KR20230173159A - 개선된 포스포트랜스퍼라제를 위한 재료 및 방법 - Google Patents
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Abstract
비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT) 단백질 및 이러한 NPT 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 본원에 기술된다. 구체적 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT 단백질은 야생형 NPT에 비해 감소된 활성을 갖는다. 본원에 제공된 비-자연 발생 NPT 단백질은 형질전환 또는 형질감염된 세포를 스크리닝하기 위한 선택성 표지로서 유용하다. 비-자연 발생 NPT 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터와 키트, 및 비-자연 발생 NPT 단백질 및 관심 단백질 또는 관심 비-코딩 RNA 서열을 발현하는 세포의 생산 방법이 또한 본원에 제공된다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,739호; 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,744호; 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,746호; 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,749호, 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,753호; 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,759호; 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,764호; 2021년 4월 21일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/177,767호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
서열목록
본 출원은 파일명이 "14620-686-228_SL.txt"이고, 작성일이 2022년 4월 9일이며, 크기가 118,113 바이트인 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT) 단백질 및 이러한 NPT 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 구체적 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT 단백질은 야생형 NPT에 비해 감소된 활성을 갖는다. 본원에 제공된 비-자연 발생 NPT 단백질은 형질전환 또는 형질감염된 세포를 스크리닝하기 위한 선택성 표지(selectable marker)로서 유용하다. 비-자연 발생 NPT 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터와 키트 및 비-자연 발생 NPT 단백질 및 관심 단백질 또는 관심 비-코딩 RNA 서열을 발현하는 세포의 생산 방법이 또한 본원에 제공된다.
일부 경우에는, 게놈 내로 안정하게 통합된 외인성 전이유전자를 보유하는 포유동물 세포주를 생성하는 것이 덜 어려워지고는 있지만, 단백질 생산물을 높은 수준 및/또는 높은 전이유전자 복제수로 발현하는 클론 주를 식별하는 것은 어려운 일(예를 들어 비효율적이고, 시간 소모적인 것 등)이다. 전이유전자 통합 부위에서의 서열은 전이유전자 발현에 대한 주요 영향을 가질 수 있어서(문헌[Lee et al., Trends Biotechnol., 37(9): 931-942 (2019)]), 상이한 클론에서 극적으로 상이한 발현 수준을 초래한다. DNA 조절 요소가 전이유전자와 숙주 DNA 사이에 배치될 때 염색체 위치 효과로부터 전이유전자를 보호하는 데 사용될 수 있다(문헌[Gupta et al., Biotechnol. Adv. 37(8): 107415 (2019)]에서 리뷰됨). 이러한 접근법은 발현 및 발현 안정성을 증가시킬 수 있지만, 유의한 스크리닝이 여전히 고발현 클론을 식별하는 데 필요할 수 있다. 바이러스 생산자 세포주를 개발하기 위해서는, 아마도 높은 전이유전자 발현을 갖는 것보다, 패키징되는 바이러스 페이로드(viral payload)의 다수의 복제물을 갖는 주를 생성하는 것이 더 중요하다. 멀티카피(multicopy) 전이유전자를 선택하는 방법은 세포주 개발을 더 효율적이도록 만들 것이다.
문제 중 하나는 안정한 세포주를 생성하는 데 사용되는 다수의 작제물이 심지어 매우 낮은 수준으로 발현될 때에도 형질전환된 세포에 선택적 이점을 부여하는 매우 효율적인 선택 표지(selection marker)를 함유하는 것이다. 그러므로, 높은 표지 유전자 발현 또는 멀티-카피 전이유전자를 직접적으로 선택하지 않는다. 선택 표지 발현 또는 번역 효율을 감소시키기 위한 몇몇의 접근법이 기술되어 왔다. 이들은 발현을 유도하기 위한 약한 프로모터를 사용하는 것(문헌[Niwa et al., Gene 108(2): 193-199 (1991)]; 문헌[Fan et al., J Biotechnol 168(4): 652-658 (2013)]; 문헌[Zhou et al, BMC Biotechnol. 13: 29 (2013)]), 교대 코돈으로부터 번역을 개시하는 것(예를 들어, ATG 대신에 GTG 또는 TTG)(문헌[van Blokland et al., J Biotechnol 128(2): 237-245 (2007)]; 문헌[Cairns et al, Biotechnol Bioeng 108(11): 2611-2622 (2011)]), 및 번역을 개시하기 위해 내부 리보좀 진입 부위(IRES)를 사용하는 것(문헌[Gurtu et al., Biochem Biophys Res Commun 229(1): 295-298 (1996)]; 문헌[Kwaks et al., Nat Biotechnol 21(5): 553-558 (2003);]; 문헌[Ho et al., J Biotechnol 157(1): 130-139 (2012)])을 포함한다.
선택 표지 효율을 감소시키기 위한 또 다른 접근법은 감소된 활성을 갖는 돌연변이 단백질을 사용하는 것이다. 클루타민 합성효소(GS) 유전자에서의 돌연변이가 CHO 세포에서 선택 엄격성을 증가시키는 데 사용되어 왔다(문헌[Lin et al., MAbs 11(5): 965-976 (2019)]). Tn5로부터의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)(아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제3'-IIa)는 가장 일반적으로 사용되는 선택 표지 중 하나이다. 이는 세균에서 네오마이신 및 카나마이신에 대한 내성 및 포유동물과 식물 세포에서 G418에 대한 내성을 부여하며, 이는 이들 항생 물질을 인산화하는 것에 의한다(문헌[Shaw et al., Microbiol Rev 57(1): 138-163 (1993)]). 돌연변이 유발 연구(문헌[Blazquez et al., Mol. Microbiol. 5(6): 1511-1518 (1991)]; 문헌[Kocabiyik et al., SAAS Bull Biochem Biotechnol 5: 58-63 (1992)]; 문헌[Kocabiyik and Perlin, Biochem Biophys Res Commun 185(3): 925-931 (1992)]; 문헌[Kocabivik and Perlin, Int J Biochem 26(1): 61-66 (1994)]) 및 자연발생 돌연변이의 발견(문헌[Yenofsky et al. Proc Natl Acad Sci U S A 87(9): 3435-3439 (1990)])은 세균에서 항생 물질 내성을 부여하는 능력을 감소시키되, 제거하지는 않는 주요 잔기를 식별하였다. 돌연변이 NPT 유전자가 CHO 세포에서 안정한 항체 생산 세포주를 선택하기 위해 사용되는 벡터 내로 혼입되었을 때, 선택의 엄격함이 증가됨에 따라 야생형 NPT 유전자의 사용에 비해 항체 발현 및 생산성이 더 높아졌다(문헌[Sautter and Enenkel, Biotechnol Bioeng 89(5): 530-538 (2005)]; 문헌[Ho et al., J Biotechnol 157(1): 130-139 (2012)]). 두 가지 벡터 시스템을 사용하여, 2 내지 16%의 효소 활성을 갖는 NPT 돌연변이는 야생형 NPT 유전자로 선택된 풀에 비해 특이적 항체 생산성을 5배 내지 10배로 증가시켰다(문헌[Sautter and Enenkel 2005]). 3%의 활성을 갖는 돌연변이 NPT 유전자가 단일 트리시트로닉 벡터(tricistronic vector)에서 사용되었을 때, 특이적 생산성은 야생형 NPT 유전자의 사용에 비해 17배 증가하였다(문헌[Ho et al. 2012]). 그러나, 이들 접근법은 제한적이다.
본 발명은 형질전환된 세포의 선택을 보다 엄격하게 만들며, 이로 인해 관심 전이유전자를 높은 수준으로 발현하는 세포주를 식별 및 작성하는 데 필요한 스크리닝을 감소시킬 유의하게 감소된 활성을 갖는 NPT 돌연변이의 식별을 인식하고 다룬다. 일 양태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT에서 1개, 2개 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 개시된 1개, 2개 이상의 아미노산 치환, 또는 이의 조합)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 하기 (a) 내지 (f)에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (b) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (c) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (d) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (e) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (f) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 하기 (a) 내지 (f)에서의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 1의 위치 36 및 210 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (b) 서열 번호 1의 위치 36 및 182 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (c) 서열 번호 1의 위치 36 및 218 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (d) 서열 번호 1의 위치 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (e) 서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (f) 서열 번호 1의 위치 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지(selectivity marker)로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 세균 세포는 대장균(E. coli)이다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산된다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산된다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 37의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 서열은 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 단백질을 인코딩하며, 제2 단백질은 치료적 단백질이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 비-자연 발생 NPT를 포함하는 시험관내 또는 생체외 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 서열 번호 20, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 37의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 세균, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 식물 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 인간 세포주로부터의 것이다.
또 다른 양태에서, 비-자연 발생 NPT를 발현하는 시험관내 또는 생체외 숙주 세포가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 비해 약화되고, 비-자연 발생 NPT는 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (b) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (c) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (d) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (e) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (f) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
일부 실시형태에서, 시험관 내 또는 생체외 숙주 세포는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 비해 약화된 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT를 발현하며, 비-자연 발생 NPT는 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (b) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (c) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (d) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (e) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (f) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세균 세포는 대장균이다.
본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산된다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산된다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 발현된 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다. 본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 발현된 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다. 본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 발현된 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다. 본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 발현된 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다. 본원에 기재된 시험관내 또는 생체외 숙주 세포의 일부 실시형태에서, 발현된 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포는 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열은 제2 단백질을 인코딩하며, 제2 단백질은 치료적 단백질이다. 일부 실시형태에서, 제2 핵산 서열은 비-코딩 RNA를 인코딩하며, 비-코딩 RNA는 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 세균, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 식물 세포이다.
또 다른 양태에서, 전이유전자가 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 본원에 기재된 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및 (ii) 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및 b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 세포를 핵산 서열이 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 선택하는 단계.
일 실시형태에서, 전이유전자가 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및 (ii) 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 세포를 핵산 서열이 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 선택하는 단계.
특정 실시형태에서, 전이유전자가 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법으로서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 제1 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및 (ii) 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;(2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 세포를 핵산 서열이 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 선택하는 단계.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포를 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 전이유전자의 높은 복제수는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비-자연 발생 NPT 또는 돌연변이 NPT 대신에 사용될 때 획득되는 것보다 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 전이유전자의 높은 발현 수준은 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비-자연 발생 NPT 또는 돌연변이 NPT 대신에 사용될 때 획득되는 것보다 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 5 내지 1000배 더 높다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 세균 세포는 대장균이다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산된다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 세균 세포는 대장균이다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산되며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 세균, 효모, 포유동물, 또는 식물 세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 인간 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포주(예를 들어, 인간 세포주)로부터의 것이다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 핵산 서열은 선택된 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다. 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 이들의 게놈 DNA 내로 통합된 전이유전자의 5개 내지 100개의 복제물을 갖는다. 특정 실시형태에서, 선택된 세포는 이들의 게놈 DNA 내로 통합된 전이유전자의 1개 내지 5개의 복제물을 갖는다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 선택된 세포는 전이유전자의 높은 복제수를 갖는다. 일부 실시형태에서, 전이유전자의 높은 복제수는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 대신에 사용될 때 획득되는 것보다 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 선택된 세포는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전이유전자의 높은 발현 수준은 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비-자연 발생 NPT 또는 돌연변이 NPT 대신에 사용될 때 획득되는 것보다 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 5 내지 1000배 더 높다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 선택된 세포는 전이유전자의 높은 복제수 및 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전이유전자의 높은 복제수는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 대신에 사용될 때 획득되는 것보다 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높다. 일부 실시형태에서, 전이유전자의 높은 발현 수준은 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비-자연 발생 NPT 또는 돌연변이 NPT 대신에 사용될 때 획득되는 것보다 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 5 내지 1000배 더 높다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 선택된 세포는 바이러스 유전자를 포함한다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 전이유전자는 인간 성장 인자 유전자를 포함한다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418이다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 10배 내지 1000배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 100배 내지 1000배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 500배 내지 1000배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 750배 내지 1000배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 100배 내지 500배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 10배 내지 100배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 10배 내지 50배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 10배 내지 25배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 2배 내지 10배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 10배 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 100배 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 500배 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 750배 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 10배 내지 100배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 10배 내지 50배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 5배 내지 25배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 것의 5배 내지 10배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 일부 실시형태에서, 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 것의 2배 내지 10배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 집단은 동일하며, 사용된 조건은 동일하다.
전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법의 특정 실시형태에서, 전이유전자는 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 비-코딩 RNA는 안티센스 RNA, miRNA, shRNA, 긴 비-코딩 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, tRNA, 또는 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 단백질은 치료적 단백질 또는 항원이다. 치료적 단백질 또는 항원은 본원에 기재되거나, 당업자에게 알려진 것일 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질은 바이러스 단백질이다. 바이러스 단백질은 본원에 기재되거나, 당업자에게 알려진 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT의 사용은 전이유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포를 위한 스크린에 대한 필요성을 7,500배 내지 10,000배만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT의 사용은 전이유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포를 위한 스크린에 대한 필요성을 5,000배 내지 10,000배만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT의 사용은 전이유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포를 위한 스크린에 대한 필요성을 2,500배 내지 10,000배만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT의 사용은 전이유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포를 위한 스크린에 대한 필요성을 1,000배 내지 10,000배만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT의 사용은 전이유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포를 위한 스크린에 대한 필요성을 5,000배 내지 7,500배만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT의 사용은 전이유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포를 위한 스크린에 대한 필요성을 1,000배 내지 5,000배만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT의 사용은 전이유전자로 형질감염 또는 형질전환된 세포를 위한 스크린에 대한 필요성을 500배 내지 1,000배만큼 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 선택성 표지로서의 야생형 NPT와 비교하여 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 a) 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존을 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 b) 세포를 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 선택성 표지로서의 야생형 NPT와 비교하여 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존을 숙주 세포 내로 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 b) 세포를 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시키는 단계. 일부 실시형태에서, 본 방법은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 선택성 표지로서의 야생형 NPT와 비교하여 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존을 숙주 세포 내로 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;(2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 b) 세포를 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시키는 단계. 일부 실시형태에서, 본 방법은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다. 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 세균, 효모, 포유동물, 또는 식물 세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 인간 세포이다.
플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 플라스미드 또는 트랜스포존은 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 바이러스 단백질이다. 특정 실시형태에서, 단백질은 치료적 단백질이다.
플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법의 특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418이다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 숙주 세포의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) (i) 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계; b) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 본 방법은 선택된 세포의 콜로니를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) (i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -; (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; b) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) (i) 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 공동 도입하는 단계; b) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 본 방법은 선택된 세포의 콜로니를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) (i) 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 공동 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -; (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; b) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) (i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 공동 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -; (1) 서열 번호 1의 위치 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 위치 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 위치 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 위치 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; b) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 숙주 세포의 집단은 (i) 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 포함함 -; 및 b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 본 방법은 선택된 세포의 콜로니를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 숙주 세포의 집단은 (i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하며, 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -; (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 본 방법은 선택된 세포의 콜로니를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 숙주 세포의 집단은 (i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 포함하며; 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 위치 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 위치 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 위치 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 위치 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 본 방법은 선택된 세포의 콜로니를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주의 제조 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 본원에 기재된 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함함 -; b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 배양하여 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주를 생산하는 단계.
일 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주의 제조 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 치료적 단백질 또는 효소를 인코딩하는 제2 핵산 서열; b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 배양하여 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주를 생산하는 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주의 제조 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 치료적 단백질 또는 효소를 인코딩하는 제2 핵산 서열; b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 배양하여 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주를 생산하는 단계.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 안정한 세포주는 포유동물 세포주이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 안정한 세포주는 인간 세포주이다. 일부 실시형태에서, 안정한 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 안정한 세포주는 치료적 단백질을 발현한다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시형태에서, 안정한 세포주는 효소를 발현한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 안정한 세포주가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포주의 안정성은 예를 들어 qPCR 또는 혼성화와 같은 정량적 방법에 의해 전이유전자의 복제수를 측정함으로써 결정될 수 있다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 세균 세포는 대장균이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산된다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산된다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산되며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기는 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 집단이 형질감염 또는 형질전환되는 경우, 숙주 세포의 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 더 적은 콜로니를 생산하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
숙주 세포는 예를 들어 포유동물 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 단백질은 치료적 단백질 또는 항원이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-코딩 RNA는 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA이다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 본원에 기재된 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함함 -; b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포를 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 증식시켜서 바이러스 생산자 세포주를 생산하는 단계. 바이러스 생산자 세포주는 예를 들어 유전자 요법 또는 암 요법을 위해 바이러스를 생산하는 데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열; b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포를 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 증식시켜서 바이러스 생산자 세포주를 생산하는 단계. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법은 하기 단계를 포함한다. a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열; b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포를 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 증식시켜서 바이러스 생산자 세포주를 생산하는 단계. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 세포주는 포유동물 세포주이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 세포주는 인간 세포주이다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질 및 AAV rep 단백질을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 외피 단백질을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 아데노바이러스의 복제에 필요한 아데노바이러스 E1 영역 단백질을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 gag 단백질을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 역전사 효소를 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질, gag 단백질, 및 역전사 효소를 포함한다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산자 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 본원에 기재된 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산자 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산자 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함한다.
바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 세포주는 포유동물 세포주이다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 세포주는 인간 세포주이다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주이다.
바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질 및 AAV rep 단백질을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 외피 단백질을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 아데노바이러스의 복제에 필요한 아데노바이러스 E1 영역 단백질을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 gag 단백질을 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 역전사 효소를 포함한다. 바이러스 생산자 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질, gag 단백질, 및 역전사 효소를 포함한다.
일 양태에서, 하기 단계를 포함하는 항원을 발현하는 포유동물 세포주의 제조 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 본원에 기재된 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및 (ii) 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함함 -; b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 배양하여 항원을 발현하는 세포주를 생산하는 단계. 일부 실시형태에서, 항원은 포유동물 대상체(예를 들어, 인간)를 면역시키거나, 포유동물 대상체(예를 들어, 인간)에서 면역 반응을 유도하는 데 사용된다. 항원은 또한 시험관내 또는 생체외로 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 항원을 발현하는 포유동물 세포주의 제조 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 네오마이신 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열; b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 배양하여 항원을 발현하는 세포주를 생산하는 단계.
일부 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 항원을 발현하는 포유동물 세포주의 제조 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 네오마이신 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열; b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및 c) 선택된 세포를 배양하여 항원을 발현하는 세포주를 생산하는 단계.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
포유동물 세포주의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 세포주는 포유동물 세포주이다. 포유동물 세포주의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 세포주는 인간 세포주이다. 포유동물 세포주의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주이다.
포유동물 세포주의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 또는 진균 항원이다. 포유동물 세포주의 제조 방법의 일부 실시형태에서, 항원은 암 항원이다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 항원 생산 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 본원에 기재된 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 항원 생산 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 항원 생산 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열.
본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 65% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다.
본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함한다. 본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함한다. 본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함한다. 본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함한다. 본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함한다.
본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 세포주는 포유동물 세포주이다. 본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 세포주는 인간 세포주이다. 본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주이다.
본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 또는 진균 항원이다. 본원에 제공된 항원 생산 세포주의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 항원은 암 항원이다.
또 다른 양태에서, 세균 세포 내로 도입될 때 카나마이신에 대한 내성 및 포유동물 세포 내로 도입될 때 G418에 대한 내성을 부여하기 위한 선택성 표지 수단이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 선택성 표지 수단은 서열 번호 20의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택성 표지 수단은 서열 번호 32의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택성 표지 수단은 서열 번호 33의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택성 표지 수단은 서열 번호 34의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택성 표지 수단은 서열 번호 36의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택성 표지 수단은 서열 번호 37의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 생산자 세포주의 제작 방법이 본원에 제공된다: a) 하나 이상의 바이러스 단백질, 및 형질전환되는 세포가 세균 세포인 경우는 카나마이신의 존재 하에 성장시키기 위한 수단 및 형질전환되는 세포가 포유동물 세포인 경우는 G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로, 세균 또는 포유동물 세포를 형질전환시켜서 형질전환된 세포를 생성하는 단계; 및 b) 형질전환된 세포를 카나마이신 또는 G418의 존재 하에 배양하여 생산자 세포주를 수득하는 단계 - 생산자 세포주는 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 바큘로바이러스로부터의 하나 이상의 바이러스 단백질을 발현함 -.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 외인성 핵산 서열의 안정한 염색체 통합을 갖는 세포의 선택 방법이 본원에 제공된다: a) 진핵 세포의 집단을, G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 포함하는 외인성 핵산 서열로 형질전환시키는 단계; b) 형질전환된 세포의 집단을 G418의 존재 하에 배양하여 G418의 존재 하에 성장할 수 있는 형질전환된 세포의 콜로니를 생산하는 단계; 및 c) 단계 (b)에서 생산된 콜로니로부터 세포를 선택하여 외인성 핵산의 안정한 염색체 통합을 갖는 세포를 수득하는 단계.
일부 실시형태에서, 외인성 핵산 서열은 전이유전자를 추가로 포함하며, 선택된 세포는 전이유전자를 발현한다.
일부 실시형태에서, 외인성 핵산 서열은 선택된 세포에 내인성인 유전자의 발현을 방해한다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는 안정한 에피좀을 갖는 포유동물 세포의 선택 방법이 본원에 제공된다: a) 포유동물의 세포의 집단을, G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 포함하는 플라스미드로 형질전환시키는 단계; b) 형질전환된 세포의 집단을 G418의 존재 하에 배양하여 G418의 존재 하에 성장할 수 있는 형질전환된 세포의 콜로니를 생산하는 단계; 및 c) 단계 (b)에서 생산된 콜로니로부터 세포를 선택하여 플라스미드를 포함하는 안정한 에피좀을 갖는 세포를 수득하는 단계.
일부 실시형태에서, 플라스미드는 EBNA1 OriP 핵산 서열을 추가로 포함하며, 선택된 세포는 EBNA1을 발현한다.
일 양태에서, 하기 단계를 포함하는 전이유전자를 일시적으로 발현하는 포유동물 세포의 선택 방법이 본원에 제공된다: a) 전이유전자 및 G418 존재 하의 성장 수단을 인코딩하는 핵산을 포유동물 세포의 집단 내로 도입하는 단계; b) 포유동물 세포의 집단을 G418의 존재 하에 48 내지 72시간 동안 배양하는 단계; 및 c) G418의 존재 하에 성장하는 포유동물 세포를 포유동물 세포의 배양된 집단으로부터 선택하는 단계 - 선택된 포유동물 세포는 전이유전자를 일시적으로 발현함 -.
일부 실시형태에서, 전이유전자는 크리스퍼 엔도뉴클레아제 또는 크리스퍼 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 수단은 서열 번호 38, 39, 40, 41, 42, 및 43의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
전술한 개요뿐만 아니라 본 출원의 구체적인 실시형태의 다음 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 해석할 때 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 출원은 도면에 나타낸 해당 실시형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1은 본원에 기재된 대표적인 발현 벡터(플라스미드 P313)를 예시한다.
도 2는 트랜스포존 요소("Leapin 좌측" 및 "Leapin 우측"), 인간 연장 인자 알파 프로모터("EF1α"), 폴리아데닐화 신호를 갖는 mCherry 코딩 영역("pA"), NPT 코딩 영역("Kan/NEO"), 및 복제 기점("pMB1 Ori")을 포함하는 작제물을 도시한다.
도 3은 본원에 기재된 콜로니 형성 검정으로부터의 결과를 도시한다.
도 4는 색을 갖지 않는 형질전환되지 않은 세포(극좌 튜브)와 비교하여 mCherry 및 NPT 단백질을 발현하는 작제물로 형질전환된 HEK293 세포의 안정한 풀에서의 mCherry 발현을 입증한다.
도 5는 야생형 NPT를 인코딩하는 작제물 P724, NPT 돌연변이 #1(V36M; G210A)을 인코딩하는 P725, 또는 NPT 돌연변이 #2(V36M; E182D)를 인코딩하는 P726으로 형질전환된 HEK293 세포에서의 전이유전자(mCherry) 복제수의 그래프를 나타내며, 여기서, 작제물은 트랜스포사제 요소를 포함하거나(+), 포함하지 않는다(-).
