CN106854240A

CN106854240A - 花生光敏色素AhphyB及其表达基因与应用

Info

Publication number: CN106854240A
Application number: CN201710130318.5A
Authority: CN
Inventors: 王兴军; 赵术珍; 张烨; 侯蕾; 赵传志; 李爱芹; 夏晗; 李长生
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2017-03-06
Publication date: 2017-06-16

Abstract

本发明涉及花生光敏色素AhphyB及其表达基因与应用。一种花生光敏色素AhphyB，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其表达基因AhphyB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次公开了调控高辐照度反应的花生光敏色素AhphyB及其编码基因，经研究发现，透射光和反射光在红光范围的加强能够引起phyB信号通路的增强，导致各种延长生长的抑制以对抗避荫反应的发生。在高R:FR比率条件下，对于避荫反应的抑制作用主要是由phyB调控的，从而为阐明光调控花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且为在玉米、花生间作模式下培育高产花生新品种提供了技术支撑。

Description

花生光敏色素AhphyB及其表达基因与应用

技术领域

本发明涉及花生光敏色素AhphyB及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

花生是我国重要的油料作物。花生生产对保障我国粮油安全具有重大意义。然而，我国花生生产、出口、加工面临着黄曲霉毒素污染超标、油脂品质低等问题，已经严重影响了我国花生在国际市场上的竞争优势。目前，花生重要农艺性状形成的分子机理研究较少，花生的分子生物学技术也远落后于其他农作物，以现有的品种资源和常规育种技术对花生品种进行改良很难突破目前存在的问题。因此，加快花生分子生物学研究进程，揭示花生产量、品质形成的分子机理，对利用现代生物技术手段结合传统育种方式培育花生高产、优质和抗病品种具有重要意义。

荚果是花生的收获器官，其正常生长发育直接影响到花生种子的产量和品质。花生的荚果发育有其特殊性，即花的形成以及受粉是在地上完成的，受精卵在地上经过少数几次分裂便停止进一步发育，但子房却不断伸长，并向地生长。伸长的子房形成针状结构，称为“果针”。随着果针的生长，位于果针顶端的胚珠被推入土中，在黑暗条件下胚胎恢复发育形成荚果。如果人为的阻止花生果针入土，那么果针在光照条件下不能膨大形成荚果。可见，光在花生荚果发育中起着非常关键的作用。

植物中光敏色素以两种形态存在，在红光下，以具有生物活性的远红光吸收态(Pfr)存在，Pfr能够被黑暗缓慢地诱导或者吸收远红光后迅速转化成失活的红光吸收态(Pr)(Fankhauser,2001)。接受红光信号后，Pfr形式的光敏色素转移到细胞核中，与核内的其它蛋白质相互作用，如光敏色素相互作用因子(phytochrome-interacting factors,PIFs)等，从而调控光形态建成，如种子萌发、幼苗去黄化、避荫反应、光周期开花和育性等(Quail,2002；Rockwell et al.,2006；Kevie et al.,2007；Franklin and Quail,2010)。光敏色素的作用模式有3种：即低辐照度响应(low-fluence responses,LFRs)、极低辐照度响应(very-low-fluence responses,VLFRs)和高辐照度响应(high irradianceresponses,HIR)。研究表明，在高辐照度反应中，透射光和反射光在红光范围的加强能够引起phyB信号通路的增强，导致各种延长生长的抑制以对抗避荫反应的发生。在高R:FR比率条件下，对于避荫反应的抑制作用主要是由phyB调控的。

中国专利文献CN103232534A(申请号201310147865.6)公开了花生光敏色素AhphyA编码基因及其应用。一种花生光敏色素AhphyA，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了编码该光敏色素AhphyA的基因及应用。该文献所述光敏色素基因phyA在远红光下对种子萌发、去黄化和下胚轴伸长抑制方面起非常重要的作用。

但本领域技术人员均知道，花生荚果发育是一个复杂的生物学过程，除可能受到光敏色素phyA的调控外，还受到很多其他方面如光敏色素phyB的调控。对花生光敏色素phyB的克隆鉴定，可以进一步阐明光影响花生荚果发育的分子机理，本研究为利用生物技术降低玉米花生间作条件下花生对避荫反应的响应，从而提高花生产量提供技术支撑。而目前由于花生荚果发育的特殊性，导致该研究无法借鉴相关成熟模型植物如拟南芥等，这也是该研究的主要技术难点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供花生光敏色素AhphyB及其表达基因与应用。

