酪酸、シアノ酢
酸、２−ブテン酸、１，３−ジカルボキシルベンゼン、
２−エチル酪酸、trans-桂皮酸、及びその他。上記のも
の及びその他はまた、当業者であれば周知である別の供
給業者や製造業者、例えば、TCI America (Portland, O
regon)、Sigma Chemical Company (St. Louis, Missour
i)、ICN (Irvine, California)及びその他多数からも入
手可能である。
【００２１】本発明で用いられる赤血球溶解液に対する
全血試料の体積比率は、約１：１〜約１：１０である。
この比率は約１：１〜約１：５であることが好ましい。
より好ましくは、この比率は約１：４である。全血試料
の体積は任意とすることができるが、一般には約０．１
〜約１０ｍＬである。
全血試料の体積比率は、約１：１〜約１：１０である。
この比率は約１：１〜約１：５であることが好ましい。
より好ましくは、この比率は約１：４である。全血試料
の体積は任意とすることができるが、一般には約０．１
〜約１０ｍＬである。
【００２２】本発明で用いられる溶解液は、一般に、約
６．０〜約８．０（好ましくは約６．５〜約７．５）の
範囲のｐＨを与える適当な緩衝液の中に、塩化アンモニ
ウムとカルボン酸又は金属カルボキシレートを含むもの
である。有用な緩衝剤として、重炭酸ナトリウム、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、リン酸
塩、その他当該技術分野で周知の緩衝剤が挙げられる
が、これらに限定はされない。該溶解液は、エチレンジ
アミン四酢酸やその他当該技術分野で周知のもののよう
なイオンキレート化剤を必要に応じて含有することがで
きる。
６．０〜約８．０（好ましくは約６．５〜約７．５）の
範囲のｐＨを与える適当な緩衝液の中に、塩化アンモニ
ウムとカルボン酸又は金属カルボキシレートを含むもの
である。有用な緩衝剤として、重炭酸ナトリウム、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、リン酸
塩、その他当該技術分野で周知の緩衝剤が挙げられる
が、これらに限定はされない。該溶解液は、エチレンジ
アミン四酢酸やその他当該技術分野で周知のもののよう
なイオンキレート化剤を必要に応じて含有することがで
きる。
【００２３】溶解液で赤血球が溶解されるように、室温
で最長約１０分間（好ましくは約５分間）の混合を行
う。得られた混合物を、常用の遠心分離機を用いた最長
１０分間（好ましくは約５分間）の遠心分離にかけ、溶
解の生成物及びその他の望ましくない破壊屑を含有する
上清液から（ペレット状の）白血球を分離する。
で最長約１０分間（好ましくは約５分間）の混合を行
う。得られた混合物を、常用の遠心分離機を用いた最長
１０分間（好ましくは約５分間）の遠心分離にかけ、溶
解の生成物及びその他の望ましくない破壊屑を含有する
上清液から（ペレット状の）白血球を分離する。
【００２４】上清液を除去した後、白血球のペレットを
室温で少なくとも１回は該溶解液の新鮮な試料で洗浄
し、続いて室温で２回目の遠心分離を最長約１０分間
（好ましくは約５分間）行う。白血球のペレットを再度
単離すると、その白血球はその後の取扱い（例えば、ポ
リメラーゼ連鎖反応に先立つ溶解処理）に利用すること
ができる。白血球を単離する方法は、全体として、最長
でも約２０分を要し、好ましくは約１０〜約１６分かか
る。１５分が最も好適である。
室温で少なくとも１回は該溶解液の新鮮な試料で洗浄
し、続いて室温で２回目の遠心分離を最長約１０分間
（好ましくは約５分間）行う。白血球のペレットを再度
単離すると、その白血球はその後の取扱い（例えば、ポ
リメラーゼ連鎖反応に先立つ溶解処理）に利用すること
ができる。白血球を単離する方法は、全体として、最長
でも約２０分を要し、好ましくは約１０〜約１６分かか
る。１５分が最も好適である。
【００２５】単離された白血球は、生物学や医学の分野
における研究者であれば容易に想到し得る多くの目的に
利用することができる。例えば、この白血球を用いて、
各種白血球細胞の機能について研究すること（二次集団
の分画をさらに要するであろう）、ヒトγ−インターフ
ェロンを調製すること（例、Ｔｏｔｈらの米国特許第
４，６９６，８９９号明細書に記載）、Ｔ４／Ｔ８細胞
比率を測定すること（例、Ｐｒｉｖｉｔｅｒａの米国特
許第４，８２６，７６０号明細書に記載）、ウイルスを
培養すること、そしてワクチンを調製すること（例、Ｈ
ａｒｔらの米国特許第４，９５６，２７８号明細書に記
載）が可能である。ポリメラーゼ連鎖反応のための調製
においてこれらの白血球を分離することが好ましく、以
下これについて詳細に説明する。
における研究者であれば容易に想到し得る多くの目的に
利用することができる。例えば、この白血球を用いて、
各種白血球細胞の機能について研究すること（二次集団
の分画をさらに要するであろう）、ヒトγ−インターフ
ェロンを調製すること（例、Ｔｏｔｈらの米国特許第
４，６９６，８９９号明細書に記載）、Ｔ４／Ｔ８細胞
比率を測定すること（例、Ｐｒｉｖｉｔｅｒａの米国特
許第４，８２６，７６０号明細書に記載）、ウイルスを
培養すること、そしてワクチンを調製すること（例、Ｈ
ａｒｔらの米国特許第４，９５６，２７８号明細書に記
載）が可能である。ポリメラーゼ連鎖反応のための調製
においてこれらの白血球を分離することが好ましく、以
下これについて詳細に説明する。
【００２６】ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅及
び検出についての一般的な原理及び条件は周知であり、
その詳細については、米国特許第４，６８３，１９５
号、同第４，６８３，２０２号、同第４，９６５，１８
８号及び国際特許出願公開第９１／１２３４２号並びに
GuatelliらのClin. Microbiol. Rev., 2 (2), pp. 217-
226 (1989)をはじめとする多数の文献に記載されてい
る。参照により上記米国特許明細書を本明細書で援用す
る。当該技術分野における教示及び本明細書中の具体的
教示を鑑みることにより、当業者であれば、本発明の白
血球調製法とポリメラーゼ連鎖反応技法とを組み合わせ
ることにより本発明を実施することに、何らの困難性も
見い出さないであろう。
び検出についての一般的な原理及び条件は周知であり、
その詳細については、米国特許第４，６８３，１９５
号、同第４，６８３，２０２号、同第４，９６５，１８
８号及び国際特許出願公開第９１／１２３４２号並びに
GuatelliらのClin. Microbiol. Rev., 2 (2), pp. 217-
226 (1989)をはじめとする多数の文献に記載されてい
る。参照により上記米国特許明細書を本明細書で援用す
る。当該技術分野における教示及び本明細書中の具体的
教示を鑑みることにより、当業者であれば、本発明の白
血球調製法とポリメラーゼ連鎖反応技法とを組み合わせ
ることにより本発明を実施することに、何らの困難性も
見い出さないであろう。
【００２７】本発明は、全血の試料中の一種又は二種以
上の標的核酸に存在する一種又は二種以上の特別な核酸
配列を増幅又は検出することに関する。
上の標的核酸に存在する一種又は二種以上の特別な核酸
配列を増幅又は検出することに関する。
【００２８】本発明は、白血球中に存在する感染因子と
関わりのある少なくとも一つの特異的核酸配列を、関与
する反応工程数に対して指数増加する量で得るのに特に
有用である。この生成物は、用いた特異的プライマーの
端部に対応する末端を含む関連のない(discrete)核酸二
重鎖であることができる。さらに、複数種の標的核酸
を、各特異的核酸に対応するプライマーセット及び検出
手段を使用することによって、同時に増幅して検出する
ことができる。同一核酸に含まれる複数の配列を増幅し
て検出することもできる。本発明は、細菌のＤＮＡ、菌
類のＤＮＡ、ウイルスのＲＮＡ又は細菌若しくはウイル
スに感染した白血球に含まれるＤＮＡに含まれる標的核
酸の増幅及び検出に特に有用である。
関わりのある少なくとも一つの特異的核酸配列を、関与
する反応工程数に対して指数増加する量で得るのに特に
有用である。この生成物は、用いた特異的プライマーの
端部に対応する末端を含む関連のない(discrete)核酸二
重鎖であることができる。さらに、複数種の標的核酸
を、各特異的核酸に対応するプライマーセット及び検出
手段を使用することによって、同時に増幅して検出する
ことができる。同一核酸に含まれる複数の配列を増幅し
て検出することもできる。本発明は、細菌のＤＮＡ、菌
類のＤＮＡ、ウイルスのＲＮＡ又は細菌若しくはウイル
スに感染した白血球に含まれるＤＮＡに含まれる標的核
酸の増幅及び検出に特に有用である。
【００２９】本明細書で説明する方法を使用することに
より、感染疾患、遺伝的欠陥若しくは細胞障害、例えば
癌、又はこれらの範疇に明確には含まれないその他の疾
患状態に関わる特別な核酸配列を検出することができ
る。また、この方法を法医学的な調査及びＤＮＡの型別
に使用することもできる。本発明の目的として、遺伝的
欠陥には、鎌型赤血球貧血、嚢性線維症、α−地中海貧
血、β−地中海貧血及びその他当業者であれば容易に想
到し得るもののような、生物由来のゲノムＤＮＡにおけ
る特殊な欠失又は変異が含まれる。本発明によりヒト白
血球抗原（ＨＬＡ）を分類することができる。検出可能
な細菌として、血中に存在し得る細菌、サルモネラ属、
連鎖球菌属、クラミジア属、淋菌属、ミコバクテリア属
（例、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び鳥
結核菌(Mycobacterium avium) 複合体）、マイコプラズ
マ属（例、マイコプラズマ・ヘモフィリス・インフルエ
ンザ(Mycoplasma Haemophilus influenzae) 及び肺炎マ
イコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae) ）、レジュネラ
・ニューモフィラ菌(Legionella pneumophila)、ボレリ
ア・ブルグドルフェライ(Borrelia burgdorferei) 、ニ
ューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium diffic
ile ）、カンピロバクテリア種（Camplyobacteri speci
es）、エルシニア種（Yersinia species）、シゲラ種
（Shigella species）ならびにリステリア種（Listeria
species）が含まれるが、これらに限定はされない。検
出可能であるウイルスには、単純ヘルペスウイルス（he
rpes simplex virus）、ＥＢウイルス（Epstein Barr v
irus）、呼吸性合胞体ウイルス(respiratory syncytial
virus) 、肝炎ウイルス（hepatitis virus ）ならびに
レトロウイルス（例えば、HTLV-I、HTLV-II 、HIV-I お
よびHIV-II）が含まれるが、これらに限定はされない。
原生動物寄生体及び菌類（酵母及びカビを含む）もまた
検出可能である。別の検出可能な種は、当業者であれば
容易に想到し得るであろう。本発明は、各種細菌又はウ
イルスに関わるＤＮＡの存在を検出するのに特に有用で
ある。
より、感染疾患、遺伝的欠陥若しくは細胞障害、例えば
癌、又はこれらの範疇に明確には含まれないその他の疾
患状態に関わる特別な核酸配列を検出することができ
る。また、この方法を法医学的な調査及びＤＮＡの型別
に使用することもできる。本発明の目的として、遺伝的
欠陥には、鎌型赤血球貧血、嚢性線維症、α−地中海貧
血、β−地中海貧血及びその他当業者であれば容易に想
到し得るもののような、生物由来のゲノムＤＮＡにおけ
る特殊な欠失又は変異が含まれる。本発明によりヒト白
血球抗原（ＨＬＡ）を分類することができる。検出可能
な細菌として、血中に存在し得る細菌、サルモネラ属、
連鎖球菌属、クラミジア属、淋菌属、ミコバクテリア属
（例、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び鳥
結核菌(Mycobacterium avium) 複合体）、マイコプラズ
マ属（例、マイコプラズマ・ヘモフィリス・インフルエ
ンザ(Mycoplasma Haemophilus influenzae) 及び肺炎マ
イコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae) ）、レジュネラ
・ニューモフィラ菌(Legionella pneumophila)、ボレリ
ア・ブルグドルフェライ(Borrelia burgdorferei) 、ニ
ューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、
クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium diffic
ile ）、カンピロバクテリア種（Camplyobacteri speci
es）、エルシニア種（Yersinia species）、シゲラ種
（Shigella species）ならびにリステリア種（Listeria
species）が含まれるが、これらに限定はされない。検
出可能であるウイルスには、単純ヘルペスウイルス（he
rpes simplex virus）、ＥＢウイルス（Epstein Barr v
irus）、呼吸性合胞体ウイルス(respiratory syncytial
virus) 、肝炎ウイルス（hepatitis virus ）ならびに
レトロウイルス（例えば、HTLV-I、HTLV-II 、HIV-I お
よびHIV-II）が含まれるが、これらに限定はされない。
原生動物寄生体及び菌類（酵母及びカビを含む）もまた
検出可能である。別の検出可能な種は、当業者であれば
容易に想到し得るであろう。本発明は、各種細菌又はウ
イルスに関わるＤＮＡの存在を検出するのに特に有用で
ある。
【００３０】本明細書においてプライマー又はプローブ
をさして用いる場合の用語「オリゴヌクレオチド」は、
二種又は三種以上の（好ましくは四種以上の）デオキシ
リボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子を意
味する。その大きさを特定することは重要ではなく、該
オリゴヌクレオチドの最終的用途又は機能をはじめとす
る多くの因子によって変わってくる。このオリゴヌクレ
オチドは当該技術分野で周知のいずれの方法によっても
誘導されることができる。
をさして用いる場合の用語「オリゴヌクレオチド」は、
二種又は三種以上の（好ましくは四種以上の）デオキシ
リボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子を意
味する。その大きさを特定することは重要ではなく、該
オリゴヌクレオチドの最終的用途又は機能をはじめとす
る多くの因子によって変わってくる。このオリゴヌクレ
オチドは当該技術分野で周知のいずれの方法によっても
誘導されることができる。
【００３１】「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必須である
とみなされる試薬のすべて、すなわち、標的核酸に対す
る一又は二以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび一又は二以上の
デオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸を称する。
とみなされる試薬のすべて、すなわち、標的核酸に対す
る一又は二以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび一又は二以上の
デオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸を称する。
【００３２】「プライマー」の語は、核酸鎖（すなわ
ち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘
発される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作
用し得る、天然の又は合成されたオリゴヌクレオチドを
称する。このような条件として、ヌクレオチド（例、４
種類の標準的なデオキシリボヌクレオシド−５′−三リ
ン酸）、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ・
コファクターの存在、並びに好適な温度及びｐＨが挙げ
られる。
ち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘
発される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作
用し得る、天然の又は合成されたオリゴヌクレオチドを
称する。このような条件として、ヌクレオチド（例、４
種類の標準的なデオキシリボヌクレオシド−５′−三リ
ン酸）、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ・
コファクターの存在、並びに好適な温度及びｐＨが挙げ
られる。
【００３３】プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在
下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分長いもの
である。各プライマーの正確なサイズは、予定される用
途、標的とされる配列の複雑さ、反応温度、及びプライ
マーの供給源に応じて変化し得る。一般には、本発明に
使用されるプライマーは１２〜６０個のヌクレオチドを
有し、そして好ましくは１８〜４５個のヌクレオチドを
有する。
下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分長いもの
である。各プライマーの正確なサイズは、予定される用
途、標的とされる配列の複雑さ、反応温度、及びプライ
マーの供給源に応じて変化し得る。一般には、本発明に
使用されるプライマーは１２〜６０個のヌクレオチドを
有し、そして好ましくは１８〜４５個のヌクレオチドを
有する。
【００３４】本発明に用いられるプライマーは、増幅し
ようとする各特異的配列の別々の鎖に対して「実質的に
相補的」となるように選択される。これは、それらが、
それぞれの核酸鎖にハイブリダイズし、所望のハイブリ
ダイズ生成物を形成し、その後ＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長が可能となる程度に十分に相補的でなければなら
ないことを意味する。好ましく且つ最も実用的な状況
は、プライマーが標的核酸に対して正確な相補性を有す
る場合である。
ようとする各特異的配列の別々の鎖に対して「実質的に
相補的」となるように選択される。これは、それらが、
それぞれの核酸鎖にハイブリダイズし、所望のハイブリ
ダイズ生成物を形成し、その後ＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長が可能となる程度に十分に相補的でなければなら
ないことを意味する。好ましく且つ最も実用的な状況
は、プライマーが標的核酸に対して正確な相補性を有す
る場合である。
【００３５】本明細書中の有用なプライマーは、例え
ば、ABI ＤＮＡ合成機（Applied Biosystemsより入手可
能）またはバイオサーチ8600シリーズもしくは8800シリ
ーズ合成機（Biosearch 8600 Series もしくは8800 Ser
ies Synthesizer ）（Milligen-Biosearch, Inc.より入
手可能）及び周知のその使用方法（例えば、米国特許第
4,965,188号）をはじめとする既知の技法および装置を
用いて調製すること、或いはいくつかの出所から入手す
ることができる。また、生物学的供給源から単離された
天然プライマーも有用である（例えば、制限エンドヌク
レアーゼ消化物）。本明細書では、用語「プライマー」
はプライマーの混合物をも意味する。
ば、ABI ＤＮＡ合成機（Applied Biosystemsより入手可
能）またはバイオサーチ8600シリーズもしくは8800シリ
ーズ合成機（Biosearch 8600 Series もしくは8800 Ser
ies Synthesizer ）（Milligen-Biosearch, Inc.より入
手可能）及び周知のその使用方法（例えば、米国特許第
4,965,188号）をはじめとする既知の技法および装置を
用いて調製すること、或いはいくつかの出所から入手す
ることができる。また、生物学的供給源から単離された
天然プライマーも有用である（例えば、制限エンドヌク
レアーゼ消化物）。本明細書では、用語「プライマー」
はプライマーの混合物をも意味する。
【００３６】検出のために、プライマーの一方又は両方
を、同種の又は異種の標識で標識することができる。標
識を結合させる方法やプライマーの調製方法は当該技術
分野では周知であり、例えば、Agrawal らのNucleic Ac
id Res., 14, pp. 6227-45 (1986) 、ビオチン標識に関
する米国特許第４，９１４，２１０号（Levensonら)、
酵素標識に関する米国特許第４，９６２，０２９号（Le
vensonら) 、及びこれらの中に引用されている文献に記
載されている。また、有用な標識には、放射性同位元
素、電子高密度試薬、色素原、蛍光原、リン光原、フェ
リチン及びその他の磁性粒子（Owenらの米国特許第４，
７９５，６９８号及びPoynton らの米国特許第４，９２
０，０６１号を参照のこと）、化学発光部分（例、ルミ
ノール）、並びに特異的結合種（アビジン、ストレプト
アビジン、ビオチン、糖類又はレクチン）も含まれる。
好ましい標識は酵素、放射性同位元素及び特異的結合種
（例、ビオチン）である。有用な酵素として、グルコー
スオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、その他当該技術分野で周知の酵
素が挙げられ、またこれらの酵素は周知の方法でオリゴ
ヌクレオチドに結合させることができる。このような酵
素と共に比色用信号又は化学発光信号を提供する試薬は
周知である。
を、同種の又は異種の標識で標識することができる。標
識を結合させる方法やプライマーの調製方法は当該技術
分野では周知であり、例えば、Agrawal らのNucleic Ac
id Res., 14, pp. 6227-45 (1986) 、ビオチン標識に関
する米国特許第４，９１４，２１０号（Levensonら)、
酵素標識に関する米国特許第４，９６２，０２９号（Le
vensonら) 、及びこれらの中に引用されている文献に記
載されている。また、有用な標識には、放射性同位元
素、電子高密度試薬、色素原、蛍光原、リン光原、フェ
リチン及びその他の磁性粒子（Owenらの米国特許第４，
７９５，６９８号及びPoynton らの米国特許第４，９２
０，０６１号を参照のこと）、化学発光部分（例、ルミ
ノール）、並びに特異的結合種（アビジン、ストレプト
アビジン、ビオチン、糖類又はレクチン）も含まれる。
好ましい標識は酵素、放射性同位元素及び特異的結合種
（例、ビオチン）である。有用な酵素として、グルコー
スオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、その他当該技術分野で周知の酵
素が挙げられ、またこれらの酵素は周知の方法でオリゴ
ヌクレオチドに結合させることができる。このような酵
素と共に比色用信号又は化学発光信号を提供する試薬は
周知である。
【００３７】標識がペルオキシダーゼのような酵素であ
る場合には、アッセイのある時点で、過酸化水素と適当
な色素生成性組成物を添加して、検出可能な色素を得
る。例えば、有用な色素提供試薬として、テトラメチル
ベンジジン及びその誘導体、ロイコ色素、例えば、水不
溶性トリアリールイミダゾール系ロイコ色素（Bruschi
の米国特許第４，０８９，７４７号に記載されてい
る）、又はその他ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在
下で色素を提供するように反応する化合物、が挙げられ
る。特に有用な色素提供組成物が欧州特許公開第０３０
８２３６号（１９８９年３月２２日発行）に記載されて
いる。また、適当な試薬を使用することにより、ペルオ
キシダーゼ標識に応じた化学発光信号を発生させること
もできる。
る場合には、アッセイのある時点で、過酸化水素と適当
な色素生成性組成物を添加して、検出可能な色素を得
る。例えば、有用な色素提供試薬として、テトラメチル
ベンジジン及びその誘導体、ロイコ色素、例えば、水不
溶性トリアリールイミダゾール系ロイコ色素（Bruschi
の米国特許第４，０８９，７４７号に記載されてい
る）、又はその他ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在
下で色素を提供するように反応する化合物、が挙げられ
る。特に有用な色素提供組成物が欧州特許公開第０３０
８２３６号（１９８９年３月２２日発行）に記載されて
いる。また、適当な試薬を使用することにより、ペルオ
キシダーゼ標識に応じた化学発光信号を発生させること
もできる。
【００３８】プライマーの一方又は両方をビオチン化し
た場合には、増幅後の核酸を、検出可能に標識されたア
ビジン又はその均等物（例、ストレプトアビジン）を用
いて検出することができる。例えば、アビジンは、酵素
と接合されること、或いは既知の技法により放射性同位
元素を含むことができる。増幅された生成物に結合して
いるビオチンはアビジンと複合化し、そして放射性信
号、比色用信号又は化学発光信号を検出するための適当
な技法を使用する。
た場合には、増幅後の核酸を、検出可能に標識されたア
ビジン又はその均等物（例、ストレプトアビジン）を用
いて検出することができる。例えば、アビジンは、酵素
と接合されること、或いは既知の技法により放射性同位
元素を含むことができる。増幅された生成物に結合して
いるビオチンはアビジンと複合化し、そして放射性信
号、比色用信号又は化学発光信号を検出するための適当
な技法を使用する。
【００３９】本明細書に用いられている捕捉「プロー
ブ」は、標的核酸の一又は二以上の鎖の核酸配列に実質
的に相補的であり且つ増幅後の核酸を不溶化するために
用いられるオリゴヌクレオチドである。プローブのオリ
ゴヌクレオチドは、適当な水不溶性支持体、例えばポリ
マービーズ、ガラスビーズ、マイクロタイタープレート
ウェル、ポリマー系若しくはセルロース系の薄膜又はそ
の他当業者であれば容易に想到し得る材料、に一般に結
合されている。オリゴヌクレオチドの長さは、一般にヌ
クレオチド数で約１２〜約４０であるが、この長さは重
量ではない。
ブ」は、標的核酸の一又は二以上の鎖の核酸配列に実質
的に相補的であり且つ増幅後の核酸を不溶化するために
用いられるオリゴヌクレオチドである。プローブのオリ
ゴヌクレオチドは、適当な水不溶性支持体、例えばポリ
マービーズ、ガラスビーズ、マイクロタイタープレート
ウェル、ポリマー系若しくはセルロース系の薄膜又はそ
の他当業者であれば容易に想到し得る材料、に一般に結
合されている。オリゴヌクレオチドの長さは、一般にヌ
クレオチド数で約１２〜約４０であるが、この長さは重
量ではない。
【００４０】ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型
の複合体における該プライマーの３′−ヒドロキシ末端
にデオキシリボクレオシド一リン酸分子を付加させる酵
素であるが、この付加は、鋳型に依存するように（すな
わち、鋳型に含まれる特異的ヌクレオチドに依存して）
行われる。当該技術分野では有用なＤＮＡポリメラーゼ
が多数知られている。このポリメラーゼは「耐熱性」で
あること、すなわち、熱に対して安定であり且つ高温、
特にＤＮＡ鎖の変性に用いられる高温における活性が優
先することが好ましい。より具体的には、耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼは、本明細書で説明したＰＣＲに用いられ
る高温によって実質的に不活化されない。この温度は、
ｐＨ、標的核酸やプライマーのヌクレオチド組成、プラ
イマーの長さ、塩濃度及びその他当該技術分野で既知の
条件をはじめとするいくつかの反応条件により変化す
る。
の複合体における該プライマーの３′−ヒドロキシ末端
にデオキシリボクレオシド一リン酸分子を付加させる酵
素であるが、この付加は、鋳型に依存するように（すな
わち、鋳型に含まれる特異的ヌクレオチドに依存して）
行われる。当該技術分野では有用なＤＮＡポリメラーゼ
が多数知られている。このポリメラーゼは「耐熱性」で
あること、すなわち、熱に対して安定であり且つ高温、
特にＤＮＡ鎖の変性に用いられる高温における活性が優
先することが好ましい。より具体的には、耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼは、本明細書で説明したＰＣＲに用いられ
る高温によって実質的に不活化されない。この温度は、
ｐＨ、標的核酸やプライマーのヌクレオチド組成、プラ
イマーの長さ、塩濃度及びその他当該技術分野で既知の
条件をはじめとするいくつかの反応条件により変化す
る。
【００４１】数多くの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが従来
技術文献に報告されており、それらには米国特許第 4,9
65,188号明細書（Mullis他）および米国特許第 4,889,8
18号明細書（Gelfand 他）に詳細に記載されているもの
が包含される。特に有用なポリメラーゼは、種々のサー
マス細菌種、例えば、サーマス・アクアティクス（Ther
mus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス（Thermus
thermophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus
filiformis）もしくはサーマス・フラバス（Thermus fl
avus）から得られるものである。別の有用な耐熱性ポリ
メラーゼが、サーモコッカス・リテラリス（Thermococc
us literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococc
us furiosus ）、サーモトガ種（Thermotoga sp.）およ
びWO-A-89/06691 （1989年 7月27日発行）に記載のもの
を包含する種々の微生物源より得られる。有用な耐熱性
ポリメラーゼには市販されているものがある。天然のポ
リメラーゼを生物体から単離する技法や、組換え技法を
用いて遺伝子工学酵素を製造するための技法がいくつか
知られており、この段落で引用した技術分野で説明され