도 6a 및 도 6b는 문헌[Shaw et al., Microbiological Reviews 57: 138-163 (1993)]으로부터 채택된 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제의 정렬을 나타낸다. 서열 번호 18, 19, 및 45 내지 62는 도 6a 및 도 6b에 도시된 서열로 정렬되었다.
도 1은 본원에 기재된 대표적인 발현 벡터(플라스미드 P313)를 예시한다.
도 2는 트랜스포존 요소("Leapin 좌측" 및 "Leapin 우측"), 인간 연장 인자 알파 프로모터("EF1α"), 폴리아데닐화 신호를 갖는 mCherry 코딩 영역("pA"), NPT 코딩 영역("Kan/NEO"), 및 복제 기점("pMB1 Ori")을 포함하는 작제물을 도시한다.
도 3은 본원에 기재된 콜로니 형성 검정으로부터의 결과를 도시한다.
도 4는 색을 갖지 않는 형질전환되지 않은 세포(극좌 튜브)와 비교하여 mCherry 및 NPT 단백질을 발현하는 작제물로 형질전환된 HEK293 세포의 안정한 풀에서의 mCherry 발현을 입증한다.
도 5는 야생형 NPT를 인코딩하는 작제물 P724, NPT 돌연변이 #1(V36M; G210A)을 인코딩하는 P725, 또는 NPT 돌연변이 #2(V36M; E182D)를 인코딩하는 P726으로 형질전환된 HEK293 세포에서의 전이유전자(mCherry) 복제수의 그래프를 나타내며, 여기서, 작제물은 트랜스포사제 요소를 포함하거나(+), 포함하지 않는다(-).
도 6a 및 도 6b는 문헌[Shaw et al., Microbiological Reviews 57: 138-163 (1993)]으로부터 채택된 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제의 정렬을 나타낸다. 서열 번호 18, 19, 및 45 내지 62는 도 6a 및 도 6b에 도시된 서열로 정렬되었다.
본 개시내용은 부분적으로 야생형 NPT와 비교하여 유의하게 감소된 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 특정 아미노산 치환을 갖는 NPT의 놀라운 발견을 기반으로 한다. 본원에 기재된 NPT를 인코딩하는 핵산 서열의 사용은 형질전환된 세포주의 선택 및 생성을 위한 선택성 표지로서의 상당한 이점을 제공하며, 이는 관심 유전자 이외에 돌연변이 NPT를 발현하고, 형질전환된 세포에 비-형질전환된 세포에 대한 선택적 이점을 제공한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수형("a", "an", 및 "the")은 문맥이 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나, 육안 검사에 의해 측정되는 최대 일치도를 위해 비교 및 정렬될 때, 동일하거나, 동일한 명시된 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
서열 비교를 위하여, 전형적으로는 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터 내로의 입력이며, 필요한 경우, 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여 참조 서열에 대해 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 전산화된 구현에 의해(미국 위스콘신주 매디슨 575 Science Dr. 소재의 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 육안 검사에 의해(일반적으로 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)] 참조) 실시될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수 가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬될 때 일부 양성-값의 임계치 점수 T와 일치하거나, 이를 만족하는 질의 서열에서의 길이 W의 짧은 단어를 식별함으로써 높은 점수의 서열 쌍(HSP)을 식별하는 단계를 수반한다. T는 이웃 단어 점수 임계치(상기 Altschul 등 참조)로 지칭된다. 이들 초기 이웃 단어 히트는 검색을 개시하여 이들을 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 시드(seed)로서의 역할을 한다. 이어서, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양 방향으로 단어 히트가 연장된다.
뉴클레오타이드 서열의 경우, 매개변수 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N(일치하지 않는 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 누적 점수가 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 점수 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향에서 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 하락하거나; 하나 이상의 마이너스 득점 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 되거나; 어느 하나의 서열의 말단에 도달할 때 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이(W), 10의 기대치(E), 및 BLOSUM62 득점 매트릭스를 사용한다(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조).
퍼센트 서열 동일성을 계산하는 단계 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열들 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다는 추가의 지표는 하기 기재되는 제1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 제2 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드와 면역학적으로 교차 반응성인 것이다. 따라서, 예를 들어 2개의 펩타이드가 오직 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 폴리펩타이드는 전형적으로 제2 폴리펩타이드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 2개의 분자가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화되는 것이다.
용어 "야생형 NPT"와 "야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 당업자에 의해 이해된다. 일반적으로, 야생형 NPT는 자연에서 유기체들 중에 우세한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제3'-II이다. 특정 실시형태에서, 야생형 NPT는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제3'-IIa이다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 Tn5로부터의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제3'-IIa)이다. 구체적 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 NPT에서 아미노산 위치의 치환의 설명은 서열 번호 1의 아미노산 위치에 대한 것이다. 예를 들어, 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 야생형 NPT의 아미노산 치환은 도 6a 및 6b에 제공된 바와 같은 정렬에서 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 야생형 NPT의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 야생형 NPT를 지칭한다. 도 6a 및 6b에서는, APH(3')-IIa의 서열이 참조 서열(즉, 서열 번호 1에 상응하는 아미노산 서열)이며, 이에 대해 다른 야생형 NPT가 비교된다. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열 번호 6으로 제공된다.
본원에 사용된 구절 "선택성 표지 수단"은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 숙주 세포가 성장하도록 하는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT, 또는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 "존재 하에 성장시키기 위한 수단"이라는 구절은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 숙주 세포가 성장하도록 하는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT, 또는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
7.1
네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT) 단백질
일 양태에서, 야생형 NPT와 아미노산 서열이 상이하며, 야생형 NPT와 비교하여 변경된 포스포트랜스퍼라제 활성(예를 들어, 감소된 포스포트랜스퍼라제 활성)을 갖는 NPT 돌연변이가 본원에 제공된다. 일 실시형태에서, NPT 돌연변이는 야생형 NPT에서 본원(예를 들어, 표 1 및 표 2)에 기재된 1개, 2개 이상의 아미노산 치환, 또는 이의 조합을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 비-자연 발생 NPT 단백질이다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 단리된 NPT 단백질이다. 구체적 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서 약화된 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, NPT는 본원에 기재되거나, 당업자에게 알려진 검정에서 상응하는 야생형 NPT와 비교하여 감소된 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, NPT의 효소 활성은 문헌[Kocabiyik and Perlin, Biochem Biophys Res Commun 185(3): 925-931 (1992)]에 기재된 바와 같은 시험관내 키나제 검정에서 측정될 수 있다. NPT 돌연변이의 효소 활성은 동일한 조건 하에서 상응하는 야생형 NPT와 비교된다. 대안적으로 또는 추가적으로, NPT의 효소 활성은 특정 양의 카나마이신(예를 들어, 25 μg/ml, 75 μg/ml, 또는 100 μg/ml) 및 세균 성장을 위한 적절한 영양분뿐만 아니라 세균이 성장하기에 적절한 조건(예를 들어, 온도 등)을 포함하는 플레이트 상에서의 특정 기간(예를 들어, 36시간, 48시간, 72시간 이상) 후에 NPT 돌연변이를 인코딩하는 플라스미드(들)로 형질전환된 세균(예를 들어, 대장균)에 의한 콜로니 형성을 평가하여 간접적으로 측정될 수 있다. NPT 돌연변이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 세균의 콜로니 형성은 NPT 돌연변이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 세균과 동일한 성장 조건 하에서 성장한 상응하는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 세균의 동일한 종의 콜로니 형성과 비교되며, 야생형 NPT를 인코딩하는 플라스미드(들)로 형질전환된 세균에 의해 형성된 콜로니에 비해 NPT 돌연변이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 세균에 의해 형성된 더 적고/적거나 더 작은 콜로니는 NPT 돌연변이의 효소 활성 및/또는 단백질 안정성이 약화됨을 나타낸다. NPT 돌연변이의 효소 활성을 평가하기 위한 간접적 검정의 또 다른 예는 NPT 돌연변이 단백질을 인코딩하는 DNA로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 세포에 의한 콜로니 형성을 상응하는 야생형 NPT를 인코딩하는 DNA로 형질감염된 포유동물 세포에 의한 콜로니 형성과 비교하는 단계를 수반하며, 포유동물 세포의 둘 모두의 집단은 동일한 조건(예를 들어, 동일한 온도, CO2 등) 하에서 성장에 필요한 배지 및 특정 농도의 G418(예를 들어, 500 μg/ml)을 함유하는 플레이트 또는 또 다른 적절한 유형의 용기 상에서 특정 기간(예를 들어, 2주, 2.5주, 3주 이상) 동안 성장되고, 야생형 NPT로 형질감염된 포유동물 세포에 의한 콜로니 형성과 비교하여 NPT 돌연변이로 형질감염된 포유동물 세포에 의한 콜로니 형성의 감소는 NPT 돌연변이가 약화된 효소 활성을 가짐을 나타낸다.
NPT 유전자의 효소 활성을 평가하기 위한 간접적 검정의 또 다른 예는 작제물을 숙주 염색체 내로 안정하게 통합시키며, 선택제를 함유하는 배지 내의 조직 배양 접시 내에서 희석 및 플레이팅될 때 콜로니를 형성하는 포유동물 발현 작제물로 형질감염된 세포의 비율을 측정하는 단계를 수반한다. 예를 들어, 야생형 또는 돌연변이 NPT 이소형을 발현하도록 설계된 플라스미드로 형질감염된 HEK293 세포를, 2E6개 이하의 세포로 10%의 소태아 혈청 및 600 μg/ml의 G418을 함유하는 DMEM 배지에 담긴 150 mm 조직 배양물에 플레이팅하고, 37℃, 8% CO2에서 2주 동안 배양한다. 배지를 제거하고, 세포를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 50% 메탄올 중의 10 ml의 0.4% 메틸렌 블루로 염색한다. 염색을 제거하고, 세포를 100% 메탄올로 세정하고, 공기 건조하고, 사진을 찍는다. 콜로니 개체군의 감소: 야생형 NPT 발현 작제물에 비해 돌연변이 NPT 발현 작제물을 사용하여 플레이팅된 세포의 수는 돌연변이가 약화된 효소 활성을 가짐을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 야생형 NPT와 비교하여 감소된 활성을 갖는 NPT 돌연변이는 적합한 검정에서 결정된 야생형 NPT(예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 44)의 포스포트랜스퍼라제 활성의 0.001% 내지 10%를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT와 비교하여 감소된 활성을 갖는 NPT 돌연변이는 적합한 검정에서 결정된 야생형 NPT(예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 44)의 포스포트랜스퍼라제 활성의 0.001% 내지 8%를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 야생형 NPT와 비교하여 감소된 활성을 갖는 NPT 돌연변이는 적합한 검정에서 결정된 야생형 NPT(예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 44)의 포스포트랜스퍼라제 활성의 0.01% 내지 6%를 나타낸다. NPT 포스포트랜스퍼라제 활성은 당업계에 알려지거나(예를 들어, 문헌[Kocabiyik and Perlin, Biochem Biophys Res Commun 185(3): 925-931 (1992)] 및 포스포트랜스퍼라제 활성의 예시적인 검정 방법에 대해 그 내부에 인용된 참고문헌 참조), 본원에 기재된(예를 들어, 콜로니 형성) 임의의 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, NPT 돌연변이는 야생형 NPT의 아미노산 서열에서 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 가지며, 야생형 NPT의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 표 1 또는 표 2에 나열된 서열 번호 1의 1개 또는 2개의 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 실시형태에서, NPT 돌연변이는 야생형 NPT의 아미노산 서열에서 1개의 아미노산 치환을 가지며, 아미노산 치환은 표 1 또는 표 2에 나열된 서열 번호 1의 1개의 아미노산 잔기에 상응하는 야생형 NPT의 아미노산 잔기에서 존재한다. 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이는 당업자에 알려지거나, 본원에 기재된 기법에 의해 평가 시, 감소된 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, NPT 돌연변이는 야생형 NPT의 아미노산 서열에서 2개의 아미노산 치환을 가지며, 아미노산 치환은 표 1 또는 표 2에 나열된 서열 번호 1의 2개의 아미노산 잔기에 상응하는 야생형 NPT의 아미노산 잔기에서 존재한다. 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이는 당업자에 알려지거나, 본원에 기재된 기법에 의해 평가 시, 감소된 활성을 갖는다.
특정 실시형태에서, NPT 돌연변이는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열에서 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 가지며, 변이체의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 표 1 또는 표 2에 나열된 서열 번호 1의 1개 또는 2개의 아미노산 잔기에 상응한다. 일부 실시형태에서, NPT 돌연변이는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열에서 1개의 아미노산 치환을 가지며, 아미노산 치환은 표 1 또는 표 2에 열거된 서열 번호 1의 1개의 아미노산 잔기에 상응하는 변이체의 아미노산 잔기에서 존재한다. 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이는 당업자에 알려지거나, 본원에 기재된 기법에 의해 평가 시, 감소된 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, NPT 돌연변이는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열에서 2개의 아미노산 치환을 가지며, 아미노산 치환은 표 1 또는 표 2에 나열된 서열 번호 1의 2개의 아미노산 잔기에 상응하는 변이체의 2개의 아미노산 잔기에서 존재한다. 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이는 당업자에 알려지거나, 본원에 기재된 기법에 의해 평가 시, 감소된 활성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 메티오닌 및 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 알라닌을 가짐으로써 야생형 NPT와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 메티오닌 및 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 아스파르트산을 가짐으로써 야생형 NPT와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 메티오닌 및 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 페닐알라닌을 가짐으로써 야생형 NPT와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신 및 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 가짐으로써 야생형 NPT와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 메티오닌 및 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 세린을 가짐으로써 야생형 NPT와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 메티오닌 및 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산에 상응하는 위치에서 글리신을 가짐으로써 야생형 NPT와 상이하다. 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이는 당업자에 알려지거나, 본원에 기재된 기법에 의해 평가 시, 감소된 활성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다. 구체적 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT는 당업자에 알려지거나, 본원에 기재된 기법에 의해 평가 시, 감소된 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 야생형 NPT는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 적어도 50% 내지 75%, 50% 내지 80%, 50% 내지 60%, 75% 내지 95%, 또는 85% 내지 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3과 각각 동일하다. 특정 실시형태에서, 야생형 서열의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3과 각각 동일하다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합과 각각 동일하다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3과 각각 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 특정 실시형태에서, 야생형 서열의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3과 각각 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합과 각각 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 야생형 서열의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합과 각각 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환이다. 특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환이다. 특정 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다. 일부 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이다. 구체적 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT 돌연변이는 당업자에 알려지거나, 본원에 기재된 기법에 의해 평가 시, 감소된 활성을 갖는다.
특정 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3과 각각 동일하다. 특정 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3과 각각 동일하다. 예를 들어, 아미노글리코사이드 트랜스퍼라제의 모티프 1, 2, 및 3의 위치에 대해서는 도 6a 및 6b를 참조한다. 일부 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합과 각각 동일하다. 일부 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 또는 모티프 3과 각각 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 특정 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3과 각각 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합과 각각 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 실시형태에서, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 변이체의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합은 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 모티프 1, 모티프 2, 및 모티프 3의 조합과 각각 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
특정 실시형태에서, NPT 돌연변이는 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이는 본원에 제공된 표 1에 열거된 임의의 하나의 NPT 돌연변이이다. 또 다른 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이는 본원에 제공된 표 2에 열거된 임의의 하나의 NPT 돌연변이이다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 36에서 메티오닌 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 210에서 알라닌을 가짐으로써 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 36에서 메티오닌 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 182에서 아스파르트산을 가짐으로써 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 36에서 메티오닌 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 218에서 페닐알라닌을 가짐으로써 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 216에서 글리신 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 261에서 아스파라긴을 가짐으로써 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 36에서 메티오닌 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 218에서 세린을 가짐으로써 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 36에서 메티오닌 및 서열 번호 1 또는 서열 번호 44의 아미노산 위치 216에서 글리신을 가짐으로써 서열 번호 1 또는 서열 번호 44와 상이하다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 1의 이중 지점 NPT 돌연변이이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, NPT 돌연변이는 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, NPT 돌연변이는 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NPT 돌연변이는 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, NPT 돌연변이는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, NPT 돌연변이는 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, NPT 돌연변이는 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 27의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 28의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 29의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 35의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 32의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 33의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 34의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 36의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이는 서열 번호 37의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 상응하는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. "감소된 콜로니 형성"은 예를 들어 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포의 카나마이신 내성 콜로니에 비해 콜로니의 0.001% 내지 75% 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 콜로니 형성은 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포의 카나마이신 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 10% 감소일 수 있다. 특정 실시형태에서, 감소된 콜로니 형성은 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포의 카나마이신 내성 콜로니에 비해 0.01% 내지 6% 감소일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 NPT 돌연변이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열 번호 1)로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다. "감소된 콜로니 형성"은 예를 들어 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 콜로니의 0.001% 내지 75% 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 콜로니 형성은 야생형 NPT로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 10% 감소일 수 있다. 특정 실시형태에서, 감소된 콜로니 형성은 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.01% 내지 6% 감소일 수 있다.
본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT는 특정 항생 물질(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, G418, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 유도체)에 대한 내성을 부여한다. 구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT의 세포에 의한 발현은 세포가 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, G418, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 유도체)의 존재 하에 성장할 수 있도록 한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 NPT 또는 비-자연 발생 NPT는 하기 섹션 8에서 기재되는 아미노산 서열을 포함한다.
7.2
핵산 서열
일 양태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이를 인코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 본원에 제공된다. 코드의 축퇴로 인해, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 임의의 뉴클레오타이드 서열은 본 개시내용으로 포함된다. 특정 실시형태에서, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된다(예를 들어, 코돈이 특정 대상체 또는 특정 대상체로부터의 세포(들)에서의 발현을 위해 최적화됨). 당업계에 알려진 기법이 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 코돈 최적화하는 데 사용될 수 있다. 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 다음 중 1개, 2개 이상, 또는 전부를 추가로 포함할 수 있다: 프로모터, 인핸서, 인트론, 및 폴리-A 서열. 일부 실시형태에서, 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터 및 복제 서열의 기점을 추가로 포함할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 자연에서 발견되는 핵산 서열로부터 단리된다. 특정 실시형태에서, 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 자연에서 발견되는 유기체로부터 단리된다. 또한, "단리된" 핵산 서열, 예컨대 cDNA 분자는 재조합 기법에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, 표현 "실질적으로 없는"은 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만(특히 약 10% 미만)의 기타 물질, 예를 들어 세포 물질, 배양 배지, 다른 핵산 분자, 화학 전구체, 및/또는 다른 화학물질을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자의 조합물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보핵산, 리보뉴클레오타이드, 및 리보핵산, 및 이의 중합체성 형태를 포함하며, 단일 또는 이중 가닥 형태를 포함한다. 특정 실시형태에서, 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체, 예를 들어 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 펩타이드 핵산("PNA")을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 데옥시리보핵산(예를 들어, cDNA 또는 DNA)을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 리보핵산(예를 들어, mRNA 또는 RNA)을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 21의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 24의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 25의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 26의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 27의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 28의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 29의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 35의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다.
특정 실시형태에서, 서열 번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 33의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 34의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 서열 번호 36의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 37의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 제2 뉴클레오타이드 서열은 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩할 수 있거나, 숙주 세포 내의 내인성 유전자를 방해하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 핵산 서열은 추가의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 트랜스포존 요소)을 추가로 포함할 수 있다. 핵산 서열은 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 복제 기점, 및/또는 폴리-A 서열을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 동일한 프로모터에 실시 가능하게 연결된다. 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 상이한 프로모터에 실시 가능하게 연결된다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 관심 유전자의 제1 단편의 제2 뉴클레오타이드 서열, 및 관심 유전자의 제2 단편의 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공되며, 제2 뉴클레오타이드 서열은 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 3' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치하며, 제1 및 제2 단편은 관심 유전자의 재조합 및 방해를 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열의 상류의 loxP 뉴클레오타이드 서열 및 제3 뉴클레오타이드 서열의 하류의 loxP 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 예를 들어, 이러한 핵산 서열이 생산 및 사용되는 방법에 대해서는 문헌[G
ldener et al., Nucleic Acids Research 24 (13): 2519-2524 (1996)]을 참조한다. 핵산 서열은 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 폴리-A 서열을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 관심 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열, 제1 트랜스포사제 서열을 포함하는 제3 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 트랜스포사제 서열을 포함하는 제4 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공되며, 제3 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열의 상류이고, 제4 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열의 하류이다. 일부 실시형태에서, 제1 트랜스포사제 서열은 Leap-In 좌측 트랜스포사제이고, 제2 트랜스포사제는 Leap-In 트랜스포사제이다. 핵산 서열은 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 복제 기점, 및/또는 폴리-A 서열을 추가로 포함할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 핵산 서열은 하기 섹션 8에 기재되는 것이다.
구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열이 본원에 제공된다. 전이유전자는 본래의 유전자 서열일 수 있거나, 이는 예를 들어 특정 숙주 세포에서의 발현에 적합하도록 하는 코돈 최적화를 포함하도록 변형될 수 있다. 전이유전자는 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 전이유전자는 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)에 실시 가능하게 연결된다.
관심 단백질은 예를 들어 치료적 단백질 또는 검출 가능한 표지일 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 단백질은 호르몬, 성장 인자, 항체, 바이러스 단백질, 효소, 사이토카인, 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 관심 단백질은 항원(예를 들어, 바이러스, 세균, 진균, 또는 암 항원)이다. 특정 실시형태에서, 관심 단백질은 바이러스 단백질, 예컨대 캡시드 단백질, 외피 단백질, 또는 바이러스 복제에 필요한 단백질이다. 바이러스 단백질은 아데노-관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 바큘러바이러스 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 단백질은 치료적 또는 진단적 검정에서 유용할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.
비-코딩 RNA는 예를 들어 안티센스 RNA, 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 긴 비-코딩 RNA, 촉매적 RNA(예를 들어, 리보자임 포함), 리보좀 RNA, tRNA, 또는 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA일 수 있다.
본원에 제공된 핵산 서열의 일부 실시형태에서, 핵산 서열은 NPT 단백질 이외의 선택성 표지를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 선택성 표지는 세포 내로 도입될 때 인공적 선택에 적합한 특성을 부여한다. 선택성 표지는 예를 들어 항생 물질에 대한 내성을 부여할 수 있거나, 이는 특정 배양 조건 하에서 진핵 세포의 성장에 필요한 효소를 암호화할 수 있다. 선택성 표지는 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 선택성 표지는 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제이다. 일부 실시형태에서, 선택성 표지는 형광 단백질이다. 일부 실시형태에서, 용어 "선택도 표지"는 "선택성 표지"와 상호 교환적으로 사용된다.
사용될 수 있는 선택 표지는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(문헌[Wigler et al, Cell 11 :223 (1977)]), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌[Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)]), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌[Lowy et al, Cell 22:8-17 (1980)])를 포함하지만, 이로 제한되지는 않으며, 유전자는 각각 tk-, hgprt-, 또는 aprt-세포에서 이용될 수 있다. 또한, 대사길항물질 내성이 다음 유전자에 대한 선택의 기반으로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(문헌[Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)]; 문헌[O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)]); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(문헌[Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)]); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(문헌[Santerre et al, Gene 30: 147 (1984)]).
7.3
벡터
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 구체적 실시형태에서, 본원(예를 들어, 섹션 7.2 또는 섹션 8)에 기재된 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 관심 유전자의 제1 단편의 제2 뉴클레오타이드 서열, 및 관심 유전자의 제2 단편의 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터가 본원에 제공되며, 제2 뉴클레오타이드 서열은 5' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치하고, 제3 뉴클레오타이드 서열은 3' 말단에서 제1 뉴클레오타이드 서열의 측면에 위치하며, 제1 및 제2 단편은 관심 유전자의 재조합 및 방해를 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 제2 뉴클레오타이드 서열의 상류의 loxP 뉴클레오타이드 서열 및 제3 뉴클레오타이드 서열의 하류의 loxP 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
구체적 실시형태에서, 벡터는 하기 섹션 8에 기재되는 것이다.