本发明技术方案如下：

一种花生光敏色素AhphyB，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

花生光敏色素AhphyB为花生中的光信号受体。

编码花生光敏色素AhphyB的表达基因AhphyB，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的表达基因AhphyB。

上述载体可购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO.2导入载体，即可获得含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的载体。

一种重组细胞，含有上述表达基因AhphyB或上述重组载体。

上述表达基因AhphyB、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作物中的应用。

有益效果

本发明首次公开了调控高辐照度反应的花生光敏色素AhphyB及其编码基因，经研究发现，透射光和反射光在红光范围的加强能够引起phyB信号通路的增强，导致各种延长生长的抑制以对抗避荫反应的发生。在高R:FR比率条件下，对于避荫反应的抑制作用主要是由phyB调控的，从而为阐明光调控花生荚果发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且为在玉米、花生间作模式下培育高产花生新品种提供了技术支撑。

附图说明

图1编码花生光敏色素AhphyB的表达基因AhphyB在不同组织中的表达量柱状图；

其中：1、幼根，2、幼茎，3、幼叶，4、成年茎，5、成年叶，6、花，7、果针入土0天，8、果针入土3天，9、果针入土9天，10、种子；

图2 AhphyB正义表达载体构建过程示意图；

图3拟南芥下胚轴在黑暗、红光、远红光、白光的光质条件下处理后的检测结果照片；

图4拟南芥下胚轴在黑暗、红光、远红光、白光的光质条件下处理后的检测结果柱状图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规培养基，试剂均为市售产品。

实施例1：花生光敏色素基因phyB的克隆

通过分析花生果针和荚果发育早期转录组高通量测序的信息，将短片段拼接成较长的基因片段，获得Uni-EST，通过5’和3’Race获得phyB基因全长开放读码框(ORF)。该基因长度3456bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码产物花生光敏色素phyB，有1151个氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

花生光敏色素phyB主要由两个结构域构成：一个是分子量为69kDa位于N末端的光感受区域，另一个是57kDa的C末端光调节区域。光感受区域和光调节区域通过铰链区连接在一起。光感受区域包括后色胆素裂解酶亚结构域(bilin lyase domain,BLD)和光敏色素亚结构域(phytochrome domain,PHY)。光调节区域含有2个PAS(Per/Arnt/Sim)同源重复序列组成的PRD结构域和1个组氨酸激酶类作用区(histidine kinase related domain,HKRD)，这一结构在光信号转导中发挥着重要作用。基因克隆的具体步骤如下：

1.1植物中RNA的提取

(1)参照CTAB-LiCl法，称取0.2g新鲜花生叶片组织或-70℃保存的样品，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻；

(2)将研好的组织迅速转移至预热至65℃的含有600微升CTAB提取液的EP管中，立即剧烈涡旋振荡30s,使其混匀；

(3)65℃水浴2～5min，期间剧烈涡旋振荡3～5次；

(4)稍微冷却后加入等体积氯仿/异戊醇涡旋振荡1min混匀；4℃，12000rpm离心15min；

(5)将上清转移到一新的Ep管中，加入2μl DNase I，37℃水浴15min；

(6)在加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12000rpm离心15min；

(7)将上清转移到新的Ep管中，加1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M，4℃过夜；

(8)4℃，12000rpm离心20min，弃上清；分别用70％乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干，加30～50μl DEPC-H₂O，溶解沉淀。

1.2RNA的纯化

(1)在微量离心管中反应

37℃反应1h；

(2)加入350μl DEPC-H₂O；

(3)加入等量(400μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)，充分混匀；

(4)离心，取上层水相到新离心管中；

(5)加入等量(400μl)的氯仿，充分混匀；

(6)离心取上清(水相)到新的离心管；

(7)加入1/10体积(40μl)的3M NaOAC(pH 5.2)；

(8)加入2.5倍(1ml)的冷无水乙醇(或1倍体积的异丙醇)，-20℃过夜；

(9)离心回收沉淀，用70％的乙醇清洗，干燥；

(10)溶解，电泳。

1.3反转录PCR

在0.5ml EP管中加入以下试剂，混匀，离心：

Total RNA	5μg以下
		Oliga dT primer(50μM)	1μl
dNTP Mixture(10mM each)	1μl
		RNase free water	up to 10μl

