CN103232534B - 花生光敏色素AhphyA编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及花生光敏色素AhphyA编码基因及其应用。一种花生光敏色素AhphyA，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了编码该光敏色素AhphyA的基因及应用。本发明为阐明光影响花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在高产、优质花生新品种培育方面具有重要指导意义。

Description

花生光敏色素AhphyA编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及花生光敏色素AhphyA编码基因及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

我国食用油供给长期处于短缺状态，自给率不足50%，进口量远远超过国内生产总量，是世界上第一大食用油及其原料的进口国。花生是我国最重要的油料作物之一，我国花生总产占全国油料作物总产量的1/2，占世界花生总产的2/5，居世界第一位。花生生产对保障我国粮油安全具有重大意义。然而，我国花生产业仍面临着十分严峻的问题。花生产量和含油量的进一步提高仍然是我国花生品种培育的最重要课题。

加大生物技术在种质创新和品种培育中的力度是实现我国花生品种改良新飞跃的关键。然而，由于对花生重要农艺性状形成的分子机理知之甚少，花生的分子生物学研究也远落后于其他农作物，为了促进花生在我国油料产业中发挥更重要的作用，缓解我国油料及食用油短缺的现状，必须加快推动花生的分子生物学研究进程，在理论上阐明决定高产、优质与抗逆性状的遗传与分子基础。

植物果实是多种农作物的收获器官，果实的正常生长发育直接影响到种子的产量和品质。花生的荚果发育与其他作物有一定的差异。花生开花受精后，子房基部的分生细胞迅速分裂，大约在开花后3-6天，即形成肉眼可见的子房柄。子房柄连同位于其尖端的子房合称果针。子房的生长最初略呈水平生长，不久即弯曲向地，入土后到达一定深度，子房开始横卧生长，子房柄即停止伸长。花生结果时喜黑暗、湿润和机械刺激的生态环境。在黑暗条件下，由于光信号的变化，诱导了植物激素合成和信号传导的变化，花生的胚珠和子房开始发育膨大，并最终形成荚果（种子和果皮）。因此，阐明光影响花生荚果发育的分子机理，不仅具有重要的理论价值，而且在高产、优质花生新品种培育方面具有重要指导意义。

光信号调控花生荚果初期的发育，而光敏色素（phytochrome）是光信号的受体，是调控植物生长发育的关键因子。光敏色素是一种可溶性色素蛋白质，包括两个结构域；N-端结构域和C-端结构域。在植物黄化苗中，光敏色素以不具有活性的Pr构象存在于细胞质中，当植物受到光照射后，光敏色素分子转变成具有生物活性Pfr构象。Pfr形式的光敏色素转移到细胞核中，与核内的其它蛋白质相互作用，如光敏色素相互作用因子（phytochrome-interactingfactors,PIFs)等，从而调控光形态建成，如种子萌发、幼苗去黄化、避荫反应、光周期开花和育性等（Quail,2002;Rockwell et al.,2006;Kevie et al.,2007;Franklin and Quail,2010）。目前，在拟南芥中已经鉴定了二十多个与光敏色素相互作用的蛋白质，其中有一类直接调节光反应的basic helix-loop-helix转录因子（被称为PIFs,phytochrome-interacting factors)。这类转录因子或正调控或负调控光反应（Castillon et al.,2007;Leivar and Quail,2011）。PIF3是第一个被发现的PIFs家族成员，最初是在用光敏色素B的C端做诱饵的酵母双杂交实验中发现的(Ni et al.,1998)。随后进一步的体外co-IP实验证明，PIF3只能和光敏色素A、光敏色素B的活化形式Pfr相互作用，而且与Pfr形式的光敏色素B的N端的相互作用比对C端的强，但N端与C端对它们相互作用的特异性都起作用。PIF3是能与光敏色素直接相互作用的信号因子，通过与被光活化的光敏色素相互作用将光信号传导下去。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供花生光敏色素AhphyA及其编码基因与应用，为研究光调控花生荚果发育的信号途径以及通过基因工程改良花生奠定了基础。

一种花生光敏色素AhphyA，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。花生光敏色素AhphyA为花生中的光信号受体。

编码花生光敏色素AhphyA的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码花生光敏色素AhphyA的基因。

该载体可购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO.2导入载体，即可获得含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的载体。