플라스미드, 코스미드, 파지 벡터, 또는 바이러스 벡터와 같은 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 재조합 발현 벡터, 예컨대 플라스미드이다. 벡터는 발현 벡터의 종래의 기능을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 리보좀 결합 요소, 종결인자, 인핸서, 선택 표지, 및 복제 기점을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성, 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 핵산을 세포에 전달할 수 있는 다수의 발현 벡터가 당업계에 알려져 있으며, 세포에서 단백질 또는 비-코딩 RNA의 생산을 위해 본원에서 사용될 수 있다. 종래의 클로닝 기법 또는 인공적 유전자 합성이 본원에 제공된 실시형태에 따른 재조합 발현 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 기법은 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 잘 알려져 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 NPT 돌연변이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 클로닝 벡터이다. 클로닝 벡터는 예를 들어 플라스미드, 파지, 바이러스, 코스미드, 에피좀, 또는 세균 인공 염색체일 수 있다. 또한 본원에 포함된 발현 벡터를 포함하는 벡터에 대해서는 섹션 7.4를 참조한다.
7.4
NPT 돌연변이의 발현 방법
일 양태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질 또는 비-코딩 RNA의 생산 방법이 본원에 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질 또는 비-코딩 RNA, 또는 둘 모두를 발현하는(예를 들어, 재조합적으로 발현하는) 세포(예를 들어, 숙주 세포)가 본원에 제공된다. 또 다른 양태에서, 핵산 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 본원에 제공되며, 핵산 서열은 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 재조합 발현을 위해 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질 또는 비-코딩 RNA, 또는 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질 또는 비-코딩 RNA, 또는 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포가 또한 본원에 제공된다. 구체적 실시형태에서, 2개의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공되며, 제1 벡터는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 제2 벡터는 하나 이상의 추가 단백질 또는 비-코딩 RNA, 또는 둘 모두를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
사용될 수 있는 세포의 예는 이 섹션 및 하기의 섹션 7.5와 섹션 8에서 기재되는 것들을 포함한다. 세포는 1차 세포 또는 세포주일 수 있다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 다른 세포로부터 단리된다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 대상체의 신체 내에서 발견되지 않는다. 세포 또는 신체의 맥락에서 용어 "대상체"는 임의의 유기체(예를 들어, 세균 또는 포유동물)를 지칭한다. 대상체는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다.
NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 및 선택적으로 하나 이상의 추가 단백질 또는 하나 이상의 비-코딩 RNA, 또는 둘 모두는 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기법에 의한 것과 같은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 달리 명시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 변형, 핵산 혼성화, 및 당업계의 기술 내의 관련 분야에서의 종래의 기법을 이용한다. 이들 기법은 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있으며, 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 문헌[Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 문헌[Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; 문헌[Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates)]; 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press]; 문헌[Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press]; 문헌[Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 포함한다.
단백질(예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 및 선택적으로 관심 단백질)은 재조합 및 파지 디스플레이 기법, 또는 이의 조합을 포함하는 당업계에 알려진 광범위하게 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman et al, 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50]; 문헌[Ames et al, 1995, J. Immunol. Methods 184: 177-186]; 문헌[Kettleborough et al, 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958]; 문헌[Persic et al, 1997, Gene 187:9-18]; 문헌[Burton et al, 1994, Advances in Immunology 57: 191-280]; PCT 출원 PCT/GB91/01 134호; 국제 공개 WO 90/02809호, WO 91/10737호, WO 92/01047호, WO 92/18619호, WO 93/11236호, WO 95/15982호, WO 95/20401호, 및 WO97/13844호; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호, 및 제5,969,108호에 개시된 것들을 포함한다.
발현 벡터는 종래의 기법에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포)로 이식될 수 있으며, 수득되는 세포는 이어서 종래의 기법에 의해 배양되어 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 생산할 수 있고, 선택적으로 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA는 정제 또는 단리 될 수 있다. 벡터(예를 들어, 발현 벡터) 또는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어 전기천공, 형질주입, 감염, 열 충격, 미세주입, 염색체 이식, 또는 당업자에게 알려진 임의의 기법에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포) 내로 도입될 수 있다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 및 선택적으로 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 발현하는 데 이용될 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생산되고, 이후 정제될 수 있는 비히클(vehicle)을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염될 때 본원에 제공된 단백질을 인시츄로 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 미생물, 예컨대 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예를 들어, 대장균 및 B. 서브틸리스(B. subtilis)); 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia); 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 형질감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 녹조류, 예컨대 클라미도모나스 라인하르티이(Chlamydomonas reinhardtii) 또는 담배 식물); 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NSO, PER.C6, VERO, CRL7030, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3 세포)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
세균 시스템에서, 발현되는 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 이롭게 선택될 수 있다. 곤충 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카 핵다각체증 바이러스(AcNPV: Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심 단백질은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 삼부 리더 서열(tripartite leader sequence)에 리게이션될 수 있다. 이어서, 이러한 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 El 또는 E3)에서의 삽입에 의해, 형질감염된 숙주에서 생존 가능하고 관심 단백질을 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 얻어질 것이다(예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1 :355-359] 참조). 특이적 개시 신호가 또한 삽입된 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 소기의 코딩 서열의 판독 프레임과 동상이어야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 모두의 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자 등을 포함하여 향상될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bittner et al, 1987, Methods in Enzymol 153 :51-544] 참조).
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들어 1차 세포 또는 세포주로부터의 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 1차 세포, 예컨대 섬유아세포, 림프구(예를 들어, B 또는 T 세포), 상피세포, 내피세포, 뉴런, 성상세포, 간세포, 근세포, 연골세포, 지방세포, 또는 줄기세포(예를 들어, 배아 줄기세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 불멸화 세포일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 용어 "숙주 세포"는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염, 감염, 미세주입, 또는 형질전환되거나, 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 달리 엔지니어링된 세포 및 이러한 세포의 후대 또는 잠재적 후대를 지칭한다. 이러한 세포의 후대는, 후속 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈 내로의 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드의 통합으로 인해, 핵산 분자 또는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염된 모세포와 동일하지 않을 수 있다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 소기의 특이적 방식으로 유전자 생산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생산물의 번역후 가공 및 변형을 위한 독특하고, 특이적인 메커니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하도록 선택될 수 있다. 이 목적을 위해, 유전자 생산물의 1차 전사체의 적절한 가공, 글리코실화, 및 인산화를 위한 세포성 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, NS0(뮤린 골수종 세포주), CRL7030, 및 HsS78Bst를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 핵산 서열 및 선택성 표지(예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT)로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 이후, 엔지니어링된 세포는 특정 기간(예를 들어, 1일 내지 2일) 동안 농축 배지 내에서 성장하도록 허용될 수 있으며, 이어서 선택성 배지(예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT의 경우, 항생 물질, 예컨대 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418을 함유하는 배지)로 전환된다. 재조합 플라스미드 내의 선택성 표지는 선택(예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT의 경우, 항생 물질, 예컨대 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418)에 대한 내성을 부여하며, 세포가 플라스미드를 이들의 염색체 내로 안정적으로 통합시키고, 성장하도록 하여 병소를 형성하고, 이는 결국 복제되고, 세포주로 확장될 수 있다. 이러한 방법은 단백질을 발현하는 세포주를 엔지니어링하는 데 이롭게 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) (i) NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제1 핵산 서열을 숙주 세포의 제1 집단 내로 도입하는 단계; (b) 숙주 세포의 제1 집단을 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 (c) 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 숙주 세포의 제1 집단을 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 제1 핵산 서열은 숙주 세포의 제1 집단 내로 도입되었고, 제1 핵산 서열은 (i) NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함함 -; 및 (b) 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 더 적은 콜로니 및/또는 더 작은 콜로니를 생산하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 50 내지 100배, 100 내지 1,000배, 1,000배 내지 5,000배, 5,000 내지 10,000배, 1,000 내지 10,000배, 10,000 내지 15,000배, 5,000 내지 15,000배, 15,000 내지 25,000배, 10,000 내지 25,000배 더 적은 콜로니를 생산하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1,000배, 또는 5 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준 비교하여 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 500배, 또는 적어도 1,000배 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 복제수는 당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 복제수는 숙주 세포의 게놈 내의 단일 복제 내인성 유전자에 대한 제2 뉴클레오타이드 서열의 풍부도를 측정하기 위해 디지털 액적 PCR을 사용하여 측정될 수 있음). 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현은 정량적 역전사 PCR(qPCT)에 의한 RNA 수준 또는 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학)에 의한 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 또한, 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 일부 단백질에 대해, 단백질의 활성(예를 들어, 효소 활성)이 평가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 전이유전자를 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공된다: (a) (i) NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 전이유전자를 포함하는 제1 핵산 서열을 갖는 숙주 세포의 제1 집단을 도입하는 단계; (b) 숙주 세포의 제1 집단을 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 (c) 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 전이유전자를 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 숙주 세포의 제1 집단을 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 제1 핵산 서열은 숙주 세포의 제1 집단 내로 도입되었고, 제1 핵산 서열은 (i) NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 전이유전자를 포함함 -; 및 (b) 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 더 적은 콜로니 및/또는 더 작은 콜로니를 생산하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 10 내지 100배, 100 내지 1,000배, 1,000배 내지 5,000배, 5,000 내지 10,000배, 1,000 내지 10,000배, 10,000 내지 15,000배, 5,000 내지 15,000배, 15,000 내지 25,000배, 10,000 내지 25,000배 더 적은 콜로니를 생산하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1,000배, 또는 5 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 전이유전자의 발현 수준 비교하여 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 500배, 또는 적어도 1,000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 복제수는 당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 복제수는 숙주 세포의 게놈 내의 단일 복제 내인성 유전자에 대한 전이유전자의 풍부도를 측정하기 위해 디지털 액적 PCR을 사용하여 측정될 수 있음). 전이유전자 서열의 발현은 정량적 역전사 PCR(qPCT)에 의한 RNA 수준 또는 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학)에 의한 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 또한, 전이유전자에 의해 인코딩된 일부 단백질에 대해, 단백질의 활성(예를 들어, 효소 활성)이 평가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) (1) NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 및 (ii) 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제2 핵산 서열을 숙주 세포의 제1 집단 내로 도입하는 단계; (b) 숙주 세포의 제1 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 (c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 숙주 세포의 제1 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 숙주 세포의 제1 집단 내로 도입되었고, 제1 핵산 서열은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함함 -; 및 (b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 더 적은 콜로니 및/또는 더 작은 콜로니를 생산하고, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 50 내지 100배, 100 내지 1,000배, 1,000배 내지 5,000배, 5,000 내지 10,000배, 1,000 내지 10,000배, 10,000 내지 15,000배, 5,000 내지 15,000배, 15,000 내지 25,000배, 10,000 내지 25,000배 더 적은 콜로니를 생산하고, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제3 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열의 복제수와 비교하여 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제3 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열의 복제수와 비교하여 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제3 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열의 복제수와 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 500배, 또는 적어도 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1,000배, 또는 5 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 500배, 또는 적어도 1,000배 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 복제수는 당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 복제수는 숙주 세포의 게놈 내의 단일 복제 내인성 유전자에 대한 제2 뉴클레오타이드 서열의 풍부도를 측정하기 위해 디지털 액적 PCR을 사용하여 측정될 수 있음). 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현은 정량적 역전사 PCR(qPCT)에 의한 RNA 수준 또는 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학)에 의한 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 또한, 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 일부 단백질에 대해, 단백질의 활성(예를 들어, 효소 활성)이 평가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 전이유전자를 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) (1) NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 및 (2) 전이유전자(예를 들어, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자)를 포함하는 제2 핵산 서열을 갖는 숙주 세포의 제1 집단을 도입하는 단계; (b) 숙주 세포의 제1 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및 (c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 일부 실시형태에서, 전이유전자를 포함하는 숙주 세포의 생산 방법이 본원에 제공되며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 숙주 세포의 제1 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 숙주 세포의 제1 집단 내로 도입되었고, 제1 핵산 서열은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 전이유전자(제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자)를 포함함 -; (b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 더 적은 콜로니를 생산하고, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 100 내지 1,000배, 1,000배 내지 5,000배, 5,000 내지 10,000배, 1,000 내지 10,000배, 10,000 내지 15,000배, 5,000 내지 15,000배, 15,000 내지 25,000배, 10,000 내지 25,000배 더 적은 콜로니를 생산하고, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제3 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열의 복제수와 비교하여 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제3 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열의 복제수와 비교하여 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제3 핵산 서열 및/또는 제4 핵산 서열의 복제수와 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 500배, 또는 적어도 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열을 포함하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1,000배, 또는 5 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포의 제1 집단은 제3 핵산 서열 및 제4 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 500배, 또는 적어도 1,000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 제3 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제4 핵산 서열은 전이유전자를 포함한다. 복제수는 당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 복제수는 숙주 세포의 게놈 내의 단일 복제 내인성 유전자에 대한 전이유전자의 풍부도를 측정하기 위해 디지털 액적 PCR을 사용하여 측정될 수 있음). 전이유전자 서열의 발현은 정량적 역전사 PCR(qPCT)에 의한 RNA 수준 또는 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학)에 의한 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 또한, 전이유전자에 의해 인코딩된 일부 단백질에 대해, 단백질의 활성(예를 들어, 효소 활성)이 평가될 수 있다.
구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT는 섹션 7.1 또는 8에 기재되는 것이다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 하기 섹션 7.2에 기재된 것이다.
재조합 DNA 기법의 당업계에 일반적으로 알려진 방법이 일반적으로 소기의 재조합 클론을 선택하는 데 적용될 수 있으며, 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; 문헌[Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 문헌[Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)]; 문헌[Colberre-Garapin et al, 1981, J. Mol. Biol. 150: 1]에 기술되어 있고, 이들은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
숙주 세포는 본원에 기재된 둘 이상의 발현 벡터로 공동-형질감염될 수 있다. 2개의 벡터는 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA의 동일한 발현이 가능하도록 동일한 선택성 표지(예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT)를 함유할 수 있다. 숙주 세포는 상이한 양의 둘 이상의 발현 벡터로 공동 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 다음 비 중 임의의 하나의 제1 발현 벡터 및 제2 발현 벡터로 형질감염될 수 있다: 1 : 1, 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8, 1 :9, 1 : 10, 1 : 12, 1 : 15, 1 :20, 1 :25, 1 :30, 1 :35, 1 :40, 1 :45, 또는 1 :50.
대안적으로, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 및 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하고, 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 발현 벡터는 단일시스트론 또는 다중시스트론일 수 있다. 다중시스트론 핵산 작제물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상, 또는 2 내지 5개, 5 내지 10개, 또는 10 내지 20개 범위의 유전자/뉴클레오타이드 서열을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 이중시스트론 핵산 서열 작제물은 다음 순서로 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT), 및 제2 유전자(예를 들어, 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA)를 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 둘 모두의 유전자의 전사는 프로모터에 의해 유도될 수 있는 반면, 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡(cap)-의존적 스캐닝 메커니즘에 의할 수 있으며, 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 예를 들어 IRES에 의한 캡-무관 메커니즘에 의할 수 있다.
본원에 기재된 관심 단백질이 재조합 발현에 의해 생산되었다면, 이는 단백질의 정제를 위해 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후의 특이적 항원에 대한 친화도에 의해, 그리고 사이징 컬럼 크로마토그래피(sizing column chromatography)), 원심분리, 분별 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 또한, 관심 단백질은 당업계에 알려진 이종 폴리펩타이드 서열(예를 들어, Flag 태그 또는 His 태그)에 융합되어 정제를 용이하게 할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질(예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT, 또는 관심 단백질)은 단리 또는 정제된다. 일반적으로, 단리된 단백질은 단리된 단백질과 다른 단백질이 실질적으로 없는 것이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질의 조합물은 세포 물질 및/또는 화학 전구체가 실질적으로 없다. 표현 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 단리되거나, 재조합적으로 생산된 세포의 세포 성분으로부터 단백질이 분리된 본원에 기재된 단백질의 조합물을 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 본원에 기재된 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1%(건조 중량 기준) 미만의 이종 단백질(또는 "오염 단백질"로도 본원에서 지칭됨) 및/또는 단백질 변이체, 예를 들어 단백질의 상이한 번역후 변형 형태 또는 단백질의 다른 상이한 버전을 갖는 단백질 조합물을 포함한다. 단백질이 재조합적으로 생산될 때, 이는 또한 일반적으로 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 배양 배지는 단백질 조합물의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만의 부피를 나타낸다. 단백질이 화학 합성에 의해 생산될 때, 이는 일반적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 즉, 이는 단백질의 합성에 관여되는 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 이러한 단백질의 조합물은 관심 단백질 이외에 화학 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량 기준) 미만으로 갖는다. 구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질은 단리 또는 정제된다.
7.5
세포
또 다른 양태에서, 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 본원(예를 들어, 섹션 7.2 또는 섹션 8)에 기재된 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 본원(예를 들어, 섹션 7.1 또는 섹션 8)에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 포함한다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 본원(예를 들어, 섹션 7.1 또는 섹션 8)에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 발현한다.
본원(예를 들어, 섹션 7.4 또는 섹션 8)에 기재되거나, 당업자에게 알려진 임의의 숙주 세포는 본 개시내용을 고려하여 본원(예를 들어, 섹션 7.1 또는 섹션 8)에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT의 재조합 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 및 전이유전자가 세포 내로 도입될 때, 이러한 숙주 세포는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 및 전이유전자를 공동 발현하도록 배양되고, 제작될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포의 예에 대해서는 섹션 7.4 및 섹션 8을 참조한다.
특정 실시형태에서, 세포(예를 들어, 숙주 세포)는 시험관내 또는 생체외 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환되지 않은 세포로부터 단리된다. 숙주 세포는 본원에 기재되거나, 당업계에 알려진 임의의 유형의 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 세균 또는 진핵 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 효모, 곤충, 포유동물, 또는 식물 세포이다. 숙주 세포가 세균 세포인 실시형태에서, 세포는 대장균 세포이다. 예시적인 대장균 세포는 예를 들어 대장균 TG1 또는 BL21 세포일 수 있지만, 이로 한정되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 인간 세포주로부터의 것이다. 적합한 포유동물 세포는 예를 들어 CHO 및 HEK239 세포, 및 이의 변이체(예를 들어, CHO-DG44 또는 CHO-K1 세포)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 불멸화 세포주이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 HEK293, CHO, PER.C6, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포이다.
구체적 실시형태에서, 숙주 세포는 예를 들어 그리고 비제한적으로 섬유아세포 또는 혈액 세포(예를 들어, B 세포 또는 T 세포)와 같은 1차 세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 배아 줄기세포이다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 식물 세포이다.
배양된 불멸화 세포는 세포 내로 도입된 핵산이 숙주 세포 게놈 내로 통합되는지 여부에 따라 단기간(일시적으로) 또는 장기간(안정한) 발현을 위해 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산으로 형질감염될 수 있다. 일시적 DNA 발현은 전형적으로는 24시간 내지 72시간 동안 지속되는 반면, 안정한 DNA 발현은 잠재적으로 단백질이 영구적으로 과발현되도록 한다.
특정 실시형태에 따르면, 재조합 발현 벡터는 종래의 방법, 예컨대 화학적 형질감염, 열 충격, 또는 전기천공에 의해 숙주 세포 내로 도입되어 재조합 핵산 서열이 효과적으로 발현되도록 한다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 세포(예를 들어, 숙주 세포)의 게놈 내로 안정하게 통합된다. 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 세포(예를 들어, 숙주 세포)의 게놈 내로 랜덤하게 통합될 수 있다. 대안적으로, 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 특정 위치에서 세포(예를 들어, 숙주 세포)의 게놈 내로 통합될 수 있다. 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 다수의 복제물이 세포(예를 들어, 숙주 세포)의 게놈 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 이의 게놈 내로 통합된 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 5, 10, 15, 20, 25개 이상의 복제물을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 본원(예를 들어, 섹션 7.2)에 기재된 것이다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이며, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로 전이유전자는 형질감염, 형질도입, 감염, 미세주입, 또는 염색체 이식에 의해 세포 내로 도입된다.
일부 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 본원(예를 들어, 섹션 7.2)에 기재된 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩한다.
구체적 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제1 핵산을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 500배, 또는 적어도 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제1 핵산을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 2 내지 20배, 2 내지 100배, 2 내지 500배, 2 내지 1000배, 50 내지 100배, 50 내지 500배, 50 내지 1000배, 또는 500 내지 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제1 핵산을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제1 핵산을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1,000배, 또는 5 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제1 핵산을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준과 비교하여 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 500배, 또는 적어도 1,000배 더 높은 발현 수준의 제2 뉴클레오타이드 서열을 획득하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 관심 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 제1 핵산을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 복제수는 당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 복제수는 숙주 세포의 게놈 내의 단일 복제 내인성 유전자에 대한 제2 뉴클레오타이드 서열의 풍부도를 측정하기 위해 디지털 액적 PCR을 사용하여 측정될 수 있음). 제2 뉴클레오타이드 서열의 발현은 정량적 역전사 PCR(qPCT)에 의한 RNA 수준 또는 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학)에 의한 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 또한, 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 일부 단백질에 대해, 단백질의 활성(예를 들어, 효소 활성)이 평가될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 또는 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 500배, 또는 적어도 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포의 제2 집단에 의해 획득된 제2 핵산 서열의 복제수와 비교하여 2 내지 20배, 2 내지 100배, 2 내지 500배, 2 내지 1000배, 50 내지 100배, 50 내지 500배, 50 내지 1000배, 또는 500 내지 1000배 더 높은 복제수의 제1 핵산 서열을 포함하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 5 내지 25배, 10 내지 25배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1,000배, 또는 5 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포의 제1 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 제2 집단에 의해 획득된 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 500배, 또는 적어도 1,000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 획득하며, 세포의 제1 집단은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하고, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함한다. 복제수는 당업계에 알려진 임의의 기법을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 복제수는 숙주 세포의 게놈 내의 단일 복제 내인성 유전자에 대한 전이유전자의 풍부도를 측정하기 위해 디지털 액적 PCR을 사용하여 측정될 수 있음). 전이유전자 서열의 발현은 정량적 역전사 PCR(qPCT)에 의한 RNA 수준 또는 면역검정(예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 면역세포화학)에 의한 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 또한, 전이유전자에 의해 인코딩된 일부 단백질에 대해, 단백질의 활성(예를 들어, 효소 활성)이 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전이유전자는 본원(예를 들어, 섹션 7.2)에 기재된 것이다. 일부 실시형태에서, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT는 본원(예를 들어, 섹션 7.1 또는 8)에 기재된 것이다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 바이러스 세포 생산자 세포주이다. 바이러스 생산자 세포주는 캡시드 단백질 또는 다른 표면 단백질(예를 들어, 외피 단백질), 복제에 필요한 단백질, 또는 둘 모두를 발현할 수 있다. 적합한 바이러스 생산자 세포주는 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 바큘러바이러스일 수 있다. 바이러스 생산자 세포주는 예를 들어 유전자 요법 또는 백신 요법을 위해 바이러스를 생산하는 데 사용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산자 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열 - 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질 또는 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 둘 모두를 포함함 -.
일부 실시형태에서, 바이러스 생산자 세포주는 서열 번호 20, 32, 33, 34, 36, 또는 37 중 임의의 하나의 NPT 돌연변이 핵산 서열을 포함한다.
본원에 제공된 바이러스 생산자 세포주의 특정 실시형태에서, 인코딩된 하나 이상의 바이러스 단백질은 예를 들어 AAV 캡시드 단백질, AAV rep 단백질, 아데노바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 E1 영역 단백질, 레트로바이러스 외피 단백질, 레트로바이러스 gag 단백질, 또는 레트로바이러스 역전사 효소, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질, gag 단백질, 및 역전사 효소일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 항원 생산 세포주가 본원에 제공되며, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다: (i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -: (1) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -; (2) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -; (3) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -; (4) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -; (5) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는 (6) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및 (ii) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열.
