CN109609515A

CN109609515A - 一种低温逆境下调控叶绿体生长发育并影响叶色的基因cde4及应用

Info

Publication number: CN109609515A
Application number: CN201910060051.6A
Authority: CN
Inventors: 胡培松; 魏祥进; 刘新勇; 张习春; 唐绍清; 焦桂爱; 圣忠华; 谢黎虹; 邵高能; 胡时开
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109609515B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种控制低温逆境下水稻叶绿体生长发育与叶片颜色的基因CDE4及其应用。该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。该基因编码的三角五肽重复蛋白具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。该基因能够在低温下使水稻叶片维持正常绿色。该基因发生突变可以导致低温下水稻幼苗叶片颜色显示为白条纹状。该基因突变体幼苗叶片白色可作为标记性状用于杂交育种和良种繁育，不但可以测定种子纯度，还可在苗期剔除假杂种。

Description

一种低温逆境下调控叶绿体生长发育并影响叶色的基因CDE4 及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻CDE4基因，利用转基因实验鉴定该基因的功能，及其该基因在杂交育种和良种繁育中的应用。

背景技术

叶片是植物进行光合作用的主要器官，水稻籽粒中2/3以上的干物质是开花后通过光合作用获得的(王旭军, 徐庆国, 杨知建 (2005) 水稻叶片衰老生理的研究进展. 中国农学通报 21: 187-190)，光合作用的效率与叶绿体结构和功能是否完整、光合作用复合体的稳定性、叶绿素含量的高低都有着复杂的关系。近年来，叶色的应用价值备受关注，叶色变异可以作为标记性状，在水稻杂交育种和良种繁育发挥重要作用，不但可以用于苗期剔除受外源花粉污染的种子和假杂种，还可以用于测定种子纯度（章志兴, 陈善福 (2001)叶色标记技术在杂交水稻种子生产中的应用. 种子科技 19: 33-34)。另外，叶色突变体的研究对有效利用基因工程提高水稻的光合能力，培育高光效水稻，增加水稻产量具有重要的理论意义和应用价值。

目前，利用水稻叶色突变体，已经克隆出多个参与或调控叶绿素代谢和叶绿体发育的基因，通过分析基因功能、表达模式、基因间互作以及核-质信号传导，初步了解了水稻叶色形成及调控机理。叶绿体通过光合作用合成植物激素和生产代谢产物，对植物正常的生长和发育过程起着重要的作用。叶绿体的形态结构、叶绿素的含量与植物的光合作用及其生长发育密切相关。而在陆生植物中存在一个庞大的蛋白家族——PPR（Pentatricopeptide repeat）蛋白，PPR 蛋白是有由核基因编码，然后转运到线粒体或是叶绿体中，通过结合细胞器 m RNA 来参与到转录后调控过程中。PPR 蛋白是识别 RNA 序列以及在各个转录后调控功能中复合体的其他成员。因此PPR蛋白在叶绿体中的发育起着重要的作用。

本发明发现的一种低温逆境下调控叶绿体生长发育并影响叶色的基因CDE4，其编码蛋白为一种PPR蛋白，关于水稻中该基因的克隆及生物学功能研究还未见报道，拟南芥及其他物种中的同源蛋白也没有报道。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种从水稻低温白条纹叶突变体中克隆一个新基因CDE4，该基因编码一个PPR家族蛋白，调控低温下水稻叶绿体正常发育与叶片颜色的正常形成。

为了解决上述技术问题，本发明采用的具体技术方案为：

所述的一种低温逆境下调控叶绿体生长发育并影响叶色的基因CDE4，其特征在于该基因的核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

所述的基因编码的三角五肽重复蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列为：

1）SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；或

2）SEQ ID No.3 所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

所述的基因在培育叶绿体发育状况变化的转基因植物中的应用。

所述的基因在培育高光合速率的转基因植物中的应用。

所述基因CDE4的突变体基因cde4，其特征在于该突变体基因核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，其CDS序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的突变体基因编码的氨基酸，其特征在于该氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的基因的突变体水稻材料表现出来的低温白叶性状作为标记性状在杂交育种和良种繁育中的应用。

