CN112899157A - 微流控芯片光刺激装置和酵母单细胞光调控基因表达方法及应用 - Google Patents

微流控芯片光刺激装置和酵母单细胞光调控基因表达方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微流控芯片光刺激装置和酵母单细胞光调控基因表达方法及应用。所述微流控芯片光刺激装置包括细胞培养芯片、用于维持活体细胞生长的培养操控单元以及光刺激单元。采用本发明的微流控芯片光刺激装置进行酵母单细胞光调控基因表达方法，采用该微流控芯片装置进行酵母细胞的显微镜测量，可以在单细胞水平上对单细胞进行定点定量光刺激，启动酵母特定基因表达，并在较长时间内收集酵母基因表达量变化所引起的信号变化。对多个酵母细胞进行的广泛刺激可以对细胞异质性响应进行统计分析，更全面地给出了细胞响应过程所对应的状态空间动力学轨迹，避免了群体响应结果的平均化信息损失。

Description

微流控芯片光刺激装置和酵母单细胞光调控基因表达方法及 应用
技术领域
本发明属于基因调控技术领域，具体涉及一种微流控芯片光刺激装置和酵母单细胞光调控基因表达方法及应用。
背景技术
在基因环路的研究中，由于生物系统具有随机性，所以细胞的状态在状态空间中是随机分布的。单细胞水平的观测能够给出具体每一个细胞的状态，对大量的单细胞状态进行统计可以得到细胞在某一个时期某一种环境下的状态分布。这一状态分布才严格地描述细胞在此种情况下的所有信息。而细胞的群体响应仅能给出细胞状态的平均值，无法反应细胞高维状态空间中不同状态之间的关系，甚至可能无法区分两个重叠的状态。例如，肿瘤细胞在癌变之后就持续地发生着突变，而每个细胞的突变都各不相同，只有理解这种基因突变的发生和发展机制才能理解癌症的转移和抗药性。因此近年来单细胞技术得到了飞速的发展，科学工作者开发了单分子荧光原位杂交、单细胞测序技术以及荧光相关光谱等多种检测手段，实现了对单细胞内的基因表达水平和蛋白质分布的检测，为理解细胞基因调控网络的动力学过程提供了重要信息，同时在肿瘤发生机制、细胞命运决定以及干细胞重编程等领域发挥了重要作用。
微流控芯片作为一种微量分析手段非常适合高通量的单细胞分析，因此发展了很多单细胞分析方法，如不同包载方法的细胞液滴技术、利用重力或流体力学卡口实现的单细胞捕捉技术、高通量单细胞测序技术等。在这些重要装置技术中，液滴技术包载率低，并且在长时间培养下细胞分裂之后聚集成团，无法在显微镜下区分单个细胞；利用重力或流体力学卡口实现的单细胞捕捉技术虽然对于哺乳动物细胞这种体积较大的很容易实现，但是对于酵母细胞这种球型的小细胞却很难做到；而高通量单细胞测序虽然能够得到单个细胞的大量转录组信息，但是却没有时间连续性，无法连续跟踪某个细胞的状态空间动力学轨迹。更重要的是，对于基因网络的研究需要得到细胞动力学过程的统计特征，这需要对大量的细胞进行高通量测量，而目前并没有一种廉价的方式进行大规模高通量的酵母单细胞培养。采用商业化的微流控芯片不仅需要购买价格几十万的培养操控设备，而且每个芯片的价格也有上千元，直接导致高通量测量的成本高昂，阻碍了对细胞基因网络动力学机制的研究。
另外一方面，细胞的基因网络本身是一个非常复杂的非线性动力学系统，为了研究基因环路的动力学特征，发展了多种扰动手段，如基因扰动方法、化学物质扰动方法和显微注射技术。在这些重要方法技术中，基因扰动方法通过基因敲除、基因过表达和基因突变改变细胞的表现型，然而因为这种方法作用于细胞整体并且效果缓慢，因而更加倾向于破坏细胞内分子相互作用网络的稳态而非对细胞内分子网络特定的局域位点进行调节，因此这种方法无法用来探究细胞内部的分子调控机制；化学物质扰动方法通过化学物质来扰动细胞内物质的浓度，诱导或者关闭基因表达，然而，化学扰动方法不能集中于特定的单一细胞，还受到时间分辨率的困扰，因为化学反应扰动的逆转需要物理地改变溶液条件；微注射技术本身对于实验手段要求很高，实验困难，并且是低通量的侵入性技术，而且仅仅对于特定的细胞有效。发展一种具有较高时间空间分辨率的无损基因调控方法已经成了现在的当务之急。