EP1082464A1 - Verfahren zur bestimmung von antigenen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von antigenen

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EP1082464A1
EP1082464A1 EP99923299A EP99923299A EP1082464A1 EP 1082464 A1 EP1082464 A1 EP 1082464A1 EP 99923299 A EP99923299 A EP 99923299A EP 99923299 A EP99923299 A EP 99923299A EP 1082464 A1 EP1082464 A1 EP 1082464A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
standard
antigen
ligand
determined
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99923299A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus Zimmermann
Peter Turecek
Hans-Peter Schwarz
Jürgen SIEKMANN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baxter AG
Original Assignee
Baxter AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter AG filed Critical Baxter AG
Publication of EP1082464A1 publication Critical patent/EP1082464A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Definitions

  • the invention relates to a method for determining antigens in a sample by amplifying a nucleic acid which is bound to the antigen to be determined.
  • antigens to be detected have to be determined precisely in low concentration ranges or amounts in order to obtain important information, for example on clinical pictures, biological contaminations, physiological values of selected proteins, etc.
  • Antigens are usually determined by antibody tests, for example by means of ELISA.
  • the antigen to be determined is detected by binding to an antibody specific for the antigen.
  • the level of bound antibody / antigen is then usually determined by a proven detection method, such as Radioactivity, fluorescence, staining reaction, etc., preferably using secondary antibodies.
  • a pathogen is the antigen responsible for scrapie.
  • Scrapie was first discovered in sheep about 250 years ago.
  • diseases related to scrapie have also been described in other animals and also in humans as transmissible spongiform encephalopathy (TSE, transmissible spongiform encephalopathies).
  • TSE transmissible spongiform encephalopathy
  • Prions are believed to be the cause of these diseases.
  • Prion diseases cannot be diagnosed satisfactorily with conventional antigen / antibody tests.
  • a prion protein is either not infectious, one speaks then of a PrP c , or else infectious, then one speaks of a PrP Sc .
  • the non-infectious prion protein PrP c is an ubiquitous cellular protein which, due to a change in conformation, becomes the infectious prion protein PrP Sc .
  • a proteinase K digest is usually carried out with a subsequent western blot, the infectious prion protein PrP Sc proving to be partially resistant to the proteinase K digest.
  • Korth et al. (Nature 390 (1998), 74-77) describe a process for the production of antibodies which specifically recognize either the “normal”, non-infectious prion protein or which specifically recognize the infectious prion protein.
  • the prions mostly cause progressive diseases of the central nervous system (spongiform encephalopathies), for example scrapie in sheep, Kuru, RSE in cattle as well as Creutzfeld-Jakob disease (CJD), Gerstmann-St Hurssler syndrome (GSS) and fatal familial insomnia (FFI ).
  • the prions are characterized by special physicochemical and biological properties against viruses and bacteria: high resistance to inactivation by formaldehyde, nucleases, heat, UV and ionizing rays, and are not recognizable as virions or cells in the electron microscope. They are insensitive to interferons, show no interference with viruses and, moreover, no nucleic acid has been detected to date.
  • nvCJD neuropathological features
  • prion tests such as Western blot using specific antibodies, have insufficient sensitivity to be able to determine prion protein effectively.
  • WO 97 37 227 describes an immunohistochemical test for the determination of prions in tissues. Using this method, the modified prion protein (PrP Sc ) can be determined in histological sections from infected tissue parts. However, this method is not very reliable and is particularly unsuitable for the examination of blood and blood products.
  • PCR polymerase chain reaction
  • connection molecule with bispecific binding affinity for DNA and antibodies, eg a chimeric molecule made of streptavidin for biotinylated DNA and protein A for immunoglobulin G, is used to bind a specific DNA molecule (marker) unspecifically to an antigen antibody -Binding complex, so that an antigen-antibody-linker-DNA complex is formed.
  • the bound DNA marker can now be primed in a PCR be amplified. The detection of the PCR product indicates the presence of the antigens.
  • the labeled DNA-antibody complexes are assembled in situ in the reaction mixture, which can lead to different stoichiometry in the composition and binding of the DNA. Additional steps for adding biotinylated reagents and binding proteins as well as numerous washing steps are required to remove excess reagents. The many process steps make this process complicated and time-consuming in order to be able to use it in routine analysis. Furthermore, this method is not suitable for complex mixtures of different antigens.
  • Hendrickson et al. (Nucl. Acids Res. 23 (3) (1995), 522-529) therefore describe an improved immunoassay for the simultaneous determination of different analytes.
  • the antibodies and the DNA in this case a single-stranded oligonucleotide, were activated separately and coupled directly to one another in a spontaneous reaction.
  • Hendrickson et al. describes the simultaneous detection of three different analytes by means of immuno-PCR.
  • the DNA-labeled antibodies that are bound to the corresponding antigen are amplified and determined by means of PCR.
  • the object of the present invention is therefore to provide a reliable and sensitive method for determining antigens, with which above all false-negative results can be excluded from the outset.
  • the object of the invention is achieved by a method for determining antigens by amplifying a nucleic acid (target nucleic acid) which is bound to a ligand specific for the antigens, which is characterized in that the determination is carried out in the presence of at least one internal standard .
  • antigen determinations can be monitored and controlled in an elegant manner by means of immune amplification reactions. Above all, false negative results can be reliably excluded by the method according to the invention. Furthermore, by using internal standards, it is also possible to obtain a quantitative reference value for the antigen determination in the sample, especially if more than one standard is used. In routine operation, however, it will generally not be necessary to use more than one standard, especially if the use of a standard is only intended to rule out false-negative results.
  • a nucleic acid bound to a ligand is preferably used as the standard (standard nucleic acid).
  • Standard nucleic acids which differ from the nucleic acid with which the (target) antigen is determined (target nucleic acid), at least in one detectable feature, are particularly preferably used.
  • both the standard nucleic acid and the target nucleic acid are then amplified and the amplified nucleic acids are examined.
  • examples of (gene) amplification methods are reverse transcriptase PCR (RT- PCR), the ligase chain reaction (LCR) and the nucleic acid sequence based amplification (NASBA).
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT- PCR reverse transcriptase PCR
  • LCR ligase chain reaction
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • the "Taqman assay” combines the polymerase chain reaction with hybridization of the target sequence with a labeled sample (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 88 (1991), 7276- 7280).
  • the standard nucleic acid can preferably have a length of at least 70 nucleic acids. A length of> 100 to several hundred nucleic acids is preferably selected.
  • the target nucleic acid is bound to the ligand, specific to the antigen to be determined.
  • Antibodies which are specific for the antigen to be determined are preferably used as ligands.
  • affinity ligands can also be used, e.g. Peptides that bind specifically to the antigen.
  • the standard nucleic acid usually differs from the target nucleic acid in at least one detectable feature, but is preferably amplified using the same means as primers. Standard nucleic acids that have a different size than the nucleic acid to be determined or a unique restriction interface have proven to be preferred, since the result can be evaluated by simple gel electrophoresis.
  • Preferred standards differ from the nucleic acid to be determined in 1% to 20% of their length or by at least 3, at most 50 nucleotides, a standard nucleic acid which is longer than the target nucleic acid as "plus” (“+”) Standard is referred to, and a standard nucleic acid that is smaller than the target nucleic acid is referred to as the "minus" ("-”) standard.
  • the exact sequence of the standard nucleic acid should of course be known.
  • Both the nucleic acid for the internal standard and the nucleic acid which is bound to the ligand, specifically for the antigen to be determined, can be used either as double-stranded or as single-stranded nucleic acid.
  • Single-stranded DNA with a terminal amino group is preferably selected for chemical crosslinking with the specific ligand.
  • the internal standard can also be provided as a combination of the standard nucleic acid with a ligand, specific for a standard antigen.
  • the internal standard can now either be bound directly to the specific ligand or else by means of a connecting molecule (linker) which has a DNA binding site on one side, for example streptavidin, and on the other side a specific ligand which is active against an antigen (Standard antigen), the connection between the specific ligand and the DNA is made.
  • the DNA is bound directly to the ligand by chemical binding, for example by means of affinity binding or covalent binding.
  • Peptides or monospecific antibodies can be used as ligands for the internal standard and / or for the antigen to be determined.
  • the ligands that are bound to the standard nucleic acid can also be specifically directed against the antigen to be determined in order to act competitively with the target ligands specifically for the antigen to be determined.
