CN105175520A - 水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻OsFDC2基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因编码产物研究对水稻叶绿体发育、Fe元素含量、抽穗时间及光合作用的影响，可用于解决杂交稻育种过程中杂种剔除、调节Fe元素含量、抽穗期及光合效率等。

Description

水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2及其用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻OsFDC2基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因编码产物研究对水稻叶绿体发育、Fe元素含量、抽穗时间及光合作用的影响，可用于解决杂交稻育种过程中杂种剔除、调节Fe元素含量、抽穗期及光合效率等。

背景技术

铁硫蛋白(Ferredoxin，Fd)又名铁氧还蛋白，是一类具有重要生物功能的金属酶，普遍存在于细菌、藻类、动物及高等植物。所有的Fd均包含被保守残基螯合的Fe-S原子簇反应中心。高等植物的Fd可分为光合型Fd(主要存在于绿色部分)和非光合型Fd(主要分布于非光合组织)。光合型Fd可将光激发出的电子从光合系统I(PSI)传递给位于光合膜基质侧的水溶性Fd，在Fd：NADP⁺氧化还原酶(LFNR)的作用下，最终将电子传递给NADP⁺生成还原态的NADPH以及ATP，被用于固定CO₂的酶促暗反应和其他一系列依赖于光的代谢过程和调节反应。目前已知许多质体酶都依赖于Fd提供电子，包括氮同化中的氮还原酶、硫同化中的硫还原酶、氨基酸合成中的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶、脂肪酸合成中的脂肪酸去饱和酶以及氧化还原调节中的硫氧还蛋白还原酶等，与碳、氮的同化与固定，硫酸盐和硝酸盐的还原，谷氨酸的合成等许多生理生化过程密切相关。光合作用为水稻的生长提供了物质来源和能量来源，叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。光合系统I是整合于叶绿体光合膜上的，由多个蛋白亚基组成的蛋白复合物，现已证明，光合生物对光能的吸收、传递和转化都是在光合膜上通过光合系统来完成的，因此从分子水平上揭示各种光合系统复合物的结构和功能及其相互关系，不仅对于阐明光合作用光能转化机理具有重要理论意义，而且在通过提高光合效率，培育高产新品种方面具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶色变异相关的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻叶片颜色进行改造的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2(水稻光合电子传递调控基因OsFDC2)编码的蛋白质，该蛋白质为SEQIDNo：3所示的氨基酸序列。

作为本发明的水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2编码的蛋白质的改进，氨基酸序列还包括在SEQIDNo：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还同时提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQIDNo：1、SEQIDNo：2所示的核苷酸序列。

备注说明：SEQIDNO：1为cDNA全长，SEQIDNO：2为gDNA全长。

作为本发明的基因的改进：所述核苷酸序列还包括在SEQIDNo：1、2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还同时提供了含有上述基因的质粒。

本发明还同时提供了含有上述基因的植物表达载体。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。细胞例如为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还同时提供了上述基因的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶片颜色得以改良(从而使该转基因水稻能提高光合效率)。

本发明还同时提供了一种改良水稻叶片颜色、影响水稻Fe含量及对Fe的耐受度、提高光合效率、调节水稻抽穗期的方法：包括用具有SEQIDNo：1、2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

进一步具体说明：本发明的目的是提供一种从水稻黄绿叶晚抽穗突变体(yellowleafandlateheading1,ylh1)中克隆的新基因OsFDC2，具有如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的DNA序列，也包括与SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的SEQIDNo：3所示的蛋白质属于铁硫蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQIDNo：1和SEQIDNo：2中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用OsFDC2基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-OsFDC2，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶色的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶色的方法。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylh1的分离和遗传分析：

本发明的水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylh1来自日本晴EMS(EthylMethylSulfonate)诱变产生的突变(图1)。ylh1通过与野生型水稻的反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制。

二、图位克隆控制水稻黄绿叶晚抽穗性状的OsYLH1基因：

1)、OsYLH1基因的初步定位：

为了分离OsYLH1基因，本发明首先组建了一个定位群体，由ylh1与籼稻品种TN1(Indica)杂交组配成F₂定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对OsFDC2位点进行初步定位，将其初步定位在第3染色体的长臂端，并介于ZJ8-2和RM1350两标记之间，见图2。

2)、OsYLH1基因的精细定位与预测：

通过对ZJ8-2和RM1350两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将OsFDC2精确定位于BACOSJNBb0072E24上ZJ8-43与ZJ8-28标记之间38.2-kb范围之内(图3)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。