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种微流控芯片光刺激装置和酵母单细胞光调控基因表达方法及应用，采用本发明的微流控芯片光刺激装置进行酵母细胞的显微镜测量，可以在单细胞水平上对单细胞进行定点定量光刺激，启动酵母特定基因表达，并在较长时间内收集酵母基因表达量变化所引起的信号变化。对多个酵母细胞进行的广泛刺激可以对细胞异质性响应进行统计分析，更全面地给出了细胞响应过程所对应的状态空间动力学轨迹，避免了群体响应结果的平均化信息损失。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种微流控芯片光刺激装置，包括细胞培养芯片、用于维持活体细胞生长的培养操控单元以及光刺激单元；
所述培养操控单元控制酵母细胞及培养基的输入，同时控制细胞的培养环境为恒温环境；
所述细胞培养芯片用于捕获通过所述培养操控单元控制输入的酵母细胞；
所述光刺激单元用于对酵母单细胞进行定点定量光刺激，启动酵母特定基因表达，并收集酵母基因表达量变化所引起的信号变化。
在上述技术方案中，所述细胞培养芯片包括用于捕获细胞的微台阵列，玻璃底板以及用于模拟血管流通的中间通道；所述微台阵列与所述玻璃底板键合在一起；所述微台阵列的材质为聚二甲基硅氧烷，所述微台阵列与所述玻璃底板之间的空隙为4微米。
在上述技术方案中，所述培养操控单元包括笼式恒温培养箱、与细胞培养芯片连通的第一微量注射泵和第二微量注射泵；所述笼式恒温培养箱为酵母细胞的培养提供恒温环境，所述第一微量注射泵用于注入酵母细胞，第二微量注射泵用于输入适当的培养基。
在上述技术方案中，所述光刺激单元包括激光耦合装置、激光控制装置、用于观察微流控芯片中细胞的显微镜以及用于成像的显微镜成像系统；
所述激光耦合装置包括反射镜、扩束器及滤色块；所述反射镜用于调整光路指向，所述扩束器用于增宽入射光宽度，滤色块用于反射激发光并透射检测光；为保证单细胞内定点定量光刺激，入射光与检测光必须在空间完全耦合；
所述激光控制装置包括激光器和数据板卡；所述数据板卡由电脑主机控制输出模拟或数字信号至激光器，所述激光器用于输出激光；
所述显微镜包括物镜，所述物镜用于将入射刺激光定点照射至酵母细胞；
所述显微镜成像系统包括集束器、共聚焦光子记录仪和电脑主机；所述集束器用于收集检测光信号，所述共聚焦光子记录仪用于记录检测光信息，电脑主机用于控制数据传递和数据收集。
本发明提供一种采用微流控芯片光刺激装置进行酵母单细胞光调控基因表达方法，包括：
光敏分子元件的导入；
光调控酵母基因表达；
记录响应信号。
在上述技术方案中，所述光敏分子元件的导入的方法包括：将光致构象转变的光敏感蛋白用同源重组的方式插入酵母基因组中，并在光刺激下生成异源二聚体。
在上述技术方案中，所述光调控酵母基因表达的方法包括：将转录因子和DNA结合域分别耦合在一对相互作用的光敏感蛋白上，其中第一个光敏感蛋白定位在转录因子结合位点附近，第二个光敏感蛋白在光刺激下与第一个光敏感蛋白结合，提高与转录因子结合在转录因子结合位点上的概率，诱导基因转录。
在上述技术方案中，所述记录响应信号的方法包括：采用不同时序信号序列及输入光功率强度对细胞进行光刺激，并实时记录细胞内响应信号的变化。
在上述技术方案中，注入所述细胞培养芯片的酵母细胞密度为105-106个/毫升，细胞注入流速为0.5毫升/分钟，细胞培养基注入流速为0.1毫升/分钟。
本发明还提供一种微流控芯片光刺激装置或上述的酵母单细胞光调控基因表达方法在光调控基因表达中的应用。
本发明具有以下的有益效果：
1、本发明的微流控芯片光刺激装置集细胞培养与光刺激基因表达扰动和在线实时监测响应信号于一体，可以对微流控细胞培养芯片中捕获的酵母细胞进行定点定量的光刺激，产生定量的扰动，实现对基因环路的定量调控和单细胞持续测量。
2、本发明的微流控芯片光刺激装置通过使用微流控细胞培养芯片技术可以对酵母单细胞进行长时间培养，满足单细胞水平下检测细胞寿命、细胞周期、新陈代谢、反馈环路和信号传导等各种实验需求。