  • Polyspecific antibodies that recognize the standard antigen can also be used.
  • Ligands which are specific for the antigen to be determined are preferably antibodies which are suitable for the determination of modified proteins and prion proteins.
  • ligands can also be selected for other purposes specifically for the antigens to be determined, e.g. from the group of viral, bacterial or human proteins. Specific antibodies for a prion protein are preferably used in the determination of prions.
  • the primers used in the amplification can preferably contain markers which further increase the detection limit for determining the amplified nucleic acid, for example fluorescent or radioactive groups or chemical groups which can be detected using affine proteins and downstream detection reactions (for example biotin-avidin, DIG Labeling etc.), with primers with fluorescent groups being particularly preferred.
  • markers which further increase the detection limit for determining the amplified nucleic acid for example fluorescent or radioactive groups or chemical groups which can be detected using affine proteins and downstream detection reactions (for example biotin-avidin, DIG Labeling etc.), with primers with fluorescent groups being particularly preferred.
  • the detection of the amplified nucleic acids can be carried out in a wide variety of ways, but usually a step is to be provided in which the amplified standard nucleic acid is separated from the amplified target nucleic acid and the separated nucleic acids are determined separately.
  • This separation step preferably consists of a gel electrophoresis or a chromatographic process.
  • Antigens that can be determined by the method according to the invention include antigens from biological samples from mammals, such as body fluids, e.g. Plasma, blood, blood cells and serum, tissue, but also antigens from eukaryotic cell cultures.
  • antigens of pathogens or marker antigens for pathogens are preferably determined. These antigens include viral antigens, bacterial antigens and, in particular, antigens for which no routine detection method has hitherto been available, such as modified ones
  • modified proteins such as prions, which are associated with infectious diseases of the central nervous system, such as CJD and BSE, or other pathogens of TSE.
  • modified proteins can be obtained by induced conformational changes.
  • This conformational change on proteins, such as possibly recombinant PrPc can be brought about by previous incubation with infectious molecules (such as PrPSc), which then e.g. can be detected by radioactive markers.
  • infectious molecules such as PrPSc
  • one or more of the antigens of human pathogens are determined.
  • the antigens to be determined can be in a purified protein-containing preparation, for example a plasma fraction, a preparation of a purified nigen plasma protein, or a biological drug. However, they can also be reliably determined in plasma pools or other complex mixtures or in the biological samples mentioned. Quality assurance as described in W096 / 35437 can also be carried out appropriately adapted with the method according to the invention.
  • the corresponding internal standard can be added before sample preparation, during all intermediate stages or only immediately before the amplification reaction.
  • the standard is added from the start as an unbound nucleic acid or as a bound nucleic acid after the immune complex formation.
  • two (or more) different nucleic acids can be added as an internal standard.
  • the internal standard is preferably used in a concentration just above the detection limit.
  • the antigen that is bound (recognized) by the internal standard can be added to the sample to be determined (e.g. the antigen determination approach), or it can already be present in the sample in a natural way (a priori).
  • the results obtained with the method according to the invention can usually be interpreted as follows: i) no detection of the internal standard (e.g. no visible band): the determination has e.g. does not work due to the amplification reaction (e.g. the PCR); this can rule out false negative results. ii) only the internal standard is detectable (e.g. only the standard band is visible): the determination including the amplification reaction (e.g. the PCR) worked, the sample is negative; iii) Standard and sample nucleic acids are detectable (e.g. both bands are visible): positive sample.
  • Suitable reaction vessels for immuno-PCR should preferably have a good protein binding capacity for immobilizing the Own proteins.
  • the tubes for the PCR must also be thermostable.
  • Polystyrene is the most suitable material in terms of protein binding, but no such PCR-compatible plates have been sold commercially until now. According to the invention, however, polycarbonate sheets can be used as replacements. It is also conceivable to use chemically modified materials for the covalent binding of proteins or materials already coated with antibodies.
  • the plates are preferably coated overnight at 4 ° C. Higher temperatures of up to 37 ° C. with a shorter incubation time are also possible.
  • PBS saline solution buffered in phosphate
  • any other common buffer e.g. Polycarbonate buffer.
  • the blocking can be carried out, for example, with PBS / 1% BSA (bovine serum albumin). Any other suitable reagent, e.g. Milk powder or pre-made blocking reagents can be used.
  • BSA bovine serum albumin
  • Incubation with the ligand / DNA complex preferably takes place for half an hour at room temperature, but other time periods (preferably 5 minutes to 2 hours) and other temperatures (preferably 4 ° to 37 ° C.) are also possible.
  • Example 1 The optimal reaction conditions for the PCR are described in Example 1. A large number of changes are of course possible (in particular changes in the number of cycles, incubation times, temperature profile, use of different polymerases, amplification systems, primer strategies, etc.).
  • the optimal conditions can, e.g. the protocol used in the examples is not optimal, for the individual antigens to be determined are readily determined by the person skilled in the art in the present field.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the method according to the invention for checking and Quality assurance of biological preparations.
  • the safety, in particular the virus safety, of stable blood products depends in principle on the extent of the contamination of pathogens, in particular on the virus contamination of the starting material, on the depletion capacity of the process and on the specific virus inactivation stages in the course of the manufacturing process.
  • An important criterion of quality assurance is therefore to exclude positive starting material from processing into pharmaceutical drugs.
  • new quality criteria can be determined for biological products which are defined by an extremely low defined or missing content of contaminating antigens.
  • Another aspect of the invention is a reagent for use in the method of the invention, which a) a reactant bound to a ligand that is specific for the antigen to be determined, and b) a reactant as an internal standard that is different from the reactant differs from a) in the reaction, contains.
  • nucleic acids or enzymes can be used as reactants in order, for example, to obtain a controlled enzyme reaction.
  • nucleic acids are used as reactants, which have a detectable feature, e.g. differ in length.
  • the target nucleic acid is preferably bound to an antibody which is specific for the modified protein.
  • the standard nucleic acid is bound to a ligand that, especially on a ligand that is already bound to a standard antigen.
  • the standard antigen can be the same as the antigen to be determined (competitive immune reaction).
  • the standard nucleic acid in the reagent according to the invention is preferably bound to a ligand which is specific for an antigen different from the antigen to be determined (target antigen).
  • the ligand / DNA complexes can be stored at -20 ° C. or 4 ° C. in a suitable buffer, preferably PBS. They are then stable for several months.
  • This preparation corresponds to a commercial form.
  • the optimal concentration at which the complexes are used is approximately 10,000 to approximately 1,000,000 copies per well of a microtiter plate. Preferably, fewer than 1 million copies are used to avoid non-specific binding in the wells.
  • Conventional formulation reagents such as albumin as carrier protein, surfactants, etc. can be used to prepare the reagent according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of the method according to the invention for the quantification of antigens, in particular for the quantification of pathogens in mammalian samples or of human pathogens in biological medicinal products.
  • Fig. 1 shows the schematic representation of the IMMUNO-PCR with internal standard.
  • a microtiter plate is coated with an antibody specific for a standard antigen and an antibody specific for the antigen to be determined. From these The standard antigen and the antigen to be determined are bound to the body. The ligands are then bound to the antigens.
  • Example 1 Add a DNA standard to the PCR
  • the PCR part of the immuno-PCR was checked according to the invention for false negative reactions by adding a standard nucleic acid which differs in length from the nucleic acid of the antibody / nucleic acid conjugate specific to an antigen.
  • a cellular (non-infectious) prion protein (PrP c ) is used as the antigen.
  • This prion protein is not in a purified form, but is in a homogenate which is obtained from a mouse brain.
  • the brain was homogenized in a buffer (0.1 g / ml) consisting of a 0.32 M cane sugar solution, 0.5% deoxycholate and 0.5% NP-40. After a centrifugation step (15 min at 4500 rpm) the pellet was discarded and then the amount of protein in the supernatant was determined.
  • the PCR solution (50 ⁇ l) contained 1 U of the polymerase AmpliTaq Gold TM (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA), 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl 2 , 0.001% gelatin, 200 ⁇ M of each dNTP and 500 ng each of the corresponding primers IP1 / IP2 (see Table 1).
  • the samples were overlaid with 50 ⁇ l of mineral oil and initially incubated for 14 min at 94 ° C. to activate the polymerase.
