CN117187302A - 一种哺乳动物红光控制转录激活装置/系统及其构建方法和在基因治疗中的应用 - Google Patents

一种哺乳动物红光控制转录激活装置/系统及其构建方法和在基因治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种哺乳动物红光调控的转录激活装置/系统(简称REDMAP2.X装置/系统)，包括红光光敏蛋白元件、转录激活元件和效应元件。所述REDMAP2.X装置/系统具有构造简单、模块小、无毒副作用、反应灵敏、转录激活效率高、高度时空特异性、可调性强等特点。所述REDMAP2.X装置/系统在红光调控下可以对基因环路实现精准、快速地激活，对基础生物学和再生医学研究的各个领域具有重要应用价值。该装置/系统的元件模块小、可由腺相关病毒AAV递送，从而实现了对疾病精准、高效、快速的基因治疗，如糖尿病和肥胖等。所述REDMAP2.X装置/系统为基因治疗提供了一种精准、高效、可控的工具，对基因治疗在临床的应用中具有潜在的价值。

Description

一种哺乳动物红光控制转录激活装置/系统及其构建方法和 在基因治疗中的应用
技术领域
本发明涉及合成生物学、光遗传学、基因治疗等多学科交叉领域，具体涉及一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统(REDMAP 2.X)及其构建方法，高效、精准、快速诱导哺乳动物基因的转录表达，以及可以由腺相关病毒AAV 递送REDMAP2.X装置/系统，实现对疾病精准、高效、长期的基因治疗。
背景技术
合成生物学，以其自下而上的特点，通过对基因线路的改装实现对生命的重新定义。对于细胞生命活动的精准调控需要通过构建人工调控的基因开关实现。精确的控制系统在基础生物学和转化生物医学研究的各个领域具有重要作用，如治疗药物的可控释放、表观遗传的特异性表达等。
对于基因表达的调控，主要是通过一些小分子化学物质实现的，如PCA、 RES、ABA等，但是这些小分子调控系统具有一定毒性、可调性差等局限性。光因为其无毒、在自然界中普遍存，时空特异性强等特点，成为理想的基因表达的理想诱导剂。光遗传技术在调控基因表达方面也具有广泛的应用，可以高度的时空特异性控制工程化细胞的生命活动，为无痕、远程控制的精确调控医学提供了潜在的应用价值，在基因工程领域和精准治疗医学中具有重要意义。目前，来自植物、真菌和细菌的天然光敏蛋白已被开发成为广泛的光遗传学转录装置/系统，在基因工程、转化再生医学、表观遗传学领域等得到了广泛应用。然而目前这些光调控的基因转录装置/系统仍然具有一定的局限性。一些由蓝光或紫外光作为诱导剂的光遗传学工具(如CRY2/CIBN，LOV，Magnet等)，具有一定的光毒性、对组织的穿透能力不强，对于深部的疾病治疗效果差，限制了在医学临床中的应用。由远红光或红光作为诱导剂的基因转录开关，虽然无光毒性、对组织的穿透能力也更强，但模块元件往往较大，如BphP1/PpsR2；这些装置/系统转录激活的效率较低，对光的感应不灵敏，需要长期光照，这些不足限制了其在疾病临床治疗的应用。近期，一种由红光调控的新型转录装置/ 系统(REDMAP)被开发出来，其具有诱导效率高、对红光响应迅速等特点。但由于该系统在应用过程中需要额外加入或表达PCB色素，也限制了在对疾病实行基因治疗的转化和应用。
基因治疗作为一种新兴、治疗效果显著的疾病治疗模式，通过将目的基因放进特定的载体中，然后导入体内，携带目的基因的载体在内体的细胞中能制造需要的药物蛋白，从而实现对疾病的治疗。腺相关病毒AAV因其不会将外缘基因整合到宿主基因组中、免疫原性低、宿主范围广、在体内表达外源基因时间长等诸多优点，成为了基因治疗中最安全有效的基因传递载体。但由于AAV 的包装范围有限(<4.7kb)，在临床应用中受到了限制。亟待开发一种模块小、操作简单、诱导效率高、快速灵敏的基因转录表达装置/系统，以推动AAV基因治疗中在临床中的广泛应用。
为了克服AAV载体递送局限性，结合红光组织穿透力强、精准的时空特异性以及无毒性，发明一种在哺乳动物中由红光调控的、操作简单、安全高效、诱导效率高、快速响应、模块元件小、不需要额外加入色素的转录激活装置/系统(REDMAP 2.X)，对基础生物研究、再生医学的应用、和精准的基因治疗具有潜在的临床应用价值。
发明内容
针对上述所述的局限性，本发明提出一种哺乳动物红光调控的转录激活装置/系统(简称REDMAP 2.X装置/系统)，实现了由红光调控哺乳动物细胞的基因转录激活。本发明所述装置/系统具有诱导效率高、快速响应、时空特异性强、组织穿透力强、无毒副作用、模块元件小以及可调性好等特点。相比较于 REDMAP系统，本发明所述装置/系统在哺乳动物中不需要额外添加或表达色素分子，更具有安全无毒、操纵简单的特点，在一定程度上也缩减了装置/系统模块的复杂度。
本发明通过660nm红光照射短短的几秒，即可高效、快速地激活报告基因的转录表达，且基因的表达量可通过调节电源的光强以及改变光照的时间得以控制；同时，可以通过控制光照区域，可实现对基因表达的空间控制，具有很强时空特异性。同时本发明中，所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统具有很低的本底泄露、很高的激活效果，可实现高效的诱导激活效率，具有很强的实用性。此外，本发明所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统在780nm的远红光照射下可以关闭转录激活，实现对基因转录开启和关闭的双重控制，具有很强的可调控性。
综上，本发明可实现对哺乳动物细胞基因环路的快速、高效、精准的转录激活控制，在哺乳动物基础生物研究、基因工程、表观遗传学和转化医学领域的研究中具有巨大的潜在应用价值。
本发明首次提出一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统。本发明中，红光作为诱导剂具有无毒副作用、诱导倍数高、良好的基因表达时空特异性、精准可控等特点；此外哺乳动物红光调控转录激活装置/系统模块元件小，可由 AAV载体递送该系统到生物体深处的组织部位，在深部组织对基因表达进行调控，为基因治疗提供了高效可控的工具，具有极大的临床应用潜力。
“术语”时空特异性”指目的基因受特定因素诱导表达时，受诱导因素作用时间和作用空间的影响，显示出基因表达对诱导因素时间和空间的依赖性。
本发明提出的一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统。本发明还进一步优化了装置/系统中红光光敏蛋白的结构、转录激活元件以及效应元件的诱导型启动子，达到最优的红光诱导激活基因转录表达的效果，使得该系统对红光具有最大化的响应能力，增大了哺乳动物红光调控转录激活装置/系统在临床中应用的可能性。
本发明中所述的各核苷酸序列或氨基酸序列均可采用人工合成的方法制备。其中为了提高细菌红光光敏蛋白DrBphp红光照射下构象的稳定性，N端融合不同的NTE结构域构成的新型红光蛋白PnBphp与FnBphp为本发明首次提出。
本发明提出的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其包括：红光感受元件、转录激活元件和效应元件。
本发明中，所述红光光敏蛋白为细菌来源的红光光敏蛋白 DrBphp(REDMAP 2.0)、增加植物光敏蛋白PhyA的NTE结构域的 PnBphp(REDMAP 2.1)、增加真菌光敏蛋白FphA的NTE结构域的 FnBphp(REDMAP 2.2)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，含有DNA结合结构域的Gal4蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述Gal4与细菌来源的红光光敏蛋白之间的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明中，所述转录激活元件包括与红光光敏蛋白相互作用的纳米伴侣蛋白LDB3/LDB14，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6-7所示，以及转录激活因子(所述转录激活因子具有招募RNA聚合酶的功能，包括VP64、VP16、p65、VPR、p65-HSF1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.8-12所示，以及LDB3/LDB14与转录激活因子之间的连接肽。
本发明中，所述LDB3纳米伴侣蛋白N端融合表达了不同拷贝数的入核信号NLS，所述NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；其中，所述纳米伴侣蛋白和转录激活因子之间的连接肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明中，所述效应元件包括诱导型启动子及目的基因。
其中，诱导型启动子由操纵子和诱导型弱启动子共同组成，即P5×UAS- (hCMVmin)和P5×UAS-(TATA)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示，红光光敏蛋白及其融合蛋白Gal4可与所述的诱导型启动子相互结合，该诱导型启动子在没有招募RNA聚合酶的情况下不能启动下游基因的表达，目的基因可以为任何有意义蛋白的基因序列。
其中，所述效应元件可为任何有意义蛋白的基因序列，包括SEAP、EGFP 和Luciferase报告基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17-19所示；基因治疗的药物蛋白Insulin和mTSLP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20-21所示。
其中，所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统可由波长为660±10nm的红光诱导激活目的基因的表达，在780nm远红光的照射下可关闭基因转录。
本发明所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统及其转录激活的作用机理如图1所示，具体解释说明为：红光光敏蛋白DrBphp、PnBphp、FnBphp和一种具有DNA结合结构域的蛋白Gal4融合表达，在660nm红光的照射下，红光光敏蛋白的构象发生改变，促使与其特异性识别的纳米伴侣蛋白LDB3及其融合的转录激活因子p65-HSF1相互结合，利用红光光敏蛋白与纳米抗体LDB3异源二聚的特性，诱导型启动子可通过转录激活因子p65-HSF1招募RNA聚合酶启动下游，目的基因的转录表达。
本发明中，将哺乳动物红光调控转录激活装置/系统所有模块构建在真核表达载体和/或AAV表达载体上，可在哺乳动物细胞中实现由红光诱导的转录激活表达。并且在任意类型的哺乳动物细胞均具有红光诱导激活表达的效果，如 HEK-293T、hMSC-TERT，HeLa、Hana3A、ATDC5等细胞系。
其中，所述红光的红光波长为660±10nm、光照强度为0-2.5mW/cm2、照射时间为0-24h，若无特殊说明光照强度为2mW/cm2，光照时间为10s；照射方法为连续照射或利用不同的红色黑底图片在不同空间进行特异性照射，从而控制哺乳动物细胞的基因转录表达水平。所述红光光源可以为LED灯、激光灯、理疗仪、手机等电子设备屏幕等。所述远红光的波长为780nm。
本发明中，哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，可通过调节光照强度以及光照时间实现对报告基因表达量的控制，此外通过控制红光光照的空间位置，对报告基因的转录表达实现空间特定激活的效果，具有良好的时间和空间特异性。
本发明还提出了所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建红光感受元件
构建红光光敏蛋白与DNA结合蛋白Gal4的融合蛋白，以及两蛋白间的连接肽，作为所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的红光感受元件。
其中，所述的红光光敏蛋白可以为任意版本蛋白DrBphp(REDMAP 2.0)/PnBphp(REDMAP 2.1)/FnBphp(REDMAP 2.2)，其氨基酸序列如 SEQIDNO.1-3所示；
(2)构建转录激活元件。
构建纳米伴侣蛋白基酸序列如SEQ ID NO.6-7所示，与转录激活子基酸序列如SEQIDNO.8-12所示的融合蛋白，以及两蛋白间的连接肽，作为所述哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统的转录激活元件。
其中，纳米伴侣蛋白LDB3和LDB14均可以与红光光敏蛋白在红光照射下相互作用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6-7所示；最终，根据报告基因的诱导效率，优先选择LDB3作为转录激活因子。
其中，纳米分子伴侣LDB3前通过增加不同拷贝数的入核信号(NLS)，实现对该装置/系统的优化，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。最终，根据报告基因的诱导效率，优先选择两拷贝数的入核信号NLS(2×NLS)与LDB3融合表达，
其中，所述转录激活因子包括p65、VP64、VPR、VP16、p65-HSF1等，这些转录因子均具有招募RNA聚合酶的功能，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8-14所示。最终，根据报告基因的诱导效率，选择p65-HSF1作为转录激活因子。
其中，所述两种融合蛋白间的连接肽为7个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
(3)构建效应元件。
构建的效应元件包括诱导型启动子以及下游的报告基因其中，所述诱导型启动子包括操纵子、诱导型弱启动子。操纵子为DNA结合蛋白Gal4可特异识别的DNA序列5×UAS，弱启动子为TATA或hCMVmin。操纵子和弱启动子共同组成种诱导型启动子(P5×UAS)，其核苷酸序列如SEQIDNO.15-16所示；报告基因为任何有意义的蛋白。包括胰岛素Insulin、mTSLP、SEAP、EGFP、 Luciferase等。其氨基酸序列如SEQ ID NO.17-21所示。
其中，诱导型启动子(P5×UAS)仅在660nm红光照射下启动下游报告基因的表达。其中诱导型启动子包括但不限于TATA或hCMVmin。最终，根据报告基因的诱导效率，优先选择(P5×UAS，5×UAS-PTATA)为诱导型启动子。
本发明所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统可以在短短几秒内对红光进行快速响应，高效启动下游报告基因的转录表达。
本发明所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统在660nm红光诱导下启动报告基因的表达，在其他的波长下均不能激活报告基因表达。
本发明所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统在660nm红光照射下激活报告基因的转录表达，在780nm的远红光照射下，关闭转录装置/系统。
本发明所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统且对红光呈现出高度的时间和空间特异性。
本发明所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统且可在不同的哺乳动物细胞系中调控基因的表达。
本发明所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，模块元件小，操作简单、且不需要额外添加色素，可由腺相关病毒AAV实现高效递送。
本发明所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，可通过联合CRISPR- dCas9实现内源基因在细胞水平以及小鼠体内水平的激活表达。
本发明还提供了一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的真核表达载体、AAV表达载体、工程化哺乳动物细胞、工程化AAV病毒颗粒和/或系统；其中，所述工程化哺乳动物细胞为转染了包含所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的哺乳动物细胞；所述工程化AAV由AAV包装质粒和包含哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的AAV载体质粒包装生产。
所述真核、AAV表达载体可以是单独含有红光光敏元件编码基因的载体、单独含有转录激活元件编码基因的载体或单独含有效应元件编码基因的载体。或者同时包括红光光敏元件编码基因的载体和转录激活元件编码基因的载体，或者同时含有转录激活元件编码基因的载体和效应元件编码基因的载体。上述所有的真核生物表达载体和AAV表达载体的构建方式详见表1。
本发明还提出了制备含有所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的真核表达载体、AAV表达载体、工程化细胞或工程化AAV的构建以及应用方法。
所述真核表达载体以及AAV表达载体的制备方法详见表1；
所述制备工程化细胞的方法包括：PEI转染、脂质体Lip3000转染；所述工程化AAV病毒的注射方式均为肌肉注射。其中，工程化AAV由上海泰尔图生物科技有限公司包装获得。
本发明还提供了所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统或所述真核表达载体、AAV表达载体、工程化细胞和工程化AAV病毒在制备工程化哺乳动物细胞和/或利用CRISPR-dCas9激活内源基因表达(EGFP、Luciferase、Insulin、 mTSLP等，氨基酸序列如SEQID NO.17-21所示)、工程化AAV病毒和/或用于 AAV递送的基因治疗试剂盒的应用。
本发明中，所述试剂盒包括调控所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统各组分质粒的试剂盒、含有调控所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的 AAV病毒剂盒以及相应的说明书。
本发明还提出了一种利用所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统在哺乳动物细胞中调控基因表达的方法，包括步骤：
a)将含有所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统构建在宿主细胞真核质粒表达载体、AAV表达载体中；
b)将含有哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的表达载体导入哺乳动物细胞中；
c)通过红光诱导哺乳动物中的报告基因和/或药物蛋白(如SEAP、Luciferase、Insulin、mTSLP等)表达；
d)检测目的基因的表达情况。
本发明还提出了一种利用所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，通过水动力的方式将哺乳动物红光调控转录激活装置/系统递送至小鼠肝脏部位，在小鼠肝脏组织中激活外源基因的方法，具体包括以下步骤：
a)将含有所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统构建在宿主细胞真核质粒表达载体、AAV表达载体中；
b)将上述含有表达载体的混合溶液通过水动力注射的方式递送入小鼠的肝脏组织；
c)通过红光诱导小鼠肝脏部位外源基因(Luciferase)的表达；
d)活体成像，分析小鼠肝脏组织外源基因的激活的效果。
本发明还提出了一种利用所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统利用CRISPR-dCas9激活哺乳动物细胞内源基因表达的方法，内源基因包含RHO2XF、 ASCL1、TTN、MIAT、IL1RN。不同内源基因所对应的gRNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO.22-25所示。
具体包括以下步骤：
a)将含有所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统、dCas9以及效应元件 MS2-p65-HSF1构建在真核质粒表达载体、AAV表达载体中；
b)将上述表达载体转染至哺乳动物细胞中；
c)通过红光诱导MS2-p65-HSF1的表达，进而诱导哺乳动物细胞内源基因的激活；
d)抽提细胞的RNA，通过RT-qPCR的方式，分析哺乳动物细胞内源基因激活的效果。