일부 실시형태에서, 항원 생산 세포주는 서열 번호 20, 32, 33, 34, 36, 또는 37 중 임의의 하나의 NPT 돌연변이 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원 생산 세포주는 바이러스 항원, 세균 항원, 또는 진균 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항원 생산 세포주는 암 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 비-자연 발생 NPT를 발현하는 시험관내 또는 생체외 세포가 본원에 제공되며, 비-자연 발생 NPT는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 비해 약화되고, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38, 39, 40, 41, 42, 및 43 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
숙주 세포가 본원에 제공된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포인 특정 실시형태에서, 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다.
숙주 세포가 본원에 제공된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염된 포유동물 세포인 특정 실시형태에서, 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA는 본원(예를 들어, 섹션 7.2)에 기재된 것이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 본원(예를 들어, 섹션 7.4 또는 섹션 8)에 기재된 방법에 의해 생산된다.
7.6
사용 방법
구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT, 또는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 당업자가 야생형 NPT를 사용할 임의의 방식으로 사용된다. 구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT, 또는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 선택성 표지가 당업자에 의해 사용될 임의의 방식으로 사용된다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT, 또는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 바와 같이 사용된다.
구체적 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)이 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 외인성 서열(들)을 포함하는 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 숙주 세포)를 선택하는 데 사용되며, 숙주 세포는 염색체 내로 안정하게 통합된 외인성 서열(들)을 갖는다. 형질감염, 형질도입, 감염, 미세주입, 또는 염색체 이식이 핵산 서열을 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 이 방법론은 관심 단백질을 발현하거나, 삽입 돌연변이 유발에 의해(예를 들어, 동종 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 또는 트랜스포존 삽입에 의해) 유전자를 방해하는 데 사용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 안정한 에피좀(EBNA1 OriP 서열을 함유하고, EBNA1 및 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 발현하는 것들과 같이 복제하는 비-통합 플라스미드)을 높은 수로 보유하는 숙주 세포는 예를 들어 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418을 사용하여 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 높은 복제수는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT 대신에 사용될 때 획득되는 것보다 5 내지 10배, 5 내지 15배, 2 내지 5배, 2 내지 10배, 2 내지 15배, 또는 10 내지 20배, 10 내지 50배, 10 내지 100배, 50 내지 100배, 50 내지 200배, 50 내지 500배, 100 내지 500배, 100 내지 1000배, 500 내지 1000배, 또는 2 내지 1000배 더 높다.
구체적 실시형태에서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)에 의한 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 단기간 배양은 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT뿐만 아니라 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 다른 공동 형질감염된 핵산 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 발현하는 작제물을 수용하였던 세포를 농축하는 데 사용될 수 있으며, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 발현하는 작제물은 통합되지 않는다. 예를 들어, 일부 세포는 형질감염하기 어려우며, NPT 유전자를 수용 및 발현하였던 세포를 농축하는 것은 또한 공동 형질감염된 크리스퍼 작제물을 수용하였던 세포를 농축할 수 있으며, 따라서 소기의 변형(예를 들어, 유전자 녹아웃)을 갖는 세포를 식별하기 위한 스크리닝 필요성을 감소시킨다.
구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포는 예를 들어 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체를 사용하여 유전자 증폭을 겪었던 이들 숙주 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, DHFR의 억제제가 이러한 방식으로 사용되어 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포)에서 통합된 전이유전자를 함유하는 염색체 영역을 "증폭"할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 햄스터 하이브리드의 생성에서와 같은 염색체 이식 또는 세포 융합에 의한 세포들 사이의 염색체의 이식에 의해 세포주를 생성할 때 선택 유전자로서 사용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 배아 줄기세포는 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 엔지니어링되고, npt 유전자가 배아 줄기세포에서 상동 재조합 동안 염색체 내로 도입되며(이종 삽입 생성), 더 높은 농도의 G418이 비분리에 의해 유전된 2개의 녹아웃 염색체를 갖는 희소 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 이는 먼저 세포를 마우스 내로 도입해야 하며 마우스를 번식하여 동형접합체를 생성하는 것 없이 시험관내 또는 생체내에서의 세포의 특성 규명에 의한 녹아웃 표현형의 일부 분석을 허용할 것이다.
구체적 실시형태에서, 숙주 세포 내의 고도의 활성 유전자 프로모터는 스플라이스 수용체의 하류에 위치한 프로모터 없는 NPT 돌연변이 뉴클레오타이드 유전자 또는 비-자연 발생 NPT 유전자로 엔지니어링된 트랜스포존을 사용하는 게놈 전체 스크리닝에 의해 식별될 수 있다. NPT 발현을 활성화시키는 매우 활성의 프로모터를 갖는 유전자 내로 삽입하는 트랜스포존은 적절한 수준의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)을 사용하여 선택될 수 있다. 관련 유전자 및 프로모터의 정체는 이후 생존 세포 내의 트랜스포존 삽입 부위를 특성 규명함으로써 식별될 수 있다.
구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 하나 이상의 공유 연결된 추가의 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포(예를 들어, 세균)는 세포를 적절한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질(예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체)과 함께 배양함으로써 선택될 수 있다. NPT 유전자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 클로닝 벡터, 바이러스, 또는 숙주 세포 내의 게놈 삽입에서 존재할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 세균 내에서 오직 발현하는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드가 예를 들어 렌티바이러스 또는 AAV를 포함하는 유전자 요법 생산물을 작성하는 데 사용될 수 있다. NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT의 고도로 약화된 성질은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 임의의 이상 패키징(aberrant packaging)을 생성하며, 유전자가 훨씬 덜 활성이기 때문에 환자에게 훨씬 더 안전하게 전달되도록 한다.
구체적 실시형태에서, DNA의 연쇄체(concatamer)가 예컨대 관심 유전자 및 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 선형 단편을 세균 복제 기점을 갖는 단편에 리게이션하고, 숙주 세포를 형질전환하고, 함께 리게이션된 유전자의 다수의 복제물을 갖는 생존 세포를 예를 들어 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418, 또는 이의 유도체를 사용하여 선택하여 작성될 수 있다. 이는 포유동물 숙주 세포에 전달될 수 있는 유전자의 헤드-투-테일 어레이(head-to-tail array)를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 숙주 염색체 내로의 더 높은 빈도의 멀티-카피 삽입을 수득할 수 있다.
구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 G418 및 다른 NPT 기질이 세포(예를 들어, 효모, 세균, 곤충 세포, 동물 세포, 식물, 및 이들 유기체의 임의의 병원체)에 독성인 임의의 곳에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 섹션 8에 기재되는 바와 같이 사용된다.
7.7
키트
또 다른 양태에서, 키트가 본원에 제공된다. 일 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열을 용기 내에 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 용기 내에 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 cDNA 또는 게놈 라이브러리 또는 개별적 클론을 용기 내에 포함한다. 일부 실시형태에서, NPT 돌연변이 핵산 서열은 섹션 7.2 또는 섹션 8에 기재되는 것이다. 특정의 구체적 실시형태에서, NPT 돌연변이 핵산 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 32, 서열 번호33, 서열 번호34, 서열 번호36, 및 서열 번호 37로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 키트는 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 유도체를 용기 내에 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 키트는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 도입될 수 있는 세포(예를 들어, 숙주 세포)를 용기 내에 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 도입되었던 세포(예를 들어, 숙주 세포)를 용기 내에 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 핵산 서열을 포함하는 벡터를 용기 내에 포함하는 키트가 본원에 제공되며, 핵산 서열은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 코스미드, 또는 세균 인공 염색체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열을 함유하는 게놈 서열, cDNA 서열, 게놈 라이브러리, 또는 개별적 클론을 용기 내에 포함하는 키트가 본원에 제공되며, 핵산 서열은 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 유도체를 용기 내에 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는, 본원에 기재된 NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT의 단편을 인코딩하는 살아있는 세포에서 증식되는 않은 합성 DNA 단편 또는 단편들을 용기 내에 포함한다. NPT 돌연변이 또는 비-자연 발생 NPT의 둘 이상의 상보적 단편이 벡터 내의 별도의 부분에 존재할 수 있으며, NPT 돌연변이 유전자 또는 비-자연 발생 NPT는 숙주 세포 내로 도입될 때 별도의 부분으로부터 재구성된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 숙주 세포를 용기 내에 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
8.
실시예
8.1
실시예 1: 감소된 활성을 갖는 NPT 돌연변이 식별
이 실시예는 NPT 돌연변이를 어떻게 제작하고, 포스포트랜스퍼라제 활성의 감소에 대해 스크리닝하는 가를 설명한다.
플라스미드 발현 벡터의 작제
플라스미드 벡터 P313을 작제하였다(도 1, 서열 번호 2). 이는 인간 연장 인자 알파 프로모터 및 제1 인트론(서열 번호 3), mCherry 코딩 영역(서열 번호 4), 및 SV40 폴리아데닐화 신호(서열 번호 5)를 포함하는 mCherry 형광 단백질 발현 카세트를 인코딩한다. P313은 포유동물 세포에서의 발현을 위한 마우스 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(서열 번호 7) 및 세균에서의 발현을 위한 대장균 라크지아(E. coli laczya) 프로모터(서열 번호 8)에 의해 유도된 트랜스포존 Tn5(아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제3'-IIa)(서열 번호 1: 서열 번호 6을 포함하는 뉴클레오타이드 서열)로부터 유래된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT) 단백질을 인코딩한다. NPT 전사는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 폴리아데닐화 신호(서열 번호 9)에 의해 포유동물 세포에서 종결된다. 플라스미드는 또한 암피실린 내성 유전자(서열 번호 10) 및 pUC57 플라스미드 복제 기점(서열 번호 11)을 인코딩한다.
NPT 개방형 해독틀 중 일부를 유전자 합성에 의해 생성된 DNA 단편으로 대체함으로써 NPT 유전자에서 돌연변이를 함유하는 플라스미드를 작성하였다(Integrated DNA Technologies, 미국 아이오와주 코랄빌 소재). 플라스미드 P313을 고유한 부위(Bsp E1, Tth111 I, Rsr II, 및 Avr II 포함)를 갖는 제한 엔도뉴클레아제의 적절한 쌍으로 소화시켜서 수용체 벡터를 작성하였다. 클로닝 혼합물은 5 μl의 2x HiFi 클로닝 혼합물, 50 ng의 합성 DNA, 및 509 ng의 소화된 벡터를 함유하였다. 혼합물을 50℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 4℃로 냉각시켰다. 2 μl를 Top10 수용성 세포(Invitrogen) 또는 Stellar 수용성 세포(Clontech) 내로 형질전환하고, LB-카르베니실린 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 5 ml의 LB-카르베니실린 배양 내로 접종시키고, 37℃에서 진탕 인큐베이터 내에서 밤새 성장시켰다. DNA를 Qiagen spin miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다(GENEWIZ, 미국 뉴저지주 플레인필드 소재). NPT 활성을 하기 기재되는 25 μg/mL(KAN25), 50 μg/mL(KAN50), 75 μg/mL(KAN75), 및 100 μg/mL(KAN100)의 농도로 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 스크리닝하였다.
세균에서의 NPT 돌연변이 스크리닝
LB-카르베니실린 내에서 밤새 성장한 배양물을 PBS로 연속 희석하고, LB-카르베니실린, LB-KAN25, 및 LB-KAN100 플레이트 상에 플레이팅하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 콜로니를 계수하고, 37℃에서 추가의 24시간 동안 인큐베이션되도록 하고, 재계수하였다. 플라스미드(여기서, 콜로니 수는 KAN25 및 카르베니실린 플레이트에 비해 KAN100 상에서 유의하게 감소하되, 부재하지는 않음)를 카르베니실린, KAN25, KAN50, KAN75, 및 KAN100 상에 재플레이팅하고, 상기와 같이 인큐베이션하고, 계수하였다. 48시간의 인큐베이션으로부터 수득된 콜로니 수를 표 1에서 보여준다.
[표 1]
결과
2개의 단일 부위 지점 돌연변이는 이 검정에서 완전히 활성이 손실되었다(G205E 및 D208G). 나머지 8개의 돌연변이 중 오직 2개만이 이 검정에서 감소된 활성을 나타냈다. 돌연변이 R211G는 또한 KAN100 플레이트 상에서 훨씬 더 느리게 성장했지만, 총 콜로니 수는 더 낮은 KAN 농도 상에서의 성장과 유사하였다. D261N은 KAN100 플레이트 상에서 성장할 수 없었고, 다른 KAN 플레이트 상에서의 다수의 콜로니의 약 절반만을 생산하였다. 본 발명자들의 검정에서 완전한 활성을 나타냈던 4개의 돌연변이(G210A, Y218S, Y218F, 및 V36M)는 카나마이신에 대해 감소된 내성을 부여하는 것으로 이전에 보고되었다(문헌[Blazquez (1991) Mol. Microbiol. 5:1511-1518]; 문헌[Kocabiyik (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 185: 925-931]; 문헌[Kocabiyik (1992) FEMS Microbiol Lett 93: 199-202]). 이들 NPT 돌연변이는 높은 복제 플라스미드 및/또는 더 강한 세균 프로모터의 사용을 통해 이전의 연구에서보다 더 높은 수준으로 발현하는 것이 가능하다.
D261N을 갖는 이중 돌연변이는 훨씬 더 낮은 활성을 갖는 것들을 식별하기 위해 작제하였다. 4개의 D261N 이중 돌연변이는 완전히 결핍되고, 하나(E182D; D261N)는 극심하게 결핍되었다(카르베니실린 플레이트에 비해 KAN25 상에서의 2%의 콜로니 및 다른 카나마이신 농도에서는 성장 없음). 2개의 클론은 오직 KAN25 플레이트 상에서 콜로니를 생산하였지만, 콜로니 수는 카르베니실린 플레이트 상의 것들과 유사하였다(즉, 클론 N(D216G; D261N) 및 클론 O(D227G; D261N)). 하나의 돌연변이는 D261N 돌연변이를 부분적으로 보완하여, 카르베니실린 플레이트 상에서의 성장에 비해 감소된 효율이기는 하지만 KAN100 플레이트 상에서 성장하도록 하는 것으로 나타났다(클론 K(H188L, D261N)).
4개의 클론(S, T, U, 및 V)은 독립적으로는 상기 완전한 활성을 갖되, 감소된 활성을 갖는 것으로 이전에 보고되었던 2개의 돌연변이를 조합하였다(문헌[Blazquez (1991) Mol. Microbiol. 5:1511-1518]; 문헌[Kocabiyik (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 185: 925-931]; 문헌[Kocabiyik (1992) FEMS Microbiol Lett 93: 199-202]). 2개의 추가의 클론은 V36M을 상기 시험되지 않은 돌연변이와 조합하였다. 돌연변이 H188S는 보고에 따르면 카나마이신에 대한 내성을 감소시켰던 한편(문헌[Blazquez (1991) Mol. Microbiol. 5:1511-1518]), 돌연번이 E182D는 G418에 대한 내성은 감소시키지만, 카나마이신에 대해서는 그렇지 않은 것으로 보고되었다(문헌[Yenofsky (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3435-3439]). V36M; H188S 돌연변이를 함유하는 클론은 완전히 결핍되었다. 3개의 클론은 오직 KAN25 플레이트 상에서 성장할 능력을 유지하였던 한편, 2개의 나머지 클론은 오직 KAN100 플레이트 상에서의 성장 결핍을 나타냈다(클론 U(V36M; Y218F) 및 W(V36M 및 E182D)에 대해 각각 1개 및 0개의 콜로니). 이들 결과는 개별적으로 NPT 활성에 대한 약한 영향을 갖거나, 영향을 갖지 않는 특정 돌연변이를 조합하는 것이 놀랍게도 수많은 적용에 적합한 활성을 갖는 이중 돌연변이 NPT를 생산함을 입증한다.
8.2
실시예 2: HEK293 세포에서의 선택 표지로서의 돌연변이 NPT 단백질
약화된 NPT 유전자 카세트를 함유하는 플라스미드가 여전히 인간 세포에서의 G418에 대한 내성을 부여할 수 있음을 입증하기 위해, 상기 작제된 몇몇의 플라스미드를 HEK293 세포 내로 형질감염시키고, 콜로니 형성 검정에 적용하였다. DNA를, Qiagen의 HiSpeed maxiprep 키트를 사용하여 제조업체의 설명에 따라 카르베니실린을 함유하는 200 ml의 LB-배양물로부터 정제하였다.
형질감염을 위해, 2E7 HEK293 세포를 40 ml의 성장 배지(DMEM+ 10% FBS+ 1xPenStrep) 중의 8개의 T-75 플라스크 내로 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 형질감염물을 15 ml의 Corning 튜브 내로 조합하고, 이는 22 μg의 DNA+ 37℃에서의 3 ml의 OptiMEM + 66 μl Fugene-6 형질감염 시약을 함유하였다. 형질감염 혼합물을 간단하게 볼텍싱하고, 37℃ CO2 인큐베이터 내에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 성장 배지(2 ml)를 첨가하고, 전체 혼합물을 앞서 플레이팅된 HEK293 세포의 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 37℃에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 모든 플라스크는 선홍색 형광을 갖는 세포를 가졌다. 플라스크를 10 ml의 PBS와 1 ml의 TryPLE로 세정하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 10 ml의 성장 배지로 플라스크로부터 세정하고, 이후 25 ml의 배지 중의 T150 플라스크 내로 재플레이팅하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 이어서 이전과 같이 성장 표면으로부터 회수하고, 세포 밀도를 Countess 세포 계수기를 사용한 복제 판독을 사용하여 결정하였다. 연속 희석을 50 ml의 선택성 성장 배지(DMEM+ 10% FBS+ 1xPenStrep+ 500 μg/ml 게네티신) 중의 Nuclon Delta Surface를 갖는 복제 150 mm 플레이트 내로 플레이팅하였다. 플레이트를 18일 동안 인큐베이션하고, 플라스미드 P313, C 및 S의 형질감염을 갖는 플레이트를 염색하고, 사진을 찍었다. 다른 형질감염물로부터의 플레이트를 또 다른 13일 동안 인큐베이션한 후, 염색하고, 사진을 찍었다. 염색을 위해, 배지를 피펫팅에 의해 천천히 제거하였다. 세포를 10 ml의 염색 용액(50%의 메탄올 중의 0.4%의 메틸렌 블루)으로 덮고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 염색 용액을 피펫팅에 의해 제거하고, 세포를 5 ml의 100% 메탄올로 세정하고, 공기 건조하였다. 플레이트를 Bio-Rad 이미징 스테이션을 사용하여 사진을 찍었다.
결과
콜로니 형성 검정으로부터의 결과는 표 2에 제시되어 있다. 4개의 돌연변이 작제물은 야생형 NPT 유전자를 갖는 작제물 P313에 대해 측정된 빈도의 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 G418 내성 콜로니를 생산하였다.
이 검정에서, 콜로니 형성 빈도는 NPT 단백질 활성의 간접적 척도이다. 형질감염된 세포의 집단에서의 다른 세포와 비교하여 돌연변이 NPT를 더 많이 발현하는 세포는 발현 카세트의 더 높은 멀티-카피 통합으로 인해 그리고/또는 카세트의 통합의 더 유리한 게놈 위치로 인해 G418의 존재 하에 성장할 때 콜로니를 형성하도록 생존할 수 있다. 이 실시예의 결과는 선택 표지로서 감소된 활성을 갖는 NPT 돌연변이의 사용이 안정하게 통합된 높은 전이유전자 발현 세포에 대한 다중 콜로니를 스크린해야 하는 시간 및 노력을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
세균에서 가장 약화된 표현형을 갖는 돌연변이 작제물 중 3개는 플레이팅된 1E7 세포로부터 G418 내성 콜로니를 생산하는 데 실패하였다. 이들 돌연변이 단백질은 포유동물 세포에서 완전히 불활성일 수 있지만, 유의하게 높은 수준을 발현하는 세포는 선택에서 또한 생존할 수 있다. 이러한 표지는 레트로바이러스 감염 또는 전위와 같은 높은 복제수의 통합을 생성하는 데 더 효율적인 방법과 조합하여 유용할 수 있다.
[표 2]
8.3
실시예 3: 트랜스포사제에 의한 전이유전자의 도입
이 실시예는 트랜스포사제 활성을 사용하여 mCherry 및 NPT 발현 카세트의 인간 세포 내로의 통합을 입증한다. 본원에 기재된 NPT 돌연변이를 이 실시예에서 사용한다.
도 2에 도시된 형태를 갖는 3개의 상이한 작제물을 생산하였다. 작제물은 이들이 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 돌연변이 1(P725) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(V36M; G210A), 또는 돌연변이 2(P726) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(E182D; D261N)를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하였던 점에서 서로 상이하였다. 작제물을 Leap-In 트랜스포사제 RNA(ATUM Design, 미국 캘리포니아주 뉴어크 소재)를 갖거나, 갖지 않은 인간 VPC 세포(HEK293 변이체) 내로 전기천공하였다. 세포를 150 mm의 플레이트 상에 플레이팅하고, 네오마이신 선택 하에 2주 동안 배양하였다. 세포를 이어서 염색하고, 콜로니 형성을 측정하였다. 염색되지 않은 상이한 플레이트로부터의 8개 내지 12개의 콜로니를 선택하고, mCherry 복제수를 내인성 글루카민 합성효소 유전자 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 대해 측정하였다.
결과
콜로니 형성으로부터 결과는 도 3에서 보여주며, 이는 NPT 돌연변이가 전위에 의해서가 아니라 발현 작제물의 랜덤 통합에 의해 콜로니 형성의 효율을 극적으로 감소시켰음을 나타낸다. 도 4는 트랜스포사제로 작성된 세포의 안정한 풀의 사진이며, 여기서, mCherry 발현에 의해 생산된 색상은 색상이 없는 형질전환되지 않은 세포와 비교할 때 정상적 백색 광 발광으로 분명하게 명백하다.
선택된 클론에서 mCherry 복제수의 측정으로부터의 결과는 도 5에서 보여준다. 결과는 NPT 돌연변이 함유 세포가 야생형 NPT를 갖는 것들에 비해 연결된 mCherry 전이유전자의 더 높은 평균 복제수를 일관되게 가짐을 입증한다. 야생형 NPT 유전자를 갖는 작제물의 랜덤 통합에 의해 생성된 대부분의 클론은 존재하는 경우 형광을 거의 갖지 않았던 한편, 2개의 돌연변이 NPT 유전자의 랜덤 통합에 의해 유래된 대부분의 클론은 형광성이었다. 이는 돌연변이 NPT 유전자가 증가된 복제수를 통해 또는 유리한 게놈 위치에서의 통합을 통해서든 G418 선택 동안 생존을 위해 야생형 NPT 유전자보다 더 높은 수준으로 발현하여야 함을 의미하는 것으로 해석될 수 있으며, 이는 mCherry 전이유전자의 발현을 증가시켰다.
전이유전자의 전위에 의한 숙주 염색체 내로의 효소적 통합은 랜덤 통합보다 훨씬 더 효율적이었으며, 심지어 야생형 NPT 유전자를 사용해도 평균 복제 수가 더 높았다. 돌연변이 NPT 유전자는 또한 야생형 NPT 유전자의 사용에 비해 복제수를 증가시키며, 이는 유전자 전달 또는 전위가 큰 작제물의 경우와 같이 비효율적인 경우에 이점을 제공할 것이다.
9.
실시형태
본 발명은 다음 비제한적인 실시형태를 제공한다.
일 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
A1.
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)로서, 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT):
(a)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(b)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(c)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(d)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(e)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(f)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
A2.
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)로서, 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT):
(a)
서열 번호 1의 위치 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(b)
서열 번호 1의 위치 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(c)
서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(d)
서열 번호 1의 위치 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(e)
서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(f)
서열 번호 1의 위치 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
A3.
실시형태 A1에 있어서, 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A4.
실시형태 A1 또는 실시형태 A3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A5.
실시형태 A1 또는 실시형태 A3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A6.
실시형태 A2에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A7.
실시형태 A1, A3, A4, 또는 A5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A8.
실시형태 A7에서, 세균 세포는 대장균인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A9.
실시형태 A1, A3, A4, 또는 A5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A10.
실시형태 A9에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A11.
