JPH11148935A - 核酸の定量的検出法及び核酸の定量的検出キット - Google Patents
核酸の定量的検出法及び核酸の定量的検出キットInfo
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- JPH11148935A JPH11148935A JP10241445A JP24144598A JPH11148935A JP H11148935 A JPH11148935 A JP H11148935A JP 10241445 A JP10241445 A JP 10241445A JP 24144598 A JP24144598 A JP 24144598A JP H11148935 A JPH11148935 A JP H11148935A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】操作が簡単で自動化が可能な、特定配列を有す
るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドから成る核
酸のの定量的検出法、及び、該検出法に基づいたキット
を提供する。 【解決手段】以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配
列を有する核酸の定量法。 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸プローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸プローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。
るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドから成る核
酸のの定量的検出法、及び、該検出法に基づいたキット
を提供する。 【解決手段】以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配
列を有する核酸の定量法。 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸プローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸プローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定のヌクレオチ
ド配列を有する核酸を定量的に測定する方法及び該核酸
を定量的に測定するためのキットに関する。
ド配列を有する核酸を定量的に測定する方法及び該核酸
を定量的に測定するためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、配列特異的ヌクレオチド標識プロ
ーブを使用して、特定のヌクレオチド配列を有する核酸
の検出を行う方法が知られている。このような方法とし
て、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法等が挙げら
れる。これらはいずれもハイブリダイゼーションの原理
に基づき、標的核酸の特異的ヌクレオチド配列を介して
標識プローブが標的核酸にハイブリダイズする性質を利
用している（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．， Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １０，１４６−１５
２，１９９２）。これらの方法は、実験手技が複雑であ
り、定量性が劣る。
ーブを使用して、特定のヌクレオチド配列を有する核酸
の検出を行う方法が知られている。このような方法とし
て、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法等が挙げら
れる。これらはいずれもハイブリダイゼーションの原理
に基づき、標的核酸の特異的ヌクレオチド配列を介して
標識プローブが標的核酸にハイブリダイズする性質を利
用している（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．， Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １０，１４６−１５
２，１９９２）。これらの方法は、実験手技が複雑であ
り、定量性が劣る。
【０００３】また、別の方法は、標的核酸のヌクレオチ
ド配列中の相違する二つの領域のそれぞれに対して相補
的なヌクレオチド配列を有する２種類のプローブを用
い、一方のプローブは固定に、他方のプロープは標識に
使用するものである（Ｖｉｒｔａｎｅｎ，Ｍ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ， １，３８１−３８３，１
９８３）。この方法はしばしば再現性に乏しい。この方
法の一種または変法として定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖ
ｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などが知
られている（Ｗａｎｇ，Ａ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８
６，９７１７−９７２１，１９８９）。
ド配列中の相違する二つの領域のそれぞれに対して相補
的なヌクレオチド配列を有する２種類のプローブを用
い、一方のプローブは固定に、他方のプロープは標識に
使用するものである（Ｖｉｒｔａｎｅｎ，Ｍ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ， １，３８１−３８３，１
９８３）。この方法はしばしば再現性に乏しい。この方
法の一種または変法として定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖ
ｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などが知
られている（Ｗａｎｇ，Ａ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８
６，９７１７−９７２１，１９８９）。
【０００４】また、ｍＲＮＡの検出法として、ビオチン
標識化ｃＤＮＡプローブと標的ｍＲＮＡとのハイプリダ
イゼーションを液相において行わせ、形成されたハイブ
リッドを固定化した後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを
認識する抗体を用いて検出する方法が知られている（Ｃ
ｏｕｔｌｅｅ，Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６５，１１６０１−１１６０４，
１９９０）。この方法は測定感度が低い。
標識化ｃＤＮＡプローブと標的ｍＲＮＡとのハイプリダ
イゼーションを液相において行わせ、形成されたハイブ
リッドを固定化した後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを
認識する抗体を用いて検出する方法が知られている（Ｃ
ｏｕｔｌｅｅ，Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６５，１１６０１−１１６０４，
１９９０）。この方法は測定感度が低い。
【０００５】さらに、最近ｍＲＮＡの検出法として、化
学基により標識したプローブと標的ｍＲＮＡとをハイブ
リダイズさせると同時に、標的ｍＲＮＡの異なる領域の
ヌクレオチド配列に相補的なリンカー・ヌクレオチドを
ハイブリダイズさせた後、精製した核酸ハイブリッドを
リンカー・ヌクレオチドを介して固相化し、該化学基を
検出する方法が考案されている（特開平９−９８７９９
号）。しかしながら本方法は検出対象がｍＲＮＡに制限
され、また操作も複雑である。
学基により標識したプローブと標的ｍＲＮＡとをハイブ
リダイズさせると同時に、標的ｍＲＮＡの異なる領域の
ヌクレオチド配列に相補的なリンカー・ヌクレオチドを
ハイブリダイズさせた後、精製した核酸ハイブリッドを
リンカー・ヌクレオチドを介して固相化し、該化学基を
検出する方法が考案されている（特開平９−９８７９９
号）。しかしながら本方法は検出対象がｍＲＮＡに制限
され、また操作も複雑である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、ヌクレオ
チド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する抗体を用い
ることにより、操作が容易で自動化が可能な、特定のヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌ
クレオチドの定量的検出法を確立し、さらに、該定量的
検出法に基づくキットを構築し、本発明を完成した。
チド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する抗体を用い
ることにより、操作が容易で自動化が可能な、特定のヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌ
クレオチドの定量的検出法を確立し、さらに、該定量的
検出法に基づくキットを構築し、本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下に関す
る。 （１）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸プローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸プローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。 （２）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸ブローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸ブローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸ブロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する非標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した非標識抗一本鎖核酸抗
体を、これに対する標識二次抗体を用いて定量する。 （３）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列を有する核酸とハイ
ブリダイズし得る核酸プローブに、結合用試薬Ａを結合
させる、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを、不溶性支持体に固相化する、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａを、固相化した
結合用試薬Ｂと結合させる、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を、固相化した核酸プローブとハ
イブリダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブを、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体と結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。 （４）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列を有する核酸にハイ
ブリダイズし得る核酸プローブに、結合用試薬Ａを結合
させる、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを、不溶性支持体に固相化する、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａを、固相化した
結合用試薬Ｂと結合させる、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を、固相化核酸プローブとハイブ
リダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固定化核酸プロ
ーブを、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する非標識抗一本鎖核酸抗体と結合反応させる、 固相化した核酸プローブと結合した非標識抗一本鎖核
酸抗体を、これに対する標識二次抗体を用いて定量す
る。 （５）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
標識抗一本鎖核酸抗体、 標識抗一本鎖核酸抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 （６）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体、 標識二次抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 （７）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブと結合する結合用試薬Ａ、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
標識抗一本鎖核酸抗体、 標識抗一本鎖核酸抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 （８）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブと結合する結合用試薬Ａ、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体、 標識二次抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。
る。 （１）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸プローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸プローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。 （２）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸ブローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸ブローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸ブロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する非標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した非標識抗一本鎖核酸抗
体を、これに対する標識二次抗体を用いて定量する。 （３）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列を有する核酸とハイ
ブリダイズし得る核酸プローブに、結合用試薬Ａを結合
させる、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを、不溶性支持体に固相化する、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａを、固相化した
結合用試薬Ｂと結合させる、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を、固相化した核酸プローブとハ
イブリダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブを、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体と結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。 （４）以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配列を有
する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列を有する核酸にハイ
ブリダイズし得る核酸プローブに、結合用試薬Ａを結合
させる、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを、不溶性支持体に固相化する、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａを、固相化した
結合用試薬Ｂと結合させる、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を、固相化核酸プローブとハイブ
リダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固定化核酸プロ
ーブを、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する非標識抗一本鎖核酸抗体と結合反応させる、 固相化した核酸プローブと結合した非標識抗一本鎖核
酸抗体を、これに対する標識二次抗体を用いて定量す
る。 （５）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
標識抗一本鎖核酸抗体、 標識抗一本鎖核酸抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 （６）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体、 標識二次抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 （７）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブと結合する結合用試薬Ａ、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
標識抗一本鎖核酸抗体、 標識抗一本鎖核酸抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 （８）以下の成分から成る、特定のヌクレオチド配列を
有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブと結合する結合用試薬Ａ、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体、 標識二次抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下に、本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
【０００９】本発明では、特定のヌクレオチド配列を有
する被検核酸（以下、「標的核酸」と記す。）の定量
を、標的核酸のヌクレオチド配列の全部又は一部に相補
的なヌクレオチド配列を有する固相化した核酸プローブ
と標的核酸を含む被検検体とをハイブリダイゼーション
法で反応させ、標的核酸とハイブリダイズしなかった核
酸プローブを定量し、標的核酸とハイブリダイズした核
酸プローブ量を算出することにより達成している。
する被検核酸（以下、「標的核酸」と記す。）の定量
を、標的核酸のヌクレオチド配列の全部又は一部に相補
的なヌクレオチド配列を有する固相化した核酸プローブ
と標的核酸を含む被検検体とをハイブリダイゼーション
法で反応させ、標的核酸とハイブリダイズしなかった核
酸プローブを定量し、標的核酸とハイブリダイズした核
酸プローブ量を算出することにより達成している。
【００１０】本発明において、該標的核酸とはポリヌク
レオチド又はオリゴヌクレオチドから成るＤＮＡ又はＲ
ＮＡであり、そのヌクレオチド配列に特別な限定はな
い。慣用の条件でのハイブリダイゼーションに適するポ
リヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドから成るＤＮＡ
又はＲＮＡであれば、標的核酸たり得る。このような標
的核酸として、例えば、インターロイキン−４遺伝子、
血液凝固系第８因子、ヒトＣ型肝炎ウイルス遺伝子など
が挙げられる。
レオチド又はオリゴヌクレオチドから成るＤＮＡ又はＲ
ＮＡであり、そのヌクレオチド配列に特別な限定はな
い。慣用の条件でのハイブリダイゼーションに適するポ
リヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドから成るＤＮＡ
又はＲＮＡであれば、標的核酸たり得る。このような標
的核酸として、例えば、インターロイキン−４遺伝子、
血液凝固系第８因子、ヒトＣ型肝炎ウイルス遺伝子など
が挙げられる。
【００１１】本発明において、該核酸プローブとは、該
標的核酸のヌクレオチド配列の全部又は一部に相補的な
ヌクレオチド配列を含むことから成る一本鎖ヌクレオチ
ドである。また、核酸プローブは、好ましくはポリヌク
レオチド又はオリゴヌクレオチドから成るＤＮＡである
が、ＲＮＡでもよい。
標的核酸のヌクレオチド配列の全部又は一部に相補的な
ヌクレオチド配列を含むことから成る一本鎖ヌクレオチ
ドである。また、核酸プローブは、好ましくはポリヌク
レオチド又はオリゴヌクレオチドから成るＤＮＡである
が、ＲＮＡでもよい。
【００１２】該核酸プローブは、好ましくは、ホスホロ
アミダイト法（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２，４
５３９−４５５７，１９８４）等により人工的に合成さ
れたヌクレオチドであるが、これに限定されない。
アミダイト法（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２，４
５３９−４５５７，１９８４）等により人工的に合成さ
れたヌクレオチドであるが、これに限定されない。
【００１３】該核酸プローブの有するヌクレオチド配列
は、該標的核酸配列に特有のヌクレオチド配列に対して
相補的であることが好ましい。
は、該標的核酸配列に特有のヌクレオチド配列に対して
相補的であることが好ましい。
【００１４】該核酸プローブの固相化に使用する不溶性
支持体としては、マイクロプレート、チューブ等の内壁
又は粒子等の表面が使用可能である。不溶性支持体の材
質としては、ポリビニル、ポリスチレン等が好ましい
が、これに限定されない。このような不溶性支持体のう
ち、マイクロプレートとして、例えば、ヌンク‐イムノ
・モジュール・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ＮＵ
ＣＮ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ
Ｆ８ Ｆｒａｍｅｄ：ヌンク 社製）が挙げられる。
支持体としては、マイクロプレート、チューブ等の内壁
又は粒子等の表面が使用可能である。不溶性支持体の材
質としては、ポリビニル、ポリスチレン等が好ましい
が、これに限定されない。このような不溶性支持体のう
ち、マイクロプレートとして、例えば、ヌンク‐イムノ
・モジュール・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ＮＵ
ＣＮ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ
Ｆ８ Ｆｒａｍｅｄ：ヌンク 社製）が挙げられる。
【００１５】該不溶性支持体へ該核酸プローブを固相化
する方法としては、特に限定されるものではないが、化
学的結合法又は物理的吸着法に分類される諸法が望まし
い。化学的結合法としては、特に限定されるものではな
いが、例えば、結合用試薬Ａを不溶性支持体と結合さ
せ、他の結合用試薬Ｂを核酸プローブと結合させた後、
結合用試薬Ａと結合用試薬Ｂとを結合させることから成
る方法が可能である。この場合には、結合用試薬Ａと結
合用試薬Ｂとが容易に結合し得る事が必要である。２種
の結合用試薬を用いる場合、例えば、ストレプトアビジ
ン、アビジンまたはリコンビナントアビジン等と、ビオ
チン、フォトプローブビオチンまたはスぺーサーを有す
るビオチン等の組み合わせが好適に用いられる。アビジ
