CN102758018B - 结合叶绿素荧光技术和原生质体系统研究光合作用的方法及其应用 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了结合叶绿素荧光技术和原生质体系统研究光合作用的方法及其应用。通过在原生质体中瞬时表达或沉默一个或多个基因，之后利用调制叶绿素荧光成像仪测定拟南芥叶肉细胞原生质体叶绿素荧光变化，并对其图像进行对比，可以快速、高通量地筛选出与光合作用相关的基因。
Description
技术领域
本发明涉及一种科研用方法，特别涉及一种用于研究光合作用的方法。
背景技术
植物的生长发育离不开光合作用，光合作用是生物界所有物质代谢和能量代谢的物质基础，它包括一系列光物理、光化学和生物化学转变的复杂过程。对光合作用的研究有助于人们更为深入地了解光合作用的过程，进而有目的地对植株，特别是农作物进行转基因处理，以提高光合作用的效率。
目前，研究参与光合作用的基因功能，主要通过稳定转化获得过表达、干涉植株，或是通过突变体，周期长，工作量大。这种研究方法效率低，很难高效地筛选出与光合作用有关的基因。
原生质体是植物细胞除去细胞壁后，由细胞质膜包裹着的那部分具有生物活性的物质。随着多种原生质体分离酶，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶、崩溃酶等的发现，在实验室条件下大量制备高活性的原生质体已发展成为一种常规技术。已经分离得到许多植物材料的原生质体。Yoo等报道了一种利用纤维素酶R-10以及离析酶R-10分离原生质体的方法(Yoo, S.D., Cho, Y.H., and Sheen, J. (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565-1572.)。现阶段，通过优化酶解拟南芥材料的酶液体系，摸索酶解时间，改良原生质体制备过程中的关键步骤，比如：离心，过滤等可以方便而又快速地获得大量具有很强光合活性的原生质体(Riazunnisa, K., Padmavathi, L., Scheibe, R., and Raghavendra, A.S. (2007). Preparation of Arabidopsis mesophyll protoplasts with high rates of photosynthesis. Physiol Plantarum 129, 679-686)。
原生质体瞬时表达技术是以原生质体为转化受体，通过一定的方法将外源基因导入原生质体内，使外源基因得以快速表达，并且能在短期内维持表达水平的技术。
原生质体瞬时表达技术与传统的稳定转化技术相比，主要的不同之处在于稳定转化将外源基因转化进入植物体内，并整合到植物基因组中，因此基因信息可遗传；而在原生质体瞬时表达系统中，则是将外源基因构建到载体质粒上，转化后在原生质体中瞬时表达，不整合到植物基因组中，也不产生可遗传后代。现阶段，尽管传统的稳定转化已经不存在技术问题 ，但是稳定转化周期长，需要繁琐的工作来鉴定转基因植物，工作量大，外源基因表达不稳定且效率低，因而满足不了目的基因的高通量功能分析的需求。此外，部分基因的突变体植株或者过表达植株会突变致死，这使得这类基因的研究工作受到限制。以原生质体为转化受体的基因瞬时表达技术的产生，有利于缓解这种需求，已成为目前分子生物学研究中的重要技术手段(Sheen， 2001)。
有关原生质体瞬时表达技术的最早报道是1969年，Aoki和Takebe利用烟草叶肉细胞原生质体和烟草花叶病毒第一次成功地将外源核酸引入原生质体(Aoki and Takebe， 1969)。此后，出现了多种DNA瞬时转化方法，比如，聚乙二醇（PEG）转化法、电激转化法、基因枪转化法等，使得DNA瞬时转化效率得到很大的提高，在此基础上，可以制备多种植物材料的原生质体，转化目的基因，研究基因定位、基因功能和信号通路(Yoo et al.， 2007; Zhang et al.， 2011)。而随着一些新的、经济敏感的报告基因如：β-葡萄糖醛酸酶（GUS）、荧光素酶（LUC）以及绿色荧光蛋白（GFP）被引入原生质体瞬时表达系统，可以根据报告基因活性来反映外源基因的表达水平，原生质体瞬时表达系统也因此得到更为广泛的使用(Sheen， 2001)。
拟南芥叶肉细胞原生质体广泛应用于基因瞬时表达研究(Yoo et al.， 2007)，信号通路研究(Sheen， 2001)，离子通道研究(Lemtiri-Chlieh and Berkowitz， 2004; Qi et al.， 2004)以及分子生物学等方面的研究(An et al.， 2003; Baek et al.， 2004; Lemtiri-Chlieh and Berkowitz， 2004; Kim et al.， 2006)。
调制叶绿素荧光成像系统具有测量快速、简单、可靠、针对活体且测量过程对样品生长基本无影响等特点，被广泛应用于藻类及其他高等植物的生理、生态学研究。如，用于筛选叶绿素荧光参数发生变化的突变体，进行遗传育种。Niyogi 等根据NPQ参数的差异，做了莱茵衣藻光合突变体的筛选工作；他们也用同样的方法，以拟南芥为材料作了筛选工作，共鉴定出13个NPQ发生变化的突变体，筛选到了藻类和拟南芥的叶黄素循环突变体(Niyogi et al.， 1997; Niyogi et al.， 1998)。此外，也可利用调制叶绿素荧光成像系统筛选虽然影响植物代谢及生长但不直接参与光合作用的突变体(Barbagallo et al.， 2003)。因为调制叶绿素荧光成像系统能通过成像的方式直观地反映叶绿素荧光参数的差异及变化，不仅可以检测叶片光合作用的横向异质性，还可检测早期肉眼不可见的胁迫损伤，甚至是阐明损伤机理和调节机制。有报道调制叶绿素荧光成像系统能应用于冻害影响的直观定量(Ehlert and Hincha， 2008)，并能够定量评估拟南芥干旱处理后的存活时间(Woo et al.， 2008)。又由于调制叶绿素荧光成像系统成像面积较大，可同时测量多个微藻样品，因此在生态毒理学领域也具有较大的应用(Escher et al.， 2006)。可直观的检测植物光合作用相关的生理指标，研究生理过程(Muller et al.， 2001; Gould et al.， 2010)。