  • samples 1-6 1000 copies of the standard nucleic acid IPOS1 were added, in samples 7-12, 100 copies of IPOS1 were added. Coating was carried out with either 8 or 0.8 ⁇ g homogenate.
  • a standard nucleic acid is not added to the PCR, but a marker antigen is added at the beginning of the experiment as an internal standard in an amount that can still be determined at the same time put the specific antigen on the appropriate wells of a microtiter plate and incubate overnight at 4 ° C. This ensures that all disruptive influences that could lead to a false negative reaction (this also includes, for example, the inadvertent failure to coat a recess) are also checked.
  • incubation is then carried out simultaneously with a corresponding standard antibody / DNA complex and subsequently amplified with the same pair of primers.
  • the wells of the microtiter plate must be coated accordingly with an antibody for the antigen to be detected and an antibody for the standard antigen.
  • the standard antigen may also occur naturally, such as certain proteins (e.g. Protein C) when using biological fluids such as e.g. Plasma.
  • An antibody / DNA conjugate was produced by covalently binding an oligonucleotide to a monoclonal anti-prion antibody in accordance with Hendricksson et al.
  • An amino-modified reporter oligonucleotide IPl, manufactured by Metabion, Martinsried, Germany
  • the monoclonal anti-prion antibody 6H4 (Prionix, Basel, Switzerland) were used as the starting material for producing the conjugate.
  • Step 1 preparation of the acetylthioacetyl-derivatized DNA
  • the acetylthioacetyl-derivatized DNA is prepared by reaction with succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA reagent / Pierce, Rockford, IL, USA).
  • each 20 ⁇ l of a solution of the IPOl oligonucleotide in H 2 0 was 2.3 ⁇ l of a sodium carbonate buffer (300 mM, pH 9.0) and a solution of 115 mM SATA placed in DMF and incubated for 30 minutes at room temperature with gentle shaking.
  • the mixture was then buffered over a HiTrap TM column (1.6 ⁇ 2.5 cm, Sephadex G-25 superfine / Pharmacia, Uppsala, Sweden) using an FPLC system (from Pharmacia).
  • Step 3 preparation and purification of the DNA-antibody conjugate
  • the derivatives prepared in step 1 and step 2 were combined (in each case approximately 1.5 ml of solution of the acetylthioacetyl-derivatized DNA or of the maleimide-modified antibody).
  • the coupling reaction had started by adding 2 ⁇ l of a 1 M aqueous hydroxylamine hydrochloride solution, pH 7.0, containing 50 mM EDTA, the mixture was incubated for 2 hours at room temperature with the exclusion of light and gentle shaking. The reaction was then stopped by adding 2 .mu.l of a 10 mM solution of N-ethylmaleimide (from Pierce) in DMF.
  • the reaction mixture was concentrated using a Centricon 3 concentrator (Amicon, Beverly, MA, USA) by centrifugation at 7000 xg.
  • the concentrated reaction mixture (approx. 500 ⁇ l) was then purified by gel filtration using the Pharmacia FPLC system (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
  • fractions at the elution maximum were collected and used for immuno-PCR in various dilutions.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe durch Amplifizieren einer Nukleinsäure, die an einen für die Antigene spezifischen Liganden gebunden ist, wobei die Bestimmung in Anwesenheit mindestens eines internen Standards durchgeführt wird.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Antigenen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe durch Amplifizieren einer Nukleinsäure, die an das zu bestimmende Antigen gebunden wird.
Die Detektion von spezifischen Antigenen ist vor allem in niedrigen Konzentrationsbereichen schwierig. Oft müssen aber die zu detektierenden Antigene gerade in niedrigen Konzentrationsberei- chen oder Mengen bestimmt werden, um wichtige Aussagen, beispielsweise zu Krankheitsbilder, biologischen Kontaminationen, physiologischen Werten von ausgewählten Proteinen, etc., zu erhalten.
Antigene werden üblicherweise durch Antikörpertests, beispielsweise mittels ELISA, bestimmt. Dabei wird das zu bestimmende Antigen durch Bindung an einen für das Antigen spezifischen Antikörper detektiert. Das Ausmaß an gebundenem Antikörper/Antigen wird dann üblicherweise durch eine bewährte Nachweismethode, wie z.B. Radioaktivität, Fluoreszenz, Färbungsreaktion, etc., vorzugsweise unter Verwendung von sekundären Antikörpern, bestimmt.
Jedoch haben sogar die empfindlichsten ELISA-Tests, z.B. solche, die mit radioaktiven Nachweismethoden durchgeführt werden, eine Nachweisgrenze, die in manchen Fällen um Zehnerpotenzen zu hoch ist, um ein brauchbares Ergebnis zu liefern. Weiters gibt es Proteine oder Pathogene, die mit herkömmlichen Antikörper/Anti- gen-Bestimmungsmethoden aufgrund der spezifischen Natur des Antigens nicht oder nur unbefriedigend bestimmt werden können.
Ein Beispiel für ein derartiges Pathogen ist das für Scrapie verantwortliche Antigen. Scrapie wurde zum ersten Mal vor etwa 250 Jahren in Schafen entdeckt. In den letzten Jahren wurden mit Scrapie verwandte Krankheiten auch bei anderen Tieren und auch im Menschen als übertragbare spongiforme Enzephalopathie (TSE, transmissible spongiform encephalopathies) beschrieben. Als Ursache dieser Krankheiten werden Prionen angenommen. Prionen-Er- krankungen sind mit herkömmlichen Antigen/Antikörpertests nicht befriedigend diagnostizierbar. Ein Prionenprotein ist entweder nicht infektiös, man spricht dann von einem PrPc, oder aber infektiös, dann spricht man von einem PrPSc. Das nicht infektiöse Prionenprotein PrPc ist ein ubiquitäres zelluläres Protein, welches durch eine Konformationsänderung zum infektiösen Prionenprotein PrPSc wird. Üblicherweise wird zur Unterscheidung des Prionen-Proteins vom infektiösen Prionenprotein ein Proteinase-K-Verdau mit einem anschließenden Western Blot durchgeführt, wobei sich das infektiöse Prionenprotein PrPSc als teilweise resistent gegenüber dem Proteinase-K-Verdau erweist. Darüberhinaus beschreiben Korth et al . (Nature 390 (1998) , 74-77) ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die spezifisch entweder das „normale", nicht infektiöse Prionenprotein erkennen, oder die spezifisch das infektiöse Prionenprotein erkennen.
Die Prionen verursachen meist progressive Erkrankungen des Zentralnervensystems (spongiforme Enzephalopathien) , beispielsweise Scrapie im Schaf, Kuru, RSE im Rind sowie die Creutzfeld-Jakob- Krankheit (CJD) , das Gerstmann-Sträussler-Syndrom (GSS) und die fatale familiäre Insomnia (FFI) . Die Prionen zeichnen sich durch besondere physikochemische und biologische Eigenschaften gegenüber Viren und Bakterien aus: hohe Resistenz gegenüber Inakti- vierung durch Formaldehyd, Nukleasen, Hitze, UV- und ionisierende Strahlen, und sind nicht als Virion oder Zelle im Elektronenmikroskop erkennbar. Sie sind insensitiv gegenüber Interfero- nen, zeigen keine Interferenz mit Viren und außerdem konnte bisher keine Nukleinsäure nachgewiesen werden.
In Großbritannien trat in letzter Zeit vermehrt eine Variante von CJD mit neuen neuropathologischen Merkmalen auf (nvCJD) . Es konnte gezeigt werden, daß diese nvCJD durch Übertragung von BSE vom Rind zum Menschen durch die Konsumation von kontaminierten Rinderinnereien verursacht wurde. Daher wird oftmals gefordert, biologische Materialien, die zur Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen herangezogen werden, wie z.B. Körpersäfte, Blut, Plasma, Plasmafraktionen und Serum, Gewebe und Zellkulturen, auf Prionen zu untersuchen.
Dieser Untersuchung der biologischen Materialien und dem an- schließenden Ausschluß kontaminierter Materialien kommt daher immer mehr an Bedeutung zu, da Prionen sich als überaus resi- stent gegenüber herkömmlichen Inaktivierungsverfahren, wie z.B. Hitzebehandlung oder Behandlung mit UV, erwiesen haben.