ンとビオチンを利用した核酸プローブの固相化は、先ず
不溶性支持体にアビジンを固相化しておき、次に５'−
端または３'−端をビオチンで標識した核酸プローブを
結合させることにより行う。また、結合用試薬Ａ及び結
合用試薬Ｂを用いる方法以外の化学的結合法として、不
溶性支持体表面にカルボキシル基をスぺーサーとして結
合させておき、ここに５'−端または３'−端をアミド化
した核酸プローブを結合させることから成る方法も好適
に用いられる。物理的吸着法としては、本技術分野で慣
用されるもののなかから適宜選択でき、例えば、被覆用
緩衝液（組成：炭酸ナトリウム１．５９ｇ、炭酸水素ナ
トリウム２．９３ｇ、アジ化ナトリウム０．２ｇ、蒸留
水１Ｌ：ｐＨ９．６）に核酸プローブを溶解させマイク
ロプレートのウェルに分注して４℃で一晩放置し、液相
を除去してからツイーン２０を含むフォスフェート・バ
ッファード・セイライン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆ
ｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：以下、「ＰＢＳ」と記す。
組成：リン酸水素２ナトリウム１２水和物２．９％、塩
化ナトリウム８％、塩化カリウム０．２％、リン酸２水
素カリウム０．２％：ｐＨ７．４）でウェルを洗浄する
ことから成る方法（石川ら編「酵素免疫測定法 第３
版」医学書院、３９５−３９７頁、１９８７年）などが
好適に用いられる。
する方法としては、特に限定されるものではないが、化
学的結合法又は物理的吸着法に分類される諸法が望まし
い。化学的結合法としては、特に限定されるものではな
いが、例えば、結合用試薬Ａを不溶性支持体と結合さ
せ、他の結合用試薬Ｂを核酸プローブと結合させた後、
結合用試薬Ａと結合用試薬Ｂとを結合させることから成
る方法が可能である。この場合には、結合用試薬Ａと結
合用試薬Ｂとが容易に結合し得る事が必要である。２種
の結合用試薬を用いる場合、例えば、ストレプトアビジ
ン、アビジンまたはリコンビナントアビジン等と、ビオ
チン、フォトプローブビオチンまたはスぺーサーを有す
るビオチン等の組み合わせが好適に用いられる。アビジ
ンとビオチンを利用した核酸プローブの固相化は、先ず
不溶性支持体にアビジンを固相化しておき、次に５'−
端または３'−端をビオチンで標識した核酸プローブを
結合させることにより行う。また、結合用試薬Ａ及び結
合用試薬Ｂを用いる方法以外の化学的結合法として、不
溶性支持体表面にカルボキシル基をスぺーサーとして結
合させておき、ここに５'−端または３'−端をアミド化
した核酸プローブを結合させることから成る方法も好適
に用いられる。物理的吸着法としては、本技術分野で慣
用されるもののなかから適宜選択でき、例えば、被覆用
緩衝液（組成：炭酸ナトリウム１．５９ｇ、炭酸水素ナ
トリウム２．９３ｇ、アジ化ナトリウム０．２ｇ、蒸留
水１Ｌ：ｐＨ９．６）に核酸プローブを溶解させマイク
ロプレートのウェルに分注して４℃で一晩放置し、液相
を除去してからツイーン２０を含むフォスフェート・バ
ッファード・セイライン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆ
ｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：以下、「ＰＢＳ」と記す。
組成：リン酸水素２ナトリウム１２水和物２．９％、塩
化ナトリウム８％、塩化カリウム０．２％、リン酸２水
素カリウム０．２％：ｐＨ７．４）でウェルを洗浄する
ことから成る方法（石川ら編「酵素免疫測定法 第３
版」医学書院、３９５−３９７頁、１９８７年）などが
好適に用いられる。
【００１６】本発明では、該標的核酸のヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列を有する該核酸プローブ
を固相化した該不溶性支持体を用いることにより、種々
の核酸が混在する試料中から標的核酸のみを特異的かつ
容易に検出する事が可能になる。また、核酸プローブの
ヌクレオチド配列は、標的核酸配列に特有のヌクレオチ
ド配列の全部又は一部に対して相補的であることが好ま
しい。さらに、核酸プローブをマイクロプレートなどに
固相化することにより、多数の試料中の標的核酸を同時
に定量することが可能となる。例えば、マイクロプレー
トに固相化すれば、液体試料分注装置、マイクロプレー
ト洗浄装置、各種のマイクロプレートリーダーなどを用
いることにより、標的核酸の定量を自動化することも可
能となる。さらに、本発明によれば、測定の対象となる
核酸はＤＮＡに限定されない。
列に相補的なヌクレオチド配列を有する該核酸プローブ
を固相化した該不溶性支持体を用いることにより、種々
の核酸が混在する試料中から標的核酸のみを特異的かつ
容易に検出する事が可能になる。また、核酸プローブの
ヌクレオチド配列は、標的核酸配列に特有のヌクレオチ
ド配列の全部又は一部に対して相補的であることが好ま
しい。さらに、核酸プローブをマイクロプレートなどに
固相化することにより、多数の試料中の標的核酸を同時
に定量することが可能となる。例えば、マイクロプレー
トに固相化すれば、液体試料分注装置、マイクロプレー
ト洗浄装置、各種のマイクロプレートリーダーなどを用
いることにより、標的核酸の定量を自動化することも可
能となる。さらに、本発明によれば、測定の対象となる
核酸はＤＮＡに限定されない。
【００１７】本発明において、被検検体中の該標的核酸
量の算出は、固相化した該核酸プローブと標的核酸を
含む被検検体溶液のハイブリダイゼーション反応を行
い、液相を分離して固相を洗浄したのち、標的核酸
とハイブリダイズしなかった核酸プローブと抗一本鎖核
酸抗体とを結合反応させ、核酸プローブと結合した抗
一本鎖核酸抗体を定量し、全核酸プローブ量から標的
核酸とハイブリダイズしなかった核酸プローブの量を差
し引くことにより達成される。
量の算出は、固相化した該核酸プローブと標的核酸を
含む被検検体溶液のハイブリダイゼーション反応を行
い、液相を分離して固相を洗浄したのち、標的核酸
とハイブリダイズしなかった核酸プローブと抗一本鎖核
酸抗体とを結合反応させ、核酸プローブと結合した抗
一本鎖核酸抗体を定量し、全核酸プローブ量から標的
核酸とハイブリダイズしなかった核酸プローブの量を差
し引くことにより達成される。
【００１８】固相化した該核酸プローブと被検検体溶液
のハイブリダイゼーション反応に使用するハイブリダイ
ゼーション溶液等及びハイブリダイゼーション反応の条
件は、特に限定されるものではなく、本技術分野で慣用
されるものから適宜選択できる（高浪ら編「新生化学実
験講座２；核酸ＩＩ」、東京化学同人、１９７−２０９
頁、１９９１年）。より簡略化したハイブリダイゼーシ
ョン反応として、例えば、以下のような方法も実施可能
である：ＰＢＳに該標的核酸を含む被検検体を溶解し、
核酸プローブを固相化したマイクロプレートのウェルに
５０μｌ添加し、室温で１時間振盪しながら保温する。
保温後ウェル内の反応液を棄て、０．１％ツイーン２０
を含むＰＢＳ（以下、「洗浄液」と記す。）２００μｌ
をウェルに添加し、室温５で分間振盪しながら保温する
ことによりウェルを洗浄する。保温後ウェル内の洗浄液
を棄てる。
のハイブリダイゼーション反応に使用するハイブリダイ
ゼーション溶液等及びハイブリダイゼーション反応の条
件は、特に限定されるものではなく、本技術分野で慣用
されるものから適宜選択できる（高浪ら編「新生化学実
験講座２；核酸ＩＩ」、東京化学同人、１９７−２０９
頁、１９９１年）。より簡略化したハイブリダイゼーシ
ョン反応として、例えば、以下のような方法も実施可能
である：ＰＢＳに該標的核酸を含む被検検体を溶解し、
核酸プローブを固相化したマイクロプレートのウェルに
５０μｌ添加し、室温で１時間振盪しながら保温する。
保温後ウェル内の反応液を棄て、０．１％ツイーン２０
を含むＰＢＳ（以下、「洗浄液」と記す。）２００μｌ
をウェルに添加し、室温５で分間振盪しながら保温する
ことによりウェルを洗浄する。保温後ウェル内の洗浄液
を棄てる。
【００１９】該標的核酸が被検検体中で二本鎖核酸とし
て存在している可能性がある場合、ハイブリダイゼーシ
ョン反応に先立ち、該二本鎖核酸を一本鎖化することが
必要である。二本鎖核酸の一本鎖化は、熱変性により行
なうことが好ましい。熱変性の条件として、例えば、以
下のような条件が可能である：標的核酸を含む被検検体
溶液を１００℃で１０分間加熱した後、ただちに０℃で
５分間保温する。
て存在している可能性がある場合、ハイブリダイゼーシ
ョン反応に先立ち、該二本鎖核酸を一本鎖化することが
必要である。二本鎖核酸の一本鎖化は、熱変性により行
なうことが好ましい。熱変性の条件として、例えば、以
下のような条件が可能である：標的核酸を含む被検検体
溶液を１００℃で１０分間加熱した後、ただちに０℃で
５分間保温する。
【００２０】本発明において、抗一本鎖核酸抗体とは、
一本鎖核酸と特異的に結合する抗体をいう。該抗一本鎖
核酸抗体は、二本鎖核酸に全く結合しないか、または二
本鎖核酸に対する親和性が一本鎖核酸に対する親和性に
比較して著しく劣っている事が必要である。抗一本鎖核
酸抗体はヌクレオチド配列に非特異的で、多種類の一本
鎖核酸に対して親和性を有する。該核酸プローブのヌク
レオチド配列に特異的な抗一本鎖核酸抗体ではなく、こ
のような該抗一本鎖核酸抗体を使用できることが本発明
の利点である。抗一本鎖核酸抗体は、好ましくは、抗一
本鎖ＤＮＡ抗体であり、標識されたもの、未標識のもの
のいずれのものも使用できる。
一本鎖核酸と特異的に結合する抗体をいう。該抗一本鎖
核酸抗体は、二本鎖核酸に全く結合しないか、または二
本鎖核酸に対する親和性が一本鎖核酸に対する親和性に
比較して著しく劣っている事が必要である。抗一本鎖核
酸抗体はヌクレオチド配列に非特異的で、多種類の一本
鎖核酸に対して親和性を有する。該核酸プローブのヌク
レオチド配列に特異的な抗一本鎖核酸抗体ではなく、こ
のような該抗一本鎖核酸抗体を使用できることが本発明
の利点である。抗一本鎖核酸抗体は、好ましくは、抗一
本鎖ＤＮＡ抗体であり、標識されたもの、未標識のもの
のいずれのものも使用できる。
【００２１】該抗一本鎖核酸抗体と該核酸プローブの結
合反応条件には特に限定はなく、本技術分野で慣用され
るものから適宜選択できる（石川ら編「酵素免疫測定法
第３版」医学書院、３９７−３９８頁、１９８７
年）。例えば、以下のような方法が可能である：ＰＢＳ
に抗一本鎖核酸抗体を溶解し、固相化した核酸プローブ
に該標的核酸をハイブリダイズさせ洗浄した後のマイク
ロプレートのウェルに添加し、室温で２時間保温する。
合反応条件には特に限定はなく、本技術分野で慣用され
るものから適宜選択できる（石川ら編「酵素免疫測定法
第３版」医学書院、３９７−３９８頁、１９８７
年）。例えば、以下のような方法が可能である：ＰＢＳ
に抗一本鎖核酸抗体を溶解し、固相化した核酸プローブ
に該標的核酸をハイブリダイズさせ洗浄した後のマイク
ロプレートのウェルに添加し、室温で２時間保温する。
【００２２】該抗一本鎖核酸抗体の標識には、本技術分
野で通常用いられる酵素、化学基等が用いられる。標識
に用いる酵素としては、特に限定されるものではない
が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ等の、基質を発光させる活性を有するものが好ま
しい。標識にこれらの酵素を用い、各酵素に特有の発色
基質、化学発光基質あるいは蛍光基質を使用する事によ
り、発色法、化学発光法、蛍光法（石川ら編「酵素免疫
測定法 第三版」、医学書院、５６〜６４頁、１９８７
年）などを用いた検出が実施可能である。特に化学発光
法、蛍光法は高感度を得るための利点となる。
野で通常用いられる酵素、化学基等が用いられる。標識
に用いる酵素としては、特に限定されるものではない
が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ等の、基質を発光させる活性を有するものが好ま
しい。標識にこれらの酵素を用い、各酵素に特有の発色
基質、化学発光基質あるいは蛍光基質を使用する事によ
り、発色法、化学発光法、蛍光法（石川ら編「酵素免疫
測定法 第三版」、医学書院、５６〜６４頁、１９８７
年）などを用いた検出が実施可能である。特に化学発光
法、蛍光法は高感度を得るための利点となる。