3、本发明采用微流控芯片光刺激装置进行酵母单细胞光调控基因表达方法，采用该微流控芯片装置进行酵母细胞的显微镜测量，可以在单细胞水平上对单细胞进行定点定量光刺激，启动酵母特定基因表达，并在较长时间内收集酵母基因表达量变化所引起的信号变化。对多个酵母细胞进行的广泛刺激可以对细胞异质性响应进行统计分析，更全面地给出了细胞响应过程所对应的状态空间动力学轨迹，避免了群体响应结果的平均化信息损失。
4、本发明中的光敏感蛋白可以替换为其他光敏感蛋白，可根据具体的实验需求而定。
5、本发明中的基因表达产物也可以替换为细胞内源或外源的任意一段基因序列，并且可以定量控制表达水平，可以用于细胞毒性或定向进化实验。
6、本发明极大地降低了实验成本。采用模拟信号进行激光器控制，并利用自制微流控芯片取代目前市场上的微流控装置，可以方便地开展大规模高通量测量，并得到对基因环路动力学过程的完整统计描述。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明实施例1提供的微流控芯片光刺激装置的结构示意图；
图2为本发明实施例1提供的细胞培养芯片结构示意图；
图3为本发明实施例2提供的酵母细胞实时培养观测图像；
图4为本发明所述酵母单细胞光调控基因表达方法的原理示意图；
图5为本发明实施例3提供的酵母细胞在光刺激下表达绿色荧光蛋白；
图6为本发明实施例4提供的酵母细胞在实施例1提供的微流控芯片光刺激装置下表达挂膜绿色荧光蛋白图像。
图中的附图标记表示为：
1-细胞培养芯片，2-电动载物台，3-笼式恒温培养箱，4-物镜，5-第一微量注射泵，6-第二微量注射泵，7-激光器，8-数据板卡，9-反射镜，10-扩束器，11-滤色块，12-集束器，13-共聚焦光子记录仪，14-电脑主机；
101-微台阵列，102-中间通道，103-玻璃底板。
具体实施方式
本发明提供一种新的微流控芯片光刺激装置，采用该微流控芯片装置进行酵母细胞的显微镜测量，可以在单细胞水平上对单细胞进行定点定量光刺激，启动酵母特定基因表达，并在较长时间内收集酵母基因表达量变化所引起的信号变化。对多个酵母细胞进行的广泛刺激可以对细胞异质性响应进行统计分析，更全面地给出了细胞响应过程所对应的状态空间动力学轨迹，避免了群体响应结果的平均化信息损失。
本发明第一方面提供一种微流控芯片光刺激装置，包括细胞培养芯片1和用于维持活体细胞生长的培养操控单元以及光刺激单元；所述培养操控单元控制酵母细胞及培养基的输入，同时控制细胞的培养环境为恒温环境；所述细胞培养芯片1用于捕获通过所述培养操控单元控制输入的酵母细胞；所述光刺激单元用于对酵母单细胞进行定点定量光刺激，启动酵母特定基因表达，并收集酵母基因表达量变化所引起的信号变化。
本发明中，所述细胞培养芯片1包括用于捕获细胞的微台阵列101，玻璃底板103以及用于模拟血管流通的中间通道102；所述微台阵列101与所述玻璃底板103键合在一起，所述微台阵列101为聚二甲基硅氧烷芯片，所述微台阵列101与所述玻璃底板103之间的空隙为4微米。优选为具有六个中间通道102和六个位于中间通道102两侧的微台阵列101。
本发明中，所述培养操控单元包括输入营养物质的灌流系统以及保持温度恒定的笼式恒温培养箱3；进一步的灌流系统包括第一微量注射泵5和第二微量注射泵6，分别用于控制灌流系统酵母细胞输入及培养基输入的流速；进一步的所述培养操控单元还包括用于控制笼式恒温培养箱3的恒温恒湿系统和二氧化碳空气系统。例如恒温空气加热装置。
本发明中，所述光刺激单元包括激光耦合装置、激光控制装置、用于观察微流控芯片中细胞的显微镜以及用于成像的显微镜成像系统；
进一步的，所述激光耦合装置包括反射镜9、扩束器10及滤色块11；所述反射镜9用于调整光路指向，所述扩束器10用于增宽入射光宽度，滤色块11用于多个不同波长激光耦合、反射激发光并透射检测光；为保证单细胞内定点定量光刺激，入射光与检测光必须在空间完全耦合；
进一步的，所述激光控制装置包括激光器7和用于激光器信号通讯的数据板卡8；所述激光器7用于输出激光，所述数据板卡8由电脑主机14控制输出模拟或数字信号至激光器7；例如所述数据板卡8为模拟或数字信号输出板卡，根据不同激光器型号选择。