尽管如此，至今没有通过测定拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达系统的叶绿素荧光来研究光合作用的相关方法报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的光合作用研究方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种研究光合作用相关功能基因的方法，包括如下步骤：
1) 制备含有叶绿体的原生质体，并将待测基因和/或反义核酸序列转入原生质体并确认待测基因可瞬时表达和/或反义核酸序列已使基因表达瞬时沉默；
2) 将转入有待测基因和/或反义核酸序列的原生质体和对照原生质体进行暗适应处理；
3) 将暗适应处理的原生质体进行光照处理，获取其荧光图像和/或荧光参数，或基于荧光图像和/或荧光参数绘制叶绿素荧光诱导动力学曲线和/或光诱导曲线；
4) 对比不同处理组的荧光图像、荧光参数、叶绿素荧光诱导动力学曲线、光诱导曲线中的至少一种，判断待测基因和/或反义核酸序列对光合作用的影响，确定其是否为光合作用相关基因。
转入原生质体的待测基因和/或反义核酸序列至少为一种。
优选的，暗适应处理的时间为8～12 min。
优选的，测定叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线的程序为：
1) 打开不足以使原生质体进行光合作用的微弱测量光，测得最小荧光F0；
2) 随后施加一个饱和脉冲，关闭所有的电子门，暂时抑制植物的光合作用，得到最大荧光Fm；
3) 打开光化光，使原生质体光合作用，施加饱和脉冲后，得到的叶绿素荧光为光化光下最大荧光Fm’；
4) 待饱和脉冲处理后，叶绿素荧光值达到稳态之后，关闭光化光，同时打开远红光，使电子门回到开放态，F 回到最小荧光F0 附近，此时得到的荧光为F0’。
优选的，原生质体为拟南芥叶肉细胞原生质体。
本发明的有益效果是：
本发明方法利用原生质体瞬时表达技术结合荧光分析技术，可以快速测定待测基因对光合作用的影响，有助于人们更为快速、方便地对光合作用相关基因进行研究。本发明方法可以同时对多个基因进行研究，可以进行高通量筛选。
附图说明
图1是拟南芥叶肉细胞原生质体FDA染色后的显微图；
图2是四周龄野生型和pgr5突变体的叶绿素荧光参数比较图；
图3是DCMU对叶盘和原生质体的光合电子传递抑制效果图；
图4是拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时表达的GFP的荧光显微图；
图5是瞬时过表达NPQ-GFP对原生质体的影响图；
图6是瞬时过表达ATPC1-GFP对原生质体Fv/Fm 和ФPSII的影响图；
图7是瞬时过表达ATPC1-c-myc对原生质体Fv/Fm 和ФPSII的影响图；
图8是DTT处理对原生质体与叶片的ФPSII和NPQ的影响图；
图9是瞬时过表达TRX m1-GFP、TRX m2-GFP、TRX m3-GFP、TRX m4-GFP对原生质体的ФPSII和NPQ的影响图；
图10是瞬时过表达TRX f1-GFP，TRX f2-GFP对原生质体的ФPSII和NPQ的影响图；
图11是瞬时过表达TRX f1-GFP与ФPSII之间的关系图；
图12是瞬时过表达Fd1-GFP，Fd2-GFP，FTRc-GFP对原生质体叶绿素荧光参数的影响图；
图13是Fd1-GFP， Fd2-GFP， FTRc-GFP， TRX f1-GFP 和 TRX f2-GFP的亚细胞定位图。
具体实施方式
下面结合试验，进一步说明本发明。
一、原生质体叶绿素荧光测定体系的建立
实验材料及溶液：
拟南芥原生质体制备溶液的配制方法
（1）母液：
① MES （0.2 M ，pH 5.7）：称取3.9 g MES溶解于100 mL去离子水；
② 甘露醇（0.8 M）：称取29.1 g 甘露醇溶解于200 mL去离子水；
③ CaCl2（1 M）：称取100 g CaCl2溶解于100 mL去离子水；
④ KCl （2 M）：称取14.9 g KCl溶解于100 mL去离子水；
⑤ MgCl2（2 M）：称取20.33 g MgCl2溶解于100 mL去离子水；
⑥ BSA（10 %）：称取1 g BSA溶解于 10 mL去离子水，分装。
以上母液均用0.45 μm滤膜过滤除菌，常温保存。
酶液：
配比为：2 mL MES（0.2 M pH 5.7），10 mL Mannitol（0.8 M），200 μL KCl（2 M），0.3 g Cellulase R-10，0.08 g Macerozyme R-10，7.4 mL ddH2O，55 ℃加热10 min，冷却到室温，再加入200 μL CaCl2（1 M），200 μL BSA（10%）。混合均匀，用0.45 μm 滤膜过滤得到；
W5 溶液：
配比为：2 mL MES（0.2 M pH 5.7），1.8 g NaCl，3.675 g CaCl2· 2H2O，0.5 mL KCl（2 M），172.5 mL ddH2O。
植物材料
本试验使用的植物材料有野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia）
拟南芥的培养
（1）培养条件：温度为23 ℃，光强110 μmol·m-2·s-1，16 h光照，8 h黑暗，相对湿度60%~70%。
（2）培养方法：取适量拟南芥种子置于4 ℃冰箱内春化4～5 d后，取出种子，将其点种在灭过菌的营养土上。盖上透明罩培养以缓苗，3 d后揭开罩子。待苗生长三至四周时，方可使用。
拟南芥叶肉细胞原生质体的制备
1) 选取3~4周龄、充分伸展的拟南芥叶片（叶位：2、3、4对）
2) 用刀片将叶片切成0.5~1 mm的细条，放入并浸没在酶液中；
3) 将酶液于10 mm汞柱的真空下抽真空30 min，室温黑暗静置酶解3 h；
4) 晃动酶液释放原生质体，加入等体积的W5溶液，轻轻晃动平皿，充分释放原生质体；