本发明的具体实施步骤如下：

一．水稻白条纹叶突变体cde4表型及生理学分析

突变体cde4来自于中花11（ZH11）突变体库，该突变体库由EMS诱变得到。cde4对低温敏感，在20℃条件下，突变体苗期出现严重的白化叶，而在32℃环境下突变体与野生型叶色没有明显差异，在25℃环境下，与野生型ZH11相比，突变体表现出白条纹叶性状（图1A-F）在杭州大田自然高温环境下突变体产量等重要农艺性状与野生型无明显差异（图2A-F）。

进一步分析了突变体cde4与其野生型水稻幼苗叶片叶绿素含量的差异，结果显示在20℃低温条件下，突变体的叶绿素a和叶绿素b都极显著的低于野生型，含量分别仅为野生型的7%与8%；25℃条件下突变体的叶绿素a和叶绿素b都有所增加，但是还是极显著的低于野生型，分别约为野生型的62%与65%；32℃条件下突变体的叶绿素a、b含量仍然低于野生型，但是与野生型的差距进一步缩小（图3A,B）。另外，我们还分析了突变体与野生型在20℃低温环境条件下的叶绿素合成速率，首先野生型ZH11与突变体cde4在20℃低温暗培养7天，然后恢复正常光照，并持续调查叶绿素恢复合成情况。结果显示野生型ZH11在恢复光照后叶绿素含量持续显著增加，而突变体cde4在恢复光照后12小时内叶绿素含量有小幅增加，然后继续增加不显著，一直维持在极低的水平（图3C），说明突变体cde4在低温环境下叶绿素合成受到极大影响。

利用透射电镜对野生型与突变体cde4的叶绿体进行显微观察发现：在20℃低温环境下,突变体cde4幼苗叶片叶肉细胞中基本观察不到正常的叶绿体，只有少数的囊状未发育成熟的叶绿体结构；在25℃环境下的突变体叶片中部分叶肉细胞有类似于野生型的正常叶绿体，而部分叶肉细胞内仍然观察不到成熟叶绿体；而在32℃条件下，突变体与野生型类似，叶绿体发育正常（图4）。该结果说明在低温环境胁迫下突变体cde4叶肉细胞内叶绿体发育异常。

二、水稻叶绿体发育相关基因CDE4的遗传分析与图位克隆

利用突变体cde4与籼稻品种南京11进行杂交，观察发现杂种F₁低温胁迫下幼苗叶片与野生型一致为正常绿色，而F₂群体在低温环境下出现正常表型苗与白化苗分离情况，叶片为正常绿色的苗数与白化苗分离数分别为227和70，分析表明卡平方χ ²（3:1）=0.324，p=0.569； P > 0.05，符合3:1的遗传分离比例。因此突变体cde4低温白化性状符合单隐性核基因的遗传分离规律。

利用F₂群体中分离出的白化苗对突变体基因进行精细定位，选取1067个白化分离单株进行定位，将cde4基因定位在第8条染色体短臂上RM1376和RM6471之间。并开发更多的多态性SSR或Indel标记，最后把突变基因定位在物理距离为38.0Kb染色体区间内（图5A）。分析发现该区域一共包含8个开放阅读框（ORFs，图5B），对该区间DNA测序比对后发现，相对于野生型ZH11，突变体cde4在第三个ORF（ORF3）的第二外显子与内含子交界处发生了1个单碱基替换，导致了cde4中该基因的转录方式发生改变，CDNA缺失9个碱基，翻译后蛋白质缺失3个氨基酸（图5C）。经预测发现CDE4（ORF3）编码蛋白是一个三角五肽重复（PPR）家族蛋白，该PPR蛋白的功能仍然未见报道，因此是CDE4是一个新的水稻PPR蛋白。

为了进一步确认ORF3的突变导致了突变体cde4在低温环境下幼苗白条纹、叶绿素合成不足、叶绿体发育异常等表型，我们开展了功能互补实验。通过PCR及重组连接等方法将ZH11的ORF3基因全长DNA序列克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1300中，然后通过农杆菌介导法的转化突变体cde4的愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。观察发现在低温环境下转基因阳性植株的幼苗恢复了与野生型一样的正常绿色（图5D-G），同时转基因阳性植株叶肉细胞内叶绿体发育也恢复了正常，叶片叶绿素含量及光合作用速率回复到了野生型水平（图5H-L）。因此，编码PPR蛋白的ORF3即CDE4基因，该基因的突变引起了突变体的表型异常。