ている。サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticu
s)から得られたものと等価なＤＮＡポリメラーゼを調製
するための好ましい方法が、欧州特許出願公開第０４８
２７１４号（１９９２年４月２９日発行）に記載されて
いる。
技術文献に報告されており、それらには米国特許第 4,9
65,188号明細書（Mullis他）および米国特許第 4,889,8
18号明細書（Gelfand 他）に詳細に記載されているもの
が包含される。特に有用なポリメラーゼは、種々のサー
マス細菌種、例えば、サーマス・アクアティクス（Ther
mus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス（Thermus
thermophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus
filiformis）もしくはサーマス・フラバス（Thermus fl
avus）から得られるものである。別の有用な耐熱性ポリ
メラーゼが、サーモコッカス・リテラリス（Thermococc
us literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococc
us furiosus ）、サーモトガ種（Thermotoga sp.）およ
びWO-A-89/06691 （1989年 7月27日発行）に記載のもの
を包含する種々の微生物源より得られる。有用な耐熱性
ポリメラーゼには市販されているものがある。天然のポ
リメラーゼを生物体から単離する技法や、組換え技法を
用いて遺伝子工学酵素を製造するための技法がいくつか
知られており、この段落で引用した技術分野で説明され
ている。サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticu
s)から得られたものと等価なＤＮＡポリメラーゼを調製
するための好ましい方法が、欧州特許出願公開第０４８
２７１４号（１９９２年４月２９日発行）に記載されて
いる。
【００４２】ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターは、活
性について酵素が依存する非タンパク質化合物を称す
る。従って、酵素はコファクターが存在しないと触媒的
に不活性である。現在のところ、ポリメラーゼとコファ
クターの相互作用の正確な機構については知られていな
い。このような物質のいくつかは、マンガン化合物及び
マグネシウム化合物をはじめとする既知のコファクター
である。このような化合物は、二価のアニオンが水溶液
中に解放されるような形態でマンガン又はマグネシウム
を含有する。有用なコファクターとして、マンガン塩お
よびマグネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩
及び脂肪酸塩（例えば、酪酸塩、カプロン酸塩、カプリ
ル酸塩、カプリン酸塩及びラウリン酸塩）が挙げられる
が、これらに限定はされない。比較的小さな塩、すなわ
ち塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。本発明を実施
する上で最も好ましいものは、塩化マグネシウム及び硫
酸マグネシウムのようなマグネシウム塩である。
性について酵素が依存する非タンパク質化合物を称す
る。従って、酵素はコファクターが存在しないと触媒的
に不活性である。現在のところ、ポリメラーゼとコファ
クターの相互作用の正確な機構については知られていな
い。このような物質のいくつかは、マンガン化合物及び
マグネシウム化合物をはじめとする既知のコファクター
である。このような化合物は、二価のアニオンが水溶液
中に解放されるような形態でマンガン又はマグネシウム
を含有する。有用なコファクターとして、マンガン塩お
よびマグネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩
及び脂肪酸塩（例えば、酪酸塩、カプロン酸塩、カプリ
ル酸塩、カプリン酸塩及びラウリン酸塩）が挙げられる
が、これらに限定はされない。比較的小さな塩、すなわ
ち塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。本発明を実施
する上で最も好ましいものは、塩化マグネシウム及び硫
酸マグネシウムのようなマグネシウム塩である。
【００４３】ＰＣＲにはまた、デオキシリボヌクレオシ
ド−５′−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＵＴＰ又はｄＴＴＰが必要である。通常は、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのすべてを
ＰＣＲにおいて使用する。また、ｄＩＴＰや７−デアザ
−ｄＧＴＰのような類似体も有用である。
ド−５′−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＵＴＰ又はｄＴＴＰが必要である。通常は、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのすべてを
ＰＣＲにおいて使用する。また、ｄＩＴＰや７−デアザ
−ｄＧＴＰのような類似体も有用である。
【００４４】各ＰＣＲ試薬は、個別に包装して供給して
もよいし、またプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ・コフ
ァクター及びデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン
酸をはじめとする一種又は二種以上の他のＰＣＲ試薬の
すべてを適当な緩衝液に混合した混合物として供給して
もよい。代表的な緩衝剤として、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（これが好ましい）、Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン
酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエ
タンスルホン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラ
ジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、
３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸及びＮ−
〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエ
タンスルホン酸が挙げられるが、これらに限定はされな
い。
もよいし、またプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ・コフ
ァクター及びデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン
酸をはじめとする一種又は二種以上の他のＰＣＲ試薬の
すべてを適当な緩衝液に混合した混合物として供給して
もよい。代表的な緩衝剤として、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（これが好ましい）、Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン
酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエ
タンスルホン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラ
ジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、
３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸及びＮ−
〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエ
タンスルホン酸が挙げられるが、これらに限定はされな
い。
【００４５】増幅し検出しようとする核酸は通常は二重
鎖形であるので、この二重鎖を分離（すなわち、プライ
ミングの前に変性）しなければならない。これは抽出工
程の際に行うことができ、またその後の別工程とするこ
ともできる。変性は、熱処理単独で行われるか、または
従来技術文献に記載されている他の適当な物理的、化学
的もしくは酵素的方法と組み合わせて行われる。初期変
性は、一般に、標的核酸を含有することが疑われる試料
を、約８５〜約１００℃の第一温度で適当な時間、例え
ば約１秒間〜３分間、加熱することにより行われる。
鎖形であるので、この二重鎖を分離（すなわち、プライ
ミングの前に変性）しなければならない。これは抽出工
程の際に行うことができ、またその後の別工程とするこ
ともできる。変性は、熱処理単独で行われるか、または
従来技術文献に記載されている他の適当な物理的、化学
的もしくは酵素的方法と組み合わせて行われる。初期変
性は、一般に、標的核酸を含有することが疑われる試料
を、約８５〜約１００℃の第一温度で適当な時間、例え
ば約１秒間〜３分間、加熱することにより行われる。
【００４６】次いで、変性された鎖を、一般に約５５〜
約７０℃の範囲内にある温度に冷却する。変性鎖の冷却
に要する時間は、ＰＣＲ方法に使用される機器の型によ
り異なる。変性鎖を冷却した後、ＰＣＲ試薬を含有する
反応混合物を、プライマー伸長生成物の形成に適した温
度でインキュベートする。一般に、この温度は、約５０
℃以上であり、好ましくは約６５〜約７５℃の範囲にあ
る。実施態様によっては、プライミングのためにある温
度を使用し、プライマーの伸長には異なる温度を使用す
る態様もある。好ましい実施態様では、プライミングも
プライマーの伸長も同じ温度を使用する。インキュベー
ション時間は、インキュベーション温度に依存して大き
く変化し得るが、好ましい実施態様では、約１〜約１２
０秒間である。
約７０℃の範囲内にある温度に冷却する。変性鎖の冷却
に要する時間は、ＰＣＲ方法に使用される機器の型によ
り異なる。変性鎖を冷却した後、ＰＣＲ試薬を含有する
反応混合物を、プライマー伸長生成物の形成に適した温
度でインキュベートする。一般に、この温度は、約５０
℃以上であり、好ましくは約６５〜約７５℃の範囲にあ
る。実施態様によっては、プライミングのためにある温
度を使用し、プライマーの伸長には異なる温度を使用す
る態様もある。好ましい実施態様では、プライミングも
プライマーの伸長も同じ温度を使用する。インキュベー
ション時間は、インキュベーション温度に依存して大き
く変化し得るが、好ましい実施態様では、約１〜約１２
０秒間である。
【００４７】このように形成されたプライマー伸長生成
物は、ハイブリダイズした生成物のまま適当な方法で検
出してもよいし、また、一方若しくは両方の鎖を検出す
るため、又はさらにＰＣＲ法でサイクルを繰り返すため
に変性してもよい。
物は、ハイブリダイズした生成物のまま適当な方法で検
出してもよいし、また、一方若しくは両方の鎖を検出す
るため、又はさらにＰＣＲ法でサイクルを繰り返すため
に変性してもよい。
【００４８】ハイブリダイズしたプライマー伸長生成物
を変性する場合、プライマー伸長生成物を形成して変性
するＰＣＲのサイクルをさらに所望の回数遂行すること
ができる。一般に、少なくとも２０回は遂行するが、２
０〜５０回が好ましい。アッセイの最終時に変性した
後、最終のプライマー伸長生成物を下記のように検出す
ることができる。
を変性する場合、プライマー伸長生成物を形成して変性
するＰＣＲのサイクルをさらに所望の回数遂行すること
ができる。一般に、少なくとも２０回は遂行するが、２
０〜５０回が好ましい。アッセイの最終時に変性した
後、最終のプライマー伸長生成物を下記のように検出す
ることができる。
【００４９】本発明の増幅方法は、反応混合物の温度サ
イクルが所望の所定時間について制御されるよう、連続
的に自動化された方式で実施されることが好ましい。こ
のために開発された装置がいくつかあり、当業者であれ
ば知っている。この目的の装置の一つが、米国特許第
４，９６５，１８８号及び欧州特許出願公開第０２３６
０６９号に詳細に記載されており、ある温度環境から別
の環境へ制御された条件下で液体を移送する工程が含ま
れる。
イクルが所望の所定時間について制御されるよう、連続
的に自動化された方式で実施されることが好ましい。こ
のために開発された装置がいくつかあり、当業者であれ
ば知っている。この目的の装置の一つが、米国特許第
４，９６５，１８８号及び欧州特許出願公開第０２３６
０６９号に詳細に記載されており、ある温度環境から別
の環境へ制御された条件下で液体を移送する工程が含ま
れる。
【００５０】別の装置に、液体を取り扱うシステムを含
まない温度サイクリングを利用するものがあり、米国特
許第４，９６５，１８８号及び欧州特許出願公開第０２
３６０６９号に詳細に記載されている。一般に、この装
置は、反応混合物を含有する多数の反応チューブを保持
する伝熱性容器と、加熱手段と、冷却及び温度維持手段
と、増幅の序列、温度変化及びタイミングを制御するた
めの信号を発生する計算手段とを含む。
まない温度サイクリングを利用するものがあり、米国特
許第４，９６５，１８８号及び欧州特許出願公開第０２
３６０６９号に詳細に記載されている。一般に、この装
置は、反応混合物を含有する多数の反応チューブを保持
する伝熱性容器と、加熱手段と、冷却及び温度維持手段
と、増幅の序列、温度変化及びタイミングを制御するた
めの信号を発生する計算手段とを含む。
【００５１】例えば、Hoffman らのBiotechniques, 6(1
0), pp. 932-936 (1988)に記載されているように、増幅
にはガスクロマトグラフも使用されており、さらに、
「ティーカップ」における増幅が簡単且つ安価な技法と
して記載されている〔Innis ら(編) 、PCR Protocols:
A Guide to Methods and Applications, Chapter 51,p
p. 429-434, Robert Watson, Academic Press, Inc., 1
990〕。
0), pp. 932-936 (1988)に記載されているように、増幅
にはガスクロマトグラフも使用されており、さらに、
「ティーカップ」における増幅が簡単且つ安価な技法と
して記載されている〔Innis ら(編) 、PCR Protocols:
A Guide to Methods and Applications, Chapter 51,p
p. 429-434, Robert Watson, Academic Press, Inc., 1
990〕。
【００５２】使い捨て可能な化学試験パックで増幅反応
を行うのに好適な装置が、欧州特許出願公開第０４０２
９９４号（１９９０年１２月１９日発行）に詳細に記載
されている。一般に、この装置は、化学試験パックを支
持するための表面と、該試験パック内の隣接チャンバー
間で流体を移動させるために反応パックに作用する、該
表面の上方で支持された圧力アプリケータと、試験パッ
クを差し渡す移動範囲で圧力アプリケータを作動させる
ための手段とを含む。
を行うのに好適な装置が、欧州特許出願公開第０４０２
９９４号（１９９０年１２月１９日発行）に詳細に記載
されている。一般に、この装置は、化学試験パックを支
持するための表面と、該試験パック内の隣接チャンバー