5) 用55 μm的尼龙网过滤原生质体，收集至15 mL圆底塑料试管中，800 rpm离心1~2 min，沉淀的原生质体用预冷的W5溶液清洗一次，之后冰上静置30 min。
拟南芥叶肉细胞原生质体制备效果的检测
使用荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，FDA)染色法检测原生质体活力，结果如图1所示。显微镜下可观察到制出的原生质体形状为正常的圆球状，用FDA染色5 min后，蓝光照射，呈黄绿色有活性的原生质体数目接近100%。
原生质体叶绿素荧光参数测定
采用德国Walz公司的IMAGING-PAM-M-Series叶绿素荧光仪测定原生质体的叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线。
测定叶绿素荧光诱导动力学曲线时，先将原生质体样品加入96孔板，暗适应10 min。打开配套软件，选定感兴趣的区域（AOI），所有荧光参数的值都通过软件记录下来。用弱光（0.5 μmol·m-2·s-1）照射测定初始荧光(F0)，调制频率为1 Hz， 随后进行饱和脉冲光(2 700 μmol·m-2·s-1)处理， 一个脉冲后，得到最大荧光(Fm)， 打开适合拟南芥原生质体的光化光(35 μmol·m-2·s-1)，之后再进行饱和脉冲光处理，一个脉冲后，得到光化光下的最大荧光(Fm’)。
充分暗适应后，PSII 的最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学能量转化的有效量子产量[Y(II)，ФPSII]、非光化学淬灭系数(NPQ)等各参数数值均是在选定模式下系统自动计算生成。成像图直接导出观察，各参数值导出后，通过相关软件进一步分析。
拟南芥叶肉细胞原生质体叶绿素荧光测量板的选取
将新鲜分离的高活力野生型拟南芥叶肉细胞原生质体分装于普通的透明96孔板中，测定其叶绿素荧光参数。
结果表明：透明板中各孔原生质体间的荧光信号会相互影响，通过尝试不同的培养板，最后发现白色不透明96孔板能有效地避免这种影响，因此，后续实验均使用白色不透明板。
拟南芥叶肉细胞原生质体悬浮基质的选取
拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达系统中常使用两种悬浮基质：W5溶液和WI溶液。为了选择合适的悬浮基质，制备原生质体，分别用W5溶液和WI溶液悬浮，置于白色不透明96孔板中，测定叶绿素荧光参数Fv/Fm。
实验发现：相比于W5溶液，用WI溶液悬浮的原生质体，其Fv/Fm（PSII最大量子产量）较高，分别为：0.72和0.68，选定WI为悬浮基质。
不同体积、浓度拟南芥叶肉细胞原生质体F
v
/F
m
的比较
制备拟南芥叶肉细胞原生质体，用WI溶液悬浮，设置三个体积梯度（50 μL、100 μL、200 μL）、三个浓度梯度（4×105、2×105、1×105），将原生质体分别置于白色不透明96孔板中，测定叶绿素荧光参数Fv/Fm实验发现：浓度为4×105 个/mL ，体积为200 μL时原生质体的Fv/Fm最高。考虑到经济因素，选定的体积、浓度体系为：2×105 个/mL ，体积为100 μL。
二、拟南芥叶肉细胞原生质体与叶片叶绿素荧光参数的比较
文献报道pgr5（PGR5是环式电子传递所涉及到的蛋白质）突变体的NPQ低于野生型(DalCorso et al., 2008)，除草剂二氧苯基二甲基脲（DCMU）能够阻断PSII电子从QA向二级质子醌受体（QB）传递，导致QA迅速还原，光化学淬灭受到抑制，初始荧光（F0）增加(Allahverdiyeva et al., 2007)。因此，用DCMU分别处理野生型拟南芥的叶盘和原生质体，比较DCMU处理后二者叶绿素荧光参数发生改变的趋势，可以确定原生质体系统与植株的叶绿素荧光参数是否相似或者变化趋势一致，进而确定叶绿素荧光成像技术能否用于测定拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的叶绿素荧光参数。
植物材料：
采用的植物材料为拟南芥纯合突变体pgr5，及其对应的野生型拟南芥。拟南芥的处理及原生质体的制备同上。
拟南芥叶片叶绿素荧光参数测定
采用德国Walz公司的Imaging-PAM-M-Series叶绿素荧光仪测定拟南芥叶片的叶绿素荧光诱导动力学曲线。
拟南芥叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线测定的方法与原生质体叶绿素荧光诱导动力学曲线测定的方法类似，不同之处在于适合拟南芥叶片的光化光光强为110 μmol·m-2·s-1；
四周龄野生型、pgr5突变体植株的NPQ诱导曲线的测定方法为：610 μmol·m-2·s-1强度高光照射6 min，随后暗适应4 min；
四周龄野生型、pgr5突变体原生质体的NPQ诱导曲线的测定方法为：110 μmol·m-2·s-1 强度高光照射6 min，随后暗适应4 min。
二氧苯基二甲基脲（DCMU），处理拟南芥叶肉细胞原生质体
配制6个梯度为0、0.5、1、5、10、50 μM的DCMU溶液，将其分别加入96孔板中，每孔10 μL 。随后，在各孔中加入原生质体90 μL，混合均匀，使原生质体溶液中DCMU的终浓度分别为：0、0.05、0.1、0.5、1、5 μM。
DCMU处理拟南芥叶盘
用2 mM MES溶液配制6个梯度为0、0.5、1、5、10、50 μM的DCMU溶液。用直径为6 mm的打孔器从四周龄的拟南芥叶片上打下叶盘，迅速放入配置好的DCMU溶液中，暗处理20 min。处理完后，用去离子水洗去叶盘表面残留的DCMU，在Imaging-PAM的测量板上铺好叶盘，暗适应10 min，测定叶绿素荧光。
实验结果：