실시형태 A1, 실시형태 A3, 실시형태 A4, 또는 실시형태 A5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산되는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A12.
실시형태 A2에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A13.
실시형태 A12에서, 세균 세포는 대장균인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A14.
실시형태 A2에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A15.
실시형태 A14에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A16.
실시형태 A2에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산되며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A17.
실시형태 A1, A3, A4, A5, 또는 A7 내지 A11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A18.
실시형태 A1, A3, A4, A5, 또는 A7 내지 A11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A19.
실시형태 A1, A3, A4, A5, 또는 A7 내지 A11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A20.
실시형태 A1, A3, A4, A5, 또는 A7 내지 A11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A21.
실시형태 A1, A3, A4, A5, 또는 A7 내지 A11 중 어느 하나에 있어서 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A22.
실시형태 A1, A3, A4, A5, 또는 A7 내지 A11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A23.
실시형태 A2 또는 실시형태 A12 내지 실시형태 A16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A24.
실시형태 A2 또는 실시형태 A12 내지 실시형태 A16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A25.
실시형태 A2 또는 실시형태 A12 내지 실시형태 A16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A26.
실시형태 A2 또는 실시형태 A12 내지 실시형태 A16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A27.
실시형태 A2 또는 실시형태 A12 내지 실시형태 A16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A28.
실시형태 A2 또는 실시형태 A12 내지 실시형태 A16 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
A29.
실시형태 A1 내지 실시형태 A28 중 어느 하나의 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열.
A30.
실시형태 A29에 있어서, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 핵산 서열.
A31.
실시형태 A30에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 단백질을 인코딩하며, 제2 단백질은 치료적 단백질인, 핵산 서열.
A32.
실시형태 A29 내지 실시형태 A31 중 어느 하나에 있어서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 37의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 서열.
A33.
실시형태 A29 내지 실시형태 A32 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
A34.
실시형태 A1 내지 실시형태 A28 중 어느 하나의 비-자연 발생 NPT를 포함하는 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
A35.
실시형태 A29 내지 실시형태 A32 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
A36.
실시형태 A35에 있어서, 핵산 서열은 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
A37.
실시형태 A33의 벡터를 포함하는 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
A38.
실시형태 A34 내지 실시형태 A37 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 세균, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 식물 세포인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
A39.
실시형태 A34 내지 실시형태 A37 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포주인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
제2 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
B1.
비-자연 발생 NPT를 발현하는 시험관내 또는 생체외 숙주 세포로서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 비해 약화되며, 비-자연 발생 NPT는 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포:
(a)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(b)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(c)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(d)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(e)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(f)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
B2.
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT를 발현하는 시험관내 또는 생체외 숙주 세포로서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 비해 약화되며, 비-자연 발생 NPT는 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포:
(a)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(b)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(c)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(d)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(e)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(f)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -.
B3.
실시형태 B1에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B4.
실시형태 B1에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B5.
실시형태 B2에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B6.
실시형태 B1, B3, 또는 B4에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B7.
실시형태 B6에서, 세균 세포는 대장균인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B8.
실시형태 B1, B3, 또는 B4에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B9.
실시형태 B8에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B10.
실시형태 B1, B3, 또는 B4에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산되는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B11.
실시형태 B2 또는 실시형태 B5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B12.
실시형태 B11에서, 세균 세포는 대장균인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B13.
실시형태 B2 또는 실시형태 B5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B14.
실시형태 B13에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B15.
실시형태 B2 또는 실시형태 B5에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산되며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B16.
실시형태 B1, B3, B4, 또는 B6 내지 B10 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B17.
실시형태 B1, B3, B4, 또는 B6 내지 B10 중 어느 하나에 있어서,비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B18.
실시형태 B1, B3, B4, 또는 B6 내지 B10 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B19.
실시형태 B1, B3, B4, 또는 B6 내지 B10 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B20.
실시형태 B1, B3, B4, 또는 B6 내지 B10 중 어느 하나에 있어서 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B21.
실시형태 B1, B3, B4, 또는 B6 내지 B10 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B22.
실시형태 B2, B5, 또는 B11 내지 B15 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B23.
실시형태 B2, B5, 또는 B11 내지 B15 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B24.
실시형태 B2, B5, 또는 B11 내지 B15 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B25.
실시형태 B2, B5, 또는 B11 내지 B15 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B26.
실시형태 B2, B5, 또는 B11 내지 B15 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B27.
실시형태 B2, B5, 또는 B11 내지 B15 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B28.
실시형태 B1 내지 B27 중 어느 하나에 있어서, 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B29.
실시형태 B28에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 단백질을 인코딩하며, 제2 단백질은 치료적 단백질인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B30.
실시형태 B28에 있어서, 제2 핵산 서열은 비-코딩 RNA를 인코딩하며, 비-코딩 RNA는 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
B31.
실시형태 B1 내지 실시형태 B30 중 어느 하나에 있어서, 세균, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 식물 세포인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
제3 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
C1.
전이유전자가 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법으로서,
a)
하기 (i) 및 (ii)를 갖는 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및
(ii) 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열,
- 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
b)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 세포를 핵산 서열이 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 선택하는 단계를 포함하는, 세포의 선택 방법.
C2.
전이유전자가 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법으로서,
a)
하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및
(ii) 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열,
- 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
b)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 세포를 핵산 서열이 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 선택하는 단계를 포함하는, 세포의 선택 방법.
C3.
실시형태 C1에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 세포의 선택 방법.
C4.
실시형태 C1 또는 실시형태 C3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C5.
실시형태 C1에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C6.
실시형태 C2에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 세포의 선택 방법.
C7.
실시형태 C1, C3, C4, 또는 C5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 세포의 선택 방법.
C8.
실시형태 C7에 있어서, 세균 세포는 대장균인, 세포의 선택 방법.
C9.
실시형태 C1, C3, C4, 또는 C5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 세포의 선택 방법.
C10.
실시형태 C9에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 세포의 선택 방법.
C11.
실시형태 C1, C3, C4, 또는 C5에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산되는, 세포의 선택 방법.
C12.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 세포의 선택 방법.
C13.
실시형태 C12에 있어서, 세균 세포는 대장균인, 세포의 선택 방법.
C14.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C15.
실시형태 C14에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 세포의 선택 방법.
C16.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산되며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C17.
실시형태 C1, C3, C4, C5, 또는 C7 내지 C11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 세포의 선택 방법.
C18.
실시형태 C1, C3, C4, C5, 또는 C7 내지 C11 중 어느 하나에 있어서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 세포의 선택 방법.
C19.
실시형태 C1, C3, C4, C5, 또는 C7 내지 C11 중 어느 하나에 있어서 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 세포의 선택 방법.
C20.
실시형태 C1, C3, C4, C5, 또는 C7 내지 C11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 세포의 선택 방법.
C21.
실시형태 C1, C3, C4, C5, 또는 C7 내지 C11 중 어느 하나에 있어서 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 세포의 선택 방법.
C22.
실시형태 C1, C3, C4, C5, 또는 C7 내지 C11 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 세포의 선택 방법.
C23.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C24.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C25.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C26.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C27.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C28.
실시형태 C2 또는 실시형태 C6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 세포의 선택 방법.
C29.
실시형태 C1 내지 실시형태 C28 중 어느 하나에 있어서,
(a)
선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 2배 내지 1000배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되고/되거나;
(b)
선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 10배 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 달성하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 전이유전자를 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되는, 세포의 선택 방법.
C30.
실시형태 C1 내지 실시형태 C29 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 세균, 효모, 포유동물, 또는 식물 세포인, 세포의 선택 방법.
C31.
실시형태 C1 내지 실시형태 C29 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포인, 세포의 선택 방법.
C32.
실시형태 C1 내지 실시형태 C31 중 어느 하나에 있어서, 핵산 서열은 선택된 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는, 세포의 선택 방법.
C33.
실시형태 C1 내지 실시형태 C32 중 어느 하나에 있어서, 선택된 세포는 전이유전자의 높은 복제수를 갖는, 세포의 선택 방법.
C34.
실시형태 C1 내지 실시형태 C33 중 어느 하나에 있어서, 선택된 세포는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는, 세포의 선택 방법.
C35.
실시형태 C1 내지 실시형태 C34 중 어느 하나에 있어서, 선택된 세포는 이들의 게놈 DNA 내로 통합된 전이유전자의 5개 내지 100개의 복제물을 갖는, 세포의 선택 방법.
C36.
실시형태 C1 내지 실시형태 C35 중 어느 하나에 있어서, 선택된 세포는 이들의 게놈 DNA 내로 통합된 전이유전자의 1개 내지 5개의 복제물을 갖는, 세포의 선택 방법.
C37.
실시형태 C1 내지 실시형태 C36 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자는 바이러스 유전자를 포함하는, 세포의 선택 방법.
C38.
실시형태 C1 내지 실시형태 C36 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자는 인간 성장 인자 유전자를 포함하는, 세포의 선택 방법.
C39.
실시형태 C1 내지 실시형태 C38 중 어느 하나에 있어서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418인, 세포의 선택 방법.
C40.
선택성 표지로서의 야생형 NPT와 비교하여 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법으로서,
a)
비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존을 숙주 세포 내로 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
b)
세포를 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시키는 단계를 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C41.
선택성 표지로서의 야생형 NPT와 비교하여 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법으로서,
a)
비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존을 숙주 세포 내로 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
b)
세포를 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시키는 단계를 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C42.
실시형태 C40에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C43.
실시형태 C40에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C44.
실시형태 C40, C42, 또는 C43에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C45.
실시형태 C40, C42, 또는 C43에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C46.
실시형태 C40, C42, 또는 C43에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C47.
실시형태 C40, C42, 또는 C43에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C48.
실시형태 C40, C42, 또는 C43에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C49.
실시형태 C40, C42, 또는 C43에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C50.
실시형태 C41에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C51.
실시형태 C41에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C52.
실시형태 C41에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C53.
실시형태 C41에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C54.
실시형태 C41에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C55.
실시형태 C41에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C56.
실시형태 C40 내지 실시형태 C55 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 세균, 효모, 포유동물, 또는 식물 세포인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C57.
실시형태 C40 내지 실시형태 C55 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C58.
실시형태 C40 내지 실시형태 C55 중 어느 하나에 있어서, 플라스미드 또는 트랜스포존은 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C59.
실시형태 C58에 있어서, 단백질은 바이러스 단백질인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C60.
실시형태 C58에 있어서, 단백질은 치료적 단백질인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C61.
실시형태 C40 내지 실시형태 C60 중 어느 하나에 있어서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C62.
실시형태 C1 내지 실시형태 C39 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자는 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C63.
실시형태 C62에 있어서, 전이유전자는 안티센스 RNA, miRNA, shRNA, 긴 비-코딩 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, tRNA, 또는 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 비-코딩 RNA를 인코딩하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
C64.
실시형태 C62에 있어서, 전이유전자는 단백질을 인코딩하며, 단백질은 치료적 단백질 또는 항원인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
제4 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
D1.
제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
a)
(i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -;
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -;
b)
숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및
c)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D2.
제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
a)
(i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 공동 도입하는 단계 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -;
(1)
서열 번호 1의 위치 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 위치 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 위치 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 위치 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -;
b)
숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및
c)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 생산 방법.
D3.
제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
a)
숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 숙주 세포의 집단은 (i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 포함하며, 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -;
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
b)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D4.
제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
a)
숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 숙주 세포의 집단은 (i) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 포함하며; 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 위치 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 위치 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 위치 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 위치 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
b)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D5.
실시형태 D1 또는 실시형태 D3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D6.
실시형태 D1 또는 실시형태 D3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D7.
실시형태 D2에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 숙주 세포의 제작 방법.
D8.
실시형태 D1, D3, D4, D5, 또는 D6에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 숙주 세포의 제작 방법.
D9.
실시형태 D8에 있어서, 세균 세포는 대장균인, 숙주 세포의 제작 방법.
D10.
실시형태 D1, D3, D4, D5, 또는 D6에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내는, 숙주 세포의 제작 방법.
D11.
실시형태 D10에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 숙주 세포의 제작 방법.
D12.
실시형태 D1, D3, D4, D5, 또는 D6에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산되는, 숙주 세포의 제작 방법.
D13.
실시형태 D2 또는 실시형태 D7에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D14.
실시형태 D13에 있어서, 세균 세포는 대장균인, 숙주 세포의 제작 방법.
D15.
실시형태 D2 또는 실시형태 D7에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D16.
실시형태 D15에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 숙주 세포의 제작 방법.
D17.
실시형태 D2 또는 실시형태 D7에서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 5.5% 내지 0.004% 범위의 빈도로 생산되며, 야생형 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D18.
실시형태 D1, D3, D4, D5, D6, 또는 D8 내지 D12 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 숙주 세포의 제작 방법.
D19.
실시형태 D1, D3, D4, D5, D6, 또는 D8 내지 D12 중 어느 하나에 있어서,비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 숙주 세포의 제작 방법.
D20.
실시형태 D1, D3, D4, D5, D6, 또는 D8 내지 D12 중 어느 하나에 있어서 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 숙주 세포의 제작 방법.
D21.
실시형태 D1, D3, D4, D5, D6, 또는 D8 내지 D12 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 숙주 세포의 제작 방법.
D22.
실시형태 D1, D3, D4, D5, D6, 또는 D8 내지 D12 중 어느 하나에 있어서 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 숙주 세포의 제작 방법.
D23.
실시형태 D1, D3, D4, D5, D6, 또는 D8 내지 D12 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 숙주 세포의 제작 방법.
D24.
실시형태 D2, D7, 또는 D13 내지 D17 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D25.
실시형태 D2, D7, 또는 D13 내지 D17 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D26.
실시형태 D2, D7, 또는 D13 내지 D17 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D27.
실시형태 D2, D7, 또는 D13 내지 D17 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D28.
실시형태 D2, D7, 또는 D13 내지 D17 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D29.
실시형태 D2, D7, 또는 D13 내지 D17 중 어느 하나에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D30.
실시형태 D1 내지 실시형태 D29 중 어느 하나에서, 숙주 세포의 집단은 제2 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되며 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단보다 더 적은 콜로니를 생산하며, 제2 핵산 서열은 야생형 NPT 단백질을 인코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D31.
실시형태 D1 내지 실시형태 D30 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포인, 숙주 세포의 제작 방법.
D32.
실시형태 D31에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 숙주 세포의 제작 방법.
D33.
실시형태 D1 내지 실시형태 D29 중 어느 하나에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포인, 숙주 세포의 제작 방법.
D34.
실시형태 D1 내지 실시형태 D33 중 어느 하나에 있어서, 선택된 세포의 콜로니를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
D35.
실시형태 D1 내지 실시형태 D34 중 어느 하나에 있어서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418인, 숙주 세포의 제작 방법.
D36.
실시형태 D1 내지 실시형태 D35 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 치료적 단백질 또는 항원인, 숙주 세포의 제작 방법.
D37.
실시형태 D1 내지 실시형태 D35 중 어느 하나에 있어서, 비-코딩 RNA는 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA인, 숙주 세포의 제작 방법.
D38.
실시형태 D1 내지 실시형태 D37 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 숙주 세포.
제5 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
E1.
치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주의 제조 방법으로서,
a)
하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 치료적 단백질 또는 효소를 인코딩하는 제2 핵산 서열;
b)
G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
c)
선택된 세포를 배양하여 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E2.
치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주의 제조 방법으로서,
a)
하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 치료적 단백질 또는 효소를 인코딩하는 제2 핵산 서열;
b)
G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
c)
선택된 세포를 배양하여 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E3.
실시형태 E1에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E4.
실시형태 E1 또는 실시형태 E3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E5.
실시형태 E1 또는 실시형태 E3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E6.
실시형태 E2에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E7.
실시형태 E1, E3, E4, 또는 E5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E8.
실시형태 E1, E3, E4, 또는 E5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E9.
실시형태 E1, E3, E4, 또는 E5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E10.
실시형태 E1, E3, E4, 또는 E5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E11.
실시형태 E1, E3, E4, 또는 E5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E12.
실시형태 E1, E3, E4, 또는 E5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E13.
실시형태 E2 또는 실시형태 E6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E14.
실시형태 E2 또는 실시형태 E6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E15.
실시형태 E2 또는 실시형태 E6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E16.
실시형태 E2 또는 실시형태 E6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E17.
실시형태 E2 또는 실시형태 E6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E18.
실시형태 E2 또는 실시형태 E6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E19.
실시형태 E1 내지 실시형태 E18 중 어느 하나에 있어서, 안정한 세포주는 포유동물 세포주인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E20.
실시형태 E1 내지 실시형태 E18 중 어느 하나에 있어서, 안정한 세포주는 인간 세포주인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E21.
실시형태 E1 내지 실시형태 E18 중 어느 하나에 있어서, 안정한 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E22.
실시형태 E1 내지 실시형태 E21 중 어느 하나에 있어서, 안정한 세포주는 치료적 단백질을 발현하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E23.
실시형태 E22에 있어서, 치료적 단백질은 항체 또는 항체 단편인, 안정한 세포주의 제조 방법.
E24.
실시형태 E1 내지 실시형태 E21 중 어느 하나에 있어서, 안정한 세포주는 효소를 발현하는, 안정한 세포주의 제조 방법.
E25.
실시형태 E1 내지 실시형태 E24 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 안정한 세포주.
제6 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
F1.
바이러스 생산자 세포주의 제작 방법으로서,
a)
하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열 - 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함함 -;
b)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포를 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
c)
선택된 세포를 증식시켜서 바이러스 생산자 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F2.
바이러스 생산자 세포주의 제작 방법으로서,
a)
하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열 - 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함함 -;
b)
네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포를 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
c)
선택된 세포를 증식시켜서 바이러스 생산자 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F3.
실시형태 F1에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F4.
실시형태 F1 또는 실시형태 F3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F5.
실시형태 F1 또는 실시형태 F3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F6.
실시형태 F2에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F7.
실시형태 F1, F3, F4, 또는 F5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F8.
실시형태 F1, F3, F4, 또는 F5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F9.
실시형태 F1, F3, F4, 또는 F5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F10.
실시형태 F1, F3, F4, 또는 F5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F11.
실시형태 F1, F3, F4, 또는 F5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F12.
실시형태 F1, F3, F4, 또는 F5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F13.
실시형태 F2 또는 실시형태 F6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F14.
실시형태 F2 또는 실시형태 F6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F15.
실시형태 F2 또는 실시형태 F6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F16.
실시형태 F2 또는 실시형태 F6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F17.
실시형태 F2 또는 실시형태 F6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F18.
실시형태 F2 또는 실시형태 F6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F19.
실시형태 F1 내지 실시형태 F18 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 포유동물 세포주인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F20.
실시형태 F1 내지 실시형태 F18 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 인간 세포주인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F21.
실시형태 F1 내지 실시형태 F18 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주인, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F22.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F23.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질 및 AAV rep 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F24.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 외피 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F25.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 아데노바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 E1 영역 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F26.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F27.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 gag 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F28.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 역전사 효소를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F29.
실시형태 F1 내지 실시형태 F21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질, gag 단백질, 및 역전사 효소를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
F30.
실시형태 F1 내지 실시형태 F29 중 어느 하나의 방법에 의해 제작되는 바이러스 생산자 세포주.
F31.
하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산자 세포주로서, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열 - 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함함 -.
F32.
하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산자 세포주로서, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열 - 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함함 -.
F33.
실시형태 F31에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 바이러스 생산자 세포주.
F34.
실시형태 F31 또는 실시형태 F33에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F35.
실시형태 F31 또는 실시형태 F33에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F36.
실시형태 F32에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 바이러스 생산자 세포주.
F37.
실시형태 F31, F33, F34, 또는 F35에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주.
F38.
실시형태 F31, F33, F34, 또는 F35에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주.
F39.
실시형태 F31, F33, F34, 또는 F35에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주.
F40.
실시형태 F31, F33, F34, 또는 F35에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주.
F41.
실시형태 F31, F33, F34, 또는 F35에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주.
F42.
실시형태 F31, F33, F34, 또는 F35에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 바이러스 생산자 세포주.
F43.
실시형태 F32 또는 실시형태 F36에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F44.
실시형태 F32 또는 실시형태 F36에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F45.
실시형태 F32 또는 실시형태 F36에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F46.
실시형태 F32 또는 실시형태 F36에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F47.
실시형태 F32 또는 실시형태 F36에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F48.
실시형태 F32 또는 실시형태 F36에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F49.
실시형태 F31 내지 실시형태 F48 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 포유동물 세포주인, 바이러스 생산자 세포주.
F50.
실시형태 F31 내지 실시형태 F48 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 인간 세포주인, 바이러스 생산자 세포주.
F51.
실시형태 F31 내지 실시형태 F48 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주인, 바이러스 생산자 세포주.
F52.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F53.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질 및 AAV rep 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F54.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 외피 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F55.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 아데노바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 E1 영역 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F56.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F57.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 gag 단백질을 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F58.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 역전사 효소를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
F59.
실시형태 F31 내지 실시형태 F51 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 레트로바이러스 외피 단백질, gag 단백질, 및 역전사 효소를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
제7 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
G1.
항원을 발현하는 세포주의 제조 방법으로서,
a)
하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 네오마이신 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열;
b)
G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
c)
선택된 세포를 배양하여 항원을 발현하는 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G2.
항원을 발현하는 세포주의 제조 방법으로서,
a)
하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함함 -:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 네오마이신 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열;
b)
G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
c)
선택된 세포를 배양하여 항원을 발현하는 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G3.
실시형태 G1에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G4.
실시형태 G1 또는 실시형태 G3에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G5.
실시형태 G1에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G6.
실시형태 G2에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G7.
실시형태 G1, G3, G4, 또는 G5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G8.
실시형태 G1, G3, G4, 또는 G5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G9.
실시형태 G1, G3, G4, 또는 G5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G10.
실시형태 G1, G3, G4, 또는 G5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G11.
실시형태 G1, G3, G4, 또는 G5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G12.
실시형태 G1, G3, G4, 또는 G5에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G13.
실시형태 G2 또는 실시형태 G6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G14.
실시형태 G2 또는 실시형태 G6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G15.
실시형태 G2 또는 실시형태 G6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G16.
실시형태 G2 또는 실시형태 G6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G17.
실시형태 G2 또는 실시형태 G6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G18.
실시형태 G2 또는 실시형태 G6에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G19.
실시형태 G1 내지 실시형태 G18 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 포유동물 세포주인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G20.
실시형태 G1 내지 실시형태 G18 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 인간 세포주인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G21.
실시형태 G1 내지 실시형태 G18 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G22.
실시형태 G1 내지 실시형태 G21 중 어느 하나에 있어서, 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 또는 진균 항원인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G23.
실시형태 G1 내지 실시형태 G21 중 어느 하나에 있어서, 항원은 암 항원인, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법.
G24.
실시형태 G1 내지 실시형태 G23 중 어느 하나의 방법에 의해 제작되는, 항원 생산 세포주.
G25.
하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 항원 생산 세포주로서, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 항원 생산 세포주:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열.
G26.
하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 항원 생산 세포주로서, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 항원 생산 세포주:
(i) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열 - 비-자연 발생 NPT는 하기 (1) 내지 (6)을 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함 -:
(1)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(2)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(3)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(4)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(5)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(6)
서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -; 및
(ii) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열.
G27.
실시형태 G25에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 항원 생산 세포주.
G28.
실시형태 G25 또는 실시형태 G27에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G29.
실시형태 G25 또는 실시형태 G27에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 65% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G30.
실시형태 G26에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택도 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 항원 생산 세포주.
G31.
실시형태 G25, G27, G28, 또는 G29에 있어서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환인, 항원 생산 세포주.
G32.
실시형태 G25, G27, G28, 또는 G29에 있어서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환인, 항원 생산 세포주.
G33.
실시형태 G25, G27, G28, 또는 G29에 있어서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환인, 항원 생산 세포주.
G34.
실시형태 G25, G27, G28, 또는 G29에 있어서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환인, 항원 생산 세포주.
G35.
실시형태 G25, G27, G28, 또는 G29에 있어서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환인, 항원 생산 세포주.