Herkömmliche Prionentests, wie z.B. Western Blot unter Verwendung von spezifischen Antikörpern, haben eine ungenügende Sensi- tivität, um Prionenprotein effektiv bestimmen zu können. In der WO 97 37 227 ist ein immunhistochemischer Test zur Bestimmung von Prionen in Geweben beschrieben. Mittels dieser Methode kann eventuell in histologischen Schnitten aus infizierten Gewebeteilen das veränderte Prionenprotein (PrPSc) bestimmt werden. Diese Methode ist allerdings wenig zuverlässig und insbesondere für die Untersuchung von Blut und Blutprodukten ungeeignet.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur in-vi- tro-Amplifikation spezifischer einzelsträngiger oder doppel- strängiger DNA-Fragmente. Durch eine wiederholte Hitzedenaturie- rung der DNA-Doppelstränge, Anhybridisieren der Primer und Verlängerung durch DNA-Polymerase kommt es zu einer enormen Anreicherung eines doppelsträngigen DNA-Fragments . Nach 20 Zyklen erhält man ausgehend von einem DNA-Molekül infolge einer exponen- tiellen Kettenreaktion ca. 1 Million Kopien (siehe EP 0 200 362 und EP 0 201 184) . Mittels dieser Methode können allerdings nur Nukleinsäuren detektiert werden, für Proteine ist dieses Verfahren ungeeignet.
Ein verbessertes Verfahren wird in der EP 0 714 988 beschrieben. Dabei wird der zu bestimmenden Probe ein Standard zugesetzt, um die mittels PCR bestimmte DNA auch quantifizieren zu können.
In Sano et al . (Science 258 (1992), 120-122) ist eine Kombination von ELISA mit PCR als Immuno-PCR beschrieben. Dabei wird ein Verbindungsmolekül (Linker) mit bispezifischer Bindungsaffinität für DNA und Antikörper, z.B. ein chimäres Molekül aus Streptavidin für biotinylierte DNA und Protein A für Immunglobu- lin G, benutzt, um ein bestimmtes DNA-Molekül (Marker) unspezifisch an einen Antigen-Antikörper-Komplex zu binden, so daß ein Antigen-Antikörper-Linker-DNA-Komplex entsteht. Der gebundene DNA-Marker kann nun mittels entsprechender Primer in einer PCR amplifiziert werden. Der Nachweis des PCR-Produkts zeigt die Präsenz der Antigene an.
Die markierten DNA-Antikörper-Komplexe werden in situ im Reaktionsgemisch zusammengesetzt, dadurch kann es zu verschiedener Stöchiometrie in der Zusammensetzung und Bindung der DNA kommen. Zusätzliche Schritte für die Zugabe von biotinylierten Reagenzien und Bindungsproteinen sowie zahlreiche Waschschritte sind erforderlich, um überschüssige Reagenzien zu entfernen. Durch die vielen Verfahrensschritte wird dieses Verfahren kompliziert und zeitaufwendig, um es in der Routineanalyse anwenden zu können. Weiters ist diese Methode für komplexe Gemische von verschiedenen Antigenen nicht geeignet.
Hendrickson et al . (Nucl. Acids Res . 23(3) (1995), 522-529) beschreiben daher einen verbesserten Immunassay zur gleichzeitigen Bestimmung von verschiedenen Analyten. Dabei wurden die Antikörper und die DNA, in diesem Fall ein einzelsträngiges Oligonu- kleotid, separat aktiviert und in einer spontanen Reaktion direkt aneinander gekoppelt . Von Hendrickson et al . wird die gleichzeitige Detektion von drei unterschiedlichen Analyten mittels Immuno-PCR beschrieben. Die DNA-markierten Antikörper, die an das entsprechende Antigen gebunden sind, werden mittels PCR amplifiziert und bestimmt.
Bei diesen Immuno-PCR-Methoden besteht jedoch - wie allgemein bei der PCR an sich - stets das Risiko von fälschlicherweise negativen Resultaten, d.h. mit der Detektionsreaktion kann ein spezifisches Antigen nicht nachgewiesen werden, obwohl dieses spezifische Antigen tatsächlich in der Probe enthalten ist. Dies kann vor allem beim Nachweis von Pathogenen in Proben, welche zur Weiterverarbeitung zu Arzneimitteln, die an Menschen verabreicht werden sollen, eingesetzt werden, fatale Folgen haben: dadurch könnten Proben aufgrund von fälschlicherweise negativen Resultaten zur Weiterverarbeitung ausgewählt werden, obwohl diese Proben Pathogene enthalten.
Um die damit verbundene Gefahr der Verwendung von möglicherweise infektiösen Ausgangsmaterialien bei der Herstellung von pharmazeutischen Präparaten auszuschließen, ist man bestrebt, falsch- negative Resultate zu eliminieren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein zuverlässiges und sensitives Verfahren zur Bestimmung von Antigenen zur Verfügung zu stellen, mit welchem vor allem falsch-negative Ergebnisse von vornherein ausgeschlossen werden können.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen durch Amplifizieren einer Nukleinsäure (Ziel-Nukleinsäure) , die an einem für die Antigene spezifischen Liganden gebunden ist, gelöst, welches sich dadurch auszeichnet, daß die Bestimmung in Anwesenheit mindestens eines internen Standards durchgeführt wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Antigen-Bestimmungen mittels Immun-Amplifikationsreaktionen auf elegante Weise überwacht und kontrolliert werden. Vor allem aber können durch das erfindungsgemäße Verfahren falsch-negative Ergebnisse verläßlich ausgeschlossen werden. Weiters ist durch die Verwendung von internen Standards auch der Erhalt einer quantitativen Vergleichsgröße für die AntigenbeStimmung in der Probe möglich, vor allem, wenn mehr als ein Standard verwendet wird. Im Routinebetrieb wird es aber in der Regel nicht erforderlich sein, mehr als einen Standard zu verwenden, insbesondere, wenn mit der Verwendung eines Standards lediglich falsch-negative Ergebnisse ausgeschlossen werden sollen.
Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß eine an einem Liganden gebundene Nukleinsäure als Standard eingesetzt (Standard-Nuklein- säure) . Dabei kommen besonders bevorzugt Standard-Nukleinsäuren zum Einsatz, die sich von der Nukleinsäure, mit welcher das (Ziel-) Antigen bestimmt wird (Ziel-Nukleinsäure) , zumindest in einem detektierbaren Merkmal unterscheidet.
Erfindungsgemäß werden dann sowohl die Standard-Nukleinsäure als auch die Ziel-Nukleinsäure amplifiziert und die amplifizierten Nukleinsäuren untersucht.
Beispiele für (Gen-) Amplifikationsverfahren sind neben der Poly- merase-Kettenreaktion (PCR) die reverse Transkriptase-PCR (RT- PCR) , die Ligase-Chain-Reaction (LCR) sowie die nucleic acid se- quence based amplification (NASBA) .
Um die Proben besser charakterisieren zu können, wird beim „Taqman Assay" die Polymerase-Kettenreaktion mit einer Hybridisierung der Zielsequenz mit einer markierten Probe kombiniert (Holland et al . , Proc . Natl . Acad. Sei., 88 (1991), 7276-7280).
Die Standard-Nukleinsäure kann vorzugsweise eine Länge von mindestens 70 Nukleinsäuren aufweisen. Bevorzugt wird eine Länge von > 100 bis mehrere hundert Nukleinsäuren gewählt.
Die Ziel-Nukleinsäure ist an den Liganden, spezifisch für das zu bestimmende Antigen, gebunden. Als Liganden werden bevorzugt Antikörper, die spezifisch für das zu bestimmende Antigen sind, verwendet. Es können aber auch Äffinitäts-Liganden eingesetzt werden, wie z.B. Peptide, die spezifisch an das Antigen binden. Die Standard-Nukleinsäure unterscheidet sich üblicherweise in wenigstens einem detektierbarem Merkmal von der Ziel-Nukleinsäure, wird aber vorzugsweise mit Hilfe der gleichen Mitteln, wie Primer, amplifiziert. Als bevorzugt haben sich Standard-Nukleinsäuren erwiesen, die eine andere Größe als die zu bestimmende Nukleinsäure oder eine unike Restriktionsschnittstelle aufweisen, da hierbei das Ergebnis durch einfache Gelelektrophorese ausgewertet werden kann. Bevorzugte Standards unterscheiden sich von der zu bestimmenden Nukleinsäure in 1% bis 20% ihrer Länge bzw. durch mindestens 3, maximal 50 Nukleotide, wobei eine Standard-Nukleinsäure, die länger ist als die Ziel-Nukleinsäure als "plus" ("+") -Standard bezeichnet wird, und eine Standard-Nukleinsäure, die kleiner ist als die Ziel-Nukleinsäure als "minus" ("-") -Standard bezeichnet wird. Die genaue Sequenz der Standard-Nukleinsäure sollte natürlich bekannt sein.