間で流体を移動させるために反応パックに作用する、該
表面の上方で支持された圧力アプリケータと、試験パッ
クを差し渡す移動範囲で圧力アプリケータを作動させる
ための手段とを含む。
【００５３】欧州特許出願公開第０４０２９９４号は、
それに記載された装置を用いて処理することができる有
用な化学試験パックについて詳細に記載している。ま
た、同刊行物には、本発明の方法に適した、繰り返し間
隔を置いて（すなわち、サイクル化して）試験パックを
加熱、冷却するための手段も記載されている。既述のよ
うに、これらの装置及び試験パックは本発明を実施する
上で好ましいものではあるが、本明細書に記載した有益
な結果を得るのにこれらが不可欠であるとは考えられな
い。
それに記載された装置を用いて処理することができる有
用な化学試験パックについて詳細に記載している。ま
た、同刊行物には、本発明の方法に適した、繰り返し間
隔を置いて（すなわち、サイクル化して）試験パックを
加熱、冷却するための手段も記載されている。既述のよ
うに、これらの装置及び試験パックは本発明を実施する
上で好ましいものではあるが、本明細書に記載した有益
な結果を得るのにこれらが不可欠であるとは考えられな
い。
【００５４】本発明の方法は適当な容器の中で行うこと
も有用である。最も簡素な容器は試験管、キュベット、
フラスコ又はビーカーであろうが、該方法を実施するた
めの自動化工程を促進するために、より複雑で巧妙な容
器が開発されている（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ
９１／１２３４２号を参照のこと）。例えば、該方法を
実施する際に特定の温度特性を提供するように構成され
たキュベット及び化学試験パック（パウチとしても知ら
れている）が、米国特許第４，９０２，６２４号（Colu
mbusら）及び欧州特許出願公開第０３８１５０１号（１
９９０年８月８日発行）に記載されている。このような
試験パックは、増幅又は検出方法における各種段階で有
用な各種試薬、緩衝液その他材料を有する複数の反応チ
ャンバーを含む。該パックは、本発明の増幅法の各種工
程を促進するために適切且つ迅速に加熱及び冷却を繰り
返すことができる。その他の有用な容器を、本発明の方
法の自動化用途又は使い捨て用途のために適当に開発す
ることもできる。
も有用である。最も簡素な容器は試験管、キュベット、
フラスコ又はビーカーであろうが、該方法を実施するた
めの自動化工程を促進するために、より複雑で巧妙な容
器が開発されている（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ
９１／１２３４２号を参照のこと）。例えば、該方法を
実施する際に特定の温度特性を提供するように構成され
たキュベット及び化学試験パック（パウチとしても知ら
れている）が、米国特許第４，９０２，６２４号（Colu
mbusら）及び欧州特許出願公開第０３８１５０１号（１
９９０年８月８日発行）に記載されている。このような
試験パックは、増幅又は検出方法における各種段階で有
用な各種試薬、緩衝液その他材料を有する複数の反応チ
ャンバーを含む。該パックは、本発明の増幅法の各種工
程を促進するために適切且つ迅速に加熱及び冷却を繰り
返すことができる。その他の有用な容器を、本発明の方
法の自動化用途又は使い捨て用途のために適当に開発す
ることもできる。
【００５５】増幅生成物を検出するため、これを反応媒
体中の他の物質から分離することが有用である場合が多
い（しかし、必要ではない）。これはいくつかの方法で
行われるが、好ましくは、該方法で複製されたプライマ
ー伸長生成物が水に不溶化して反応混合物から分離され
るように水不溶性捕捉プローブを使用することにより行
われる。プローブは適当な方法で不溶性材料に結合され
ることができる。
体中の他の物質から分離することが有用である場合が多
い（しかし、必要ではない）。これはいくつかの方法で
行われるが、好ましくは、該方法で複製されたプライマ
ー伸長生成物が水に不溶化して反応混合物から分離され
るように水不溶性捕捉プローブを使用することにより行
われる。プローブは適当な方法で不溶性材料に結合され
ることができる。
【００５６】増幅生成物は、これに相補的なオリゴヌク
レオチドを使用することにより、望ましくない物質から
分離することができる。このオリゴヌクレオチドは、捕
捉プローブを形成するための周知の結合技法により不溶
性支持体（例、ポリマー粒子又は磁性粒子）に結合され
る（既述）。このような技法の一つが欧州特許出願公開
第０４３９２２２号（１９９１年９月１８日発行）に記
載されている。その他の技法が、例えば、米国特許第
４，７１３，３２６号（Dattaguptaら) 、国際特許出願
公開第ＷＯ８８／０１３０２号（１９８８年２月２５日
発行）及び欧州特許公報第００７０６８７号（１９８３
年１月２６日発行）に記載されており、この技法による
と、捕捉オリゴヌクレオチドと増幅核酸が結合する多成
分のハイブリダイズ生成物において中間体オリゴヌクレ
オチドが用いられる。分離は、遠心分離法又は混合物を
磁場に置く方法によって行うことができる。
レオチドを使用することにより、望ましくない物質から
分離することができる。このオリゴヌクレオチドは、捕
捉プローブを形成するための周知の結合技法により不溶
性支持体（例、ポリマー粒子又は磁性粒子）に結合され
る（既述）。このような技法の一つが欧州特許出願公開
第０４３９２２２号（１９９１年９月１８日発行）に記
載されている。その他の技法が、例えば、米国特許第
４，７１３，３２６号（Dattaguptaら) 、国際特許出願
公開第ＷＯ８８／０１３０２号（１９８８年２月２５日
発行）及び欧州特許公報第００７０６８７号（１９８３
年１月２６日発行）に記載されており、この技法による
と、捕捉オリゴヌクレオチドと増幅核酸が結合する多成
分のハイブリダイズ生成物において中間体オリゴヌクレ
オチドが用いられる。分離は、遠心分離法又は混合物を
磁場に置く方法によって行うことができる。
【００５７】その他の有用な分離手段として、Pall社よ
り市販されているポリアミド膜（例、 LOPRODYNE（商
標）又は BIODYNE（商標）膜）のような微孔質濾過膜が
ある。これらは、コーティングすることなく使用しても
よいし、また分析工程を促進する界面活性剤その他材料
で予備コーティングしたものを使用してもよい。
り市販されているポリアミド膜（例、 LOPRODYNE（商
標）又は BIODYNE（商標）膜）のような微孔質濾過膜が
ある。これらは、コーティングすることなく使用しても
よいし、また分析工程を促進する界面活性剤その他材料
で予備コーティングしたものを使用してもよい。
【００５８】これらの膜は、アッセイの別の工程を実施
するための適当な容器と共に独立した支持体として使用
することができる。これらは、使い捨て可能な試験装置
の一部として取り付けることができる。当該技術分野で
は各種の使い捨て可能な試験装置が知られており、米国
特許第３，８２５，４１０号（Bagshawe）、同第３，８
８８，６２９号（Bagshawe）、同第３，９７０，４２９
号（Updike）及び同第４，４４６，２３２号（Liotta）
に記載されているものが含まれる。特に有用な装置が米
国特許第４，９２１，６７７号（Hinckleyら）に記載さ
れており、そして Eastman Kodak社よりSURESELL（商
標）試験装置として市販されている。
するための適当な容器と共に独立した支持体として使用
することができる。これらは、使い捨て可能な試験装置
の一部として取り付けることができる。当該技術分野で
は各種の使い捨て可能な試験装置が知られており、米国
特許第３，８２５，４１０号（Bagshawe）、同第３，８
８８，６２９号（Bagshawe）、同第３，９７０，４２９
号（Updike）及び同第４，４４６，２３２号（Liotta）
に記載されているものが含まれる。特に有用な装置が米
国特許第４，９２１，６７７号（Hinckleyら）に記載さ
れており、そして Eastman Kodak社よりSURESELL（商
標）試験装置として市販されている。
【００５９】検出用の水不溶性生成物の分離には、マイ
クロタイタープレート、試験管、ビーカー、ビーズ、フ
ィルム、メンブランフィルター、濾紙、ゲル、磁性粒子
又はガラスウールをはじめとする有用ないずれの固体支
持体でも使用することができる。それは、ガラス、セラ
ミックス、金属、天然又は合成ポリマー、セルロース系
材料、フィルター材料、その他当業者であれば容易に想
到し得る材料をはじめとする多様な材料から製造するこ
とができる。特に有用な固体支持体の材料は、平均粒径
が一般に約０．１〜約１０μｍのポリマービーズであ
る。
クロタイタープレート、試験管、ビーカー、ビーズ、フ
ィルム、メンブランフィルター、濾紙、ゲル、磁性粒子
又はガラスウールをはじめとする有用ないずれの固体支
持体でも使用することができる。それは、ガラス、セラ
ミックス、金属、天然又は合成ポリマー、セルロース系
材料、フィルター材料、その他当業者であれば容易に想
到し得る材料をはじめとする多様な材料から製造するこ
とができる。特に有用な固体支持体の材料は、平均粒径
が一般に約０．１〜約１０μｍのポリマービーズであ
る。
【００６０】検出は、捕捉プローブを、平らな支持体、
例えば、上記の微孔質濾過膜、又は薄いポリマーフィル
ム、フィルムラミネート、非コーティング紙若しくはポ
リマーコーティング紙の上に固定化することにより実施
することもでき、これらのいくつかについては当該技術
分野で知られている。このような材料に関しては欧州特
許出願公開第０４０８７３８号（１９９１年１月２３日
発行）に詳細に記載されている。
例えば、上記の微孔質濾過膜、又は薄いポリマーフィル
ム、フィルムラミネート、非コーティング紙若しくはポ
リマーコーティング紙の上に固定化することにより実施
することもでき、これらのいくつかについては当該技術
分野で知られている。このような材料に関しては欧州特
許出願公開第０４０８７３８号（１９９１年１月２３日
発行）に詳細に記載されている。
【００６１】本発明の増幅方法を遂行するために必要な
試薬、材料及び指示は、試験キットの中で供給すること
ができる。塩化アンモニウム及びカルボン酸又は金属カ
ルボキシレート、プライマー、ＰＣＲ試薬、試験装置
（又は試験パック）、その他該方法に一般に必要な材料
について、別々の包装又は容器を使用してもよい。好ま
しくは、試験キットは、塩化アンモニウム及びカルボン
酸又は金属カルボキシレートの混合物、必要なすべての
ＰＣＲ試薬、並びに反応を行うための適当な容器又は試
験パックを含む。
試薬、材料及び指示は、試験キットの中で供給すること
ができる。塩化アンモニウム及びカルボン酸又は金属カ
ルボキシレート、プライマー、ＰＣＲ試薬、試験装置
（又は試験パック）、その他該方法に一般に必要な材料
について、別々の包装又は容器を使用してもよい。好ま
しくは、試験キットは、塩化アンモニウム及びカルボン
酸又は金属カルボキシレートの混合物、必要なすべての
ＰＣＲ試薬、並びに反応を行うための適当な容器又は試
験パックを含む。
【００６２】
【実施例】本発明の実施を説明するために、以下の実施
例を含めるが、これらは本発明の限定を意味するもので
はない。特に断らないかぎり、パーセントは重量％を表
す。 実施例１：全血試料の調製 この実施例は、下記の赤血球溶解液調製物及び手順を使
用して全血試料中の赤血球その他の物質から白血球を分
離した後に得られた白血球の数を比較するものである。
例を含めるが、これらは本発明の限定を意味するもので
はない。特に断らないかぎり、パーセントは重量％を表
す。 実施例１：全血試料の調製 この実施例は、下記の赤血球溶解液調製物及び手順を使
用して全血試料中の赤血球その他の物質から白血球を分
離した後に得られた白血球の数を比較するものである。
【００６３】ヘパリンを含む全血試料を異なる４つのド
ナーから得た。各試料のアリコート（０．５ｍＭ）を、
１．５ｍＬの微小遠心分離管の中で、１０ｍＭの重炭酸
ナトリウムと、 Ａ．１６０ｍＭの塩化アンモニウム（１６０ＡＣ）、又
は Ｂ．１６０ｍＭの塩化アンモニウム及び０．０１重量％
の酢酸（１６０ＡＣ／ＡＡ）、又は Ｃ．８０ｍＭの塩化アンモニウム（８０ＡＣ）、又は Ｄ．８０ｍＭの塩化アンモニウム及び０．０１重量％の
酢酸（８０ＡＣ／ＡＡ）とを含有する溶解液（ｐＨ＝
７．２）の１ｍＬと混合した。
ナーから得た。各試料のアリコート（０．５ｍＭ）を、
１．５ｍＬの微小遠心分離管の中で、１０ｍＭの重炭酸
ナトリウムと、 Ａ．１６０ｍＭの塩化アンモニウム（１６０ＡＣ）、又
は Ｂ．１６０ｍＭの塩化アンモニウム及び０．０１重量％
の酢酸（１６０ＡＣ／ＡＡ）、又は Ｃ．８０ｍＭの塩化アンモニウム（８０ＡＣ）、又は Ｄ．８０ｍＭの塩化アンモニウム及び０．０１重量％の
酢酸（８０ＡＣ／ＡＡ）とを含有する溶解液（ｐＨ＝
７．２）の１ｍＬと混合した。
【００６４】上記溶液中に試料を含有する微小遠心分離
管を、自動ロッカーにより室温で５分間穏やかに混合し
た。次いで、その管を室温で３０００ｒｐｍ、５分間の
遠心分離にかけた。溶解した赤血球、可溶性成分その他
の物質を含有する上清液を廃棄した。白血球を含むペレ
ットを、最初に試料を混合した溶液と同じ新鮮な溶解液
の中で再懸濁した。この懸濁液を再度室温で３０００ｒ
ｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。その上清液を廃棄
し、そしてそのペレットを１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝
化塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ＝７．２、Sigma Chemic
al社、製品番号 P0261）に再懸濁した。ばらばらになっ
た白血球を含有する懸濁液のアリコートを新鮮なＰＢＳ
で１：１０に希釈した。上記方法を全体で約１５分で遂
行した。
管を、自動ロッカーにより室温で５分間穏やかに混合し
た。次いで、その管を室温で３０００ｒｐｍ、５分間の
遠心分離にかけた。溶解した赤血球、可溶性成分その他
の物質を含有する上清液を廃棄した。白血球を含むペレ
ットを、最初に試料を混合した溶液と同じ新鮮な溶解液
の中で再懸濁した。この懸濁液を再度室温で３０００ｒ
ｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。その上清液を廃棄
し、そしてそのペレットを１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝
化塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ＝７．２、Sigma Chemic
al社、製品番号 P0261）に再懸濁した。ばらばらになっ
た白血球を含有する懸濁液のアリコートを新鮮なＰＢＳ
で１：１０に希釈した。上記方法を全体で約１５分で遂
行した。
【００６５】白血球の存在を顕微鏡で確認し、その細胞
数を、ヘモサイトメーターチャンバーを使用して顕微鏡
下で計数した。希釈し再懸濁した試料の各々について計
数を３回繰り返し、その平均計数値とその平均について
の標準偏差を算出した。希釈係数とヘモサイトメーター
の補正率（ヘモサイトメーターの製造業者より入手）と
を組み合わせて、ヘモサイトメーターで得られた平均計
数値を、元の試料に含まれる全血１ミリリットル当たり
の白血球数の推定値に換算した。上記各種塩化アンモニ
ウム溶液についてのこれらの推定計数値を下記表１に示
す。