G36.
실시형태 G25, G27, G28, 또는 G29에 있어서, NPT는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하며, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환인, 항원 생산 세포주.
G37.
실시형태 G26 또는 실시형태 G30에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 38의 아미노산 서열(V36M, G210A)을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G38.
실시형태 G26 또는 실시형태 G30에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 39의 아미노산 서열(V36M, E182D)을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G39.
실시형태 G26 또는 실시형태 G30에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 40의 아미노산 서열(V36M, Y218F)을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G40.
실시형태 G26 또는 실시형태 G30에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 41의 아미노산 서열(D216G, D261N)을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G41.
실시형태 G26 또는 실시형태 G30에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 42의 아미노산 서열(V36M, Y218S)을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G42.
실시형태 G26 또는 실시형태 G30에 있어서, 비-자연 발생 NPT는 서열 번호 43의 아미노산 서열(V36M, D216G)을 포함하는, 항원 생산 세포주.
G43.
실시형태 G25 내지 실시형태 G42 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 포유동물 세포주인, 항원 생산 세포주.
G44.
실시형태 G25 내지 실시형태 G42 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 인간 세포주인, 항원 생산 세포주.
G45.
실시형태 G25 내지 실시형태 G42 중 어느 하나에 있어서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주인, 항원 생산 세포주.
G46.
실시형태 G25 내지 실시형태 G45 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 또는 진균 항원인, 항원 생산 세포주.
G47.
실시형태 G25 내지 실시형태 G45 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 항원은 암 항원인, 항원 생산 세포주.
제8 세트의 실시형태에서, 하기가 제공된다:
H1.
세균 세포 내로 도입될 때 카나마이신에 대한 내성 및 포유동물 세포 내로 도입될 때 G418에 대한 내성을 부여하기 위한 선택성 표지 수단.
H2.
실시형태 H1에 있어서, 서열 번호 20의 핵산 서열을 포함하는, 선택성 표지 수단.
H3.
실시형태 H1에 있어서, 서열 번호 32의 핵산 서열을 포함하는, 선택성 표지 수단.
H4.
실시형태 H1에 있어서, 서열 번호 33의 핵산 서열을 포함하는, 선택성 표지 수단.
H5.
실시형태 H1에 있어서, 서열 번호 34의 핵산 서열을 포함하는, 선택성 표지 수단.
H6.
실시형태 H1에 있어서, 서열 번호 36의 핵산 서열을 포함하는, 선택성 표지 수단.
H7.
실시형태 H1에 있어서, 서열 번호 37의 핵산 서열을 포함하는, 선택성 표지 수단.
H8.
생산자 세포주의 제조 방법으로서,
a)
하나 이상의 바이러스 단백질, 및 형질전환되는 세포가 세균 세포인 경우는 카나마이신의 존재 하에 성장시키기 위한 수단 및 형질전환되는 세포가 포유동물 세포인 경우는 G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로, 세균 또는 포유동물 세포를 형질전환시켜서 형질전환된 세포를 생성하는 단계; 및
b)
형질전환된 세포를 카나마이신 또는 G418의 존재 하에 배양하여 생산자 세포주를 수득하는 단계 - 생산자 세포주는 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 바큘로바이러스로부터의 하나 이상의 바이러스 단백질을 발현함 -;를 포함하는, 생산자 세포주의 제조 방법.
H9.
외인성 핵산 서열의 안정한 염색체 통합을 갖는 세포의 선택 방법으로서,
a)
진핵 세포의 집단을, G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 포함하는 외인성 핵산 서열로 형질전환시키는 단계;
b)
형질전환된 세포의 집단을 G418의 존재 하에 배양하여 G418의 존재 하에 성장할 수 있는 형질전환된 세포의 콜로니를 생산하는 단계; 및
c)
단계 (b)에서 생산된 콜로니로부터 세포를 선택하여 외인성 핵산의 안정한 염색체 통합을 갖는 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 세포의 선택 방법.
H10.
실시형태 H9에 있어서, 외인성 핵산 서열은 전이유전자를 추가로 포함하며, 선택된 세포는 전이유전자를 발현하는, 세포의 선택 방법.
H11.
실시형태 H9에 있어서, 외인성 핵산 서열은 선택된 세포에 내인성인 유전자의 발현을 방해하는, 세포의 선택 방법.
H12.
안정한 에피좀을 갖는 포유동물 세포의 선택 방법으로서,
a)
포유동물의 세포의 집단을, G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 포함하는 플라스미드로 형질전환시키는 단계;
b)
형질전환된 세포의 집단을 G418의 존재 하에 배양하여 G418의 존재 하에 성장할 수 있는 형질전환된 세포의 콜로니를 생산하는 단계; 및
c)
단계 (b)에서 생산된 콜로니로부터 세포를 선택하여 플라스미드를 포함하는 안정한 에피좀을 갖는 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 세포의 선택 방법.
H13.
실시형태 H12에 있어서, 플라스미드는 EBNA1 OriP 핵산 서열을 추가로 포함하며, 선택된 세포는 EBNA1을 발현하는, 포유동물 세포의 선택 방법.
H14.
전이유전자를 일시적으로 발현하는 포유동물 세포의 선택 방법으로서,
a)
전이유전자 및 G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 인코딩하는 핵산을 포유동물의 세포의 집단 내로 도입하는 단계;
b)
포유동물 세포의 집단을 G418의 존재 하에 48 내지 72시간 동안 배양하는 단계; 및
c)
G418의 존재 하에 성장하는 포유동물 세포를 포유동물 세포의 배양된 집단으로부터 선택하는 단계를 포함하며, 선택된 포유동물 세포는 전이유전자를 일시적으로 발현하는, 포유동물 세포의 선택 방법.
H15.
실시형태 H14에서, 전이유전자는 크리스퍼 엔도뉴클레아제 또는 크리스퍼 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 세포의 선택 방법.
H16.
실시형태 H8 내지 실시형태 H15 중 어느 하나에 있어서, 수단은 서열 번호 38, 39, 40, 41, 42, 및 43의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인, 포유동물 세포의 선택 방법.
10.
본원에 개시된 서열
다음 표는 본원에 기재된 서열에 부여된 서열 식별 번호의 요약을 제공한다:
>서열 번호 1, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 단백질에 대한 단백질 서열
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
>서열 번호 2, P313 WT 벡터
taactataacggtcctaaggtagcgaacctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccaattcagtcgataactataacggtcctaaggtagcgatttaaatacgcgctctcttaaggtagccgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgctcatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggcgcgccgccaccatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtagtctagagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcgcggccgcattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctgccaccatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagcctagggataacagggtaatggcgcgggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggtggcaaacagctattatgggtattatgggtgacgtcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaacc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>서열 번호 3, 인간 연장 인자 알파 프로모터
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>서열 번호 4, mCherry 코딩 영역
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>서열 번호 5, SV40 폴리아데닐화 신호
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>서열 번호 6, 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 단백질을 인코딩하는 DNA
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>서열 번호 7, 마우스 포스포글리세레이트 키나제 프로모터
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>서열 번호 8, 대장균 라크지아 프로모터
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>서열 번호 9, 단순 포진 바이러스 폴리아데닐화 신호
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>서열 번호 10, 암피실린 내성 유전자
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>서열 번호 11: pUC57 플라스미드 복제 기점
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>서열 번호 12, P614 Neo ORF
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>서열 번호 13, P615 Neo ORF
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>서열 번호 14, P616 Neo ORF
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>서열 번호 15, P623 Neo ORF
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>서열 번호 16, P624 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggcggcctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttaacgagttcttctga
>서열 번호 17, P626 Neo ORF
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>서열 번호 18, APH(6)-Ia 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 19, APH(6)-Ib 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 20, P629 Neo ORF
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>서열 번호 21, P641 Neo ORF
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>서열 번호 22, P642 Neo ORF
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>서열 번호 23, P643 Neo ORF
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>서열 번호 24, P675 Neo ORF
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>서열 번호 25, P676 Neo ORF
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>서열 번호 26, P677 Neo ORF
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>서열 번호 27, P678 Neo ORF
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>서열 번호 28, P679 Neo ORF
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>서열 번호 29, P680 Neo ORF
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>서열 번호 30, P681 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctttcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열 번호 31, P682 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccatgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열 번호 32, P683 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccatgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtgcccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열 번호 33, P684 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccatgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgcagccaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열 번호 34, P685 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccatgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctttcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열 번호 35, P686 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccatgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgaccagcggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열 번호 36, P687 Neo ORF
Atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccatgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgatgatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열 번호 37, P688 Neo ORF
atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccatgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcgggccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
>서열번호 38,
P683(V36M G210A)
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAMFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCARLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
>서열번호 39, P687(V36M E182D)
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAMFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKASMPDGDDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
>서열번호 40, P685(V36M Y218F)
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAMFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRFQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
>서열번호 41, P629(D216G D261N)
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVAGRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLNEFF
>서열번호 42, P684(V36M Y218S)
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAMFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRSQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
>서열번호 43, P688(V36M D216G)
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAMFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVAGRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
>서열 번호 44
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
>서열 번호 45, APH(6)-Ic 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 46, APH(6)-Id 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 47, APH(3')-IIIa 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 48, APH(3')-VIIa 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 49, APH(3')-VIa 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 50, APH(3')-IVa 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 51, APH(3')-Ia 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 52, APH(3')-Ic 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 53, APH(3')-Ib 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 54, APH(3")-IIa 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 55, APH(3')-Vb 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 56, APH(3')-Va 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 57, APH(3')-Vc 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 58, APH(3")-Ia 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 59, APH(3")-Ib 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 60, APH(2")-Ia 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 61, APH(4)-Ib 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
>서열 번호 62, APH(4)-Ib 아미노산 서열
(아미노산 서열에 대해 도 6a 및 도 6b 참조)
본 발명의 특정 실시형태가 본원에 기재되어 있다. 전술한 설명의 해석 시, 개시된 실시형태들의 변형이 당업자에게 명백해질 수 있으며, 당업자는 적절한 이러한 변형을 이용할 수 있음이 예상된다. 따라서, 본 발명은 본원에 구체적으로 기재된 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 본 발명은 적용 가능한 법에 의해 허용되는 본원에 첨부된 청구범위에 나열된 기술 요지의 모든 변경 및 등가물을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서 달리 명시되거나, 문맥 상 명백하게 모순되지 않는 한, 이의 모든 가능한 변형에서 상기 기재된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 의해 포함된다. 본 발명의 다수의 실시형태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변경이 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 실시예 섹션에서의 설명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 예시하되, 제한하지 않도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 인용되어 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 명시되었던 것과 동일한 정도로 그 전체 내용이 그리고 모든 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> JANSSEN BIOTECH, INC.
<120> MATERIALS AND METHODS FOR IMPROVED PHOSPHOTRANSFERASES
<130> 14620-686-228/JBI6523WOPCT1
<140>
<141>
<150> 63/177,739
<151> 2021-04-21
<150> 63/177,744
<151> 2021-04-21
<150> 63/177,746
<151> 2021-04-21
<150> 63/177,749
<151> 2021-04-21
<150> 63/177,753
<151> 2021-04-21
<150> 63/177,759
<151> 2021-04-21
<150> 63/177,764
<151> 2021-04-21
<150> 63/177,767
<151> 2021-04-21
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 264
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Neomycin phosphotransferase protein sequence
<400> 1
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 2
<211> 6963
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 2
taactataac ggtcctaagg tagcgaacct gcaggcagct gcgcgctcgc tcgctcactg 60
aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg 120
agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgc ggccaattca 180
gtcgataact ataacggtcc taaggtagcg atttaaatac gcgctctctt aaggtagccg 240
tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg 300
gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa 360
agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt 420
gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt 480
gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga 540
attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc gggttggaag 600
tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg cttgagttga 660
ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc gcgcctgtct 720
cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg cgacgctttt 780
tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta tttcggtttt 840
tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc tcatgttcgg cgaggcgggg 900
cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc ggcctgctct 960
ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc tggcccggtc 1020
ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag ggagctcaaa 1080
atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaaaagggc 1140
ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc cgtccaggca 1200
cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg aggggtttta 1260
tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag cttggcactt 1320
gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca ttctcaagcc 1380
tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaggcg cgccgccacc 1440
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 1500
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 1560
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 1620
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 1680
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 1740
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 1800
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 1860
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 1920
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 1980
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 2040
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 2100
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta gtctagagat 2160
acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg 2220
aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca 2280
acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa 2340
gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatgg ctgattatga tcgcggccgc attctaccgg 2400
gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc 2460
acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc 2520
caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg 2580
aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt 2640
ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg 2700
ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt 2760
gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc 2820
ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc 2880
tcatctccgg gcctttcgac ctagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 2940
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 3000
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctgcca ccatgattga acaagatgga 3060
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 3120
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 3180
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg 3240
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 3300
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 3360
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 3420
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 3480
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 3540
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg agcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 3600
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 3660
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 3720
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 3780
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaggg 3840
ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa 3900
taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt 3960
cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg 4020
tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca 4080
acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct agggataaca gggtaatggc gcgggccgca 4140
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4200
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 4260
agcgcgcagc tgcctgcagg tggcaaacag ctattatggg tattatgggt gacgtcaagc 4320
ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 4380
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 4440
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 4500
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 4560
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 4620
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 4680
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 4740
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 4800
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 4860
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 4920
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4980
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 5040
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 5100
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 5160
tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 5220
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 5280
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 5340
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 5400
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 5460
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 5520
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 5580
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 5640
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 5700
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 5760
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 5820
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 5880
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 5940
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 6000
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 6060
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 6120
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 6180
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 6240
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 6300
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 6360
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 6420
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 6480
ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 6540
acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 6600
ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 6660
ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag 6720
attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 6780
taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 6840
cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 6900
tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcaca 6960
tgt 6963
<210> 3
<211> 1188
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420
gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gctcatgttc ggcgaggcgg 660
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1188
<210> 4
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 4
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711
<210> 5
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 5
gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt 60
gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 120
acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt 180
aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgatc 225
<210> 6
<211> 795
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Neomycin phosphotransferase DNA sequence
<400> 6
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 7
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 7
attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc 60
cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac 120
cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc 180
cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga 240
agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt 300
aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct 360
gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc 400
<210> 8
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 8
agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 60
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtgg 96
<210> 9
<211> 272
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 9
gggggaggct aactgaaaca cggaaggaga caataccgga aggaacccgc gctatgacgg 60
caataaaaag acagaataaa acgcacggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc 120
ggtcccaggg ctggcactct gtcgataccc caccgagacc ccattggggc caatacgccc 180
gcgtttcttc cttttcccca ccccaccccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag 240
ccaacgtcgg ggcggcaggc cctgccatag cc 272
<210> 10
<211> 1119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 10
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 60
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 120
gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 180
ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 240
gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 300
agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 360
caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 420
gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 480
agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 540
gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 600
aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 660
ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 720
tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 780
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 840
gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 900
atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 960
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 1020
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 1080
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatc 1119
<210> 11
<211> 615
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 11
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 60
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 120
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 180
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 240
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 300
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 360
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 420
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 480
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 540
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 600
tcaagaagat ccttt 615
<210> 12
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 12
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac cctgggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 13
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 13
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc ggcctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 14
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 14
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
aacgagttct tctga 795
<210> 15
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 15
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac cctgggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
aacgagttct tctga 795
<210> 16
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 16
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc ggcctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