为了明确原生质体的叶绿素荧光参数发生改变的趋势是否与叶片一致，选取pgr5及其对应的野生型作为比较。先测定野生型、突变体叶片的叶绿素荧光参数Fv/Fm与NPQ。随后，以它们为材料分别制备原生质，测定野生型、突变体原生质体的叶绿素荧光参数Fv/Fm与NPQ。实验结果如图2所示，图中，A. 四周龄野生型、 pgr5突变体植株各自的Fv/Fm、 1/4 NPQ荧光成像图，1/4 NPQ的图像为110 μmol·m-2·s-1强度光强照射3 min；B. 四周龄野生型、pgr5突变体植株的NPQ诱导曲线，610 μmol·m-2·s-1强度高光照射6 min，随后暗适应4 min，n = 8；C. 四周龄野生型、 pgr5突变体原生质体各自的Fv/Fm、 1/4 NPQ荧光成像图，1/4 NPQ的图像为35 μmol·m-2·s-1强度光强照射3 min后所获得；D. 四周龄野生型、pgr5突变体原生质体的NPQ诱导曲线，110 μmol·m-2·s-1 强度高光照射6 min，随后暗适应4 min，n = 6。
从图中可以看出，对叶片而言，PGR5突变后，相比野生型其非光化学淬灭常数NPQ会降低而Fv/Fm却不会发生显著改变（图2A和B）。与叶片结果相似，突变体原生质体的NPQ值相比野生型原生质体显著降低（图2 C和D）。
DCMU处理野生型拟南芥叶盘和原生质体后叶绿素荧光参数的比较
分别制备野生型拟南芥的叶盘和对应的原生质体，用浓度梯度为0、0.5、1、5、10和50 μM的DCMU处理生型拟南芥的叶盘，用浓度梯度为0、0.05、0.1、0.5、1和5 μM的DCMU处理生型拟南芥制备的原生质体。
实验结果如图3所示，图中A. DCMU处理后，原生质体（白色柱）和叶盘（灰色柱）的叶绿素荧光参数Fv/Fm的荧光成像图及其对应的值；B. DCMU处理后，原生质体（白色柱）和叶盘（灰色柱）的叶绿素荧光参数F0的荧光成像图及其对应的值；C. DCMU处理后，原生质体（白色柱）和叶盘（灰色柱）的叶绿素荧光参数1/4 NPQ的荧光成像图及其对应的NPQ值；D. DCMU处理后，原生质体（白色柱）和叶盘（灰色柱）的叶绿素荧光参数ФPSII的荧光成像图及其对应的值。其中，n =8。如图所示，处理原生质体所用的DCMU浓度为0、0.05、0.1、0.5、1和5 μM， 而处理叶盘所用的DCMU浓度则为0、0.5、1、5、10和50 μM。
实验结果表明：随着DCMU浓度的增加，叶盘与原生质体的初始荧光（F0）均逐渐增大（图3B），而Fv/Fm，NPQ，PSII的实时荧光ФPSII均会逐渐降低（图3A，C，D）。
通过实验可知，原生质体的叶绿素荧光参数能在一定程度上反映叶片的真实情况，可以通过测定原生质体的叶绿素荧光参数来分析叶片的光合作用。
三、拟南芥原生质体中瞬时表达光合作用相关基因对其叶绿素荧光参数的影响
拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达技术中，原生质体需要经历PEG介导的质粒DNA转化过程及过夜培养过程。为了明确转化后原生质体是否依然适合于叶绿素荧光测定。分别在原生质体中瞬时转化了GFP和NPQ1-GFP融合蛋白以及GFP与ATPC1-GFP，c-myc与ATPC1-c-myc融合蛋白。其中，NPQ1( Non-photochemical quenching 1)，编码紫黄质去环氧化酶，作为叶黄素循环中的关键酶，在强光下能够将紫黄质转变为玉米黄质，从而耗散掉过剩的光能，起光保护的作用(Niyogi et al.， 1998)。缺失NPQ1的拟南芥突变体，其NPQ会大大下降(Niyogi et al.， 1998)，而在烟草中过表达NPQ1会导致NPQ增加(Havaux et al.， 2000)。ATPC1是质体ATP合酶的一个亚基，缺失ATPC1的拟南芥突变体，暗适应后，其最小荧光F0会增加，而且，其Fv/Fm和ФPSII会显著降低(Bosco et al.， 2004; Wu et al.， 2007)。
植物材料
本实验所用植物材料为野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia，Nossen），将拟南芥种子在37 ℃培养箱中烘干后，置于4 ℃冰箱内冷冻保存。
拟南芥转化主要溶液的配制方法
（1）WI溶液（20 mL）
0.4 mL MES（0.2 M pH 5.7），12.5 mL Mannitol（0.8 M），0.2 mL KCl（2 M） 6.9 mL ddH2O
（2）MMG溶液（10 mL）
0.2 mL MES（0.2 M pH 5.7），5 mL Mannitol（0.8 M），0.15 mL MgCl2（1 M），4.65 mL ddH20：
（3）PEG/Ca2+溶液（10 mL）
4 g PEG 4000，2.5 mL Mannitol（0.8 M），1 mL CaCl2（1 M），3 mL ddH2O。
拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化
MMG溶液重悬原生质体，定量至1-2 × 105个/mL
在一个2 mL的圆底EP管加入10 μL DNA（5 kb大小的质粒DNA 10~20μg），加入100 μL原生质体（2 × 104个原生质体），混匀；
再加入110 μL PEG/Ca2+溶液，混匀；
暗处放置15 min后用440 μL W5溶液稀释，并轻轻混匀，800 rpm离心2 min，去上清；
加入WI溶液，分散原生质体，平铺于6/12/24孔板中培养过夜。
瞬时转化的确认：
提取纯化转化后原生质体的蛋白，进行蛋白电泳及western blot，确认转化至原生质体的基因是否有表达。
在拟南芥原生质体中瞬时转化GFP载体后，经过过夜培养，收集原生质体，在血球计数板上盖上盖玻片，将原生质体从侧面吸入计数室，在荧光显微镜下观察。根据发绿色荧光的原生质体与所有原生质体数目的比值来统计转化率，观察结果如图4所示。从图中可知原生质体的转化率可达90%以上。
NPQ1-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达GFP和NPQ1-GFP融合蛋白，过夜培养，收集原生质体，800 rpm转速离心，吸出多余培养液，将剩余培养液与原生质体混匀，按每孔100 μL量分装于96孔板。待所有样品分装完成，将96孔暗适应10 min后测定叶绿素荧光参数。实验结果如图5所示。图中，A．原生质体瞬时过表达GFP、NPQ1-GFP后各自的1/4 NPQ荧光成像图，为六组重复取三组；B. 原生质体瞬时过表达GFP、NPQ1-GFP后各自所测得的NPQ数值，数值为六组重复取平均值，**p≤0.01; t-test；C. Western blot检测瞬时表达的GFP和NPQ1-GFP蛋白，上图是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下图是CBB染色的PVDF膜，星型标记表示非特异性条带，RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基。