所述显微镜包括物镜4，所述物镜4用于将入射刺激光定点照射至酵母细胞；
所述显微镜成像系统包括集束器12、共聚焦光子记录仪13和电脑主机14；所述集束器12用于收集检测光信号，所述共聚焦光子记录仪13用于记录检测光信息，电脑主机14用于控制数据传递和数据收集。
根据本发明所述的装置的一些实施方式，所述光刺激单元还包括激光LED切换单元。
进一步的，所述激光LED切换单元包括固定架和控制平台，其中所述固定架用于LED灯的固定，所述控制平台用于切换LED灯刺激与激光刺激。
本发明第二方面提供一种采用上述的微流控芯片光刺激装置进行酵母单细胞光调控基因表达的方法，包括：光敏分子元件的导入；光调控酵母基因表达；记录响应信号。
根据本发明所述的酵母单细胞光调控基因表达的方法的一些实施方式，注入所述细胞培养芯片的细胞密度为105-106个/毫升，细胞注入流速为0.5毫升/分钟。细胞密度乘以流速等于单位时间内注入的细胞总量。单位时间内注入细胞总量过小时，细胞将较难被微流控微台阵列捕获，较难获得适宜检测的目标活体单细胞。单位时间内注入细胞总量过大时，每个微台阵列都将捕获多个细胞，且细胞会堆积在微台前侧，导致后续实验中细胞堆积，无法进行长时间培养。因此，在本发明优选的细胞密度和流速下，检测效果更佳。
根据本发明所述的酵母单细胞光调控基因表达的方法的一些实施方式，细胞培养基注入流速为0.1毫升/分钟。流速过低，新生成的子细胞无法被冲走，导致细胞堆积，无法进行长时间培养。流速过快，已经被捕获的细胞也将被冲走，导致检测目标丢失。因此，在本发明优选的培养基注入流速下，检测效果更佳。
根据本发明所述的酵母单细胞光调控基因表达的方法的一些实施方式，所述光敏分子元件的导入方法包括将光致构象转变的光敏感蛋白用同源重组的方式插入酵母基因组中，并在光刺激下生成异源二聚体。
根据本发明所述的酵母单细胞光调控基因表达的方法的一些实施方式，所述光调控酵母基因表达方法是将转录因子和DNA结合域分别耦合在一对相互作用的光敏感蛋白上，其中第一个光敏感蛋白定位在转录因子结合位点附近，第二个光敏感蛋白在光刺激下与第一个光敏感蛋白结合，提高与转录因子结合在转录因子结合位点上的概率，诱导基因转录。该过程可以如图4所示。
根据本发明所述的酵母单细胞光调控基因表达的方法的一些实施方式，所述记录响应信号的方法包括采用不同时序信号序列及输入光功率强度对细胞进行光刺激，并实时记录细胞内响应信号的变化。
根据本发明所述的酵母单细胞光调控基因表达的方法的一些实施方式，细胞培养芯片1中培养的酵母细胞可以为荧光标记或者不经过荧光标记的酵母细胞，具体根据实验需要而定。对细胞中具体蛋白的荧光标记也依实验需要而定，例如可以为光调控基因表达产物，也可以为光调控基因表达产物的下游效应基因。
本发明第三方面提供了上述的微流控芯片光刺激装置或上述的酵母单细胞光调控基因表达方法在光调控基因表达中的应用。
以下实施例中涉及到的物质含义解释如下：
(1)PIF3，来源于拟南芥，是一种光敏色素作用因子，是一种植物转录因子，能直接与光敏化的光敏色素的活化形式结合形成异源二聚体；
(2)VP16，来源于单纯疱疹病毒,是一种转录激活蛋白质功能域，用于在被感染的细胞内促进一些基因的表达；
(3)NPhyB，来源于拟南芥，是一种光敏色素，能够在波长650～680nm的红光照射下转换为光敏化状态，并在波长710～740nm的远红光照射下逆转光敏化状态；
(4)lexA-DBD，来源于原核生物，是一种DNA序列识别蛋白功能域，能够识别特定序列的DNA序列，单独的DBD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录；
(5)TATAbox，TATA框是构成真核生物启动子的元件之一。其一致顺序为TATAATAAT(非模板链序列)。它约在多数真核生物基因转录起始点上游约-30bp(-25至-32bp)处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录；
(6)EGFP，增强绿色荧光蛋白，EGFP是GFP突变系，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上；