本发明还提出了一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统用于基因治疗的方法，所述方法包括：a)构建含有哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的AAV 表达质粒载体；b)制备包含哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的工程化 AAV病毒(表达Luciferase、Insulin或mTSLP)，其中，所述工程化AAV病毒由上海泰尔图生物科技有限公司制备；c)通过肌肉注射的方式向生物体内递送哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的工程化AAV病毒；d)通过红光激活表达目的基因和/或治疗蛋白，如Insulin、mTSLP，从而实现对相应疾病进行基因治疗。
本发明还提出了一种利用所述哺乳动物红光调控转录激活装置通/系统过腺相关病毒AAV作为载体，实现对Ⅰ型糖尿病治疗的方法，所述方法包括：
a)构建哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的AAV载体质粒，选择Insulin 作为报告基因，即构建了含有REDMAP 2.X装置/系统元件，表达Insulin的AAV 载体，见表1；
b)将含有哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的AAV质粒包装成AAV病毒颗粒；
c)将包装好的含有哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的工程化AAV病毒通过肌肉注射到小鼠腿部肌肉组织；
d)通过红光的诱导激活小鼠肌肉组织AAV表达胰岛素的水平，从而实现精准长期的到降血糖效果。
本发明还提出了一种利用所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统通过腺相关病毒AAV作为载体，实现对肥胖疾病治疗的方法，所述方法包括：
a)构建哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的AAV载体质粒，选择mTSLP 作为报告基因，即构建了含有REDMAP 2.X装置/系统的元件，表达mTSLP的 AAV载体，见表1；
b)将含有哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的AAV质粒包装成病毒AAV 颗粒；
c)将包装好的含有哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的工程化AAV病毒通过肌肉注射的方式，递送到小鼠肌肉组织；
d)通过红光的照射，激活小鼠肌肉组织中AAV表达mTSLP，从实现减肥效果。
本发明中，在动物水平的红光诱导激活，红光为波长为660±10nm，光源可以为LED、激光灯、理疗仪。无特殊说明光照强度为20mW/cm2，光照时间为30min，光照频率为每三天光照一次。
本发明的有益效果在于：本发明所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统可以由红光实现精准、高效、快速的转录激活效果，并且具有高度的时空特异性、较强的组织透过性。除此之外还可由780nm的远红光实现对报告基因转录的关闭，具有较强的基因转录表达可调性。由于该哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的元件简单、模块小，且不需要额外添加色素，可由腺相关病毒(AAV)作为递送载体，为基因治疗在临床中的应用提供了有力的工具。本发明中的含有哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的工程化AAV成功实现了对小鼠Ⅰ型糖尿病以及肥胖的长期精准可控治疗。本发明提出的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统可广泛应用多种基础生物研究和转化医学研究，在临床应用中具有巨大的价值。
附图说明
图1为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统及其激活转录的原理示意图。
图2为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中对红光光敏蛋白不同纳米分子伴侣的挑选结果图。
图3为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中LDB3前不同拷贝数入核信号NLS优化的结果图。
图4为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中LDB3融合表达的不同转录激活子优化的结果图。
图5为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中启动报告基因表达的诱导型弱启动子的优化结果图。
图6为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中优化红光光敏蛋白结构域后的激活效果比较图。
图7为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中激活报告基因转录表达对光照时间依赖性的结果图。
图8为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中激活报告基因转录表达对光照强度依赖性的结果图。
图9为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在光照后不同时间取样报告基因表达效率的结果图。
图10为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在不同波长光诱导下激活报告基因表达的结果图。
图11为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统受660nm红光开启和780nm远红光关闭的结果图。
图12为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在不同哺乳动物细胞系中具有普适性的结果图。
图13为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统激活报告基因转录表达具有可逆性的结果图。
图14为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统激活报告基因转录表达空间特异性验证的结果图。
图15为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统内源基因转录表达的原理示意图。
图16为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统激活内源基因表达对光照强度依赖性的结果图。
图17为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统激活内源基因表达对光照时间依赖性的结果图。
图18为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统激活内源基因表达具有可逆性的结果图。
图19为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在不同哺乳动物细胞系中激活内源基因表达的结果图。
图20为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统激活不同内源基因表达的结果图。
图21为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统通过水动力方式在小鼠肝脏组织激活外源基因表达流程图。
图22为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.0装置/系统通过水动力方式激活小鼠肝脏组织外源基因表达的具有光照强度依赖性的结果图。
图23为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.0装置/系统通过水动力方式激活小鼠肝脏组织外源基因表达具有光照时间依赖性的结果图。
图24为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.1和REDMAP 2.2装置/系统通过水动力方式激活小鼠肝脏组织外源基因表达具有光照时间依赖性的结果图。
图25为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒在小鼠肌肉组织长期性稳定表达的流程图。
图26为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒在小鼠肌肉组织激活Luciferase表达长期性稳定表达的活体成像结果图。
图27为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒在小鼠肌肉组织长期性激活Luciferase表达数据统计结果图。
图28为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的三病毒 AAV治疗Ⅰ型糖尿病的血糖监测结果图。
图29为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的两病毒 AAV治疗Ⅰ型糖尿病的原理图。
图30为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的两病毒 AAV治疗Ⅰ型糖尿病的血糖监测结果图。
图31为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的两病毒 AAV治疗Ⅰ型糖尿病的体内Insulin含量监测结果图。
图32为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒对肥胖基因治疗肥胖的原理图。
图33为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒对肥胖基因治疗的小鼠体重统计结果图。
图34为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒对肥胖小鼠进行基因治疗后体内米色脂肪、白色脂肪以及棕色脂肪重量统计结果图。
图35为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒对肥胖小鼠进行基因治疗的小鼠血清中甘油三酯含量的统计结果图。
图36为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒对肥胖小鼠进行基因治疗的小鼠肝脏中甘油三酯含量的统计结果图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。这些实施例仅用于举例说明发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识。以下实施例中所用的试剂、仪器等，以及未注明具体条件的实验方法，按照常规或商品供货商所建议的条件进行。
材料与方法
质粒构建以及相关试剂的配置
利用分子克隆技术构建本发明所有表达质粒，步骤为业内常识。
所有用于PCR的引物均由上海睿勉生物科技有限公司合成。本发明实施例中构建的表达质粒均经过测序，测序由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。本发明实施例中所用的Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶、同源重组酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。核酸内切酶购自New England Biolabs； T4DNA连接酶、DNA Marker DL15000、DNA Marker DL5000、DNA Marker DL2000均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。酵母提取物(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Trypton)、琼脂粉、氨苄青酶素(Amp)、琼脂糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司。核酸染料GoldView购自翌圣生物科技(上海)有限公司；质粒小抽提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA胶回收试剂盒、 PCR产物纯化试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司；实施例中提及的无水乙醇、NaCl等其余试剂均为国产分析纯产品。
PCR体系以及程序设定按照Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶(宝日医生物技术(北京)有限公司)提供的说明书进行；无缝克隆按照同源重组酶 (南京诺唯赞生物科技有限公司)提供的说明书进行、T4酶连按照T4 DNA连接酶(宝日医生物技术(北京)有限公司)提供的说明书进行；DNA载体或片段的酶切按照核酸内切酶(New England Biolabs)提供的说明书进行；DNA片段的胶回收、纯化回收，其步骤根据DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒 (康为世纪生物科技有限公司)的操作说明书；质粒提取步骤根据质粒小抽(天根生化科技(北京)有限公司)提取试剂盒说明书。
试剂的配置
DH5α感受态的制备
DH5α的生长密度使用Eppendorf分光光度计测定600nm波长处的光吸收值(OD600)。制备感受态用到的所有试剂、耗材需要提前采用高压蒸汽灭菌处理，超净工作台用紫外照射杀菌，制作的全部过程严格保证无菌、冰浴(离心机提前4℃预冷，试剂和1.5mL离心管提前放入4℃冰箱预冷)。
具体步骤如下：
1)将DH5α划线无抗固体LB平板，过夜培养，以到达活化的目的；
2)挑取单克隆接种于5mL液体LB培养基中，37℃，210rpm过夜培养；
3)将2mL的种子液接种到200mL无抗液体LB中，37℃，210rpm培养至OD600＝0.3-0.5；
4)将菌液置于冰上冷却20min；
5)4℃，4500rpm离心7min，弃上清；
6)加入和菌液等体积的0.1M CaCl2，用移液枪轻轻吹打混匀；
7)4℃，4500rpm离心7min，弃上清；
8)加入和菌液1/2体积的0.1M CaCl2，用移液枪轻轻吹打混匀；
9)4℃，4500rpm离心7min，弃上清；
10)加入和菌液1/2体积的0.1M CaCl2溶液配置的10％的甘油，用移液枪轻轻吹打混匀；
11)4℃，4500rpm离心7min，弃上清；
12)用10mL 0.1M CaCl2配置的10％的甘油重悬，100μL/管分装，-80℃超低温保存；
质粒的转化
转化的方式为CaCl2介导的化学转化法
具体步骤如下
1)将提前制备好的DH5α感受态至于冰上进行解冻，加入适当的质粒DNA(无缝克隆的产物(10μL)全部加入、质粒100ng),加入的质粒DNA 的体积一般不超过感受态总体积的1/10；
2)冰上静置30min，42℃热激90s，4℃静置2min；
3)加入600μL无抗LB，210rpm 37℃培养45min；
4)6000rpm离心2min，弃上清，用200uL LB重悬后，涂布在含氨苄抗性的LB固体培养平板上；
5)37℃倒置过夜培养。
细胞培养与转染以及相关试剂的配置
本发明实施例中用以下细胞系和PEI转染为例说明REDMAP 2.X装置/系统在细胞中的工作情况，但不限制本发明保护范围。
所述REDMAP 2.X装置/系统及其转录激活的作用机理如图1所示，具体解释说明为：红光光敏蛋白DrBphp、PnBphp、FnBphp和一种具有DNA结合结构域的蛋白Gal4融合表达，在660nm红光的照射下，红光光敏蛋白的构象发生改变，促使与其特异性识别的纳米伴侣蛋白LDB3及其融合的转录激活因子p65- HSF1相互结合，利用红光光敏蛋白与纳米抗体LDB3异源二聚的特性，诱导型启动子可通过转录激活因子p65-HSF1招募RNA聚合酶启动下游，目的基因的转录表达。
用于细胞培养10cm细胞培养皿、细胞培养板购自Thermo Fisher Scientific 公司(Labserv)；使用的Eulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)、胎牛血清购自美国Gibico公司；青霉素和链霉素溶液购自上海碧云天生物技术有限公司；转染所用的PEI购自Polysciences公司，脂质体lip3000购自Thermo Fisher Scientific公司(Labserv)；细胞数量计数采用Countess II automated cell counter；其余耗材为普通国产耗材。
细胞培养：本发明中涉及到的细胞包括人胚胎肾细胞(HEK-293T, ATCC:CRL-3216)，稳定整合了一个E1基因(Thermo Fisher,R70507)拷贝，端粒的人类间叶细胞(hMSC-TERT)和HEK-293T衍生的Hana3A细胞，鼠源软骨细胞 ATDC5、所有细胞培均养于Eulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM)中，培养基中加入10％(v/v)的胎牛血清和1％(v/v)的青霉素和链霉素溶液；细胞培养于37℃、含有5％浓度的二氧化碳的培养箱中。
转染：所有细胞系转染方法有两种，第一种转染采用PEI，第二中采用脂质体Lip3000。
PEI的配置以及转染方法
PEI的配置
用去内毒素的无菌水充分溶解PEI，调整pH至7.0，终浓度为1μg/μL,0.22 μm的滤膜除菌后分装，冻存于-20℃冰箱。
具体步骤如下
1)提前12-16h在24孔板/10cm细胞培养皿中接种适量的细胞，24孔板 (6×104)/10cm细胞培养皿(6×105)；
2)将需要转染进入细胞的DNA与DMEM完全培养基混合，24孔板每孔 50μL/10cm细胞培养皿1mL；
3)在DMEM与DNA的混合物中入相对应体积的PEI，其中PEI：DNA＝3： 1(HeLa细胞，PEI：DNA＝5：1)涡旋振荡约10s，掌上离心机去除管壁的液体，室温静置15min；
4)将转染混合物均匀滴加在细胞培养液中，置于37℃CO2培养箱培养；
5)转染后6h换入适当体积的新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素) 培养基；
脂质体Lip3000的方式按照厂家提供的说明书进行。
报告基因的检测方法以及相关试剂的配置：
分泌型碱性磷酸酶(SEAP)
用于配置检测报告基因反应缓冲液的高精氨酸、氯化镁、二乙醇胺、盐酸溶液购至生工生物工程(上海)股份有限公司；生色底物(对硝基苯酚磷酸盐)购至上海晶纯生化科技股份有限公司(阿拉丁)。
相关试剂的配置：
pH(HCL)调制9.8，4℃避光保存。
分装至2mL EP管，-20℃保存。
具体步骤如下
1)吸取200μL细胞培养液上清置于96孔板中；
2)盖上保鲜膜(防止液体蒸发)，65℃放置30min，(为了去除内源的碱性磷酸酶，外源表达的碱性磷酸酶SEAP具有耐高温的特点)；
3)吸取80μL加热后的细胞培养液(或者根据实验用PBS进行稀释)上清于新的96孔板中，与120μL反应溶液(2xbuffer:pNPP＝5:1)快速混合；
4)酶标仪连续监测反应后的产物在405nm波长下的吸收值，检测时间为10 min；
酶活的计算
碱性磷酸酶(SEAP)的酶活力定义是：37℃pH＝9.8时，在1min内与底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP-Na2)反应生成1mol/L对硝基苯酚的碱性磷酸酶，定义为1 个活力单位(1U)。对硝基苯酚(pNPP-Na2)本身有亮黄色，在波长405nm时，不同浓度的对硝基苯酚(反应产物)对应不同的吸光值。计算方法为：样品和底物反应过程中不同时间点所测OD值做成曲线的斜率*256.8，即为酶活，单位 U/L。
小鼠体内Luciferase的检测
Luciferase是一种荧光素酶，广泛分于生物发光有机体，其中包括细菌、真菌、鱼、昆虫等。底物为荧光素(Luciferin)，当Luciferase和其底物混合时会产生一种迅速衰减的黄绿色闪光，这种光信号可用荧光检测仪(Luminometer) 进行检测。发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比，因此，可对报告基因荧光素酶的转录进行间接估计。
具体步骤如下
1)小鼠腹腔注射荧光素底物溶液(150mg/kg)；
2)将小鼠放置于小动物麻醉机中(异氟烷+氧气)；
3)等待5-10min，用活体成像仪检测荧光信号；
细胞/组织RNA的抽提
所有RNA抽提的材料均由RNase酶进行预先处理，Trizol购自宝日医生物技术(北京)有限公司；DEPC处理的ddH2O购自生工生物工程(上海)股份有限公司，涉及到的异丙醇、氯仿、无水乙醇等均为国产分析纯产品。
具体步骤如下
1)24孔板中每孔加入200μL的Trizol，若提取组织RNA则加入400μLTrizol，细胞实验有两重复，将重复孔进行混合(共400μL)，室温静置5min；