3)、OsYLH1基因的鉴定和功能分析：

为了验证候选基因功能，构建了如图4所示的互补载体，通过转基因技术，将互补载体转入到突变体ylh1中，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)，证明本发明正确克隆了OsYLH1基因，氨基酸序列分析表明OsFDC2编码铁硫蛋白。此外，由于该基因编码蛋白对叶绿体的发育和光合效率有影响，我们还构建了如图6所示亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明OsFDC2蛋白在细胞中定位于叶绿体。

本发明利用水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylh1，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了OsFDC2基因，该基因编码铁硫蛋白，在水稻中影响叶绿体的发育及光合效率，其它植物的同源基因均未被克隆，相关功能未知。通过对OsFDC2基因的功能解读，不仅丰富了叶绿体发育及光合效率的分子调控机制，对于阐明光合作用光能转化机理也具有重要理论意义。

叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。黄绿叶突变典型特征是叶绿体发育异常，大部分黄绿叶突变体缺乏叶绿素，光合效率下降，植物黄绿叶突变产生机制非常复杂，涉及光合电子传递、核-质基因组互作、质体基因及基因与环境的互作等过程，目前对黄绿叶的分子机理研究还仅停留在叶绿素代谢的层面，更为复杂的调控模式还不清楚。本发明获得的黄绿叶晚抽穗突变体，是众多黄绿叶突变体中较为特殊的一类，其相关基因编码蛋白主要是通过改变光合电子传递，进而对叶绿体的发育和光合效率产生影响。通过图位克隆技术本发明首次在水稻中克隆了相关基因OsFDC2，该基因编码铁硫蛋白，在水稻中影响叶绿体的发育及光合效率，其它植物的同源基因均未被克隆。通过对OsFDC2基因的功能解读，将为深入研究叶绿体发育机制，阐明植物光合系统作用的分子机理，进而为水稻高光合育种奠定基础。

综上所述，本发明利用水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylh1，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了OsFDC2基因，该基因编码铁硫蛋白，在水稻中影响叶绿体的发育，降低光合效率，其它物种的同源基因均未被克隆，相关功能未知。通过对OsFDC2基因的功能解读，进一步明确了OsFDC2对水稻叶绿体发育及光合效率的影响，同时为深入揭示光合作用光能转化机理奠定基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylh1与野生型苗期、分蘖期表型及叶片特写；

A为苗期野生型和突变体表型及对应叶片特写图；

B为分蘖期野生型和突变体表型及对应叶片特写图。

图2为OsYLH1基因在水稻第3染色体上的初步定位图。

图3为OsYLH1基因的精细定位及突变位点示意图；

(A)为OsYLH1基因的精细定位图；

(B)为OsYLH1基因定位区间序列分析及突变位点分析图；

(C)为OsYLH1基因在野生型和突变体中突变位点序列分析图；

(D)为OsYLH1基因在野生型和突变体中突变位点测序比对图。

图4为互补载体pCAMBIA1300-OsFDC2图谱。

图5为功能互补实验T0转基因水稻植株表型及测序验证；

(A)为互补载体转化突变体ylh1的转基因株表型图，从左至右分别为野生型，突变体及转化互补载体的突变体转基因株；

(B)为互补载体转化突变体ylh1的转基因株叶片特写图，从左至右分别为野生型，突变体及转化互补载体的突变体转基因株；

(C)为转化互补载体的突变体ylh1转基因株OsYLH1基因测序分析结果，箭头所指为突变位点。

图6为OsFDC2亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果；

(A)为OsFDC2::GFP融合载体图；

(B)为OsFDC2在细胞中的亚细胞定位图；Brightfield为明场观察结果；GFP为绿色荧光观察结果；Chlorophyll为叶绿体自发荧光观察；Merged为绿色荧光与叶绿体自发荧光合并后的观察结果。

图7为突变体ylh1与对照日本晴光合色素含量、净光合速率及铁含量测定；

A为对照日本晴与突变体ylh1叶绿素a含量测定结果；

B为对照日本晴与突变体ylh1叶绿素b含量测定结果；

C为对照日本晴与突变体ylh1类胡萝卜素含量测定结果；

D对照日本晴与突变体ylh1叶绿素a/b的比值；

E为对照日本晴与突变体ylh1净光合速率含量测定结果；

F为对照日本晴与突变体ylh1铁含量测定结果。

图8为透射电镜分析突变体ylh1与对照日本晴叶绿体形态的变化；

从右至左分别为放大6000倍，25000倍及50000倍的叶绿体显微结构，白色箭头所指为逐步放大区域。

图9为互补转基因植株叶绿素含量及光合效率测定；

A：互补转基因植株叶绿素含量测定及叶绿素a/b值；B:互补转基因植株净光合速率测定。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料：

