KR20210124289A - 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위한 방법 및 생성물 - Google Patents

기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위한 방법 및 생성물 Download PDF

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몰리고 테크놀로지스 에이비
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Abstract

본 발명은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 및 특히 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자를 제공하는 단계; (b) 주형으로서의 (a)의 원형 DNA 분자 및 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드(dNTP)를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 수행하는 단계; 및 (c) 절단 도메인에서 RCA 반응의 생성물을 효소적으로 절단하여 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다.

Description

기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위한 방법 및 생성물
본 발명은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 복수(예를 들어, 라이브러리)의 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 효소-매개되는 롤링 서클 증폭(RCA: rolling circle amplification) 반응에서 기능화된 뉴클레오티드를 이용하는 방법을 제공한다. 방법에 사용하기 위한 키트 및 방법에 의해 수득된 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 또한 제공된다. 특히, 본 발명은 방법에 의해 수득된 복수의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리를 제공한다.
단일 가닥 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 통해 상보적 서열에 예를 들어 분자간 하이브리드화하는 능력으로 인해 광범위한 응용 분야에서 유용하다. 또한, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 압타머(aptamer)로 알려진 2차 구조를 포함하여 복합적 토폴로지 기하(topological geometry) 및 분자 어셈블리를 형성하기 위해 자체적으로 하이브리드화할 수 있다(즉, 분자내 상보성). 이러한 압타머는 비-공유 상호 작용을 통해 생물학적 표적에 높은 친화도로 결합하여 다양한 기능을 수행할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 유용성은 뉴클레오티드, 특히 왓슨-크릭 염기 쌍을 방해하지 않는 핵 염기에 기능을 추가(즉, 반응성 화학 기의 추가)함으로써 향상될 수 있다. 그러나, 이러한 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 합성은 문제가 될 수 있으며, 이는 전술한 응용 분야의 성장을 억제했다.
현재, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 고체-상(solid-phase) 합성을 사용하여 생산되며, 여기서 뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합된 성장 사슬에 단계적 방식으로 첨가된다. 그러나, 이 방법은 생산된 올리고뉴클레오티드의 길이와 정확도의 측면에서 심각하게 제한될 수 있다. 고체-상 합성에 의한 올리고뉴클레오티드 생산의 오류율은 자연에서 관찰되는 폴리머라제 효소의 오류율보다 상당히 높고, 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 극적으로 증가하여 단지 약 70%의 순도는 길이가 약 50개 잔기인 상업적 올리고뉴클레오티드에서 일반적이다. 더욱이, 고밀도의 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 가용성은 고체-상 합성의 길이, 품질 및 비용 측면에서의 한계로 인해 제한되어 왔다. 특히, 고체-상 합성에 의해 생산된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있는 기능화된 뉴클레오티드의 수는 작용기에 의한 교차 반응 때문에 제한된다.
합성 올리고뉴클레오티드의 많은 용도는 고순도 수준을 필요로 하며, 즉, 고체-상 합성 반응의 원하는 생성물을 단리하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(PAGE)과 같은 방법을 통한 추가 정제 단계가 종종 필요하다. 이것은 현재의 방법을 노동 집약적이고 비싸게 만든다. 또한 이러한 추가 정제 단계 후에도, 잔류 불순물로 인한 실질적인 문제가 여전히 관찰될 수 있다.
고체-상 방법의 이러한 문제를 고려하여, 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는 대체 방법, 특히 더 높은 정확도로 더 긴 올리고뉴클레오티드를 생산할 수 있는 비용 효율적인 방법에 대한 요구가 있다.
변형된(예를 들어, 기능화된) 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위한 효소 반응에서 이전에 사용되었지만, 단지 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 프라이머 확장(PE) 반응을 통해 기능화된 DNA를 생산하는 맥락에서 사용되었다. 이러한 반응은 나중에 제거되어야 하는 특정 프라이머의 사용을 필요로 하며, 변형된 뉴클레오티드가 폴리머라제에 의해 혼입되어야 할 뿐만 아니라 PCR의 경우 기능화된 생성물이 주형(template)으로 인식되어야 한다. 이는 일부 변형의 경우 문제가 될 수 있으므로 이러한 방법의 유용성을 제한한다. 또한, 프라이머는 고체-상 방법으로 합성되고 서열 검증이 되지 않아 새로 합성된 DNA의 오류가 증폭된다. 또한, PCR 기반 방법은 압도적으로 이중 가닥 DNA 생성물을 초래하므로 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 얻기 위해서는 추가적인 용출 및 정제 단계가 필요하다.
본 발명자들은 이전에 서열 검증된 주형으로부터 '모노클로날 화학량론적'(MOSIC: monoclonal stoichiometric) 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 효소 생산 방법을 설명했다(문헌[Ducani et al., 2013, Nature Methods, 647-652]). 본 발명자들은 놀랍게도 MOSIC 방법이 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하도록 성공적으로 적응될 수 있음을 결정했다.
대표적인 예에서, 상기 방법은 각각 제한 효소 부위를 포함하는 헤어핀 서열에 의해 경계를 이루는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 서열의 설계 및 제조를 포함한다. 그 다음, 선형 서열은 이중 가닥 롤링 서클 증폭(RCA) 주형으로 원형화되며, 이는 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드의 존재 하에 RCA에 의해 닉킹되고(nicked) 증폭되어 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 부분적으로 단일 가닥 선형 콘카테머(concatemer)를 생성한다. 그 다음, RCA 생성물은 전술한 헤어핀 영역에서 제한 부위를 인식하는 제한 효소로 처리되고, 콘카테머를 절단하여 복수의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 방출, 즉 기능화된 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 생성한다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 예상과 달리 기능화된 뉴클레오티드가 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제에 의해 효율적으로 혼입되며 헤어핀 구조의 형성을 방지하거나 그 안정성 또는 효과적인 절단을 방해하지 않는다는 것을 유리하게 결정했다. 더욱이, 본 발명자들은 기능화된 뉴클레오티드가 방법과 관련된 유익한 특성을 여전히 유지하면서 MOSIC 방법에서 활용될 수 있음을 발견했다. 예를 들어, 전술한 PCR 기반 방법과 달리, 본 방법은 프라이머를 필요로 하지 않으며 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 직접 생산할 수 있다. 이것은 프라이머 어닐링(annealing)을 허용하거나 이중 가닥 생성물을 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 전환하기 위한 임의의 추가 단계의 필요성을 회피한다. 더욱이, 본 방법은 기능화된 뉴클레오티드가 추가 증폭을 위한 주형으로 인식될 것을 요구하지 않으며, 이는 더 많은 수의 기능화된 잔기가 혼입될 수 있음을 의미한다.
따라서, 가장 광범위하게, 본 발명은 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 생산에서 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자의 용도를 제공하는 것으로 보일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 생산에서 절단 도메인 및 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자의 용도로 볼 수 있다.
기능화된 뉴클레오티드가 동등한 통상적 뉴클레오티드와 조합하여 사용될 때, 기능화된 뉴클레오티드는 RCA 반응에 의해 생산된 콘카테머에 무작위로 혼입될 수 있고, 따라서 콘카테머의 절단은 복수(예를 들어, 라이브러리)의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생성하며, 즉 여기서 기능화된 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에서 다른 위치에 혼입된다는 것이 명백할 것이다. 생산된 기능화된 올리고뉴클레오티드의 다양성은 각각 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 복수의 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 원형 DNA 분자를 사용함으로써 증가될 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다. 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 및/또는 길이가 다를 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 기능화된 올리고뉴클레오티드의 다양성은 RCA 반응에서 기능화된 뉴클레오티드의 조합을 사용함으로써 증가될 수 있다. 합성 후 올리고뉴클레오티드를 변형함으로써, 예를 들어 분자 또는 성분을 올리고뉴클레오티드의 기능화된 뉴클레오티드에 접합함으로써 기능화된 올리고뉴클레오티드의 라이브러리에 여전히 추가의 다양성이 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 DNA 나노 기술, 핵산 영상화(imaging) 및 바이오 의학에서 새로운 응용을 열 수 있는 고기능화된 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산을 위한 새로운 방법을 유리하게 제공한다는 것이 분명할 것이다. 따라서, 일 특정 양태에서, 본 발명은 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자를 제공하는 단계;
(b) 주형으로서의 (a)의 원형 DNA 분자 및 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드(dNTP)를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 수행하는 단계; 및
(c) 절단 도메인에서 RCA 반응의 생성물을 절단하여 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다.
이하에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 원형 DNA 분자를 제공하는 단계는 임의의 적절한 수단에 의해 달성될 수 있고 원형 DNA 분자의 구조에 의존할 수 있다. 이와 관련하여, 원형 DNA 분자는 단일 가닥 DNA 분자 또는 이중 가닥 DNA 분자일 수 있다.
원형 DNA 분자가 이중 가닥 분자인 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 RCA 주형을 제공하기 위해 처리되어야 함이 분명할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 RCA 반응이 수행되기 전에 RCA 주형을 제공하기 위해 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 추가 단계를 포함한다.
본 발명은 유리하게는 임의의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 따라서, 임의의 적합한 서열이 본 발명의 원형 DNA 분자에서 올리고뉴클레오티드 서열로서 사용될 수 있다. 적합한 서열은 올리고뉴클레오티드 서열 도메인이 RCA 생성물의 생산 또는 절단을 방해(즉, 억제 또는 왜곡)해서는 안 된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 RCA 반응을 수행하는 폴리머라제의 진행을 억제하거나 이의 치환을 초래할 수 있는 2차 구조의 생성을 방지하도록 설계될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 압타머일 수 있거나 이를 코딩할 수 있다.
더욱이, 올리고뉴클레오티드 서열은 RCA 생성물에서 절단 도메인에 특이적으로 하이브리드화하지 않도록 설계될 수 있다. 대안적으로 볼 때, 올리고뉴클레오티드 서열에 접하는 절단 도메인은 이들이 RCA 생성물의 올리고뉴클레오티드 서열(들)에 특이적으로 하이브리드화하지 않도록 설계될 수 있다.
원형 DNA 분자가 복수의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 실시형태에서, 각 서열은 RCA 생성물에서 다른 올리고뉴클레오티드 서열에 특이적으로 하이브리드화하지 않도록 설계될 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서, 상보성 영역을 함유하는 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하여, 예를 들어 특히 RCA 생성물로부터 방출된 후에 상기 올리고뉴클레오티드가 상호 작용할 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 이러한 상호 작용이 RCA 생성물의 생산 또는 절단, 즉 기능화된 올리고뉴클레오티드의 생산을 방해하지 않는 한, 방법에 의해 생산된 기능화된 올리고뉴클레오티드의 상호 작용(예를 들어, 하이브리드화)을 촉진하도록 설계될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자의 올리고뉴클레오티드 서열의 핵산 서열은 절단 도메인의 핵산 서열 및/또는 원형 DNA 분자의 다른 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 80% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 원형 DNA 분자의 올리고뉴클레오티드 서열은 절단 도메인의 핵산 서열 및/또는 원형 DNA 분자의 다른 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 70%, 60%, 50% 또는 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들어 BLAST 정렬 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
따라서, 용어 "올리고뉴클레오티드 서열"은 특별히 제한되지 않고 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들, 또는 이의 보체(complement)를 생성하는데 사용되는 주형 서열을 지칭한다. 이와 관련하여, 원형 DNA 분자가 단일 가닥인 경우, 원형 DNA 분자의 서열은 단계 (b)에서 얻은 RCA 생성물에서 반복된(탠덤) 서열의 역 보체이다. 원형 DNA 분자가 이중 가닥인 경우, 단계 (b)에서 얻은 RCA 생성물의 반복된 서열과 그의 역 보체를 모두 포함한다. 따라서, RCA 주형을 제공하기 위해 원형 DNA를 처리하는 단계는 RCA 생성물에서 반복될 서열을 포함하는 원형 DNA 분자의 가닥을 절단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 임의의 원하는 길이의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하는데 사용될 수 있다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 방법은 고체-상 합성 방법을 사용하여 정확하게 생산될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 길이를 훨씬 초과하는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 서열(및 따라서 방법에 의해 생성된 기능화된 올리고뉴클레오티드)은 약 6개 내지 약 10000개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 기능화된 폴리뉴클레오티드의 생산으로 볼 수 있다. 이와 관련하여, "올리고뉴클레오티드"와 "폴리뉴클레오티드"의 크기 사이의 경계는 당업계에 잘 정의되어 있지 않다. 예를 들어, 400개 초과의 뉴클레오티드의 서열은 폴리뉴클레오티드로 불릴 수 있다. 따라서, 용어 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 상기 특정된 크기 범위 내의 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, "폴리뉴클레오티드"라는 용어가 사용되는 경우, 이는 전형적으로 400개 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 지칭할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법 및 용도는 복수의 단일 가닥 기능화된 DNA 분자를 생성하는 것으로 간주될 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 약 6 내지 약 750개의 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, 약 6 내지 약 500개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 6 내지 약 450개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 약 8 내지 약 400개의 뉴클레오티드 길이, 약 8개 내지 약 300개 뉴클레오티드 길이, 약 8개 내지 약 250개 뉴클레오티드 길이, 약 10개 내지 약 200개 뉴클레오티드 길이, 약 10개 내지 약 150개 뉴클레오티드 길이, 약 12개 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이, 약 12개 내지 약 75개 뉴클레오티드 길이, 약 14개 내지 약 70개 뉴클레오티드 길이, 약 14개 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이 등을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 약 10 내지 400, 11 내지 390, 12 내지 380, 13 내지 370, 14 내지 360 또는 15 내지 350개의 뉴클레오티드를 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 예를 들어 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 예컨대 약 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 더 긴 올리고뉴클레오티드의 생산에 특히 효과적이다. 예를 들어, 본 발명에 의해 생성된 올리고뉴클레오티드는 약 30 내지 1000, 40 내지 900, 50 내지 800, 60 내지 700, 70 내지 600, 80 내지 500, 90 내지 450 또는 100 내지 400개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 의해 생성된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)는 약 400 내지 10000, 500 내지 9000, 600 내지 8000, 700 내지 7000, 800 내지 6000, 900 내지 5000 또는 1000 내지 4000개의 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 예를 들어 약 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 복수의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며, 각각의 올리고뉴클레오티드 서열은 절단 도메인에 의해 경계를 이룬다. 올리고뉴클레오티드 서열은 서로 동일하거나 상이하거나 또는 이들의 조합일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 아래에 정의되는 바와 같이 동일한 올리고뉴클레오티드 서열의 하나 초과의 카피, 예를 들어 2, 3, 4, 5 등의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 아래에 정의되는 바와 같이 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어 2, 3, 4, 5 등의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열의 각각 하나의 카피를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 아래에서 추가로 논의되는 바와 같이, 본 발명은 원형 DNA 분자에서 올리고뉴클레오티드 서열의 카피 수에 기초하여 제어된 화학량론으로 복수의 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생성하는데 사용될 수 있다.
원형 DNA 분자에서 복수의 올리고뉴클레오티드 서열이 임의의 순서로 존재할 수 있다는 것은 분명할 것이다. 예를 들어, 동일한 올리고뉴클레오티드 서열의 다수의 카피는 원형 DNA 분자에서 서로 직접 인접할 수 있다(올리고뉴클레오티드 서열과 접하는 절단 도메인에 의해서만 분리됨). 대안적으로, 동일한 올리고뉴클레오티드 서열의 다수의 카피는 상이한 올리고뉴클레오티드 서열로 산재(intersperse)될 수 있다. 원형 DNA 분자는 상기 정의된 바와 같은 RCA 생성물의 생산 또는 절단을 방해할 수 있는 RCA 생성물에서 반복된 서열 사이의 상호 작용을 피하거나 최소화하도록 설계될 수 있다(예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오티드 서열의 순서).
본원에서 사용되는 용어 "복수"는 2개 이상, 예를 들어 본 발명의 맥락에 따라 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 또는 30 이상, 예컨대 50, 100, 150, 200, 250 이상을 의미한다. 예를 들어, 원형 DNA 분자는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 또는 30개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열, 예컨대 2 내지 100, 3 내지 90, 4 내지 80, 5 내지 70, 6 내지 60, 7 내지 50, 8 내지 40, 9 내지 30 또는 10 내지 20개의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 50, 100, 150, 200, 250 이상과 같이 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 또는 30개 이상의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 즉 상이한 서열 및/또는 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 생산할 수 있다. 이와 관련하여, 기능화된 뉴클레오티드가 RCA 생성물에 무작위로 혼입될 수 있기 때문에, 즉 기능화된 뉴클레오티드가 전술한 바와 같이 100% 미만의 상대적인 양으로 존재할 때, 동일한 주형 올리고뉴클레오티드 서열로부터 상이한 기능화된 올리고뉴클레오티드가 생성될 수 있다. 더욱이, 원형 DNA 분자가 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 각 주형은 복수의 상이한 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성할 것이다. 또한, RCA 반응은 복수의 원형 DNA 분자를 이용할 수 있으므로, 반응은 복수의 각 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 각 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010개 이상의 카피를 생성할 것이다.