2)加入80μL(1/5体积)的氯仿，颠倒混匀至呈现乳白色，室温静置5min；
3)12000rpm 4℃离心15min；
4)此时混合物分为三层，既下层红色为机物、中间白色为DNA、上层透明为RNA，小心吸取适量体积的透明层液体于新的1.5mL离心管中(注意不要吸到中间DNA和下层有机物)；
5)加入等体积异丙醇，室温静置10min(也可放置于4℃、-20℃提高RNA 沉淀的效率)；
6)12000rpm 4℃离心10min，弃上清；
7)加入1mL 75％乙醇(DEPC处理的H2O配置),轻轻悬浮底部的沉淀；
8)12000rpm 4℃离心10min，弃上清；
9)吹干后用适量的DEPC处理过的H2O溶解沉淀，立即进行反转或-80℃储存。
RT-qPCR数据分析
提取细胞的RNA后，按照HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR(Vazyme,China；Cat.no.R232-01)提供的说明书将RNA反转成cDNA。通过 Real-Time PCRInstrument(QuantStudio 3,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)用TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme， China；Cat.no.Q712-02)测定靶基因的循环阈值。扩增条件为：95℃预变性10 min，接着40个循环(95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s)，最后72℃延伸10min，所用引物见表2。
数据分析采用进行计算，所有样品均以管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，结果表示成以黑暗条件下为参照的相对RNA水平。
水动力尾静脉注射质粒
水动力方法的主要原理是通过小鼠尾静脉将质粒DNA溶液高压快速注射进小鼠体内，由于高压下血循环的冲击，会对小鼠肝脏造成瞬间损伤，使输入的 DNA片段可以进入肝细胞内。
注射小鼠肝脏的质粒DNA由Ringer’s溶液稀释配置得到，每只小鼠注射的体积由小鼠的体重来计算：
相关试剂的配置：
实施例1哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中对红光光敏蛋白不同纳米伴侣分子的挑选。
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中最佳纳米伴侣蛋白，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共两块：黑暗组和光照组；
第三步，转染。在接种细胞16-18h后，将PDL6(P5×UAS-SEAP-pA, P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)和不同的纳米伴侣蛋白的质粒载体pQL207(PhCMV-LDB3-VP64-pA)/pQL208(PhCMV-LDB14-VP64-pA)以 1:2:2(w/w/w)的比例进行转染(具体步骤见方法材料)。用锡箔纸包裹遮光，黑暗条件培养；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入500 μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。光照组置于660nm，光照强度为2mW/cm2的LED下持续光照24h，黑暗组一直在黑暗条件下培养；
第六步，检测报告基因(具体步骤见材料方法)。
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中，LDB3为纳米伴侣蛋白时，报告基因SEAP激活报告的效率最高。实验数据详见附图2。所有的数据都以n＝3 独立复制实验的方式呈现。
实施例2哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中对转录激活元件LDB3入核信号NLS拷贝数的优化。
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统的转录激活元件LDB3的最佳的入核信号NLS拷贝数，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共两块：黑暗组和光照组；
第三步，转染。在接种细胞16-18h后，各组中加入PDL6(P5×UAS-SEAP-pA, P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)和带有不同拷贝数核定位信号NLS的LDB3质粒载体pQL232(PhCMV-3NLS-LDB3-VP64-pA)，pQL250 (PhCMV-2NLS-LDB3-VP64-pA)，pQL243(PhCMV-1NLS-LDB3-VP64-pA)，pQL207 (PhCMV-LDB3-VP64-pA)，以1:2:2(w/w/w)的比例用PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照(具体步骤同本发明实施例1)；
第六步，检测报告基因(具体步骤见材料方法)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中，LDB3的N端融合表达两拷贝的入核信号NLS(PhCMV-2NLS-LDB3-VP64-pA)激活报告基因表达的效率最高。实验数据详见附图3，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例3哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中对转录及后元件中不同转录激活子的选择
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中的不同的激活子对系统活性的影响，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共两块：黑暗组和光照组；
第三步，转染。在接种细胞16-18h后，各组中加入PDL6(P5×UAS-SEAP-pA, P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)和融合不同转录激活子的质粒载体pQL251(PhCMV-2NLS-LDB3-VP16-pA)/pQL250(PhCMV-2NLS- LDB3-p65-pA)/pQL252(PhCMV-2NLS-LDB3-VPR-pA)/pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3- p65-HSF1-pA)，以1:2:2(w/w/w)的比例用PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照(具体步骤同本发明实施例1)；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)。
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中，选择p65-HSF1转录激活子激活报告基因表达的效率最高。实验数据详见附图4，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例4为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中对效应元件中诱导型启动子的优化。
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中的不同的诱导型启动子对报告基因激活效率的影响，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共两块：黑暗组和光照组；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pNX12(PhCMV-2NLS- LDB3-p65-HSF1-pA)，pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)和不同诱导型启动子的质粒载体PDL6(P5×UAS-SEAP-pA；P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)/pYZ430(P5×UAS-SEAP- pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)，以1:2:2(w/w/w)的比例与PEI转染试剂用PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照(具体步骤同本发明实施例1)；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)。
结果显示，哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中，选择 5×UAS-PTATA为诱导型启动子，激活报告基因表达的效率最高。实验数据详见附图5，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例5为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中对红光光敏蛋白结构的优化
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中不同结构的红光光敏蛋激活报告基因表达效率的影响，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共两块：黑暗组和光照组；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pYZ430(P5×UAS-SEAP- pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，和不同版本的红光光敏蛋白质粒载体pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)/pQL325(PhCMV- Gal4-PnBphp-pA)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)，以1:2:2(w/w/w)的比例用 PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照(具体步骤同本发明实施例1)；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统中，相比于DrBphp(REDMAP 2.0)，PnBphp(REDMAP 2.1)具有更好的激活效率，FnBphp(REDMAP 2.2)具有更好的激活表达量。不同红光光敏蛋白的结构特点和实验数据详见说明书附图 6，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例6为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中报告基因的表达与光照时间相关性的探究
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统激活报告基因表达对光照时间具有依赖性，但不对本发明的保护范围有所限制。
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中。共11块，其中一块为黑暗组；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pNX12(PhCMV-2NLS- LDB3-p65-HSF1-pA)，pYZ430(P5×UAS-SEAP-pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)以及含有不同版本红光蛋白pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)(REDMAP 2.0)/ pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA) (REDMAP 2.2)的质粒载体，以2:1:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。将11块24孔板进行编号(分别为1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11)，1号板放置于黑暗条件培养，2-11号板分别用660nm，光照强度为2mW/cm2的LED下光照不同的时间(1s、5s、10s、6min、1h、3h、6h、12h、 18h、24h)，光照处理后，置于黑暗条件培养；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统激活报告基因的表达具有光照时间依赖性。实验数据详见附图7，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例7为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统中报告基因的表达与光照强度相关性的探究
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统激活报告基因表达对光照强度具有依赖性，但不对本发明的保护范围有所限制。
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共8块；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pYZ430(P5×UAS-SEAP- pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)(REDMAP 2.0)/ pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA) (REDMAP 2.2)的质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。将8块24孔板进行编号(分别为1、2、3、4、5、6、7、8)， 1号板放置于黑暗条件培养，2-8号板分别用660nm的LED用不同的光照强度 (0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2mW/cm2)光照10s，光照处理后，置于黑暗条件培养；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统激活报告基因的表达对光照强度具有依赖性。实验数据详见附图8，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例8为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统对报告基因表达效率最佳检测时间的探究
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统最优的检测时间，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中。分为光照组和黑暗组；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pYZ430(P5×UAS-SEAP- pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/ pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP2.2)的质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。光照组置于660nm，光照强度为2mW/cm2的LED下光照 10s，之后置于黑暗条件下培养。分别在光照后的0、2、4、6、12、24、48h取样，取出的细胞上清储存于-20℃，统一检测；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统报告基因表达的最佳检测时间为光照后24h。实验数据详见附图9，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例9为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统光谱特异性的探究。
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统激活和关闭基因表达特性，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共5块；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pYZ430(P5×UAS-SEAP- pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/ pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP2.2)的质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。将6块24孔板进行编号(分别为1、2、3、4、5、)，1号板放置于365nm的LED下，2号板放置于465nm的LED下，3号板放置于530nm的 LED下，4号板放置于660nm的LED下，5号板放置于780nm的LED下，光照时间均为10s，光照处理后置于黑暗条件培养。
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)。
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统仅在在660nm的红光照射开启报告基因的转录，具有良好的光谱特异性。实验数据详见附图10，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例10为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统开启/关闭报告基因转录表达的探究
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统良好的开关特性，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中。共3块；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，pYZ430(P5×UAS-SEAP-pA；P5×UAS, 5×UAS-PTATA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4- FnBphp-pA)(REDMAP 2.2)的质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。第一组置于660nm，光照强度为2mW/cm2660 nm LED灯下光照10s，第二组660nm LED光照10s后，立刻使用光照强度为2mW/cm2的 780nm LED光照2min，黑暗组一直置于黑暗条件培养；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统在660nm的红光照射开启报告基因的转录后可在780nm远红光照射下关闭报告基因的转录，该系统具有灵敏的开关特性。实验数据详见附图11，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例11为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在不同哺乳动物细胞系中激活报告基因表达效果的探究
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统在任意哺乳动物细胞系激活基因转录表达的效果，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T、hMSC-TERT、Hana3A、ATDC5、HeLa细胞于24孔板中，分为光照组和黑暗组；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，pYZ430(P5×UAS-SEAP-pA；P5×UAS, 5×UAS-PTATA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4- FnBphp-pA)(REDMAP 2.2)的质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂/ 脂质体Lip3000(ATDC5)进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。光照组置于660nm，光照强度为2mW/cm2的LED下光照 10s，光照处理后置于黑暗条件培养，黑暗组一直在黑暗条件下培养；