(7)GAL2，来源于酿酒酵母半乳糖代谢调控系统，是一种细胞膜定位蛋白。
【实施例1】
一种微流控芯片光刺激装置，如图1所示，该装置包括细胞培养芯片1和用于维持活体细胞生长的培养操控单元以及光刺激单元。细胞培养芯片1包括用于捕获细胞的微台阵列101，玻璃底板103以及用于模拟血管流通的中间通道102。细胞培养芯片1的CAD俯视视图如图2所示，每个细胞培养芯片1包含六个独立通道。微台阵列101的材质为聚二甲基硅氧烷，与玻璃底板103之间空隙为4微米。所述细胞培养芯片1置于电动载物台2上。培养操控单元包括笼式恒温培养箱3，为酵母细胞的培养提供恒温环境，培养操控单元还包括与细胞培养芯片1连通的第一微量注射泵5和第二微量注射泵6，第一微量注射泵5用于注入酵母细胞，第二微量注射泵6用于输入适当的培养基。光刺激单元包括激光耦合装置、激光控制装置、用于观察细胞培养芯片1中细胞的显微镜以及用于成像的显微镜成像系统。激光耦合装置包括反射镜9、扩束器10及滤色块11；反射镜9用于调整光路指向，扩束器10用于增宽入射光宽度，滤色块11用于反射激发光并透射检测光，集束器12用于汇聚检测光束。为保证单细胞内定点定量光刺激，入射光与检测光必须在空间完全耦合。激光控制装置包括激光器7、数据板卡8和电脑主机14，激光器7用于输出激光，数据板卡8用于输出模拟或数字信号至激光器7，电脑主机14用于控制数据板卡8。显微镜包括物镜4，物镜4用于将入射刺激光定点照射至酵母细胞。显微镜成像系统包括集束器12、共聚焦光子记录仪13、电脑主机14，集束器12用于收集检测光信号，共聚焦光子记录仪13用于记录检测光信息，电脑主机14用于控制数据传递和数据收集。
【实施例2】
酿酒酵母细胞W303-1a经过夜培养后经过600纳米吸光度测量获得细胞密度约为5.5×105个/毫升，以0.5毫升/分钟流速将酵母细胞悬浮液注入微流控细胞培养芯片中，并通过显微镜观察细胞捕获情况。随后以0.1毫升/分钟流速通入酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，于30℃下，以明场LED灯光源作为照明条件下酵母生长图像。结果如图3所示。图3中，左上角时间表示从通入酵母培养基之后所经过时间，白色剪头表示细胞直径较小的酵母细胞，例如新分裂的子代细胞，脱离细胞培养芯片1的微台阵列101，因此不会造成细胞堆积问题。从图3能够看出，酵母细胞在微台阵列101下面可以正常生长并分裂增值，表明细胞培养芯片1可以用于酵母细胞的长时间培养并且不会对生长造成显著影响。
【实施例3】
利用同源重组构建光刺激响应的酿酒酵母细胞样品，原理图如图4所示。使用PIF3蛋白连接VP16激活域组成第一个组件，NPhyB与lexA-DBD DNA结合域组成第二个组件。NPhyB在660纳米激光的刺激下发生构象变化，并与PIF3结合，激活下游基因表达。而在远红外光740纳米的刺激下，NPhyB与PIF3解结合，下游基因表达停止。
具体过程如下：
(1)构建包含PIF3-VP16，NPhyB-lexA-DBD以及TATAbox-EGFP的转染质粒；
(2)配置1摩尔/升乙酸锂制备酵母感受态细胞，并在42℃下混合转染质粒与感受态细胞一分钟；
(3)在适当的筛选条件下筛选阳性克隆；
(4)测序验证基因组编辑的发生位置；
(5)实时定量DNA聚合酶链式扩增确定阳性克隆拷贝数。
(6)过夜培养的阳性克隆酵母细胞W303-1a经过600纳米吸光度测量并稀释至5×105个/毫升，以0.5毫升/分钟流速将酵母细胞悬浮液注入细胞培养芯片1中，并通过显微镜观察细胞捕获情况。
(7)以0.1毫升/分钟流速通入酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，于30℃下，持续照射1毫瓦660纳米激光，并以5毫瓦488纳米激光作为荧光蛋白激发光源，每隔20分钟拍摄当前视野绿色荧光蛋白的表达情况。