(1)PCR仪上65℃，反应5min，转移到冰上。

(2)在上述管中加入下列试剂配制反应体系：

上述变性后反应液	10μl
		5×PrimeScriptⅡbuffer	4μl
RNase inhibitor(40U/μl)	0.5μl
		PrimeScriptⅡRTase(200U/μl)	1μl
RNase free water	4.5μl

(4)混匀，PCR仪上，按42℃60min，95℃5min，冰上冷却。

(5)反转录产物直接用于后续试验，或-20℃保存。

1.4PCR扩增反应和产物回收

置PCR仪上按以下程序进行扩增：

94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环；72℃终延伸10min。

PCR反应结束后，取20μL PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，于-20℃保存。

实施例2：花生光敏色素基因AhphyB在不同组织中的表达模式分析

2.1植物中RNA的提取同实施例1中的1.1步骤

2.2单链cDNA的获得及表达模式分析

以花生的幼根(15d)、幼茎(15d)、幼叶(15d)、成年茎(45d)、成年叶(45d)、花、果针入土0d，3d，9d以及种子的RNA为材料，利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA SynthesisKit(TaKaRa)试剂盒反转录成单链cDNA，用于之后的qRT-PCR。

以Actin为体系内标，引物序列为：

T63(F):5’-GCCCAACTAGCGAGTCGAAC-3’

T63(R):5’-CAGAACCCAGAAGGCTCTCC-3’

用于花生光敏色素基因AhphyB荧光定量的引物为：

AhphyBqF：5’-CTTCAGCAAGCGGAGCAACAAAC-3’

AhphyBqR：5’-CGTCTTCTGTGTACTGCGCTATG-3’

荧光定量PCR反应条件为：95℃10min；之后95℃15s，60℃1min，共进行40个循环。结果显示：AhphyB在花生的根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达，在入土9d的果针中表达量最高，成年叶中次之，幼年根、成年茎和种子中表达量最低，结果如图1所示。

实施例3：花生光敏色素基因AhphyB正义表达载体pROKⅡ-AhphyB的构建

花生光敏色素基因AhphyB正义表达载体pROKⅡ-AhphyB的构建过程如图2所示：

3.1以限制性内切酶BamHⅠ和限制性内切酶SacⅠ分别双酶切质粒pROKⅡ、质粒pMD18-T-AhphyB，37℃酶切4h，限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶SacⅠ对质粒进行双酶切体系如下：

3.2电泳后分别切取11kb的pROKⅡ质粒和3456bp的AhphyB片段，用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，具体步骤如下：

(1)将凝胶放在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量，每个管中胶的重量不能超过300mg；

(2)按100mg胶加300μl溶胶液的比例，室温溶胶(或50℃溶胶)，其间摇动；装柱，9000rpm，离心30s，去掉废液；

(3)500μl漂洗液漂洗，12000rpm离心30s，重复漂洗一次，倒掉废液以后，再于12000rpm离心2min；

(4)将柱子放入一新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加入合适体积的洗脱缓冲液(30～50μl)，室温放置2～5min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，其中质粒pROKⅡ回收的DNA片段为pROKⅡ片段、质粒pMD18-T-AhphyB回收的DNA片段为花生光敏色素基因AhphyB片段。

3.3将两个回收片段用T4连接酶连接，构建成花生光敏色素基因AhphyB正义表达载体pROKⅡ-AhphyB。

连接体系如下：

将上述反应物混匀，16℃反应过夜，制得正义表达载体pROKⅡ-AhphyB，用于转化大肠杆菌DH5α。

3.4大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取E.coil DH5α(购自天根生化科技有限公司)单菌落接种到约5ml的LB液体培养基中，于37℃，250rpm震荡培养过夜；

LB液体培养基组分如下：

称取10g胰蛋白胨(Typtone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5g NaCl，用1MNaOH调pH值约7.0，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌20min；

(2)次日将菌液以1％的接种量转移至100ml的LB液体培养基中，继续培养至吸光度OD₆₀₀＝0.4；

(3)将菌液冰浴10min，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体；

(4)重悬于10ml预冷的0.1M的CaCl₂中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体；

(5)重悬于2ml(含15％甘油)预冷的0.1M的CaCl₂中，分装成100μl/管，-70℃保存备用。

3.5转化

(1)从-70℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞置于冰上溶解；

(2)将表达载体pROKⅡ-AhphyB 5μl加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min；