数据表明：过表达NPQ1-GFP融合蛋白的原生质体，其NPQ高于过表达GFP蛋白原生质体的NPQ。数值分别为0.37和0.21（图5A，5B）。
收集已测定叶绿素荧光参数的原生质体，提取蛋白，进行蛋白电泳和western blot检测。Western blot结果显示：用抗GFP的抗体可以检测出GFP和NPQ1-GFP融合蛋白对应的条带，说明它们能够在拟南芥叶肉细胞原生质体中成功表达（图5 C）。
这些结果显示：原生质体经过瞬时转化，仍然具有光合活性和生理功能，适合于叶绿素荧光参数测定。
ATPC1-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
为了更加充分地证明瞬时过表达外源基因的原生质体能用于叶绿素荧光参数测定，选取另一个已报道过的，其稳定过表达植株的叶绿素荧光参数会发生变化的基因ATPC1进行实验。先在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达GFP和ATPC1-GFP融合蛋白，过夜培养，收集原生质体，800 rpm转速离心，吸出多余培养液，将剩余培养液与原生质体混匀，按每孔100 μL量分装于96孔板。待所有样品分装完成，将96孔暗适应10 min后测定叶绿素荧光参数。实验结果如图6所示。图中，A．原生质体瞬时过表达GFP、ATPC1-GFP后各自Fv/Fm的荧光成像图及对应的数值；B. 原生质体瞬时过表达GFP、ATPC1-GFP后各自ФPSII的荧光成像图及对应的数值；C. Western blot检测瞬时表达的GFP和ATPC1-GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下半部分是CBB染色的PVDF膜， RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基；D. 原生质体瞬时过表达GFP (20 μg)、ATPC1-GFP (0、5、10、15、20 μg) 后各自ФPSII的荧光成像图及对应的数值；A、B中荧光成像图为六组重复中取三组，对应数值为六组重复取平均值；D中荧光成像图为四组重复取一组，对应数值为四组重复取平均值； *p≤0.05，**p≤0.01; t-test。
比较过表达ATPC1-GFP融合蛋白的原生质体与过表达GFP的原生质体。前者的Fv/Fm与ФPSII均高于后者，数值分别为Fv/Fm（0.67与0.58）（图6A），ФPSII（0.35 与 0.28）（图6B）。
为了证明瞬时转化ATPC1-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数Fv/Fm与ФPSII增高是由ATPC1过表达造成的，将35S:ATPC1-GFP融合质粒DNA的量设置一个梯度后转化原生质体。在100 μL反应体系中，当35S:ATPC1-GFP的量低于10 μg时，转化效率很低，与对照即转化20 μg 35S:GFP质粒的原生质体相比，它们的ФPSII几乎一致（图6D）。当转化15或20 μg质粒时，原生质体的Ф PSII显著高于对照（图6D）。并且ФPSII的数值随着ATPC1-GFP融合蛋白量的增加而增加（图6D，E）。
收集已测定叶绿素荧光参数的原生质体，提取蛋白，进行蛋白电泳和western blot检测。Western blot结果显示：用抗GFP的多克隆兔抗可以检测出GFP和ATPC1-GFP融合蛋白对应的条带，说明它们能够在拟南芥叶肉细胞原生质体中成功表达（图6C）。
以上结果表明：瞬时过表达ATPC1融合蛋白的原生质体其叶绿素荧光参数Fv/Fm，ФPSII发生改变的确是由ATPC1蛋白过表达所造成的。
ATPC1-c-myc瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
考虑到有些蛋白与GFP融合表达后会散失功能，为了尽可能降低这种影响，有时会直接表达蛋白，或是将蛋白与较小的标签融合表达，如：HA，c-myc，6×His，FLAG等。
为了进一步证明上一部分实验中原生质体叶绿素荧光参数发生改变的原因确实是ATPC1基因过表达。将ATPC1连入改造过的pUC-c-myc中，构建载体ATPC1-c-myc，选择生态型为Col-0和No-0的野生型拟南芥，制备原生质体，瞬时过表达ATPC1与10个氨基酸的多肽融合的ATPC1-c-my，同时瞬时转化c-myc作为对照。
实验结果如图7所示。图中A.No-0，Col-0生态型拟南芥原生质体瞬时过表达c-myc、ATPC1-c-myc后各自Fv/Fm的荧光成像图及对应的数值；B. No-0，Col-0生态型拟南芥原生质体瞬时过表达c-myc、ATPC1-c-myc后各自ФPSII的荧光成像图及对应的数值；A-B，荧光成像图为六组重复取两组，对应的数值为六组重复取平均值，**p≤0.01; t-test。
实验结果显示：在这两个生态型拟南芥的原生质体中瞬时过表达ATPC1-c-myc后，相比对照，原生质体的Fv/Fm与ФPSII均比对照高（图7A，7B），与转化瞬时过表达ATPC1-GFP的原生质体一致。
四、光合作用相关功能基因的快速筛选
根据已有研究的报道DTT处理叶盘，会使其NPQ显著下降(Bilger et al.， 1989; Kalituho et al.， 2007)。用浓度递增的DTT溶液（0~10 mM）处理拟南芥叶盘和原生质体，也获得了一致的结果。由于DTT是一种还原型物质，且能打开蛋白质的二硫键，推论拟南芥的NPQ，ФPSII可能受氧化还原作用的调控，进一步推论NPQ，ФPSII可能会受叶绿体氧化还原系统的调控。