용어 "상이한(different)"은 하나 이상의 상이한 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 상이한 올리고뉴클레오티드 서열은 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 이상의 뉴클레오티드에 의해 상이할 수 있다. 상이함은 올리고뉴클레오티드 서열의 길이 및/또는 서열에 있을 수 있다. 대안적으로 볼 때, 상이한 올리고뉴클레오티드 서열은 서로 100% 미만의 서열 동일성, 예컨대 서로 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 상이한 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만, 올리고뉴클레오티드 내의 기능화된 뉴클레오티드의 위치 또는 특정 위치에서 기능화된 뉴클레오티드의 유형이 상이하다(예를 들어, RCA 반응에서 기능화된 뉴클레오티드의 조합이 사용되는 경우). 대안적으로 또는 추가적으로, 상이한 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 상기 정의된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 서열에서 상이할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다수의 상이한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 동시에 생성하는데 사용될 수 있다. 특히, 원형 DNA 분자의 서열을 변경함으로써, 특히 존재하는 각각의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열의 카피 수를 제어함으로써, 궁극적으로 본 방법에 의해 생성되는 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 화학양론을 제어할 수 있다. 그러나, 각각의 올리고뉴클레오티드 서열로부터 유도된 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 상이할 수 있기 때문에(RCA 생성물에 기능화된 뉴클레오티드의 무작위 혼입으로 인해), 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 화학양론은 특정 올리고뉴클레오티드 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드의 수에 대해 제어될 수 있다. 따라서 원형 DNA 분자는 복수의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열의 복수의 사본을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "절단 도메인"은 전형적으로 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 방출하기 위해 특이적으로 절단될 수 있는 RCA 생성물 내의 도메인을 초래하는 원형 DNA 분자 내의 도메인을 지칭한다. 따라서, 원형 DNA 분자의 절단 도메인은 직접 절단될 수 있거나, 예를 들어 보조 인자(co-factor)와의 접촉 시 단지 RCA 생성물에서 기능적이거나 특정 조건 하에서 기능적인 절단 도메인을 단순히 코딩할 수 있다.
"절단"은 공유 결합을 끊는 임의의 수단을 포함한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 절단은 예를 들어 포스포디에스테르 결합의 절단에 의한 뉴클레오티드 사슬에서의 공유 결합의 절단(즉, 가닥 절단 또는 가닥 분열(scission))을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 절단 도메인은 핵산 분자를 절단할 수 있는, 즉 둘 이상의 뉴클레오티드들 사이의 포스포디에스테르 연결을 끊을 수 있는 하나 이상의 효소에 의해 인식되는 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자를 제공하는 단계;
(b) 주형으로서의 (a)의 원형 DNA 분자 및 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드(dNTP)를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 수행하는 단계; 및
(c) 절단 도메인에서 RCA 반응의 생성물을 효소적으로 절단하여 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 단계 (c)는 RCA 반응의 생성물을 절단 효소와 접촉시키는 것을 포함한다.
예를 들어, 절단 도메인은 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소) 인식 서열을 포함할 수 있다. 제한 효소는 제한 부위로 알려진 특정 인식 뉴클레오티드 서열에서 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA를 절단하며 적합한 효소는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 원형 DNA 분자에서 올리고뉴클레오티드 서열(들)의 설계를 용이하게 하기 위해 희귀 절단 제한 효소, 즉 긴 인식 부위(길이가 적어도 8개의 염기쌍)를 갖는 효소를 사용하여 예를 들어 올리고뉴클레오티드 서열(들) 내에 절단 인식 부위의 포함을 회피하는 것이 특히 유리할 수 있다.
일부 실시형태에서, 절단 도메인은 유형 II 제한 엔도뉴클레아제, 보다 바람직하게는 유형 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 서열을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 절단 도메인 및 절단 효소가 본 발명에서 사용될 수 있지만, 일부 실시형태에서 올리고뉴클레오티드 서열과 접하는 절단 도메인을 인식하는 절단 효소는 BseGI, BtsCI 또는 이의 이소스키조머(isoschizomer), 예를 들어 BstF5I 또는 FokI일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 대표적인 효소는 BsrDI, BtsI, BtsIMutI, MlyI 또는 이의 이소스키조머를 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, RCA 반응 생성물을 절단하는 단계는 절단 도메인에서 RCA 생성물을 선택적으로 절단하기 위해 적합한 조건 하에서 RCA 생성물을 절단 효소와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 절단 도메인은 다른 성분의 첨가에 의해 RCA 생성물에서 기능적으로 만들어질 수 있으며(활성화될 수 있으며), 즉 RCA 생성물은 기능적 절단 도메인, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이것은 올리고뉴클레오티드(본원에서 "제한 올리고뉴클레오티드"라고 함)를 RCA 생성물의 절단 도메인에 하이브리드화하여 듀플렉스(duplex)를 형성함으로써 달성될 수 있다. 형성된 듀플렉스의 적어도 일부는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함할 것이며, 이는 절단되어 기능화된 올리고뉴클레오티드의 방출을 초래할 수 있다. 이것은 RCA 생성물, 특히 절단 도메인에 혼입된 기능화된 뉴클레오티드가 절단 효소의 활성을 방해(예를 들어, 효율을 감소)할 수 있는 실시형태에서 특히 유리할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, RCA 반응 생성물을 절단하는 단계는 RCA 생성물을 제한 올리고뉴클레오티드 및 절단 효소와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 제한 올리고뉴클레오티드 및 절단 효소는 RCA 생성물과 동시에 또는 순차적으로 접촉될 수 있다.
일부 실시형태에서, 절단 도메인은 절단 효소 이외의 수단에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 절단 도메인은 DNAzyme 뉴클레아제와 같은 자가 절단 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 자가 절단하는 절단 도메인(예를 들어, DNAzyme 뉴클레아제를 포함하는 절단 도메인)에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자를 제공하는 단계;
(b) 주형으로서의 (a)의 원형 DNA 분자 및 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드(dNTP)를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 수행하는 단계; 및
(c) 절단 도메인에서 RCA 반응의 생성물을 절단하여 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함하며,
단계 (c)는 RCA 반응의 생성물에서 자가 절단하는 절단 도메인을 활성화하는 것을 포함한다.
적합한 자가 절단 서열은 당업계에 공지되어 있다. 자가 절단 서열을 이용하는 실시형태에서, 절단 도메인은 단지 RCA 생성물에서 기능적(활성)일 수 있다. 대안적으로, 자가 절단 서열은 특정 조건 하에서 기능적일 수 있고, 따라서 상기 방법은 절단 도메인에서 RCA 생성물의 절단을 촉진하는 조건, 즉 자가 절단 서열을 활성화하는 조건을 RCA 생성물에 적용하는, 예를 들어 자기 절단 활동에 요구되는 금속 이온과 같은 보조 인자와 RCA 생성물을 접촉하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로 볼 때, RCA 반응의 생성물을 절단하는 단계는 절단 도메인에서 RCA 생성물의 절단을 촉진하는 조건, 즉 자가 절단 서열을 활성화하는 조건을 RCA 생성물에 적용하는, 예를 들어 자기 절단 활동에 요구되는 금속 이온과 같은 보조 인자와 RCA 생성물을 접촉하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 절단 도메인은 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하거나 이것으로 구성된다. 헤어핀 구조는 또한 헤어핀-루프 또는 스템-루프(stem-loop)로 알려질 수 있으며 이들 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 헤어핀은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자에서 발생할 수 있는 분자내 염기 쌍 패턴이다. 헤어핀은 동일한 가닥의 두 영역이 반대 방향으로 읽을 때 일반적으로 뉴클레오티드 서열에서 상보적일 때 발생하며 염기 쌍(하이브리드화)은 이중 가닥 스템(듀플렉스) 및 짝을 이루지 않는, 즉 단일 가닥 루프를 형성한다. 결과적인 구조는 롤리팝(lollipop) 형상으로 설명될 수 있다.
따라서, 절단 도메인이 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 일부 실시형태에서, 절단 도메인은 자기 상보성인 서열을 포함한다. RCA 생성물이 확장됨에 따라, 이러한 자기 상보적 영역의 하이브리드화는 헤어핀 구조를 초래하며, 여기서 헤어핀 구조의 이중 가닥 부분은 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 포함한다. 따라서, RCA 생성물에서 헤어핀 구조의 이중 가닥 부분의 절단은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 및 헤어핀 구조(즉, 헤어핀 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드)의 방출을 초래한다.
본원에서 사용되는 용어 "하이브리드화" 또는 "하이브리드화하다"는 왓슨-크릭 염기 쌍을 통해 듀플렉스를 형성하기에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열들 사이의 듀플렉스 형성을 지칭한다. 2개의 뉴클레오티드 서열은 이들 분자가 염기쌍 조직 상동성을 공유할 때 서로 "상보적"이다. "상보적인" 뉴클레오티드 서열은 특이성과 결합하여 적절한 하이브리드화 조건 하에서 안정한 듀플렉스를 형성할 것이다. 예를 들어, 두 서열은 제1 서열의 섹션이 반-병렬(anti-parallel) 의미로 제2 서열의 섹션에 결합할 수 있을 때 상보적이며, 여기서 각 서열의 3'-말단은 다른 서열의 5'-말단에 결합하고 그 다음 한 서열의 각각의 A, T(U), G 및 C가 다른 서열의 T(U), A, C 및 G와 각각 정렬된다. RNA 서열은 또한 상보적인 G = U 또는 U = G 염기쌍을 포함할 수 있다. 따라서, 2개의 서열은 본 발명에서 "상보성"이 되기 위해 완전한 상동성을 가질 필요는 없다. 일반적으로 2개의 서열은 뉴클레오티드의 적어도 약 90%(바람직하게는 적어도 약 95%)가 분자의 정의된 길이에 걸쳐 염기쌍 조직을 공유할 때 충분히 상보적이다.
RCA 생성물이 절단되면 기능화된 올리고뉴클레오티드가 방출된다. 방출되는 기능화된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 서열로만 구성될 수 있거나(즉, 추가 뉴클레오티드 없이), 이들은 하나 또는 양쪽 말단에서 올리고뉴클레오티드 서열과 접하는 절단 도메인으로부터 하나 이상의 추가 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서 일부 실시형태에서, 기능화된 올리고뉴클레오티드는 한쪽 또는 양쪽 말단에서 절단 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 원형 DNA 분자의 서열은 RCA 생성물이 절단될 때 방출되는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 절단 도메인으로부터 임의의 추가 뉴클레오티드를 포함하지 않도록 설계된다. 대안적으로 볼 때, 올리고뉴클레오티드 서열(들)과 접하는 절단 도메인은 원형 DNA 분자에 배열되어 RCA 생성물에서의 절단이 절단 도메인으로부터 어떠한 추가 뉴클레오티드를 포함하지 않는 기능화된 올리고뉴클레오티드의 방출을 초래할 수 있다.
절단 효소가 절단 효소 인식 서열 외부의 위치에서 핵산 분자를 절단할 수 있으므로, 절단 도메인과 올리고뉴클레오티드 서열 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드가 있을 수 있다. 대안적으로 볼 때, 절단이 완전한 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 방출을 초래하는 것을 보장하기 위해, 절단 도메인은 절단 효소 인식 서열에 추가하여 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 임의의 추가 뉴클레오티드(예를 들어, 절단 도메인의 일부를 형성하는 뉴클레오티드) 없이 포함한다.
따라서, 용어 "경계를 이루는"은 올리고뉴클레오티드 서열에 직접 또는 간접적으로 인접한 절단 도메인을 지칭한다. 대안적으로 볼 때, 절단 도메인은 올리고뉴클레오티드 서열의 양쪽 말단에 위치하며, 즉 절단 도메인은 올리고뉴클레오티드 서열의 상류 및 하류(5'및 3' 말단)에 있다. 일부 실시형태에서, 절단 도메인의 절단 부위(예를 들어, 절단 효소가 절단 도메인을 절단하는 부위)는 그것이 접하는 올리고뉴클레오티드 서열의 말단에 직접 인접한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 서열 및 절단 도메인 서열은 중첩될 수 있으며, 즉 올리고뉴클레오티드 서열의 말단은 절단 도메인의 일부를 형성할 수 있으며, 예를 들어 절단 부위가 절단 도메인 내의 내부 부위일 때, 즉 절단 도메인은 올리고뉴클레오티드 서열의 말단 또는 말단의 일부를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 절단 도메인과 올리고뉴클레오티드 서열 사이에(즉, 서열들의 말단들 사이에) 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 절단 도메인 및 올리고뉴클레오티드 서열은 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드가 겹칠 수 있다.
원형 DNA 분자에서 절단 도메인의 크기는 전술한 바와 같이 특별히 제한되지 않으며 절단 도메인의 유형에 따라 달라질 것이다. 절단 도메인은 RCA 생성물이 절단 도메인에서 절단되면 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열이 쉽게 정제될 수 있도록 절단 도메인의 길이가 올리고뉴클레오티드 서열의 길이와 다르도록 설계되거나 선택될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 절단 도메인(들)은 원형 DNA 분자에서 올리고뉴클레오티드 서열보다 짧도록 선택될 수 있다. 원형 DNA 분자가 다양한 길이의 복수의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 절단 도메인(들)은 원형 DNA 분자에서 가장 짧은 올리고뉴클레오티드 서열보다 짧도록 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 절단 도메인(들)은 원형 DNA 분자에서 올리고뉴클레오티드 서열보다 더 길도록 선택될 수 있다. 원형 DNA 분자가 다양한 길이의 복수의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 절단 도메인(들)은 원형 DNA 분자에서 가장 긴 올리고뉴클레오티드 서열보다 길도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 절단 도메인(들) 및 올리고뉴클레오티드 서열의 길이는 적어도 2개의 뉴클레오티드, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드만큼 상이하다.
원하는 올리고뉴클레오티드 서열 및 절단 도메인이 대략 동일한 길이인 경우, 절단 도메인은 크기에 따라 최종 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 수 있도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 헤어핀 구조의 스템 영역의 길이를 확장하기 위해 자기 상보성의 추가 영역이 절단 도메인의 말단에 추가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 뉴클레오티드는 헤어핀 구조의 루프 영역에 추가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 절단 도메인은 길이가 약 4 내지 50 뉴클레오티드, 예컨대 길이가 약 5 내지 45, 6 내지 40, 7 내지 35 또는 8 내지 30 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 약 12 내지 22개 또는 약 14 내지 20개를 포함하는 약 10 내지 25개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 그러나, 전술한 기능적 요건을 충족하는 한 임의의 적합한 길이의 절단 도메인이 본 발명에서 사용될 수 있음이 명백할 것이다.
올리고뉴클레오티드 서열과 접하는 절단 도메인은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 유리하게는, 올리고뉴클레오티드 서열(들)과 접하는 절단 도메인은 단일 절단 단계가 모든 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 방출하기에 충분하도록 동일하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, RCA 반응 생성물을 절단하는 단계는 절단 도메인에서 RCA 생성물을 선택적으로 절단하기 위해 적합한 조건 하에서 RCA 생성물을 절단 효소와 접촉시키는 것을 포함한다.
RCA 생성물에서 절단 도메인을 절단하기에 적합한 조건은 절단을 달성하기 위해 사용되는 수단에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제와 같은 절단 효소를 사용하여 절단이 달성되는 경우, 조건은 선택된 효소에 따라 달라질 것이며 적합한 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 절단 단계는 제조업체의 지침을 따를 수 있다. 유사하게, DNAzyme과 같은 자가 절단 서열을 사용하여 절단이 달성되는 경우, 특정 서열에 적합한 조건이 사용될 수 있다. 절단 단계에서 사용될 수 있는 조건에 적합한 범위의 예는 아래에 설명되어 있다.