(3)42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管；

(4)热激完毕后，立即取出放于冰上2min；

(5)加入890μl的LB液体培养基，37℃，200rpm孵育1h；

(6)将菌液涂布在加卡那酶素的LB固体平板上，37℃培养12h；

(7)将平板放入4℃保存。

3.6阳性克隆的菌液PCR检测

(1)从平板上挑取白色菌落接种到LB液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养3～4h；

(2)PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg²⁺)2.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，AhphyB-OX-F引物、AhphyB-OX-R引物(10μM)各1μl，菌液2μl，Taq酶(博大泰克公司产)0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl；

上述引物序列如下：

AhphyB-OX-F：5’-CCCGGATCCATGGCTTCAGCAAGCGG-3’；

AhphyB-OX-R：5’-GCCGAGCTCCTAGTTAACGATTTTAGAGTAAG-3’；

(3)PCR反应程序：98℃10min，94℃45s，51℃45s，72℃1.5min，34循环，72℃10min，4℃保存；取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到一条3456bp的条带；

3.7质粒的提取

(1)将PCR阳性的菌液于37℃，200rpm震荡培养过夜；

(2)将菌液转移到离心管中，室温10000rpm离心1min，收集菌体；

(3)弃上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出；

(4)加入100μl预冷的溶液Ⅰ，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液Ⅰ配方为：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)；

(5)加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，快速颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液Ⅱ配方为：0.2M NaOH、1％十二烷基硫酸钠(SDS)；

(6)加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和地颠倒10次，冰浴5min，4℃12000rpm离心10min，其中所述溶液Ⅲ配方为：5M乙酸钾60ml、3M冰乙酸11.5ml、H₂O 28.5ml、pH 5.2；

(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min；

(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24:1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min；

(9)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，混匀后-20℃沉淀1h，4℃12000rpm离心10min；

(10)倒掉上清，加入500μl 70％的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥；

(11)加入适当体积的TE溶液和2μl RNaseA，37℃消化0.5h，制得质粒。

3.8质粒的酶切检测

(1)限制性内切酶SmaⅠ、限制性内切酶XhoⅠ对质粒进行双酶切体系：

(4)37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一条3456bp的条带和11kb左右的条带。

3.9序列测定

以上步骤中获得的阳性克隆pROKⅡ-AhphyB进行测序验证。

实施例4：pROKⅡ-AhphyB正义植物表达载体转化农杆菌

4.1农杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取单菌落(农杆菌GV3101，购自天根生化科技有限公司)接种到约3ml的YEP液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.5；

YEP液体培养基组分如下：

称取10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，用1M NaOH调pH值约7.0，加双蒸水定容至1000mL，121℃灭菌20min；

(2)吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

(3)5000rpm离心30s，弃去上清液；

(4)沉淀用1.5ml 0.5M NaCl悬浮，冰浴20min；

(5)5000rpm离心30s，弃去上清液；

(6)每管用100μl 20mM CaCl₂悬浮，用于转化，-70℃保存备用。

4.2DNA直接转化农杆菌

(1)50μl农杆菌感受态细胞中加入pROKⅡ-phyB表达载体质粒DNA 0.1～1μg(5～10μl)，之后冰浴30min；

(2)放入液氮中1.5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

(3)取出离心管，加入0.5ml的YEP，于28℃，220rpm震荡培养3～5h；

(4)取出菌液于含有相应抗生素的YEP平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2d左右菌落可见。

4.3重组农杆菌鉴定

(1)挑取单菌落，接种于含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平的YEP液体培养基中，28℃震荡培养过夜；

(2)菌液PCR鉴定步骤同实施例3中步骤3.6。

实施例5：农杆菌介导转化拟南芥野生型

(1)当拟南芥开花，并且许多小的花序开花时，植物可以用来侵染；

(2)摇农杆菌过夜；

(3)离心5000rpm 10min，弃去上清；

(4)加入等体积的侵染液(含5％蔗糖，0.02％silwet)重悬；

(5)花序在农杆菌中浸染45s；

(6)弱光培养1d；

(7)正常培养，收集种子，制得WT/AhphyB拟南芥种子；

实施例6：不同光质对拟南芥野生型，phyB-9突变体，WT/AhphyB下胚轴伸长的影响

将过量表达花生光敏色素基因AhphyB的拟南芥纯合株系(WT/AhphyB)、phyB突变体(购自美国拟南芥资源中心)以及野生型(Columbia，Col；购自美国拟南芥资源中心)拟南芥种子消毒，均匀铺撒到1/2MS培养基(含蔗糖和琼脂)(购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)上，4℃春化3d，21℃光照1h后，分别转移到红光、远红光、白光和黑暗条件下培养，培养皿竖直放置，4d后统计下胚轴长度。使用ImageJ软件测量拟南芥下胚轴，使用SPSS软件进行显著性分析。