aacgagttct tctga 795
<210> 17
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 17
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcggc gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
aacgagttct tctga 795
<210> 18
<211> 307
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(6)-Ia amino acid sequence
<400> 18
Met Ser Ser Ser Asp His Ile His Val Pro Asp Gly Leu Ala Glu Ser
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Ser Gly Gly Glu Glu Gly Arg Ala Trp Ile Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Ala Leu Val Ala Arg Cys Val Asp Arg Trp Glu Leu Lys Arg Asp
35 40 45
Gly Gly Val Arg Ser Gly Glu Ala Ser Leu Val Val Pro Val Leu Arg
50 55 60
Ala Asp Gly Thr Arg Ala Ala Leu Lys Leu Gln Met Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Thr Thr Ala Ala Leu Ile Gly Leu Arg Ala Trp Gly Gly Asp Gly Met
85 90 95
Val Arg Leu Leu Asp His Asp Glu Glu Ser Ser Thr Met Leu Leu Glu
100 105 110
Arg Leu Asp Gly Ser Arg Thr Leu Ala Ser Val Glu Asp Asp Asp Glu
115 120 125
Ala Met Gly Val Leu Ala Gly Leu Leu Asn Arg Leu His Ser Val Pro
130 135 140
Ala Pro Pro Gly Leu Arg Gly Leu Gly Glu Ile Ala Gly Ala Met Val
145 150 155 160
Glu Glu Val Pro Ser Ala Val Asp Ser Leu Ala Asp Pro Glu Asp Arg
165 170 175
Ser Arg Leu Arg Gly Trp Ala Ser Ala Val Ala Glu Leu Val Gly Glu
180 185 190
Pro Gly Asp Arg Val Leu His Trp Asp Leu His Tyr Glu Asn Val Leu
195 200 205
Ala Ala Glu Arg Glu Pro Trp Leu Ala Ile Asp Pro Glu Pro Leu Val
210 215 220
Gly Asp Pro Gly Phe Asp Leu Trp Pro Ala Leu Asp Thr Gly Trp Glu
225 230 235 240
Arg Ile Glu Ala Thr Gly Asp Ala Arg Arg Val Val Arg Arg Arg Phe
245 250 255
Asp Leu Leu Thr Glu Ser Leu Glu Leu Asp Arg Gly Arg Ala Ala Gly
260 265 270
Trp Thr Leu Ala Arg Leu Leu Gln Asn Thr Leu Trp Asp Ile Glu Asp
275 280 285
Gly Leu Thr Ala Ile Ala Pro Ser Gln Ile Ala Val Ala Glu Ala Leu
290 295 300
Ala Lys Pro
305
<210> 19
<211> 307
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(6)-Ib amino acid sequence
<400> 19
Met Ser Thr Ser Lys Leu Val Glu Ile Pro Glu Pro Leu Ala Ala Ser
1 5 10 15
Tyr Ala Arg Ala Phe Gly Glu Glu Gly Gln Ala Trp Ile Ala Ala Leu
20 25 30
Pro Ala Leu Val Glu Glu Leu Leu Asp Arg Trp Glu Leu Thr Ala Asp
35 40 45
Gly Ala Ser Ala Ser Gly Glu Ala Ser Leu Val Leu Pro Val Leu Arg
50 55 60
Thr Asp Gly Thr Arg Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gly Leu Arg Thr Trp Asn Gly His Gly Val
85 90 95
Val Arg Leu Leu Asp His Asp Pro Arg Ser Ser Thr Met Leu Leu Glu
100 105 110
Arg Leu Asp Ala Ser Arg Thr Leu Ala Ser Val Glu Asp Asp Asp Ala
115 120 125
Ala Met Gly Val Leu Ala Gly Leu Leu Ala Arg Leu Val Ser Val Pro
130 135 140
Ala Pro Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Asp Ile Ala Gly Ala Met Leu
145 150 155 160
Glu Glu Val Pro Arg Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp Pro Ala Asp Arg
165 170 175
Arg Leu Leu Asn Asp Trp Ala Ser Ala Val Ala Glu Leu Val Gly Glu
180 185 190
Pro Gly Asp Arg Met Leu His Trp Asp Leu His Tyr Gly Asn Val Leu
195 200 205
Ala Ala Glu Arg Glu Pro Trp Leu Ala Ile Asp Pro Glu Pro Leu Ala
210 215 220
Gly Asp Pro Gly Phe Asp Leu Trp Pro Ala Leu Asp Ser Arg Trp Asp
225 230 235 240
Asp Ile Val Ala Gln Arg Asp Val Val Arg Val Val Arg Arg Arg Phe
245 250 255
Asp Leu Leu Thr Glu Val Leu Gly Leu Asp Arg Ala Arg Ala Ala Gly
260 265 270
Trp Thr Tyr Gly Arg Leu Leu Gln Asn Ala Leu Trp Asp Ile Glu Asp
275 280 285
Gly Ser Ala Ala Leu Asp Pro Ala Ala Val Thr Leu Ala Gln Ala Leu
290 295 300
Arg Gly His
305
<210> 20
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 20
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcgggccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
aacgagttct tctga 795
<210> 21
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 21
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctgagttcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 22
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 22
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cggctgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 23
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 23
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcgggccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 24
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 24
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtgg cattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
aacgagttct tctga 795
<210> 25
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 25
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
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atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg cgatcaggac 660
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aacgagttct tctga 795
<210> 26
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 26
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
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<210> 27
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 27
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgatgatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
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aacgagttct tctga 795
<210> 28
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 28
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
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caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
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gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtgcc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
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ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 29
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 29
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
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caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg cagccaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 30
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 30
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctttcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 31
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 31
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccatgtt ccggctgtca 120
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caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
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ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 32
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 32
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atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 33
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 33
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccatgtt ccggctgtca 120
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gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
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ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 34
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 34
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ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctttcaggac 660
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gacgagttct tctga 795
<210> 35
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 35
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccatgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
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ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac cagcggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
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ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 36
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 36
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccatgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgatgatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
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ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 37
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 37
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccatgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
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ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcgggccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 38
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 38
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Met Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Ala Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 39
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 39
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Met Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Met Pro Asp Gly Asp Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 40
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 40
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Met Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Phe Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 41
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 41
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Gly Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asn Glu Phe Phe
260
<210> 42
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Met Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
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85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 43
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 43
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Met Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Gly Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 44
<211> 264
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Neomycin phosphotransferase amino acid sequence
<400> 44
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 45
<211> 266
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(6)-Ic amino acid sequence
<400> 45
Met Glu Arg Trp Arg Leu Leu Arg Asp Gly Glu Leu Leu Thr Thr His
1 5 10 15
Ser Ser Trp Ile Leu Pro Val Arg Gln Gly Asp Met Pro Ala Met Leu
20 25 30
Lys Val Ala Arg Ile Pro Asp Glu Glu Ala Gly Tyr Arg Leu Leu Thr
35 40 45
Trp Trp Asp Gly Gln Gly Ala Ala Arg Val Phe Ala Ser Ala Ala Gly
50 55 60
Ala Leu Leu Met Glu Arg Ala Ser Gly Ala Gly Asp Leu Ala Gln Ile
65 70 75 80
Ala Trp Ser Gly Gln Asp Asp Glu Ala Cys Arg Ile Leu Cys Asp Thr
85 90 95
Ala Ala Arg Leu His Ala Pro Arg Ser Gly Pro Pro Pro Asp Leu His
100 105 110
Pro Leu Gln Glu Trp Phe Gln Pro Leu Phe Arg Leu Ala Ala Glu His
115 120 125
Ala Ala Leu Ala Pro Ala Ala Ser Val Ala Arg Gln Leu Leu Ala Ala
130 135 140
Pro Arg Glu Val Cys Pro Leu His Gly Asp Leu His His Glu Asn Val
145 150 155 160
Leu Asp Phe Gly Asp Arg Gly Trp Leu Ala Ile Asp Pro His Gly Leu
165 170 175
Leu Gly Glu Arg Thr Phe Asp Tyr Ala Asn Ile Phe Thr Asn Pro Asp
180 185 190
Leu Ser Asp Pro Gly Arg Pro Leu Ala Ile Leu Pro Gly Arg Leu Glu
195 200 205
Ala Arg Leu Ser Ile Val Val Ala Thr Thr Gly Phe Glu Pro Glu Arg
210 215 220
Leu Leu Arg Trp Ile Ile Ala Trp Thr Gly Leu Ser Ala Ala Trp Phe
225 230 235 240
Ile Gly Asp Gly Asp Gly Glu Gly Glu Gly Ala Ala Ile Asp Leu Ala
245 250 255
Val Asn Ala Met Ala Arg Arg Leu Leu Asp
260 265
<210> 46
<211> 277
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(6)-Id amino acid sequence
<400> 46
Met Phe Met Pro Pro Val Phe Pro Ala His Trp His Val Ser Gln Pro
1 5 10 15
Val Leu Ile Ala Asp Thr Phe Ser Ser Leu Val Trp Lys Val Ser Leu
20 25 30
Pro Asp Gly Thr Pro Ala Ile Val Lys Gly Leu Lys Pro Ile Glu Asp
35 40 45
Ile Ala Asp Glu Leu Arg Gly Ala Asp Tyr Leu Val Trp Arg Asn Gly
50 55 60
Arg Gly Ala Val Arg Leu Leu Gly Arg Glu Asn Asn Leu Met Leu Leu
65 70 75 80
Glu Tyr Ala Gly Glu Arg Met Leu Ser His Ile Val Ala Glu His Gly
85 90 95
Asp Tyr Gln Ala Thr Glu Ile Ala Ala Glu Leu Met Ala Lys Leu Tyr
100 105 110
Ala Ala Ser Glu Glu Pro Leu Pro Ser Ala Leu Leu Pro Ile Arg Asp
115 120 125
Arg Phe Ala Ala Leu Phe Gln Arg Ala Arg Asp Asp Gln Asn Ala Gly
130 135 140
Cys Gln Thr Asp Tyr Val His Ala Ala Ile Ile Ala Asp Gln Met Met
145 150 155 160
Ser Asn Ala Ser Glu Leu Arg Gly Leu His Gly Asp Leu His His Glu
165 170 175
Asn Ile Met Phe Ser Ser Arg Gly Trp Leu Val Ile Asp Pro Val Gly
180 185 190
Leu Val Gly Glu Val Gly Phe Gly Ala Ala Asn Met Phe Tyr Asp Pro
195 200 205
Ala Asp Arg Asp Asp Leu Cys Leu Asp Pro Arg Arg Ile Ala Gln Met
210 215 220
Ala Asp Ala Phe Ser Arg Ala Leu Asp Val Asp Pro Arg Arg Leu Leu
225 230 235 240
Asp Gln Ala Tyr Ala Tyr Gly Cys Leu Ser Ala Ala Trp Asn Ala Asp
245 250 255
Gly Glu Glu Glu Gln Arg Asp Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ile Lys Gln
260 265 270
Val Arg Gln Thr Ser
275
<210> 47
<211> 264
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-IIIa amino acid sequence
<400> 47
Met Ala Lys Met Arg Ile Ser Pro Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Lys
1 5 10 15
Tyr Arg Cys Val Lys Asp Thr Glu Gly Met Ser Pro Ala Lys Val Tyr
20 25 30
Lys Leu Val Gly Glu Asn Glu Asn Leu Tyr Leu Lys Met Thr Asp Ser
35 40 45
Arg Tyr Lys Gly Thr Thr Tyr Asp Val Glu Arg Glu Lys Asp Met Met
50 55 60
Leu Trp Leu Glu Gly Lys Leu Pro Val Pro Lys Val Leu His Phe Glu
65 70 75 80
Arg His Asp Gly Trp Ser Asn Leu Leu Met Ser Glu Ala Asp Gly Val
85 90 95
Leu Cys Ser Glu Glu Tyr Glu Asp Glu Gln Ser Pro Glu Lys Ile Ile
100 105 110
Glu Leu Tyr Ala Glu Cys Ile Arg Leu Phe His Ser Ile Asp Ile Ser
115 120 125
Asp Cys Pro Tyr Thr Asn Ser Leu Asp Ser Arg Leu Ala Glu Leu Asp
130 135 140
Tyr Leu Leu Asn Asn Asp Leu Ala Asp Val Asp Cys Glu Asn Trp Glu
145 150 155 160
Glu Asp Thr Pro Phe Lys Asp Pro Arg Glu Leu Tyr Asp Phe Leu Lys
165 170 175
Thr Glu Lys Pro Glu Glu Glu Leu Val Phe Ser His Gly Asp Leu Gly
180 185 190
Asp Ser Asn Ile Phe Val Lys Asp Gly Lys Val Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Leu Gly Arg Ser Gly Arg Ala Asp Lys Trp Tyr Asp Ile Ala Phe Cys
210 215 220
Val Arg Ser Ile Arg Glu Asp Ile Gly Glu Glu Gln Tyr Val Glu Leu
225 230 235 240
Phe Phe Asp Leu Leu Gly Ile Lys Pro Asp Trp Glu Lys Ile Lys Tyr
245 250 255
Tyr Ile Leu Leu Asp Glu Leu Phe
260
<210> 48
<211> 250
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-VIIa amino acid sequence
<400> 48
Met Lys Tyr Ile Asp Glu Ile Gln Ile Leu Gly Lys Cys Ser Glu Gly
1 5 10 15
Met Ser Pro Ala Glu Val Tyr Lys Cys Gln Leu Lys Asn Thr Val Cys
20 25 30
Tyr Leu Lys Lys Ile Asp Asp Ile Phe Ser Lys Thr Thr Tyr Ser Val
35 40 45
Lys Arg Glu Ala Glu Met Met Met Trp Leu Ser Asp Lys Leu Lys Val
50 55 60
Pro Asp Val Ile Glu Tyr Gly Val Arg Glu His Ser Glu Tyr Leu Ile
65 70 75 80
Met Ser Glu Leu Arg Gly Lys His Ile Asp Cys Phe Ile Asp His Pro
85 90 95
Ile Lys Tyr Ile Glu Cys Leu Val Asn Ala Leu His Gln Leu Gln Ala
100 105 110
Ile Asp Ile Arg Asn Cys Pro Phe Ser Ser Lys Ile Asp Val Arg Leu
115 120 125
Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Leu Asp Asn Arg Ile Ala Asp Ile Asp Val
130 135 140
Ser Asn Trp Glu Asp Thr Thr Glu Phe Asp Asp Pro Met Thr Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Trp Leu Cys Glu Asn Gln Pro Gln Glu Glu Leu Cys Leu Ser His
165 170 175
Gly Asp Met Ser Ala Asn Phe Phe Val Ser His Asp Gly Ile Tyr Phe
180 185 190
Tyr Asp Leu Ala Arg Cys Gly Val Ala Asp Lys Trp Leu Asp Ile Ala
195 200 205
Phe Cys Val Arg Glu Ile Arg Glu Tyr Tyr Pro Asp Ser Asp Tyr Glu
210 215 220
Lys Phe Phe Phe Asn Met Leu Gly Leu Glu Pro Asp Tyr Lys Lys Ile
225 230 235 240
Asn Tyr Tyr Ile Leu Leu Asp Glu Met Phe
245 250
<210> 49
<211> 259
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-VIa amino acid sequence
<400> 49
Met Glu Leu Pro Asn Ile Ile Gln Gln Phe Ile Gly Asn Ser Val Leu
1 5 10 15
Glu Pro Asn Lys Ile Gly Gln Ser Pro Ser Asp Val Tyr Ser Phe Asn
20 25 30
Arg Asn Asn Glu Thr Phe Phe Leu Lys Arg Ser Ser Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Thr Thr Tyr Ser Val Ser Arg Glu Ala Lys Met Leu Ser Trp Leu
50 55 60
Ser Glu Lys Leu Lys Val Pro Glu Leu Ile Met Thr Phe Gln Asp Glu
65 70 75 80
Gln Phe Glu Phe Met Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ala Lys Pro Ile Ser
85 90 95
Ala Leu Phe Leu Thr Asp Gln Glu Leu Leu Ala Ile Tyr Lys Glu Ala
100 105 110
Leu Asn Leu Leu Asn Ser Ile Ala Ile Ile Asp Cys Pro Phe Ile Ser
115 120 125
Asn Ile Asp His Arg Leu Lys Glu Ser Lys Phe Phe Ile Asp Asn Gln
130 135 140
Leu Leu Asp Asp Ile Asp Gln Asp Asp Phe Asp Thr Glu Leu Trp Gly
145 150 155 160
Asp His Lys Thr Tyr Leu Ser Leu Trp Asn Glu Leu Thr Glu Thr Arg
165 170 175
Val Glu Glu Arg Leu Val Phe Ser His Gly Asp Ile Thr Asp Ser Asn
180 185 190
Ile Phe Ile Asp Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Phe Leu Asp Leu Gly Arg
195 200 205
Ala Gly Leu Ala Asp Glu Phe Val Asp Ile Ser Phe Val Glu Arg Cys
210 215 220
Leu Arg Glu Asp Ala Ser Glu Glu Thr Ala Lys Ile Phe Leu Lys His
225 230 235 240
Leu Lys Asn Asp Arg Pro Asp Lys Arg Asn Tyr Phe Leu Lys Leu Asp
245 250 255
Glu Leu Asn
<210> 50
<211> 262
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-IVa amino acid sequence
<400> 50
Met Asn Glu Ser Thr Arg Asn Trp Pro Glu Glu Leu Leu Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gln Thr Glu Leu Thr Val Asn Lys Ile Gly Tyr Ser Gly Asp His
20 25 30
Val Tyr His Val Lys Glu Tyr Arg Gly Thr Pro Ala Phe Leu Lys Ile
35 40 45
Ala Pro Ser Val Trp Trp Arg Thr Leu Arg Pro Glu Ile Glu Ala Leu
50 55 60
Ala Trp Leu Asp Gly Lys Leu Pro Val Pro Lys Ile Leu Tyr Thr Ala
65 70 75 80
Glu His Gly Gly Met Asp Tyr Leu Leu Met Glu Ala Leu Gly Gly Lys
85 90 95
Asp Gly Ser His Glu Thr Ile Gln Ala Lys Arg Lys Leu Phe Val Lys
100 105 110
Leu Tyr Ala Glu Gly Leu Arg Ser Val His Gly Leu Asp Ile Arg Glu
115 120 125
Cys Pro Leu Ser Asn Gly Leu Glu Lys Lys Leu Arg Asp Ala Lys Arg
130 135 140
Ile Val Asp Glu Ser Leu Val Asp Pro Ala Asp Ile Lys Glu Glu Tyr
145 150 155 160
Asp Cys Thr Pro Glu Glu Leu Tyr Gly Leu Leu Leu Glu Ser Lys Pro
165 170 175
Val Thr Glu Asp Leu Val Phe Ala His Gly Asp Tyr Cys Ala Pro Asn
180 185 190
Leu Ile Ile Asp Gly Glu Lys Leu Ser Gly Phe Ile Asp Leu Gly Arg
195 200 205
Ala Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ser Leu Ala Ile Arg Ser
210 215 220
Leu Arg His Asp Tyr Gly Asp Asp Arg Tyr Lys Ala Leu Phe Leu Glu
225 230 235 240
Leu Tyr Gly Leu Asp Gly Leu Asp Glu Asp Lys Val Arg Tyr Tyr Ile
245 250 255
Arg Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 51
<211> 271
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-Ia amino acid sequence
<400> 51
Met Ser His Ile Gln Arg Glu Thr Ser Cys Ser Arg Pro Arg Leu Asn
1 5 10 15
Ser Asn Met Asp Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr Lys Trp Ala Arg Asp Asn
20 25 30
Val Gly Gln Ser Gly Ala Thr Ile Tyr Arg Leu Tyr Gly Lys Pro Asp
35 40 45
Ala Pro Glu Leu Phe Leu Lys His Gly Lys Gly Ser Val Ala Asn Asp
50 55 60
Val Thr Asp Glu Met Val Arg Leu Asn Trp Leu Thr Glu Phe Met Pro
65 70 75 80
Leu Pro Thr Ile Lys His Phe Ile Arg Thr Pro Asp Asp Ala Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Thr Ala Ile Pro Gly Lys Thr Ala Phe Gln Val Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Pro Asp Ser Gly Glu Asn Ile Val Asp Ala Leu Ala Val Phe Leu
115 120 125
Arg Arg Leu His Ser Ile Pro Val Cys Asn Cys Pro Phe Asn Ser Asp
130 135 140
Arg Val Phe Arg Leu Ala Gln Ala Gln Ser Arg Met Asn Asn Gly Leu
145 150 155 160
Val Asp Ala Ser Asp Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp Pro Val Glu
165 170 175
Gln Val Trp Lys Glu Met His Lys Leu Leu Pro Phe Ser Pro Asp Ser
180 185 190
Val Val Thr His Gly Asp Phe Ser Leu Asp Asn Leu Ile Phe Asp Glu
195 200 205
Gly Lys Leu Ile Gly Cys Ile Asp Val Gly Arg Val Gly Ile Ala Asp
210 215 220
Arg Tyr Gln Asp Leu Ala Ile Leu Trp Asn Cys Leu Gly Glu Phe Ser
225 230 235 240
Pro Ser Leu Gln Lys Arg Leu Phe Gln Lys Tyr Gly Ile Asp Asn Pro
245 250 255
Asp Met Asn Lys Leu Gln Phe His Leu Met Leu Asp Glu Phe Phe
260 265 270
<210> 52
<211> 271
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-Ic amino acid sequence
<400> 52
Met Ser His Ile Gln Arg Glu Thr Ser Cys Ser Arg Pro Arg Leu Asn
1 5 10 15
Ser Asn Leu Asp Ala Asp Leu Tyr Gly Tyr Arg Trp Ala Arg Asp Asn
20 25 30
Val Gly Gln Ser Gly Ala Thr Ile Tyr Arg Leu Tyr Gly Lys Pro Asn
35 40 45
Ala Pro Glu Leu Phe Leu Lys His Gly Lys Gly Ser Val Ala Asn Asp
50 55 60
Val Thr Asp Glu Met Val Arg Leu Asn Trp Leu Thr Ala Phe Met Pro
65 70 75 80
Leu Pro Thr Ile Lys His Phe Ile Arg Thr Pro Asp Asp Ala Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Thr Ala Ile Pro Gly Lys Thr Ala Phe Gln Val Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Pro Asp Ser Gly Glu Asn Ile Val Asp Ala Leu Ala Val Phe Leu
115 120 125
Arg Arg Leu His Ser Ile Pro Val Cys Asn Cys Pro Phe Asn Ser Asp
130 135 140
Arg Val Phe Arg Leu Ala Gln Ala Gln Ser Arg Met Asn Asn Gly Leu
145 150 155 160
Val Asp Ala Ser Asp Phe Asp Asp Glu Arg Asn Gly Trp Pro Val Glu
165 170 175
Gln Val Trp Lys Glu Met His Lys Leu Leu Pro Phe Ser Pro Asp Ser
180 185 190
Val Val Thr His Gly Asp Phe Ser Leu Asp Asn Leu Ile Phe Asp Glu
195 200 205
Gly Lys Leu Ile Gly Cys Ile Asp Val Gly Arg Val Gly Ile Ala Asp
210 215 220
Arg Tyr Gln Asp Leu Ala Ile Leu Trp Asn Cys Leu Gly Glu Phe Ser
225 230 235 240
Pro Ser Leu Gln Lys Arg Leu Phe Gln Lys Tyr Gly Ile Asp Asn Pro
245 250 255
Asp Met Asn Lys Leu Gln Phe His Leu Met Leu Asp Glu Phe Phe
260 265 270
<210> 53
<211> 269
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-Ib amino acid sequence
<400> 53
Met Asn Asp Ile Asp Arg Glu Glu Pro Cys Ala Ala Ala Ala Val Pro
1 5 10 15
Glu Ser Met Ala Ala His Val Met Gly Tyr Lys Trp Ala Arg Asp Lys
20 25 30
Val Gly Gln Ser Gly Cys Ala Val Tyr Arg Leu His Ser Lys Ser Gly
35 40 45
Gly Ser Asp Leu Phe Leu Lys His Gly Lys Asp Ala Ala Asp Asp Val
50 55 60
Thr Asp Glu Met Val Arg Leu Arg Trp Leu Ala Gly His Ile Ser Val
65 70 75 80
Pro Ser Val Val Ser Phe Val Arg Thr Pro Asn Gln Ala Trp Leu Leu
85 90 95
Thr Thr Ala Ile His Gly Lys Thr Ala Phe Gln Val Leu Glu Glu Tyr
100 105 110
Pro Asp Ser Gly Glu Asn Ile Val Asp Ala Ala Val Phe Leu Arg Arg
115 120 125
Leu His Ser Ile Pro Val Cys Asn Cys Pro Phe Asn Ser Asp Arg Val
130 135 140
Phe Arg Leu Ala Gln Ala Gln Ser Arg Met Asn Asn Gly Leu Val Asp
145 150 155 160
Val Asp Asp Phe Asp Lys Glu Arg Glu Gly Trp Thr Ala Glu Gln Val
165 170 175
Trp Glu Ala Met His Arg Leu Leu Pro Leu Ala Pro Asp Pro Val Val
180 185 190
Thr His Gly Asp Phe Ser Leu Asp Asn Leu Leu Ile Val Glu Gly Lys
195 200 205
Val Val Gly Cys Ile Asp Val Gly Arg Ala Gly Ile Ala Asp Arg Tyr
210 215 220
Gln Asp Leu Ala Val Leu Trp Asn Cys Leu Glu Glu Phe Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Gln Glu Arg Leu Val Ala Gln Tyr Gly Ile Ala Asp Pro Asp Arg
245 250 255
Arg Lys Leu Gln Phe His Leu Leu Leu Asp Glu Leu Phe
260 265
<210> 54
<211> 264
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-IIa amino acid sequence
<400> 54
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 55
<211> 263
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-Vb amino acid sequence
<400> 55
Met Glu Ser Thr Leu Arg Arg Thr Tyr Pro His His Thr Trp His Leu
1 5 10 15
Val Asn Glu Gly Asp Ser Gly Ala Phe Val Tyr Arg Leu Thr Gly His
20 25 30
Gly Pro Glu Leu Tyr Ala Lys Ile Ala Pro Arg Thr Pro Glu Asn Ser
35 40 45
Ala Phe His Leu Asp Gly Glu Ala Asp Arg Leu Asp Trp Leu Ala Arg
50 55 60
His Gly Ile Ser Val Pro Arg Val Val Glu Arg Gly Ala Asp Asp Thr
65 70 75 80
Thr Ala Trp Leu Val Thr Glu Ala Val Pro Gly Ala Ala Ser Ala Glu
85 90 95
Glu Trp Pro Glu Asp Glu Arg Ala Ala Val Val Asp Ala Ile Ala Glu
100 105 110
Met Ala Arg Thr Leu His Glu Leu Pro Val Ser Glu Cys Pro Phe Asp
115 120 125
Arg Arg Leu Asp Val Thr Gly Glu Ala Arg His Asn Val Arg Glu Gly
130 135 140
Leu Val Asp Leu Asp Asp Leu Gln Glu Glu Pro Ala Gly Trp Thr Gly
145 150 155 160
Asp Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asp Leu Thr Arg Pro Glu Lys Glu Asp
165 170 175
Leu Val Val Cys His Gly Asp Leu Cys Pro Asn Asn Val Leu Leu Asp
180 185 190
Pro Glu Thr His Arg Val Thr Gly Leu Ile Asp Val Gly Arg Leu Arg
195 200 205
Leu Ala Thr Cys His Ala Asp Ile Ala Leu Ala Ala Arg Glu Leu Ala
210 215 220
Ile Asp Glu Asp Pro Trp Phe Gly Pro Ala Tyr Ala Glu Arg Phe Leu
225 230 235 240
Glu Arg Tyr Gly Ala His His Val Asp Gln Glu Lys Met Ala Phe Tyr
245 250 255
Gln Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 56
<211> 268
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-Va amino acid sequence
<400> 56
Met Asp Asp Ser Thr Leu Arg Arg Lys Tyr Pro His His Glu Trp His
1 5 10 15
Ala Val Asn Glu Gly Asp Ser Gly Ala Phe Val Tyr Gln Leu Thr Gly