【００２３】また、該抗一本鎖核酸抗体を蛍光色素等の
化学基で直接標識して用いる事も可能である。この場合
には蛍光色素に固有の励起波長で励起させ、固有の検出
波長を測定することになるが、前述した酵素標識法に較
べて測定の手順が１工程減少し、測定に要する時間が短
時間化されるという利点が生じる。抗一本鎖核酸抗体の
標識に用いる化学基としては、特に限定されるものでは
ないが、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、
ローダミン等の蛍光色素が好ましい。
化学基で直接標識して用いる事も可能である。この場合
には蛍光色素に固有の励起波長で励起させ、固有の検出
波長を測定することになるが、前述した酵素標識法に較
べて測定の手順が１工程減少し、測定に要する時間が短
時間化されるという利点が生じる。抗一本鎖核酸抗体の
標識に用いる化学基としては、特に限定されるものでは
ないが、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、
ローダミン等の蛍光色素が好ましい。
【００２４】該標的核酸とハイブリダイズしなかった該
核酸プローブと非標識の該抗一本鎖核酸抗体とを結合反
応させ、抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体を用い
て被検検体中の標的核酸を算出することも実施可能であ
る。該二次抗体は、抗一本鎖核酸抗体の作製に用いた動
物種Ｘの免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ
ｎ：以下、「Ｉｇ」と記す。）等を抗原として他の動物
種Ｙを免疫し、血清を採取し精製することによって得ら
れる。動物種Ｘ及び動物種Ｙとしては、特に限定される
ものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヤギ、ニワトリ等が用いられる。二次抗体の標識に
は、抗一本鎖核酸抗体の標識の項に記した酵素、化学基
が用いられる。
核酸プローブと非標識の該抗一本鎖核酸抗体とを結合反
応させ、抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体を用い
て被検検体中の標的核酸を算出することも実施可能であ
る。該二次抗体は、抗一本鎖核酸抗体の作製に用いた動
物種Ｘの免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉ
ｎ：以下、「Ｉｇ」と記す。）等を抗原として他の動物
種Ｙを免疫し、血清を採取し精製することによって得ら
れる。動物種Ｘ及び動物種Ｙとしては、特に限定される
ものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヤギ、ニワトリ等が用いられる。二次抗体の標識に
は、抗一本鎖核酸抗体の標識の項に記した酵素、化学基
が用いられる。
【００２５】
【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されない。なお、本発明
においては、特に記載しない限り、合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチドはグライナージャパン社においてホス
ホロアミダイト法（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．， ｅｔ ａ
ｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，
４５３９−４５５７，１９８４）で合成し、吸光度の測
定はマイクロプレートリーダーＭＰＲＡ４（東ソー 社
製）を用いておこなった。 実施例１．インターロイキン−４ ＤＮＡフラグメント
の定量。
するが、本発明はこれらに限定されない。なお、本発明
においては、特に記載しない限り、合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチドはグライナージャパン社においてホス
ホロアミダイト法（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．， ｅｔ ａ
ｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，
４５３９−４５５７，１９８４）で合成し、吸光度の測
定はマイクロプレートリーダーＭＰＲＡ４（東ソー 社
製）を用いておこなった。 実施例１．インターロイキン−４ ＤＮＡフラグメント
の定量。
【００２６】ストレプトアビジンを１０μｇ／ｍ１の濃
度に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調
製し、この２００μ１をヌンク‐イムノ・モデジュール
・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）の
ウェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、洗
浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロッキング・
リーエイジェント・フォー・イライザ（Ｂｌｏｃｋｉｎ
ｇ Ｒｅａｇｅｎｔｆｏｒ ＥＬＩＳＡ：べーリンガー
マンハイム 社製）を用い、室温で１５分間静置するこ
とによりブロッキングを行った。インターロイキン−４
（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４：以下、「ＩＬ−４」と
記す。）のＤＮＡ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．， ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，１４，１６８１−１６８４，１９９６）に対する
５'−端ビオチン化ＤＮＡプローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ
−Ｔ12（連続する１２個のチミジン）−ＣＣＡ ＡＣＴ
ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＴ−３'：配列
番号１、Ｔ12は含まない）をＰＢＳで０．０１μｇ／ｍ
ｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍ１の
各濃度に希釈し、該ウェルに５０μ１を分注した。分注
後、振盪しながら室温で１時間保温した。洗浄液で洗浄
後、５０μｌのＩＬ−４ ＤＮＡフラグメント（５'−
ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＴＴ Ｇ
Ｇ−３'（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１４，１６８１−１６８４，１９９６）：配列番号
２）を添加し、振盪しながら室温で１時間保温した。こ
れを洗浄後、ＰＢＳに溶解した抗一本鎖ＤＮＡマウス抗
体（０．５μｇ／ｍｌ：ＱＥＤバイオサイエンス 社
製）５０μｌを添加し、振盪しながら室温で１時間保温
した。洗浄液で洗浄後、洗浄液に溶解したホースラディ
ッシュぺルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅ
ｒｏｘｉｄａｓｅ：以下、「ＨＲＰ」と記す。）標識抗
マウスＩｇＧヤギポリクローナルＦ（ａｂ'）2 抗体
（４．２μｇ／ｍｌ：べ−リンガーマンハイム 社製）
２００μｌを添加し、振盪しながら室温で１時間保温し
た。洗浄後にＨＲＰ発色基質（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキ
シダーゼ発色用キットに含まれる：住友ベークライト
社製）１００μｌを添加し、遮光下室温で１０分間保温
した後にさらに反応停止液（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシ
ダーゼ発色用キットに含まれる：住友ベークライト 社
製）１００μｌを添加し、４９２ｎｍにおける吸光度を
測定した。本実施例では、固相化用の５'−端ビオチン
化ＤＮＡプローブの濃度を０．０１μｇ／ｍ１から３μ
ｇ／ｍ１まで変化させると同時に、ＩＬ−４ ＤＮＡフ
ラグメントの濃度も０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／
ｍｌまで変化させて測定した。結果を図１に示す（較正
曲線）。ＤＮＡプローブの濃度が１μｇ／ｍ１よりも大
きくなると較正曲線に差がみられなくなった。標的核酸
ＩＬ−４ＤＮＡフラグメントの測定範囲は１０ｎｇ／ｍ
１から１μｇ／ｍ１でった。該標的核酸の測定可能な最
低濃度１０ｎｇ／ｍｌは、１ウェルあたりの絶対量とし
て約８０ ｆｅｍｔｏｍｏｌｅｓに相当する。 実施例２．血液凝固系第８因子ＤＮＡフラグメントの定
量。
度に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調
製し、この２００μ１をヌンク‐イムノ・モデジュール
・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）の
ウェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、洗
浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロッキング・
リーエイジェント・フォー・イライザ（Ｂｌｏｃｋｉｎ
ｇ Ｒｅａｇｅｎｔｆｏｒ ＥＬＩＳＡ：べーリンガー
マンハイム 社製）を用い、室温で１５分間静置するこ
とによりブロッキングを行った。インターロイキン−４
（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４：以下、「ＩＬ−４」と
記す。）のＤＮＡ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．， ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，１４，１６８１−１６８４，１９９６）に対する
５'−端ビオチン化ＤＮＡプローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ
−Ｔ12（連続する１２個のチミジン）−ＣＣＡ ＡＣＴ
ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＴ−３'：配列
番号１、Ｔ12は含まない）をＰＢＳで０．０１μｇ／ｍ
ｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍ１の
各濃度に希釈し、該ウェルに５０μ１を分注した。分注
後、振盪しながら室温で１時間保温した。洗浄液で洗浄
後、５０μｌのＩＬ−４ ＤＮＡフラグメント（５'−
ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＴＴ Ｇ
Ｇ−３'（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａ
ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１４，１６８１−１６８４，１９９６）：配列番号
２）を添加し、振盪しながら室温で１時間保温した。こ
れを洗浄後、ＰＢＳに溶解した抗一本鎖ＤＮＡマウス抗
体（０．５μｇ／ｍｌ：ＱＥＤバイオサイエンス 社
製）５０μｌを添加し、振盪しながら室温で１時間保温
した。洗浄液で洗浄後、洗浄液に溶解したホースラディ
ッシュぺルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅ
ｒｏｘｉｄａｓｅ：以下、「ＨＲＰ」と記す。）標識抗
マウスＩｇＧヤギポリクローナルＦ（ａｂ'）2 抗体
（４．２μｇ／ｍｌ：べ−リンガーマンハイム 社製）
２００μｌを添加し、振盪しながら室温で１時間保温し
た。洗浄後にＨＲＰ発色基質（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキ
シダーゼ発色用キットに含まれる：住友ベークライト
社製）１００μｌを添加し、遮光下室温で１０分間保温