拟南芥叶绿体氧化还原系统中硫氧还蛋白(TRXs)被分为7组(2f，11h， 4m， 2o， 1x，2y 和 1z)，其中5组：4m， 2f， 1x， 2y 和 1z被认为是质体/叶绿体定位的硫氧还蛋白(Gelhaye et al.， 2005; Meyer et al.， 2005; Arsova et al.， 2010)。叶绿体中起主要调节作用的硫氧还蛋白是TRX m和f，它们通过受铁氧还蛋白硫氧还蛋白还原酶（FTR）介导，受还原型铁氧还蛋白（Fd）激活(Gelhaye et al.， 2005; Meyer et al.， 2005; Schurmann and Buchanan， 2008; Arsova et al.， 2010)。
在原生质体中瞬时过表达了4个TRX m和2个TRX f，测定叶绿素荧光参数。进而筛查了其上游的FTR和Fd，研究这些基因是否参与光合作用光反应中心的氧化还原调控。
实验方法
DTT处理拟南芥叶肉细胞原生质体
配制6个梯度为0、2、10、20、40、100 mM的DTT溶液，将其分别加入96孔板中，每孔10 μL 。
随后，在各孔中加入原生质体90 μL，混合均匀，使原生质体溶液中DTT的终浓度分别为：0、0.2、1、2、4、10 mM。
DTT处理拟南芥叶盘
用2 mM MES溶液配制6个梯度为0、0.2、1、2、4、10 mM的DTT液。用直径为6 mm的打孔器从四周龄的拟南芥叶片上打下叶盘，迅速放入配置好的DTT溶液中，暗处理20 min。
处理完后，用去离子水洗去叶盘表面残留的DTT，在Imaging-PAM的测量板上铺好叶盘，暗适应10 min，测定叶绿素荧光。
激光扫描共聚焦显微镜拍摄
目的基因在原生质体中瞬时表达后，收集原生质体，用激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP5 AOBS）进行观察，并用Leica Microsystem LAS AF软件显示与输出图像。
GFP和叶绿素自发荧光（chl）使用488 nm波长的激光激发，使用500-530 nm收集GFP信号，用650-750 nm收集叶绿素自发荧光。
所有的荧光观察实验至少独立重复三次。
DTT分别处理野生型拟南芥叶盘和原生质体后叶绿素荧光参数的比较
配制6个浓度梯度的DTT溶液，分别为：0、0.2、1、2、4、10 mM。
将拟南芥叶盘浸泡在DTT溶液中20 min后，取出叶盘，用水洗去叶盘表面的DTT。暗适应后测定叶绿素荧光参数，实验结果如图8所示，图中，A 用不同浓度(0、0.2、1、2、4 and 10 mM)的DTT溶液处理拟南芥叶盘所测得的叶绿素荧光参数ФPSII 的荧光成像图和对应的数值；B 1/4 NPQ的荧光成像图和对应的数值；C 用不同浓度(0、0.2、1、2、4 and 10 mM)的DTT溶液处理拟南芥叶肉细胞原生质体所测得的叶绿素荧光参数ФPSII的荧光成像图和对应的数值；D 1/4 NPQ的荧光成像图和对应的数值；荧光成像图为六组重复取一组，对应的数值为六组重复取平均值。
由实验数据发现叶盘的NPQ会显著降低，ФPSII会显著升高（图8A，B）。
用同样浓度梯度的DTT处理原生质体后测叶绿素荧光参数，发现原生质体的NPQ也会随着DTT浓度的升高而降低，ФPSII则随着DTT浓度的升高而升高（图8 C，D）。
TRX m1、TRX m2、TRX m3、TRX m4-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
为了研究拟南芥叶绿体中起主要调节作用的硫氧还蛋白是否参与调控NPQ和ФPSII，先分别在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达了4个m类的硫氧还蛋白（TRX m1-GFP， TRX m2-GFP， TRX m3-GFP 和TRX m4-GFP），测定过表达原生质体的叶绿素荧光，检测它们是否会造成原生质体的叶绿素荧光参数ФPSII和NPQ发生改变。实验结果如图9所示，图中A.瞬时过表达GFP、TRX m1-GFP、TRX m2-GFP、TRX m3-GFP、TRX m4-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ФPSII的荧光成像图及其对应的数值；B. 瞬时过表达GFP、TRX m1-GFP、TRX m2-GFP、TRX m3-GFP、TRX m4-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；A-B， 荧光成像图为六组重复取三组，对应的数值为六组重复取平均值。
经过6次以上生物学重复，实验结果表明：尽管可以通过荧光显微镜检测到4个m类硫氧还蛋白与GFP融合蛋白表达后的荧光，也就是说这四个蛋白能在原生质体中表达。但是，他们在原生质体中分别瞬时过表达后均没有显著改变原生质体的叶绿素荧光参数（图9）。
TRX f1、TRX f2-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
瞬时过表达m类硫氧还蛋白后测量原生质体的叶绿素荧光参数，发现它们过表达后叶绿素荧光参数没有发生显著改变。在此基础上，为了了解另一类主要的硫氧还蛋白f类的硫氧还蛋白是否会通过氧化还原作用影响原生质体的叶绿素荧光参数ФPSII和NPQ，在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时过表达2个f类的硫氧还蛋白（TRX f1-GFP和TRX f2-GFP），测定过表达后原生质体的叶绿素荧光。实验结果如图10所示，图中，A.瞬时过表达GFP和TRX f1-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ФPSII的荧光成像图及其对应的数值；B.瞬时过表达GFP和TRX f1-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；C.瞬时过表达GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ФPSII的荧光成像图及其对应的数值；D.瞬时过表达GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；E. Western blot检测瞬时表达的TRX f1-GFP，TRX f2-GFP，GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下半部分是CBB染色的PVDF膜，RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基；A-D，荧光成像图为六组重复取三组，对应的数值为六组重复取平均值，*p≤0.05，**p≤0.01; t-test。
