CN105440114B

CN105440114B - 茄子隐花色素基因SmCRY1及其用途

Info

Publication number: CN105440114B
Application number: CN201511002769.8A
Authority: CN
Inventors: 刘杨; 蒋明敏; 任丽; 陈火英
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2035-12-28
Also published as: CN105440114A

Abstract

本发明公开了一种茄子隐花色素基因SmCRY1及其用途；所述SmCRY1基因的cDNA序列包括：(a)如SEQ ID NO.1第1～2037位所示的碱基序列；或(b)与SEQ ID NO.1第1～2037位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列；或(c)能与SEQ ID NO.1第1～2037位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2中所示。该基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，叶中的表达量显著高于其他组织。本发明为今后利用基因工程技术改良植物在弱光中生长不良提供理论依据，具有很大的应用价值。

Description

茄子隐花色素基因SmCRY1及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及茄子光信号通路中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种茄子隐花色素基因SmCRY1及其用途。

背景技术

蓝光和近紫外光可以使植物产生蓝光反应，隐花色素在植物中的主要作用就是作为蓝光和近紫外光的受体，来调节植物的生长发育。在拟南芥中存在3个隐花色素基因CRY1，CRY2和CRY3，其中研究比较多的主要是CRY1和CRY2。CRY1和CRY2蛋白在蓝光照射条件下发生磷酸化，这种磷酸化是特异的依赖于蓝光并随着蓝光光强的增强而增加，而红光和远红光并没有这种效果。CRY1和CRY2蛋白的磷酸化和其功能发挥也是密切相关的，筛选到的CRY1和CRY2功能缺失的cry1和cry2突变体中，有多数是因为突变位点干扰了CRY蛋白的磷酸化。

对隐花色素CRY1生理功能的了解主要是通过分析其功能缺失突变体cry1及过表达转基因材料CRY1-ox实现的，对它们的表型分析显示，随着蓝光强度的增强，与野生型相比，cry1下胚轴长度显著高于野生型，表现为弱敏感反应，而相反的CRY1-ox与野生型相比，其下胚轴长度表现为对蓝光的超敏感的反应。CRY1-ox幼苗在蓝光下还表现为子叶面积增大和花色素苷的过量积累，而cry1突变体在上述两个表型上与CRY1-ox相反。

目前已从很多植物中克隆得到CRY基因，如拟南芥、大豆、玉米、番茄等。茄子是重要的蔬菜作物，但相关研究相对比较滞后。目前，未有任何与茄子CRY1基因及其编码蛋白的相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于填补茄子CRY1基因的空白；提供一种茄子隐花色素CRY1的cDNA以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子SmCRY1基因在不同组织器官的表达模式。本发明还提供了SmCRY1转入拟南芥后表型发生改变的结果。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种茄子CRY1蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明还涉及一种编码所述茄子CRY1蛋白的SmCRY1基因，所述SmCRY1基因的cDNA序列包括：

(a)如SEQ ID NO.1第1～2037位所示的碱基序列；或

(b)与SEQ ID NO.1第1～2037位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列；或

(c)能与SEQ ID NO.1第1～2037位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。

优选的，所述cDNA序列包括SEQ ID NO.1第1～2037位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸。

第三方面，本发明涉及一种用于扩增所述SmCRY1基因的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

第四方面，本发明还涉及一种SmCRY1基因在植物组织中表达量的定量分析方法，所述方法包括如下步骤：

S1、获得植物组织，提取其总RNA；

S2、以所述总RNA为模板，反转录获得cDNA；

S3、以cDNA第一条链为模板，分别用SmCRY1基因与内参基因Actin(GU984779.1)的特异性引物扩增进行荧光定量分析，获得所述SmCRY1基因在植物组织中表达量；

所述扩增SmCRY1基因的特异性引物的碱基序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；所述扩增内参基因Actin(GU984779.1)的碱基序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

第五方面，本发明还涉及一种SmCRY1基因在基因工程改良植物品质中的用途。

优选的，所述基因工程改良植物品质指的是基因工程改良植物在弱光中生长不良。

优选的，所述植物包括拟南芥、大豆、玉米或番茄。

在本发明中，术语“SmCRY1基因编码序列”指SEQ ID NO.1所示的第1～2037位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1所示的第1～2037位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1所示的第1～2037位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmCRY1相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmCRY1基因产物的表达模式，即分析茄子SmCRY1基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，根据本发明的茄子SmCRY1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选茄子SmCRY1相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与茄子SmCRY1相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对茄子SmCRY1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmCRY1相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的茄子SmCRY1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

光信号能调控许多次生代谢途径，例如花青素的合成。茄子是广泛种植的蔬菜作物，紫色茄子的果皮含有丰富的花青素。近年来的研究结果表明，紫色茄子的抗氧化保健作用在常见蔬菜作物中是最好的。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，克隆蓝光受体SmCRY1基因，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。