结果如图3、图4所示，对不同光照处理下Col野生型拟南芥，phyB突变体(phyB-m)以及两个AhphyB转基因株系的下胚轴长度进行了统计。结果表明，黑暗条件下野生型Col和phyB-m下胚轴的长度相似，两个过量表达AhphyB拟南芥株系的下胚轴长度略低于Col与phyB-m；在白光下，phyB-m的下胚轴长度显著长于Col及两个过量表达AhphyB转基因株系的下胚轴。在红光下，phyB-m的下胚轴长度显著长于Col及两个转基因株系的下胚轴长度，同时略低于其在黑暗条件下的下胚轴长度，过量表达AhphyB的两个拟南芥株系下胚轴长度在红光下均显著低于Col与phyB-m的下胚轴长度。

这一结果说明与拟南芥phyB相似，在红光和白光条件下，花生phyB也具有抑制下胚轴伸长的功能。前人研究发现，过量表达phyB能够抑制幼苗在远红光下的去黄化表型。phyB突变体的下胚轴在远红光下比Col的下胚轴更短且达到显著水平，但过量表达AhphyB的两个转基因株系并未在此条件下表现出更长的下胚轴表型。这一结果说明，AhphyB在响应FR介导的幼苗去黄化过程中的功能可能与AtphyB不同。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心

<120> 花生光敏色素AhphyB及其表达基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1151

<212> PRT

<213> Arachis hypogaea Linn.

<400> 1

Met Ala Ser Ala Ser Gly Ala Thr Asn Arg Val Pro His His Gln His

1 5 10 15

Gln Asn Gln His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Pro Thr Ala Ser

20 25 30

Ser Ser Lys Arg Thr Val Val His Asn Thr Asn Asp Ala Ser Ile Ser

35 40 45

Lys Ala Ile Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Ala Arg Leu His Ala Val Phe

50 55 60

Glu Gln Ser Gly Glu Ser Gly Lys Ser Phe Asp Tyr Ser His Ser Val

65 70 75 80

Arg His Thr Ser Glu Ser Val Pro Glu His Gln Ile Ile Ala Tyr Leu

85 90 95

Leu Lys Ile Gln Arg Gly Gly Leu Ile Gln Pro Phe Gly Cys Met Ile

100 105 110

Ala Val Asp Glu Pro Ser Phe Arg Ile Leu Gly Tyr Ser Glu Asn Ala

115 120 125

Arg Asp Met Leu Gly Ile Ser Pro Gln Ser Val Pro Thr Leu Glu Arg

130 135 140

Leu Pro Gly Ser His Glu Glu Ala Leu Thr Ile Gly Thr Asp Val Arg

145 150 155 160

Ser Leu Phe Thr Ala Ser Ser Ser Thr Leu Leu Glu Arg Ala Phe Gly

165 170 175

Ala Arg Glu Ile Thr Leu Leu Asn Pro Ile Trp Ile His Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Gly Lys Pro Phe Tyr Gly Ile Leu His Arg Ile Asp Val Gly Ile

195 200 205

Val Ile Asp Leu Glu Pro Ala Arg Thr Glu Asp Pro Ala Leu Ser Ile

210 215 220

Ala Gly Ala Val Gln Ser Gln Lys Leu Ala Val Arg Ala Ile Ser Gln

225 230 235 240

Leu Gln Ser Leu Pro Gly Gly Asp Val Lys Leu Leu Cys Asp Thr Val

245 250 255

Val Glu Ser Val Gly Glu Leu Thr Gly Tyr Asp Arg Val Met Val Tyr

260 265 270

Lys Leu His Glu Asp Glu His Gly Glu Val Val Ala Glu Ser Lys Arg

275 280 285

Pro Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gly Leu His Tyr Pro Ala Thr Asp Ile