水稻(OryzasativaL.)突变体ylh1，原始野生材料为粳稻品种“日本晴(NIP)”。

水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylh1来自日本晴EMS(EthylMethylSulfonate)诱变产生的突变(如图1所示)，该突变体是在中国浙江省境内获得。与对照品种农艺性状比较如下：

**代表突变体与野生型间存在极显著差异，P<0.01

该诱变方法具体为：用1.5％EMS浸泡水稻种子8h，清水冲洗后正常发芽；在M1代选择黄绿叶晚抽穗表型的突变体ylh1，经多代稳定遗传后用于群体构建和基因定位。

ylh1通过与野生型品种(即，籼稻品种TN1)的反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制。实验的结果为：在M₂代群体中随机选择65个单株进行遗传分析，51株为野生型表型，14株为突变型表型，卡平方检测结果(χ²＝0.37<χ²0.05＝3.84)，分离比符合3：1，说明该突变表型由单隐性核基因控制。以籼稻品种TN1为父本，ylh1为母本进行反交所得的F1代植株全部表现为正常表型，F2代种子播种四周后，随机选350个单株其中268株表现为野生型表型，82株表现为突变型表型。卡平方检测结果(χ²＝0.45<χ²0.05＝3.84)，正常植株表型和突变体植株表型分离比符合3：1；进一步证明该突变表型受隐性单隐性核基因控制。

2、分析和定位群体：

纯合的ylh1突变体和野生型品种籼稻品种TN1进行杂交，F₁代自交，得到F₂群体。并从中选出5413株ylh1突变个体作为定位群体。在三叶期期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。

3、SSR和STS标记定位OsFDC2基因

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中。每一个PCR反应用2μlDNA样品。

OsFDC2基因的初步定位：在ylh1与TN1组合的F₂群体中选取30个隐性个体，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将OsFDC2初步定位在第3号染色体长臂端ZJ8-2和RM1350两STS标记之间(如图2所示)。

备注说明：上述30个隐性个体是包含在5413株突变体中的，本发明先用30株做初定位，然后放大群体至5413用于精细定位和基因克隆。

OsFDC2基因的精细定位：选取ylh1与TN1组合的F₂群体中共5413株隐性个体，在初定位的基础上进一步设计SSR和STS标记，最终将OsFDC2精确定位于精确定位于BAC号为OSJNBb0072E24上38.2-kb范围之内(图3A)，两边的分子标记为ZJ8-43与ZJ8-28引物序列为：

ZJ8-43：F：ATCTGCTCCTTCCATCTTAAA，R：AGCAAGCTATTCGACAAGAG；

ZJ8-28：F：TAGCCTACAATGCATGTGACCAA，R：AGGTGAAAGGAGAAGCGGCG；

备注：引物序列见表1。

表1、OsFDC2基因的定位标记序列

4、基因预测和比较分析：

根据精细定位的结果，在38.2-kb范围内根据RiceAutomatedAnnotationSystem(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有4个候选基因(图3B)。根据两标记剩余的重组个体数，我们设计了各基因的测序引物，采用PCR方法分别从ylh1和野生型品种基因组中扩增出候选基因进行测序分析。发现ylh1突变体在LOC_Os03g48040的第5个外显子和第6个外显子剪接位点处发生1个碱基的替换突变，由G突变为A，使cDNA剪接发生变化，造成移码突变并在随后的第7个氨基酸后面翻译提前终止(图3C，D)。将此用不同的突变单株及群体中突变表型的单株，各重复验证三次，突变位点稳定存在(测序引物序列见表2)。根据BAC克隆OSJNBb0072E24序列的基因注释信息(NCBI)，预测此基因编码2Fe-2Siron-sulfurclusterbindingdomaincontainingprotein，参考拟南芥注释该基因命名为铁硫蛋白C2编码基因(Ferredoxinc2)OsFDC2，该基因全长3048bp，包含8个外显子和7个内含子，水稻中的OsFDC2基因与拟南芥中编码FDC2蛋白的基因有57％的同源率。

该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表的SEQIDNo：3所示。

该基因的cDNA如SEQIDNO：1所示，gDNA如SEQIDNO：2所示。

表2、OSFDC2基因的测序引物序列

实施例2：

植物转化：

以粳稻品种“日本晴”基因组为模板，根据目的基因设计引物：

F-5’-gctcggtacccggggatccATTAGTTTACGGAAAATAGATGGAC-3’