20 25 30
Gly Pro Glu Pro Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Lys Ile Ala Pro Arg Ala
35 40 45
Pro Glu Asn Ser Ala Phe Asp Leu Ser Gly Glu Ala Asp Arg Leu Glu
50 55 60
Trp Leu His Arg His Gly Ile Pro Val Pro Arg Val Val Glu Arg Gly
65 70 75 80
Ala Asp Asp Thr Ala Ala Trp Leu Val Thr Glu Ala Val Pro Gly Val
85 90 95
Ala Ala Ala Glu Glu Trp Pro Glu His Gln Arg Phe Ala Val Val Glu
100 105 110
Ala Met Ala Glu Leu Ala Arg Ala Leu His Glu Leu Pro Val Glu Asp
115 120 125
Cys Pro Ser Asp Arg Arg Leu Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Arg Arg
130 135 140
Asn Val Ala Glu Gly Leu Val Asp Leu Asp Asp Leu Gln Glu Glu Arg
145 150 155 160
Ala Gly Trp Thr Gly Asp Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asp Arg Thr Arg
165 170 175
Pro Glu Lys Glu Asp Leu Val Val Cys His Gly Asp Leu Cys Pro Asn
180 185 190
Asn Val Leu Leu Asp Pro Gly Thr Cys Arg Val Thr Gly Val Ile Asp
195 200 205
Val Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg His Ala Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Ala Arg Glu Leu Glu Ile Asp Glu Asp Pro Trp Phe Gly Pro Ala Tyr
225 230 235 240
Ala Glu Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Gly Ala His Arg Val Asp Lys Glu
245 250 255
Lys Leu Ala Phe Tyr Gln Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260 265
<210> 57
<211> 264
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3')-Vc amino acid sequence
<400> 57
Met Tyr Ala Met Leu Arg Arg Lys Tyr Gln His Tyr Glu Trp Thr Ser
1 5 10 15
Val Asn Glu Gly Asp Ser Gly Ala Ser Val Tyr Arg Leu Ala Gly Gln
20 25 30
Gln Pro Glu Leu Tyr Val Lys Phe Ala Pro Arg Glu Pro Glu Asn Ser
35 40 45
Ala Phe Asp Leu Ala Gly Glu Ala Asp Arg Leu Thr Trp Leu Thr Arg
50 55 60
His Gly Ile Pro Val Pro Cys Ile Val Glu Cys Gly Gly Asp Asp Thr
65 70 75 80
Ser Val Phe Leu Val Thr Glu Ala Val Thr Gly Val Ala Ala Ala Glu
85 90 95
Glu Trp Pro Glu His Gln Arg Phe Ala Val Val Glu Ala Met Ala Asp
100 105 110
Leu Ala Arg Thr Leu His Glu Leu Pro Val Gly Gly Cys Pro Phe Asp
115 120 125
Arg Ser Leu Ala Val Thr Val Ala Glu Ala Arg His Asn Leu Arg Glu
130 135 140
Gly Leu Val Asp Leu Asp Asp Leu Gln Glu Glu His Ala Asn Trp Ser
145 150 155 160
Gly Asp Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asp Arg Thr Arg Pro Glu Lys Glu
165 170 175
Asp Leu Val Val Cys His Gly Asp Leu Cys Pro Asn Asn Val Leu Leu
180 185 190
Asp Pro Glu Thr Cys Arg Val Thr Gly Met Ile Asp Val Gly Arg Leu
195 200 205
Gly Arg Ala Asp Arg His Ala Asp Ile Ala Leu Ala Ala Arg Glu Leu
210 215 220
Glu Ile Asp Glu Asp Pro Trp Phe Gly Pro Glu Tyr Ala Gln Arg Phe
225 230 235 240
Leu Glu Arg Tyr Gly Ala His His Val Asp Glu Asn Lys Met Ala Phe
245 250 255
Tyr Gln Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 58
<211> 272
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3")-Ia amino acid sequence
<400> 58
Met Ser Asp His Pro Gly Pro Gly Ala Val Thr Pro Glu Leu Phe Gly
1 5 10 15
Val Gly Gly Asp Trp Leu Ala Val Thr Ala Gly Glu Ser Gly Ala Ser
20 25 30
Val Phe Arg Ala Ala Asp Ala Thr Arg Tyr Ala Lys Cys Val Pro Ala
35 40 45
Ala Asp Ala Ala Gly Leu Glu Ala Glu Arg Asp Arg Ile Ala Trp Leu
50 55 60
Ser Gly Gln Gly Val Pro Gly Pro Arg Val Leu Asp Trp Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Asp Ala Gly Ala Cys Leu Val Thr Arg Ala Val Pro Gly Val Pro Ala
85 90 95
Asp Arg Val Gly Ala Asp Asp Leu Arg Thr Ala Trp Gly Ala Val Ala
100 105 110
Asp Ala Val Arg Arg Leu His Glu Val Pro Val Ala Ser Cys Pro Phe
115 120 125
Arg Arg Gly Leu Asp Ser Val Val Asp Ala Ala Arg Asp Val Val Ala
130 135 140
Arg Gly Ala Val His Pro Glu Phe Leu Pro Val Glu Gln Arg Leu Val
145 150 155 160
Pro Pro Ala Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Glu Leu Ala Arg Arg
165 170 175
Arg Asp Gln Glu Ala Ala Asp Thr Val Val Cys His Gly Asp Leu Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Val Leu His Pro Glu Thr Leu Glu Val Ser Gly Phe
195 200 205
Ile Asp Leu Gly Arg Leu Gly Ala Ala Asp Arg His Ala Asp Leu Ala
210 215 220
Leu Leu Leu Ala Asn Ala Arg Glu Thr Trp Val Asp Glu Glu Arg Ala
225 230 235 240
Arg Phe Ala Asp Ala Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Gly Ile Ala Pro Asp
245 250 255
Pro Glu Arg Leu Arg Phe Tyr Leu His Leu Asp Pro Leu Thr Trp Gly
260 265 270
<210> 59
<211> 267
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(3")-Ib amino acid sequence
<400> 59
Leu Asn Arg Thr Asn Ile Phe Phe Gly Glu Ser His Ser Asp Trp Leu
1 5 10 15
Pro Val Arg Gly Gly Glu Ser Gly Asp Phe Val Phe Arg Arg Gly Asp
20 25 30
Gly His Ala Phe Ala Lys Ile Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu
35 40 45
Ala Gly Glu Arg Asp Arg Leu Ile Trp Leu Lys Gly Arg Gly Val Ala
50 55 60
Cys Pro Glu Val Ile Asn Trp Gln Glu Glu Gln Glu Gly Ala Cys Leu
65 70 75 80
Val Ile Thr Ala Ile Pro Gly Val Pro Ala Ala Asp Leu Ser Gly Ala
85 90 95
Asp Leu Leu Lys Ala Trp Pro Ser Met Gly Gln Gln Leu Gly Ala Val
100 105 110
His Ser Leu Ser Val Asp Gln Cys Pro Phe Glu Arg Arg Leu Ser Arg
115 120 125
Met Phe Gly Arg Ala Val Asp Val Val Ser Arg Asn Ala Val Asn Pro
130 135 140
Asp Phe Leu Pro Asp Glu Asp Lys Ser Thr Pro Leu His Asp Leu Leu
145 150 155 160
Ala Arg Val Glu Arg Glu Leu Pro Val Arg Leu Asp Gln Glu Arg Thr
165 170 175
Asp Met Val Val Cys His Gly Asp Pro Cys Met Pro Asn Phe Met Val
180 185 190
Asp Pro Lys Thr Leu Gln Cys Thr Gly Leu Ile Asp Leu Gly Arg Leu
195 200 205
Gly Thr Ala Asp Arg Tyr Ala Asp Leu Ala Leu Met Ile Ala Asn Ala
210 215 220
Glu Glu Asn Trp Ala Ala Pro Asp Glu Ala Glu Arg Ala Phe Ala Val
225 230 235 240
Leu Phe Asn Val Leu Gly Ile Glu Ala Pro Asp Arg Glu Arg Leu Ala
245 250 255
Phe Tyr Leu Arg Leu Asp Pro Leu Thr Trp Gly
260 265
<210> 60
<211> 319
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(2")-Ia amino acid sequence
<400> 60
Glu His Glu Leu His Glu Gly Lys Lys Glu Asp Cys Tyr Leu Met Glu
1 5 10 15
Tyr Arg Tyr Asp Asp Asn Ala Thr Asn Val Lys Ala Met Lys Tyr Leu
20 25 30
Ile Glu His Tyr Phe Asp Asn Phe Lys Val Asp Ser Ile Glu Ile Ile
35 40 45
Gly Ser Gly Tyr Asp Ser Val Ala Tyr Leu Val Asn Asn Glu Tyr Ile
50 55 60
Phe Lys Thr Lys Phe Ser Thr Asn Lys Lys Lys Gly Tyr Ala Lys Glu
65 70 75 80
Lys Ala Ile Tyr Asn Phe Leu Asn Thr Asn Leu Glu Thr Asn Val Lys
85 90 95
Ile Pro Asn Ile Glu Tyr Ser Tyr Ile Ser Asp Glu Leu Ser Ile Leu
100 105 110
Gly Tyr Lys Glu Ile Lys Gly Thr Phe Leu Thr Pro Glu Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Met Ser Glu Glu Glu Gln Asn Leu Leu Lys Arg Asp Ile Ala Ser
130 135 140
Phe Leu Arg Gln Met His Gly Leu Asp Tyr Thr Asp Ile Ser Glu Cys
145 150 155 160
Thr Ile Asp Asn Lys Gln Asn Val Leu Glu Glu Tyr Ile Leu Leu Arg
165 170 175
Glu Thr Ile Tyr Asn Asp Leu Thr Asp Ile Glu Lys Asp Tyr Ile Glu
180 185 190
Ser Phe Met Glu Arg Leu Asn Ala Thr Thr Val Phe Glu Gly Lys Lys
195 200 205
Cys Leu Cys His Asn Asp Phe Ser Cys Asn His Leu Leu Leu Asp Gly
210 215 220
Asn Asn Arg Leu Thr Gly Ile Ile Asp Phe Gly Asp Ser Gly Ile Ile
225 230 235 240
Asp Glu Tyr Cys Asp Phe Ile Tyr Leu Leu Glu Asp Ser Glu Glu Glu
245 250 255
Ile Gly Thr Asn Phe Gly Glu Asp Ile Leu Arg Met Tyr Gly Asn Ile
260 265 270
Asp Ile Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Gln Asp Ile Val Glu Glu Tyr Tyr
275 280 285
Pro Ile Glu Thr Ile Val Tyr Gly Ile Lys Asn Ile Lys Gln Glu Phe
290 295 300
Ile Glu Asn Gly Arg Lys Glu Ile Tyr Lys Arg Thr Tyr Lys Asp
305 310 315
<210> 61
<211> 332
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(4)-Ib amino acid sequence
<400> 61
Met Thr Gln Glu Ser Leu Leu Leu Leu Asp Arg Ile Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Ser Tyr Ala Ser Leu Arg Asn Asp Gln Glu Phe Trp Glu Pro Leu Ala
20 25 30
Arg Arg Ala Leu Glu Glu Leu Gly Leu Pro Val Pro Pro Val Leu Arg
35 40 45
Val Pro Gly Glu Ser Thr Asn Pro Val Leu Val Gly Glu Pro Asp Pro
50 55 60
Val Ile Lys Leu Phe Gly Glu His Trp Cys Gly Pro Glu Ser Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Ser Glu Ala Tyr Ala Val Leu Ala Asp Ala Pro Val Pro Val
85 90 95
Pro Arg Leu Leu Gly Arg Gly Glu Leu Arg Pro Gly Thr Gly Ala Trp
100 105 110
Pro Trp Pro Tyr Leu Val Met Ser Arg Met Thr Gly Thr Thr Trp Arg
115 120 125
Ser Ala Met Asp Gly Thr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Leu Ala
130 135 140
Arg Glu Leu Gly Arg Val Leu Gly Arg Leu His Arg Val Pro Leu Thr
145 150 155 160
Gly Asn Thr Val Leu Thr Pro His Ser Glu Val Phe Pro Glu Leu Leu
165 170 175
Arg Glu Arg Arg Ala Ala Thr Val Glu Asp His Arg Gly Trp Gly Tyr
180 185 190
Leu Ser Pro Arg Leu Leu Asp Arg Leu Glu Asp Trp Leu Pro Asp Val
195 200 205
Asp Thr Leu Leu Ala Gly Arg Glu Pro Arg Phe Val His Gly Asp Leu
210 215 220
His Gly Thr Asn Ile Phe Val Asp Leu Ala Ala Thr Glu Val Thr Gly
225 230 235 240
Ile Val Asp Phe Thr Asp Val Tyr Ala Gly Asp Ser Arg Tyr Ser Leu
245 250 255
Tyr Gln Leu His Leu Asn Ala Phe Arg Gly Asp Arg Glu Ile Leu Ala
260 265 270
Ala Leu Leu Asp Gly Ala Gln Trp Lys Arg Thr Glu Asp Phe Ala Arg
275 280 285
Glu Leu Leu Ala Phe Thr Phe Leu His Asp Phe Glu Val Phe Glu Glu
290 295 300
Thr Pro Leu Asp Leu Ser Gly Phe Thr Asp Pro Glu Glu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Phe Leu Trp Gly Pro Pro Asp Thr Ala Pro Gly Ala
325 330
<210> 62
<211> 341
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
APH(4)-Ia amino acid sequence
<400> 62
Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile
1 5 10 15
Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu
20 25 30
Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr
50 55 60
Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ala Gln
85 90 95
Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu
100 105 110
Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser
115 120 125
Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr
130 135 140
Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr
145 150 155 160
His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln
165 170 175
Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg
180 185 190
His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn
195 200 205
Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp
210 215 220
Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala
225 230 235 240
Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu
245 250 255
Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp
260 265 270
Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp
275 280 285
Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val
290 295 300
Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg
325 330 335
Pro Arg Ala Lys Glu
340
Claims (63)
- 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)로서, 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT):
(a) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 210에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(b) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 182에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(c) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(d) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216 및 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 261에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(e) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 218에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(f) 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36 및 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 아미노산 잔기 36에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 216에 상응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -. - 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)로서, 하기 (a) 내지 (f)를 갖는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT):
(a) 서열 번호 1의 위치 36 및 210에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 210에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환임 -;
(b) 서열 번호 1의 위치 36 및 182에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 182에서의 아미노산 치환은 아스파르트산으로의 치환임 -;
(c) 서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌으로의 치환임 -;
(d) 서열 번호 1의 위치 216 및 261에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 261에서의 아미노산 치환은 아스파라긴으로의 치환임 -;
(e) 서열 번호 1의 위치 36 및 218에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 218에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환임 -; 또는
(f) 서열 번호 1의 위치 36 및 216에서의 아미노산 치환 - 서열 번호 1의 위치 36에서의 아미노산 치환은 메티오닌으로의 치환이고, 서열 번호 1의 위치 216에서의 아미노산 치환은 글리신으로의 치환임 -. - 제1항에 있어서, 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지(selectable marker)로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제1항 또는 제3항에 있어서, 야생형 NPT는 서열 번호 1과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제2항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 야생형 NPT와 비교하여 선택성 표지로서의 약화된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포는, 25 μg/mL, 75 μg/mL, 또는 100 μg/mL의 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 48시간 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 형질감염 또는 형질전환된 세균 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며; 선택적으로 세균 세포는 대장균(E. coli)인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포는, 500 μg/mL의 게네티신(G418)을 함유하는 배지 내의 조직 배양 플레이트 상에서 2주 성장 후의 콜로니 형성 검정에 의한 평가 시, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 나타내며; 선택적으로, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니는, 동일한 발현 벡터이되, 야생형 NPT를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포의 G418 내성 콜로니에 비해 0.001% 내지 75% 범위의 빈도로 생산되는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제2항에 있어서, 서열 번호 38(V36M, G210A), 서열 번호 39(V36M, E182D), 서열 번호 40(V36M, Y218F), 서열 번호 41(D216G, D261N), 서열 번호 42(V36M, Y218S), 또는 서열 번호 43(V36M, D216G)의 아미노산 서열을 포함하는, 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT).
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 제11항에 있어서, 핵산 서열은 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고; 선택적으로, 제2 단백질은 치료적 단백질인, 핵산 서열.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 37의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 서열.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 NPT를 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 서열 또는 제14항의 벡터를 포함하는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
- 제16항에 있어서, 핵산 서열은 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함하고, 제2 단백질은 선택적으로 치료적 단백질이거나; 선택적으로, 제2 핵산 서열은 비-코딩 RNA를 인코딩하고; 선택적으로, 비-코딩 RNA는 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 세균, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포이고; 선택적으로, 포유동물 세포는 인간 세포인, 시험관내 또는 생체외 숙주 세포.
- 전이유전자가 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 전이유전자의 높은 복제수 및/또는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는 세포의 선택 방법으로서,
(a) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계:
(i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및
(ii) 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및
(b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 세포를 핵산 서열이 도입되었던 숙주 세포의 집단으로부터 선택하는 단계를 포함하는, 세포의 선택 방법. - 제20항에 있어서,
(a) 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에서의 전이유전자의 복제수와 비교하여 2배 내지 1000배 더 높은 복제수의 전이유전자를 포함하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질 및 전이유전자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되고/되거나;
(b) 선택된 세포는 네오마이신 포스포트렌스퍼라제 기질의 존재 하에 성장한 숙주 세포의 제2 집단의 선택에 따른 세포의 제2 세트에 의한 전이유전자의 발현 수준과 비교하여 10배 내지 1000배 더 높은 발현 수준의 전이유전자를 달성하며, 숙주 세포의 제2 집단은 야생형 NPT 단백질 및 전이유전자를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열로 형질감염 또는 형질전환되는, 세포의 선택 방법. - 제20항 또는 제21항에 있어서, 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포이고; 선택적으로, 포유동물 세포는 인간 세포인, 세포의 선택 방법.
- 제20항, 제21항, 또는 제22항에 있어서, 핵산 서열은 선택된 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는, 세포의 선택 방법.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 세포는 전이유전자의 높은 복제수를 갖는, 세포의 선택 방법.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 세포는 전이유전자의 높은 발현 수준을 갖는, 세포의 선택 방법.
- 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 세포는 이들의 게놈 DNA 내로 통합된 전이유전자의 5개 내지 100개의 복제물을 갖는, 세포의 선택 방법.
- 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 세포는 이들의 게놈 DNA 내로 통합된 전이유전자의 1개 내지 5개의 복제물을 갖는, 세포의 선택 방법.
- 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자는 바이러스 유전자 또는 성장 인자 유전자를 포함하거나, 전이유전자는 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하고; 선택적으로, 비-코딩 RNA는 안티센스 RNA, miRNA, shRNA, 긴 비-코딩 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, tRNA, 또는 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로, 단백질은 치료적 단백질 또는 항원인, 세포의 선택 방법.
- 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418인, 세포의 선택 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 선택성 표지로서 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법으로서,
(a) 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 트랜스포존을 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
(b) 세포를 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시키는 단계를 포함하는, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법. - 제30항에 있어서, 숙주 세포는 세균, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포이고; 선택적으로, 포유동물 세포는 인간 세포인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 플라스미드 또는 트랜스포존은 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고; 선택적으로, 단백질은 바이러스 단백질 또는 치료적 단백질이고; 선택적으로, 비-코딩 RNA는 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418인, 플라스미드 또는 트랜스포존의 사용 방법.
- 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
(a) (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계; - 선택적으로, 제2 단백질은 치료적 단백질 또는 항원이거나, 선택적으로, 비-코딩 영역은 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA임 -;
(b) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및
(c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법. - 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
(a) (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 공동 도입하는 단계; - 선택적으로, 제2 단백질은 치료적 단백질 또는 항원이거나, 선택적으로, 비-코딩 영역은 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA임 -;
(b) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계; 및
(c) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법. - 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
(a) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 숙주 세포의 집단은 (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 선택적으로, 제2 단백질은 치료적 단백질 또는 항원이거나, 선택적으로, 비-코딩 영역은 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA임 -; 및
(b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법. - 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포의 제작 방법으로서,
(a) 숙주 세포의 집단을 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장시켜서 콜로니를 생산하는 단계 - 숙주 세포의 집단은 (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 NPT를 인코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 서열 및 (ii) 제2 단백질 또는 비-코딩 RNA를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 선택적으로, 제2 단백질은 치료적 단백질 또는 항원이거나, 선택적으로, 비-코딩 영역은 shRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 크리스퍼 뉴클레아제를 위한 가이드 RNA, 촉매적 RNA, 리보좀 RNA, 또는 tRNA임 -; 및
(b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포의 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법. - 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포이고; 선택적으로, 포유동물 세포는 인간 세포인, 숙주 세포의 제작 방법.
- 제38항에 있어서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, CHO 세포, PER.C6 세포, 뮤린 NS0 세포, 섬유육종 HT-1080 세포, 뮤린 Sp2/0 세포, BHK 세포, 또는 뮤린 C127 세포인, 숙주 세포의 제작 방법.
- 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 세포의 콜로니를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 숙주 세포의 제작 방법.
- 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질은 네오마이신, 카나마이신, 또는 G418인, 숙주 세포의 제작 방법.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 숙주 세포.
- 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주의 제조 방법으로서,
(a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및 (ii) 치료적 단백질 또는 효소를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함함 -;
(b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
(c) 선택된 세포를 배양하여 치료적 단백질 또는 효소를 발현하는 안정한 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 안정한 세포주의 제조 방법. - 제43항에 있어서, 안정한 세포주는 치료적 단백질 또는 효소를 발현하며, 선택적으로, 치료적 단백질은 항체 또는 항체 단편인, 안정한 세포주의 제조 방법.
- 제43항 또는 제44항의 방법에 의해 생산되는 안정한 세포주.
- 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법으로서,
(a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및 (ii) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고, 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함함 -;
(b) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 기질의 존재 하에 성장하는 세포를 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
(c) 선택된 세포를 증식시켜서 바이러스 생산자 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법. - 제46항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질; AAV 캡시드 단백질 및 AAV rep 단백질; 외피 단백질; 아데노바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 E1 영역 단백질; 레트로바이러스 외피 단백질; 레트로바이러스 gag 단백질; 레트로바이러스 역전사 효소; 또는 레트로바이러스 외피 단백질, gag 단백질, 및 역전사 효소를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주의 제작 방법.
- 제46항 또는 제47항의 방법에 의해 제작되는 바이러스 생산자 세포주.
- 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산자 세포주로서, 하나 이상의 핵산 서열은 하기 (a) 및 (b)를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주:
(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 바이러스 단백질을 인코딩하는 제2 핵산 서열 - 하나 이상의 바이러스 단백질은 캡시드 단백질, 외피 단백질, 복제에 필요한 바이러스 단백질, 또는 이의 조합을 포함함 -. - 제49항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 단백질은 AAV 캡시드 단백질; AAV 캡시드 단백질 및 AAV rep 단백질; 외피 단백질; 아데노바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 E1 영역 단백질; 레트로바이러스 외피 단백질; 레트로바이러스 gag 단백질; 레트로바이러스 역전사 효소; 또는 레트로바이러스 외피 단백질, gag 단백질, 및 역전사 효소를 포함하는, 바이러스 생산자 세포주.
- 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법으로서,
(a) 하나 이상의 핵산 서열을 숙주 세포의 집단 내로 도입하는 단계 - 하나 이상의 핵산 서열은 (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및 (ii) 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 선택적으로, 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원, 또는 암 항원임 -;
(b) G418의 존재 하에 성장하는 세포를 단계 (a)의 세포의 집단으로부터 선택하는 단계; 및
(c) 선택된 세포를 배양하여 항원을 발현하는 세포주를 생산하는 단계를 포함하는, 항원을 발현하는 세포주의 제조 방법. - 제51항의 방법에 의해 제작되는, 항원 생산 세포주.
- 제43항, 제44항, 제46항, 제47항, 또는 제51항에 있어서, 세포주는 포유동물 세포주이고; 선택적으로, 포유동물 세포주는 인간 세포주인, 방법.
- 제43항, 제44항, 제46항, 제47항, 또는 제51항에 있어서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주인, 방법.
- 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 항원 생산 세포주로서, 하나 이상의 핵산 서열은,
(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)를 인코딩하는 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 선택적으로, 하나 이상의 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 진균 항원, 또는 암 항원인, 항원 생산 세포주. - 제45항, 제48항, 제49항, 제50항, 제52항, 또는 제55항에 있어서, 세포주는 포유동물 세포주이고; 선택적으로, 포유동물 세포주는 인간 세포주인, 방법.
- 제45항, 제48항, 제49항, 제50항, 제52항, 또는 제55항에 있어서, 세포주는 CHO, PER.C6, 뮤린 NS0, HEK293, 섬유육종 HT-1080, 뮤린 Sp2/0, BHK, 또는 뮤린 C127 세포주인, 방법.
- 세균 세포 내로 도입될 때 카나마이신에 대한 내성 및 포유동물 세포 내로 도입될 때 G418에 대한 내성을 부여하기 위한 선택성 표지 수단으로서, 선택적으로, 선택성 표지 수단은 서열 번호 20의 핵산 서열; 서열 번호 32의 핵산 서열; 서열 번호 33의 핵산 서열; 서열 번호 34의 핵산 서열; 서열 번호 36의 핵산 서열; 또는 서열 번호 37의 핵산 서열을 포함하는, 선택성 표지 수단.
- 생산자 세포주의 제조 방법으로서,
(a) 하나 이상의 바이러스 단백질, 및 형질전환되는 세포가 세균 세포인 경우는 카나마이신의 존재 하에 성장시키기 위한 수단 및 형질전환되는 세포가 포유동물 세포인 경우는 G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로, 세균 또는 포유동물 세포를 형질전환시켜서 형질전환된 세포를 제작하는 단계; 및
(b) 형질전환된 세포를 카나마이신 또는 G418의 존재 하에 배양하여 생산자 세포주를 수득하는 단계를 포함하며, 생산자 세포주는 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 바큘로바이러스로부터의 하나 이상의 바이러스 단백질을 발현하는, 생산자 세포주의 제조 방법. - 외인성 핵산 서열의 안정한 염색체 통합을 갖는 세포의 선택 방법으로서,
(a) 진핵 세포의 집단을, G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 포함하는 외인성 핵산 서열로 형질전환시키는 단계;
(b) 형질전환된 세포의 집단을 G418의 존재 하에 배양하여 G418의 존재 하에 성장할 수 있는 형질전환된 세포의 콜로니를 생산하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 생산된 콜로니로부터 세포를 선택하여 외인성 핵산의 안정한 염색체 통합을 갖는 세포를 수득하는 단계를 포함하며; 선택적으로, 외인성 핵산 서열은 전이유전자를 추가로 포함하고, 선택된 세포는 전이유전자를 발현하거나; 외인성 핵산 서열은 선택된 세포에 내인성인 유전자의 발현을 방해하는, 세포의 선택 방법. - 안정한 에피좀을 갖는 포유동물 세포의 선택 방법으로서,
(a) 포유동물의 세포의 집단을, G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 포함하는 플라스미드로 형질전환시키는 단계;
(b) 형질전환된 세포의 집단을 G418의 존재 하에 배양하여 G418의 존재 하에 성장할 수 있는 형질전환된 세포의 콜로니를 생산하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 생산된 콜로니로부터 세포를 선택하여 플라스미드를 포함하는 안정한 에피좀을 갖는 세포를 수득하는 단계를 포함하며; 선택적으로, 플라스미드는 EBNA1 OriP 핵산 서열을 추가로 포함하고, 선택된 세포는 EBNA1을 발현하는, 포유동물 세포의 선택 방법. - 전이유전자를 일시적으로 발현하는 포유동물 세포의 선택 방법으로서,
(a) 전이유전자 및 G418의 존재 하에 성장시키기 위한 수단을 인코딩하는 핵산을 포유동물의 세포의 집단 내로 도입하는 단계;
(b) 포유동물 세포의 집단을 G418의 존재 하에 48 내지 72시간 동안 배양하는 단계; 및
(c) G418의 존재 하에 성장하는 포유동물 세포를 포유동물 세포의 배양된 집단으로부터 선택하는 단계를 포함하며, 선택된 포유동물 세포는 전이유전자를 일시적으로 발현하고; 선택적으로, 전이유전자는 크리스퍼 엔도뉴클레아제 또는 크리스퍼 가이드 RNA를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 세포의 선택 방법. - 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 수단은, 서열 번호 38, 39, 40, 41, 42, 및 43의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 비-자연 발생 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인, 방법.
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