Sowohl die Nukleinsäure für den internen Standard als auch die Nukleinsäure, die an den Liganden, spezifisch für das zu bestimmende Antigen, gebunden wird, kann entweder als doppelsträngige oder als einzelsträngige Nukleinsäure eingesetzt werden. Bevorzugterweise wird einzelsträngige DNA mit einer endständigen Ami- nogruppe zum chemischen Crosslinking mit dem spezifischen Liganden gewählt. Bevorzugt werden hierbei Nukleinsäuren mit einer Länge von 70 - 120 Basenpaaren verwendet.
Der interne Standard kann auch als Verbund der Standard-Nukleinsäure mit einem Liganden, spezifisch für ein Standard-Antigen, zur Verfügung gestellt werden. Der interne Standard kann nun entweder unmittelbar an dem spezifischen Liganden gebunden werden oder aber auch mittels eines Verbindungsmoleküls (Linker) , welches auf der einen Seite eine DNA-Bindungsstelle aufweist, beispielsweise Streptavidin, und auf der anderen Seite einen spezifischen Liganden, der gegen ein Antigen (Standard-Antigen) gerichtet ist, die Verbindung zwischen dem spezifischen Liganden und der DNA hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA unmittelbar durch chemische Bindung an den Liganden gebunden, beispielsweise mittels Affinitätsbindung oder kovalenter Bindung.
Als Liganden für den internen Standard und/oder für das zu bestimmende Antigen können Peptide oder monospezifische Antikörper, sowohl monoklonale oder polyklonale, aber auch Chimäre, re- kombinante beziehungsweise humanisierte Antikörper verwendet werden. Die Liganden, die an die Standard-Nukleinsäure gebunden sind, können auch spezifisch gegen das zu bestimmende Antigen gerichtet sein, um kompetitiv mit den Ziel-Liganden spezifisch für das zu bestimmenden Antigen zu wirken. Dabei können auch polyspezifische Antikörper eingesetzt werden, die das Standard-Antigen erkennen. Liganden, die spezifisch für das zu bestimmenden Antigen sind, sind bevorzugterweise Antikörper, die zur Bestimmung von modifizierten Proteinen und Prionenproteinen geeignet sind. Gleichfalls können für andere Zwecke auch Liganden spezifisch für die zu bestimmenden Antigene ausgewählt werden, z.B. aus der Gruppe von viralen, bakteriellen oder Humanproteinen. Bevorzugterweise werden bei der Bestimmung von Prionen spezifische Antikörper für ein Prionenprotein verwendet.
Die bei der Amplifizierung verwendeten Primer können vorzugsweise Marker enthalten, welche die Nachweisgrenze zur Bestimmung der amplifizierten Nukleinsäure noch weiter erhöhen, beispielsweise fluoreszierende oder radioaktive Gruppen oder chemische Gruppen, die mit affinen Proteinen und nachgeschalteten Detekti- onsreaktionen detektiert werden können (z.B. Biotin-Avidin, DIG- Markierung etc.), wobei Primer mit fluoreszierenden Gruppen besonders bevorzugt sind.
Die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren kann auf unterschiedlichste Weise erfolgen, meist jedoch ist ein Schritt vorzusehen, bei welchem die amplifizierte Standard-Nukleinsäure von der amplifizierten Ziel-Nukleinsäure getrennt wird, und die getrennten Nukleinsäuren separat bestimmt werden. Vorzugsweise besteht dieser Trennungsschritt in einer Gelelektrophorese oder in einem chromatographischen Verfahren. Durch Bestimmung des Verhältnisses der Menge an Ziel-Nukleinsäure zur bekannten Menge einer Standard-Nukleinsäure kann zusätzlich die Quantifizierung des Antigens ermöglicht werden.
Zu den Antigenen, die mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, gehören Antigene aus biologischen Proben von Säugetieren, wie Körperflüssigkeiten, z.B. Plasma, Blut, Blutzellen und Serum, Gewebe, aber auch Antigene aus eukaryonti- schen Zellkulturen. Bevorzugt werden erfindungsgemäß Antigene von Pathogenen oder auch Marker-Antigene für Pathogene bestimmt. Zu diesen Antigenen zählen virale Antigene, bakterielle Antigene und insbesondere Antigene, für die bislang keine Routine-Nachweismethode zur Verfügung stand, wie beispielsweise modifizierte
(z.B. konformationsgeänderte) Proteine, wie Prionen, die im Zusammenhang mit infektiösen Krankheiten des Zentralnervensystems, wie CJD und BSE, oder anderen Erregern von TSE, stehen. Solche modifizierten Proteine können durch induzierte Konformationsänderungen erhalten werden. Diese Konformationsänderung an Proteinen, wie gegebenenfalls rekombinante PrPc, kann durch vorhergegangene Inkubation mit infektiösen Molekülen (wie PrPSc) hervorgerufen werden, welche dann z.B. durch radioaktive Marker detek- tierbar sind. Eine derartige Konformationsänderung von modifizierten Prionenmolekülen wurde bereits von Kocisko et al .
(Nature 370 (1994) , 471-474) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere der Antigene von Humanpathogenen, wie HIV, Hepatitisviren, darunter HAV, HBV, HCV, HGV und Parvoviren, bestimmt. Die zu bestimmenden Antigene können in einer gereinigten proteinhältigen Präparation, z.B. einer Plasmafraktion, einer Präparation eines gerei- nigten Plasmaproteins, bzw. einem biologischen Arzneimittel, bestimmt werden. Sie können aber auch in Plasmapools oder anderen komplexen Gemischen bzw. in den genannten biologischen Proben zuverlässig bestimmt werden. Eine Qualitätssicherung wie in der W096/35437 beschrieben, kann auch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren entsprechend adaptiert durchgeführt werden.
Der entsprechende interne Standard kann vor der Probenaufbereitung zugesetzt werden, während allen Zwischenstufen oder erst unmittelbar vor der Amplifikationsreaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Standard von Anfang an als ungebundene Nukleinsäure bzw. als gebundene Nukleinsäure nach der Immunkomplexbildung zugesetzt. Weiters können auch zwei (oder mehrere) verschiedene Nukleinsäuren als interner Standard zugesetzt werden. Bevorzugt wird der interne Standard in einer Konzentration von knapp oberhalb der Nachweisgrenze eingesetzt. Die in der EP- 0 714 988-A beschriebenen Ausführungsformen können hierbei ohne weiteres für die vorliegende Erfindung adaptiert werden.
Das Antigen, das vom internen Standard gebunden (erkannt) wird, kann zu der zu bestimmenden Probe zugegeben werden (z.B. dem Antigen-Bestimmungs-Ansatz) , oder aber auch bereits in der Probe in natürlicher Weise (a priori) vorliegen.
In Routinetests kann die Interpretation der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Resultate üblicherweise folgendermaßen erfolgen: i) keine Detektion des internen Standards (z.B. keine sichtbare Bande) : die Bestimmung hat z.B. wegen der Amplifikationsreaktion (z.B. die PCR) nicht funktioniert; dadurch können falsch negative Resultate ausgeschlossen werden. ii) nur der interne Standard ist detektierbar (z.B. nur die Standard-Bande ist sichtbar) : die Bestimmung inklusive der Amplifikationsreaktion (z.B. die PCR) hat funktioniert, die Probe ist negativ; iii) Standard- und Proben-Nukleinsäure sind detektierbar (z.B. beide Banden sind sichtbar) : positive Probe.