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统不同的哺乳动物细胞系中均可激活报告基因的表达，具有普适性。实验数据详见附图12，所有的数据都以n＝3 独立复制实验的方式呈现。
实施例12为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置可逆性的探究
本实施例以SEAP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X在哺乳动物细胞激活报告基因的表达具有可逆性，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，接板。接种HEK-293T于24孔板中。
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pYZ430(P5×UAS-SEAP- pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/ pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP2.2)的质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)。
第五步，光照。第一组置于波长为660nm，光照强度为1.5mW/cm2的LED 下光照2s，光照结束后立即置于黑暗处培养，48h后继续光照3s，第二组先置于黑暗处培养24h后光照3s，之后置于黑暗处培养。
第六步，检测报告基因(具体步骤见方法材料)。
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置在660nm红光照射下激活基因的转录表达，再次照射660nm红光后仍然可以激活基因转录表达，具有良好的可调性和灵敏性。实验数据详见附图13，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例13为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统空间特异性的探究
本实施例以EGFP为检测报告基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统对红光诱导具有空间特异性，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于10cm细胞培养皿中；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，pDQ63(P5×UAS-EGFP-pA；P5×UAS, 5×UAS-PhCMVmin)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL217(PCMV-Gal4-DrBphp-pA)(REDMAP 2.0)/pQL325(PhCMV- Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP 2.2) 的质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入10 mL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。将细胞培养皿放置于智能手机屏幕上，屏幕显示提前制作好的黑底红字图片，10min后置于黑暗条件培养；
第六步，检测报告基因。由荧光成像仪对绿色荧光蛋白EGFP的表达情况成像；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统诱导EGFP表达出与手机中图片相同的字母，说明具有良好的空间特异性。实验数据详见附图14。
实施例14为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统对内源基因激活效果与光照强度关系的研究
本实施例以RHOXF2为激活目的内源基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统利用CRISPR-dCas9在不同光照强度下激活内源基因表达的情况，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共8块；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pDQ100(P5×UAS-MS2- p65-HSF1-pA；P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pWS69(PhCMV-dCas9-pA)，pWS105 (PU6-sgRNA1RHOXF2-pA)和pWS106(PU6-sgRNA2RHOXF2-pA)pNX12(PhCMV-2NLS- LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4- PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP 2.2)的质粒载体，以1:10:5:5:15:15(w/w/w)的比例用PEI转染试剂行转染(具体步骤见方法材料)。
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。将8块24孔板进行编号(分别为1、2、3、4、5、6、7、8)， 1号板放置于黑暗条件培养，2-8号板分别用660nm的LED用不同的光照强度 (0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5mW/cm2)光照10s，光照处理后，置于黑暗条件培养；
第六步，检测报告基因。抽提RNA，RT-qPCR检测内源的基因激活(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统对内源基因的激活呈现出对光照强度的依赖性。实验数据详见附图16，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例15为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统对内源基因激活效果与光照时间关系的研究
本实施例以RHOXF2为激活目的内源基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统在不同光照时间下激活内源基因表达的情况，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共7块；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pDQ100(P5×UAS-MS2- p65-HSF1-pA；P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pWS69(PhCMV-dCas9-pA)，pWS105 (PU6-sgRNA1RHOXF2-pA)和pWS106(PU6-sgRNA2RHOXF2-pA)pNX12(PhCMV-2NLS- LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4- PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP 2.2)的质粒载体，以1:10:5:5:15:15(w/w/w)的比例用PEI转染试剂行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。将7块24孔板进行编号(分别为1、2、3、4、5、6、7)，1 号板放置于黑暗条件培养，2-7号板分别用660nm，光照强度为2mW/cm2的LED 下光照不同的时间(1s、3s、5s、10s、1h、12h)，光照处理后，置于黑暗条件培养；
第六步，检测报告基因。抽提RNA，RT-qPCR检测内源的基因激活(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统对内源基因的激活对光照时间具有依赖性。实验数据详见附图17，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例16为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统激活内源基因的可调性研究
本实施例以RHOXF2为激活目的内源基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统利用CRISPR-dCas9在在660nm红光和780nm远红光照射下实现内源基因表达的开启和关闭，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中，共7块；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pDQ100(P5×UAS-MS2- p65-HSF1-pA；P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pWS69(PhCMV-dCas9-pA)，pWS105 (PU6-sgRNA1RHOXF2-pA)和pWS106(PU6-sgRNA2RHOXF2-pA)，pNX12(PhCMV-2NLS- LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4- PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP 2.2)的质粒载体，以1:100:50:50:150:150(w/w/w)的比例用PEI转染试剂行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。第一组在光照前取样，第二组用光照强度为0.1mW/cm2 660nm LED660nm光照1s，置于黑暗条件培养24h后取样，第三组用0.1 mW/cm2660 nm光照1s，置于黑暗条件培养48h后取样，第三组置于黑暗条件培养48h后用660nm光照1s，24h后(72h)取样；
第六步，检测报告基因。抽提RNA，RT-qPCR检测内源的基因激活(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统对内源基因的激活在660nm红光具有良好的可调性。实验数据详见附图18，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例17为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在不同哺乳动物细胞系中激活内源基因效果的研究
本实施例以RHOXF2为激活目的内源基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统在不同哺乳动物细胞中激活内源基因表达的效果，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HeLa、hMSC-TERT、Hana3A细胞于24孔板中；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pDQ100(P5×UAS-MS2- p65-HSF1-pA；P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pWS69(PhCMV-dCas9-pA)，pWS105 (PU6-sgRNA1RHOXF2-pA)，pWS106(PU6-sgRNA2RHOXF2-pA)，pNX12(PhCMV-2NLS- LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL325(PhCMV-Gal4- PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP 2.2)的质粒载体，以1:10:5:5:15:15(w/w/w)的比例用PEI转染试剂/脂质体Lip3000进行转染(具体步骤见方法材料)。
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；。
第五步，光照。(具体步骤同本发明实施例11)；
第六步，检测报告基因。抽提RNA，RT-qPCR检测内源的基因激活(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统利用CRISPR-dCas9对内源基因的激活在不同哺乳动物细胞系中具有普适性。实验数据详见附图19，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例18为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在不同哺乳动物细胞系中激活内源基因效果的研究。
本实施例选择ASCL1、TTN、IL1RN、MIAT4种不同内源基因作为目的激活基因，验证哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统对不同内源基因的激活效果，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，接板。接种HEK-293T细胞于24孔板中；
第三步，转染。在接种细胞16-24h后，各组中加入pDQ100(P5×UAS-MS2- p65-HSF1-pA；P5×UAS,5×UAS-PhCMVmin)，pWS69(PhCMV-dCas9-pA)，pSZ83(PU6- sgRNA1ASCL1-pA)和pSZ84(PU6-sgRNA2ASCL1-pA)/pSZ92(PU6-sgRNA1IL1RN-pA)和 pSZ93(PU6-sgRNA2IL1RN-pA)/pSZ103(PU6-sgRNA1TTN-pA)和pSZ104(PU6- sgRNA2TTN-pA)/pYZ417(PU6-sgRNA1MIAT-pA)和pYZ418(PU6-sgRNA2MIAT-pA)，pNX12(PhCMV-2NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白 pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBphp-pA)(REDMAP 2.2)质粒载体，以1:10:5:5:15:15(w/w/w)的比例PEI转染试剂进行转染(具体步骤见方法材料)；
第四步，换液。转染6h后，在绿光条件下用枪头吸出细胞培养液，换入 500μL新鲜DMEM(含胎牛血清和青霉素/链霉素)培养基；
第五步，光照。(具体步骤同本发明实施例11)；
第六步，检测报告基因。抽提RNA，RT-qPCR检测内源的基因激活(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统可激活不同的内源基因。实验数据详见附图20，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例19为哺乳动物REDMAP 2.0装置/系统在小鼠肝脏中激活外源基因表达与光照强度之间关系的研究
本实施例以Luciferase作为小鼠肝脏中激活的外源基因，验证哺乳动物 REDMAP2.0装置/系统在小鼠体内激活外源基因表达于光照强度之间的关系，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，将质粒DNA溶液通过尾静脉注射到小鼠肝脏中。混合pYZ450 (P5×UAS-Luciferase-pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)、pQL326(PhCMV-3NLS-LDB3-p65- HSF1-pA)，pQL217(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.0)质粒载体，以1:2:2 (w/w/w)的比例混合用水动力的方法将质粒通过尾静脉注入小鼠的肝脏细胞(具体步骤见方法材料)；
第三步，光照。水动力肝脏递送质粒16h后，将小鼠分为5组(编号为1、2、 3、4、5)光照强度分别0、1、5、10和20mW/cm2光照小鼠腹部，光照时间为1 h；8h后检测肝脏中激活基因的表达效果；
第四步，检测报告基因。检测小鼠肝脏中报告基因luciferase的表达(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.0装置/系统在小鼠的肝脏激活外源源基因的表达呈现光照强度依赖性。实验数据详见附图22，所有的数据都以n＝4独立复制实验的方式呈现。
实施例20为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.X装置/系统在小鼠肝脏中激活外源基因表达与光照时间之间关系的研究
本实施例以Luciferase作为小鼠肝脏中激活的外源基因，验证哺乳动物 REDMAP2.X装置/系统不同的红光光敏蛋白在小鼠肝脏中外源基因表达的情况，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，将质粒DNA溶液通过尾静脉注射到小鼠肝脏中。混合pYZ450(P5× UAS-Luciferase-pA；P5×UAS,5×UAS-PTATA)、pQL236(PhCMV-3NLS-LDB3-p65-HSF1- pA)，以及含有不同版本红光光敏蛋白pQL217(PhCMV-Gal4-DrBphp-pA)(REDMA P 2.0)pQL325(PhCMV-Gal4-PnBphp-pA)(REDMAP 2.1)/pQL326(PhCMV-Gal4-FnBph p-pA)(REDMAP 2.2)质粒载体，以1:2:2(w/w/w)的比例混合用水动力的方法将质粒通过尾静脉注入小鼠的肝脏细胞(具体步骤见方法材料)；
第三步，光照。水动力肝脏递送质粒16h后，将小鼠分为5组(编号为1、2、 3、4、5)，其中REDMAP 2.0装置/系统的光照时间分别为0、5、30、60、120 min，REDMAP 2.1和REDMAP2.2装置/系统的光照时间分别为0、1、5、30和60 min；8h后检测肝脏中激活基因的表达效果；
第四步，检测报告基因。检测小鼠肝脏中报告基因luciferase的表达(具体步骤见方法材料)；
结果显示，哺乳动物REDMAP 2.X装置/系统在小鼠肝脏组织激活外源基因的表达均呈现出光照时间依赖性，且FnBphp(REDMAP 2.2)激活基因表达更加快速、高效。实验数据详见附图23-24，所有的数据都以n＝4独立复制实验的方式呈现。
实施例21为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV 腺相关病毒在小鼠体内长期稳定表达的研究
本施实例以Luciferase作为检测AAV长期表达的报告基因，验证REDMAP 2.2装置/系统工程AAV在体内实现基因治疗长期性的可能性，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，包装成含REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒。AAV载体质粒包含pQL271(ITR-P5×UAS-Luciferase-P2A-Insulin-pA-ITR P5×UAS,5×UAS-PTATA)， pNX11(ITR-PhCMV-3NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，pNX177(ITR-PhCMV-Gal4- FnBphp-pA-ITR)，由公司完成AAV病毒的包装；
第三步，工程AAV的肌肉注射。上述三种AAV加入的病毒量均为每只分别2 ×1011vg，以1:1:1的比例混合，三点法注射在小鼠的小腿肌肉中；
第四步，光照。AAV肌肉注射两周后进行光照，光照组每周光照30min，8 h后即刻检测报告基因的表达情况，黑暗组一直处于正常饲养环境中；
第五步，检测报告基因。检测小鼠肌肉组织Luciferase的表达(具体步骤见方法材料)。
结果显示，由REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒可在小鼠体内长期、稳定的生产和表达。实验数据详见附图26-27，所有的数据都以n＝5独立复制实验的方式呈现。
实施例22为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV (三病毒)对Ⅰ型糖尿病基因治疗效果探究