本发明利用一个水稻苗期低温白条纹叶突变体，通过图位克隆法的方法分离到了CDE4基因，该基因编码一个PPR家族蛋白蛋白。通过转基因互补实验鉴定了CDE4基因的功能。本发明克隆的CDE4基因能在低温下调控水稻的叶色，维持期正常的叶绿体发育及光合作用；同时该基因突变体幼苗叶片白色可作为标记性状用于杂交育种和良种繁育，不但可以测定种子纯度，还可在苗期剔除假杂种。

附图说明

图1：野生型和突变体不同时期的表型。A-F分别为野生型中花11与突变体cde4幼苗期在20ºC（A, D）、25ºC（B, E）、32ºC（C, F）环境处理下的表型，图中左边是ZH11，右边是cde4；G, H 分别为野生型中花11与突变体cde4在杭州自然高温环境下分蘖期（G）与成熟期（H）的表型，图中左边是ZH11，右边是cde4。

图2：野生型中花11与突变体cde4在杭州自然高温环境下产量相关农艺性状分析。A-F分别为株高；单株穗数；每穗粒数；结实率；千粒重；每株产量。每个数据统计10株，用Student’s t–test (* P < 0.05; ** P < 0.01)进行显著性差异分析。

图3：野生型与突变体cde4叶绿素含量比较。A, B为野生型和突变体叶3叶期幼苗绿素a（A）与叶绿素b（B）含量分析。C为野生型和突变体cde4由持续黑暗转为正常日照培养环境后叶绿素积累速率比较。所有数据独立3次生物学重复。

图4：野生型ZH11和突变体cde4在不同温度环境下幼苗叶肉细胞叶绿体显微结构比较。A-D为20℃条件下野生型和突变体3叶期第2叶片叶绿体超微结构；E-H为20℃环境下叶绿体结构分析；I-L为32℃环境下叶绿体结构分析。

图5：CDE4基因的图位克隆与功能互补。A CDE4基因的精细定位；B 精细定位区间候选基因分析；C CDE4的基因结构及野生型与突变体的差异；D, E 野生型ZH11的CDE4基因转入突变体，转基因阳性植株回复了正常叶色表型；F 利用野生型与突变体cDNA 9bp差异开发标记鉴定转基因植株；G Western blot鉴定转基因植株；H-J 转基因互补植株叶绿体显微结构回复正常；K, L 野生型、突变体和转基因互补植株苗期叶片叶绿素含量光合速率分析。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。

实施例1：CDE4基因的图位克隆

a)水稻材料

水稻（Oryza sativa L）突变体cde4，原始野生型材料为粳稻品种中花11(ZH11)。

b)叶绿素含量及光合特性的测定

选饱满的突变体和野生型种子浸种催芽，把已发芽的突变体和ZH11的种子播种于钵子中，放置于20℃、25℃和32℃，光照12h，暗处理12h的人工气候箱中培养。观察并记录突变体表型。于三叶期取叶片测定叶绿素含量。

叶绿素含量的测定：取待测样品0.1g-0.2g浸泡于10ml 95%的乙醇，放置于4℃的冰箱中浸提色素48h左右。以型分光光度计测定665nm、649nm、470nm波光下的OD值。利用Lichtenthaler法进行修正的公式计算叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)的含量。

Chla含量（mg/g）=（13.95O.D665-6.88O.D649）V/1000W

Chlb含量（mg/g）=（24.96O.D649-7.32O.D665）V/1000W

注：O.D：测定波长下的光密度值。

V：叶绿素提取液总体积（mL）。若测定用的是稀释液，应乘以稀释倍数。

W：材料鲜重（g）。

c)叶绿体结构电镜观察

利用透射电镜（TEM）观察20℃、25℃和32℃条件下野生型和突变体cde4第三片叶的叶绿体超微结构。

d)遗传分析和定位群体

选取突变体和南京11进行杂交，F1代自交后衍生F2群体，F2群体正常叶色与白条纹叶单株发生分离，通过观察F1幼苗叶片表型及调查F2群体正常叶色与白条纹叶色单株分离比例确定突变体表型显隐性；从F2群体中共挑选出1067个白条纹叶分离单株作为定位群体。在三叶期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA进行基因定位。