Geeignete Reaktionsgefäße für die Immuno-PCR sollten vorzugsweise eine gute Proteinbindungskapazität zur Immobilisierung der Proteine besitzen. Andererseits müssen die Gefäße für die PCR auch thermostabil sein. Für eine große Anzahl von Proben sind nicht einzelne Reaktionsgefäße, sondern Mikrotiterplatten zu bevorzugen. Polystyrol ist das am besten geeignete Material hinsichtlich Proteinbindung, jedoch werden bis jetzt keine derartigen PCR-tauglichen Platten kommerziell vertrieben. Als Ersatz können aber erfindungsgemäß beispielsweise Polycarbonatplatten verwendet werden. Denkbar ist auch der Einsatz von chemisch modifizierten Materialien zur kovalenten Bindung von Proteinen oder bereits mit Antikörpern beschichtete Materialien.
Die Beschichtung der Platten erfolgt bevorzugt über Nacht bei 4°C, es sind auch höhere Temperaturen etwa bis 37°C mit kürzerer Inkubationszeit möglich. Als Beschichtungspuffer kann beispielsweise PBS (in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) verwendet werden, aber auch jeder andere gängige Puffer, wie z.B. Polycarbo- natpuffer .
Die Blockierung kann beispielsweise mit PBS/1% BSA (bovines Serumalbumin) durchgeführt werden. Als Ersatz kann auch jedes andere geeignete Reagens, wie z.B. Milchpulver oder vorgefertigte Blocking-Reagenzien, verwendet werden.
Die Inkubation mit dem Ligand/DNA-Komplex findet bevorzugt eine halbe Stunde bei Raumtemperatur statt, jedoch sind auch andere Zeitdauern (bevorzugt 5 min - 2 Stunden) und andere Temperaturen (bevorzugt 4° - 37°C) möglich.
Die optimalen Reaktionsbedingungen für die PCR sind in Beispiel 1 beschrieben. Es sind selbstverständlich eine Vielzahl von Veränderungen möglich (insbesondere Veränderung der Zyklenzahl, Inkubationszeiten, Temperaturprofil, Verwendung verschiedener Po- lymerasen, Amplifikationssysteme, Primerstrategien, etc.). Die optimalen Bedingungen können, falls z.B. das in den Beispielen verwendete Protokoll sich nicht als optimal darstellt, für die einzelnen zu bestimmenden Antigene vom Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet ohne weiteres ermittelt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Überprüfung und Qualitätssicherung von biologischen Präparaten.
Die Sicherheit, insbesondere die Virussicherheit von stabilen Blutprodukten hängt im Prinzip vom Ausmaß der Kontamination von Pathogenen, insbesondere von der Viruskontamination des Aus- gangsmaterials , von der Abreicherungskapazität des Verfahrens und von den spezifischen Virusinaktivierungsstufen im Rahmen des Herstellungsprozesses, ab. Ein wichtiges Kriterium der Qualitätssicherung ist daher, positives Ausgangsmaterial von der Verarbeitung zu pharmazeutischen Arzneimitteln auszuschließen.
Durch die hohe Empfindlichkeit und die besonders niedrige Nachweisgrenze des erfindungsgemäßen Verfahrens können somit neue Qualitätskriterien bei biologischen Produkten festgestellt werden, welche durch einen äußerst geringen definierten bzw. fehlenden Gehalt an kontaminierenden Antigenen definiert sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Reagens zur Verwendung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, welches a) einen Reaktanten, der an einem Liganden gebunden ist, welcher spezifisch für das zu bestimmende Antigen ist, und b) einen Reaktanten als interner Standard, welcher sich vom Reaktanten aus a) in der Reaktionsweise unterscheidet, enthält.
Als unterschiedliche Reaktionsweise kommen beispielsweise unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten, Spezifität für andere Reaktanten, in Betracht. Als Reaktanten können Nukleinsäuren oder Enzyme verwendet werden, um beispielsweise eine kontrollierte Enzymreaktion zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren als Reaktanten verwendet, die sich in einem detektierbaren Merkmal, z.B. in der Länge, unterscheiden.
Insbesondere, wenn das erfindungsgemäße Reagens bei der Detek- tion von modifizierten Proteinen eingesetzt wird, liegt die Ziel-Nukleinsäure bevorzugt gebunden an einem Antikörper, der spezifisch ist für das modifizierte Protein, vor.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagens ist die Standard-Nukleinsäure an einem Liganden gebun- den, insbesondere an einem Liganden, der bereits an ein Standard-Antigen gebunden ist. Dabei kann das Standard-Antigen gleich dem zu bestimmenden Antigen sein (kompetitive Immunreaktion) .
Vorzugsweise ist die Standard-Nukleinsäure im erfindungsgemäßen Reagens an einen Liganden gebunden, der spezifisch ist für ein von dem zu bestimmenden Antigen (Ziel-Antigen) unterschiedliches Antigen.
Die Liganden/DNA-Komplexe können nach der Herstellung bei -20°C oder 4°C in einem geeigneten Puffer, bevorzugt PBS, gelagert werden. Sie sind dann mehrere Monate stabil. Diese Präparation entspricht einer handelsfähigen Form. Die optimale Konzentration, mit der die Komplexe verwendet werden, liegt bei ca. 10 000 bis ca. 1 000 000 Kopien pro Vertiefung einer Mikrotiter- platte. Bevorzugterweise werden weniger als 1 Million Kopien eingesetzt, um unspezifische Bindungen in den Vertiefungen zu vermeiden. Für die Herstellung des erfindungsgemäßen Reagens können übliche Formulierungsreagenzien, wie beispielsweise Albumin als Trägerprotein, Tenside, usw. verwendet werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Quan ifizierung von Antigenen, insbesondere zur Quantifizierung von Pathogenen in Säugetier-Proben oder von Humanpathogenen in biologischen Arzneimitteln.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfigur, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert.
Es zeigt:
Fig. 1 die schematische Darstellung der IMMUNO-PCR mit internem Standard.
Gemäß Fig. 1 wird eine Mikrotiterplatte mit einem Antikörper spezifisch für ein Standard-Antigen und einem Antikörper spezifisch für das zu bestimmende Antigen beschichtet. Von diesen An- tikörpern wird das Standard-Antigen und das zu bestimmende Antigen gebunden. Danach werden die Liganden an die Antigene gebunden. Die Liganden bestehen aus dem jeweiligen spezifischen Antikörper für das Standardantigen, kovalent gebunden an ein Oligo- nukleotid (=interne Standard-Nukleinsäure, IPOS 1) und einem Antikörper spezifisch für das zu bestimmende Antigen, kovalent gebunden an ein in der Länge unterschiedliches Oligonukleotid (=Ziel-Nukleinsäure, IPO 1) . Nach einer Polymerase-Kettenreak- tion (PCR) werden die daraus resultierenden unterschiedlich langen Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese detektiert.
B e i s p i e l 1: Zugabe eines DNA-Standards zur PCR
Während die meisten ELISAs im Prinzip sehr zuverlässig sind, kann es bei der PCR durchaus vorkommen, daß die Reaktion durch inhibitorische Substanzen gestört wird. Dies kann zu einer falsch-negativen PCR führen. Bei dem vorliegenden Experiment wurde der PCR-Teil der Immuno-PCR erfindungsgemäß durch Zugabe einer Standard-Nukleinsäure, die sich in der Länge von der Nukleinsäure des auf ein Antigen spezifischen Antikörper/Nuklein- säure-Konjugats unterscheidet, auf falsch-negative Reaktionen überprüft .
In diesem Beispiel wird als Antigen ein zelluläres (nicht infektiöses) Prionenprotein (PrPc) verwendet. Dieses Prionenprotein liegt nicht in gereinigter Form vor, sondern befindet sich in einem Homogenat, welches aus einem Mäusehirn gewonnen wird. Zu diesem Zweck wurde das Hirn in einem Puffer (0,1 g/ml) , der aus einer 0,32 M Rohrzuckerlösung, 0,5% Desoxycholat und 0,5% NP-40 besteht, in einem Dounce homogenisiert. Nach einem Zentrifuga- tionsschritt (15 min bei 4500 Upm) wurde das Pellet verworfen und dann die Proteinmenge im Überstand bestimmt.