した後にさらに反応停止液（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシ
ダーゼ発色用キットに含まれる：住友ベークライト 社
製）１００μｌを添加し、４９２ｎｍにおける吸光度を
測定した。本実施例では、固相化用の５'−端ビオチン
化ＤＮＡプローブの濃度を０．０１μｇ／ｍ１から３μ
ｇ／ｍ１まで変化させると同時に、ＩＬ−４ ＤＮＡフ
ラグメントの濃度も０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／
ｍｌまで変化させて測定した。結果を図１に示す（較正
曲線）。ＤＮＡプローブの濃度が１μｇ／ｍ１よりも大
きくなると較正曲線に差がみられなくなった。標的核酸
ＩＬ−４ＤＮＡフラグメントの測定範囲は１０ｎｇ／ｍ
１から１μｇ／ｍ１でった。該標的核酸の測定可能な最
低濃度１０ｎｇ／ｍｌは、１ウェルあたりの絶対量とし
て約８０ ｆｅｍｔｏｍｏｌｅｓに相当する。 実施例２．血液凝固系第８因子ＤＮＡフラグメントの定
量。
【００２７】ストレプトアビジンを１μｇ／ｍ１の濃度
に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調製
し、この２００μ１をヌンク‐イムノ・モデジュール・
マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）のウ
ェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、該ウ
ェルを洗浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロッ
キング・リーエイジェント・フォー・イライザ（ベーリ
ンガーマンハイム 社製）を用い、室温で１５分間静置
することによりブロッキングを行った。該ウェルに、Ｐ
ＢＳに溶解させた血液凝固系第８因子（ｂｌｏｏｄ ｃ
ｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ：以
下、ＦＶＩＩＩと記す）のＤＮＡ（Ｇｉｔｓｃｈｉｅ
ｒ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１
２，３２６−３３０，１９８４）に対する５'−端ビオ
チン化ＤＮＡプローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ−Ｔ12（連
続する１２個のチミジン）−ＴＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ
ＴＡＡ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＡＧ ＧＣ−３'：配列番
号３、Ｔ12は含まない：ジーンメッド・バイオテクノロ
ジー 社製）５０μｌを添加後、振盪しながら室温で１
時間保温した。洗浄液で洗浄後、ここにＰＢＳに溶解さ
せた、５０μｌのＦＶＩＩＩＤＮＡフラグメント（５'
−ＧＣＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＧＣ
ＴＴＴ ＴＡ−３'（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．， ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２，３２６−３３
０，１９８４）：配列番号４）を添加し、振盪しながら
室温で１時間保温した。これを洗浄液で洗浄後、ＰＢＳ
に溶解させた抗一本鎖ＤＮＡマウス抗体（０．５μｇ／
ｍｌ：ＱＥＤバイオサイエンス 社製）５０μ１を添加
し、振盪しながら室温で１時間保温した。洗浄液で洗浄
後、洗浄液に溶解したＦ（ａｂ'）2 化したＨＲＰ標識
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（５μｇ／ｍ
ｌ：ベーリンガーマンハイム 社製）２００μ１を添加
し、振盪しながら室温で１時間保温した。洗浄液で洗浄
後にＨＲＰ発色基質１００μ１（ＳＵＭｌＬＯＮペルオ
キシダーゼ発色用キットに含まれる：住友ベークライト
社製）を添加し、遮光下室温で１０分間保温した後に
さらに反応停止液（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発
色用キットに含まれる：住友ベークライト社製）１００
μｌを添加し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
本実施例では、固相化用の５'−端ビオチン化ＤＮＡプ
ローブの濃度を０．０１μｇ／ｍ１から３μｇ／ｍｌま
で変化させると同時に、ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメン
トの濃度も０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで
変化させて測定した。結果を図２に示す（較正曲線）。
ＤＮＡプローブの濃度が１μｇ／ｍｌよりも大きくなる
と較正曲線に差がみられなくなった。標的核酸ＦＶＩＩ
Ｉ ＤＮＡフラグメントの測定範囲は１０ｎｇ／ｍｌか
ら１μｇ／ｍ１であった。該標的核酸の測定可能な最低
濃度１０ｎｇ／ｍｌは、１ウェルあたりの絶対量として
約７０ ｆｅｍｔｏｍｏｌｅｓに相当する。 実施例３．Ｃ型肝炎ウイルス ＲＮＡフラグメントの定
量。
に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調製
し、この２００μ１をヌンク‐イムノ・モデジュール・
マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）のウ
ェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、該ウ
ェルを洗浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロッ
キング・リーエイジェント・フォー・イライザ（ベーリ
ンガーマンハイム 社製）を用い、室温で１５分間静置
することによりブロッキングを行った。該ウェルに、Ｐ
ＢＳに溶解させた血液凝固系第８因子（ｂｌｏｏｄ ｃ
ｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ：以
下、ＦＶＩＩＩと記す）のＤＮＡ（Ｇｉｔｓｃｈｉｅ
ｒ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１
２，３２６−３３０，１９８４）に対する５'−端ビオ
チン化ＤＮＡプローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ−Ｔ12（連
続する１２個のチミジン）−ＴＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ
ＴＡＡ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＡＧ ＧＣ−３'：配列番
号３、Ｔ12は含まない：ジーンメッド・バイオテクノロ
ジー 社製）５０μｌを添加後、振盪しながら室温で１
時間保温した。洗浄液で洗浄後、ここにＰＢＳに溶解さ
せた、５０μｌのＦＶＩＩＩＤＮＡフラグメント（５'
−ＧＣＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＧＣ
ＴＴＴ ＴＡ−３'（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．， ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２，３２６−３３
０，１９８４）：配列番号４）を添加し、振盪しながら
室温で１時間保温した。これを洗浄液で洗浄後、ＰＢＳ
に溶解させた抗一本鎖ＤＮＡマウス抗体（０．５μｇ／
ｍｌ：ＱＥＤバイオサイエンス 社製）５０μ１を添加
し、振盪しながら室温で１時間保温した。洗浄液で洗浄
後、洗浄液に溶解したＦ（ａｂ'）2 化したＨＲＰ標識
抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（５μｇ／ｍ
ｌ：ベーリンガーマンハイム 社製）２００μ１を添加
し、振盪しながら室温で１時間保温した。洗浄液で洗浄
後にＨＲＰ発色基質１００μ１（ＳＵＭｌＬＯＮペルオ
キシダーゼ発色用キットに含まれる：住友ベークライト
社製）を添加し、遮光下室温で１０分間保温した後に
さらに反応停止液（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発
色用キットに含まれる：住友ベークライト社製）１００
μｌを添加し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
本実施例では、固相化用の５'−端ビオチン化ＤＮＡプ
ローブの濃度を０．０１μｇ／ｍ１から３μｇ／ｍｌま
で変化させると同時に、ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメン
トの濃度も０．００１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまで
変化させて測定した。結果を図２に示す（較正曲線）。
ＤＮＡプローブの濃度が１μｇ／ｍｌよりも大きくなる
と較正曲線に差がみられなくなった。標的核酸ＦＶＩＩ
Ｉ ＤＮＡフラグメントの測定範囲は１０ｎｇ／ｍｌか
ら１μｇ／ｍ１であった。該標的核酸の測定可能な最低
濃度１０ｎｇ／ｍｌは、１ウェルあたりの絶対量として
約７０ ｆｅｍｔｏｍｏｌｅｓに相当する。 実施例３．Ｃ型肝炎ウイルス ＲＮＡフラグメントの定
量。
【００２８】ストレプトアビジンを１０μｇ／ｍｌの濃
度に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調
製し、この２００μｌをヌンク‐イムノ・モデジュール
・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）の
ウェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、該
ウェルを洗浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロ
ッキング・リーエイジェント・フォー・イライザ（ベー
リンガー・マンハイム社製）を用い、室温で１５分間静
置することによりブロッキングを行なった。ストレプト
アビジンを固相化した該ウェルに、ＰＢＳに溶解させた
Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕ
ｓ：以下、ＨＣＶと記す）のＲＮＡ（Ｋａｔｏ，Ｎ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ．， ８７，９５２４−９５２８，１９９
０）に対する５'−端ビオチン化ＤＮＡプローブ（５'−
ｂｉｏｔｉｎ−Ｔ12（連続する１２個のチミジン）−Ｃ
ＡＣ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＴ
Ａ ＧＡＧ ＴＡＧＣＴＴ−３'：配列番号５、Ｔ12は
含まない）５０μｌを添加後、振盪しながら室温で１時
間保温した。これを洗浄液で洗浄後、ここにＰＢＳに溶
解させた５０μｌのＨＣＶ ＲＮＡフラグメント（５'
−ＡＡＧ ＣＵＡ ＣＵＣ ＵＡＣＣＵＵ ＣＵＣ Ａ
ＣＧ ＡＧＡ ＧＵＣ ＧＵＧ−３'：ＨＣＶのＲＮＡ
配列（Ｋａｔｏ，Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．， ８７，９５
２４−９５２８，１９９０）に基づいて作製した。：配
列番号６）を添加し、振盪しながら室温で１時間保温し
た。これを洗浄液で洗浄後、ＰＢＳに溶解させた抗一本
鎖ＤＮＡマウス抗体（０．５μｇ／ｍｌ：ＱＥＤバイオ
サイエンス 社製）５０μｌを添加し、振盪しながら室
温で１時間保温した。洗浄液で洗浄後、洗浄液に溶解し
たＦ（ａｂ'）2化したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギポ
リクローナル抗体（１．８μｇ／ｍｌ：ベーリンガーマ
ンハイム社製）２００μｌを添加し、振盪しながら室温
で１時間保温した。洗浄液で洗浄後にＨＲＰ発色基質１