本实施例以Insulin作为治疗蛋白，验证REDMAP 2.2装置/系统由三病毒 AAV对Ⅰ型糖尿病的基因治疗效果，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，包装成含REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒。AAV载体质粒包含pQL271(ITR-P5×UAS-Luciferase-P2A-Insulin-pA-ITR P5×UAS,5×UAS-PTATA)， pNX11(ITR-PhCMV-3NLS-LDB3-p65-HSF1-pA)，pNX177(ITR-PhCMV-Gal4- FnBphp-pA-ITR)，由公司完成AAV病毒的包装；
第三步，工程AAV的肌肉注射。上述三种AAV加入的病毒量均为每只2× 1011vg，以1:1:1的比例混合，三点法注射在小鼠的小腿肌肉中；
第四步，光照。AAV肌肉注射两周后进行光照，光照组每5天光照1h(同一天早上30min,晚上30min，第二天进行检测)，黑暗组一直处于正常饲养环境中；
第五步，检测报告基因。检测小鼠的血糖水平，使用便携式血糖检测仪；
结果显示，由REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒实现对Ⅰ型糖尿病有效的基因治疗，小鼠血糖可长期维持在正常稳定值。实验数据详见附图28，所有的数据都以n＝5独立复制实验的方式呈现。
实施例23为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV (两病毒)对Ⅰ型糖尿病基因治疗效果的探究
本实施例以Insulin作为治疗蛋白，验证REDMAP 2.2装置/系统由两病毒 AAV对Ⅰ型糖尿病的基因治疗效果，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1；
第二步，包装成含REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV病毒。AAV载体质粒包含pQL318(ITR-PhCMV-3NLS-LDB3-p65-HSF1-pA P5×UAS-EGFP-P2A-Insulin-pA- ITR P5×UAS,5×UAS-PTATA)，pNX177(ITR-PhCMV-Gal4-FnBphp-pA-ITR)，由公司完成AAV病毒的包装；
第三步，工程AAV的肌肉注射。上述两种AAV加入的病毒量均为每只分别2 ×1011vg，以1:1的比例混合，三点法注射在小鼠的小腿肌肉中；
第四步，光照。AAV肌肉注射两周后进行光照，光照组每周天光照1h(同一天早上30min,晚上30min，第二天进行检测)，黑暗组一直处于正常饲养环境中；
第五步，检测报告基因。使用便携式血糖检测仪检测小鼠的血糖水平，眼眶取血后获得的血清用Elisa试剂盒检测血清中Insulin的含量；
结果显示，由REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒实现对Ⅰ型糖尿病有效的基因治疗，小鼠血糖可长期维持在正常稳定值，胰岛素的表达也达到接近正常水平。实验数据详见附图30-31，所有的数据都以n＝6独立复制实验的方式呈现。
实施例24为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV (两病毒)对肥胖疾病基因治疗的探究
本实施例以减肥细胞因子mTSLP作为治疗蛋白，验证REDMAP 2.2装置/系统由两病毒AAV递送对肥胖疾病基因治疗的效果，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，包装成含REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒。AAV载体质粒包含pNX166(ITR-PhCMV-3NLS-LDB3-p65-HSF1-pA P5×UAS-mTSLP-pA-ITR P5×UAS,5×UAS-PTATA)和pNX177(ITR-PhCMV-Gal4-FnBphp-pA-ITR)，由公司完成 AAV病毒的包装；
第三步，工程AAV的肌肉注射。上述两种AAV加入的病毒量均为每只分别2 ×1011vg，以1:1的比例混合，三点法注射在小鼠的小腿肌肉中，其中还包含肌肉注射无意义AAV病毒组和肥胖HFD组和野生型WT组；
第四步，光照。AAV肌肉注射两周后进行光照，光照组每周天光照30min，黑暗组一直处于正常饲养环境中；
第五步，检测报告基因。监测小鼠体重变化；
结果显示，由REDMAP 2.2装置/系统工程化的AAV病毒对肥胖疾病的基因治疗时，体重显著下降。实验数据详见附图33，所有的数据都以n＝6独立复制实验的方式呈现。
实施例25为哺乳动物红光调控转录激活REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV (两病毒)对肥胖疾病基因治疗的机制探究
本实施例以通过检测经过REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV基因治疗后同实施案例25，称取小鼠体内白色脂肪、米色脂肪和棕色脂肪的重量，以及测量血清和肝脏组织中甘油三脂的含量，验证REDMAP 2.2装置/系统工程化AAV基因治疗肥胖疾病的机制，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，获取小鼠的血清。治疗6周后，各组小鼠通过眼眶取血获得血清；
第二步，检测血清和肝脏组织中甘油三酯的含量；
第三步，分离小鼠的米色脂肪、白色脂肪、棕色脂肪，分别进行称重；
结果显示，由REDMAP 2.2装置/系统对肥胖疾病进行基因治疗后，小鼠体内的各脂肪组织均减少，血清和肝脏中的甘油三酯含量明显降低。实验数据详见附图34-36，所有的数据都以n＝8独立复制实验的方式呈现。
表1相关质粒信息
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表2qPCR相关引物信息
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SEQ ID NO.1：红光光敏蛋白DrBphp的氨基酸序列
MSRDPLPFFPPLYLGGPEITTENCEREPIHIPGSIQPHGALLTADGHSGEVLQMS LNAATFLGQEPTVLRGQTLAALLPEQWPALQAALPPGCPDALQYRATLDWPA AGHLSLTVHRVGELLILEFEPTEAWDSTGPHALRNAMFALESAPNLRALAEVA TQTVRELTGFDRVMLYKFAPDATGEVIAEARREGLHAFLGHRFPASDIPAQAR ALYTRHLLRLTADTRAAAVPLDPVLNPQTNAPTPLGGAVLRATSPMHMQYLR NMGVGSSLSVSVVVGGQLWGLIACHHQTPYVLPPDLRTTLEYLGRLLSLQVQ VKEAADVAAFRQSLREHHARVALAAAHSLSPHDTLSDPALDLLGLMRAGGLI LRFEGRWQTLGEVPPAPAVDALLAWLETQPGALVQTDALGQLWPAGADLAPS AAGLLAISVGEGWSECLVWLRPELRLEVAWGGATPDQAKDDLGPRHSFDTYL EEKRGYAEPWHPGEIEEAQDLRDTLTGAL
SEQ ID NO.2：红光光敏蛋白PnBphp的氨基酸序列
MEKKMSGSRPTQSSEGSRRSRHSARIIAQTTVDAKLHADFEESGSSFDYSTSVRVTGPVVENQPPRSD KVTTTYLHHIQKGKLIQPFGCLLALDEKTFKVMSRDPL PFFPPLYLGGPEITTENCEREPIHIPGSIQPHGALLTADGHSGEVLQMSLNAATF LGQEPTVLRGQTLAALLPEQWPALQAALPPGCPDALQYRATLDWPAAGHLSL TVHRVGELLILEFEPTEAWDSTGPHALRNAMFALESAPNLRALAEVATQTVRE LTGFDRVMLYKFAPDATGEVIAEARREGLHAFLGHRFPASDIPAQARALYTRH LLRLTADTRAAAVPLDPVLNPQTNAPTPLGGAVLRATSPMHMQYLRNMGVGS SLSVSVVVGGQLWGLIACHHQTPYVLPPDLRTTLEYLGRLLSLQVQVKEAAD VAAFRQSLREHHARVALAAAHSLSPHDTLSDPALDLLGLMRAGGLILRFEGR WQTLGEVPPAPAVDALLAWLETQPGALVQTDALGQLWPAGADLAPSAAGLL AISVGEGWSECLVWLRPELRLEVAWGGATPDQAKDDLGPRHSFDTYLEEKRGYAEPWHPGEIEEAQDLRDTLTGAL
SEQ ID NO.3：红光光敏蛋白FnBphp的氨基酸序列
MSELPSRSISPRDPSPGETPGRDPSTPSTDAGVGYSASQDAPSFGAYDRVYPIRSLVSLEPPATSEPS SNKSKSPLSPTSGARQFSIIDGHTWTRLRSDSRANSTDYSGGTGLSPESSEAPSSQRMSDSSSARPPSNTTGLRRG DDHTTFTPSSEDSHPQVQEPYELMTTRFRHVVTDDGHAVITGRTVDSFKAMSRDPLPFFPPLYLGGPEITTENC EREPIHIPGSIQPHGALLTADGHSGEVLQMSLNAATFLGQEPTVLRGQTLAALL PEQWPALQAALPPGCPDALQYRATLDWPAAGHLSLTVHRVGELLILEFEPTEA WDSTGPHALRNAMFALESAPNLRALAEVATQTVRELTGFDRVMLYKFAPDAT GEVIAEARREGLHAFLGHRFPASDIPAQARALYTRHLLRLTADTRAAAVPLDP VLNPQTNAPTPLGGAVLRATSPMHMQYLRNMGVGSSLSVSVVVGGQLWGLI ACHHQTPYVLPPDLRTTLEYLGRLLSLQVQVKEAADVAAFRQSLREHHARVA LAAAHSLSPHDTLSDPALDLLGLMRAGGLILRFEGRWQTLGEVPPAPAVDALL AWLETQPGALVQTDALGQLWPAGADLAPSAAGLLAISVGEGWSECLVWLRP ELRLEVAWGGATPDQAKDDLGPRHSFDTYLEEKRGYAEPWHPGEIEEAQDLR DTLTGAL
SEQ ID NO.4：Gal4的氨基酸序列
MCGRKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLT RAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVN KDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVS SEQ ID NO.5：红光光敏蛋白与Gal4之间连接肽的氨基酸序列 ASGSGGGGDV
SEQ ID NO.6：纳米伴侣蛋白LDB3的氨基酸序列
MEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTWDHYIMGWFRQAPGKEREFVSA ISENGDAWNYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAIGFD VPSGRSWQGSHFWMYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO.7：纳米伴侣蛋白LDB14的氨基酸序列
MEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGTTSRWESMGWFRQAPGKEREFVSA ISWQNNSVPYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAAQHN FLGHRYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO.8：转录激活子VP64的氨基酸序列
GRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDL
DMLYID
SEQ ID NO.9：转录激活子VP16的氨基酸序列
SAYSRARTKNNYGSTIEGLLDLPDDDAPEEAGLAAPRLSFLPAGHTRRLSTAPP TDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYG ALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGG
SEQ ID NO.10：转录激活子p65的氨基酸序列
PSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLS
SEQ ID NO 11：转录激活子VPR的氨基酸序列
RADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLD MLINSRSSGSPKKKRKVGSQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGP TDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQAS ALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQA GEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPV APHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIA DMDFSALLGSGSGSRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPP GSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPD EETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTE DLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF
SEQ ID NO.12：转录激活子p65-HSF1的氨基酸序列
PSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAP VPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQ QLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLS GDEDFSSIADMDFSALLSQISSSGQGGGGSGFSVDTSALLDLFSPSVTVPDMSL PDLDSSLASIQELLSPQEPPRPPEAENSSPDSGKQLVHYTAQPLFLLDPGSVDTG SNDLPVLFELGEGSYFSEGDGFAEDPTISLLTGSEPPKAKDPTVS
SEQ ID NO.13：LDB3纳米伴侣蛋白N端入核信号NLS的氨基酸序列
PKKKSKV
SEQ ID NO.14：LDB3和转录激活子之间连接肽的氨基酸序列SDSAGSAGSAGSGS
SEQ ID NO.15：诱导型启动子P 5×UAS (hCMVmin)的核苷酸序列
CGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGT CCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGTCGAGCT CGGTACCCGGGTCGAGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAG CTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTG ACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCG
SEQ ID NO.16：诱导型启动子P 5×UAS (TATA)的核苷酸序列
CGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGT CCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGAGAGGG TATATAATGGAAGCTCGAATTCCAGAAGCTTATACTCAGTGCCCTGACTATAT ACTCAGTGCCCTGACTAT
SEQ ID NO.17：碱性磷酸酶SEAP的氨基酸序列
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITY AEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPA NDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQ GFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHR TACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYR FEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKE VGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDL DTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWD EDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELP AAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDA RKIREILIKAKKGGKIAV
SEQ ID NO.18：绿色荧光蛋白EGFP的氨基酸序列
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGK LPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDG NYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADK QKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
SEQ ID NO.19：报告基因荧光素酶Luciferase的氨基酸序列
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITY AEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPA NDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQ GFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHR TACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYR FEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKE VGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDL DTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWD EDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELP AAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDA RKIREILIKAKKGGKIAV
SEQ ID NO.20：治疗蛋白Insulin的氨基酸序列
PMALWMRFLPLLALLVLWEPKPAQAFVKQHLCGPHLVEALYLVCGERGFFYT PKSRRKREDPQVPQLELGGGPEAGDLQTLALEVARQKRGIVDQCCTSICSLYQ LENYCN
SEQ ID NO.21：治疗蛋白mTSLP的氨基酸序列
MVLLRSLFILQVLVRMGLTYNFSNCNFTSITKIYCNIIFHDLTGDLKGAKFEQIE DCESKPACLLKIEYYTLNPIPGCPSLPDKTFARRTREALNDHCPGYPETERNDG TQEMAQEVQNICLNQTSQILRLWYSFMQSPE
SEQ ID NO.22-23：RHOXF2的gRNA的核苷酸序列
sgRNA1RHOXF2ACGCGTGCTCTCCCTCATC
sgRNA2RHOXF2CTGTGGGTTGGGCCTGCTG
SEQ ID NO.24-25：ASCL1的gRNA的核苷酸序列
sgRNA1ASCL1GGCTGGGTGTCCCATTGAAA
sgRNA2ASCL1ATGGAGAGTTTGCAAGGAGC