Nach Bestimmung der Protein-Konzentration wurden verschiedene Mengen des Homogenats in 2 gleichen Ansätzen (2x unbeschichtet, 2x 8 μg, 2x 800 ng) in Polycarbonatplatten (96 Vertiefungen, V- förmig von MJ Research, Watertown, Mass., USA) über Nacht in einem Volumen von 50 μl bei 4°C inkubiert. Nach dieser Beschichtung wurden die entsprechenden Vertiefungen 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 50 μl einer PBS/1% BSA-Lösung blockiert. An- schließend wurde eine halbe Stunde mit ca. 104 Kopien des Prion- antikörper/DNA-Komplexes (Ziel-Nukleinsäure, 6H4-IP01; s. Tabelle 1) in 50 μl PBS/0,1% inkubiert. Es wurde 6 x mit 100 μl PBS gewaschen und dann die PCR-Lösung direkt zu den entsprechenden Vertiefungen dazugegeben. Die PCR-Lösung (50 μl) enthielt 1 E der Polymerase AmpliTaq Gold™ (Perkin Eimer, Norwalk, CT, USA), 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,001% Gelatine, 200 μM von jedem dNTP und jeweils 500 ng der entsprechenden Primer IP1/IP2 (s. Tabelle 1) . Die Proben wurden mit 50 μl Mineralöl überschichtet und zunächst 14 min bei 94 °C zur Aktivierung der Polymerase inkubiert. Dann wurde 40 Zyklen nach folgendem Profil in einem PTC0200-Thermocycler (MJ Research) amplifiziert: 30 s bei 94°C, 30 s bei 55°C, 60 s bei 72°C mit einem abschließenden Elongationsschritt bei 72 °C für 60 s. Zu den Proben, die auf falsch-negative Resultate überprüft wurden, wurden zu einem Ansatz ca. 100 und zum anderen ca. 1000 Kopien der internen Standard-Nukleinsäure IPOSl (s. Tabelle 2) dazugegeben.
8 μl des jeweiligen Probenansatzes wurden auf ein 3,5% "low- melting" Agarosegel aufgetragen. In der Tabelle 2 wird das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Es zeigt sich, daß in den Vertiefungen, in denen sich kein Homogenat befindet, nur der Standard IPOSl zu sehen ist, d.h. es befindet sich kein spezifisches Antigen in dieser Probe. Die Reaktion war jedoch auf keinen Fall falsch-negativ. Durch die Zugabe von verschiedenen Mengen von IPOSl kann man auch eine Kompetition mit der Ziel-Nukleinsäure IPOl erkennen, d.h. 1000 Kopien ergeben eine stärkere Bande als 100 Kopien. Der Standard sollte aus diesem Grund nur knapp über der Nachweisgrenze eingesetzt werden, um ein Wegkompetitieren des spezifischen Signals zu verhindern. Bei größeren Mengen von spezifischem Antigen könnte es durchaus vorkommen, daß nur die IPOl-Bande zu erkennen ist. Dies ist durchaus im Sinne der Erfindung, da vorrangig falsch-negative Reaktionen verhindert werden sollen.
Tabelle 1. Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide und Primer. IPOSl 5 Λ -AGAACCCACT GCTTACTGGC CTTATCGAAA
TTAATACGAC TCACTATAGG GAGACCCAAG CTTGGTACCG
AGCTCGGATG TGCCTTCTAG TTGCCAGCC -3' IPOl 5' -AGAACCCACT GCTTACTGGC CTTATCGAAA
TTAATACGAC TTGGTACCG AGCTCGGATG TGCCTTCTAG TTGCCAGCC -3'
IP1 5' -AGAACCCACT GCTTACTGGC -3'
IP2 5' -GGCTGGCAAC TAGAAGGCAC -3'
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit Hirnhomogenat beschichtet, blockiert und mit 6H4-IP01 inkubiert. Nach 6-mali- gen Waschen wurde nach Zugabe von internem DNA-Standard amplifiziert. Die negative Kontrolle der PCR-Reaktion war negativ, die positiven Kontrollen der beiden verwendeten DNA-Reagenzien (DNA- Standard, 6H4-IP01) waren positiv. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Bei den Proben 1-6 wurden 1000 Kopien der Standard-Nukleinsäure IPOSl, bei den Proben 7-12 wurden 100 Kopien IPOSl dazugegeben. Beschichtet wurde entweder mit 8 oder 0,8 μg Homogenat .
Tabelle 2 : Kontrollierte Bestimmung von Prionantigen in einem Mäusehirnhomogenat
Banden Probe Homogenat IPOSl IPOl IPOSl in μg zugegebene Kopien
1 - 1000 - ++
2 - 1000 - ++
3 8 1000 + ++
4 8 1000 + ++
5 0,8 1000 + ++
6 0,8 1000 + ++
7 - 100 - +
8 - 100 - +
9 8 100 + +
10 8 100 + +
11 0,8 100 + +
12 0,8 100 + + rkl .ärung der Zeichen : + = Bande , ++ = starke Bande , keine Bande Zugabe des Markerantigens :
Wenn die gesamte Immuno-PCR auf falsch-negative Reaktionen überprüft werden soll, wird nicht zur PCR eine Standard-Nukleinsäure dazugegeben, sondern es wird am Anfang des Experiments als interner Standard ein Markerantigen in einer Menge, die gerade noch bestimmt werden kann, gleichzeitig mit dem spezifischen Antigen auf die entsprechenden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Damit ist gewährleistet, daß alle störenden Einflüsse, die zu einer falsch-negativen Reaktion (dazu gehört zum Beispiel auch das versehentliche Nichtbeschichten einer Vertiefung) führen könnten, mitkontrolliert werden. Bei der Inkubation mit dem spezifischen Antikörper/DNA-Komplexes wird dann mit einem entsprechenden Standard- Antikörper/DNA-Komplex gleichzeitig inkubiert und im Anschluß mit dem gleichen Primerpaar amplifiziert.
Falls die Immuno-PCR auf einem sogenannten Sandwich-ELISA basiert, müssen die Vertiefungen der Mikrotiterplatte dementsprechend mit einem Antikörper für das zu detektierende Antigen und einem Antikörper für das Standard-Antigen beschichtet werden. Es kann auch vorkommen, daß das Standard-Antigen natürlich vorkommt, wie beispielsweise bestimmte Proteine (z.B. Protein C) bei der Verwendung von biologischen Flüssigkeiten, wie z.B. Plasma.
Beispiel 2: Herstellung und Verwendung der Antikörper/DNA- Komplexe
Die Herstellung eines Antikörper/DNA-Konjugates durch kovalente Bindung eines Oligonukleotides an einem monoklonalen anti-Prio- nen-Antikörper erfolgte entsprechend Hendricksson et al . Als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Konjugates wurde ein amino- modifiziertes Reporter-Oligonukleotid (IPOl, hergestellt von Fa. Metabion, Martinsried, Deutschland) sowie der monoklonale anti- Prionen-Antikörper 6H4 (Prionix, Basel, Schweiz) verwendet.
Schritt 1: Herstellung der Acetylthioacetyl-derivatisierten DNA Die Herstellung der Acetylthioacetyl-derivatisierten DNA erfolgt durch Reaktion mit Succinimidyl-S-Acetylthioacetat (SATA-Rea- gens/Pierce, Rockford, IL, USA) .
Dazu wurden zu 20 μl einer Lösung des IPOl-Oligonukleotids in H20 (Konzentration: 0,5 μg/ml) jeweils 2,3 μl eines Natriumkarbonat-Puffers (300 mM, pH 9,0) sowie einer Lösung von 115 mM SATA in DMF gegeben und über 30 Minuten bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurde über eine HiTrap™- Säule (1,6 x 2,5 cm, Sephadex G-25 superfine/Pharmacia, Uppsala, Schweden) unter Verwendung eines FPLC-Systems (Fa. Pharmacia) umgepuffert. Als Elutionspuffer wurde ein 100 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5 verwendet.
Schritt 2 : Herstellung des Maleimid-modifizierten Antikörpers
Zu 90 μl eines 100 mM Natriumphosphat-Puffers, pH 7,0 wurden 12,5 μl einer Lösung des 6H4-Antikörpers (Konzentration: 2 mg/ml) gegeben. Diese Lösung wurde in einer Slide-A-Lyzer Dialyse-Kassette (10.000 MWCO, Probevolumen: 0,1 - 0,5 ml/Pierce, Rockford, IL, USA) über Nacht bei einer Temperatur von +4°C gegen 100 mM Natriumphosphat-Puffers, pH 7 , 0 dialysiert . Dazu wurden dann 15 μl einer wäßrigen Lösung von Sulfosuccinimidyl-4- (N- maleimidomethyl) -cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC/Fa. Pierce) gegeben (Konzentrationen: 2,75 mM Sulfo-SMCC, 100 mM Natriumphosphat, 1,5 % DMF, pH 7,0) . Nach Inkubation über 30 Minuten bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln wurde wie unter Schritt 1 beschrieben über eine HiTrap™-Säule (1,6 x 2,5 cm) umgepuffert .