예를 들어, 절단 효소, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제는 그의 절단 인식 부위에 특이적으로 결합할 수 있고, 다양한 완충액, 예컨대 인산염 완충 식염수(PBS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), HEPES 완충 식염수(HBS) 및 트리스 완충 식염수(TBS)에서 EDTA와 함께 및 없이 선택적으로(예를 들어, 특이적으로) 핵산을 절단할 수 있다. 절단은 약 3.0 내지 10.0의 pH 범위, 예를 들어 4.0 내지 9.0, 5.0 내지 8.0에서, 광범위한 온도 범위에 걸쳐, 예를 들어 0 내지 70℃에서 발생할 수 있다. 당업자는 다른 적절한 조건을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 방법은 원형(circular) DNA 분자를 주형으로 사용하여 롤링 서클 증폭을 수행하는 단계를 포함한다. 롤링 서클 증폭(RCA)은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌[Dean et al., 2001 (Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification, Genome Research, 11, pp.1095-1099)]에 기재되어 있는데, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다. 간단히 말해서, RCA는 롤링 원형 주형(RCA 주형)으로서 원형 단일 가닥 핵산 분자, 예를 들어 서클 또는 원형 올리고뉴클레오티드 및 가닥-치환 폴리머라제를 사용하여 주형에 하이브리드화되는 프라이머를 연장하는 핵산 분자의 합성에 관한 것이다. 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 추가는 합성 반응, 즉 중합을 시작한다. 롤링 서클 주형은 무한하기 때문에, 결과적인 생성물은 롤링 서클 주형에 상보적인 탠덤 반복으로 구성된 긴 단일 가닥 핵산 분자이다.
전형적인 RCA 반응 혼합물은 원형 DNA 분자 및 프라이머 확장 반응에 사용되는 하나 이상의 프라이머를 포함하며, 예를 들어 RCA는 단일 프라이머에 의해 주형화되어 단일 콘카테머 생성물 또는 다중 프라이머를 생성할 수 있으며, 각각은 원형 올리고뉴클레오티드의 다른 영역에 어닐링하여 서클당 다중 콘카테머 생성물을 생성한다. 원형 핵산과 접촉할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 어닐링 조건 하에서 원형 DNA 분자에 대한 하이브리드화를 제공하기에 충분한 길이로 이루어질 것이다. 일부 실시형태에서, 프라이머는 단계 (a)에서 제공된 이중 가닥 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단(예를 들어, 닉킹)함으로써 제공될 수 있다.
상기 성분 이외에, 본 발명에서 사용되는 반응 혼합물은 전형적으로 폴리머라제(아래에서 추가로 정의됨, 예를 들어 phi29 DNA 폴리머라제), 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드, 하나 이상의 통상적인 뉴클레오티드 및 아래에서 설명되는 바와 같은 DNA 폴리머라제 반응에 필요한 기타 성분을 포함한다. 원하는 폴리머라제 활성은 하나 이상의 별개의 폴리머라제 효소에 의해 제공될 수 있다.
RCA 반응 혼합물은 1가 이온 공급원, 2가 양이온 공급원 및 완충제를 포함하는 수성 완충 매질을 추가로 포함할 수 있다. KCl, K-아세테이트, NH4-아세테이트, K-글루타메이트, NH4Cl, 황산 암모늄 등과 같은 임의의 편리한 1가 이온 공급원이 사용될 수 있다. 2가 양이온은 마그네슘, 망간, 아연 등일 수 있으며, 여기서 양이온은 전형적으로 마그네슘일 것이다. MgCl2, Mg-아세테이트 등을 포함하는 임의의 편리한 마그네슘 양이온 공급원이 사용될 수 있다. 완충액에 존재하는 Mg2+의 양은 0.5 내지 10 mM 범위일 수 있지만, 바람직하게는 약 3 내지 6 mM 범위이고, 이상적으로는 약 5 mM일 것이다. 완충제에 존재할 수 있는 대표적인 완충제 또는 염은 트리스, 트리신, HEPES, MOPS 등을 포함하며, 여기서 완충제의 양은 전형적으로 약 5 내지 150 mM, 일반적으로 약 10 내지 100 mM, 보다 일반적으로 약 20 내지 50 mM의 범위일 것이며, 특정 바람직한 실시형태에서 완충제는 약 6.0 내지 9.5 범위의 pH를 제공하기에 충분한 양으로 존재할 것이다. 완충 매질에 존재할 수 있는 다른 약제는 EDTA, EGTA 등과 같은 킬레이트제를 포함한다.
이중 가닥 원형 DNA 분자의 단일 가닥이 절단(예를 들어, 닉킹)되어 RCA 주형(및 RCA 반응을 위한 프라이머)을 제공하는 실시형태에서, RCA 반응 혼합물에 단일 가닥 결합 단백질을 포함하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, E. coli 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 프라이머 확장 반응 및 PCR 반응의 수율과 특이성을 높이기 위해 사용되었다. (미국 특허 제5,449,603호 및 제5,534,407호). 파지(phage) T4의 유전자 32 단백질(단일 가닥 DNA 결합 단백질)은 더 큰 DNA 단편을 증폭하는 능력을 분명히 향상시키며(문헌[Schwartz, et al., Nucl.Acids Res.18: 1079 (1990)]), 그것은 DNA 폴리머라제 충실도를 향상시키며(문헌[Huang, DNA Cell.Biol.15: 589-594 (1996)]), 가장 중요하게는, 그것은 DNA 폴리머라제가 주형을 예를 들어 이미 생성된 단일 가닥 DNA로 전환하고 이중 가닥 DNA를 합성하는 것을 방지한다(문헌[Ducani et al.Nucl.Acids Res.42: 10596 (2014)]). 사용될 때, 이러한 단백질은 반응 혼합물에서 약 0.01 ng/μL 내지 약 1 μg/μL 범위; 예컨대 약 0.1 ng/μL 내지 약 100 ng/μL; 약 1 ng/μL 내지 약 10 ng/μL를 포함하는 농도를 달성하기 위해 사용될 것이다.
RCA 반응은 궁극적으로 원형 DNA 분자의 상보적 서열의 인접한(탠덤) 반복을 포함하는 폴리뉴클레오티드 생성물을 생성한다. 이 생성물은 콘카테머, RCA 생성물 또는 "RCP"로 알려질 수 있다. 따라서 RCA 생성물은 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열(또는 보다 구체적으로 원형 DNA 분자 주형의 올리고뉴클레오티드 서열의 역 보체)로 구성된 선형 서열을 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 원형 DNA 분자가 단일 가닥인 경우, RCA 반응 혼합물은 RCA 중합 반응을 개시하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다. 프라이머는 어닐링 조건 하에서 원형 DNA 분자에 하이브리드화를 제공하기에 충분한 길이로 이루어질 것이다. 프라이머는 일반적으로 길이가 적어도 10개의 뉴클레오티드, 일반적으로 길이가 적어도 15개의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 길이다 적어도 16개의 뉴클레오티드일 것이며, 길이가 30개 뉴클레오티드 또는 그 이상만큼 길 수 있으며, 여기서 프라이머의 길이는 일반적으로 18개 내지 50개 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 약 20개 내지 35개 뉴클레오티드 길이일 것이다.
프라이머는 원형 DNA 분자내의 모든 영역에 어닐링할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 프라이머가 하이브리드화할 수 있는 특정 도메인(RCA 프라이머 결합 부위)을 포함할 수 있다. 대표적인 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 올리고뉴클레오티드 서열이 아니라 RCA 프라이머 결합 부위로서 기능할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열과 접하는 절단 도메인들 사이의 서열을 포함할 수 있다. RCA 프라이머 결합 부위는, RCA 생성물의 절단시 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로부터 용이하게 분리될 수 있도록 하기 위해 상기 논의된 절단 도메인과 유사한 올리고뉴클레오티드 서열과 상이한 길이로 이루어지도록 설계될 수 있다. 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 복수의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자에서 RCA 프라이머 결합 부위는 임의의 2개의 절단 도메인들 사이에 있을 수 있음이 명백할 것이다.
용어 "어닐링 조건"은 상보적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2개의 핵산 분자가 서로 특이적으로 하이브리드화되는 조건을 지칭한다. 온도, 염 농도, 핵산 농도, 조성 및 길이, 완충액 조성을 비롯한 다양한 파라미터가 하이브리드화에 영향을 미친다. 당업자는 일상적인 문제로서 RCA 반응을 위한 특정 프라이머/주형 조합에 적합한 어닐링 조건을 쉽게 결정할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 이중 가닥이고, 상기 방법은 RCA 반응이 수행되기 전에 RCA 주형을 제공하기 위해 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 추가 단계를 포함한다. 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 단계는 RCA 반응을 시작하기 위해 프라이머를 제공하는 단계를 대체할 수 있음, 즉 절단된 가닥이 RCA 프라이머로서 기능함이 분명할 것이다. 따라서 대안적으로 볼 때, 상기 방법은 RCA 반응이 수행되기 전에 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하여 RCA 주형 및 프라이머를 제공하는 추가 단계를 포함하며, 즉, 원형 DNA 분자에 단일 가닥 파괴의 도입은 RCA 반응을 위한 프라이머로서 작용할 수 있는 3' 말단을 생성한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 이중 가닥 원형 DNA 분자의 일 가닥을 절단하는 것 외에도 반응 혼합물에 하나 이상의 RCA 프라이머를 제공하는 것, 예를 들어 서클당 수득하는 RCA 생성물의 수를 증가시키는 것이 유리할 수 있다.
일부 실시형태에서, RCA 주형을 제공하기 위해 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 단계는 절단 효소로 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 것을 포함한다. 원형 DNA 분자의 단일 가닥의 이러한 절단은 단일 가닥 파괴(닉)를 초래한다.
일부 실시형태에서, 절단에 의해 생성된 3' 말단에 대한 DNA 폴리머라제의 결합을 용이하게 하기 위해, 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 근접하게 여러 번 절단하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 원형 DNA 분자의 단일 가닥은 2회 이상 절단될 수 있으며, 즉 서로 근접하게 2개 이상의 닉이 생성될 수 있다. 바람직하게는, 닉은 20개 뉴클레오티드 내, 더 바람직하게는 10개 뉴클레오티드 내, 더 바람직하게는 서로 5개 뉴클레오티드 내, 예를 들어 서로 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 내에서 생성된다.
일부 실시형태에서, 이중 가닥 원형 DNA 분자의 한 가닥을 절단하는 데 사용되는 절단 효소는 닉카제(nickase)이다. 닉카제는 DNA 듀플렉스의 단일 가닥만을 절단하는 엔도뉴클레아제이다. 일부 닉카제는 특정 뉴클레오티드 인식 서열에 결합하고 이를 인식함으로써 DNA 분자의 특정 부위에만 단일 가닥 닉을 도입한다. 다수의 자연 발생 닉카제가 발견되었으며, 이 중 현재 적어도 4개에 대해 서열 인식 특성이 결정되었다. 닉카제는 미국 특허 제6,867,028호에 기재되어 있는데, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함되며, 임의의 적합한 닉카제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 절단 효소(닉카제)는 Nb.BsrDI, Nt.BspQI 또는 이들의 조합일 수 있다.
닉카제 효소를 사용하는 일부 실시형태에서, 닉카제 효소는 RCA 생성물의 원치 않는 절단을 방지하기 위해 분석에서 제거되거나 원형 DNA 분자의 절단 후에 비활성화될 수 있다.
원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 절단 효소(예를 들어, 닉카제)는 원형 DNA 분자 내의 임의의 부위에서 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 절단 효소가 작용할 수 있는 특정 도메인(단일 가닥 절단 부위 또는 도메인, 예를 들어 닉카제 부위)을 포함할 수 있다. 대표적인 실시형태에서, 원형 DNA 분자는 올리고뉴클레오티드 서열이 아니고 단일 가닥 절단 부위 또는 도메인으로 기능할 수 있는 절단 도메인들 사이의 서열을 포함할 수 있다. 절단 효소에 의해 인식되는 서열(단일 가닥 절단 부위 또는 도메인)이 올리고뉴클레오티드 서열에 없다는 사실은 RCA 생성물의 5' 말단에서 생성된 올리고뉴클레오티드가 상부 절단(truncate)되지 않는 것을 보장한다. 단일 가닥 절단 부위 또는 도메인은 위에서 논의된 절단 도메인 및 RCA 프라이머 결합 부위와 유사한 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 상이한 길이로 이루어지도록 설계되어, RCA 생성물의 절단 시 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로부터 쉽게 분리될 수 있는 것을 보장할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, RCA 프라이머 결합 부위는 또한 단일 가닥 절단 부위 또는 도메인으로서 또는 그 반대로 기능한다.
적어도 일부 가닥 치환 활성을 갖는 임의의 DNA 폴리머라제가 본 발명의 RCA 반응에 사용될 수 있다. 가닥 치환 활성은 일단 폴리머라제가 원형 DNA 분자 주위로 확장되면 프라이머 서열 및 연장된 생성물을 대체하고 주형 주위를 계속해서 "롤(roll)"할 수 있는 것을 보장한다. 원형 DNA 분자의 닉킹된 가닥이 RCA 확장을 위한 프라이머를 제공하는 실시형태에서, 가닥 치환 활성은 폴리머라제가 닉킹된 가닥을 대체할 수 있음을 보장한다. 적어도 일부 가닥 치환 활성을 갖는 적합한 DNA 폴리머라제 효소는 phi29 DNA 폴리머라제, E.coli DNA 폴리머라제 I, Bsu DNA 폴리머라제(큰 단편), Bst DNA 폴리머라제(큰 단편) 및 Klenow 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "DNA 폴리머라제"는 자연 발생 효소뿐만 아니라 자연 발생 DNA 폴리머라제의 유도체를 포함하여 모든 이러한 변형된 유도체도 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, DNA 폴리머라제는 5'-3'엑소뉴클레아제 활성을 제거하도록 변형되었을 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특히 바람직한 DNA 폴리머라제는 phi29 DNA 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제 및 유도체, 예를 들어 서열-변형된 유도체, 또는 이의 돌연변이체를 포함한다.
DNA 폴리머라제의 서열-변형된 유도체 또는 돌연변이체는 야생형 서열의 기능적 활성, 예를 들어 DNA 폴리머라제 활성 및 적어도 일부 가닥 치환 활성의 적어도 일부를 보유하는 돌연변이체를 포함한다. 돌연변이체는 효소의 활성 프로필에 영향을 미칠 수 있으며, 예를 들어 다른 반응 조건, 예를 들어 온도, 주형 농도, 프라이머 농도 등 하에 중합의 속도를 향상 또는 감소시킬 수 있다. 돌연변이 또는 서열 변형은 또한 효소의 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 열 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 방법의 RCA 반응은 전형적으로 기능화된 뉴클레오티드와 통상적인 뉴클레오티드의 혼합물을 사용하여 수행된다.
본원에서 사용되는 용어 "통상적인 뉴클레오티드"는 DNA에서 발견되는 4개의 염기; 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 중 하나를 포함하는 데옥시뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서 용어 "통상적인 뉴클레오티드"는 예를 들어 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 포함한다. 우라실은 전형적으로 DNA에서 자연적으로 발견되지 않지만 dTTP 대신에 또는 추가로 dUTP가 쉽게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, dUTP는 "통상적인" 뉴클레오티드로 간주될 수 있다. 일반적으로 반응 혼합물은 존재하는 4개의 자연 발생 염기, 즉 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP에 상응하는 4개의 상이한 유형의 dNTP 중 적어도 3개를 포함할 것이다. 그러나 위에서 언급한 바와 같이, dTTP 대신에 또는 dTTP에 추가하여 dUTP가 사용될 수 있다. 더욱이, 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 4개 또는 5개의 dNTP, 즉 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및/또는 dUTP를 포함할 수 있다. 본 방법에서, 각 dNTP는 전형적으로 약 10 내지 5000 μM, 일반적으로 약 20 내지 1000 μM 범위의 양으로 존재할 것이다. 각각의 dNTP는 상이한 양으로 존재할 수 있거나 동일한 양의 각 dNTP가 사용될 수 있다.
용어 "기능화된 뉴클레오티드" 또는 "기능화된 dNTP"는 변형되지 않은 통상적인 뉴클레오티드에 비해 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 지칭하며, 여기서 상기 변형은 추가적 또는 대안적 특성 또는 특징(즉, 상응하는 통상적인 뉴클레오티드에 비해)을 갖는 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 상기 기능화된 뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 변형은 예를 들어 표지(label)의 혼입에 의해 뉴클레오티드를 검출 가능하게 만들 수 있거나, 또는 다른 성분, 즉 상응하는 통상적인 뉴클레오티드가 상호 작용하거나 반응하지 않는 성분과 상호 작용 및/또는 반응을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 분해, 예를 들어 화학적 및/또는 효소적 분해(예를 들어, 뉴클레아제 분해)에 내성이 있게 만들 수 있거나, 또는 뉴클레오티드의 대사를 변경시킬 수 있다.