一种重组细胞，含有上述编码花生光敏色素AhphyA的基因或者上述重组载体。

上述编码花生光敏色素AhphyA的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作物品质中的应用。

有益效果

本发明公开了一种花生光敏色素AhphyA及其编码基因，从而为阐明光影响花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在高产、优质花生新品种培育方面具有重要指导意义。

附图说明

图1AhphyA在不同组织中的表达模式，其中1-10分别是幼根，幼茎，幼叶，成年茎，成年叶，花，果针入土0天，果针入土3天，果针入土9天，种子；

图2AhphyA正义表达载体的构建过程示意图；

图3VLFR条件下拟南芥种子萌发率的测定。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。

实施例1：花生中phyA的克隆

通过分析花生果针和荚果发育早期转录组高通量测序的信息，将短片段拼接成较长的基因片段，获得Uni-EST，通过3’race获得phyA基因全长开放读码框（ORF）。该基因长度3378bp，编码产物光敏色素A，其编码1125个氨基酸残基，氨基酸残基聚合成二聚体。光敏色素A主要由两个结构域构成：一个是分子量为70kDa位于N末端的光感受区域，另一个是55kDa的C末端光调节区域。光感受区域和光调节区域通过铰链区连接在一起。光感受区域包括后色胆素裂解酶亚结构域(bilin lyase domain,BLD)和光敏色素亚结构域(phytochrome domain,PHY)。光调节区域含有2个PAS(Per/Arnt/Sim)同源重复序列和1个组氨酸激酶类作用区(histidine kinase related domain,HKRD)，这一结构在光信号转导中发挥着重要作用。

3'RACE反应使用的是TaKaRa宝生物公司3'-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒，该试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以从较少样品中扩增得到低丰度的基因，并且对长片段的3'RACE扩增具有明显优势。使用TaKaRa LA Taq扩增得到的PCR产物3'端附有一个“A”碱基，其产物可直接克隆于T-Vector中。反转录引物3'RACEAdaptor Primer含有由TaKaRa独特设计的dT区域，反转录效率高。具体步骤如下：

1.1植物中RNA的提取：

（1）参照CTAB-LiCl法，称取0.2g新鲜组织或-70℃保存的样品，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。

（2）将研好的组织迅速转移至预热（65℃）的含有600μl CTAB提取液的Ep管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀。

（3）65℃水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次。

（4）稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12000rpm离心15min。

（5）将上清转移到另一新的Ep管中，加入2μl的DNase I，37℃水浴15min。

（6）再加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min。

（7）将上清转移到另一新的Ep管中，加入1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M，4℃过夜沉淀。

（8）4℃，12,000rpm离心20min，弃上清。

（9）分别用70%乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50μl DEPC-H₂O，溶解沉淀。

1.2反转录反应

①反转录反应，反应体系如下：

②反应条件：42℃，60min；70℃，15min。

③反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于-20℃。

1.3套式PCR反应

通过已经测序得到的片段，利用olige6.0软件在此片段上设计与3'RACE试剂盒中的outer引物和inner引物配对。

3’RACE：

3O：5’-ACAAGCATTGCATGTTCAGCGAATATC-3’

3I：5’-GATGGTTACTTGGATCTTGAGA-3’

使用TaKaRa LA Taq(TaKaRa Code:DRR02)*1进行PCR反应时的实验操作如下：

①先进行Outer PCR反应，反应体系如下：

②按以下条件进行PCR反应：

置PCR仪上按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min。

PCR反应结束后，取5～10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物，于-20℃保存。若没有得到目的扩增产物，可进行Inner PCR反应。

④Inner PCR反应，反应体系如下：

⑤按以下条件进行PCR反应。

置PCR仪上按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min。

⑥PCR反应结束后，取5～10μL的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3'RACE PCR扩增产物，于-20℃保存。

实施例2：基因AhphyA在不同组织中的表达模式分析

1、植物中RNA的提取同实施例1中的1.1步骤

2、单链cDNA的获得及表达模式分析：

以花生的根（25天）、茎（15天）、叶（15天）、花、果针入土0天，3天，9天以及种子的RNA为材料，利用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（购自TaKaRa公司）试剂盒反转录成单链cDNA，用于之后的QRT-PCR。

以Actin为体系内标，引物序列为：

T63(F):5’-GCCCAACTAGCGAGTCGAAC-3’；

T63(R):5’-CAGAACCCAGAAGGCTCTCC-3’。

用于AhphyA荧光定量的引物为：

AhphyAqF：5’-AGACTTCTGGGAAACCCTTCTATGC-3’；

AhphyAqR：5’-ATAGGAACTTCATAAGGCTTGACGG-3’；

荧光定量PCR反应条件为：95℃10min；之后95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。结果显示：AhphyA在花生的根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达，在成年叶中表达量最高，花中次之，入土后9天和入土0天的果针中表达量最低。（如图1所示）。