R-5’-aggtcgactctagaggatccAAGTCCTAAACCAAGAGAGAAGTG-3’。

PCR扩增体系为：50μL的PCR反应体系：模板DNA2μL；2×PCRbuffer25μL；2mmoldNTP(罗氏)10μL；KODFX(TOYOBO)酶1μL；10μMPrimerF3μL；10μMPrimerR3μL；ddH2O6μL；PCR扩增条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸8min；共35个循环；68℃下延伸10min，15℃保温。

备注说明：以粳稻品种“日本晴”基因组为模板。

PCR扩增后进行电泳分离，回收得到约6054bp的DNA片段，用BamHI酶切pCAMBIA1300(p1300)后进行同源重组，获得了互补载体pCAMBIA1300-OsFDC2，该克隆覆盖了整个ORF的基因组区域(即包含了SEQIDNo：2所示的核苷酸序列)，还包括ATG上游2314-bp启动子序列和TGA下游1212-bp终止子序列(如图4所示)。

这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体成熟种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有300mg/L潮霉素的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/L潮霉素预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同时期的突变体比较，转基因植株叶色恢复为正常绿色。

通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)。

说明：上文中所涉及的各种培养基的配方可参考TokiS.,HaraN.,OnoK.,OnoderaH.,TagiriA.,OkaS.,TanakaH.(2006)EarlyinfectionofscutellumtissuewithAgrobacteriumallowshigh‐speedtransformationofrice.ThePlantJournal47:969-976.

实施例3、

水稻原生质体的转化及OsFDC2绿色荧光融合蛋白的定位观察：

将FDC2基因cDNA序列克隆至pCAMBIA1301-S65T中构建GFP融合载体(图6A)，该pCAMBIA1301-S65T载体原始出处为：

RenD,LiY,ZhaoF,SangX,ShiJ,WangN,GuoS,LingY,ZhangC,YangZ,HeG.MULTI-FLORETSPIKELET1,whichencodesanAP2/ERFprotein,determinesspikeletmeristemfateandsterilelemmaidentityinrice.PlantPhysiol.2013；162(2):872-884。

具体包括如下内容：

(1)生长15天左右的水稻NIP幼苗用锋利的刀片在塑料培养皿板上切碎幼苗茎叶，移到200ml洗净的锥形瓶中(一般20ml酶解液每次60株左右；预先将酶解液倒入瓶中，根据瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜装太多。放入28度摇床，60-80rpm，4-6小时。

(2)在酶解时间完成之前，配置PEG400040％溶液，置于65℃水浴锅中或室温溶解，65℃溶解，中间取出来振荡一次。

(3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入约15ml左右的W5。用300目(或400目)的钢制滤网将碎叶片过滤掉，用干净的塑料培养皿收集酶解后的原生质体。然后将原生质体缓慢倒入(或用去枪尖的枪头吸取)50ml离心管中，天平称重平衡后，放入水平离心机，150g，5min，充分收集原生质体，离心完成后，缓慢吸走上清。

(4)向原生质体沉淀中加入1mlW5溶液，缓慢轻轻倾斜混匀重悬，然后用去枪尖的枪头吸移到2ml离心管中。此时50ml离心管中可能还有少量未重悬的原生质体，可再加入1mlW5溶解，吸移到之前的2ml离心管中，150g，3min，移除上清液。

(5)用MMG重悬，具体加多少根据原生质体的量和要转的质粒个数来定，一般最后每个质粒中加入100ul稀释的原生质体。或者用显微镜稍微观察下产量和酶解后完整个体的数目比例，然后根据原生质体的状态来确定MMG用量。

(6)准备转化用质粒(pCAMBIA1301-S65T、pCAMBIA1301-S65TFDC2)10-15ug左右或10ul，于2ml离心管中。

(7)加入100ul的重悬好的原生质体，然后加入PEG40％110ul，混匀。

(8)28度避光静置15min。

(9)加入足量的W5稀释，混匀，然后离心150g，3min，缓慢移除上清，再用W5洗一次(中间会有损失，但不影响结果)。最后得到的沉淀，用W5重悬(用2ml的管子装满)，轻轻混匀，移到细胞培养板中。用锡箔纸包裹，避光28度静置培养，14小时。

(10)培养时间完成后，将培养板各孔中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸移到2ml管中，然后离心150g，3min，去除上清，保留100ul左右上清液，重悬原生质体。

(11)共聚焦显微镜观察拍照。

结果显示阳性对照在细胞各个部位均有表达，说明实验的表达系统工作正常，OsFDC2GFP融合蛋白特异的在叶绿体中表达，其他部位未见表达，说明OsFDC2是定位于叶绿体中的蛋白(图6B)。

说明：上文中所涉及的各种溶液的配方可参考Zhangetal.Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglightchloroplast-relatedprocesses.PlantMethods2011,7:30.