용어 "기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드", "단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드" 및 "기능화된 올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드를 함유하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 기능화된 올리고뉴클레오티드는 통상적인 뉴클레오티드만을 함유하는 상응하는 올리고뉴클레오티드에 비해 추가적인 또는 대안적인 특성 또는 특징을 갖는다. 예를 들어, 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드의 혼입은 예를 들어 표지의 혼입에 의해 올리고뉴클레오티드를 검출 가능하게 만들 수 있거나, 또는 다른 성분, 즉 통상적인 뉴클레오티드만을 함유하는 상응하는 올리고뉴클레오티드가 상호 작용하거나 반응하지 않는 성분과 상호 작용 및/또는 반응을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 올리고뉴클레오티드를 분해, 예를 들어 화학적 및/또는 효소적 분해(예를 들어, 뉴클레아제 분해)에 내성이 있게 만들 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드의 대사를 변경시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 올리고뉴클레오티드의 안정성을 개선할 수 있으며, 예를 들어 듀플렉스의 열 안정성(예를 들어, 용융 온도)과 같은 올리고뉴클레오티드에 의해 형성된 듀플렉스의 안정성을 개선할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드의 혼입은 올리고뉴클레오티드가 단지 통상적인 뉴클레오티드만을 함유하는 상응하는 올리고뉴클레오티드에 의해 형성되지 않는 2차 또는 3차 구조를 형성할 수 있게 할 수 있다.
따라서, 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 맥락에서 용어 "단일 가닥"은 변성 조건, 예를 들어 열 또는 적절한 화학적 변성제의 적용 후 단일 가닥인 올리고뉴클레오티드, 즉 단지 하나의 연속 골격(하나의 가닥)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 위에서 언급한 바와 같이, 이것은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 2차 또는 3차 구조를 형성하는 것을 배제하지 않는다. 예를 들어, 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 자가-상보성 영역을 포함할 수 있고, 따라서 동일한 올리고뉴클레오티드의 다른 곳에서 상보성 영역에 하이브리드화되는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 일 영역에 의해 매개되는 헤어핀 또는 스템-루프 구조를 형성할 수 있다.
통상적인 뉴클레오티드의 기능화는 뉴클레오티드의 임의 부분의 구조의 변경 또는 변형에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 기능화된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결에 관련된 핵 염기, 당 또는 기에 대한 변형, 예를 들어 화학적 변형을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 핵 염기에 대한 변형, 예를 들어 화학적 변형을 포함한다. 다양한 위치에서의 변형은 아래에 더 자세히 설명되며, 아래에 설명된 특정 위치 중 임의의 것이 아래에 설명된 작용기 중 임의의 것으로 변형될 수 있는 것이 고려된다.
예를 들어, 피리미딘(즉, 시토신, 티민 및 우라실)에서 C5 위치를 작고 단단하며 소수성인 기로 치환하는 것은 치환된 피리미딘을 함유하는 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기 적층(stacking) 상호 작용을 개선하고/거나 이에 의해 형성된 듀플렉스를 안정화할 수 있다. 작고 단단하며 소수성인 기는 알키닐기, 예를 들어 메틸, 에티닐, 프로피닐, 또는 할로겐기, 예를 들어 플루오로, 클로로 또는 브로모일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 C5 위치에서 치환, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 알키닐기 또는 할로겐을 갖는 피리미딘을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레오티드를 검출 가능하게 만들 수 있는 변형은 뉴클레오티드로의 표지의 혼입을 포함할 수 있다. 임의의 표지는 본 발명에서 유용성을 찾을 수 있으며 직접 또는 간접적으로 신호를 제공하는 분자일 수 있다. 예를 들어, 직접 신호를 제공하는 표지는 형광 분자일 수 있으며, 즉, 기능화된 뉴클레오티드는 형광 표지된 뉴클레오티드일 수 있다. 간접적으로 신호를 제공하는 표지는 예를 들어 비오틴 분자일 수 있으며, 즉 표지된 뉴클레오티드는 비오틴 표지된 뉴클레오티드일 수 있으며, 이는 신호를 제공하기 위해 추가 단계를 필요로 하며, 예를 들어 검출 가능한 신호, 예를 들어 눈에 띄게 검출 가능한 색상 변화를 제공하기 위해 화학적 기질에 작용할 수 있는 효소에 접합된 스트렙타비딘의 첨가를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 표지는 핵 염기에 혼입(접합)된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 핵 염기에 접합된 비오틴기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비오틴기는 예를 들어 링커 또는 연결 도메인을 통해, 핵 염기에 간접적으로 접합될 수 있으며, 적합한 링커는 당업계에 잘 알려진 것들로부터 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 링커는 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 상호 작용을 촉진하기 위해, 즉 입체 장애를 최소화하거나 방지하기 위해 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비오틴기는 C5 위치에서 피리미딘에 접합된다. 대표적인 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드를 함유하는 비오틴은 비오틴-16-아미노알릴-2'-dUTP, 비오틴-16-아미노알릴-2'-dTTP 또는 비오틴-16-아미노알릴-2'-dCTP일 수 있다.
일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 스테롤기로 표지될 수 있으며, 즉 뉴클레오티드는 스테롤기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 콜레스테롤기로 표지되거나 이를 포함할 수 있다.
직접적으로 검출 가능한 표지는 추가 시약을 사용하지 않고 직접 검출될 수 있는 것인 한편, 간접적으로 검출 가능한 표지는 하나 이상의 추가 시약을 사용하여 검출될 수 있는 것이며, 예를 들어 여기서 표지는 둘 이상의 성분으로 만들어진 신호 생성 시스템의 구성원이다. 많은 실시형태에서, 표지는 직접 검출 가능한 표지이며, 여기서 직접 검출 가능한 관심 표지는 형광 표지, 컬러 표지, 방사성 동위 원소 표지, 화학 발광 표지 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 분광 광도계로 또는 광학적으로 검출 가능한 표지가 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표지는 간접적으로 신호를 제공할 수 있으며, 즉, 신호를 생성하기 위해 추가 성분의 추가를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 표지는 신호 제공 분자에 접합되는 분자에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 형광 표지된 뉴클레오티드이다. 형광 표지는 검출 가능한 신호를 제공하기 위해 여기를 필요로 하지만, 여기 소스는 신호를 검출하는 데 사용되는 기기/장치에서 유도되므로, 형광 표지는 직접 신호를 제공하는 표지로 볼 수 있다.
뉴클레오티드를 표지하는데 사용될 수 있는 형광 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 형광단은 UV 내지 근적외선 파장 범위의 여기 및 방출 스펙트럼으로 확인되었다. 따라서, 형광단은 UV, 가시 광선 또는 IR 스펙트럼 범위에서 여기 및/또는 방출 파장을 가질 수 있다.
형광단은 단백질, 펩티드, 작은 유기 화합물, 합성 올리고머 또는 합성 중합체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광단은 작은 유기 화합물, 예를 들어 분자량 5000 Da 이하의 유기 화합물이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 형광단은 4000 Da 이하, 예컨대 3500 Da, 3000 Da, 2500 Da, 2250 Da, 2000 Da, 1900 Da, 1800 Da, 1700 Da, 1600 Da, 1500 Da 이하의 분자량을 갖는다.
따라서, 형광단은 크산텐 유도체(예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신, 텍사스 레드), 시아닌 유도체(예를 들어, 시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 티아카르보시아닌, 메로시아닌), 스쿠아레인 유도체(예를 들어, 고리-치환된 스쿠아레인, Seta, SeTau), 나프탈렌 유도체(예를 들어, 단실 또는 프로단 유도체), 쿠마린 유도체, 옥사디아졸 유도체(예를 들어, 피리딜옥사졸, 니트로벤족사디아졸 및 벤족사디아졸), 안트라센 유도체(예를 들어, DRAQ5, DRAQ7 및 CyTRAK Orange를 포함하는 안트라퀴논), 피렌 유도체(예를 들어, 캐스케이드 블루), 옥사진 유도체(예를 들어, 나일(Nile) 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛, 옥사진 170), 아크리딘 유도체(예를 들어, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 옐로우), 아릴메틴 유도체(예를 들어, 아우라민, 크리스탈 바이올렛, 말라카이트 그린) 또는 테트라피롤 유도체(예를 들어, 포르피린, 프탈로시아닌, 빌리루빈)일 수 있다.
본 발명에서 유용할 수 있는 형광단들 또는 형광단 시리즈의 특정 예는 Alexa Fluors(예컨대, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 등), Atto, 시아닌(Cy), 인도시아닌, 설포시아닌, DyLight, Abberior STAR, Chromeo, Oregon Green, 플루오레세인, Texas red, 로다민, Silicon-rhodamine(SiR), 스쿠아레인(Squaraine), FluoProbes, Tetrapyrrole, Bodipy, HiLyte, Quasar, CAL fluor, Coumarin, Seta, CF, Tracy, IRDye, CruzFluor, Tide Fluor, Oyster, iFluor, Chromis 및 Brilliant Violet 및 이들의 형광 유도체 또는 유사체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 Cy3와 같은 시아닌 형광 표지를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 Cy3로 표지된 dATP, 예를 들어 7-프로파르길아미노-7-데아자-ATP-Cy3이다.
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 atto-488과 같은 atto 형광 표지를 함유한다. 일부 특정 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 예를 들어 atto-488로 표지된 dATP, 예를 들어 7-프로파르길아미노-7-데아자-ATP-Atto-488이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레오티드를 반응성으로 만들 수 있는 변형은 반응성 기, 예를 들어 다른 화학 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 기, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 표지와 같은 기능화된 올리고뉴클레오티드에 접합될 분자 또는 성분 상의 화학 기의 혼입을 포함한다. 잠재적 반응성 기는 친핵성 작용기(알킨, 알케닐, 아민, 알코올, 티올, 히드라지드, 아지드), 친전자성 작용기(알데히드, 에스테르, 비닐 케톤, 에폭시드, 이소시아네이트, 말레이미드), 고리 첨가 반응, 이황화 결합 형성, 또는 금속에의 결합이 가능한 작용기를 포함한다. 특정 예는 에틴(아세틸렌), 프로핀, 1-부틴, 2-부티네아지드, 비닐(에테닐), 프로페닐, 1-부테닐, 1차 및 2차 아민, 히드록삼산, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, N-히드록시숙신이미딜 탄산염, 옥시카르보닐이미다졸, 니트로페닐 에스테르, 트리플루오로에틸 에스테르, 글리시딜 에테르, 비닐설폰, 아지드 및 말레이미드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레오티드를 반응성으로 만들 수 있는 변형은 다른 화학 기, 예를 들어 클릭(click) 화학을 통해 기능화된 올리고뉴클레오티드에 접합될 분자 또는 성분 상의 화학 기와 반응할 수 있는 반응성 기의 혼입을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "클릭 화학"은 일반적으로 모듈식이고, 범위가 넓고, 높은 수율을 제공하고, 단지 무해한 부산물, 예컨대 비크로마토그래피 방법에 의해 제거될 수 있고 입체 특이성인(반드시 거울상 선택성은 아님) 것을 생성하는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Angew.Chem.Int.Ed., 2001, 40(11):2004-2021]을 참조하며, 이는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 일부 경우에, 클릭 화학은 온화한 수성 조건에서 서로 선택적으로 반응할 수 있는 작용기 쌍을 설명할 수 있다. 따라서, 클릭 화학 그룹은 본 방법의 올리고뉴클레오티드에 추가 작용기의 접합에 적합하다. 일반적인 클릭 화학 반응은 아지드-알킨 고리 첨가, 알킨-니트론 고리 첨가, 알켄-테트라진 반응 및 알켄-테트라졸 반응을 포함한다. 따라서, 기능화된 뉴클레오티드는 아지드기, 알킨기, 알켄기, 니트론기, 테트라진기 또는 테트라졸기를 포함할 수 있다.
클릭 화학 반응의 특정 예는 아지드와 알킨의 후이스겐(Huisgen) 1,3-쌍극성 고리 첨가, 즉 1,2,3-트리아졸이라고 하는 5원 헤테로 원자 고리를 형성하기 위해 아지드와 알킨의 구리 촉매 반응일 수 있다. 이 반응은 Cu(I)-촉매되는 아지드-알킨 고리 첨가(CuAAC), Cu(I) 클릭 화학 또는 Cu+ 클릭 화학으로도 알려질 수 있다. 클릭 화학용 촉매는 Cu(I) 염, 또는 환원제를 사용하여 Cu(II) 시약을 Cu(I) 시약으로 환원함으로써 인시츄 제조된 Cu(I) 염일 수 있다(문헌[Pharm Res.2008, 25(10): 2216―2230]). 클릭 화학에 대해 알려진 Cu(II) 시약은 Cu(II)(TBTA) 착물 및 Cu(II)(THPTA) 착물을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 트리스-(벤질트리아졸릴메틸)아민으로도 알려진 트리스-[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민인 TBTA는 Cu(I) 염에 대한 안정화 리간드일 수 있다. 트리스(히드록시프로필트리아졸릴 메틸)아민인 THPTA는 Cu(I)에 대한 안정화제의 다른 예일 수 있다. 구리가 없는 클릭 화학을 사용하여, 예컨대 스트레인 촉진되는 아지드-알킨 클릭 화학 반응에 의해 아지드 및 알킨(예를 들어, 시클로옥틴 또는 시클로노닌과 같은 시클로알킨)으로부터 1,2,3-트리아졸 고리를 구성하기 위해 다른 조건이 또한 달성될 수 있다(SPAAC, 예를 들어 문헌[Chem.Commun., 2011, 47:6257-6259 and Nature, 2015, 519(7544):486-90] 참조, 이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다).
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 당 기에 반응성 기, 예를 들어 데옥시리보스 당에 위치 2에서의 변형을 함유하며, 예컨대 수소를 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아지드 기로 치환한다. 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 2'-아지도-dNTP, 예를 들어 2'-아지도-dATP이다.
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 특히 알킨, 알케닐, 티오 또는 할로겐 기로부터 선택되는 핵 염기에 반응성 기를 함유한다. 위에서 언급한 바와 같이, 기능화된 뉴클레오티드는 C5 위치에 치환을 포함하는 피리미딘을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 알킨기는 에틴이며, 예를 들어 기능화된 뉴클레오티드는 5'-에티닐-dUTP와 같은 에티닐-dNTP이다. 대안적으로, 알킨기는 프로피닐기일 수 있으며, 예를 들어 기능화된 뉴클레오티드는 5'-프로피닐-dUTP와 같은 프로피닐 dNTP이다. 일부 실시형태에서, 알케닐기는 비닐(에테닐)이며, 예를 들어 기능화된 뉴클레오티드는 5'-비닐-dUTP와 같은 비닐-dNTP이다. 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 4'-티오-dTTP와 같은 티오-dNTP이다. 일부 실시형태에서, 할로겐 기는 예를 들어 브롬이며, 예를 들어 기능화된 뉴클레오티드는 5'-브로모-dUTP와 같은 브로모-dNTP이다. 기능화된 올리고뉴클레오티드 내로 할로겐 기의 혼입은 친핵성 방향족 치환 또는 UV 매개 가교결합을 예를 들어 단백질에 의해 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 방법에 의해 생성된 기능화된 올리고뉴클레오티드는 방향족 기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있거나, UV 매개 가교결합을 통해 다른 분자, 예를 들어 단백질 또는 펩티드에 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 다른 성분과 상호 작용, 예를 들어 비공유 결합을 통해 상호 작용을 할 수 있는 기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드는 결합 파트너에 결합할 수 있는 동족 결합 쌍의 한 부분 또는 성분, 예를 들어 친화성 결합 파트너, 예를 들어 비오틴 또는 합텐, 즉 동족 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 항체를 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 기능화된 뉴클레오티드는 예를 들어 고체 지지체에 고정될 수 있는 기능화된 올리고뉴클레오티드의 생산에서 유용성을 찾을 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 분해, 예를 들어 화학적 및/또는 효소적 분해(예를 들어, 뉴클레아제 분해)에 내성이 있게 만드는 변형을 함유한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 당 기에 변형, 예를 들어 데옥시리보스 당에 위치 2에서의 변형을 함유하며, 예컨대 수소를 플루오로, 클로로, O-메틸 또는 O-에틸 기로 치환한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 2'-플루오로-dNTP, 예를 들어 2-플루오로-UTP이다. 일부 실시형태에서 기능화된 뉴클레오티드는 O-Me 기, 예를 들어 2'-O-메틸-ATP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결을 형성하는 포스페이트기에서의 변형을 포함하며, 예컨대 산소를 황으로 치환하며, 예를 들어 뉴클레오티드는 포스포로티오네이트기를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 티오트리포스페이트, 예를 들어 2-데옥시티미딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트), 2-데옥시시티딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트), 2-데옥시우리딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트), 2-데옥시아데노신-5'-O-(1-티오트리포스페이트) 또는 2-데옥시구아노신-5'-O-(1-티오트리포스페이트)이다. 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 핵 염기에서의 변형, 예컨대 아미노, 메틸, 에틸 또는 프로피닐 변형, 예를 들어 2-아미노-dATP, 5-메틸-dCTP, C-5 프로피닐-dCTP 또는 C-5 프로피닐-dUTP를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 열 안정성에 영향을 미치는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 잠긴 리보스 당(locked ribose sugar)을 포함하며, 즉 오탄당 고리의 2' 산소와 4' 탄소 사이에 추가 공유 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드는 LNA(locked nucleic acid, 잠긴 핵산) 뉴클레오티드, 즉 LNA-ATP와 같은 LNA-NTP이다. 잠긴 리보스 형태는 염기 적층을 향상시켜 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용융 온도를 증가시킨다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 기능화된 뉴클레오티드는 (내재화된(internalized)) 알킨 또는 아지드 기를 포함하는 뉴클레오티드, 형광 표지된 뉴클레오티드, 스테롤기를 포함하는 뉴클레오티드, 폴리에테르기를 포함하는 뉴클레오티드, 금속 착물을 포함하는 뉴클레오티드, 비닐기를 포함하는 뉴클레오티드, 티올기를 포함하는 뉴클레오티드, 티오네이트화 뉴클레오티드, 뉴클레아제 내성이 증가하도록 변형된 뉴클레오티드, 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드(예를 들어, LNA-뉴클레오티드)의 열 안정성에 영향을 미치는(예를 들어 증가시키는) 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 이들 기능화된 뉴클레오티드를 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 혼입하면 다양한 유용한 기능을 제공할 수 있다. 예를 들어, 형광단을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 서열 특이적 형광 프로브로서 사용될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 티올화 뉴클레오티드를 포함시키면 올리고뉴클레오티드가 티올 반응성 분자로 표지되고 이러한 티올 반응성 분자의 분자 검출을 위한 프로브로서 사용되도록 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용될 수 있는 기능화된 뉴클레오티드는 디곡시게닌기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 디곡시게닌 표지된 뉴클레오티드가 아니다. 특히, 일부 실시형태에서 기능화된 뉴클레오티드는 디곡시게닌-11-dUTP가 아니다.