图5为采用NIKON Ti2荧光显微镜和NIKON C2共聚焦成像系统所拍摄酵母细胞在660纳米光刺激下的绿色荧光蛋白表达情况。可以看到在受到光刺激之后，酵母细胞内开始启动绿色荧光蛋白的转录和翻译，并逐渐积累，最后在160分钟左右达到蛋白质表达峰值，并保持稳定。
【实施例4】
采用实施例1的装置进行光刺激酵母基因表达的响应检测：
(1)将TATAbox-EGFP的转染质粒替换为TATAbox-GAL2-EGFP，并进行如实施例3所述基因组编辑与阳性克隆筛选；
(2)过夜培养的阳性克隆酵母细胞W303-1a经过600纳米吸光度测量并稀释至5×105个/毫升，以0.5毫升/分钟流速将酵母细胞悬浮液注入细胞培养芯片1中，并通过显微镜观察细胞捕获情况。
(3)以0.1毫升/分钟流速通入酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，于30℃下，持续照射1毫瓦660纳米激光，并以5毫瓦488纳米激光作为荧光蛋白激发光源，30分钟后拍摄当前视野绿色荧光蛋白的表达情况。
图6为采用NIKON Ti2荧光显微镜和NIKON C2共聚焦成像系统所拍摄酵母细胞在660纳米光刺激30分钟后的绿色荧光蛋白表达情况。可以看到在受到光刺激之后，酵母细胞内开始启动包含膜定位蛋白的绿色荧光蛋白复合体的表达，并积累于细胞膜上。此时酵母细胞内积累的绿色荧光蛋白较少，但因为全部积累在细胞膜上，因此可以形成图中所示的点状信号分布。利用这一方式，可以采用实施例1的装置进行光刺激酵母基因表达的单分子检测。
通过实施例2-4能够看出，本发明的微流控芯片光刺激装置可以长时间地对酵母细胞进行实时培养，并能够利用光信号启动酵母细胞内的基因表达，并实现对光刺激后酵母细胞的蛋白质含量的长时间检测。另外，如实施例4所述，本发明也可应用于酵母细胞内单分子水平的基因表达动力学分析。
以上所述的仅是本发明的优选实例。应当指出对于本领域的普通技术人员来说，在本发明所提供的技术启示下，作为本领域的公知常识，还可以做出其它等同变型和改进，也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片光刺激装置，其特征在于，包括细胞培养芯片、用于维持活体细胞生长的培养操控单元以及光刺激单元；
所述培养操控单元控制酵母细胞及培养基的输入，同时控制细胞的培养环境为恒温环境；
所述细胞培养芯片用于捕获通过所述培养操控单元控制输入的酵母细胞；
所述光刺激单元用于对酵母单细胞进行定点定量光刺激，启动酵母特定基因表达，并收集酵母基因表达量变化所引起的信号变化。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片光刺激装置，其特征在于，所述细胞培养芯片包括用于捕获细胞的微台阵列，玻璃底板以及用于模拟血管流通的中间通道；所述微台阵列与所述玻璃底板键合在一起；所述微台阵列的材质为聚二甲基硅氧烷，所述微台阵列与所述玻璃底板之间的空隙为4微米。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片光刺激装置，其特征在于，所述培养操控单元包括笼式恒温培养箱、与细胞培养芯片连通的第一微量注射泵和第二微量注射泵；所述笼式恒温培养箱为酵母细胞的培养提供恒温环境，所述第一微量注射泵用于注入酵母细胞，第二微量注射泵用于输入适当的培养基。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片光刺激装置，其特征在于，所述光刺激单元包括激光耦合装置、激光控制装置、用于观察微流控芯片中细胞的显微镜以及用于成像的显微镜成像系统；
所述激光耦合装置包括反射镜、扩束器及滤色块；所述反射镜用于调整光路指向，所述扩束器用于增宽入射光宽度，滤色块用于反射激发光并透射检测光；
所述激光控制装置包括激光器和数据板卡；所述数据板卡由电脑主机控制输出模拟或数字信号至激光器，所述激光器用于输出激光；
所述显微镜包括物镜，所述物镜用于将入射刺激光定点照射至酵母细胞；
所述显微镜成像系统包括集束器、共聚焦光子记录仪和电脑主机；所述集束器用于收集检测光信号，所述共聚焦光子记录仪用于记录检测光信息，电脑主机用于控制数据传递和数据收集。
