CN117969818A - 一种生物素化预处理梅毒抗原的方法和梅毒抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梅毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：试剂R1，链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原；试剂R2，含有消除血清干扰效应的重要组分；试剂R3，碱性磷酸酶标记TP15、TP17、TP47三个片段的抗原。所述试剂盒进一步的包括定标品A(阴性)和定标品B(阳性)。本发明的试剂盒采用链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原相对于传统的双抗原夹心检测法解决了样本生物素干扰造成阳性结果漏检的问题，具有高灵敏度，准确度高，操作方便等优点。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断检测领域，具体涉及一种生物素化预处理梅毒抗原的方法。
背景技术
苍白密螺旋体苍白亚种(treponema pallidumsubp.pallidum)(又名梅毒螺旋体)感染人体所引起的一种系统性、慢性性传播疾病，可引起人体多系统多器官的损害，产生多种临床表现，导致组织破坏、功能失常，甚至危及生命。分为后天性梅毒和先天性梅毒。前者主要通过性接触感染，后者从母体通过胎盘传给胎儿，偶然可经输血感染。梅毒临床现有检测方法有暗视野显微镜检查、镀银染色检查、梅毒血清学实验、非梅毒血清学实验、核酸扩增试验，组织病理检查等，其中梅毒血清学实验中化学发光法逐渐成为趋势。现有化学发光法多为双抗原夹心技术，采用亲和素与生物素放大信号的原理。基本步骤为：样本、链霉亲和素磁微粒、生物素化TP抗原依次加入到反应杯中，孵育、洗涤，样本中TP抗体被捕获在磁微粒上。之后，加入碱性磷酸酶标记的TP抗原，孵育、洗涤。加入化学发光底物，测定产生的化学发光信号，以相对发光单位(RLU)进行表示。
然而，上述方法检测过程存在样本中游离的生物素会干扰结果的问题，影响试剂盒测值定性结果，造成阳性结果漏检，造成对患者病症的误诊。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原的制备方法为，包括如下步骤：1)使用TP15、TP17、TP47三个片段的抗原分别与生物素交联，形成TP15Ag-Biotin、TP17Ag-Biotin、TP47Ag-Biotin交联物；2)将三个片段的交联物按照比例混合形成Ag-Biotin混合物；3)使用链霉亲和素与Ag-Biotin混合物混合交联。
在某些实施方式中，步骤1)中三个片段的抗原分别与生物素以物质的量(摩尔比)1：20比例交联。
在某些实施方式中，步骤2)中三个片段的交联物按照浓度比例2：1：4混合。
在某些实施方式中，步骤3)中链霉亲和素使用优选浓度为6mg/mL。
在某些实施方式中，步骤3)中链霉亲和素与Ag-Biotin混合物混合后各组分浓度为：链霉亲和素浓度为6mg/mL、TP15Ag-Biotin 2.5μg/mL、TP17Ag-Biotin1.25μg/mL、TP47Ag-Biotin 5μg/mL。
本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的方法获得的链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原。
本发明第三方面提供了梅毒抗体检测试剂盒，包括：试剂R1，链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原；试剂R3，碱性磷酸酶(AP)标记的TP15、TP17、TP47抗原；任选地，进一步包括试剂R2，其含有消除血清干扰效应的重要组分。
在某些实施方式中，所述链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原的制备方法为：使用TP15、TP17、TP47三个片段的抗原分别与生物素交联，形成TP15Ag-Biotin、TP17Ag-Biotin、TP47Ag-Biotin交联物；将三个片段的交联物按照比例混合形成Ag-Biotin混合物；使用链霉亲和素与Ag-Biotin混合物混合交联。
在某些实施方式中，所述链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原如本发明第二方面所述。
在某些实施方式中，所述试剂R2含有可以一定程度上降低血清及血浆样本假阳性和测试的本底值。
在某些实施方式中，所述试剂R2包括10～50mM HEPES，50～150mM NaCl，0.01％～0.1％吐温-20，0.1％～1％酪蛋白酸钠，10～20mM EDTA二钠，50～100μg/mL，鼠IgG和0.05～0.45％NaN3。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括阴性定标品A和阳性定标品B。