바람직한 실시형태에서, 기능화된 dNTP는 알킨기 또는 비닐기를 포함하는 뉴클레오티드, 예를 들어 알킨(예를 들어, 에티닐)기 또는 비닐기를 포함하는 변형된 핵 염기, 예를 들어 위치 C5에 알킨 또는 비닐 기를 갖는 피리미딘을 포함하는 뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 기능화된 dNTP는 아지드기를 포함하는, 예를 들어 아지드기를 함유하는 변형된 당을 포함하는 뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보스 당의 위치 2에 아지드기를 포함하는 뉴클레오티드이다.
RCA 반응을 위한 반응 혼합물은 주형 원형 DNA 분자로부터 RCA 생성물을 생성할 수 있는 성분들의 조합을 포함해야 한다. 예를 들어, 반응 혼합물(예를 들어, 통상적인 및 기능화된 뉴클레오티드의 혼합물)에 존재하는 뉴클레오티드는 롤링 서클 증폭을 허용하기 위해 원형 DNA 주형에서 각각의 뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있어야 한다. 반응 혼합물에 존재하는 기능화된 뉴클레오티드 및 통상적인 뉴클레오티드의 상대적인 양은 기능화된 뉴클레오티드 및 폴리머라제의 정체성에 따라 달라질 수 있다. 더욱이, 반응 혼합물에 존재하는 각 뉴클레오티드의 상대적인 양은 RCA 생성물로의 기능화된 뉴클레오티드의 혼입을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 기능화된 뉴클레오티드의 농도를 증가(또는 통상적인 뉴클레오티드의 비율 감소)하면 RCA 생성물에서 기능화된 뉴클레오티드의 비율이 더 커질 수 있다(예를 들어, 기능화된 뉴클레오티드가 동등한 통상적인 뉴클레오티드와 조합하여 사용될 때). 반대로, 기능화된 뉴클레오티드의 농도를 감소(또는 통상적인 뉴클레오티드의 비율을 증가)하면 RCA 생성물에서 기능화된 뉴클레오티드의 비율이 낮아질 수 있다.
따라서, 기능화된 뉴클레오티드는 주형 DNA에서 동일한 DNA 염기(뉴클레오티드)에 하이브리드화하는 통상적인 뉴클레오티드에 추가로 또는 전체적으로 이를 대신하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 오직 일 유형의 기능화된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 기능화된 뉴클레오티드들의 조합이 동일한 반응에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물에서 모든 기능화된 뉴클레오티드는 동일한 유형의 작용기, 예를 들어 알킨기를 함유한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물에서 기능화된 뉴클레오티드는 상이한 유형의 작용기를 함유한다. 예를 들어, 상이한 유형의 기능화된 뉴클레오티드는 동일한 DNA 염기(뉴클레오티드), 예를 들어 형광단으로 기능화된 dATP 뉴클레오티드 및 스테롤기로 기능화된 제2 dATP 뉴클레오티드에 하이브리드화 가능할 수 있다. 다른 대표적인 예에서, 상이한 유형의 기능화된 뉴클레오티드는 상이한 DNA 염기(뉴클레오티드), 예컨대 형광단으로 기능화된 dATP 뉴클레오티드 및 스테롤기(또는 dATP 뉴클레오티드 상의 형광단에 대해 상이한 형광단)로 기능화된 dTTP 뉴클레오티드에 하이브리드화 가능할 수 있다. 따라서, 기능화된 뉴클레오티드와 통상적인 뉴클레오티드의 임의의 조합이 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, RCA 반응 혼합물은 오직 한 유형의 기능화된 뉴클레오티드를 함유한다.
반응 혼합물에 존재하는 기능화된 뉴클레오티드의 양은 특정 DNA 염기(뉴클레오티드)에 하이브리드화할 수 있는 전체 뉴클레오티드의 상대적 백분율로 측정될 수 있다. 대안적으로, 이 값은 기능화된 뉴클레오티드가 상응하는 통상적인 뉴클레오티드를 대체한 백분율로 간주될 수 있다. 예를 들어, 동일한 양의 통상적인 dATP와 형광단으로 변형된 dATP를 사용하는 것은 변형(기능화)되는 총 dATP 뉴클레오티드의 50% 또는 기능화된 dATP 뉴클레오티드로 통상적인 dATP 뉴클레오티드의 50% 대체로 표현될 수 있다.
RCA 반응 혼합물에서 기능화된 뉴클레오티드의 상대적인 양은 최종 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에서 기능화된 뉴클레오티드의 빈도(frequency)를 제어하기 위해 다양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 특정 DNA 염기(뉴클레오티드)에 하이브리드화할 수 있는 전체 뉴클레오티드의 최대 약 5%, 예를 들어 약 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%를 나타낼 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서 기능화된 뉴클레오티드는 특정 DNA 염기(뉴클레오티드)에 결합할 수 있는 전체 뉴클레오티드의 25%, 50%, 75% 또는 100%와 같은 더 높은 비율을 나타낼 수 있다.
존재하는 기능화된 뉴클레오티드의 상대적인 양은 여러 가지 이유로 다양할 수 있다. 예를 들어, Cy3로 변형된 dATP와 같은 일부 기능화된 뉴클레오티드는 고농도로 상업적으로 입수 가능하지 않다. 더욱이, 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 기능화된 뉴클레오티드의 포함이 본 발명에 의해 생성된 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 수율에 영향을 미칠 수 있으며, 예를 들어 높은 상대적인 양의 기능화된 뉴클레오티드의 사용은 RCA 반응을 담당하는 DNA 폴리머라제의 활성을 억제(예를 들어, RCA 생성물이 합성되는 효율을 감소)할 수 있거나, 또는 RCA 생성물을 절단하고 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 방출하는 것을 담당하는 절단 효소의 활성을 억제(예를 들어, RCA 생성물이 절단되는 효율 감소)할 수 있다.
그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 높은 수율이 높은 상대적인 양의 기능화된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 최대 약 75%, 예컨대 최대 약 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%를 사용하는 경우에도 달성될 수 있다는 것을 결정했다. 일부 실시형태에서, 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%와 같은 75% 초과의 기능화된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 가능할 수 있다. 특히, 본 발명자들은 핵 염기에 알킨 또는 비닐 기를 함유하는 기능화된 뉴클레오티드가 RCA 생성물에 효율적으로 포함될 수 있기 때문에 본 발명에서 특히 유용하다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 더욱이, RCA 생성물은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 쉽게 절단될 수 있지만, 아래에서 논의되는 바와 같이, 일부 실시형태에서 통상적인 뉴클레오티드만을 함유하는 동등한 RCA 생성물을 절단하는 데 필요한 양에 비해 더 많은 양의 절단 효소가 필요할 수 있다.
유사하게, 본 발명자들은 데옥시리보스 당에 O-메틸기를 함유하는 기능화된 뉴클레오티드가 RCA 반응에서 통상적인 뉴클레오티드를 완전히 대체하고 여전히 RCA 생성물을 생성할 수 있음을 발견했다. 더욱이, 본 발명자들은 놀랍게도 이들 뉴클레오티드를 RCA 생성물로 혼입하는 것이 절단 도메인(예를 들어, 헤어핀 절단 도메인) 또는 이들의 효소 절단(예를 들어 제한 엔도뉴클레아제에 의해)의 형성에 영향을 미치지 않는다는 것을 결정했다.
따라서, 반응 혼합물에 존재하는 기능화된 뉴클레오티드의 상대적인 양은 원하는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 수율을 최적화하거나 RCA 생성물의 생성을 최적화하기 위해 조정될 수 있다. 이러한 변형은 하기 실시예에 기술된 방법에 기초할 때 당업자의 범위 내에 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 반응 혼합물에서 기능화된 뉴클레오티드의 상대적인 양은 약 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 25%, 5 내지 25%, 10 내지 25%, 25 내지 50%, 25 내지 75%, 25 내지 100%, 50 내지 75%, 50 내지 100% 또는 75 내지 100%일 수 있다.
반응 혼합물에서 기능화된 뉴클레오티드의 상대적인 양, 단계 (b)에서 RCA 생성물의 생성 후 뉴클레오티드의 절대량(통상적인 뉴클레오티드 및 기능화된 뉴클레오티드 모두)에 더하여, 상기 방법은 절단 도메인에서 RCA 생성물을 절단하여 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, RCA 생성물을 절단하는 단계는 절단 도메인에서 RCA 생성물을 선택적으로 절단하기 위해 적합한 조건 하에서 절단 효소와 RCA 생성물을 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.
용어 "방출"은 절단 도메인으로부터 기능화된 올리고뉴클레오티드를 탈착 또는 분리하기 위해 올리고뉴클레오티드 서열에 접하는 절단 도메인에서 RCA 생성물을 절단하는 것을 지칭하기 위해 본 문맥에서 사용된다. 주어진 기능화된 올리고뉴클레오티드의 방출은 올리고뉴클레오티드 서열에 접하는 두 절단 도메인에서의 절단을 수반하는 것이 바람직하다.
기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 RCA 생성물에서의 모든 절단 도메인에서 절단이 일어날 필요는 없다. 위에서 언급한 바와 같이, RCA 생성물, 특히 절단 도메인에서 기능화된 뉴클레오티드의 혼입은 절단 단계의 효율을 감소시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 절단 도메인의 일부의 절단은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 일부의 방출을 초래할 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, RCA 생성물을 절단하는 단계는 RCA 생성물에서 절단 도메인의 적어도 약 30%, 예를 들어, 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 절단을 초래한다. 일부 실시형태에서, RCA 생성물을 절단하는 단계는 RCA 생성물에서 절단 도메인의 적어도 약 90%, 예를 들어 95% 이상의 절단을 초래한다.
대안적으로 볼 때, 일부 실시형태에서, RCA 생성물을 절단하는 단계는 RCA 생성물에 포함된 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 적어도 약 30%, 예를 들어 약 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 방출을 초래한다. 일부 실시형태에서, RCA 생성물을 절단하는 단계는 RCA 생성물에 함유된 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 적어도 약 90%, 예를 들어 95% 이상의 방출을 초래한다.
일단 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드가 방출되면, 다른 응용 분야에서 사용하기 위해 절단 반응 혼합물(예를 들어, 반응 성분 및/또는 분해 생성물, 에컨대 절단 도메인, 절단되지 않은 RCA 생성물 등)로부터 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 단리, 분리 또는 정제하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 단리, 분리 또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 단리, 분리 또는 정제는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단리, 분리 또는 정제 단계 후, 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 단리 절차 또는 이들의 제조에 사용된 물질 또는 성분(예를 들어, 반응 성분 및/또는 분해 생성물, 예컨대 절단 도메인, 절단되지 않은 RCA 생성물 등)으로부터 유래된 임의의 오염 성분이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 약 50 또는 60% 초과의 순도, 예를 들어 약 70, 80 또는 90% 초과, 예컨대 w/w(건조 중량)로 평가된 약 95 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 이러한 순도 수준은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 분해 생성물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 더 낮은 순도를 갖는, 예를 들어 약 50% 미만의 관심있는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 약 40 또는 30% 미만을 함유하는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 농축 제제를 제조하는 것이 유용할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 혼합물 또는 복수(예를 들어, 라이브러리)를 생성할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 예를 들어 크기에 따라 추가로 분리하여 특정의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 얻거나(즉, 특정의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 분리하거나) 또는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 하위 그룹 또는 하위 라이브러리를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 분리하여 특정의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 하위 그룹 또는 하위 라이브러리를 단리하기 위한 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 전술한 방법에 의해 수득된 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 혼합물(예를 들어 라이브러리)로부터 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 분리하여 특정의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 하위 그룹을 단리하는 추가 단계를 포함한다.
예를 들어, 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 겔 전기영동을 사용하여 절단 반응의 생성물을 크기에 따라 분리할 수 있다. 이어서, 원하는 기능화된 올리고뉴클레오티드를 겔로부터 단리되고, 필요하다면 당업계에 공지된 방법에 따라 추가로 정제될 수 있다. 본 발명의 기능화된 올리고뉴클레오티드를 정제, 단리 또는 분리하는 다른 방법은 크로마토그래피(예를 들어, HPLC, 크기 배제, 이온 교환, 친화성, 소수성 상호 작용, 역상) 또는 모세관 전기영동을 이용한다.
전술한 바와 같이, 전술한 방법에 의해 생성된 기능화된 올리고뉴클레오티드는 다른 화학 기, 예를 들어 예컨대 클릭(click) 화학을 통해 기능화된 올리고뉴클레오티드에 접합될 분자 또는 성분 상의 화학 기와 반응할 수 있는 반응성 기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 추가 분자 또는 성분(그 자체가 작용기를 포함하거나 작용기로 볼 수 있음)을 접합하는 것은 RCA 반응에 사용되는 기능화된 뉴클레오티드에 존재하는 경우 본 방법의 효율성을 억제하거나 낮출 수 있는 기와 같은 크고 벌키한(bulky) 기를 혼입하는 데 특히 유용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, RCA 반응 동안 폴리머라제에 의해 직접 혼입될 수 없거나 단지 낮은 효율 또는 수율로 혼입될 분자 또는 성분을 포함하는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 생성될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 방법에 의해 수득된 기능화된 올리고뉴클레오티드를 추가 접합 단계에 적용하는 것은 기능화된 올리고뉴클레오티드 라이브러리에 존재하는 구조의 다양성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 에컨대 클릭 화학을 통해 올리고뉴클레오티드의 작용성(예를 들어 반응성) 기를 통해 분자 또는 성분을 기능화된 올리고뉴클레오티드(들)에 접합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 분자 또는 성분은 알킨, 비닐 또는 아지드 기(즉, 본원에 정의된 방법에서 RCA 생성물에 혼입된 기능화된 뉴클레오티드의 알킨, 비닐 또는 아지드 기)를 통해 기능화된 올리고뉴클레오티드에 접합된다.
용어 "접합"은 본 발명의 맥락에서 분자 또는 성분을 기능화된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 상기 기능화된 올리고뉴클레오티드에서 알킨, 비닐 또는 아지드 기)에 연결하거나 결합하는 것과 관련하여 상기 분자 또는 성분을 공유 결합을 통해 상기 올리고뉴클레오티드에 연결하는 것을 지칭한다. 특히, 이 접합은 클릭 화학 반응을 통해 발생할 수 있다.
추가 분자 또는 성분을 하나 이상의 알킨기를 포함하는 본 발명의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드에 접합시키는 데 사용될 수 있는 특정 클릭 화학 반응의 예는 아지드-알킨 고리 첨가이다. 원하는 접합을 달성하기 위해, 알킨기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 아지드기를 함유하는 분자 또는 성분(예를 들어, 형광단과 같은 표지)과 함께 적절한 기간 동안 배양될 수 있다. 아지드-알킨 고리 첨가 반응은 일반적으로 구리 촉매, 특히 구리(l) 촉매를 사용한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 및 아지드 함유 분자 또는 성분은 황산구리의 존재 하에 배양될 수 있다. 환원제를 사용하여 활성 구리(I) 촉매를 생성할 수도 있다. 환원제는 예를 들어 아스코르브산 나트륨일 수 있다.