SEQ ID NO.26-27：IL1RN的gRNA的核苷酸序列
sgRNA1IL1RNTGTACTCTCTGAGGTGCTC
sgRNA2IL1RNGAGTCACCCTCCTGGAAAC
SEQ ID NO.28-29：TTN的gRNA的核苷酸序列
sgRNA1TTNCCTTGGTGAAGTCTCCTTTG
sgRNA2TTNATGTTAAAATCCGAAAATGC
SEQ ID NO.30-31：MIAT的gRNA的核苷酸序列
sgRNA1MIATGCGCCCATGAAATTTTAATG
sgRNA2MIATGCTTCTGCGCCCCTGGTCCG
SEQ ID NO.32-33：Ascl1的gRNA的核苷酸序列
sgRNA1ASCL1GCAGCCGCTCGCTGCAGCAG
sgRNA2ASCL1AGCTGAGGAGGTGGGGGAAG
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种哺乳动物红光控制转录激活装置/系统及其构建方法和在基因治疗中的应用
<160> 45
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 502
<212> PRT
<213> 红光光敏蛋白DrBphp
<400> 1
Met Ser Arg Asp Pro Leu Pro Phe Phe Pro Pro Leu Tyr Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Glu Ile Thr Thr Glu Asn Cys Glu Arg Glu Pro Ile His Ile Pro
20 25 30
Gly Ser Ile Gln Pro His Gly Ala Leu Leu Thr Ala Asp Gly His Ser
35 40 45
Gly Glu Val Leu Gln Met Ser Leu Asn Ala Ala Thr Phe Leu Gly Gln
50 55 60
Glu Pro Thr Val Leu Arg Gly Gln Thr Leu Ala Ala Leu Leu Pro Glu
65 70 75 80
Gln Trp Pro Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro Pro Gly Cys Pro Asp Ala
85 90 95
Leu Gln Tyr Arg Ala Thr Leu Asp Trp Pro Ala Ala Gly His Leu Ser
100 105 110
Leu Thr Val His Arg Val Gly Glu Leu Leu Ile Leu Glu Phe Glu Pro
115 120 125
Thr Glu Ala Trp Asp Ser Thr Gly Pro His Ala Leu Arg Asn Ala Met
130 135 140
Phe Ala Leu Glu Ser Ala Pro Asn Leu Arg Ala Leu Ala Glu Val Ala
145 150 155 160
Thr Gln Thr Val Arg Glu Leu Thr Gly Phe Asp Arg Val Met Leu Tyr
165 170 175
Lys Phe Ala Pro Asp Ala Thr Gly Glu Val Ile Ala Glu Ala Arg Arg
180 185 190
Glu Gly Leu His Ala Phe Leu Gly His Arg Phe Pro Ala Ser Asp Ile
195 200 205
Pro Ala Gln Ala Arg Ala Leu Tyr Thr Arg His Leu Leu Arg Leu Thr
210 215 220
Ala Asp Thr Arg Ala Ala Ala Val Pro Leu Asp Pro Val Leu Asn Pro
225 230 235 240
Gln Thr Asn Ala Pro Thr Pro Leu Gly Gly Ala Val Leu Arg Ala Thr
245 250 255
Ser Pro Met His Met Gln Tyr Leu Arg Asn Met Gly Val Gly Ser Ser
260 265 270
Leu Ser Val Ser Val Val Val Gly Gly Gln Leu Trp Gly Leu Ile Ala
275 280 285
Cys His His Gln Thr Pro Tyr Val Leu Pro Pro Asp Leu Arg Thr Thr
290 295 300
Leu Glu Tyr Leu Gly Arg Leu Leu Ser Leu Gln Val Gln Val Lys Glu
305 310 315 320
Ala Ala Asp Val Ala Ala Phe Arg Gln Ser Leu Arg Glu His His Ala
325 330 335
Arg Val Ala Leu Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Pro His Asp Thr Leu
340 345 350
Ser Asp Pro Ala Leu Asp Leu Leu Gly Leu Met Arg Ala Gly Gly Leu
355 360 365
Ile Leu Arg Phe Glu Gly Arg Trp Gln Thr Leu Gly Glu Val Pro Pro
370 375 380
Ala Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu Ala Trp Leu Glu Thr Gln Pro Gly
385 390 395 400
Ala Leu Val Gln Thr Asp Ala Leu Gly Gln Leu Trp Pro Ala Gly Ala
405 410 415
Asp Leu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ile Ser Val Gly Glu
420 425 430
Gly Trp Ser Glu Cys Leu Val Trp Leu Arg Pro Glu Leu Arg Leu Glu
435 440 445
Val Ala Trp Gly Gly Ala Thr Pro Asp Gln Ala Lys Asp Asp Leu Gly
450 455 460
Pro Arg His Ser Phe Asp Thr Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Gly Tyr Ala
465 470 475 480
Glu Pro Trp His Pro Gly Glu Ile Glu Glu Ala Gln Asp Leu Arg Asp
485 490 495
Thr Leu Thr Gly Ala Leu
500
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<211> 602
<212> PRT
<213> 红光光敏蛋白PnBphp
<400> 2
Met Glu Lys Lys Met Ser Gly Ser Arg Pro Thr Gln Ser Ser Glu Gly
1 5 10 15
Ser Arg Arg Ser Arg His Ser Ala Arg Ile Ile Ala Gln Thr Thr Val
20 25 30
Asp Ala Lys Leu His Ala Asp Phe Glu Glu Ser Gly Ser Ser Phe Asp
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Val Arg Val Thr Gly Pro Val Val Glu Asn Gln Pro
50 55 60
Pro Arg Ser Asp Lys Val Thr Thr Thr Tyr Leu His His Ile Gln Lys
65 70 75 80
Gly Lys Leu Ile Gln Pro Phe Gly Cys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Lys
85 90 95
Thr Phe Lys Val Met Ser Arg Asp Pro Leu Pro Phe Phe Pro Pro Leu
100 105 110
Tyr Leu Gly Gly Pro Glu Ile Thr Thr Glu Asn Cys Glu Arg Glu Pro
115 120 125
Ile His Ile Pro Gly Ser Ile Gln Pro His Gly Ala Leu Leu Thr Ala
130 135 140
Asp Gly His Ser Gly Glu Val Leu Gln Met Ser Leu Asn Ala Ala Thr
145 150 155 160
Phe Leu Gly Gln Glu Pro Thr Val Leu Arg Gly Gln Thr Leu Ala Ala
165 170 175
Leu Leu Pro Glu Gln Trp Pro Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro Pro Gly
180 185 190
Cys Pro Asp Ala Leu Gln Tyr Arg Ala Thr Leu Asp Trp Pro Ala Ala
195 200 205
Gly His Leu Ser Leu Thr Val His Arg Val Gly Glu Leu Leu Ile Leu
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Glu Phe Glu Pro Thr Glu Ala Trp Asp Ser Thr Gly Pro His Ala Leu
225 230 235 240
Arg Asn Ala Met Phe Ala Leu Glu Ser Ala Pro Asn Leu Arg Ala Leu
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Ala Glu Val Ala Thr Gln Thr Val Arg Glu Leu Thr Gly Phe Asp Arg
260 265 270
Val Met Leu Tyr Lys Phe Ala Pro Asp Ala Thr Gly Glu Val Ile Ala
275 280 285
Glu Ala Arg Arg Glu Gly Leu His Ala Phe Leu Gly His Arg Phe Pro
290 295 300
Ala Ser Asp Ile Pro Ala Gln Ala Arg Ala Leu Tyr Thr Arg His Leu
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Leu Arg Leu Thr Ala Asp Thr Arg Ala Ala Ala Val Pro Leu Asp Pro
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Val Leu Asn Pro Gln Thr Asn Ala Pro Thr Pro Leu Gly Gly Ala Val
340 345 350
Leu Arg Ala Thr Ser Pro Met His Met Gln Tyr Leu Arg Asn Met Gly
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Val Gly Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Val Val Gly Gly Gln Leu Trp
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Gly Leu Ile Ala Cys His His Gln Thr Pro Tyr Val Leu Pro Pro Asp
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Leu Arg Thr Thr Leu Glu Tyr Leu Gly Arg Leu Leu Ser Leu Gln Val
405 410 415
Gln Val Lys Glu Ala Ala Asp Val Ala Ala Phe Arg Gln Ser Leu Arg
420 425 430
Glu His His Ala Arg Val Ala Leu Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Pro
435 440 445
His Asp Thr Leu Ser Asp Pro Ala Leu Asp Leu Leu Gly Leu Met Arg
450 455 460
Ala Gly Gly Leu Ile Leu Arg Phe Glu Gly Arg Trp Gln Thr Leu Gly
465 470 475 480
Glu Val Pro Pro Ala Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu Ala Trp Leu Glu
485 490 495
Thr Gln Pro Gly Ala Leu Val Gln Thr Asp Ala Leu Gly Gln Leu Trp
500 505 510
Pro Ala Gly Ala Asp Leu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ile
515 520 525
Ser Val Gly Glu Gly Trp Ser Glu Cys Leu Val Trp Leu Arg Pro Glu
530 535 540
Leu Arg Leu Glu Val Ala Trp Gly Gly Ala Thr Pro Asp Gln Ala Lys
545 550 555 560
Asp Asp Leu Gly Pro Arg His Ser Phe Asp Thr Tyr Leu Glu Glu Lys
565 570 575
Arg Gly Tyr Ala Glu Pro Trp His Pro Gly Glu Ile Glu Glu Ala Gln
580 585 590
Asp Leu Arg Asp Thr Leu Thr Gly Ala Leu
595 600
<210> 3
<211> 696
<212> PRT
<213> 红光光敏蛋白FnBphp
<400> 3
Met Ser Glu Leu Pro Ser Arg Ser Ile Ser Pro Arg Asp Pro Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Thr Pro Gly Arg Asp Pro Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Gly
20 25 30
Val Gly Tyr Ser Ala Ser Gln Asp Ala Pro Ser Phe Gly Ala Tyr Asp
35 40 45
Arg Val Tyr Pro Ile Arg Ser Leu Val Ser Leu Glu Pro Pro Ala Thr
50 55 60
Ser Glu Pro Ser Ser Asn Lys Ser Lys Ser Pro Leu Ser Pro Thr Ser
65 70 75 80
Gly Ala Arg Gln Phe Ser Ile Ile Asp Gly His Thr Trp Thr Arg Leu
85 90 95
Arg Ser Asp Ser Arg Ala Asn Ser Thr Asp Tyr Ser Gly Gly Thr Gly
100 105 110
Leu Ser Pro Glu Ser Ser Glu Ala Pro Ser Ser Gln Arg Met Ser Asp
115 120 125
Ser Ser Ser Ala Arg Pro Pro Ser Asn Thr Thr Gly Leu Arg Arg Gly
130 135 140
Asp Asp His Thr Thr Phe Thr Pro Ser Ser Glu Asp Ser His Pro Gln
145 150 155 160
Val Gln Glu Pro Tyr Glu Leu Met Thr Thr Arg Phe Arg His Val Val
165 170 175
Thr Asp Asp Gly His Ala Val Ile Thr Gly Arg Thr Val Asp Ser Phe
180 185 190
Lys Ala Met Ser Arg Asp Pro Leu Pro Phe Phe Pro Pro Leu Tyr Leu
195 200 205
Gly Gly Pro Glu Ile Thr Thr Glu Asn Cys Glu Arg Glu Pro Ile His
210 215 220
Ile Pro Gly Ser Ile Gln Pro His Gly Ala Leu Leu Thr Ala Asp Gly
225 230 235 240
His Ser Gly Glu Val Leu Gln Met Ser Leu Asn Ala Ala Thr Phe Leu
245 250 255
Gly Gln Glu Pro Thr Val Leu Arg Gly Gln Thr Leu Ala Ala Leu Leu
260 265 270
Pro Glu Gln Trp Pro Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro Pro Gly Cys Pro
275 280 285
Asp Ala Leu Gln Tyr Arg Ala Thr Leu Asp Trp Pro Ala Ala Gly His
290 295 300
Leu Ser Leu Thr Val His Arg Val Gly Glu Leu Leu Ile Leu Glu Phe
305 310 315 320
Glu Pro Thr Glu Ala Trp Asp Ser Thr Gly Pro His Ala Leu Arg Asn
325 330 335
Ala Met Phe Ala Leu Glu Ser Ala Pro Asn Leu Arg Ala Leu Ala Glu
340 345 350
Val Ala Thr Gln Thr Val Arg Glu Leu Thr Gly Phe Asp Arg Val Met
355 360 365
Leu Tyr Lys Phe Ala Pro Asp Ala Thr Gly Glu Val Ile Ala Glu Ala
370 375 380
Arg Arg Glu Gly Leu His Ala Phe Leu Gly His Arg Phe Pro Ala Ser
385 390 395 400
Asp Ile Pro Ala Gln Ala Arg Ala Leu Tyr Thr Arg His Leu Leu Arg
405 410 415
Leu Thr Ala Asp Thr Arg Ala Ala Ala Val Pro Leu Asp Pro Val Leu
420 425 430
Asn Pro Gln Thr Asn Ala Pro Thr Pro Leu Gly Gly Ala Val Leu Arg
435 440 445
Ala Thr Ser Pro Met His Met Gln Tyr Leu Arg Asn Met Gly Val Gly
450 455 460
Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Val Val Gly Gly Gln Leu Trp Gly Leu
465 470 475 480
Ile Ala Cys His His Gln Thr Pro Tyr Val Leu Pro Pro Asp Leu Arg
485 490 495
Thr Thr Leu Glu Tyr Leu Gly Arg Leu Leu Ser Leu Gln Val Gln Val
500 505 510
Lys Glu Ala Ala Asp Val Ala Ala Phe Arg Gln Ser Leu Arg Glu His
515 520 525
His Ala Arg Val Ala Leu Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Pro His Asp
530 535 540