e) CDE4基因的初步定位和精细定位

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA,该DNA抽提的方法为SDS法(Dellaporta et al. 1983)。取大约100mg水稻叶片剪碎后放入2ml离心管，加入钢珠经液氮冷冻后，在磨样机上粉碎，然后提取DNA,获得的DNA沉淀溶解于400μL超纯水中，每一个PCR反应用1μLDNA样品。

在CDE4基因的初步定位中，首先用由28个具有突变表型的F2个体进行SSR分析。首先根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各染色体上的SSR引物进行PCR扩增（反应体系如下）。通过8%的聚丙烯酰胺凝胶（凝胶配置方法如下）电泳分离，通过检测条带的多态性，将基因初步定位到第8染色体的短臂上。

PCR反应体系：

8%聚丙烯酰胺凝胶配方：

聚丙烯酰胺凝胶显色液配方：

注：甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。

进一步发展了新的分子标记，利用1067个F2白条纹极端个体进行精细定位，将CDE4精确定位于标记Ind3和Ind5之间38.0kb区间内，（图3），通过分析此区段开放阅读框（ORF）推测候选基因并基因测序分析，寻找突变位点。

新开发分子标记引物序列（L为SSR标记；Ind为Indel标记）：

L1F (SEQ ID NO.7) 5' TGCGAGTATTTAACTCACCCATCC 3'；

L1R (SEQ ID NO.8) 5' CTTGCCTCACAAGATCCAAACC 3'；

L2F (SEQ ID NO.9) 5' TAGGTTGGCAGACCTTTTCG 3'；

L2R (SEQ ID NO.10) 5' GTCAAGATCATCCTCGTAGCG 3'；

Ind1F (SEQ ID NO.11) 5' GTCAGCGACACACGTCAGAT 3'；

Ind1R (SEQ ID NO.12) 5' ATGCATGGCTGCTAGGGTAG 3'；

Ind2F (SEQ ID NO.13) 5' GCTCAAGTACTGGGGCTGAG 3'；

Ind2R (SEQ ID NO.14) 5' TTGGTTTGTGGTGTTCTGGA 3'；

Ind3F (SEQ ID NO.15) 5' AGTGATAATCTGGATTTGTA 3'；

Ind3R (SEQ ID NO.16) 5' AAAATTCCATGCTTGCTAAA 3'；

Ind4F (SEQ ID NO.17) 5' CTCAAGGAGTACCTGGCAGC 3'；

Ind4R (SEQ ID NO.17) 5' CAAGGCAAGCATGCAAGTAA 3'；

IndF (SEQ ID NO.19) 5' ATATTGGGGCAGGTAGATCC 3'；

Ind5R (SEQ ID NO.20) 5' ACCCGGTTTGTGGAAGATAA 3'；

Ind6F (SEQ ID NO.21) 5' ATGGCAATCCAATTCCAACA 3'；

Ind6R (SEQ ID NO.22) 5' ATAAGCAAGCGTCGCAACTT 3'；

Ind7F (SEQ ID NO.23) 5' ATTGCTGAAAGATTGCTGGG 3'；

Ind7R (SEQ ID NO.24) 5' ATTGGATCCCTAAACCGGAA 3'；

Ind8F (SEQ ID NO.25) 5' TTTCTCTATGCGTGTGCTGC 3'；

Ind8R (SEQ ID NO.26) 5' AATTGCTGGGGAGGATTTCT 3'。

经过对该区段所有候选基因测序比对，发现该区段8个ORFs,只有ORF3在野生型与突变体中存在差异，相对于野生型ZH11，突变体cde4在第三个ORF（ORF3）的第二外显子与内含子交界处发生了1个单碱基替换，导致了cde4中该基因的转录方式发生改变，CDNA缺失9个碱基，翻译后蛋白质缺失3个氨基酸（图5C），因此判定候选基因ORF3就是CDE4，该基因的突变导致突变体低温幼苗白化表型。