在某些实施方式中，所述阴性定标品A成分主要为10～50mM PBS、50～150mMNaCl、100～200mL/L丙三醇、1％-2％牛血清白蛋白和0.05～0.1％Procline-300。
在某些实施方式中，所述阳性定标品B为使用定标品A将TP抗体阳性血稀释70倍制备获得。
本发明第四方面提供了本发明第三方面所述的试剂盒在体外非诊断目的的梅毒检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种生物素化预处理梅毒抗原的方法和梅毒抗体检测试剂盒，能够快速高效、高灵敏度检出梅毒螺旋体抗体，并解决传统双抗原夹心方法检测中容易出现的因样本中游离的生物素造成的生物素干扰问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
图1显示梅毒抗体检测试剂盒的测试结果。
图2显示本发明试剂盒与传统化学发光方法的标准曲线对比。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1梅毒抗体检测试剂盒的制备
梅毒抗体检测试剂盒的制备包括链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原、碱性磷酸酶(AP)标记的TP15、TP17、TP47抗原、定标品A(阴性)：成分主要为10～50mM PBS、50～150mM NaCl、100～200mL/L丙三醇1％-2％牛血清白蛋白、0.05～0.1％Procline-300。定标品B(阳性)：使用定标品A将TP抗体阳性血(厂家：Seracare、批号：BM200092)稀释70倍作为定标品B。
其中链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原的制备步骤为：
①使用TP15、TP17、TP47三个片段的抗原分别与生物素以物质的量(摩尔比)1：20比例交联，形成TP15Ag-Biotin、TP17Ag-Biotin、TP47Ag-Biotin交联物；在室温条件下反应30min。使用紫外分光光度计测得浓度后将浓度浓缩或稀释至统一为1mg/mL②将三个片段的交联物按照浓度比例2：1：4混合，混合后的各片段浓度优选TP15Ag-Biotin 2.5μg/mL、TP17Ag-Biotin 1.25μg/mL、TP47Ag-Biotin 5μg/mL。③使用链霉亲和素与Ag-Biotin混合物混合交联，链霉亲和素使用优选浓度为6mg/mL，磁分离后去上清；使用上述混合生物素与上清等体积加入。链霉亲和素与Ag-Biotin混合物混合后各组分浓度为：链霉亲和素浓度为6mg/mL，TP15Ag-Biotin 2.5μg/mL、TP17Ag-Biotin 1.25μg/mL、TP47Ag-Biotin 5μg/mL。37℃条件下，旋转混合15-30min；使用试剂1稀释液磁分离清洗三次后储存备用。试剂1的稀释液配方为10～50mM MOPSO，10～50mM NaCl，0.01％～0.1％吐温-20，0.1％～1％RPE1740，2.5％～5％蔗糖，0.05～0.45％NaN3。
试剂2中含有消除血清干扰效应的重要组分,可以一定程度上降低血清及血浆样本假阳性和测试的本底值。包括10～50mM HEPES,50～150mM NaCl,0.01％～0.1％吐温-20，0.1％～1％酪蛋白酸钠，10～20mM EDTA二钠，50～100μg/mL，鼠IgG(厂家：上海科华、批号：H20220601)，0.05～0.45％NaN3。
碱性磷酸酶标记的TP15、TP17、TP47抗原的制备方法为：
①原料换液：主要将原料抗原中的未知或已知会影响标记效果的储存液更换，可选用方法为重力柱脱盐、离心柱脱盐、透析袋透析过夜，优选透析袋过夜。
②抗原及碱性磷酸酶的活化：选用合适的活化剂对抗原TP15、TP17、TP47及AP上的基团进行活化，优选的抗原活化剂为2IT，活化时间为30～60min，温度为室温，优选30min。优选的AP活化剂为SMCC类的活化剂包括SMCC、sulfo-SMCC、SM(PEG)n(n＝2,4,6,8,10,12,24)等。活化时间为15～30min。温度为室温，优选15min。
③将活化后的抗原与AP进行混合交联，质量比为1：1，交联时间为温度为2～8℃，16～24h。
④反应终止：在交联物中加入NEM溶液室温静置15min后加入EA溶液继续静置15min。
⑤收样：采用脱盐或过分子筛或过HPLC方式收回，优选HPLC。
实施例2梅毒抗体检测试剂盒的应用
本发明以全自动化学发光分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为夹心法，即：