数を、ヘモサイトメーターチャンバーを使用して顕微鏡
下で計数した。希釈し再懸濁した試料の各々について計
数を３回繰り返し、その平均計数値とその平均について
の標準偏差を算出した。希釈係数とヘモサイトメーター
の補正率（ヘモサイトメーターの製造業者より入手）と
を組み合わせて、ヘモサイトメーターで得られた平均計
数値を、元の試料に含まれる全血１ミリリットル当たり
の白血球数の推定値に換算した。上記各種塩化アンモニ
ウム溶液についてのこれらの推定計数値を下記表１に示
す。
【００６６】 表１ 試料 平均計数値（標準偏差） （白血球／mL）×１０-5 160AC 160AC/AA 80AC 80AC/AA １ 82 (6.7) 98 (3.2) 83 (3.5) 99 (2.7) ２ 83 (4.2) 99 (2.7) 86 (2.0) 102 (3.1) ３ 81 (3.0) 99 (2.3) 81 (0.6) 103 (1.5) ４ 82 (2.1) 99 (3.6) 82 (2.9) 102 (2.0)
【００６７】表１に示した結果は、カルボン酸である酢
酸が存在した場合には、元の試料から回収される白血球
が顕著に増加したことを示しており、好ましい実施態様
（８０ＡＣ／ＡＡ）では回収量が最大となった。このこ
とは、細胞集団中に標的核酸が非常に低い力価で存在し
得る場合には特に有利である。
酸が存在した場合には、元の試料から回収される白血球
が顕著に増加したことを示しており、好ましい実施態様
（８０ＡＣ／ＡＡ）では回収量が最大となった。このこ
とは、細胞集団中に標的核酸が非常に低い力価で存在し
得る場合には特に有利である。
【００６８】実施例２：標的核酸を単離し、増幅し、そ
して検出するための方法 この実施例は、実施例１に記載した白血球細胞を単離す
るための方法を使用して白血球から解放されたＨＩＶ−
１ ＤＮＡを増幅して検出する方法を例示するものであ
る。この実施例では以下の材料及び方法を使用した。
して検出するための方法 この実施例は、実施例１に記載した白血球細胞を単離す
るための方法を使用して白血球から解放されたＨＩＶ−
１ ＤＮＡを増幅して検出する方法を例示するものであ
る。この実施例では以下の材料及び方法を使用した。
【００６９】この実施例では以下の配列を有するプライ
マーを使用した。以下のプライマーはいずれもＨＩＶ−
１ ＤＮＡのｇａｇ領域に対して相補的である。 配列番号：１： 5'-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT
-3' 配列番号：２： 5'-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC
-3' プライマー中、Ｘは、米国特許第４，９６２，０２９号
（Levensonら）に記載されている技法で２個のアミノテ
トラエチレングリコールのスペーサー基を介してオリゴ
ヌクレオチドに添付されたビオチニル部分（DuPont社、
ビオチンホスホルアミダイト試薬より誘導）を表す。
マーを使用した。以下のプライマーはいずれもＨＩＶ−
１ ＤＮＡのｇａｇ領域に対して相補的である。 配列番号：１： 5'-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT
-3' 配列番号：２： 5'-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC
-3' プライマー中、Ｘは、米国特許第４，９６２，０２９号
（Levensonら）に記載されている技法で２個のアミノテ
トラエチレングリコールのスペーサー基を介してオリゴ
ヌクレオチドに添付されたビオチニル部分（DuPont社、
ビオチンホスホルアミダイト試薬より誘導）を表す。
【００７０】この実施例では以下の配列を有する捕捉プ
ローブを使用した。 配列番号：３： 5'-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG
TATAGCCCTA C-Y-3' Ｙは、米国特許第４，９１４，２１０号（Levensonら）
の教示により１個のアミンジオール結合基に接続された
２個のテトラエチレングリコールのスペーサーを表す。
ローブを使用した。 配列番号：３： 5'-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG
TATAGCCCTA C-Y-3' Ｙは、米国特許第４，９１４，２１０号（Levensonら）
の教示により１個のアミンジオール結合基に接続された
２個のテトラエチレングリコールのスペーサーを表す。
【００７１】これらプライマー及び捕捉プローブは、Ap
plied Biosystems Model 380B （３本カラム式ＤＮＡ合
成機、標準ホスホルアミダイト法、規模ABI １μモル、
迅速サイクルプロトコル）を用い、公知の出発物質及び
方法で調製した。ヌクレオシド−３’−ホスホルアミダ
イト及びヌクレオシド誘導体化孔径制御ガラス支持体を
Applied Biosystemsから入手した。すべての精製は、核
酸精製カラムを用いた後、逆相ＨＰＬＣ技法を使用して
行った。
plied Biosystems Model 380B （３本カラム式ＤＮＡ合
成機、標準ホスホルアミダイト法、規模ABI １μモル、
迅速サイクルプロトコル）を用い、公知の出発物質及び
方法で調製した。ヌクレオシド−３’−ホスホルアミダ
イト及びヌクレオシド誘導体化孔径制御ガラス支持体を
Applied Biosystemsから入手した。すべての精製は、核
酸精製カラムを用いた後、逆相ＨＰＬＣ技法を使用して
行った。
【００７２】捕捉試薬を得るため、従来法でポリ〔スチ
レン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン
酸〕（重量比９５：５）から調製したポリマー粒子（平
均粒径１μｍ）に上記プローブを共有結合させた。この
粒子を水に含む懸濁液を２−（Ｎ−モルフォリノ）エタ
ンスルホン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６）で洗浄し、
そして固形分約１０％になるように懸濁した。洗浄後の
粒子を該緩衝液（０．１モル）で固形分３．３３％にな
るように希釈した試料（３．３ｍＬ）を、１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩
酸塩（８４ｍｇ／ｍＬ水のもの２．１ｍＬ）及びプロー
ブ（４４．４４ＯＤ／ｍＬナノ純水のもの９８３μＬ）
と混合した。得られた懸濁液を、間欠的に混合及び遠心
分離を行いながら水浴中、５０℃で約２時間加熱した。
その後、これらの粒子を、（エチレンジニトリロ）四酢
酸二ナトリウム塩（０．１ミリモル）を含有するトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１モ
ル、ｐＨ８）で３回洗浄し、そしてその中に固形分４％
になるように再懸濁した。
レン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン
酸〕（重量比９５：５）から調製したポリマー粒子（平
均粒径１μｍ）に上記プローブを共有結合させた。この
粒子を水に含む懸濁液を２−（Ｎ−モルフォリノ）エタ
ンスルホン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６）で洗浄し、
そして固形分約１０％になるように懸濁した。洗浄後の
粒子を該緩衝液（０．１モル）で固形分３．３３％にな
るように希釈した試料（３．３ｍＬ）を、１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩
酸塩（８４ｍｇ／ｍＬ水のもの２．１ｍＬ）及びプロー
ブ（４４．４４ＯＤ／ｍＬナノ純水のもの９８３μＬ）
と混合した。得られた懸濁液を、間欠的に混合及び遠心
分離を行いながら水浴中、５０℃で約２時間加熱した。
その後、これらの粒子を、（エチレンジニトリロ）四酢
酸二ナトリウム塩（０．１ミリモル）を含有するトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１モ
ル、ｐＨ８）で３回洗浄し、そしてその中に固形分４％
になるように再懸濁した。
【００７３】緩衝液で固形分０．２５％になるように希
釈して、その捕捉試薬（１．２μＬ）をSURECELL（商
標）使い捨て試験装置(Johnson & Johnson Clinical Di
agnostics 社より入手できる) のテストウェルにおいて
微孔質膜(LOPRODYNE（商標）ポリアミド膜、平均孔径５
μｍ、Pall社) に適用して乾燥した。このことは米国特
許第４，９４８，５６１号（Hinckleyら）に詳細に記載
されている。
釈して、その捕捉試薬（１．２μＬ）をSURECELL（商
標）使い捨て試験装置(Johnson & Johnson Clinical Di
agnostics 社より入手できる) のテストウェルにおいて
微孔質膜(LOPRODYNE（商標）ポリアミド膜、平均孔径５
μｍ、Pall社) に適用して乾燥した。このことは米国特
許第４，９４８，５６１号（Hinckleyら）に詳細に記載
されている。
【００７４】ＰＣＲ法は、米国特許第５，０８９，２３
３号に詳細に記載されている Johnson & Johnson Clini
cal Diagnostics 社製の自動ＰＣＲ処理装置を用い、下
記の加熱及び冷却のプロトコルで実施した。本明細書で
はこの米国特許明細書を参照することにより援用する。
サーマス・アクアティクス(Thermus aquaticus) 由来の
組換えＤＮＡポリメラーゼを従来法で得た。グリセロー
ル、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤及
びｄＮＴＰは Sigma Chemical 社から入手した。
３号に詳細に記載されている Johnson & Johnson Clini
cal Diagnostics 社製の自動ＰＣＲ処理装置を用い、下
記の加熱及び冷却のプロトコルで実施した。本明細書で
はこの米国特許明細書を参照することにより援用する。
サーマス・アクアティクス(Thermus aquaticus) 由来の
組換えＤＮＡポリメラーゼを従来法で得た。グリセロー
ル、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤及
びｄＮＴＰは Sigma Chemical 社から入手した。
【００７５】地方の病院から、ＨＩＶに対して血清陽性
(sero-positive) である患者の全血（試料番号１〜１
０）及びＨＩＶに対して血清陰性(sero-negative) であ
る患者の全血（試料番号１１及び１２）を入手した。実
施例１の溶解液Ｄを使用して、赤血球を溶解して白血球
細胞を単離するために全血を実施例１の方法により処理
した。第二の洗浄工程の後に得られた白血球細胞ペレッ
トから、白血球細胞由来のＤＮＡを抽出した。
(sero-positive) である患者の全血（試料番号１〜１
０）及びＨＩＶに対して血清陰性(sero-negative) であ
る患者の全血（試料番号１１及び１２）を入手した。実
施例１の溶解液Ｄを使用して、赤血球を溶解して白血球
細胞を単離するために全血を実施例１の方法により処理
した。第二の洗浄工程の後に得られた白血球細胞ペレッ
トから、白血球細胞由来のＤＮＡを抽出した。
【００７６】白血球細胞由来のＤＮＡを抽出は、係属中
の米国特許出願第０８／３０６，８７０号（１９９４年
９月１５日出願）に記載されているＤＮＡポリマー捕捉
法によって行った。簡単に説明すると、ペレット状の白
血球細胞に、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液、０．１５％の界面活性剤TWEEN 20
（商標）及び２５μＧ／μＬの子ウシ胸腺ＤＮＡを含有
する白血球溶解液１５０μＬを添加した。その懸濁液を
混合した後、１００℃で５分間加熱した。この懸濁液を
室温にまで冷却した後、１５０μＬのＡＣＥＳ（２−
〔（２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ〕エタン
スルホン酸）緩衝液を添加し、続いてポリマー捕捉剤の
溶液２５μＬを添加した。その混合物を激しく混合し、
次いで室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離に
かけた。その上清液を分離して廃棄した。この捕捉剤−
ＤＮＡ複合体を含有するペレットに、２０ミリモルの水
酸化ナトリウム１００μＬを添加し、次いでその混合物
を１００℃で５分間加熱してＤＮＡを解放させた。この
溶液（２５μＬ）を、さらに処理することなく、ＰＣＲ
試薬混合物中に直接導入した。
の米国特許出願第０８／３０６，８７０号（１９９４年
９月１５日出願）に記載されているＤＮＡポリマー捕捉
法によって行った。簡単に説明すると、ペレット状の白
血球細胞に、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝液、０．１５％の界面活性剤TWEEN 20
（商標）及び２５μＧ／μＬの子ウシ胸腺ＤＮＡを含有
する白血球溶解液１５０μＬを添加した。その懸濁液を
混合した後、１００℃で５分間加熱した。この懸濁液を
室温にまで冷却した後、１５０μＬのＡＣＥＳ（２−
〔（２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ〕エタン
スルホン酸）緩衝液を添加し、続いてポリマー捕捉剤の
溶液２５μＬを添加した。その混合物を激しく混合し、
次いで室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離に
かけた。その上清液を分離して廃棄した。この捕捉剤−
ＤＮＡ複合体を含有するペレットに、２０ミリモルの水
酸化ナトリウム１００μＬを添加し、次いでその混合物
を１００℃で５分間加熱してＤＮＡを解放させた。この
溶液（２５μＬ）を、さらに処理することなく、ＰＣＲ
試薬混合物中に直接導入した。
【００７７】ロイコ色素分散液は、アガロース（０．５
％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−
２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダ
ゾール系ロイコ色素（２５０μモル）、ジエチレントリ
アミン五酢酸（１００μモル）、４’−ヒドロキシアセ
トアニリド（５ミリモル）、ポリビニルピロリドン（１
１２ミリモル）及びリン酸ナトリウム、一塩基性、一水
和物（１０ミリモル）を含有した。
％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−
２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダ
ゾール系ロイコ色素（２５０μモル）、ジエチレントリ
アミン五酢酸（１００μモル）、４’−ヒドロキシアセ
トアニリド（５ミリモル）、ポリビニルピロリドン（１
１２ミリモル）及びリン酸ナトリウム、一塩基性、一水
和物（１０ミリモル）を含有した。
【００７８】この実施例で使用した接合体溶液は、市販
品（Zymed Laboratories社）の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼとストレプトアビジンの接合体（１２６μＬ／
Ｌ）、カゼイン（０．５％）及びメルチオレート（０．