实施例4、

4.1光合色素含量测定：

由于ylh1突变体表型与温度没有明显的相关性，因此我们在大田取样，分别测定苗期，分蘖期和抽穗期叶片叶绿素含量，同时测定光合速率。分别取突变体和NIP叶片去掉主脉，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10ml80％丙酮，26℃条件下暗培养48小时。取溶液在紫外分光光度计(DU800,BECKMANCOULTER)663nm、645nm和470nm三种波长下测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)的含量,按照Wellburn(1994)计算类胡萝卜素(Car)的含量，计算公式如下：

chla＝(12.7×OD₆₆₃－2.69×OD₆₄₅)×V/W

chlb＝(22.9×OD₆₄₅－4.68×OD₆₆₃)×V/W

car＝(1000×OD₄₇₀×V/W－3.27×Chla－104×Chlb)/198

其中：V为提取液体积(10ml)，W为叶片质量0.2g，OD₆₆₃、OD₆₄₅及OD₄₇₀为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。

用德国WALS公司产的GFS-3000型光合测定仪测定抽穗期突变体与野生型剑叶净光合速率，每个单株测一个主分蘖，20次重复计算平均值，净光合速率单位umol.m^-2.s^-1。

结果显示，与野生型相比，突变体在苗期、分蘖期和成熟期叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量均明显减少，其中苗期各个光合色素含量降低最为明显(图7A，7B，7C)。但Chla/b的比值在各个时期均明显增加(图7D)。突变体ylh1净光合速率较野生型NIP明显降低(图7E)。由此推断，突变体的表型变化是由于叶绿素和类胡萝卜素缺失引起，而黄绿叶晚抽穗的表型会影响水稻净光合速率。为了验证互补转基因苗在叶绿素含量、净光合速率方面是否得到回复，我们也测定了相关数据，测定结果显示互补转基因苗在叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量方面均已恢复至NIP的水平(图9A)，而叶绿素a/叶绿素b的比值和净光合速率也与NIP基本一致(图9B)，这些结果说明将NIP的FDC2基因转入ylh1突变体中，可完全回复突变体的突变表型。

4.2.铁元素含量测定：

以分蘖期新抽出的突变体和野生型水稻叶片为待测样品，样品前处理及上样检测方法参考赵肖华等(2012)、许萍等(2011)，使用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法检测铁元素含量。测定结果显示突变体(ylh1)中铁元素含量明显低于野生型NIP(图7F)，这说明FDC2基因突变后会引起水稻铁元素含量的减少，从而引起突变体叶片颜色的改变。

[1]赵肖华,曹赵云,牟仁祥,许萍,陈铭学.液相色谱-串联质谱法测定蔬菜、水果中5种阿维菌素类药物残留量[J].分析测试学报,2012,10:1266-1271.

[2]许萍,陈铭学,牟仁祥,金冬梅,周蓉.ICP-MS混合模式测定植物性农产品中的9种痕量元素[J].分析测试学报,2011,10:1138-1142.

实施例5、

叶绿体透射电镜的制备和观察:

(1)样品:取突变体苗期叶片和对照野生型苗期叶片，切成0.5～1mm3左右的小块；

(2)固定：将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；

(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理20分钟；

(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3：1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1：1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；

(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；

(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用HitachiH-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。

结果显示野生型叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒片层层次丰富，排列紧密。突变体叶片相比野生型虽然叶绿体数目的变化不大，但基粒堆叠层数明显减少，而且排列没有野生型那么紧密、整齐，嗜锇颗粒明显增加(图8)。观察结果表明基因突变造成了突变体中叶绿体结构发育缺陷。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质为SEQIDNo：3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2编码的蛋白质，其特征在于：所述氨基酸序列还包括在SEQIDNo：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

3.编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于：该基因具有SEQIDNo：1、SEQIDNo：2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述核苷酸序列还包括在SEQIDNo：1、2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

5.一种含有权利要求3或4所述基因的质粒。

6.一种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞含有权利要求3或4所述的基因序列。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

9.如权利要求3或4所述基因的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶片颜色得以改良。

10.一种改良水稻叶片颜色、影响水稻Fe含量及对Fe的耐受度、提高光合效率、调节水稻抽穗期的方法，其特征在于：包括用具有SEQIDNo：1、2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。