5.一种采用权利要求1所述的微流控芯片光刺激装置进行酵母单细胞光调控基因表达方法，包括：
光敏分子元件的导入；
光调控酵母基因表达；
记录响应信号。
6.根据权利要求5所述的酵母单细胞光调控基因表达方法，其特征在于，所述光敏分子元件的导入的方法包括：将光致构象转变的光敏感蛋白用同源重组的方式插入酵母基因组中，并在光刺激下生成异源二聚体。
7.根据权利要求5所述的酵母单细胞光调控基因表达方法，其特征在于，所述光调控酵母基因表达的方法包括：将转录因子和DNA结合域分别耦合在一对相互作用的光敏感蛋白上，其中第一个光敏感蛋白定位在转录因子结合位点附近，第二个光敏感蛋白在光刺激下与第一个光敏感蛋白结合，提高与转录因子结合在转录因子结合位点上的概率，诱导基因转录。
8.根据权利要求5所述的酵母单细胞光调控基因表达方法，其特征在于，所述记录响应信号的方法包括：采用不同时序信号序列及输入光功率强度对细胞进行光刺激，并实时记录细胞内响应信号的变化。
9.根据权利要求5所述的酵母单细胞光调控基因表达方法，其特征在于，注入所述细胞培养芯片的酵母细胞密度为105-106个/毫升，细胞注入流速为0.5毫升/分钟，细胞培养基注入流速为0.1毫升/分钟。
10.一种权利要求1-4任意一项所述的微流控芯片光刺激装置或者权利要求5-9任意一项所述的酵母单细胞光调控基因表达方法在光调控基因表达中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874907A (zh) * 2022-03-15 2022-08-09 华东师范大学 一种体外探测电磁暴露细胞生物效应的系统

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030082809A1 (en) * 2001-08-23 2003-05-01 Quail Peter H. Universal light-switchable gene promoter system
CN1712939A (zh) * 2004-06-22 2005-12-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法
US20070292838A1 (en) * 2005-01-27 2007-12-20 Politecnico Di Milano System and method for stimulation and optical surveying in a non invasive manner of the electrical activity of at least a cell
CN102643852A (zh) * 2011-02-28 2012-08-22 华东理工大学 光可控的基因表达系统
CN104232483A (zh) * 2014-09-04 2014-12-24 中国科学院深圳先进技术研究院 一种用于光感基因调控的微流控分光波导结构
CN104694372A (zh) * 2015-03-09 2015-06-10 东南大学 一种垂直捕获裂殖酵母细胞的微流控芯片及方法
CN106520537A (zh) * 2016-10-21 2017-03-22 南通大学 一种t细胞免疫应答的微流控光学分析系统及分析方法
CN108865822A (zh) * 2018-07-20 2018-11-23 大连理工大学 一种实现高通量单细胞捕获与力学特性分析的微流控芯片
CN109311931A (zh) * 2016-04-07 2019-02-05 何塞·L·阿瓦洛斯 用于生产化学物质的光基因控制代谢途径的系统和方法
CN109596838A (zh) * 2018-12-17 2019-04-09 中国科学院电子学研究所 一种单细胞内多种蛋白同时定量检测系统及方法