５％）をリン酸緩衝化塩化ナトリウム水溶液（２４ミリ
モルのリン酸ナトリウム及び７５ミリモルの塩化ナトリ
ウム）に含有するものとした。接合体の最終濃度は３１
２ｎＧ／ｍＬであった。
品（Zymed Laboratories社）の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼとストレプトアビジンの接合体（１２６μＬ／
Ｌ）、カゼイン（０．５％）及びメルチオレート（０．
５％）をリン酸緩衝化塩化ナトリウム水溶液（２４ミリ
モルのリン酸ナトリウム及び７５ミリモルの塩化ナトリ
ウム）に含有するものとした。接合体の最終濃度は３１
２ｎＧ／ｍＬであった。
【００７９】この実施例で使用した洗浄液は、塩化ナト
リウム（３７３ミリモル）、（エチレンジニトリロ）四
酢酸二ナトリウム塩（２．５ミリモル）、デシル硫酸ナ
トリウム（３８ミリモル）及びエチル水銀チオサリチル
酸ナトリウム（２５μモル）をリン酸ナトリウム、一塩
基性一水和物緩衝液（２５ミリモル、ｐＨ７．４）に含
有するものとした。
リウム（３７３ミリモル）、（エチレンジニトリロ）四
酢酸二ナトリウム塩（２．５ミリモル）、デシル硫酸ナ
トリウム（３８ミリモル）及びエチル水銀チオサリチル
酸ナトリウム（２５μモル）をリン酸ナトリウム、一塩
基性一水和物緩衝液（２５ミリモル、ｐＨ７．４）に含
有するものとした。
【００８０】「ＴＰ４」モノクローナル抗体を反応混合
物に使用した。この抗体はサーマス・アクアティクス(T
hermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的
であり、最近特許された米国特許出願第０７／９５８，
１４４号（Scalice ら）に詳細に記載されている。本明
細書ではこれを参照することにより援用する。一般に、
MilsteinらのNature 256、pp. 495-497 、1975に記載さ
れているような従来法でＤＮＡポリメラーゼ免疫化した
マウスの免疫細胞及びハイブリドーマ細胞系統(ATCC 由
来のHB 11126又は11127)から該抗体は調製される。この
方法により、宿主動物の抗体分泌細胞をリンパ様組織
（例、脾臓）から単離し、ポリエチレングリコールの存
在下、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ネズミミエローマ細胞と融
合し、選択培地中へ希釈し、そしてマルチウェル組織培
養皿において平板培養した。７〜１４日後、抗体を含有
するハイブリドーマ細胞を収穫して従来法で精製した。
物に使用した。この抗体はサーマス・アクアティクス(T
hermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的
であり、最近特許された米国特許出願第０７／９５８，
１４４号（Scalice ら）に詳細に記載されている。本明
細書ではこれを参照することにより援用する。一般に、
MilsteinらのNature 256、pp. 495-497 、1975に記載さ
れているような従来法でＤＮＡポリメラーゼ免疫化した
マウスの免疫細胞及びハイブリドーマ細胞系統(ATCC 由
来のHB 11126又は11127)から該抗体は調製される。この
方法により、宿主動物の抗体分泌細胞をリンパ様組織
（例、脾臓）から単離し、ポリエチレングリコールの存
在下、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ネズミミエローマ細胞と融
合し、選択培地中へ希釈し、そしてマルチウェル組織培
養皿において平板培養した。７〜１４日後、抗体を含有
するハイブリドーマ細胞を収穫して従来法で精製した。
【００８１】ポリメラーゼ連鎖反応混合物（１００μ
Ｌ）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリ
モル）、塩化マグネシウム（１０ミリモル）、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々１．５ミリ
モル）、プライマー（各々０．４μモル）、ゼラチン
（０．０１％）、上記ＤＮＡポリメラーゼ（１６単位／
１００μＬ）並びに「ＴＰ４」モノクローナル抗体（対
ＤＮＡポリメラーゼのモル比として５０：１）を含有す
るものとした。試薬及び材料の残部は、市販品を利用し
たか、或いは Johnson & Johnson Clinical Diagnostic
s 社で従来法により調製した。
Ｌ）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリ
モル）、塩化マグネシウム（１０ミリモル）、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々１．５ミリ
モル）、プライマー（各々０．４μモル）、ゼラチン
（０．０１％）、上記ＤＮＡポリメラーゼ（１６単位／
１００μＬ）並びに「ＴＰ４」モノクローナル抗体（対
ＤＮＡポリメラーゼのモル比として５０：１）を含有す
るものとした。試薬及び材料の残部は、市販品を利用し
たか、或いは Johnson & Johnson Clinical Diagnostic
s 社で従来法により調製した。
【００８２】増幅ＨＩＶ−１ ＤＮＡの検出 本発明のＰＣＲプロトコルは下記の通りとした。 増幅サイクル４０回 各サイクルは、 Ａ）９５℃で１５秒間加熱して変性する工程（第一回目
のサイクルだけは１９５秒間とした）、及び Ｂ）、Ｃ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリン
グ）及び伸長する工程
のサイクルだけは１９５秒間とした）、及び Ｂ）、Ｃ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリン
グ）及び伸長する工程
【００８３】アッセイは、上記のように、反応混合物に
おいて、１００μＬ及び２５μＬのＤＮＡ抽出混合物に
対して１６単位のＤＮＡポリメラーゼを使用して行っ
た。
おいて、１００μＬ及び２５μＬのＤＮＡ抽出混合物に
対して１６単位のＤＮＡポリメラーゼを使用して行っ
た。
【００８４】増幅生成物の検出は下記のように行った。
最終増幅反応混合物の一部（５μＬ）を、緩衝液〔トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル、
ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化マグネ
シウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１％）〕
と混合し、そして９５℃５分間インキュベートすること
により核酸を変性させた。次いで、得られた溶液をSURE
CELL（商標）試験装置に移し、増幅された標的核酸を５
０℃で捕捉プローブにハイブリダイズさせた。
最終増幅反応混合物の一部（５μＬ）を、緩衝液〔トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル、
ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化マグネ
シウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１％）〕
と混合し、そして９５℃５分間インキュベートすること
により核酸を変性させた。次いで、得られた溶液をSURE
CELL（商標）試験装置に移し、増幅された標的核酸を５
０℃で捕捉プローブにハイブリダイズさせた。
【００８５】続いて、試験装置の試験ウェルを、緩衝液
〔リン酸二水素ナトリウム（１０ミリモル）、塩化ナト
リウム（１５０ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム（１
％）及びエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル）〕（２
５０μＬ、ｐＨ７．４）によって５５℃で洗浄した。上
記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液
（５０μＬ）を各試験ウェルへ添加し、そしてその膜を
室温で透過させた。２分後、試験ウェルを２回洗浄し
た。
〔リン酸二水素ナトリウム（１０ミリモル）、塩化ナト
リウム（１５０ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム（１
％）及びエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル）〕（２
５０μＬ、ｐＨ７．４）によって５５℃で洗浄した。上
記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液
（５０μＬ）を各試験ウェルへ添加し、そしてその膜を
室温で透過させた。２分後、試験ウェルを２回洗浄し
た。
【００８６】各試験ウェルに上記ロイコ色素分散液（１
００μＬ）を添加して、その装置を室温で２分間インキ
ュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の溶液
（１００μＬ）を添加することにより発色を停止させ
た。アッセイで観測された得られた色素信号について、
濃度スケール０〜１０（最高観測濃度は１０）により視
覚的に等級分けを行った。アッセイの結果を下記表２に
示す。
００μＬ）を添加して、その装置を室温で２分間インキ
ュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の溶液
（１００μＬ）を添加することにより発色を停止させ
た。アッセイで観測された得られた色素信号について、
濃度スケール０〜１０（最高観測濃度は１０）により視
覚的に等級分けを行った。アッセイの結果を下記表２に
示す。
【００８７】表２ 本発明の方法により患者の全血から単離された白血球由
来のＤＮＡを増幅した結果。ＨＩＶ−１生成物の検出
来のＤＮＡを増幅した結果。ＨＩＶ−１生成物の検出
【００８８】内部標準を基準とした色評点が２．０以下
のものは、バックグラウンドレベルの信号を表す。この
色評点は、ＰＣＲが明らかに行われており、標的ＨＩＶ
−１由来のＤＮＡが増幅されて検出されたことを示唆し
ている。
のものは、バックグラウンドレベルの信号を表す。この
色評点は、ＰＣＲが明らかに行われており、標的ＨＩＶ
−１由来のＤＮＡが増幅されて検出されたことを示唆し
ている。
【００８９】本発明をその好ましい実施態様を特に参照
しながら詳細に説明したが、本発明の精神及び範囲内で
変更や置換が可能であることを理解すべきである。本明
細書において言及した刊行物はすべてここに援用するも
のとする。
しながら詳細に説明したが、本発明の精神及び範囲内で
変更や置換が可能であることを理解すべきである。本明
細書において言及した刊行物はすべてここに援用するも
のとする。
【００９０】
（１）一般情報 （ｉ）出願人：エケゼ，トビアス イー．(Ekeze, Tobi
as E.) ケルシュナー，ジョアンヌ エイチ．(Kerschner, Joan
ne H) （ｉｉ）発明の名称：赤血球細胞を選択的に溶解するた
めの塩化アンモニウムとカルボン酸又は金属カルボキシ
レートを使用するポリメラーゼ連鎖反応のための白血球
試料の調製法 （ｉｉｉ）配列の数：３ （ｉｖ）通信用住所： （Ａ）名宛人：Johnson & Johnson （Ｂ）ストリート：One Johnson & Johnson Plaza （Ｃ）シティー：New Brunswick （Ｄ）ステート：New Jersey （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ：０８９３３ （ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ 互換性 （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース（Pate
nt In Release ）＃ １．０，バージョン＃１．２５ （ｖｉ）最新の出願データ： （Ａ）出願数： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／代理業者情報 （Ａ）氏名：オグデン，ステーシア エル．（Ogden, S
tasia L.） （Ｂ）登録番号：３６，２２８ （Ｃ）参照／ドケット番号：ＣＤＳ−９６ （ｉｘ）遠距離通信情報： （Ａ）電話：９０８−５２４−２８１９ （Ｂ）テレファックス：９０８−５２４−２８０８
as E.) ケルシュナー，ジョアンヌ エイチ．(Kerschner, Joan
ne H) （ｉｉ）発明の名称：赤血球細胞を選択的に溶解するた
めの塩化アンモニウムとカルボン酸又は金属カルボキシ
レートを使用するポリメラーゼ連鎖反応のための白血球
試料の調製法 （ｉｉｉ）配列の数：３ （ｉｖ）通信用住所： （Ａ）名宛人：Johnson & Johnson （Ｂ）ストリート：One Johnson & Johnson Plaza （Ｃ）シティー：New Brunswick （Ｄ）ステート：New Jersey （Ｅ）国：ＵＳＡ （Ｆ）ＺＩＰ：０８９３３ （ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ 互換性 （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース（Pate
nt In Release ）＃ １．０，バージョン＃１．２５ （ｖｉ）最新の出願データ： （Ａ）出願数： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人／代理業者情報 （Ａ）氏名：オグデン，ステーシア エル．（Ogden, S
tasia L.） （Ｂ）登録番号：３６，２２８ （Ｃ）参照／ドケット番号：ＣＤＳ−９６ （ｉｘ）遠距離通信情報： （Ａ）電話：９０８−５２４−２８１９ （Ｂ）テレファックス：９０８−５２４−２８０８
【００９１】配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ (genomic) 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：１ 他の情報：標識＝その他 注釈＝ビオチニル部分で変性された塩基 配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
【００９２】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ (genomic) 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：１ 他の情報：mod base＝その他 注釈＝ビオチニル部分で変性された塩基 配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
【００９３】配列番号：３ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ (genomic) 配列の特徴 特徴を表す記号：modified base 存在位置：４１ 他の情報：mod base＝その他 注釈＝１個のアミンジオール結合基に接続された２個の
テトラエチレングリコールのスペーサーで変性された塩
基 配列 ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C 41
テトラエチレングリコールのスペーサーで変性された塩