하나 이상의 비닐기를 포함하는 본 발명의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드에 추가 분자 또는 성분을 접합하기 위한 추가의 대표적인 예는 알켄-테트라진 반응을 이용할 수 있다. 이 반응은 구리가 없다는 장점이 있다. 또한, 이는 전술한 알킨-아지드 클릭 화학 반응에 완전히 직교한다. 따라서, 알킨기와 비닐기를 모두 포함하는 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 2개의 다른 추가 분자 또는 성분을 동일한 올리고뉴클레오티드에 접합시키기 위해 독립적으로 2개의 클릭 화학 반응에 참여할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위한 2단계 방법으로서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 기능화된 뉴클레오티드(예를 들어, 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 기와 같은 반응성 기, 예를 들어 알킨, 비닐 또는 아지드 기를 포함함)를 올리고뉴클레오티드에 혼입하는 제1 단계, 및 기능화된 뉴클레오티드의 작용기를 통해 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 추가 분자 또는 성분을 접합하는 제2 단계를 포함하는 2단계 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다.
임의의 바람직한 분자 또는 성분(즉, 실체(entity))이 본 방법에 의해 생성된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 작용기에 접합될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 이러한 분자 또는 성분은 공유 결합을 형성하기 위해 올리고뉴클레오티드의 작용기와 반응할 수 있는 기(예를 들어, 반응성 기)의 존재를 단순히 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 분자 또는 성분은 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 유기 화합물(예를 들어, 콜레스테롤과 같은 스테롤), 형광단, 금속-리간드 착물, 다당류, 나노 입자, 나노 튜브, 중합체, 세포, 세포 기관, 소포, 바이러스, 바이러스 유사 입자 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포이다.
일부 실시형태에서, 기능화된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 치료 또는 예방 효과를 갖는 화합물 또는 분자, 예를 들어 항생제, 항바이러스제, 백신, 항종양제, 예를 들어 방사성 화합물 또는 동위 원소, 사이토카인, 독소, 올리고뉴클레오티드, 핵산 코딩 유전자 또는 핵산 백신에 접합되거나 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능화된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 압타머)는 표지, 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 발광 표지, 발색단 표지, 뿐만 아니라 검출 가능한 기질을 생성하는 물질 및 효소, 예를 들어, 겨자무 과산화효소(horse radish peroxidase), 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제에 접합되거나 융합될 수 있다. 이 검출은 웨스턴 블로팅/면역블로팅(Western blotting/immunoblotting), 조직 화학(histochemistry), 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 유세포 분석(flow cytometry, FACS) 형식을 포함하여 항체가 통상적으로 사용되는 수많은 분석에 적용될 수 있다. 자기 공명 영상, 양전자 방출 단층 촬영 프로브 및 중성자 포획 치료를 위한 붕소 10을 위한 표지가 또한 본원에 기재된 기능화된 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 분자 또는 성분은 형광단, 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤), 폴리에테르, 금속 착물, 티올 함유 분자, 증가된 뉴클레아제 내성을 제공하는 기를 함유하는 분자, 및 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 기를 함유하는 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
기능화된 올리고뉴클레오티드에 접합된 분자 또는 성분은 다른 분자와 상호 작용할 수 있고 이러한 상호 작용은 공유 또는 비공유 상호 작용일 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 접합된 펩티드는 항체와 같은 동족 결합 파트너와 비공유적으로 상호 작용할 수 있다. 추가의 예에서, 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 기를 포함하는 분자는 공유결합 착물을 형성하기 위해 상기 분자 또는 성분의 반응성 기와의 반응을 통해 상기 정의된 다른 분자 또는 성분에 접합될 수 있다.
본 방법의 단계 (a)에서 제공된 원형 DNA 분자는 임의의 적절한 수단에 의해 생산될 수 있으며 다양한 수단은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 원형 DNA 분자를 제공하는 단계 (a) 전에 추가 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 원형 DNA 분자를 생산하는 방법은 절단 도메인(본원에서 "위유전자(pseudogene)"라고 함)에 의해 경계를 이루는 하나 이상의 원하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열을 인실리코(in silico)에서 설계하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 방법은 위유전자를 설계하는 컴퓨터 구현 방법을 이용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계, 예를 들어 위의 문헌[Ducani et al., 2013]에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "위유전자"는 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 하나 이상의 원하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 대안적으로, 이 서열은 본원에서 "핵산 구축물(construct)"로서 지칭될 수 있다.
인실리코에서 설계된 위유전자 서열은 상업적으로 이용 가능한 유전자 합성 방법, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 수단, 예를 들어 어셈블리 PCR를 사용하여 생산될 수 있다. 따라서, 방법은 위유전자를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
위유전자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 분자로서 생산될 수 있다. 위유전자는 단계 (a)의 원형 DNA 분자를 제공하기 위해 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단을 사용하여 원형화될 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥 분자는 후술하는 바와 같이 리가제(ligase) 효소를 사용하여 결찰될 수 있다. 이와 관련하여 위유전자의 5' 말단들 중 적어도 하나가 인산화되어 결찰이 일어나도록 할 수 있음이 이해될 것이다. 위유전자를 생산하는 단계가 5' 말단이 인산화되지 않는 DNA 분자를 생성하는 실시형태에서, 방법은 예를 들어 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 같은 키나제 효소를 사용하여 위유전자의 5' 말단(들)을 인산화하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
유사하게, 위유전자가 단일 가닥 분자로서 제공되는 경우, 서크리가제(CircLigase)와 같은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 분자의 분자내 결찰을 촉매할 수 있는 적절한 리가제 효소를 사용하여 원형화될 수 있다. 다시, 상기 방법은 예를 들어 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 같은 키나제 효소를 사용하여 위유전자의 5' 말단(들)을 인산화하여 결찰 반응을 촉진하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대장균(E.coli.)과 같은 박테리아에서 복제될 수 있는 플라스미드에 위유전자를 삽입하는 것이 유리할 수 있다. 적합한 플라스미드 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 이것은 위유전자의 서열이 확인되도록 하고(예를 들어, 시퀀싱을 통해) 서열의 임의의 오류가 임의의 적합한 방법을 사용하여 시퀀싱 및 돌연변이 유발의 반복을 통해 수정되도록 할 수 있다.
플라스미드로의 위유전자의 삽입은 또한 원형 DNA 분자의 상당한 수의 카피 생성을 용이하게 한다. 예를 들어, 서열 검증된 위유전자를 포함하는 플라스미드를 포함하는 단일 박테리아 콜로니를 성장시켜 플라스미드를 증폭시킬 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단을 사용하여 박테리아로부터 후속적으로 정제될 수 있다.
그 다음 위유전자 서열은 예를 들어 위에서 설명한 제한 효소를 사용하여 플라스미드로부터 절제된다. 절제된 선형 위유전자 서열은 PAGE 및 겔 추출 또는 기타 적절한 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 그 다음 정제된 선형 위유전자 서열은 T4 리가제와 같은 적합한 리가제 효소를 사용하여 재원형화되어 본 방법의 단계 (a)에서 제공될 원형 DNA 분자를 형성할 수 있다.
증폭 외에도, 플라스미드를 포함하는 위유전자를 박테리아로 형질 감염시키는 프로세스가 또한 박테리아 글리세롤 스톡(stock)이 생산되도록 할 수 있다. 원하는 위유전자 플라스미드를 포함하는 박테리아는 글리세롤에서 제조되고, 냉동되고 장기간 안정적으로 보관될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 방법의 단계 (a)는
(i) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 DNA 분자를 DNA 플라스미드 내로 클로닝하는 단계;
(ii) 상기 플라스미드를 증폭하는 단계;
(iii) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 플라스미드의 일부를 절제하는 단계; 및
(iv) 단계 (iii)에서 얻은 플라스미드의 일부를 원형화하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (ii)는 상기 DNA 플라스미드를 박테리아로 형질 감염시키고 박테리아를 성장시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 DNA 분자는 각각 절단 도메인을 포함하는 5' 말단 영역 및 3' 말단 영역을 추가로 포함하고, 여기서 단계 (iii)은 말단 영역에서 절단 도메인을 절단 효소로 절단하는 것을 포함한다.
본원에 정의된 임의의 적합한 절단 효소를 사용하여 플라스미드로부터 위유전자를 절제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 절단 효소는 BsmBI 또는 BsaI 또는 이의 이소스키조머이다.
본 발명의 일부 특정 실시형태에서, 방법은 phi29 DNA 폴리머라제 또는 이의 유도체 및 변형된 핵 염기를 포함하는 기능화된 뉴클레오티드를 사용한다. 일부 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 핵 염기 내의 반응성 기, 예컨대 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 반응성 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵 염기의 반응성 기는 상기 정의된 바와 같은 알킨 또는 비닐 기이다. 일부 실시형태에서, RCA 혼합물에서 기능화된 뉴클레오티드의 상대적인 양은 약 25 내지 100%, 예를 들어 25 내지 75%, 50 내지 100% 또는 75 내지 100% 또는 이들 범위 내의 임의의 값이다. 일부 실시형태에서, 절단 도메인은 상기 정의된 바와 같이 RCA 생성물에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 키트, 특히 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하는 데 사용하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는
(i) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자; 및 선택적으로
(ii) (i)의 절단 도메인을 절단하는 하나 이상의 절단 효소; 및/또는
(iii) 기능화된 dNTP를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트로서,
(i) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자 - 상기 절단 도메인은 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 상기 헤어핀 구조의 이중 가닥 부분은 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 포함함 - ; 및
(ii) 기능화된 dNTP(예를 들어, 본원에 정의된 바와 같음); 및 선택적으로
(iii) (i)의 절단 도메인을 절단하는 하나 이상의 절단 효소를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시형태에서, 키트는 롤링 서클 증폭을 수행할 수 있는, 즉 본원에 정의된 바와 같은 적어도 일부 가닥 치환 활성을 포함할 수 있는 DNA 중합효소 효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 phi29 폴리머라제 또는 이의 유도체, 또는 Bst DNA 폴리머라제 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 닉카제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 Nb.BsrDI, Nt.BspQI 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 단일 가닥 결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 대장균 단일 가닥 DNA 결합 단백질, T4 파지의 유전자 32 단백질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 상기 정의된 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 접합될 하나 이상의 분자 또는 성분을 포함할 수 있다.
키트의 원형 DNA 분자, 절단 효소 및 기능화된 dNTP는 위에 설명된 바와 같다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 적어도 20개의 뉴클레오티드를 함유한다. 예를 들어, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 적어도 50개의 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 약 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 50 내지 1000, 55 내지 900, 60 내지 800, 65 내지 700, 70 내지 600, 80 내지 500, 90 내지 450 또는 100 내지 400 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 400 내지 10000, 500 내지 9000, 600 내지 8000, 700 내지 7000, 800 내지 6000, 900 내지 5000 또는 1000 내지 4000 뉴클레오티드, 예를 들어 약 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다.
일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 5%는 기능화된 뉴클레오티드, 즉 본원에 정의된 작용기를 함유하는 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 이상은 기능화된 뉴클레오티드이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 잔기의 약 5 내지 100%, 예를 들어 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 잔기의 약 10 내지 95%, 15 내지 90%, 20 내지 85%, 25 내지 80%, 30 내지 75%, 35 내지 70%, 40 내지 65% 또는 45 내지 55%는 기능화된 뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 내부 기능화된 뉴클레오티드, 즉 올리고뉴클레오티드의 5'또는 3' 말단에 있지 않은 기능화된 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 내부 기능화된 뉴클레오티드, 예를 들어, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 내부 기능화된 뉴클레오티드를 함유한다.
단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 본원에 정의된 기능화된 뉴클레오티드들 중 임의의 하나 이상을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 알킨기, 알켄기(예를 들어, 비닐기), 아지드기, 할로겐기, O-메틸기, 잠긴 리보스 당 또는 이들의 조합으로부터 선택된 작용기를 함유하는 기능화된 뉴클레오티드를 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서;
(i) 올리고뉴클레오티드는 적어도 50개의 뉴클레오티드를 함유하며;
(ii) 뉴클레오티드 잔기의 적어도 5%는 알킨기, 알켄기(예를 들어, 비닐), 아지드기, 할로겐기, O-메틸기, 잠긴 리보스 당 또는 이들의 조합 중에서 선택된 작용기를 함유하며, 여기서 기능화된 뉴클레오티드 잔기 내의 작용기의 바람직한 위치는 위에서 정의된 바와 같다.
또 추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 복수의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리를 제공한다. 복수의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 라이브러리는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 추가 양태에서, 본 발명은 단일 분자 형광 인시츄 하이브리드화(smFISH)에 사용하기 위한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드 풀(pool)을 생산하는 방법인 본원에 정의된 방법을 제공하며, 여기서 기능화된 뉴클레오티드는 형광 표지된 뉴클레오티드이고, 풀의 각 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 30개, 바람직하게는 약 20 내지 25개 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직한 실시형태에서, 기능화된 뉴클레오티드는 동일한 형광 분자로 표지된다.
직접 형광 표지된 기능화된 뉴클레오티드의 사용에 대한 대안으로서, 방법은 형광 표지가 후속적으로 접합될 수 있는 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드의 사용을 포함할 수 있다. 적합한 형광 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며 위에 정의되어 있다.
따라서, 또 추가의 양태에서, 본 발명은 단일 분자 형광 인시츄 하이브리드화(smFISH)에 사용하기 위한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드 풀(pool)을 생산하는 방법인 본원에 정의된 방법을 제공하며, 여기서 기능화된 뉴클레오티드는 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드이며, 상기 방법은 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 풀의 각각의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 30개, 바람직하게는 약 20 내지 25개 뉴클레오티드를 함유한다. 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드는 위에 정의되어 있으며, 아지드기, 알킨기, 알켄기, 니트론기, 테트라진기 또는 테트라졸기, 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다.
smFISH 기술에서 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 하이브리드화 프로브 역할을 하여 검출할 특정 표적 서열을 포함하는 핵산 분자의 존재와 위치를 확인한다. 따라서, 단일 분자 형광 인시츄 하이브리드화(smFISH)에 사용하기 위한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드 풀이 본원에 개시된 방법에 의해 생성되면, 기능화된 올리고뉴클레오티드는 smFISH 방법에서 검출될 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화될 수 있다.
단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드가 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 클릭 화학을 통해 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화되기 전 또는 후에 수행될 수 있다.
예를 들어, 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 기능화된 올리고뉴클레오티드는 클릭 화학을 통해 각 기능화된 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계를 거칠 수 있으며, 그 다음, 일단 형광 표지가 접합되면 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화될 수 있다. 대안적으로, 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 기능화된 뉴클레오티드를 포함하는 기능화된 올리고뉴클레오티드는 먼저 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화될 수 있고, 그 다음 일단 표적 서열에 하이브리드화되면, 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서의 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합시키는 단계를 거칠 수 있다.
따라서, 또 추가의 양태에서, 본 발명은 단일 분자 형광 인시츄 하이브리드화(smFISH)에 사용하기 위한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드 풀(pool)을 생산하는 방법인 본원에 정의된 방법을 제공하며, 여기서 기능화된 뉴클레오티드는 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드이며, 상기 방법은 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 풀의 각각의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 30개, 바람직하게는 약 20 내지 25개 뉴클레오티드를 함유하며, 여기서 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서의 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합시키는 단계는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화되기 전에 수행된다.
유사하게, 본 발명은 또한 단일 분자 형광 인시츄 하이브리드화(smFISH)에 사용하기 위한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드 풀을 생성하는 방법인 본원에 정의된 방법을 제공하며, 여기서 기능화된 뉴클레오티드는 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드이며, 상기 방법은 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 풀의 각각의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 30개, 바람직하게는 약 20 내지 25개 뉴클레오티드를 함유하며, 여기서 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서의 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합시키는 단계는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화된 후에 수행된다.
단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 "풀"은 상이한 서열, 즉 표적(검출될 분자) 내 상이한(예를 들어, 중첩되지 않는) 서열에 하이브리드화하는 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 풀은 적어도 약 20개의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 약 22, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 풀은 약 30 내지 96개의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 약 36, 48, 60, 72, 84 또는 96개의 올리고뉴클레오티드를 함유한다.
대안적으로 볼 때, 일부 실시형태에서 위유전자는 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 적어도 약 20개의 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 약 22, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 올리고뉴클레오티드 서열을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 위유전자는 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 약 30 내지 96개의 올리고뉴클레오티드 서열, 예를 들어 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 약 36, 48, 60, 72, 84 또는 96 올리고뉴클레오티드 서열을 함유한다.