仪器依次加入50uL样品、50uL试剂R2(试剂2)，30uL试剂R1(试剂1)和100uL试剂R3(试剂3)，反应25min，磁分离清洗后，加入100uL底物，仪器根据RLU发光强度自动测算S/CO结果及定性结果值。
企业参考品使用要求如下
1)20支TP抗体阴性参考品(N1-N20)：应全部为阴性反应，阴性符合率应为20/20；
2)10支TP抗体阳性参考品(P1-P10)：应全部为阳性反应,应为10/10；
3)4支最低检出限参考品(L1-L4)，L1应检出阳性，L2应检出阳性，L3可检出阳性或阴性；L4应检出阴性；
测试结果见图1，结果表明企业内部参考品的阴性符合率应为20/20，阳性符合率为10/10，最低检出限参考品结果均符合。
实施例3生物素化预处理梅毒抗原的方法(使用本专利方法配制试剂盒)和传统化学发光方法对比
传统方法参见文献：张海鸥，梅毒螺旋体多种检测方法的建立，长春理工大学，2022.DOI:10.26977/d.cnki.gccgc.2022.000600第3章梅毒螺旋体抗体化学发光免疫检测方法的建立。
本发明以全自动化学发光分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为夹心法，即仪器依次加入50uL样品、50uL试剂R2(试剂2)，30uL试剂R1(试剂1)和100uL试剂R3(试剂3)，反应25min，磁分离清洗后，加入100uL底物，记录发光强度。
使用含有不同浓度抗体梅毒弱阳性样本，样本中生物素浓度作为横坐标，测试发光值RLU为纵坐标绘制出标准曲线(见图2)。由图2可见。使用本发明专利方法制备的梅毒抗体检测试剂盒对生物素干扰去除有明显效果，且当生物素浓度较高时，测值稳定，仍未表现出干扰。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原的制备方法为，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)使用TP15、TP17、TP47三个片段的抗原分别与生物素交联，形成TP15Ag-Biotin、TP17Ag-Biotin、TP47Ag-Biotin交联物；2)将三个片段的交联物按照比例混合形成Ag-Biotin混合物；3)使用链霉亲和素与Ag-Biotin混合物混合交联。
2.根据权利要求1所述的方法获得的链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原。
3.梅毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：试剂R1，链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原；试剂R3，碱性磷酸酶(AP)标记的TP15、TP17、TP47抗原；任选地，进一步包括试剂R2，其含有消除血清干扰效应的重要组分。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原的制备方法为：使用TP15、TP17、TP47三个片段的抗原分别与生物素交联，形成TP15Ag-Biotin、TP17Ag-Biotin、TP47Ag-Biotin交联物；将三个片段的交联物按照比例混合形成Ag-Biotin混合物；使用链霉亲和素与Ag-Biotin混合物混合交联。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁微粒预混生物素化TP15、TP17、TP47抗原如权利要求2所述。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括阴性定标品A和阳性定标品B。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2包括10～50mM HEPES，50～150mM NaCl，0.01％～0.1％吐温-20，0.1％～1％酪蛋白酸钠，10～20mM EDTA二钠，50～100μg/mL，鼠IgG和0.05～0.45％NaN3。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性定标品A成分主要为10～50mMPBS、50～150mM NaCl、100～200mL/L丙三醇、1％-2％牛血清白蛋白和0.05～0.1％Procline-300。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性定标品B为使用定标品A将TP抗体阳性血稀释70倍制备获得。
10.权利要求3-9任一项所述的试剂盒在体外非诊断目的的梅毒检测中的应用。
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