基 配列 ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C 41
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョアンヌ ハンセン ケルシュナー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14610, ロチェスター，クローバー ストリート 1500
Claims (23)
- 【請求項１】 （Ａ）少なくとも約５０ｍＭの塩化アン
モニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有する
カルボン酸又は金属カルボキシレート約０．００１重量
％〜約０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを
混合し、 （Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前記全
血試料から白血球のペレットを形成し、 （Ｃ）その上清を除去した後、前記白血球ペレットを前
記溶解液の新鮮な試料中で洗浄し、そして （Ｄ）前記白血球ペレットを遠心分離して単離する白血
球の選択的調製方法であって、 前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造
式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、炭素原子数２〜６のアルケニル基、炭素原
子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリ
ール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル
基を表す）で示され、 前記溶解液のｐＨは６〜８の間にあり、そして前記
（Ａ）〜（Ｄ）を約２０分以内で遂行する、白血球の選
択的調製方法。 - 【請求項２】 前記溶解液が約５０〜約１００ｍＭの塩
化アンモニウムを含有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記カルボン酸又は前記金属カルボキシ
レートが約０．００５〜０．０５重量％である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記カルボン酸が、モノハロ酢酸、ジハ
ロ酢酸、トリハロ酢酸及び酢酸から成る群より選ばれ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記カルボン酸が酢酸である、請求項４
に記載の方法。 - 【請求項６】 前記ｐＨが６．５〜７．５の間にある、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記（Ａ）〜（Ｄ）を約１０〜約１６分
以内で遂行する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記全血試料の体積が約０．０１〜約１
０ｍＬである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 遠心分離工程の各々を約１０分未満以内
で遂行する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 （１）（Ａ）少なくとも約５０ｍＭの
塩化アンモニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基
を有するカルボン酸又は金属カルボキシレート約０．０
０５重量％以上を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合
し、 （Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前記全
血試料から白血球のペレットを形成し、 （Ｃ）その上清を除去した後、前記白血球ペレットを前
記溶解液の新鮮な試料中で洗浄し、そして （Ｄ）前記白血球ペレットを遠心分離して単離する方法
であって、 前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造
式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、炭素原子数２〜６のアルケニル基、炭素原
子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリ
ール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル
基を表す）で示され、 前記溶解液のｐＨは６〜８の間にあり、そして前記
（Ａ）〜（Ｄ）を約２０分以内で遂行する方法により、
全血試料中の標的核酸を含有することが疑われる白血球
を選択的に調製する工程と、 （２）前記洗浄後のペレットの中の白血球を溶解するこ
とにより前記標的核酸を解放させる工程と、 （３）前記標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブ
リダイズし得る一組のプライマーを使用するポリメラー
ゼ連鎖反応によって、前記解放された標的核酸を増幅す
る工程と、 （４）前記増幅された標的核酸を検出する工程とを含
む、標的核酸を増幅して検出するための方法。 - 【請求項１１】 前記溶解液が約５０〜約１００ｍＭの
塩化アンモニウムを含有する、請求項１０に記載の方
法。 - 【請求項１２】 前記（Ａ）〜（Ｄ）を約１０〜約１６
分以内で遂行する、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記全血試料の体積が約０．０１〜約
１０ｍＬである、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１４】 遠心分離工程の各々を約１０分未満以
内で遂行する、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記ポリメラーゼ連鎖反応を耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼの存在下で遂行し、さらに前記プライ
マーの一方又は両方を検出のために標識する、請求項１
０に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記標識プライマーをビオチンで標識
し、さらに所定の基質の存在下で検出可能な信号を提供
し得る酵素とアビジンの接合体を使用して検出を行う、
請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 ウイルス、細菌、菌類又は原生動物の
ＲＮＡ又はＤＮＡを検出するための、請求項１０に記載
の方法。 - 【請求項１８】 連鎖球菌属(Streptococcus species)
、ミコバクテリア属(Mycobacterium species) 、ニュ
ーモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、単
純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、サイトメガロウイ
ルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、カンジダ属(Can
dida species) 又はアスペルギルス属(Aspergillus spe
cies) 由来のＲＮＡ又はＤＮＡを検出するための、請求
項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヒト結核菌
(Mycobacterium tuberculosis)、鳥結核菌(Mycobacteri
um avium) 又はサイトメガロウイルスＲＮＡ若しくはＤ
ＮＡを検出するための、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記増幅された標的核酸を、前記標識
プライマー上の前記標識に応じて比色用信号又は化学発
光信号を提供する試薬を使用して検出する、請求項１０
に記載の方法。 - 【請求項２１】 （ａ）標的核酸の対向鎖に特異的であ
り且つハイブリダイズし得る二種のプライマーであっ
て、その一方又は両方を検出部分で標識した一組のプラ
イマー、及び同一又は別の容器に入れた少なくとも一種
の他のＰＣＲ試薬、並びに（ｂ）別の容器に入れた、少
なくとも約５０ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも
一つのカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カル
ボキシレート約０．００５重量％以上を含有する溶液又
は水で再構成する場合にはその乾燥組成物であって、前
記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式： Ｒ−ＣＯＯＭ （上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭
素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換
アルキル基、炭素原子数２〜６のアルケニル基、炭素原
子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリ
ール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル
基を表す）で示され、そして前記溶解液のｐＨは６〜８
の間にある前記溶液又は乾燥組成物を含む、ポリメラー
ゼ連鎖反応用キット。 - 【請求項２２】 前記プライマーの一方又は両方がビオ
チンで標識されており、さらに前記キットが耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、マグネシウム又はマンガン塩であるコ
ファクター、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴ
Ｐを含む、請求項２１に記載のキット。 - 【請求項２３】 前記一組のプライマーが、ＨＩＶ−
１、ＨＩＶ−２、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculo
sis)、鳥結核菌(Mycobacterium avium) 又はサイトメガ
ロウイルスＲＮＡ若しくはＤＮＡの対向鎖に特異的であ
り且つハイブリダイズし得る二種のプライマーを含む、
請求項２１に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/615,848 US5702884A (en) | 1996-03-12 | 1996-03-12 | Whole blood sample preparation for polymerase chain reaction using ammonium chloride and a carboxylic acid or metal carboxylate for selective red blood cell lysis |
| US08/615848 | 1996-03-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH102898A true JPH102898A (ja) | 1998-01-06 |
| JP3715405B2 JP3715405B2 (ja) | 2005-11-09 |
Family
ID=24467058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05628997A Expired - Fee Related JP3715405B2 (ja) | 1996-03-12 | 1997-03-11 | 白血球の選択的調製方法及びポリメラーゼ連鎖反応用キット |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5702884A (ja) |
| EP (1) | EP0795751B1 (ja) |
| JP (1) | JP3715405B2 (ja) |
| AT (1) | ATE250226T1 (ja) |
| CA (1) | CA2199337C (ja) |
| DE (1) | DE69724857T2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004500002A (ja) * | 1998-02-02 | 2004-01-08 | ジエントラ・システムズ・インコーポレーテツド | Ｄｎａを単離するための溶出試薬、方法およびキット |
| JP2007529225A (ja) * | 2004-03-16 | 2007-10-25 | アンビオン インコーポレーティッド | 分画された血液白血球からのｒｎａの抽出のための方法および試薬 |
| JP2009517696A (ja) * | 2005-11-30 | 2009-04-30 | マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー | 病原体検出バイオセンサー |
| US8722347B2 (en) | 1997-12-09 | 2014-05-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic sensor |
| US8835127B2 (en) | 2001-02-07 | 2014-09-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic detection system |
| US9005989B2 (en) | 2001-02-07 | 2015-04-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic detection system |
| US9291549B2 (en) | 2001-02-07 | 2016-03-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Pathogen detection biosensor |
| JP5908840B2 (ja) * | 2010-09-22 | 2016-04-26 | 株式会社カネカ | 核酸の検出方法及びデバイス、キット |
| WO2021182575A1 (ja) * | 2020-03-11 | 2021-09-16 | 積水メディカル株式会社 | 白血球濃縮分離デバイス、血液採取容器及び白血球の分離方法 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU682538B2 (en) * | 1993-11-16 | 1997-10-09 | Becton Dickinson & Company | Process for lysing mycobacteria |
| DE19836559A1 (de) | 1998-08-12 | 2000-03-23 | Antigen Gmbh | Gefäß zur Entnahme von Blut |
| AU4682400A (en) * | 1999-05-04 | 2000-11-17 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Rapid and efficient capture of dna from sample without using cell lysing reagent |