본 발명은 이제 다음의 도면을 참조하여 다음의 비제한적인 실시예에서 보다 자세하게 설명될 것이다.
도 1은 에티듐 브로마이드 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 아가로스 겔의 사진(위), 및 형광단의 방출 파장에 대응하는 파장을 사용한 형광 이미징(아래)을 보여준다. 아가로스 겔은 형광단 ATTO-488(도 1a) 또는 Cy3(도 1b)를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물(378개 뉴클레오티드 함유)을 보여준다.
도 2는 에티듐 브로마이드 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 아가로스 겔 사진의 네거티브 이미지를 보여준다. 아가로스 겔은 5-EdUTP/dTTP 뉴클레오티드의 다양한 상대적인 양, 즉 25%, 50%, 75% 및 100% 및 phi29 DNA 폴리머라제 (도 2a) 또는 Bst DNA 폴리머라제 (도 2b)를 사용하여 생산된 5-에트닐-dUTP(5-EdUTP)를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물(420개 뉴클레오티드 함유)을 보여준다.
도 3은 에티듐 브로마이드 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 아가로스 겔의 사진(왼쪽), 및 Cy3 형광단의 방출 파장에 대응하는 파장을 사용한 형광 이미징(오른쪽)을 보여준다. 아가로스 겔은 5-에트닐-dUTP(5-EdUTP) 또는 후속적으로 Cy3 형광단-아지드 분자(N3-Cy3)와 반응된 통상적인 dTTP를 포함하는 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물(420개 뉴클레오티드 함유)을 보여준다. 음영 처리된 상자는 표시된 종의 존재를 나타낸다.
도 4는 에티듐 브로마이드 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 아가로스 겔 사진의 네거티브 이미지를 보여준다. 아가로스 겔은 다양한 상대적인 양의 기능화된 뉴클레오티드를 사용하여 생성된, (도 4a) 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트(2'F-dUTP); (도 4b) 2'-데옥시티미딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트)(α-티올-dTTP); 및 (도 4c) 2-dNTP 알파 S 뉴클레오티드(알파 S-dATP, 알파 S-dTTP, 알파 S-dCTP, 알파 S-dTTP 및 알파 S-dNTP 혼합물)를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물(420개 뉴클레오티드 함유)을 보여준다. 도 4a 및 도 4b의 오른쪽 패널은 RCA 생성물에 대응하는 밴드를 보여주기 위해 과다 노출된 100% 기능화된 뉴클레오티드에 대응하는 레인(lane)을 보여준다. 도 4c의 오른쪽 패널은 RCA 생성물에 대응하는 밴드를 보여주기 위해 과다 노출된 알파 S-dNTP 혼합물에 대응하는 레인을 보여준다.
도 5는 에티듐 브로마이드 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 아가로스 겔 사진의 네거티브 이미지를 보여준다. 아가로스 겔은 다양한 농도의 DNase I에 적용된 본 발명에 의해 생성된 올리고뉴클레오티드를 보여주며, 여기서 도 5a는 통상적인 뉴클레오티드(천연 ODN)만을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 반응 생성물을 보여주고; 도 5b는 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트 기능화된 뉴클레오티드(2'F-dUTP)를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 반응 생성물을 보여주며; 도 5c는 2'-데옥시티미딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트)(S-ODN)를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 반응 생성물을 보여준다.
도 6은 SybrGold 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 변성 PAGE 겔 사진의 네거티브 이미지를 보여준다. PAGE 겔은 다양한 상대적인 양의 5-비닐-dUTP 뉴클레오티드, 즉 25%, 50%, 75% 및 100%를 사용하여 생성된 5-비닐-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트(5-비닐-dUTP)를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 보여준다.
도 7은 SybrGold 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 변성 PAGE 겔 사진의 네거티브 이미지를 보여준다. PAGE 겔은 다양한 상대적인 양의 5-비닐-dUTP 뉴클레오티드, 즉 25%, 50%, 75% 및 100%를 사용하여 생성된 4-티오티미딘-5'-트리포스페이트(4-티오-dTTP)를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 보여준다.
도 8은 서열 번호 1 내지 13에 대응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 생산에 사용된 위유전자 서열의 주석이 달린 버전을 보여준다. 절단 및 닉킹 효소에 의해 인식되는 서열, 헤어핀 서열 및 최종 올리고뉴클레오티드 서열이 확인된다.
도 9는 2'-아지도-dATP의 구조(도 9a), 및 SybrGold 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 변성 PAGE 겔 사진의 네거티브 이미지(도 9b 및 도 9c)를 보여준다. PAGE 겔은 다양한 상대적인 양의 2'-아지도-dATP 뉴클레오티드, 즉 25%, 50%, 75% 및 100% 및 phi29 DNA 폴리머라제(도 9b) 또는 Bst DNA 폴리머라제(도 9c)를 사용하여 생산된 2'-아지도-dATP를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 보여준다.
도 10은 비오틴-16-아미노알릴-2'-dUTP의 구조(도 10a), 및 SybrGold 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 변성 PAGE 겔 사진의 네거티브 이미지(도 10b)를 보여준다. PAGE 겔은 다양한 상대적인 양의 비오틴-16-AA-dUTP 뉴클레오티드, 즉 25%, 50%, 75% 및 100% 및 phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 생산된 비오틴-16-아미노 알릴-2'-dUTP를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 보여준다.
도 11은 5'-브로모-2'-데옥시우리딘-5'트리포스페이트 뉴클레오티드(도 11a) 및 5'-프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 뉴클레오티드(도 11b)의 구조; 및 SybrGold 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 변성 PAGE 겔 사진의 네거티브 이미지(도 11c, 도 11d, 도 11e, 및 도 11f)를 보여준다. PAGE 겔은 다양한 상대적인 양의 각각의 기능화된 뉴클레오티드, 즉 25%, 50%, 75% 및 100% 및 phi29 DNA 폴리머라제 또는 Bst DNA 폴리머라제를 사용하여 생산된 5'-Br-dUTP(도 11c 및 도 11e) 또는 5'-프로피닐-dCTP(도 11d 및 도 11f)를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 보여준다.
도 12는 2'-O-메틸아데노신-5'-트리포스페이트 뉴클레오티드의 구조(도 12a), 및 SybrGold 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 변성 PAGE 겔 사진의 네거티브 이미지(도 12b)를 보여준다. PAGE 겔은 다양한 상대적인 양의 2'-OMe-ATP 뉴클레오티드, 즉 25%, 50%, 75% 및 100% 및 phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 생산된 2'-OMe-ATP를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 보여준다.
도 13은 LNA-아데노신-5'-트리포스페이트 뉴클레오티드의 구조(도 13a), 및 SybrGold 염색 후 UV 광을 사용하여 시각화된 변성 PAGE 겔 사진의 네거티브 이미지(도 13b 및 도 13c)를 보여준다. PAGE 겔은 다양한 상대적인 양의 LNA-ATP 뉴클레오티드, 즉 25%, 50%, 75% 및 100% 및 phi29 DNA 폴리머라제(도 13b) 또는 Bst DNA 폴리머라제(도 13c)를 사용하여 생산된 LNA-ATP를 포함하는 본 발명의 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 보여준다.
실시예
실시예 1 ― 형광 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
단일 가닥 형광 올리고뉴클레오티드 378개 뉴클레오티드 길이(서열 번호: 1)가 phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 효소적으로 생산되었다. 이것은 2개의 상이한 기능화된 dATP 핵 염기의 혼입을 통해 수행되었으며, 하나는 형광단 Cy3(7-프로파르길아미노-7-데아자-ATP-Cy3)을 포함하고 다른 하나는 형광단 ATTO-488(7-프로파르길아미노-7-데아자-ATP-ATTO-488)을 포함한다.
서열 번호 1 및 헤어핀 절단 도메인을 포함하는 이중 가닥 원형 DNA 주형은 문헌[Ducani et al., 2013, Nature Methods, 647-652]에 기재된 바와 같이 제조되었다. 주형(1 ng/μL)은 Nb.BsrDI 및 Nt.BspQI(0.25 U/μL)으로 닉킹되었고, 롤링 서클 증폭 반응(0.1 내지 0.25 ng/μL 주형 DNA, phi29 DNA 폴리머라제 0.25 U/μL, 0.1 μg T4 유전자 32)은 각 반응에서 천연 dATP 및 기능화된 dATP의 상이한 비율로 여러 번 수행되었다(즉, 기능화된 dATP의 상이한 상대적 양, 2%, 3% 또는 5%). 생성된 RCA 생성물을 탈이온수 및 1X 소화(digestion) 완충액(50 mM 칼륨 아세테이트, 20 mM 트리스-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 100 μg/ml BSA, 25℃에서 pH 7.9)에 5회 희석한 다음, BtsCI 제한 효소(0.5 U/μL)로 50℃에서 밤새 소화되었으며, 소화 생성물은 아가로스 겔에서 실행되었다. 이미징은 2개의 형광단에 대응하는 방출 파장을 사용하고 에티듐 브로마이드 염색 후 UV 시각화에 의해 수행되었다.
생성된 이미지는 ATTO-488 및 Cy3에 대해 각각 도 1a 및 1b에 도시된다. dATP-ATTO-488 뉴클레오티드의 백분율을 증가시키면 더 높은 형광성을 갖는 올리고뉴클레오티드가 생성되었음을 알 수 있다. 그러나, dATP 뉴클레오티드의 5%가 dATP-ATTO-488일 때 RCA 생성물의 총량은 약 60% 감소했다.
놀랍게도, dATP-ATTO-488의 사용과는 대조적으로, 존재하는 dATP-Cy3 뉴클레오티드의 백분율은 phi29 DNA 폴리머라제의 효율성에 영향을 미치지 않는 것으로 보였으며; 단일 가닥 DNA 생성물은 RCA 혼합물에서 5%의 dATP-Cy3으로 가시적이었다(도 1b). 더욱이, 변형된 뉴클레오티드의 혼입은 BtsCI 제한 효소의 효율, 및 결과적으로 절단 도메인을 포함하는 설계된 헤어핀의 방출을 방지하거나 감소시키지 않았다.
서열번호 1: CCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTG
실시예 2 ― 내재화된 알킨기, 즉 핵 염기 내 알킨기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
알킨기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 420개 뉴클레오티드 길이(서열 번호 2)가 phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 효소적으로 생산되었다.
서열 번호 2 및 헤어핀 절단 도메인을 포함하는 이중 가닥 원형 DNA 주형은 문헌[Ducani et al., 2013, Nature Methods, 647-652]에 기재된 바와 같이 제조되었다. 주형 RCA 반응의 닉킹은 실시예 1에 기재된 조건을 사용하여 수행되었지만, 5'-에티닐-dUTP(5'-EdUTP)의 상대적인 양을 증가, 즉, dTTP를 5'-EdUTP로 대체하여 5'-EdUTP의 상대적인 양이 0%(대조 반응), 25%, 50%, 75% 또는 100%가 되도록 하였다. 증폭 후, RCA 생성물을 BtsCI 제한 효소에 의해 소화되고 실시예 2에 기재된 바와 같이 아가로스 겔 상에 로딩하였다.
도 2a의 결과는 놀랍게도 dTTP 뉴클레오티드의 최대 100%가 알킨 기능화된 dUTP로 대체된 경우에도 RCA 수율이 단지 15 내지 20% 떨어졌다는 것을 보여준다. 따라서 도 2a는 RCA 생성물이 BtsCI에 의해 성공적이고 효율적으로 절단되었음을 보여준다. 알킨 기능화된 dUTP 뉴클레오티드의 혼입은 기능화된 올리고뉴클레오티드의 낮은 이동성이 관찰되었다는 사실에 의해 확인되었다.
phi29 DNA 폴리머라제를 Bst DNA 폴리머라제로 대체하는 추가 실험이 수행되었다. 겔 전기영동은 기능화된 dUTP의 최대 50%까지 증폭 수율의 변화를 나타내지 않았고, 최종 생성물은 25%의 변형된 dUTP를 갖는 것과 비교하여 이동하여, 대응하는 천연 뉴클레오티드(dTTP)보다 더 높은 분자량을 갖는 변형된 뉴클레오티드의 혼입을 확인했다(도 2b).
서열번호 2: ATTGAAGCATGCGGCGTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATGCGTAAGATACCACCACACCCGCATTCGCCATTCAGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTGCTGTTTCCTGTGTAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGTCATATTTGTTCCCTTTAGATCCGCCTCCATCTACAGGGCGCGTCCCCGCGCTTAATGCGCGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACTTACCTTCGGAAAAGAAATTGTTATCCGCTCACAAAAGCCAGAGTATTTAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGGGTTATTGTCTCATCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCTTATCAGACCCTGCCGCTTACAAGTGGTCGCCAGTCTATTAACAGCACTCAATACGGGATAATTTTTCAATATT
실시예 3 ― 내부화된 알킨기를 포함하는 단일 가닥 뉴클레오티드에 아지드-형광단을 접합하기 위한 클릭 화학 반응
실시예 2에서 생산된 올리고뉴클레오티드 내로 기능화된 5-에티닐-dUTP 뉴클레오티드의 성공적인 혼입은 클릭 화학 반응을 수행함으로써 추가로 입증되었다.
75%의 알킨 기능화된 dUTP 뉴클레오티드와의 반응으로부터 기능화된 올리고뉴클레오티드가 Cy3-아지드(50 μM)와 함께 배양되었다. 클릭 화학 용액은 또한 촉매로서 황산구리(50 μM), 아스코르브산 나트륨(50 mM) 및 THPTA(250 μM)를 포함하였다. 음성 대조로서, 동일한 주형으로부터 동일한 방법으로 생성되었지만 통상적인 dNTP로 생성된 올리고뉴클레오티드가 또한 Cy3-아지드와 함께 배양되었다. 또한, 내재화된 알킨기를 포함하는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 또한 Cy3-아지드의 부재 하에 배양되었다. 세 가지 반응으로부터의 반응 혼합물을 아가로스 겔에서 실행하고 이미지화했다(도 3). 예상 길이의 형광성 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 기능화된 올리고뉴클레오티드 및 형광단-아지드를 포함하는 반응에 대해서만 관찰되었다. 또한, 황산구리의 존재로 인한 가시적인 DNA 분해는 관찰되지 않았다.
실시예 4 ― 엔도뉴클레아제 내성 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
2'-플루오로-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트(2'F-dUTP) 또는 2'-데옥시티미딘-5'-O-(1-티오트리포스페이트)(포스포로티오에이트 dTTP)는 이전에 뉴클레아제 안정성을 부여하는 능력으로 인해 바이오 의학 및 치료제 응용을 위해 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 변형하는 데 사용되었다. 이들 변형된 뉴클레오티드는 전술한 실험 스킴(scheme)을 사용하여 RCA에 의해 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되었다. 통상적인 dTTP 뉴클레오티드는 0에서 100%까지 증가하는 백분율로 기능화된 뉴클레오티드에 의해 대체되었다. 그 다음 탠덤 반복 RCA 생성물은 BtsCI 제한 효소에 의해 별개의 420 염기 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드(서열 번호 2)로 소화되었다.
2'F-dUTP 기능화된 뉴클레오티드로 수행된 실험에서, 기능화된 뉴클레오티드의 0%에서 75%까지 유사한 RCA 수율이 나타났으며, 기능화된 뉴클레오티드의 100%에서 급격한 수율 저하가 관찰되었다(도 4a).
포스포로티오에이트 dTTP 실험에서, RCA 수율은 기능화된 뉴클레오티드의 양이 증가함에 따라 점진적으로 감소하여, 통상적인 뉴클레오티드만 사용한 수율에 비해, 75%의 기능화된 뉴클레오티드로 최대 약 65% 감소했다(도 4b).
그러나 아가로스 겔의 과다 노출은 심지어 100%의 기능화된 핵 염기로 기능화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 어떻게 생성되었는지 보여주었다 - 도 4a 및 4b의 오른쪽 패널 참조.
다른 포스포로티오에이트 dNTP(알파 S dNTP로 표시됨)는 하나씩 첨가하거나 또는 조합하여 추가 실험에서 시험되었다(도 4c). 모든 통상적인 뉴클레오티드의 75%가 상응하는 알파 S 기능화된 뉴클레오티드로 대체된 마지막 경우에도, RCA 생성물을 합성하고 효소적으로 절단하여 아가로스 겔에서 볼 수 있는 올리고뉴클레오티드를 생성했다.