290 295 300

Pro Gln Ala Ser Arg Phe Leu Phe Lys Gln Asn Arg Val Arg Met Ile

305 310 315 320

Val Asp Cys Asn Ala Ser Pro Leu Arg Val Val Gln Asp Glu Ala Leu

325 330 335

Val Gln Pro Leu Cys Leu Val Gly Ser Thr Leu Arg Ala Pro His Gly

340 345 350

Cys His Ala Gln Tyr Met Ala Asn Met Gly Ser Ile Ala Ser Leu Val

355 360 365

Met Ala Val Ile Ile Asn Ala Asn Asp Glu Glu Ala Val Gly Gly Arg

370 375 380

Ser Ser Met Arg Leu Trp Gly Leu Val Val Cys His His Thr Ser Ala

385 390 395 400

Arg Cys Ile Pro Phe Pro Leu Arg Tyr Ala Cys Glu Phe Leu Met Gln

405 410 415

Ala Phe Gly Leu Gln Leu Asn Met Glu Leu Gln Leu Ala Ser Gln Ser

420 425 430

Leu Glu Lys Arg Val Leu Arg Thr Gln Thr Leu Leu Cys Asp Met Leu

435 440 445

Leu Arg Asp Ser Pro Thr Gly Ile Val Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met

450 455 460

Asp Leu Val Arg Cys Asp Gly Ala Ala Leu Tyr Tyr Lys Gly Asn Tyr

465 470 475 480

Tyr Pro Leu Gly Val Thr Pro Thr Glu Ser Gln Ile Arg Asp Ile Ile

485 490 495

Glu Trp Leu Leu Ala Tyr His Gly Asp Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp

500 505 510

Ser Leu Gly Asp Ala Gly Tyr Pro Gly Ala Ala Ser Leu Gly Asp Ala

515 520 525

Val Cys Gly Met Ala Val Ala Tyr Ile Thr Glu Gly Asp Phe Leu Phe

530 535 540

Trp Phe Arg Ser His Thr Ala Lys Glu Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys

545 550 555 560

His His Pro Glu Asp Lys Asp Asp Gly Gln Arg Met His Pro Arg Ser

565 570 575

Ser Phe Lys Ala Phe Leu Glu Val Val Lys Ser Arg Ser Leu Pro Trp

580 585 590

Asp Asn Ala Glu Met Asp Ala Ile His Ser Leu Gln Leu Ile Leu Arg

595 600 605

Asp Ser Phe Arg Asp Ala Glu His Ser Asn Ser Lys Ala Val Met His

610 615 620

Ser His Leu Ala Asp Phe Glu Leu Gln Gly Val Asp Glu Leu Ser Ser

625 630 635 640

Val Ala Arg Glu Met Val Arg Leu Ile Glu Thr Ala Thr Ala Pro Ile

645 650 655

Phe Ala Val Asp Val Asp Gly Arg Ile Asn Gly Trp Asn Ala Lys Val

660 665 670

Ala Glu Leu Thr Gly Leu Pro Val Asp Glu Ala Met Gly Lys Ser Leu

675 680 685

Val His Asp Leu Val Tyr Lys Glu Phe Glu Glu Thr Val Asp Lys Leu

690 695 700

Leu Ser Arg Ala Leu Arg Gly Glu Glu Asp Lys Asn Val Glu Ile Lys

705 710 715 720

Leu Lys Thr Phe Gly Pro Gly Asn Gln Asn Gly Ala Val Phe Val Val

725 730 735

Val Asn Ala Cys Ser Ser Lys Asp Tyr Thr Asn Asn Ile Val Gly Val

740 745 750

Cys Phe Val Gly Gln Asp Val Thr Gly Gln Lys Val Val Met Asp Lys

755 760 765

Phe Ile Asn Ile Gln Gly Asp Tyr Lys Ala Ile Val His Ser Pro Asn

770 775 780

Pro Leu Ile Pro Pro Ile Phe Ala Ser Asp Asp Asn Thr Cys Cys Leu

785 790 795 800

Glu Trp Asn Ala Ala Met Glu Lys Leu Thr Gly Trp Gly Arg Ala Asp

805 810 815

Val Ile Gly Lys Met Leu Val Gly Glu Val Phe Gly Ser Cys Cys Gln

820 825 830

Leu Lys Gly Ser Asp Ala Leu Thr Lys Phe Met Ile Val Leu His Asn

835 840 845

Ser Leu Gly Gly Gln Asp Thr Asp Lys Phe Pro Phe Ser Phe Leu Asp

850 855 860

Arg His Gly Lys Tyr Val Gln Ala Phe Leu Thr Ala Asn Lys Arg Val

865 870 875 880

Asn Met Asp Gly Gln Ile Ile Gly Ala Phe Cys Phe Leu Gln Ile Ala

885 890 895

Ser Pro Asp Leu Gln Gln Ala Leu Lys Ile Gln Lys Gln Gln Glu Lys

900 905 910

Asn Cys Tyr Ala Arg Met Lys Glu Leu Ala Tyr Ile Cys Gln Glu Ile

915 920 925

Lys Asn Pro Leu Ser Gly Ile Arg Phe Thr Asn Ser Leu Leu Glu Ala

930 935 940

Thr Gly Leu Thr Asp Glu Gln Lys Gln Phe Leu Glu Thr Ser Thr Ala

945 950 955 960

Cys Glu Lys Gln Met Ser Lys Ile Ile Gln Asp Val Asp Leu Ala Ser

965 970 975

Ile Glu Asp Gly Ser Met Glu Leu Glu Lys Gly Glu Phe Leu Leu Gly

980 985 990

Asn Val Ile Asn Ala Val Val Ser Gln Val Met Leu Leu Leu Arg Glu

995 1000 1005

Arg Asn Leu Gln Leu Ile Arg Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Thr

1010 1015 1020

Leu Ala Val Tyr Gly Asp Gln Leu Arg Ile Gln Gln Val Leu Ala

1025 1030 1035

Asp Phe Leu Leu Asn Met Val Arg Tyr Ala Pro Ser Pro Asp Gly

1040 1045 1050

Trp Val Glu Ile His Val His Pro Arg Ile Lys Gln Ile Ser Asp

1055 1060 1065

Gly Leu Thr Leu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Met Val Cys Pro Gly

1070 1075 1080

Glu Gly Val Pro Pro Glu Leu Val Gln Asp Met Phe His Ser Ser

1085 1090 1095

Arg Trp Val Thr Gln Glu Gly Leu Gly Leu Ser Met Ser Arg Lys

1100 1105 1110

Ile Leu Lys Leu Met Asn Gly Glu Val Gln Tyr Ile Arg Glu Ala

1115 1120 1125

Glu Arg Cys Tyr Phe Phe Val Leu Leu Glu Leu Pro Val Thr Arg

1130 1135 1140

Arg Thr Tyr Ser Lys Ile Val Asn

1145 1150

<210> 2

<211> 3456

<212> DNA

<213> Arachis hypogaea Linn.