结果表明，瞬时过表达TRX f1-GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ФPSII和NPQ与DTT处理后发生改变的趋势一致。相比过表达GFP的对照，过表达TRX f1-GFP，TRX f2-GFP的原生质体其ФPSII有所升高（图10A、C），NPQ有所降低（图10B、D）。
为了证明原生质体叶绿素荧光参数ФPSII升高是由TRX f过表达引起，首先将35S:TRX f1-GFP融合质粒DNA的量设置4个梯度：5、10、15 和20 μg，转化原生质体。
在100 μL原生质体体系中，当35S:TRX f1-GFP的量低于10 μg时，转化效率很低，只能检测到很少量的TRX f1-GFP蛋白，与对照即转化20 μg 35S:GFP质粒的原生质体相比，它们的ФPSII几乎一致。当转化15或20 μg质粒时，原生质体的Ф PSII显著高于对照（图11A）。
对于拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达系统，100 μL原生质体的体系中，20 μg质粒转化2×104个原生质体的转化效果通常为最好。为了进一步证实TRX f在原生质体中瞬时过表达会造成原生质体ФPSII增加，将35S:TRX f1-GFP融合质粒DNA的量设置另外4个梯度：7.5、15、22.5 和30 μg，转化原生质体。实验结果显示：转化22.5 μg质粒的原生质体，其ФPSII最高，转化15 和30 μg质粒的原生质体，其ФPSII都有所降低（图11B）。
收集已测定叶绿素荧光参数的原生质体，提取蛋白，进行蛋白电泳和western blot检测。Western blot结果显示：用抗GFP的一抗以及相应二抗孵育后，可以检测出GFP和TRX f1-GFP融合蛋白对应的条带，说明它们能够在拟南芥叶肉细胞原生质体中成功表达。结果显示：对于100 μL的原生质体体系，转化质粒的最佳用量约为20 μg，此时融合蛋白的表达量最高，质粒量的增加或减少都会降低转化率。而原生质体叶绿素荧光参数ФPSII会随着TRX f1-GFP融合蛋白表达量增加而增加（图11C，D）。
以上结果可以共同说明：瞬时过表达TRX f1-GFP融合蛋白的原生质体其叶绿素荧光参数ФPSII增加的确是由TRX f1蛋白过表达所造成的。
Fd1-GFP、Fd2-GFP、FTRc-GFP瞬时过表达后叶绿素荧光参数分析
由于TRX f被FTR还原，FTR被Fd还原(Schurmann and Buchanan， 2008)，也就是说FTR和Fd处于TRX f的上游。为了明确瞬时过表达TRX f上游的蛋白是否会引起叶绿素荧光参数发生相同的改变，选取了两个叶中表达的Fd：Fd1和Fd2，以及FTR的催化亚基FTRc，将它们在原生质体中瞬时过表达。
实验结果如图12所示，图中，A.瞬时过表达GFP，FTRc-GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ФPSII的荧光成像图及其对应的数值；B.瞬时过表达GFP，FTRc-GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；C.瞬时过表达GFP，Fd1-GFP，Fd2-GFP，TRX f1-GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数ФPSII的荧光成像图及其对应的数值；D.瞬时过表达GFP，Fd1-GFP，Fd2-GFP，TRX f1-GFP和TRX f2-GFP后，原生质体叶绿素荧光参数NPQ的荧光成像图及其对应的数值；E. Western blot检测瞬时表达的Fd1-GFP，Fd2-GFP ，FTRc-GFP，GFP蛋白，上半部分是用抗GFP的多克隆兔抗的免疫印迹，下半部分是CBB染色的PVDF膜， RbcL是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基；A-D，荧光成像图为六组重复取两组，对应的数值为六组重复取平均值，*p≤0.05，**p≤0.01; t-test。
结果显示：尽管过表达TRX f1-GFP，TRX f2-GFP的原生质体，其ФPSII会显著上升，NPQ会显著下降（图12A，B，C，D），却没有发现过表达Fd1和Fd2，以及FTRc的原生质体的叶绿素荧光参数，如NPQ 或者 ФPSII发生明显地改变（图12A，B，C，D）。Western-blot结果显示，GFP， FTRc-GFP， Fd1-GFP 和Fd2-GFP能够在原生质体中正常表达（图12E）。
说明f类硫氧还蛋白通过氧化还原作用直接调控NPQ和ФPSII，由于f类硫氧还蛋白在植物体内的含量较稳定，瞬时过表达f类硫氧还蛋白的上游基因不起作用，也存在另一种可能，即这些蛋白与GFP融合表达后散失了功能。尽管如此，利用新方法，将拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化技术与叶绿素荧光技术结合起来，所获得的结果提示TRX f1 和TRX f2可能是氧化还原调控NPQ和ФPSII的两个潜在硫氧还蛋白。
Fd1、Fd2、FTRc、TRX f1、TRX f2的亚细胞定位