US20200286580A1 (en) * 2017-10-30 2020-09-10 Institute Of Science And Technology Austria (Ist Austria) System and method for engineering, testing and modelling a biological circuit
CN111808750A (zh) * 2020-07-15 2020-10-23 清华大学 一种微流控芯片装置和活体单细胞原位检测方法及应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030082809A1 (en) * 2001-08-23 2003-05-01 Quail Peter H. Universal light-switchable gene promoter system
CN1712939A (zh) * 2004-06-22 2005-12-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于激光诱导荧光的细胞成像方法
US20070292838A1 (en) * 2005-01-27 2007-12-20 Politecnico Di Milano System and method for stimulation and optical surveying in a non invasive manner of the electrical activity of at least a cell
CN102643852A (zh) * 2011-02-28 2012-08-22 华东理工大学 光可控的基因表达系统
CN104232483A (zh) * 2014-09-04 2014-12-24 中国科学院深圳先进技术研究院 一种用于光感基因调控的微流控分光波导结构
CN104694372A (zh) * 2015-03-09 2015-06-10 东南大学 一种垂直捕获裂殖酵母细胞的微流控芯片及方法
CN109311931A (zh) * 2016-04-07 2019-02-05 何塞·L·阿瓦洛斯 用于生产化学物质的光基因控制代谢途径的系统和方法
CN106520537A (zh) * 2016-10-21 2017-03-22 南通大学 一种t细胞免疫应答的微流控光学分析系统及分析方法
US20200286580A1 (en) * 2017-10-30 2020-09-10 Institute Of Science And Technology Austria (Ist Austria) System and method for engineering, testing and modelling a biological circuit
CN108865822A (zh) * 2018-07-20 2018-11-23 大连理工大学 一种实现高通量单细胞捕获与力学特性分析的微流控芯片
CN109596838A (zh) * 2018-12-17 2019-04-09 中国科学院电子学研究所 一种单细胞内多种蛋白同时定量检测系统及方法
CN111808750A (zh) * 2020-07-15 2020-10-23 清华大学 一种微流控芯片装置和活体单细胞原位检测方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
魏琪瑶等: "光遗传学工具的开发及其应用研究", 《生物工程学报》 *
黄培元等: "基于光控蛋白质相互作用的光遗传学技术及其应用", 《中国激光》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874907A (zh) * 2022-03-15 2022-08-09 华东师范大学 一种体外探测电磁暴露细胞生物效应的系统
CN114874907B (zh) * 2022-03-15 2023-06-23 华东师范大学 一种体外探测电磁暴露细胞生物效应的系统

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