实施例3：AhphyA正义表达载体pROKⅡ-AhphyA的构建（如图2所示）

1、以限制性内切酶BamHⅠ和限制性内切酶SmaⅠ分别双酶切质粒pROKⅡ、质粒pMD18-T-AhphyA，37℃酶切4h，限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶SmaⅠ对质粒进行双酶切体系如下：

2、电泳后分别切取11kb的pROKⅡ质粒和3378bp的AhphyA片段，用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，具体步骤如下：

（1）将凝胶放在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量，每个管中胶的重量不能超过300mg。

（2）按100mg胶加300μl溶胶液的比例，室温溶胶（或50℃溶胶），其间偶尔摇动；装柱，9000rpm，离心30s；去掉废液。

（3）500μl漂洗液（wash buffer）漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。倒掉废液以后，再于12000rpm离心2min。

（4）将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加入合适体积的洗脱缓冲液（Eloution buffer,通常用30μl-50μl），室温放置2-5min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，其中质粒pROKⅡ回收的DNA片段为pROKⅡ片段、质粒pMD18-T-AhphyA回收的DNA片段为AhphyA片段。

3、将两个回收片段用T4连接酶连接，构建成AhphyA正义表达载体pROKⅡ-AhphyA。连接体系如下：

将上述a、b、c、d反应物混匀，16℃反应过夜，制得正义表达载体pROKⅡ-AhphyA，用于转化大肠杆菌DH5α。

4、大肠杆菌感受态细胞的制备

（1）挑取E.coil DH5α（购自天根生化科技有限公司）单菌落接种到约5ml的LB液体培养基，于37℃，250rpm震荡培养过夜。

（2）次日将菌液以1%的接种量转移至100ml的液体培养基中，继续培养至吸光度(OD)600=0.4。

（3）将此菌液冰浴10min,在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

（4）重悬于10ml预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

（5）重悬于2ml(含15%甘油)的预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，分装成100μl/管，-70℃保存备用。

5、转化

（1）从-70℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞置于冰上溶解。

（2）将正义表达载体pROKⅡ-AhphyA5μl加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。

（3）42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管。

（4）热激完毕后立即取出放于冰上2min。

（5）加入890μl的LB液体培养基，37℃，200rpm孵育1h。

（6）将菌液涂布在卡那（Kan）抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。

（7）将平板放入4℃保存。

6、阳性克隆的菌液PCR检测

（1）从转化的平板上挑取白色菌落接种到LB液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养3-4h。

（2）PCR反应体系：Taq酶缓冲液（含有Mg²⁺）2.5μl,dNTP(2.5mM)1μl，AhgphyAF引物、AhgphyAR引物（10μM）各1μl，菌液2μl，Taq酶（博大泰克公司产）0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl；

上述引物序列如下：

AhgphyAF：5’-AGACTTCTGGGAAACCCTTCTATGC-3’；

AhgphyAR：5’-ATAGGAACTTCATAAGGCTTGACGG-3’；

（3）PCR反应程序：98℃10min,94℃45s,55℃45s,72℃1.5min,34循环,72℃10min,4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一3378bp左右的条带。

7、质粒的提取

（1）将菌液PCR阳性的菌液于37℃，250rpm震荡培养过夜。

（2）将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min,收集菌体。

（3）倒取上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出。

（4）加入100μl预冷的溶液Ⅰ，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液Ⅰ配方为：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、10mmol/L EDTA（pH8.0）。

（5）加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，快速颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液Ⅱ配方为：0.2mol/L NaOH、1wt%十二烷基硫酸钠（SDS）。

（6）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和地颠倒10次，冰浴5min，4℃12000rpm离心10min，其中所述溶液Ⅲ配方为：5mol/L乙酸钾60ml、3mol/L冰乙酸11.5ml、H₂O28.5ml、pH5.2。

（7）将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为25:24:1），反复混匀，4℃12000rpm离心10min。

（8）将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24:1），反复混匀，4℃12000rpm离心10min。

（9）将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积预冷（-20℃）的异丙醇，混匀后-20℃沉淀1h,4℃12000rpm离心10min。