为了确保叶绿素荧光参数发生改变的原因是外源基因的瞬时过表达，必须要有检测目的基因已经发生了过表达的方法，比如，通过western blot，用抗GFP的抗体检测目的基因与GFP融合蛋白的表达。还可以利用荧光显微镜观察目的基因与GFP融合蛋白的荧光，瞬时转化TRX f1-GFP，TRX f2-GFP，FTRc-GFP，Fd1-GFP，Fd2-GFP，用激光共聚焦显微镜可以检测到这5个基因成功表达，且定位在叶绿体中（图13）。
可见，本发明方法可以很好地应用于光合作用的研究。
基于上述实验，可以明确地预见，将反义RNA转入原生质体中，使原生质体中的正常表达基因瞬时沉默，同样可以应用于光合作用的研究。
Claims (2)
1.一种研究光合作用相关功能基因的方法，包括如下步骤：
1) 制备含有叶绿体的原生质体，并将待测基因和/或反义核酸序列转入原生质体并确认待测基因可瞬时表达和/或反义核酸序列已使基因表达瞬时沉默；
2) 将转入有待测基因和/或反义核酸序列的原生质体和对照原生质体置于白色不透明孔板中进行暗适应处理；
3) 将暗适应处理的原生质体进行光照处理，获取其荧光图像和/或荧光参数，或基于荧光图像和/或荧光参数绘制叶绿素荧光诱导动力学曲线和/或光诱导曲线；
4) 对比不同处理组的荧光图像、荧光参数、叶绿素荧光诱导动力学曲线、光诱导曲线中的至少一种，判断待测基因和/或反义核酸序列对光合作用的影响，确定待测基因和/或反义核酸序列沉默的基因是否为光合作用相关基因；
其中，含有叶绿体的原生质体的制备方法如下：
拟南芥原生质体制备溶液的配制方法
母液：
① 0.2 M ，pH 5.7 MES ：称取3.9 g MES溶解于100 mL去离子水；
② 0.8 M甘露醇：称取29.1 g 甘露醇溶解于200 mL去离子水；
③ 1 M CaCl2：称取100 g CaCl2溶解于100 mL去离子水；
④ 2 M KCl ：称取14.9 g KCl溶解于100 mL去离子水；
⑤ 2 M MgCl2：称取20.33 g MgCl2溶解于100 mL去离子水；
⑥ 10 %BSA：称取1 g BSA溶解于 10 mL去离子水，分装；
以上母液均用0.45 μm滤膜过滤除菌，常温保存；
酶液：
配比为：2 mL 0.2 M pH 5.7的MES，10 mL 0.8 M Mannitol，200 μL 2 M KCl，0.3 g Cellulase R-10，0.08 g Macerozyme R-10，7.4 mL ddH2O，55 ℃加热10 min，冷却到室温，再加入200 μL 1 M CaCl2，200 μL 10% BSA；混合均匀，用0.45 μm 滤膜过滤得到；
W5 溶液：
配比为：2 mL 0.2 M pH 5.7 MES，1.8 g NaCl，3.675 g CaCl2· 2H2O，0.5 mL2 M KCl，172.5 mL ddH2O；
植物材料为野生型拟南芥Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia，（1）培养条件：温度为23 ℃，光强110 μmol·m-2·s-1，16 h光照，8 h黑暗，相对湿度60%~70%；
（2）培养方法：取适量拟南芥种子置于4 ℃冰箱内春化4～5 d后，取出种子，将其点种在灭过菌的营养土上，盖上透明罩培养以缓苗，3 d后揭开罩子，待苗生长三至四周时，方可使用；
拟南芥叶肉细胞原生质体的制备
选取3～4周龄、充分伸展的叶位为2、3、4对的拟南芥叶片；
用刀片将叶片切成0.5~1 mm的细条，放入并浸没在酶液中；
将酶液于10 mm汞柱的真空下抽真空30 min，室温黑暗静置酶解3 h；
晃动酶液释放原生质体，加入等体积的W5溶液，轻轻晃动平皿，充分释放原生质体；
用55 μm的尼龙网过滤原生质体，收集至15 mL圆底塑料试管中，800 rpm离心1~2 min，沉淀的原生质体用预冷的W5溶液清洗一次，之后冰上静置30 min；
将待测基因和/或反义核酸序列转入原生质体的方法如下：
拟南芥转化主要溶液的配制方法
（1）20 mL WI溶液
0.4 mL 0.2 M pH 5.7 MES，12.5 mL 0.8 M Mannitol，0.2 mL 2 M KCl 6.9 mL ddH2O
（2）10 mL MMG溶液
0.2 mL 0.2 M pH 5.7MES，5 mL 0.8 M Mannitol，0.15 mL 1 M MgCl2，4.65 mL ddH20：
（3）10 mL PEG/Ca2+溶液
4 g PEG 4000，2.5 mL 0.8 M Mannitol，1 mL 1 M CaCl2，3 mL ddH2O；
拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时转化：
a) MMG溶液重悬原生质体，定量至1～2 × 105个/mL ；
b) 在一个2 mL的圆底EP管加入10 μL 含有10～20μg 5 kb大小的质粒DNA，加入100 μL 2 × 104个原生质体，混匀；
c) 再加入110 μL PEG/Ca2+溶液，混匀；
d) 暗处放置15 min后用440 μL W5溶液稀释，并轻轻混匀，800 rpm离心2 min，去上清；
e) 加入WI溶液，分散原生质体，平铺于孔板中培养过夜；
原生质体叶绿素荧光参数测定
采用德国Walz公司的IMAGING-PAM-M-Series叶绿素荧光仪测定原生质体的叶绿素荧光诱导动力学曲线和快速光响应曲线，测定叶绿素荧光诱导动力学曲线时：
a) 先将原生质体样品加入孔板，暗适应10 min；
b) 打开配套软件，选定感兴趣的区域AOI，所有荧光参数的值都通过软件记录下来；
c) 用0.5 μmol·m-2·s-1的弱光照射测定初始荧光F0；
d) 调制频率为1 Hz， 随后进行2 700 μmol·m-2·s-1的饱和脉冲光处理，一个脉冲后，得到最大荧光Fm ；
e) 打开适合拟南芥原生质体的35 μmol·m-2·s-1光化光，之后再进行饱和脉冲光处理，一个脉冲后，得到光化光下的最大荧光Fm’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：转入原生质体的待测基因和/或反义核酸序列至少为一种。
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