Schritt 3 : Herstellung und Reinigung des DNA-Antikörper- konjugates
Zur Herstellung des Antikörper/DNA-Konjugates wurden die unter Schritt 1 und Schritt 2 hergestellten Derivate vereinigt (jeweils ca. 1,5 ml Lösung der Acetylthioacetyl-derivatisierter DNA bzw. des Maleimid-modifizierten Antikörpers) . Nach Start der Kupplungsreaktion durch Zugabe von 2 μl einer 1 M wäßrigen Hydroxylaminhydrochlorid-Lösung, pH 7,0, enthaltend 50 mM EDTA, wurde über 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Lichtaus- Schluß und leichtem Schütteln inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 μl einer 10 mM Lösung von N-Ethylmaleimid (Fa. Pierce) in DMF abgestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Hilfe eines Centricon 3-Konzentrators (Amicon, Beverly, MA, USA) durch Zentrifugation bei 7000 x g aufkonzentriert .
Das aufkonzentrierte Reaktionsgemisch (ca. 500μl) wurde anschließend durch Gelfiltration mit Hilfe des Pharmacia FPLC- Systems nachgereinigt (Pharmacia, Uppsala, Schweden) .
Chromatographische Bedingungen:
Säule: XK 16mm/120mm, gefüllt mit Sephacryl 300 HR
(Fa. Pharmacia) Elutionspuffer : 200 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7 , 0 Flußrate: 0,5 ml/min Detektion: 280 nm Fraktionsgröße: 0,25 ml
Die Fraktionen im Elutionsmaximum wurden gesammelt und für die Immuno-PCR in verschiedenen Verdünnungen eingesetzt.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe durch Amplifizieren einer Nukleinsäure, die an einen für die Antigene spezifischen Liganden gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Anwesenheit mindestens eines internen Standards durchgeführt wird. .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine an einen Liganden gebundene Nukleinsäure als interner Standard eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der interne Standard eine Standard-Nukleinsäure enthält, welche sich von der Nukleinsäure, mit welcher das Antigen bestimmt wird, zumindest in einem detektierbaren Merkmal unterscheidet.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand der Standard-Nukleinsäure vom Liganden, der an das zu detektierende Antigen bindet, verschieden ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene in einer Probe von einer Körperflüssigkeit eines Säugetieres bestimmt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene in einer Probe eines Materials, ausgesucht aus der Gruppe von Blut, Plasma, einer Plasmafraktion, einer Blutzellenfraktion und einer Präparation eines gereinigten plasmatischen Proteins, bestimmt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene in einer Probe einer Zellkultur bestimmt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigene modifizierte Proteine bestimmt werden, wie z.B. Prionen, insbesondere Erreger von BSE oder CJD oder andere Erreger von TSE .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierten Proteine durch induzierte Konformationsänderung enthalten sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, als Liganden verwendet werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure kovalent an den Liganden gebunden ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure über hochaffine Liganden an den Liganden gebunden ist .
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Standard-Nukleinsäure an einen Liganden gebunden ist, welcher sich von dem für das zu bestimmende Antigen spezifischen Liganden unterscheidet.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem internen Standard ein Standard-Antigen detektiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard-Antigen vor bzw. gleichzeitig mit der Probe dem Anti- gen-Bestimmungs-Ansatz zugesetzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard-Antigen bereits natürlich in der Probe vorhanden ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Standard-Nukleinsäure an den für das zu bestimmende Antigen spezifischen Liganden gebunden ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure durch die Polymerase-Ketten- reaktion amplifiziert wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Standard-Nukleinsäure und die Nukleinsäure, die an einen spezifischen Liganden für die zu bestimmenden Antigene gebunden ist, mit den gleichen Mitteln zur Amplifi- zierung behandelt werden, insbesondere mit den gleichen Primern.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Standard-Nukleinsäure von der Nukleinsäure, die an einen spezifischen Liganden für die zu bestimmenden Antigene gebunden ist, durch die unterschiedliche Länge unterscheidet.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der interne Standard in einer Konzentration von knapp oberhalb der Nachweisgrenze eingesetzt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei verschiedene Standard-Nukleinsäuren als interner Standard eingesetzt werden.
23. Reagens zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, enthaltend a) einen Reaktanten, der an einen Liganden gebunden ist, welcher spezifisch für das zu bestimmende Antigen ist, und b) einen Reaktanten als interner Standard, welcher sich von dem Reaktanten aus a) in der Reaktionsweise unterscheidet.
24. Reagens nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktanten Nukleinsäuren sind und sich die Nukleinsäure aus b) zumindest in einem detektierbaren Merkmal von der Nukleinsäure aus a) unterscheidet.
25. Reagens zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, welches eine Nukleinsäure gebunden an einen Antikörper enthält, welcher Antikörper spezifisch ist für die modifizierten Proteine .
26. Reagens nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß als interner Standard eine Standard-Nukleinsäure an einen Liganden gebunden, enthalten ist, welcher weiters an ein Standard-Antigen gebunden ist.
27. Reagens nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard-Antigen gleich ist mit dem zu bestimmenden Antigen.
28. Reagens nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß als interner Standard eine Standard-Nukleinsäure an einen Liganden gebunden, enthalten ist, welcher spezifisch ist für ein von dem zu bestimmenden Antigen unterschiedliches Antigen.
29. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22, zur Quantifizierung von Antigenen eines Pathogens in einer Probe eines Säugetieres.
30. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22, zur Quantifizierung von Antigenen eines Humanpathogens in einem biologischen Arzneimittel.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001031056A2 (fr) * 1999-10-27 2001-05-03 Universite De Liege Methode de detection par pcr
DE10041766A1 (de) * 2000-08-25 2002-03-14 Friz Biochem Gmbh Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen
GB0029617D0 (en) * 2000-12-05 2001-01-17 Norchip As Ligand detection method
EP1395805A4 (de) * 2001-06-11 2005-03-09 Illumina Inc Multiplex-detektionsverfahren
EP1270738A1 (de) * 2001-06-18 2003-01-02 chimera biotec GmbH Verfahren zum Nachweis von Substanzen in Flüssigkeiten
EP1615948B1 (de) 2003-04-18 2015-04-01 Becton Dickinson and Company Immunoamplifikation
EP1753873A4 (de) 2004-03-05 2008-11-05 Ohio Med College Verfahren und zusammensetzungen zur beurteilung von nukleinsäuren und allelen
WO2005106036A2 (en) * 2004-04-12 2005-11-10 Medical College Of Ohio Methods and compositions for assaying analytes

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665539A (en) * 1991-07-12 1997-09-09 The Regents Of The University Of California Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
EP0586112A3 (en) * 1992-08-14 1994-09-14 Pharma Gen S A Control of pcr mediated detection of micro-organisms
ZA936015B (en) * 1992-08-24 1994-03-10 Akzo Nv Elimination of false negatives in nuleic acid detection.
US5635602A (en) * 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
CA2159044A1 (en) * 1994-09-26 1996-03-27 Falko-Guenter Falkner Method of quantitating nucleic acids
ES2122835B1 (es) * 1994-12-19 1999-07-01 Moreno Jimenez Jose Dispositivo para la evacuacion de humos y vapores.
US5559000A (en) * 1995-01-18 1996-09-24 The Scripps Research Institute Encoded reaction cassette
AT406019B (de) * 1995-05-08 2000-01-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines arzneimittels enthaltend ein oder mehrere plasmaderivate
SE504798C2 (sv) * 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
CA2268904A1 (en) * 1996-10-15 1998-04-23 Imperial College Of Science, Technology And Medicine Diagnosis of spongiform encephalopathy
US5922553A (en) * 1996-11-21 1999-07-13 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of detecting protein by immuno RNA

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9963109A1 *

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ATA96398A (de) 2000-05-15
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JP2002517206A (ja) 2002-06-18

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