００μｌ（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用キッ
トに含まれる：住友ベークライト 社製）を添加し、遮
光下室温で１０分間保温した後にさらに反応停止液（Ｓ
ＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用キットに含まれ
る：住友ベークライト 社製）１００μｌを添加し、４
９２ｎｍにおける吸光度を測定した。本実施例では、固
相化用の５'‐端ビオチン化ＤＮＡプローブの濃度を１
μｇ／ｍｌと３μｇ／ｍｌに変化させるとともに、ＨＣ
Ｖ ＲＮＡフラグメントの濃度も０．０００１μｇ／ｍ
ｌから１０μｇ／ｍｌまで変化させて測定した。結果を
図３に示す（校正曲線）。ＤＮＡプローブの濃度が１０
μｇ／ｍｌよりも大きくなると較正曲線に差がみられな
くなった。標的核酸ＨＣＶ ＲＮＡの測定範囲は１０ｎ
ｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌであった。該標的核酸の測定
可能な最低濃度１０ｎｇ／ｍｌは、１ウェルあたりの絶
対量として約５０ ｆｅｍｔｏｍｏｌｅｓに相当する。 実施例４．ＩＬ−４ ＤＮＡフラグメント測定系に対す
るＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメントおよびＨＣＶ関連Ｄ
ＮＡの交差反応性。
度に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調
製し、この２００μｌをヌンク‐イムノ・モデジュール
・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）の
ウェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、該
ウェルを洗浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロ
ッキング・リーエイジェント・フォー・イライザ（ベー
リンガー・マンハイム社製）を用い、室温で１５分間静
置することによりブロッキングを行なった。ストレプト
アビジンを固相化した該ウェルに、ＰＢＳに溶解させた
Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕ
ｓ：以下、ＨＣＶと記す）のＲＮＡ（Ｋａｔｏ，Ｎ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ．， ８７，９５２４−９５２８，１９９
０）に対する５'−端ビオチン化ＤＮＡプローブ（５'−
ｂｉｏｔｉｎ−Ｔ12（連続する１２個のチミジン）−Ｃ
ＡＣ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＴ
Ａ ＧＡＧ ＴＡＧＣＴＴ−３'：配列番号５、Ｔ12は
含まない）５０μｌを添加後、振盪しながら室温で１時
間保温した。これを洗浄液で洗浄後、ここにＰＢＳに溶
解させた５０μｌのＨＣＶ ＲＮＡフラグメント（５'
−ＡＡＧ ＣＵＡ ＣＵＣ ＵＡＣＣＵＵ ＣＵＣ Ａ
ＣＧ ＡＧＡ ＧＵＣ ＧＵＧ−３'：ＨＣＶのＲＮＡ
配列（Ｋａｔｏ，Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．， ８７，９５
２４−９５２８，１９９０）に基づいて作製した。：配
列番号６）を添加し、振盪しながら室温で１時間保温し
た。これを洗浄液で洗浄後、ＰＢＳに溶解させた抗一本
鎖ＤＮＡマウス抗体（０．５μｇ／ｍｌ：ＱＥＤバイオ
サイエンス 社製）５０μｌを添加し、振盪しながら室
温で１時間保温した。洗浄液で洗浄後、洗浄液に溶解し
たＦ（ａｂ'）2化したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギポ
リクローナル抗体（１．８μｇ／ｍｌ：ベーリンガーマ
ンハイム社製）２００μｌを添加し、振盪しながら室温
で１時間保温した。洗浄液で洗浄後にＨＲＰ発色基質１
００μｌ（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用キッ
トに含まれる：住友ベークライト 社製）を添加し、遮
光下室温で１０分間保温した後にさらに反応停止液（Ｓ
ＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用キットに含まれ
る：住友ベークライト 社製）１００μｌを添加し、４
９２ｎｍにおける吸光度を測定した。本実施例では、固
相化用の５'‐端ビオチン化ＤＮＡプローブの濃度を１
μｇ／ｍｌと３μｇ／ｍｌに変化させるとともに、ＨＣ
Ｖ ＲＮＡフラグメントの濃度も０．０００１μｇ／ｍ
ｌから１０μｇ／ｍｌまで変化させて測定した。結果を
図３に示す（校正曲線）。ＤＮＡプローブの濃度が１０
μｇ／ｍｌよりも大きくなると較正曲線に差がみられな
くなった。標的核酸ＨＣＶ ＲＮＡの測定範囲は１０ｎ
ｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌであった。該標的核酸の測定
可能な最低濃度１０ｎｇ／ｍｌは、１ウェルあたりの絶
対量として約５０ ｆｅｍｔｏｍｏｌｅｓに相当する。 実施例４．ＩＬ−４ ＤＮＡフラグメント測定系に対す
るＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメントおよびＨＣＶ関連Ｄ
ＮＡの交差反応性。
【００２９】ストレプトアビジンを１０μｇ／ｍｌの濃
度に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調
製し、この２００μｌをヌンク‐イムノ・モデジュール
・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）の
ウェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、該
ウェルを洗浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロ
ッキング・リーエイジェント・フォー・イライザ（ベー
リンガー・マンハイム社製）を用い、室温で１５分間静
置することによりブロッキングを行なった。ストレプト
アビジンを固相化した該ウェルに、ＰＢＳに溶解させた
ＩＬ−４のＤＮＡ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．， ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ １４，１６８１−１６８４，１９９６）に対する
５'−端ビオチン化ＤＮＡプローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ
−Ｔ12（連続する１２個のチミジン）−ＣＣＡ ＡＣＴ
ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＴ−３'：配列
番号１）をＰＢＳで１μｌ／ｍｌの濃度に希釈し、該ウ
ェルに５０μｌを分注した。分注後、振盪しながら室温
で１時間保温した。これを洗浄液で洗浄後、ここにＰＢ
Ｓに溶解させた５０μｌのＩＬ−４ ＤＮＡフラグメン
ト（５'−ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＣＡ
ＧＴＴ ＧＧ−３'（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，１４，１６８１−１６８４，１９９６）；配列
番号２）、ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメント（５'−Ｇ
ＣＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴ
Ｔ ＴＡ−３'（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２，３２６−３３０，
１９８４）：配列番号４）、ＨＣＶ ｒｅｌａｔｅｄ
ＤＮＡフラグメント（５'−ＴＧＴ ＡＣＧ ＧＴＡ
ＡＧＴ ＧＣＴＧＡＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＣ
Ａ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＧＡ Ａ−３'：ＨＣＶ ＲＮ
Ａ（Ｋａｔｏ，Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．， ８７，９５２
４−９５２８，１９９０）に基づいて作製した。：配列
番号７）を添加し、振盪しながら室温で１時間保温し
た。これを洗浄液で洗浄後、ＰＢＳに溶解させた抗一本
鎖ＤＮＡマウス抗体（０．５μｇ／ｍｌ：ＱＥＤバイオ
サイエンス 社製）５０μｌを添加し、振盪しながら室
温で１時間保温した。洗浄液で洗浄後、洗浄液に溶解し
たＦ（ａｂ'）2化したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギポ
リクローナル抗体（１．８μｇ／ｍｌ：ベーリンガーマ
ンハイム 社製）２００μｌを添加し、振盪しながら室
温で１時間保温した。洗浄液で洗浄後に、ＨＲＰ発色基
質１００μｌ（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用
キットに含まれる：住友ベークライト 社製）を添加
し、遮光下室温で１０分間保温した後にさらに反応停止
液（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用キットに含
まれる：住友ベークライト 社製）１００μｌを添加
し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。本実施例で
は各ＤＮＡフラグメントの濃度を、ＩＬ−４ ＤＮＡフ
ラグメントでは０．０１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌま
で、ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメントでは０．１μｇ／
から３０μｇ／ｍｌまで、ＨＣＶ ｒｅｌａｔｅｄ Ｄ
ＮＡフラグメントでは０．１μｇ／ｍｌから３０μｇ／
ｍｌまでそれぞれ変化させて測定した。結果を図４に示
す（校正曲線）。ＩＬ−４ ＤＮＡフラグメントに対す
る較正曲線は図４に示通りであったが、ＦＶＩＩＩ Ｄ
ＮＡフラグメントとＨＣＶ ｒｅｌａｔｅｄ ＤＮＡフ
ラグメントは、ＩＬ−４フラグメントのアッセイ系にお
いては３０μｇ／ｍｌの濃度まで交差反応性を示さず、
本方法で作製したアッセイ系の特異性が非常に高いこと
が示される。 実施例５．蛍光色素で標識したＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラ
グメントのアッセイ系：抗一本鎖ＤＮＡ抗体を用いたア
ッセイ系との比較。
度に０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で調
製し、この２００μｌをヌンク‐イムノ・モデジュール
・マキシソープ・Ｆ８・フレイムド（ヌンク 社製）の
ウェルに分注した後、４℃で一晩保温した。保温後、該
ウェルを洗浄液で洗浄し、その後２７ｍｇ／ｍｌのブロ
ッキング・リーエイジェント・フォー・イライザ（ベー
リンガー・マンハイム社製）を用い、室温で１５分間静
置することによりブロッキングを行なった。ストレプト
アビジンを固相化した該ウェルに、ＰＢＳに溶解させた
ＩＬ−４のＤＮＡ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．， ｅ
ｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ １４，１６８１−１６８４，１９９６）に対する
５'−端ビオチン化ＤＮＡプローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ
−Ｔ12（連続する１２個のチミジン）−ＣＣＡ ＡＣＴ
ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＴ−３'：配列
番号１）をＰＢＳで１μｌ／ｍｌの濃度に希釈し、該ウ
ェルに５０μｌを分注した。分注後、振盪しながら室温