<400> 2

atggcttcag caagcggagc aacaaacaga gttccccacc accaacacca aaaccaacac 60

caacagcaac aacaacaaca gcaccccaca gcatcttcat caaaacgcac tgtcgtacac 120

aacacgaacg acgcgtcaat aagcaaggcc atagcgcagt acacagaaga cgcccgcctc 180

cacgccgttt tcgagcagtc cggcgagtcc ggcaagtcct tcgactactc ccactccgtc 240

cgccacacct ccgagtccgt accggagcac cagatcatcg cttacctact gaagatccag 300

cgcggcggcc tcatccagcc tttcggctgt atgattgccg tcgacgagcc gtccttccgc 360

atcctcggat actccgagaa cgctcgggac atgctcggca tatcaccgca gtcagtccca 420

actctcgaac gtctccccgg atcccacgag gaggcgctca caattggtac tgacgtgcgc 480

agtcttttca ccgcctccag cagcaccctg ctagagaggg cgtttggggc gcgcgagatc 540

acgctcctca acccaatttg gatccattcc cggaattccg gcaagccttt ttatggaatc 600

ttgcaccgaa tcgatgttgg aatcgtcatc gatttggagc ctgctaggac tgaggaccct 660

gcactgtcaa ttgcaggggc tgttcagtcc cagaagctag ctgttcgagc tatttcgcag 720

cttcagtcgc ttcccggagg cgatgtgaag cttctttgtg acactgttgt ggagagtgtg 780

ggagaattga ccggttatga tagggtgatg gtgtacaaac ttcatgagga tgagcatggt 840

gaggttgttg ctgagagtaa gaggcctgat ttggagcctt atattggttt gcattaccct 900

gctactgata tacctcaggc ttcgaggttc ttgttcaagc agaatagagt taggatgatt 960

gtagattgca atgcttcgcc attgagggtg gtgcaggatg aggcccttgt gcagcccttg 1020

tgtttggttg gctccaccct gcgtgcacca cacggttgcc acgctcagta tatggcgaat 1080

atggggtcga ttgcttcgct ggttatggcg gttatcatca atgctaatga tgaggaagct 1140

gttggcggcc gcagctcaat gaggctgtgg ggattggttg tttgccacca cacttcggcc 1200

aggtgtatac cttttccctt gaggtatgct tgtgaattct tgatgcaggc ctttgggctg 1260

cagctgaata tggagcttca attggcttct cagtcgttag agaagcgagt tttgaggacg 1320

caaactctgt tgtgtgacat gcttcttagg gactcgccca ctggcattgt tactcagagt 1380

cctagtatta tggatttggt gcggtgtgat ggagcagctt tgtactacaa aggaaactac 1440

tatccattgg gtgtaacacc tactgaatct caaataaggg atattataga gtggttgttg 1500

gcataccatg gagattcgac gggtttgagt actgatagtc tgggtgatgc tgggtatcct 1560

ggtgctgcct cgcttgggga tgctgtttgt gggatggctg ttgcatatat cactgaaggg 1620

gattttcttt tctggtttag gtctcacaca gcaaaagaga tcaaatgggg tggtgcaaag 1680

catcatcctg aggataagga tgatgggcag agaatgcatc ctcgttcttc atttaaggca 1740

tttttggaag tggtgaaaag ccggagtttg ccatgggata atgcagaaat ggatgcgatt 1800

cactctttgc agcttattct gcgagactca tttagagatg ccgagcatag caactcaaag 1860

gctgttatgc attcgcatct ggcggatttt gagttgcaag gggtagatga gctaagttct 1920

gtggcgagag aaatggtcag attgatagaa actgccactg ctcccatatt cgctgttgac 1980

gttgatggcc gcataaatgg gtggaatgca aaggttgcag aattgacagg gcttccagtc 2040

gacgaggcta tggggaagtc actggttcat gatcttgtgt acaaggagtt cgaagaaact 2100

gtagacaagc ttctctctcg cgctctaaga ggtgaagaag ataagaatgt tgagataaaa 2160

ttgaagacat ttggcccagg aaatcaaaat ggtgcagttt ttgtagtggt gaatgcttgc 2220

tccagcaagg attatacaaa taatatagtt ggagtatgct ttgttggtca ggacgttact 2280

ggtcagaagg ttgtaatgga caaattcatc aacatacaag gtgactacaa ggctattgta 2340

catagcccaa atccattgat ccccccaatt tttgcatcgg atgataacac ttgttgctta 2400

gagtggaatg cagccatgga aaagcttact ggttgggggc gtgcagatgt aattggaaag 2460

atgttggttg gagaggtttt cggtagttgc tgtcagttaa agggctcgga tgctttaaca 2520

aagttcatga ttgtgttgca caattccctt ggtggacaag ataccgacaa gttccctttt 2580

tcatttcttg accggcatgg aaaatatgtg caagctttct tgacagcaaa taagagggtt 2640

aacatggatg gtcagattat tggagctttt tgctttttgc aaattgcgag tcctgatctt 2700

caacaggctc tgaaaataca gaagcaacaa gagaagaatt gctatgctag gatgaaagag 2760

ttagcctata tttgtcaaga aataaagaat ccactgagtg gcatacgctt tacaaactct 2820

cttttggagg ctactggatt gaccgatgaa caaaagcagt ttcttgagac tagtactgca 2880

tgtgagaagc aaatgtcaaa aataatacag gatgttgact tggcaagcat tgaagatgga 2940

tcaatggagc ttgaaaaggg agaattcttg cttggaaacg tcatcaatgc tgttgttagc 3000

caagtaatgt tattactaag agagagaaat ttacagttga ttcgtgatat acctgaagaa 3060

atcaagacgt tggctgttta tggtgatcag ttgaggattc aacaagtctt ggctgatttc 3120

ttattgaata tggtgcgcta tgcgccttct ccagatgggt gggtagagat tcatgtacat 3180

ccaagaataa aacaaatctc cgacgggctt actcttctcc gtgctgaatt taggatggta 3240

tgtcctggtg aaggtgttcc tcctgaattg gttcaagaca tgttccatag cagtcgttgg 3300

gtgactcaag aaggcttagg tctgagcatg agccggaaga ttctaaagtt aatgaatggt 3360

gaagtccaat atatcaggga ggcagaaaga tgctatttct tcgttcttct tgaactacct 3420

gtaacacgga gaacttactc taaaatcgtt aactag 3456

Claims

1.一种花生光敏色素AhphyB，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码花生光敏色素AhphyB的表达基因AhphyB，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的表达基因AhphyB。

4.一种重组细胞，含有权利要求2所述表达基因AhphyB或上述重组载体。

5.权利要求2所述表达基因AhphyB、权利要求3所述重组载体和/或权利要求4所述重组细胞在改良花生或其他经济作物中的应用。