통상적인 뉴클레오티드만으로 생산된 대조 올리고뉴클레오티드에 비해 기능화된 올리고뉴클레오티드의 엔도뉴클레오티드 내성이 조사되었다. 통상적인 뉴클레오티드만으로 생산된 대조 420-nt 길이 올리고뉴클레오티드, 2'-F-dUTP 기능화된 올리고뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 dTTP 기능화된 올리고뉴클레오티드(둘 다 75%의 상대적인 양의 기능화된 뉴클레오티드를 사용하여 생산됨)가 증가하는 농도의 DNAse I과 함께 배양되었다(도 5a 내지 5c). 대조 올리고뉴클레오티드는 18 mU/ml의 DNAse I로 완전히 소화되었지만, 효소적으로 생산된 2'-F-dUTP 및 포스포로티오에이트 dTTP 기능화된 DNA 올리고뉴클레오티드는 둘 다 동일한 농도의 엔도뉴클레아제로 배양한 후에 아가로스 겔에서 여전히 가시적이었다.
실시예 5 ― 비닐기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
티미딘 유사체 5-비닐-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트(5-비닐-dUTP)로 기능화된 76 내지 81개 염기 길이의 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드(서열 번호 3 내지 13)가 전술한 실험 스킴에 따라 RCA 반응을 통해 효소적으로 생산되었다. 모든 올리고뉴클레오티드는 단일 위유전자(서열 번호 16)에서 코딩되었다. 단일 가닥 올리고뉴클레오티드에 이러한 기능화된 뉴클레오티드의 혼입은 구리가 없는 클릭 화학 반응이 사용되어 테트라진 유사 분자를 올리고뉴클레오티드에 접합시키는 것을 가능하게 한다. 이 알켄-테트라진 반응은 이전에 수행된 알킨-아지드 클릭 화학 반응과 완전히 직교할 수 있다.
통상적인 뉴클레오티드 dTTP에 비해 RCA 반응 혼합물에서 기능화된 뉴클레오티드의 양을 증가시키는 것은 5-비닐-dUTP가 단일 가닥 RCA 생성물에 성공적으로 혼입되고 헤어핀 구조가 성공적으로 소화되도록 하였다. 그러나 RCA 생성물을 절단하는 데 사용된 phi29 DNA 폴리머라제 및 유형 II 엔도뉴클레아제 모두의 활성 수준은 기능화된 뉴클레오티드가 없을 때보다 낮았으며, 그 결과, 기능화된 뉴클레오티드가 통상적인 dTTP 뉴클레오티드를 완전히 대체했을 때 소화되지 않은 헤어핀 구조를 가진 더 높은 분자량 밴드가 생성되었다(도 6).
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실시예 6 ― 티올화 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
티올화된 dTTP(4-티오티미딘-5'-트리포스페이트)로 기능화된 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 전술한 반응 스킴 및 주형(서열 번호 3 내지 13)을 사용하여 RCA 반응을 통해 효소적으로 생산되었다. 모든 올리고뉴클레오티드는 단일 위유전자(서열 번호 16)에서 코딩되었다.
phi29 DNA 폴리머라제 혼입에 의한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로의 티올화 뉴클레오티드의 혼입은 상응하는 통상적인 뉴클레오티드(dTTP)의 75% 대체까지의 기능화된 뉴클레오티드의 양, 즉 75%의 상대적 양의 기능화된 뉴클레오티드에서 매우 성공적이었다(도 7).
RCA 생성물은 전술한 바와 같이 유형 II 제한 효소에 의해 소화되었지만, 기능화된 RCA 생성물의 완전한 소화에는 통상적인 뉴클레오티드만을 포함하는 RCA 생성물에 사용된 농도보다 10배 높은 효소 농도가 필요했다. 통상적인 dTTP 뉴클레오티드가 기능화된 티올화 뉴클레오티드로 완전히 대체되었을 때, 유형 II 제한 효소로 처리한 후 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 관찰되지 않았지만, 웰(well)에서 소화되지 않은 RCA 생성물의 매우 희미한 축적만이 관찰되었는데, 이는 폴리머라제의 활성이 또한 영향을 받았음을 시사한다.
실시예 7 ― 아지드 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
대응하는 통상적인 dATP 뉴클레오티드를 대체하는 기능화된 2'-아지도-dATP 뉴클레오티드(도 9a)의 증가하는 백분율을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 420개 뉴클레오티드 길이(서열 번호 2)가 phi29 DNA 폴리머라제(도 9b) 및 Bst DNA 폴리머라제(도 9c)를 사용하여 효소적으로 생산되었다.
새로 합성된 DNA 가닥의 고밀도 아지도기는 Cu(I) 촉매되는 후이스겐 고리 첨가("클릭" 화학)에 의해, 또는 아지드와 시클로알킨, 예를 들어 시클로옥틴 또는 시클로노닌의 스트레인(strain) 촉진되는 [3 + 2] 고리 첨가에 의해, 알킨 분자로 합성 후 기능화를 가능하게 한다.
가닥 치환 활성을 갖는 2개의 상이한 폴리머라제가 증폭 단계에서 사용되었다: phi29 DNA 폴리머라제 또는 Bst DNA 폴리머라제. 두 폴리머라제는 기능화된 뉴클레오티드를 증폭 생성물에 혼입할 수 있었으며, 이는 그 다음 소화되고 아가로스 겔에서 실행되었다.
phi29 DNA 폴리머라제로 생성된 DNA 생성물은 변형된 뉴클레오티드의 최대 75%까지 겔에서 가시적이었고(도 9b), Bst DNA 폴리머라제 생성물은 최대 100%까지 가시적이었지만(도 9c), Bst 증폭 완충액 염은 스미어 효과(smear effect)로 이어졌다(2'-아지도 dATP의 0%에 대응하는 레인에서도). 기능화된 뉴클레오티드는 성공적으로 혼입되었으며, 증폭 생성물의 절단을 가능하게 하는 헤어핀 구조의 형성에 큰 영향을 미치지 않았다.
실시예 8 ― 비오틴화된 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
대응하는 통상적 뉴클레오티드 dTTP를 대체하는 기능화된 비오틴-16-아미노알릴-2'-dUTP(도 10a)의 증가하는 백분율(25% 내지 100%)을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 420개 뉴클레오티드 길이(서열 번호 2)는 phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 효소적으로 생산되었다(도 10b).
비오틴화된 뉴클레오티드의 혼입은 DNA 증폭 반응에 약간만 영향을 미쳤으며, 놀랍게도, 기능화된 뉴클레오티드의 큰 크기로 인한 입체 장애의 가능성에도 불구하고, RCA 생성물의 절단을 가능하게 하는 헤어핀 구조의 형성을 방해하지 않았다. 다수의 내부 비오틴을 기능화된 폴리뉴클레오티드에 혼입하는 것은 스트렙타비딘 기능화된 분자와의 접합을 가능하게 한다.
실시예 9 ― 5-변형된 피리미딘을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산: 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트 및 5-프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트
각각 대응하는 통상적인 뉴클레오티드 dTTP 및 dCTP를 대체하는 비천연 5-변형된 피리미딘: 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트(도 11a) 및 5-프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트(도 11b)의 증가하는 백분율(25% 내지 100%)을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 420개 뉴클레오티드 길이(서열 번호 2)는, phi29 DNA 폴리머라제(도 11c 및 11d) 및 Bst DNA 폴리머라제(도 11e 및 11f)를 사용하여 효소적으로 생산되었다. 놀랍게도, 두 기능화된 뉴클레오티드는 RCA 생성물에서 헤어핀 구조의 형성에 영향을 주지 않고 새로 합성된 DNA 서열에 성공적으로 혼입되어 절단 반응이 발생하게 할 수 있었다.
실시예 10 ― 2'-O-메틸-ATP를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
대응하는 통상적 뉴클레오티드 dATP를 대체하는 2'-O-메틸-ATP(도 12a)의 증가하는 백분율(25% 내지 100%)을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 420개 뉴클레오티드 길이(서열 번호 2)는 phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 효소적으로 생산되었다(도 12b). 존재하는 기능화된 뉴클레오티드의 100%에서도, 증폭 생성물은 여전히 가시적이었다. 이 결과는 알려진 천연 폴리머라제가 이러한 변형된 기질을 효율적으로 수용할 수 없음을 보여준 이전 연구와 상반된다(문헌[Romesberg, JACS 2004, 10.1021/ja038525p]).
또한, 더 높은 분자량의 소화되지 않은 DNA 밴드가 겔에서 보이지 않았으며, 이는 기능화된 뉴클레오티드의 존재가 제한 효소에 의한 헤어핀 구조의 형성과 그의 소화에 영향을 미치지 않았음을 보여준다. 이것은 O-메틸기에 의해 DNA 분자에 부여되는 뉴클레아제 내성의 관점에서 놀라운 결과였다.
실시예 11 ― LNA-아데노신-5'-트리포스페이트를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 효소적 생산
대응하는 통상적 뉴클레오티드 dATP를 대체하는 LNA-아데노신-5'-트리포스페이트(도 13a)의 증가하는 백분율(25% 내지 100%)을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 420개 뉴클레오티드 길이(서열 번호 2)는 phi29 DNA 폴리머라제(도 13b) 및 Bst DNA 폴리머라제(도 13c)를 사용하여 효소적으로 생산되었다.
LNA 단량체는 구조적으로 RNA를 모방하지만, 기능화된 뉴클레오티드의 100%에 의해서도, phi29 DNA 폴리머라제 및 Bst DNA 폴리머라제 모두의 폴리머라제의 효율성은 크게 영향을 받지 않았다. 더욱이, 기능화된 뉴클레오티드는 증폭 생성물의 소화를 가능하게 하는 헤어핀 구조의 형성을 방해하지 않았다.
<110> Moligo Technologies AB <120> Method and products for producing functionalised single stranded oligonucleotides <130> 20.11.140968/01 <150> GB1901583.3 <151> 2019-02-05 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequence <400> 1 ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 60 ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 120 atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 180 gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 240 tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 300 ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 360 acatttcccc gaaaagtg 378 <210> 2 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequence <400> 2 attgaagcat gcggcgtgca taattctctt actgtcatgc catgcgtaag ataccaccac 60 acccgcattc gccattcagg cggccgccac cgcggtggag ctccagctgc tgtttcctgt 120 gtagagttgg 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Claims (37)

  1. 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는 방법으로서,
    (a) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자를 제공하는 단계;
    (b) 주형으로서의 (a)의 원형 DNA 분자 및 하나 이상의 기능화된 뉴클레오티드(dNTP)를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA) 반응을 수행하는 단계; 및
    (c) 절단 도메인에서 RCA 반응의 생성물을 효소적으로 절단하여 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 원형 DNA 분자는 이중 가닥이고, 상기 방법은 RCA 반응이 수행되기 전에 RCA 주형을 제공하기 위해 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 추가 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기능화된 dNTP는 알킨기를 포함하는 뉴클레오티드, 형광 표지된 뉴클레오티드, 스테롤기를 포함하는 뉴클레오티드, 폴리에테르기를 포함하는 뉴클레오티드, 금속 착물을 포함하는 뉴클레오티드, 비닐기를 포함하는 뉴클레오티드, 티올기를 포함하는 뉴클레오티드, 티오네이트화 뉴클레오티드, 뉴클레아제 내성이 증가하도록 변형된 뉴클레오티드, 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드, 및 올리고뉴클레오티드의 열 안정성에 영향을 미치는 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능화된 dNTP는 알킨기, 알켄기, 아지드기, 할로겐기, O-메틸기, 잠긴 리보스 당을 포함하는 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 상기 기능화된 dNTP는 알킨기, 비닐기 또는 아지드기를 포함하는 뉴클레오티드인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 방법은 알킨, 비닐 또는 아지드 기를 통해 분자 또는 성분을 올리고뉴클레오티드에 접합시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 분자 또는 성분은 형광단, 스테롤, 폴리에테르, 금속 착물, 티올기를 함유하는 분자, 증가된 뉴클레아제 내성을 제공하는 기를 함유하는 분자, 및 클릭 화학 반응에 참여할 수 있는 기를 함유하는 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 도메인은 올리고뉴클레오티드 서열에 직접 인접하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 도메인은 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 함유하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 도메인은 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 헤어핀 구조의 이중 가닥 부분은 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 효소는 유형 II 제한 엔도뉴클레아제, 선택적으로 BseGI 또는 BtsCI와 같은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 서열에 접하는 절단 도메인은 동일한, 방법.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하여 RCA 주형을 제공하는 단계는 절단 효소로 원형 DNA 분자의 단일 가닥을 절단하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 원형 DNA 분자는 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 함유하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 절단 효소에 의해 인식되는 서열은 올리고뉴클레오티드 서열에 접하고 올리고뉴클레오티드 서열에 없는 절단 도메인들 사이에 있는, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 효소는 닉카제이고, 선택적으로 상기 절단 효소는 Nb.BsrDI, Nt.BspQI 또는 이들의 조합인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RCA 반응은 phi29 DNA 폴리머라제를 사용하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RCA 반응은 Bst DNA 폴리머라제를 사용하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 DNA 분자는 복수의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며, 각각의 올리고뉴클레오티드 서열은 절단 도메인에 의해 경계를 이루는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 상이한, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는
    (i) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 DNA 분자를 DNA 플라스미드 내로 클로닝하는 단계;
    (ii) 상기 플라스미드를 증폭하는 단계;
    (iii) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 플라스미드의 일부를 절제하는 단계; 및
    (iv) 단계 (iii)에서 얻은 플라스미드의 일부를 원형화하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단계 (ii)는 상기 DNA 플라스미드를 박테리아 내로 형질 감염시키고 박테리아를 성장시키는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형 DNA 분자는 각각 절단 도메인을 포함하는 5' 말단 영역 및 3' 말단 영역을 추가로 포함하고, 단계 (iii)은 말단 영역에서 절단 도메인을 절단 효소로 절단하는 것을 포함하며, 선택적으로 상기 절단 효소는 BsmBI 또는 BsaI인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 단리 또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드의 생산에서 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자의 용도로서, 상기 절단 도메인은 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 포함하는 용도.
  26. 제25항에 있어서, 상기 절단 도메인은 제7항 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고/같거나 상기 DNA 분자는 제19항에 정의된 바와 같은, 용도.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 키트로서,
    (i) 절단 도메인에 의해 경계를 이루는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 원형 DNA 분자 - 상기 절단 도메인은 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 상기 헤어핀 구조의 이중 가닥 부분은 절단 효소에 의해 인식되는 서열을 포함함 - ; 및
    (ii) 선택적으로 제3항 또는 제4항에 정의된 바와 같은 기능화된 dNTP; 및 선택적으로
    (iii) (i)의 절단 도메인을 절단하는 하나 이상의 절단 효소를 포함하는, 키트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 절단 도메인은 제7항, 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같고/같거나 상기 DNA 분자는 제19항에 정의된 바와 같은, 키트.
  29. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드로서,
    (i) 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 50개의 뉴클레오티드를 함유하며;
    (ii) 상기 뉴클레오티드 잔기의 적어도 5%는 알킨기, 알켄기, 아지드기, 할로겐기, O-메틸기, 잠긴 리보스 당 또는 이들의 조합 중에서 선택된 작용기를 함유하는, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서, 작용기를 함유하는 뉴클레오티드 잔기 중 적어도 하나는 내부 잔기인, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 잔기의 적어도 10%는 알킨기, 알켄기, 아지드기, 할로겐기, O-메틸기, 잠긴 리보스 당 또는 이들의 조합 중에서 선택된 작용기를 함유하는, 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드.
  32. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 복수의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리로서, 상기 라이브러리는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 라이브러리.
  33. 제1항 내지 제3항 또는 제7항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 분자 형광 인시츄 하이브리드화(smFISH)에 사용하기 위한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드 풀(pool)을 생산하는 방법이고, 상기 기능화된 뉴클레오티드는 형광 표지된 뉴클레오티드이며, 상기 풀의 각 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 30개, 바람직하게는 약 20 내지 25개 뉴클레오티드를 함유하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 분자 형광 인시츄 하이브리드화(smFISH)에 사용하기 위한 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드 풀을 생산하는 방법이고, 상기 기능화된 뉴클레오티드는 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드이며, 상기 방법은 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 풀의 각각의 단일 가닥 기능화된 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 30개, 바람직하게는 약 20 내지 25개 뉴클레오티드를 함유하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 클릭 화학에 참여할 수 있는 화학 기를 포함하는 뉴클레오티드는 아지드기, 알킨기, 알켄기, 니트론기, 테트라진기 또는 테트라졸기, 또는 이들의 조합을 포함하는 뉴클레오티드인, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화되기 전에 수행되는, 방법.
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 클릭 화학을 통해 각각의 기능화된 올리고뉴클레오티드에서 적어도 하나의 기능화된 뉴클레오티드에 형광 표지를 접합하는 단계는 기능화된 올리고뉴클레오티드가 표적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화된 후에 수행되는, 방법.
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