で１時間保温した。これを洗浄液で洗浄後、ここにＰＢ
Ｓに溶解させた５０μｌのＩＬ−４ ＤＮＡフラグメン
ト（５'−ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＣＡ
ＧＴＴ ＧＧ−３'（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，１４，１６８１−１６８４，１９９６）；配列
番号２）、ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメント（５'−Ｇ
ＣＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴ
Ｔ ＴＡ−３'（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．， ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２，３２６−３３０，
１９８４）：配列番号４）、ＨＣＶ ｒｅｌａｔｅｄ
ＤＮＡフラグメント（５'−ＴＧＴ ＡＣＧ ＧＴＡ
ＡＧＴ ＧＣＴＧＡＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＣ
Ａ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＧＡ Ａ−３'：ＨＣＶ ＲＮ
Ａ（Ｋａｔｏ，Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．， ８７，９５２
４−９５２８，１９９０）に基づいて作製した。：配列
番号７）を添加し、振盪しながら室温で１時間保温し
た。これを洗浄液で洗浄後、ＰＢＳに溶解させた抗一本
鎖ＤＮＡマウス抗体（０．５μｇ／ｍｌ：ＱＥＤバイオ
サイエンス 社製）５０μｌを添加し、振盪しながら室
温で１時間保温した。洗浄液で洗浄後、洗浄液に溶解し
たＦ（ａｂ'）2化したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギポ
リクローナル抗体（１．８μｇ／ｍｌ：ベーリンガーマ
ンハイム 社製）２００μｌを添加し、振盪しながら室
温で１時間保温した。洗浄液で洗浄後に、ＨＲＰ発色基
質１００μｌ（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用
キットに含まれる：住友ベークライト 社製）を添加
し、遮光下室温で１０分間保温した後にさらに反応停止
液（ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色用キットに含
まれる：住友ベークライト 社製）１００μｌを添加
し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。本実施例で
は各ＤＮＡフラグメントの濃度を、ＩＬ−４ ＤＮＡフ
ラグメントでは０．０１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌま
で、ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメントでは０．１μｇ／
から３０μｇ／ｍｌまで、ＨＣＶ ｒｅｌａｔｅｄ Ｄ
ＮＡフラグメントでは０．１μｇ／ｍｌから３０μｇ／
ｍｌまでそれぞれ変化させて測定した。結果を図４に示
す（校正曲線）。ＩＬ−４ ＤＮＡフラグメントに対す
る較正曲線は図４に示通りであったが、ＦＶＩＩＩ Ｄ
ＮＡフラグメントとＨＣＶ ｒｅｌａｔｅｄ ＤＮＡフ
ラグメントは、ＩＬ−４フラグメントのアッセイ系にお
いては３０μｇ／ｍｌの濃度まで交差反応性を示さず、
本方法で作製したアッセイ系の特異性が非常に高いこと
が示される。 実施例５．蛍光色素で標識したＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラ
グメントのアッセイ系：抗一本鎖ＤＮＡ抗体を用いたア
ッセイ系との比較。
【００３０】蛍光測定用マイクロプレート、オパク・ス
トリプウェル（ＯＰＡＱＵＥ ＳＴＲＩＰＷＥＬＬ：コ
ーニング・コースター 社製）へ、ストレプトアビジン
を３μｇ／ｍｌの濃度で固相化し、さらにここへＦＶＩ
ＩＩ核酸プローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ−Ｔ12（連続す
る１２個のチミジン）−ＴＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡ
Ａ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＡＧ ＧＣ−３'（Ｇｉｔｓｃ
ｈｉｅｒ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，
３１２，３２６−３３０，１９８４）：配列番号３、Ｔ
12は含まない：ジーンメッド・バイオテクノロジー社
製）の固相化を実施例２．に示したものと同じ方法で行
なった。このプレートを洗浄液で洗浄後、ここにＰＢＳ
に溶解させた３'−端を蛍光色素ＦＩＴＣで標識した５
０μｌのＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメント（５'−ＧＣ
Ｃ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ
ＴＡ−ＦＩＴＣ−３'（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２，３２６−
３３０，１９８４）：配列番号４）を添加し、振盪しな
がら室温で１時間保温した。これを洗浄液で洗浄後、核
酸プローブと結合したＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメント
を標識しているＦＩＴＣの蛍光を、蛍光プレートリーダ
ー：バイオルミン ９６０（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ９６０：
モレキュラー・ダイナミクス 社製）を使用し、励起波
長４９５ｎｍ、蛍光波長５１９ｎｍで測定した。本実施
例ではＦＩＴＣ標識ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの
濃度を０．００３μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌまで変化
させて検討した。図５にその結果を示す。３μｇ／ｍｌ
における蛍光強度は、０．００３μｇ／ｍｌにおいて得
られた蛍光強度の約４．５倍しかなく、ＦＶＩＩＩ Ｄ
ＮＡフラグメント濃度の増加に伴う充分な蛍光強度の増
加は得られず、この測定系におけるＦＶＩＩＩ ＤＮＡ
フラグメントの正確な測定は不可能であった。
トリプウェル（ＯＰＡＱＵＥ ＳＴＲＩＰＷＥＬＬ：コ
ーニング・コースター 社製）へ、ストレプトアビジン
を３μｇ／ｍｌの濃度で固相化し、さらにここへＦＶＩ
ＩＩ核酸プローブ（５'−ｂｉｏｔｉｎ−Ｔ12（連続す
る１２個のチミジン）−ＴＡＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡ
Ａ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＡＧ ＧＣ−３'（Ｇｉｔｓｃ
ｈｉｅｒ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，
３１２，３２６−３３０，１９８４）：配列番号３、Ｔ
12は含まない：ジーンメッド・バイオテクノロジー社
製）の固相化を実施例２．に示したものと同じ方法で行
なった。このプレートを洗浄液で洗浄後、ここにＰＢＳ
に溶解させた３'−端を蛍光色素ＦＩＴＣで標識した５
０μｌのＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメント（５'−ＧＣ
Ｃ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴＴ
ＴＡ−ＦＩＴＣ−３'（Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ，Ｊ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２，３２６−
３３０，１９８４）：配列番号４）を添加し、振盪しな
がら室温で１時間保温した。これを洗浄液で洗浄後、核
酸プローブと結合したＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメント
を標識しているＦＩＴＣの蛍光を、蛍光プレートリーダ
ー：バイオルミン ９６０（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ９６０：
モレキュラー・ダイナミクス 社製）を使用し、励起波
長４９５ｎｍ、蛍光波長５１９ｎｍで測定した。本実施
例ではＦＩＴＣ標識ＦＶＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの
濃度を０．００３μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌまで変化
させて検討した。図５にその結果を示す。３μｇ／ｍｌ
における蛍光強度は、０．００３μｇ／ｍｌにおいて得
られた蛍光強度の約４．５倍しかなく、ＦＶＩＩＩ Ｄ
ＮＡフラグメント濃度の増加に伴う充分な蛍光強度の増
加は得られず、この測定系におけるＦＶＩＩＩ ＤＮＡ
フラグメントの正確な測定は不可能であった。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、操作が容易で自動化が可
能なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの定量的
検出法と該定量的検出法に基づくキットが提供される。
能なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの定量的
検出法と該定量的検出法に基づくキットが提供される。
【図１】ＩＬ−４ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔに対する
較正曲線図。
較正曲線図。
【図２】ＦＶＩＩＩ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔに対す
る較正曲線図。
る較正曲線図。
【図３】ＨＣＶ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔに対する較
正曲線図。
正曲線図。
【図４】ＩＬ−４ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ測定系に
おけるＩＬ−４ ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔ、ＦＶＩＩＩ
ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＨＣＶ ｒｅｌａｔｅ
ｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔに対する較正曲線図。
おけるＩＬ−４ ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔ、ＦＶＩＩＩ
ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＨＣＶ ｒｅｌａｔｅ
ｄ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔに対する較正曲線図。
【図５】蛍光色素（ＦＩＴＣ）標識したＦＶＩＩＩ Ｄ
ＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔに対する較正曲線図。
ＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔに対する較正曲線図。
【配列番号１】ヒトＩＬ−４ ＤＮＡ検出用核酸プロー
ブ。
ブ。
【配列番号２】ヒトＩＬ−４ ＤＮＡ検出用核酸プロー
ブとハイブリダイズするように設計されたＤＮＡ。
ブとハイブリダイズするように設計されたＤＮＡ。
【配列番号３】ヒトＦＶＩＩＩ ＤＮＡ検出用核酸プロ