Thr Leu Ser Asp Pro Ala Leu Asp Leu Leu Gly Leu Met Arg Ala Gly
545 550 555 560
Gly Leu Ile Leu Arg Phe Glu Gly Arg Trp Gln Thr Leu Gly Glu Val
565 570 575
Pro Pro Ala Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu Ala Trp Leu Glu Thr Gln
580 585 590
Pro Gly Ala Leu Val Gln Thr Asp Ala Leu Gly Gln Leu Trp Pro Ala
595 600 605
Gly Ala Asp Leu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ile Ser Val
610 615 620
Gly Glu Gly Trp Ser Glu Cys Leu Val Trp Leu Arg Pro Glu Leu Arg
625 630 635 640
Leu Glu Val Ala Trp Gly Gly Ala Thr Pro Asp Gln Ala Lys Asp Asp
645 650 655
Leu Gly Pro Arg His Ser Phe Asp Thr Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Gly
660 665 670
Tyr Ala Glu Pro Trp His Pro Gly Glu Ile Glu Glu Ala Gln Asp Leu
675 680 685
Arg Asp Thr Leu Thr Gly Ala Leu
690 695
<210> 4
<211> 150
<212> PRT
<213> Gal4
<400> 4
Met Cys Gly Arg Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile
1 5 10 15
Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala
20 25 30
Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys
35 40 45
Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu
50 55 60
Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu
65 70 75 80
Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu
85 90 95
Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp
100 105 110
Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His
115 120 125
Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln
130 135 140
Arg Gln Leu Thr Val Ser
145 150
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 红光光敏蛋白与Gal4之间连接肽
<400> 5
Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 129
<212> PRT
<213> 纳米伴侣蛋白LDB3
<400> 6
Met Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Trp Asp His
20 25 30
Tyr Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ser Ala Ile Ser Glu Asn Gly Asp Ala Trp Asn Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ile Gly Phe Asp Val Pro Ser Gly Arg Ser Trp Gln Gly
100 105 110
Ser His Phe Trp Met Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 纳米伴侣蛋白LDB14
<400> 7
Met Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Ser Arg Trp
20 25 30
Glu Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ser Ala Ile Ser Trp Gln Asn Asn Ser Val Pro Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Gln His Asn Phe Leu Gly His Arg Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 56
<212> PRT
<213> 转录激活子VP64
<400> 8
Gly Arg Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
1 5 10 15
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu
20 25 30
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe
35 40 45
Asp Leu Asp Met Leu Tyr Ile Asp
50 55
<210> 9
<211> 129
<212> PRT
<213> 转录激活子VP16
<400> 9
Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile
1 5 10 15
Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly
20 25 30
Leu Ala Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg
35 40 45
Leu Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His
50 55 60
Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp
65 70 75 80
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe
85 90 95
Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe
100 105 110
Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly
115 120 125
Gly
<210> 10
<211> 52
<212> PRT
<213> 转录激活子P65
<400> 10
Pro Ser Gly Gln Ile Ser Asn Gln Ala Leu Ala Leu Ala Pro Ser Ser
1 5 10 15
Ala Pro Val Leu Ala Gln Thr Met Val Pro Ser Ser Ala Met Val Pro
20 25 30
Leu Ala Gln Pro Pro Ala Pro Ala Pro Val Leu Thr Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gln Ser Leu Ser
50
<210> 11
<211> 525
<212> PRT
<213> 转录激活子VPR
<400> 11
Arg Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp
1 5 10 15
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp
20 25 30
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp
35 40 45
Leu Asp Met Leu Ile Asn Ser Arg Ser Ser Gly Ser Pro Lys Lys Lys
50 55 60
Arg Lys Val Gly Ser Gln Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg
65 70 75 80
Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met
85 90 95
Lys Lys Ser Pro Phe Ser Gly Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg
100 105 110
Arg Ile Ala Val Pro Ser Arg Ser Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala
115 120 125
Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr Ser Ser Leu Ser Thr Ile Asn Tyr Asp
130 135 140
Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser
145 150 155 160
Ala Leu Ala Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Pro Ala Pro Ala Met Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro
180 185 190
Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala
195 200 205
Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu
210 215 220
Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser
225 230 235 240
Thr Asp Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu
245 250 255
Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr
260 265 270
Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr
275 280 285
Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro
290 295 300
Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile
305 310 315 320
Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg
325 330 335
Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala
340 345 350
Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile
355 360 365
Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro
370 375 380
Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly
385 390 395 400
Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala
405 410 415
Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr
420 425 430
Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro
435 440 445
Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro
450 455 460
Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met
465 470 475 480
Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu
485 490 495
Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His
500 505 510
Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe
515 520 525
<210> 12
<211> 313
<212> PRT
<213> 转录激活子p65-HSF1
<400> 12
Pro Ser Gly Gln Ile Ser Asn Gln Ala Leu Ala Leu Ala Pro Ser Ser
1 5 10 15
Ala Pro Val Leu Ala Gln Thr Met Val Pro Ser Ser Ala Met Val Pro
20 25 30
Leu Ala Gln Pro Pro Ala Pro Ala Pro Val Leu Thr Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gln Ser Leu Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Thr Gln Ala Gly Glu Gly
50 55 60
Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Phe Asp Ala Asp Glu Asp
65 70 75 80
Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Gly Val Phe Thr Asp
85 90 95
Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly
100 105 110
Val Ser Met Ser His Ser Thr Ala Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro
115 120 125
Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ser Gln Arg Pro Pro Asp Pro
130 135 140
Ala Pro Thr Pro Leu Gly Thr Ser Gly Leu Pro Asn Gly Leu Ser Gly
145 150 155 160
Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu
165 170 175
Ser Gln Ile Ser Ser Ser Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Phe Ser
180 185 190
Val Asp Thr Ser Ala Leu Leu Asp Leu Phe Ser Pro Ser Val Thr Val
195 200 205
Pro Asp Met Ser Leu Pro Asp Leu Asp Ser Ser Leu Ala Ser Ile Gln
210 215 220
Glu Leu Leu Ser Pro Gln Glu Pro Pro Arg Pro Pro Glu Ala Glu Asn
225 230 235 240
Ser Ser Pro Asp Ser Gly Lys Gln Leu Val His Tyr Thr Ala Gln Pro
245 250 255
Leu Phe Leu Leu Asp Pro Gly Ser Val Asp Thr Gly Ser Asn Asp Leu
260 265 270
Pro Val Leu Phe Glu Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Phe Ser Glu Gly Asp
275 280 285
Gly Phe Ala Glu Asp Pro Thr Ile Ser Leu Leu Thr Gly Ser Glu Pro
290 295 300
Pro Lys Ala Lys Asp Pro Thr Val Ser
305 310
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> LDB3纳米伴侣蛋白N端入核信号NLS
<400> 13
Pro Lys Lys Lys Ser Lys Val
1 5
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> LDB3和转录激活子之间连接肽
<400> 14
Ser Asp Ser Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 243
<212> PRT
<213> 诱导型启动子P5*UAS(hCMVmin)
<400> 15
Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys
1 5 10 15
Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys
20 25 30
Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly
35 40 45
Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala
50 55 60
Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala
65 70 75 80
Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Cys Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Cys Gly Gly
100 105 110
Gly Thr Cys Gly Ala Gly Thr Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Ala
115 120 125
Cys Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala Thr Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly Thr Thr Thr
145 150 155 160
Ala Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys
165 170 175
Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys
180 185 190
Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Thr Gly Ala Cys Cys Thr
195 200 205
Cys Cys Ala Thr Ala Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Ala Cys Cys Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys
225 230 235 240
Gly Cys Gly
<210> 16
<211> 172
<212> PRT
<213> 诱导型启动子P5*UAS(TATA)
<400> 16
Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys
1 5 10 15
Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys
20 25 30
Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly
35 40 45
Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Ala
50 55 60
Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala
65 70 75 80
Gly Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Ala
85 90 95
Gly Ala Gly Gly Gly Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Cys Thr Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Gly Cys Thr Thr Ala Thr Ala Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys
130 135 140
Cys Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr Ala Thr Ala Cys Thr Cys Ala Gly
145 150 155 160
Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr
165 170
<210> 17
<211> 550
<212> PRT
<213> 碱性磷酸酶SEAP
<400> 17
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ile Ala Val
545 550
<210> 18
<211> 239
<212> PRT
<213> 绿色荧光蛋白EGFP
<400> 18
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 19
<211> 550
<212> PRT
<213> 报告基因荧光素酶Luciferase
<400> 19
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ile Ala Val
545 550
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> 治疗蛋白Insulin
<400> 20
Pro Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gln Ala Phe Val Lys Gln His Leu Cys
20 25 30
Gly Pro His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
35 40 45
Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Arg Arg Lys Arg Glu Asp Pro Gln Val
50 55 60
Pro Gln Leu Glu Leu Gly Gly Gly Pro Glu Ala Gly Asp Leu Gln Thr
65 70 75 80
Leu Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln Lys Arg Gly Ile Val Asp Gln Cys
85 90 95
Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
<210> 21
<211> 140
<212> PRT
<213> 治疗蛋白mTSLP
<400> 21
Met Val Leu Leu Arg Ser Leu Phe Ile Leu Gln Val Leu Val Arg Met
1 5 10 15
Gly Leu Thr Tyr Asn Phe Ser Asn Cys Asn Phe Thr Ser Ile Thr Lys
20 25 30
Ile Tyr Cys Asn Ile Ile Phe His Asp Leu Thr Gly Asp Leu Lys Gly
35 40 45
Ala Lys Phe Glu Gln Ile Glu Asp Cys Glu Ser Lys Pro Ala Cys Leu
50 55 60
Leu Lys Ile Glu Tyr Tyr Thr Leu Asn Pro Ile Pro Gly Cys Pro Ser
65 70 75 80
Leu Pro Asp Lys Thr Phe Ala Arg Arg Thr Arg Glu Ala Leu Asn Asp
85 90 95
His Cys Pro Gly Tyr Pro Glu Thr Glu Arg Asn Asp Gly Thr Gln Glu
100 105 110
Met Ala Gln Glu Val Gln Asn Ile Cys Leu Asn Gln Thr Ser Gln Ile
115 120 125
Leu Arg Leu Trp Tyr Ser Phe Met Gln Ser Pro Glu
130 135 140
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> RHOXF2的gRNA
<400> 22
acgcgtgctc tccctcatc 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> RHOXF2的gRNA
<400> 23
ctgtgggttg ggcctgctg 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> ASCL1的gRNA
<400> 24
ggctgggtgt cccattgaaa 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> ASCL1的gRNA
<400> 25
atggagagtt tgcaaggagc 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> IL1RN的gRNA
<400> 26
tgtactctct gaggtgctc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> IL1RN的gRNA
<400> 27
gagtcaccct cctggaaac 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> TTN的gRNA
<400> 28
ccttggtgaa gtctcctttg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> TTN的gRNA
<400> 29
atgttaaaat ccgaaaatgc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> MIAT的gRNA
<400> 30
gcgcccatga aattttaatg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> MIAT的gRNA
<400> 31
gcttctgcgc ccctggtccg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Ascl1的gRNA
<400> 32
gcagccgctc gctgcagcag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Ascl1的gRNA
<400> 33
agctgaggag gtgggggaag 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cgagatccct ccaaaatcaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
atccacagtc ttctgggtgg 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
agtgtagcca gtatatgacc agc 23
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tgacctcttc agtaagcgac ag 22
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cgcggccaac aagaagatg 19
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
cgacgagtag gatgagaccg 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cattgagcct catgctctgt t 21
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cgctgtctga gcggatgaa 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ccccatcgcc cataagacac 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ccacgtagcc ctcttgcttc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tggctggggt ttgaaccttt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aggaagctgt tccagactgc 20

Claims (22)

1.一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，包含红光感受元件、转录激活元件和效应元件。
2.如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述红光感受元件包括：细菌来源的红光光敏蛋白DrBphp、PnBphp、FnBphp、含有DNA结合结构域的Gal4蛋白以及两个蛋白之间的融合肽。
3.如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述转录激活元件包括：与红光光敏蛋白相互作用的纳米伴侣蛋白LDB3、LDB14、转录激活因子以及LDB3/LDB14与转录激活因子之间的连接肽。
4.如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述效应元件包括：诱导型启动子及目的基因。
5.如权利要求4所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述诱导型启动子包括：操纵子和诱导型弱启动子；所述目的基因可为任何有意义蛋白的基因序列。
6.如权利要求2所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述细菌来源的红光光敏蛋白DrBphp的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述细菌来源的红光光敏蛋白PnBphp为DrBphp蛋白N端融合拟南芥红光蛋白PhyA的NTE结构域，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述细菌来源的红光光敏蛋白FnBphp为DrBphp蛋白N端融合真菌红光蛋白FphA的NTE结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.如权利要求2所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述Gal4为可以与特定DNA序列结合的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，所述Gal4与细菌来源的红光光敏蛋白之间的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.如权利要求3所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述纳米伴侣蛋白LDB3和LDB14可以与所述细菌来源的红光光敏蛋白DrBphp、PnBphp、FnBphp相互作用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6-7所示。
9.如权利要求3所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述转录激活因子具有招募RNA聚合酶的功能，包括VP64、VP16、p65、VPR、p65-HSF1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8-12所示。
10.如权利要求3所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述LDB3纳米伴侣蛋白N端融合表达了不同拷贝数的入核信号NLS，所述NLS的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示；其中，所述纳米伴侣蛋白和转录激活因子之间的连接肽，其氨基酸序列如SEQID NO.14所示。
11.如权利要求5所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述的诱导型启动子为P5×UAS-(hCMVmin)和P5×UAS-(TATA)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；其中，所述诱导型启动子在没有转录激活子招募RNA聚合酶的情况下不能启动下游基因的转录表达。
12.如权利要求4所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述效应元件可为任何有意义蛋白的基因序列，包括SEAP、EGFP和Luciferase报告基因，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.17-19所示；基因治疗的药物蛋白Insulin和mTSLP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.20-21所示。
13.如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述装置/系统可由波长为660±10nm的红光诱导激活目的基因的表达，在780nm远红光的照射下可关闭基因转录。
14.一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建红光感受元件：所述的红光感受元件包括含不同结构域的红光光敏蛋白DrBphp、PnBphp、FnBphp，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，以及含有DNA结合结构域的Gal4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4，两者之间通过连接肽形成融合蛋白，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)构建转录激活元件：所述转录激活元件包括与红光光敏蛋白相互作用的纳米伴侣蛋白LDB3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中LDB3的N端融合表达了两拷贝数入核信号2×NLS，NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。以及具有招募RNA聚合酶的转录激活因子p65-HSF1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，两者之间通过连接肽形成融合蛋白，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；
(3)构建效应元件：所述效应元件为诱导型启动子P5×UAS-(TATA)，其核苷酸序列如SEQID NO.16所示，以及目的基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17-21所示。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述红光光敏蛋白DrBphp、PnBphp、FnBphp可以响应660nm的红光发生构象的变化；步骤(2)中，所述纳米伴侣蛋白LDB3和转录激活子p65-HSF1融合蛋白可以与660nm红光照射后发生构象变化的红光光敏蛋白相互结合步骤(3)中所述诱导型启动子在p65-HSF1招募RNA聚合酶后激活下游目的基因的表达。
16.如权利要求14或15所述方法构建得到的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统，其特征在于，所述红光光敏蛋白DrBphp称为REDMAP 2.0装置/系统、PnBphp称为REDMAP 2.1装置/系统、FnBphp称为REDMAP 2.2装置/系统。
17.一种真核表达载体和/或AAV表达载体和/或工程化哺乳动物细胞和/或工程化AAV病毒和/或系统，其特征在于，所述真核表达载体和/或AAV表达载体和/或工程化哺乳动物细胞和/或工程化AAV病毒和/或系统和/或试剂盒，包含如权利要求1～13之任一项所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统。
18.如权利要求1～13之任一项所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统或如权利要求17所述的表达真核表达载体和/或AAV表达载体和/或工程化哺乳动物细胞和/或工程化AAV病毒和/或系统在制备工程化哺乳动物细胞和/或利用CRISPR-dCas9激活内源基因表达、工程化AAV病毒和/或用于AAV递送的基因治疗试剂盒的应用。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述诱导表达的产物包括SEAP、EGFP、Luciferase、Insulin和mTSLP，所述表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.17-21所示。
20.利用如权利要求1～13之任一项所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统在宿主细胞中调控基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a)将如权利要求1～13之任一项所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统构建在宿主细胞真核质粒表达载体和/或AAV表达载体中；b)将表达载体导入哺乳动物细胞中；c)通过660nm红光诱导工程化的哺乳动物细胞中转录表达目的基因，实现所述哺乳动物红光调控转录激活装置/系统在哺乳动物细胞中诱导激活基因的转录表达。
21.一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统利用CRISPR-dCas9诱导哺乳动物内源基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：a)构建含有如权利要求1～13之任一项所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统诱导的CRISPR-dCas9相关效应元件MS2-p65-HSF1真核质粒表达载体和/或AAV表达载体；b)将如权利要求1～13之任一项所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统与CRISPR-dCas9蛋白元件的质粒表达载体导入所述哺乳动物细胞中；c)通过红光照射诱导激活哺乳动物表达效应元件MS2-p65-HSF1的表达，最终使内源基因的表达上调。
22.一种哺乳动物红光调控转录激活装置/系统用于基因治疗的方法，其特征在于，所述方法包括：a)构建含有如权利要求1～13之任一项所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的AAV表达质粒载体；b)制备包含如权利要求1～13之任一项所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的工程化AAV病毒，其中，所述工程化AAV病毒由上海泰尔图生物科技有限公司制备；c)通过肌肉注射的方式向生物体内递送所述的哺乳动物红光调控转录激活装置/系统的工程化AAV病毒；d)通过红光激活表达目的基因和/或治疗蛋白，从而实现对相应疾病进行基因治疗。
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