CDE4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码区cDNA核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，该CDE4基因编码的蛋白质核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

而突变体基因cde4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其CDS序列如SEQ ID NO.5所示，该突变体基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例2：转基因实验

植物转化：

1．载体构建

将CDE4基因的完整基因组序列通过In-fusion重组酶系统（http://bioinfo.clontech.com/infusion/）将其重组到pCAMBIA1300表达载体中，首先利用BanI,HandIII酶切pCAMBIA1300表达载体，使其线性化，在利用引物1300-1F，1300-1R通过PCR扩增野生型基因组DNA,电泳检测切胶回收，利用In-fusion重组酶系统将PCR产物重组到pCAMBIA1300表达载体，测序确认没有发生碱基突变，把构建好的载体通过热击的方法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株中。

扩增CDE4序列的引物序列为：

1300-1F: 5’-ACGAATTCGAGCTCGGTACCTCCATGACTTCCCACAAACT (SEQ ID NO.27)

1300-1R: 5’- GGCCAGTGCCAAGCTTCAGATTGGACGGCAGAAAGT (SEQ ID NO.28)

2.遗传转化：

（1）转化受体的选择

将突变体cde4种子成熟胚诱导愈伤组织，经过诱导培养基增减2周后将胚芽剪下，继续培养1周，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。

（2）遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei et al. 1994),将pCAMBIA1300空载体和pCAMBIA1300:CDE4载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有120mg/L潮霉素的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有120mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现转空载体的转基因植株表型与cde4相比不发生变化，即剑叶、幼穗仍然表现白化，而阳性转基因植株与野生型表现一致，即cde4的突变表型得到了恢复，见图5。

综上所述，SEQ ID No.1为一种低温逆境下调控叶绿体稳定发育的基因，该基因具有调控叶绿体发育及光合作用功能。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种低温逆境下调控叶绿体生长发育并影响叶色的基因CDE4及应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4409

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

gaggggctcg ctgtctcatc actctgtaac cgataaggct gccgccattg ctgctgctgc 60

tgctgcttcc gccgcgtcgc cttctccggc gatggaggcg gcggcggcga ttggaggggc 120

gcggtccccg ctctccttct cctccagcct ctggtaagcg cgcgcgcgcc ctcctcctcc 180

tctcgcagta gctcccacta ggctcgcgcg gcggcgcggc ggcgcggcga ctcgtgttga 240

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ctcaccttaa cacatttttt gctttgcagg gttgagcctg atctctgttc ttacacaaca 3600

atggtcttag cttatgtgaa tgcttctgac atggatgggg ctgagaaatt cttccgccgg 3660

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<400> 13

gctcaagtac tggggctgag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 14

ttggtttgtg gtgttctgga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 15

agtgataatc tggatttgta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 16

aaaattccat gcttgctaaa 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 17

ctcaaggagt acctggcagc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 18

caaggcaagc atgcaagtaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 19

atattggggc aggtagatcc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 20

acccggtttg tggaagataa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 21

atggcaatcc aattccaaca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 22

ataagcaagc gtcgcaactt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 23

attgctgaaa gattgctggg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 24

attggatccc taaaccggaa 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 25

tttctctatg cgtgtgctgc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 26

aattgctggg gaggatttct 20

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 27

acgaattcga gctcggtacc tccatgactt cccacaaact 40

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 28

ggccagtgcc aagcttcaga ttggacggca gaaagt 36

Claims

1.一种低温逆境下调控叶绿体生长发育并影响叶色的基因CDE4，其特征在于该基因的核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

2.如权利要求1所述的基因编码的三角五肽重复蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列为：

1）SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；或

3.含有权利要求1所述的基因在培育叶绿体发育状况变化的转基因植物中的应用。

4.含有权利要求1所述的基因在培育高光合速率的转基因植物中的应用。

5.如权利要求1所述基因CDE4的突变体基因cde4，其特征在于该突变体基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其CDS序列如SEQ ID NO.5所示。

6.如权利要求5所述的突变体基因编码的氨基酸，其特征在于该氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

7.含有权利要求5所述的基因的突变体水稻材料表现出来的低温白叶性状作为标记性状在杂交育种和良种繁育中的应用。