（10）倒掉上清，加入500μl70%的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥。

（11）加入适当体积的TE溶液和2μl RNaseA，37℃消化0.5h，制得质粒。

8、质粒的酶切检测

（1）限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶KpnⅠ对质粒进行双酶切体系：

（4）37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一条3378bp左右的条带和11Kb左右的条带。

9、序列测定

以上步骤中获得的阳性克隆pROKⅡ-AhphyA由山东省农科院高新技术研究中心测序。

实施例4：pROKⅡ-AhphyA正义植物表达载体转化农杆菌

1、农杆菌感受态细胞的制备

（1）挑取单菌落（EHA105）接种到约3ml的YEB液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养至OD600=0.5。

（2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min。

（3）5000rpm离心30S，弃去上清液。

（4）沉淀用1.5ml0.5M NaCl悬浮，冰浴20min。

（5）5000rpm离心30s，弃去上清液。

（6）每管用100μl20mM CaCl₂悬浮，用于转化，-70℃保存备用。

2、DNA直接转化农杆菌

（1）50μl农杆菌感受态细胞中加入pROKⅡ-phyA表达载体质粒DNA0.1-1μg（5-10μl），之后冰浴30min。

（2）放入液氮中1.5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min。

（3）取出离心管，加入0.5ml的YEB，于28℃，220rpm震荡培养3至5小时。

（4）取出菌液于含有相应抗生素的YEB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2天左右菌落可见。

3、重组农杆菌鉴定

（1）挑取单菌落，接种于含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的YEB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。

（2）菌液PCR鉴定步骤同实施例3中步骤3.6。

实施例5：农杆菌介导转化拟南芥野生型和phyA-211突变体植株（拟南芥野生型和phyA-211突变体植株购自美国拟南芥资源中心，ABRC）

1、当拟南芥开花，并且许多小的花序开花，植物可以用来侵染。

2、摇农杆菌过夜。

3、离心5000rpm10分钟，去上清。

4、加入等体积的侵染液（含5wt%蔗糖，0.02wt%silwet）重悬。

5、浸花45s。

6、弱光培养1天。

7、正常培养，收集种子，分别制得WT/AhphyA拟南芥种子和phyA-211/AhphyA拟南芥种子。

实施例6：拟南芥野生型，phyA-211突变体，WT/AhphyA，phyA-211/AhphyA种子萌发的影响

将野生型（WT）拟南芥种子，突变体phyA-211种子与转基因WT/AhPHYA和phyA-211/AhPHYA纯合体种子在25℃烘干4周，各取50粒放置在铺有两层滤纸的空平皿上，滤纸用800μl的无菌水打湿，将平皿用黑色塑料纸包好，7℃放置3天，接着在35℃放置8小时，之后25℃平衡0.5小时，平衡后进行极低辐照度（VLFR条件）处理，即分别用0.02，0.16和1.5μmol m^-2s^-1的FR脉冲处理，之后25℃黑暗培养4天，中间操作要保证完全黑暗。实验结束后记录各个类型的种子萌发情况。

如图3所示，野生型（WT）拟南芥与突变体phyA-211拟南芥相比萌发率较高，野生型拟南芥的萌发率达到了60%，而突变体phyA-211拟南芥只有不到40%，这说明野生型能够在极低FR辐照度下发生VLFR反应，AtPHYA诱导拟南芥种子的萌发。突变体phyA-211拟南芥中由于缺少了AtPHYA，其种子萌发在极低FR光照下进展缓慢，因此萌发率低于野生型拟南芥。phyA-211/AhPHYA萌发率与野生型拟南芥接近，也达到了60%，这说明外源AhPHYA能够弥补突变体中内源AtPHYA的缺失，即外源AhPHYA能够替代内源AtPHYA发生VLFR反应，诱导种子的萌发。WT/AhPHYA拟南芥萌发率为90%，明显高于野生型拟南芥与phyA-211/AhPHYA拟南芥，也能够说明外源AhPHYA起到了作用，与内源AtPHYA一起促进了种子的萌发。

Claims (2)

1.一种花生光敏色素AhphyA，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码花生光敏色素AhphyA的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码花生光敏色素AhphyA的基因。

4. 一种重组细胞，含有权利要求2所述编码花生光敏色素AhphyA的基因或者权利要求3所述的重组载体。

5. 权利要求2所述编码花生光敏色素AhphyA的基因、权利要求3所述重组载体和/或权利要求4所述重组细胞在改良花生品质中的应用。