2、本发明的茄子CRY1基因转拟南芥的转基因植株SmCRY1/cry1-104、拟南芥突变株cry1-104、拟南芥野生型WT一同置于蓝光下培养(30μmol/m²/sec)，结果显示：cry1-104在蓝光下的下胚轴显著高于野生型WT，而转基因植株SmCRY1/cry1-104部分恢复了这一表型。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的茄子CRY1蛋白与番茄CRY1蛋白的氨基酸序列同源比较(FASTA)结果；

图2为本发明的茄子CRY1基因在不同组织的表达情况；

图3为转SmCRY1基因植株的RT-PCR检测；

图4为转SmCRY1基因对拟南芥突变株cry1-104的表型恢复情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、茄子SmCRY1基因的克隆

1.植物材料的获得

本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子的叶片用于提取RNA。

2.RNA的提取

采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP 1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。

3.基因的全长克隆

基于Genbank中CRY1基因的保守序列设计一对简并引物。将提取RNA进行反转录(Prime Script II lst Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物

F1(SEQ ID NO.3)：5′-ATGTCAGGTGGTGGWKGYAGYATAGTAT-3′

R1(SEQ ID NO.4)：5′-TYACCCKGTTTGAGAAAGCCGYYG-3′

进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到pMD-19T(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，得cDNA序列SEQ ID NO.1。

实施例2、茄子CRY1基因的序列信息与同源性分析

本发明新的茄子CRY1基因全长CDS开放读框序列为2037bp，详细序列见SEQ IDNO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子CRY1的氨基酸序列，共678个氨基酸残基，分子量为76949.9道尔顿，理论等电点(pI)为5.57，详细序列见SEQ ID NO.2所示序列。

将茄子CRY1的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与番茄CRY1基因(NM_001247738.1)在核苷酸水平上具有95.10％一致性；在氨基酸水平上，它们两者之间相似性高达96.02％，如图1所示(Query：茄子CRY1的氨基酸序列；Sbjct：番茄CRY1的氨基酸序列)。由此可见，茄子CRY1基因与番茄CRY1基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、茄子CRY1基因在不同组织中的表达

1.植物材料的获得

在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

2.RNA的提取

采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

3.cDNA的获得

以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript^TM RT reagent KitPerfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。

4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子CRY1基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中SmCRY1基因定量分析的特异性引物，

CRY1-F：5′-GACATGGTGACTCTGCTGACTCC-3′(SEQ ID NO.5)

CRY1-R：5′-GCTCTGAACAAAGATGACGTCATG-3′(SEQ ID NO.6)

内参基因为Actin(GU984779.1)，其引物为

ACTIN-F：5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′(SEQ ID NO.7)

ACTIN-R：5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′(SEQ ID NO.8)

5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

7.采用2^-ΔΔCt法作相对定量分析。结果表明SmCRY1基因在茄子的根、茎、叶、花、果皮、果肉中都有表达，其中在叶中的表达量最高，其次是花和果皮，而在根和果肉中的表达量较低，说明SmCRY1基因的表达具有明显的空间差异性(图2)。

实施例4、茄子CRY1基因转拟南芥的功能验证

所用转化载体为pCAMBIA1302(Cambia)，拟南芥材料为CRY1突变株cry1-104(Lianet al.，2011.Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA 1defines a dynamic signaling mechanism.Genes Dev.25：1023-1028)。将含有SmCRY1-1302的农杆菌培养至OD 0.8～2.0，6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用MS液重悬，调整OD₆₀₀为0.8～1.2，侵染拟南芥花序10～60sec，暗培养12h后正常培养，收集成熟的种子。

收集的T₀代转基因种子，铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，4℃春化3d，光照培养箱培养6-10d，选取根长的长，且长出真叶的健壮幼苗，移栽至土盆，培养。收集的T₁代种子继续铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，选取抗性：不抗比为3∶1的株系收集T₂代种子。T₂代在50mg/L潮霉素抗性平板上存活率为100％的认为筛选到纯和抗性植株。对获得的株系采用Real-time PCR检测SmCRY1的表达量(图3)。所用拟南芥actin(NM_179953)引物如下：

5′-GTCTGGATTGGAGGGTC-3′(SEQ ID NO.9)

5′-TGAGAAATGGTCGGAAA-3′(SEQ ID NO.10)

将筛选得到的阳性转化株同突变株，野生型一同置于蓝光下培养(30μmol/m²/sec)。结果显示，cry1-104在蓝光下的下胚轴显著高于野生型WT，而转基因植株SmCRY1/cry1-104部分恢复了这一表型(图4)。这说明茄子CRY1基因具有与拟南芥CRY1基因相似的功能。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种编码茄子CRY1蛋白的SmCRY1基因，其特征在于，所述茄子CRY1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SmCRY1基因的cDNA序列为如SEQ ID NO.1第1～2037位所示的碱基序列。

2.一种用于扩增权利要求1所述的SmCRY1基因的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

3.一种如权利要求1所述的SmCRY1基因在基因工程改良植物品质中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述基因工程改良植物品质指的是基因工程改良植物在弱光中生长不良。