ーブ。
ーブ。
【配列番号４】ヒトＦＶＩＩＩ ＤＮＡ検出用核酸プロ
ーブとハイブリダイズするように設計されたＤＮＡ。
ーブとハイブリダイズするように設計されたＤＮＡ。
【配列番号５】ＨＣＶ ＲＮＡ検出用核酸プローブ。
【配列番号６】ＨＣＶ ＲＮＡ検出用核酸プローブとハ
イブリダイズするように設計されたＲＮＡ。
イブリダイズするように設計されたＲＮＡ。
【配列番号７】ＨＣＶ ＲＮＡ検出用核酸プローブとハ
イブリダイズするように設計されたＤＮＡ。
イブリダイズするように設計されたＤＮＡ。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sankyo Company, Limited <120> Methods of the quantitative determination of nucleic acids and kits therefor. <130> 98101SW <140> <141> <150> JP HEI 9-244208 <151> 1997-09-09 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A probe which hybridizes to a DNA encoding human interleukin-4. <400> 1 ccaactgttt ccccctctgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: A designed DNA which hybridizes to a probe which hybridizes to a DNA encoding human interleukin-4. <400> 2 acagaggggg aagcagttgg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A probe which hybridizes to a DNA encoding human blood coagulation factor VIII. <400> 3 taaaagcttt aaatggtcta ggc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A designed DNA which hybridizes to a probe which hybridizes a DNA encoding human blood coagulation factor VIII. <400> 4 gcctagacca tttaaagctt tta 23 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A probe which hybridizes to an RNA encoding hepatitis C virus. <400> 5 cacgactctc gtgagaaggt agagtagctt 30 <210> 6 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A designed RNA which hybridizes to a probe which hybridizes to an RNA encoding hepatitis C virus. <400> 6 aagcuacucu accuucucac gagagucgug 30 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A designed DNA which hybridizes to a probe which hybridizes to an RNA encoding hepatitis C virus. <400> 7 tgtacggtaa gtgctgagag cactcttcca tctcatcgaa 40
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ａ 33/543 ５０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (8)
- 【請求項１】以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配
列を有する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸プローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸プローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。 - 【請求項２】以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配
列を有する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有する核酸ブローブを不溶性支持体に固相化
する、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を固相化核酸ブローブとハイブリ
ダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸ブロ
ーブと、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する非標識抗一本鎖核酸抗体を結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した非標識抗一本鎖核酸抗
体を、これに対する標識二次抗体を用いて定量する。 - 【請求項３】以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配
列を有する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列を有する核酸とハイ
ブリダイズし得る核酸プローブに、結合用試薬Ａを結合
させる、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを、不溶性支持体に固相化する、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａを、固相化した
結合用試薬Ｂと結合させる、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を、固相化した核酸プローブとハ
イブリダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固相化核酸プロ
ーブを、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する標識抗一本鎖核酸抗体と結合反応させる、 固相化核酸プローブと結合した標識抗一本鎖核酸抗体
を定量する。 - 【請求項４】以下の工程から成る、特定ヌクレオチド配
列を有する核酸の定量法： 測定対象の特定ヌクレオチド配列を有する核酸にハイ
ブリダイズし得る核酸プローブに、結合用試薬Ａを結合
させる、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを、不溶性支持体に固相化する、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａを、固相化した
結合用試薬Ｂと結合させる、 被検画分中の核酸を一本鎖化する、 一本鎖化された核酸を、固相化核酸プローブとハイブ
リダイズさせる、 標的核酸とハイブリダイズしなかった固定化核酸プロ
ーブを、ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結
合する非標識抗一本鎖核酸抗体と結合反応させる、 固相化した核酸プローブと結合した非標識抗一本鎖核
酸抗体を、これに対する標識二次抗体を用いて定量す
る。 - 【請求項５】以下の成分から成る、特定のヌクレオチド
配列を有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
標識抗一本鎖核酸抗体、 標識抗一本鎖核酸抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項６】以下の成分から成る、特定のヌクレオチド
配列を有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体、 標識二次抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項７】以下の成分から成る、特定のヌクレオチド
配列を有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブと結合する結合用試薬Ａ、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
標識抗一本鎖核酸抗体、 標識抗一本鎖核酸抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項８】以下の成分から成る、特定のヌクレオチド
配列を有する核酸の定量用キット： 特定のヌクレオチド配列を有する被検核酸にハイブリ
ダイズし得る核酸プローブと結合する結合用試薬Ａ、 核酸プローブと結合した結合用試薬Ａに結合し得る結
合用試薬Ｂを固相化した不溶性支持体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体、 ヌクレオチド配列非特異的に一本鎖の核酸と結合する
非標識抗一本鎖核酸抗体に対する標識二次抗体、 標識二次抗体検出溶液、 ハイブリダイゼーション溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10241445A JPH11148935A (ja) | 1997-09-09 | 1998-08-27 | 核酸の定量的検出法及び核酸の定量的検出キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24420897 | 1997-09-09 | ||
| JP9-244208 | 1997-09-09 | ||
| JP10241445A JPH11148935A (ja) | 1997-09-09 | 1998-08-27 | 核酸の定量的検出法及び核酸の定量的検出キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11148935A true JPH11148935A (ja) | 1999-06-02 |
Family
ID=26535266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10241445A Pending JPH11148935A (ja) | 1997-09-09 | 1998-08-27 | 核酸の定量的検出法及び核酸の定量的検出キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11148935A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8674163B2 (en) | 2003-05-29 | 2014-03-18 | Canon Kabushiki Kaisha | DNA hybrids and environment cleaning system employing DNA hybrids |
-
1998
- 1998-08-27 JP JP10241445A patent/JPH11148935A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8674163B2 (en) | 2003-05-29 | 2014-03-18 | Canon Kabushiki Kaisha | DNA hybrids and environment cleaning system employing DNA hybrids |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
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