| AU2001263836A1 (en) * | 2000-04-11 | 2001-10-23 | Bureco Ag | Method of nucleic acid recovery |
| US7262006B1 (en) | 2000-05-01 | 2007-08-28 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Rapid and efficient capture of DNA from sample without using cell lysing reagent |
| US20040106109A1 (en) * | 2001-10-02 | 2004-06-03 | Belly Robert T | Detection of ras mutations |
| DE60215226T2 (de) * | 2002-02-15 | 2007-08-23 | Gentra Systems Inc., Minneapolis | Methode für die isolierung von dna |
| EP2019687B1 (en) | 2006-03-29 | 2014-03-19 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| DE102011080853B4 (de) | 2011-08-11 | 2014-03-27 | Axagarius Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Isolierung von RNA aus Volblutproben |
| JP6542531B2 (ja) | 2012-02-29 | 2019-07-10 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | 陽性血液培養物から生存微生物を分離するための処方物およびプロセス |
| US10436680B2 (en) | 2013-10-15 | 2019-10-08 | Kianoosh Peyvan | Capture, disruption, and extraction apparatus and method |
| ES2913337T3 (es) * | 2013-11-05 | 2022-06-01 | Hoffmann La Roche | Uso de un reactivo para la lisis de eritrocitos, así como procedimientos y kits relacionados con el mismo |
| US9994741B2 (en) | 2015-12-13 | 2018-06-12 | International Business Machines Corporation | Enhanced adhesive materials and processes for 3D applications |
| CA3020581A1 (en) * | 2016-04-14 | 2017-10-19 | T2 Biosystems, Inc. | Methods and systems for amplification in complex samples |
| CN113755434B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-07-11 | 蓝莲(杭州)生物科技有限公司 | 一种白细胞分离液及白细胞分离方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4185964A (en) * | 1977-02-08 | 1980-01-29 | Central Laboratories of Associated Maryland Pathologists, Ltd. | Lysing reagent |
| US4407942A (en) * | 1981-01-29 | 1983-10-04 | Atomic Energy Of Canada Limited | Fluorescent detection of DNA damage |
| US4529705A (en) * | 1983-06-06 | 1985-07-16 | Coulter Electronics, Inc. | Reagent for combined diluting and lysing whole blood |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| CA2137690A1 (en) * | 1992-06-12 | 1993-12-23 | Thomas B. Ryder | Preparation of nucleic acid from blood |
| US5300635A (en) * | 1993-02-01 | 1994-04-05 | University Of Iowa Research Foundation | Quaternary amine surfactants and methods of using same in isolation of nucleic acids |
| WO1995014109A1 (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-26 | U.S. Department Of The Army | High through-put quantitative polymerase chain reaction for hiv clinical specimens |
-
1996
- 1996-03-12 US US08/615,848 patent/US5702884A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-06 CA CA002199337A patent/CA2199337C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-11 DE DE69724857T patent/DE69724857T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-11 EP EP97301597A patent/EP0795751B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-11 JP JP05628997A patent/JP3715405B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-11 AT AT97301597T patent/ATE250226T1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8722347B2 (en) | 1997-12-09 | 2014-05-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic sensor |
| JP2004500002A (ja) * | 1998-02-02 | 2004-01-08 | ジエントラ・システムズ・インコーポレーテツド | Ｄｎａを単離するための溶出試薬、方法およびキット |
| US8835127B2 (en) | 2001-02-07 | 2014-09-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic detection system |
| US9005989B2 (en) | 2001-02-07 | 2015-04-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic detection system |
| US9291549B2 (en) | 2001-02-07 | 2016-03-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Pathogen detection biosensor |
| US9494579B2 (en) | 2001-02-07 | 2016-11-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic detection system |
| JP2007529225A (ja) * | 2004-03-16 | 2007-10-25 | アンビオン インコーポレーティッド | 分画された血液白血球からのｒｎａの抽出のための方法および試薬 |
| JP2011200236A (ja) * | 2004-03-16 | 2011-10-13 | Applied Biosystems Llc | 分画された血液白血球からのｒｎａの抽出のための方法および試薬 |
| JP2009517696A (ja) * | 2005-11-30 | 2009-04-30 | マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー | 病原体検出バイオセンサー |
| JP5908840B2 (ja) * | 2010-09-22 | 2016-04-26 | 株式会社カネカ | 核酸の検出方法及びデバイス、キット |
| WO2021182575A1 (ja) * | 2020-03-11 | 2021-09-16 | 積水メディカル株式会社 | 白血球濃縮分離デバイス、血液採取容器及び白血球の分離方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5702884A (en) | 1997-12-30 |
| EP0795751A2 (en) | 1997-09-17 |
| ATE250226T1 (de) | 2003-10-15 |
| DE69724857D1 (de) | 2003-10-23 |
| EP0795751A3 (en) | 1999-07-21 |
| CA2199337C (en) | 2007-05-22 |
| DE69724857T2 (de) | 2004-07-08 |
| EP0795751B1 (en) | 2003-09-17 |
| JP3715405B2 (ja) | 2005-11-09 |
| CA2199337A1 (en) | 1997-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3715405B2 (ja) | 白血球の選択的調製方法及びポリメラーゼ連鎖反応用キット | |
| JP3727692B2 (ja) | 溶解物から核酸を得る方法及び標的核酸を増幅するための試験キット | |
| JP4354537B2 (ja) | 弱塩基性ポリマーを用いる核酸の捕捉および選択的放出方法ならびにその増幅方法 | |
| EP0592035B1 (en) | Thermostable DNA polymerase composition comprising a temperature sensitive polymerase inhibitor, diagnostic test kits and methods of use | |
| JP3802110B2 (ja) | 核酸の同時増幅方法並びにそのための組成物、試験キット及び試験装置 | |
| JP2533969B2 (ja) | タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法 | |
| US5403707A (en) | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures | |
| JP3497518B2 (ja) | 第二の捕捉オリゴヌクレオチドを用いた増幅された核酸の検出方法及び試験キット | |
| US6936415B1 (en) | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of two or more DNA's using primers having matched melting temperatures | |
| CA2065719A1 (en) | Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle | |
| JP4047395B2 (ja) | 核酸の同時増幅方法 | |
| EP0630973A2 (en) | Diagnostic compositions, elements, methods & test kits for amplification & detection of two or more DNA's using primers having matched melting temperatures | |
| JP5000794B2 (ja) | 標的核酸を増幅して検出するための方法 | |
| JP4130487B2 (ja) | 核酸の同時増幅方法 | |
| EP0586011A2 (en) | Methods for production and amplification of nucleic acids | |
| JP2012105663A (ja) | 標的核酸を増幅して検出するための方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040311 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040409 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20040712 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040720 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20041019 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20041022 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050120 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050726 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050825 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080902 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090902 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100902 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110902 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |