JP6140615B2 - 光制御可能な遺伝子発現システム - Google Patents

光制御可能な遺伝子発現システム Download PDF

Info

Publication number
JP6140615B2
JP6140615B2 JP2013555733A JP2013555733A JP6140615B2 JP 6140615 B2 JP6140615 B2 JP 6140615B2 JP 2013555733 A JP2013555733 A JP 2013555733A JP 2013555733 A JP2013555733 A JP 2013555733A JP 6140615 B2 JP6140615 B2 JP 6140615B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
light
polypeptide
gene
cells
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2013555733A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014509196A (ja
JP2014509196A5 (ja
Inventor
イ ヤン
イ ヤン
シュ ワン
シュ ワン
シャンジュン チェン
シャンジュン チェン
Original Assignee
華東理工大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 華東理工大学 filed Critical 華東理工大学
Publication of JP2014509196A publication Critical patent/JP2014509196A/ja
Publication of JP2014509196A5 publication Critical patent/JP2014509196A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6140615B2 publication Critical patent/JP6140615B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は遺伝工程及び合成生物学分野に関し、具体的には遺伝子発現に関し、より具体的には、光制御蛋白の誘起可能な遺伝子発現システム及び該発現システムを用いて宿主細胞における遺伝子発現を制御する方法に関する。
遺伝工程分野において、遺伝子の発現を正確に制御することは、発育及びその他の生理過程を研究、制御することに対して価値のあるツールを提供できる。遺伝子発現が複雑な生物学過程であり、複数の蛋白−蛋白間の特異的な相互作用を含む。第１ステップはＤＮＡをＲＮＡに転写することであり、転写因子を遺伝子転写を制御するプロモーターの付近に伝達しなければならない。転写因子は配列特異性ＤＮＡ結合蛋白とも呼ばれ、プロモーターＤＮＡ配列を特異的に結合して下流遺伝子ＤＮＡ配列をＲＮＡに転写可能な蛋白質または蛋白質複合体であり、プロモーターとの識別／結合はＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡをＲＮＡに転写することを開始または抑制でき、転写活性化因子または転写抑制因子に分けられる。通常、転写因子が少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含み、且つ共同因子（または補助活性化蛋白と呼ばれる）を動員して共同作用し、プロモーター領域の正確なサイトを結合することによって、遺伝子の転写を開始することができる。転写因子がＤＮＡ結合ドメインを含む以外に通常さらに転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインを含み、転写活性化ドメインはＤＮＡドメインと適当な距離から離れることができる。従来の遺伝子転移方法は汎用性または細胞類特異性プロモーターによって転移遺伝子の転写発現を開始する。標的遺伝子及び相応するプロモーターの含むＤＮＡ構築物（ターゲット転写要素とも呼ばれる）によって宿主細胞を形質転換して細胞質に進入または宿主細胞ゲノムに整合し、相応する転写因子及びプロモーターを加えて結合した後、標的遺伝子の指定される細胞類における転写を開始させその後相応する蛋白質に翻訳・発現されることができる。
外来遺伝子の細胞における転写発現を調節する他１つの方法は誘起可能型のプロモーターを使用することにある。前記誘起可能型プロモーターは具体的に、１）化学物質が誘起できるプロモーター及び遺伝子発現システム、及び２）物理方法が誘起できるプロモーター及び遺伝子発現システム、２種類を含む。化学誘起物質は小分子薬物を含み、その典型的な例としては抗生物質例えばテトラサイクリン［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．，Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９２．８９（１２）：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５．２６８（５２１８）：１７６６−１７６９］及びストレプトマイシン「Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．等，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００．１８（１１）：１２０３−１２０８．」、ホルモン「Ｗａｎｇ，Ｙ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９４．９１（１７）：８１８０−８１８４」及びその類似物及びその他の誘起物例えばアセト・アルデヒド「Ｗｅｂｅｒ，Ｗ．等．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４．２２（１１）：１４４０−１４４４」である。物理方法が誘起できるプロモーター及び遺伝子発現システムは主に紫外線（ＵＶ）により制御される「ケージ化（ｃａｇｅｄ）」技術［Ｋｅｙｅｓ，Ｗ．Ｍ．及びＡ．Ａ．Ｍｉｌｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３．２１（２）：５３−５５］及び遠赤外光がヒートショック効果により媒介される遺伝子発現システムを制御すること［Ｋａｍｅｉ，Ｙ．等，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９．６（１）：７９−８１］である。
以上方法における誘起可能なプロモーター及び遺伝子発現システムが比較的汎用されているが、欠陥が存在している。例えば、（１）一部の誘起物が多方面の効果を持っているため、その他の内因遺伝子の発現に影響を与えることによって、結果の分析が複雑になる。例えば重金属イオンにより誘起される遺伝子発現システムは、重金属が標的遺伝子の発現を誘起できるだけでなく、細胞内のその他の重金属イオンにより誘起される遺伝子の発現も発生される；（２）一部の誘起物が潜在的な毒性を有するためその他の遺伝子の機能に影響を与え、例えば重金属イオンが細胞に対して毒性を有するため、動物または人体に使用できない；（３）多くのプロモーター体系は非誘起状態において発現を開始する活性が非常に高く、調節される遺伝子を徹底に閉鎖できず、誘起剤添加の前後の遺伝子発現量比（本文書には誘起発現倍数とも呼ばれる）が比較的低く、例えばホルモン発現システム［Ｗａｎｇ，Ｙ．等．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９４．９１（１７）：８１８０−８１８４］、これらのプロモーターは毒性遺伝子及び発現量が低いうちに顕著な生物学効果に導くことができる遺伝子の発現に適しない；（４）一部の化学物質により誘起される遺伝子発現システムの転写因子が２種または２種以上の蛋白質によって共同に構成され、導入の効率が単独の転写因子より低く、例えばＦＫＢＰ−ＦＲＡＰに基づく遺伝子発現システム［Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．等．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９６．２（９）：１０２８−１０３２．］；（５）化学誘起物は時間上だけできるが空間において一部の細胞及び組織の遺伝子発現を特異性あるように制御できない；（６）多くの物理方法で誘起できる遺伝子発現システムは細胞に対する毒性が高く、例えばＵＶに誘起されるケージ化技術が細胞に対する不可逆的損傷に至る恐れがあり、遠赤外レーザよりヒートショック効果を制御する誘起発現システムがその他の内因遺伝子の発現を活性化する恐れがあり、その設備操作が複雑で且つ高価である［Ｋａｍｅｉ，Ｙ．等，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９．６（１）：７９−８１］。
然し、光が時間及び空間的に操作しやすい誘起物であり、一般的には細胞に対して前記毒性を有せず、使用できる方法は遠古からの進化物種の光調節可能な蛋白（光感受性蛋白とも呼ばれる）を真核細胞内に導入し、それらを光調節の転写因子に改造して、光照射制御標的遺伝子の発現に便利を図る。これらの蛋白質が真核細胞の生理過程を干渉しなく、真核細胞内に多重効果または非特異効果を導かないことが予期される。現在、この方面の報道が非常に少ない。Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｓａｔｏ等は酵母細胞に適用する光制御遺伝子発現システム「Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｓａｔｏ，Ｓ．等，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２．２０（１０）：１０４１−１０４４」を報道し、米国特許ＵＳ６８５８４２９には、遺伝子工程技術によって植物蛋白（植物色素ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ，Ｐｈｙと略する）と植物色素との相互作用因子（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＰＩＦ３と略する）をそれぞれツーハイブリッド系の酵母菌Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合ドメインまたはＧａｌ４の転写活性化ドメイン（ＧＡＤ）と連結し、Ｇａｌ４−Ｐｈｙ及びＰＩＦ３−ＧＡＤ、２種の融合蛋白を構成し、赤光によって照射する時にＧａｌ４−Ｐｈｙ及びＰＩＦ３−ＧＡＤ、２つの融合蛋白分子が相互作用することによって結合し、そのうち、Ｇａｌ４の転写活性化ドメイン（ＡＤ）がプロモーターのアタッチメントに連れられ、それによって下流遺伝子の転写を開始し、一方、遠赤外光の刺激を使用することによって相互作用する前記２種類の蛋白を解離させることができ、そのうち、Ｇａｌ４のＡＤがプロモーターに結合しなくなり、それによって、下流遺伝子の転写が終止される。この光誘起のプロモーターシステムは可逆性的で、誘起発現レベルが比較的高い等の利点を有するが、植物色素Ｐｈｙがその発色団フィコシアノビリン（Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｏｂｉｌｉｎ）の存在がなければＰＩＦ３と相互作用できず、一方、酵母細胞及び哺乳動物細胞には前記物質を含有せず、外来に宿主細胞に加えなければならなく、且つ前記システムはツーハイブリッドの原理に基づくものであり、転写因子が２つの種類完全に融合されている蛋白によって共同で構成され、且つその遺伝子構築物が比較的大きく、細胞の導入が比較的難しいなどの欠点を有するため、前記システムの汎用を制限した。
現在すでに知られたその他の光感受性蛋白はさらにフラビン物質を発色団とする光感受性蛋白（フラビン蛋白家族青光受容体とも呼ばれる）を有し、１、光−酸素−電圧（ｌｉｇｈｔ−ｏｘｙｇｅｎ−ｖｏｌｔａｇｅ，ＬＯＶ）ドメイン含有の光受容体蛋白例えば光感受性色素、２、フォトリアーゼに類似する隠れた色素（ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ−ｌｉｋｅ ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ）、３、近年において発見されたばかりのＦＡＤの利用する青光蛋白（ｂｌｕｅ ｌｉｇｈｔ ｕｓｉｎｇ ＦＡＤ，ＢＬＵＦ）、３つの種類に分けられている。光感受性色素はＬＯＶドメインを含有する光受容体蛋白質の最も多くの１種類であり、多く研究されていたのはフォトトロピン１（ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ １）、ホワイトカラー−１（ＷＣ−１）、ホワイトカラー−２（ＷＣ−２）、ＰＹＰ（光感受性黄色蛋白、ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ ｙｅｌｌｏｗ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｐｈｙ３、ＶＩＶＩＤ等が挙げられる。光感受性色素は通常膜結合キナーゼ蛋白が、青光の照射で自己リン酸化を発生し、キナーゼ活性を変更することによって相関する生理過程を制御する。光感受性色素の多くはＣ端がセリン／トレオニンキナーゼドメインで、Ｎ端がフラビン分子を結合する２つのＬＯＶドメインであり、青光が照射する時にＬＯＶドメインとフラビン分子とが共有結合してフラビン−システイン付加生成物を生成することによって、フラビン結合ポケット空間構造変化を引き起こし、Ｃ端ドメインがそのキナーゼ活性を変わることになるが、前記過程は完全に可逆である。それ以外に、２つのＬＯＶドメインにおいて、ＬＯＶ光感受性がＬＯＶ１より高い。Ｍａｓａｙｕｋｉ Ｙａｚａｗａ等はシロイスナズナのＦＫＦ１（ｆｌａｖｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ，ｋｅｌｃｈ ｒｅｐｅａｔ，ｆ ｂｏｘ １）とＧＩ（ＧＩＧＡＮＴＥＡ）蛋白との二者が青光により励起された後相互作用を発生できる原理を利用して、ＦＫＦ１とＧＩとをそれぞれツーハイブリッド系酵母菌Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメイン及び単純疱疹ウイルスグラニュリン１６（ＶＰ１６）の転写活性化ドメイン（ＡＤ）と連結し、Ｇａｌ４−ＦＫＦ１及びＶＰ１６−Ｇツー転写因子［Ｙａｚａｗａ，Ｍ．，等，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９．２７（１０）：９４１−９４５．］を構成する。青光刺激はＶＰ１６−ＧＩをプロモーター領域に結合されているＧａｌ４−ＦＫＦ１と相互作用させ（具体的にはＦＫＦ１とＧＩとが相互作用する）、下流遺伝子の転写を開始することできる。該システムの欠陥はＦＫＦ１とＧＩ蛋白遺伝子との構築物が比較的大きく、細胞に導入することが難しく、また、標的蛋白の発現を向上する倍数が比較的低くて、最高が約５倍のみである。シロイスナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの隠れた色素が一番目の分離され得た植物青光光感受性蛋白であり、多くに研究されるのは隠れた色素１（Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ １，ＣＲＹ１）、隠れた色素２（Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ ２，ＣＲＹ２）、光感受性色素Ａ（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ａ，ｐｈｙＡ）及び光感受性色素Ｂ（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂ，ｐｈｙＢ）等が挙げられる。シロイスナズナＣＲＹ２（隠れた色素２）とＣＩＢ１（隠れた色素２の相互作用する螺旋ループ螺旋１）蛋白と二者が青光により励起された後相互作用を発生できることを利用して、ＣＲＹ２とＣＩＢ１とをそれぞれツーハイブリッド系酵母菌Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメイン及びＧａ１４の転写活性化ドメイン（ＧＡＤ）と連結し、Ｇａｌ４−ＣＲＹ２とＣＩＢ１−ＧＡＤツー転写因子を構成し、青光で刺激する時に、ＣＩＢ１−ＧＡＤがすでにＧａｌ４応答要素と結合されるＧａｌ４−ＣＲＹ２と相互作用し、酵母細胞において下流遺伝子発現を開始できる［Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｊ．，等，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０．７（１２）：９７３−９７５］ことが研究された。該システムは外因発色団の添加する必要がないが、同じようにツーハイブリッド系原理に基づくものであるため、転写因子が２種の完全の融合蛋白によって共同で構成され、操作が複雑である。且つ非誘起状態下でも標的遺伝子がある程度に発現しているため、応用が限定される。ＢＬＵＦドメインを含む青光受容体蛋白及びＬＯＶドメインを含む光受容体蛋白と隠れた色素との異なるところは、前は光の照射後フラビン発色団と反応して共有結合生成物を生成することが発生しなく、その代わりに、発色団の構造変化を引き起こし黄色吸収光に１０ｎｍの赤方偏移を発生させる。ＢＬＵＦドメインを含む光受容体蛋白の最も研究されるのはＡｐｐＡであり、これは紅色非硫黄細菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）の転写抗抑制蛋白であり、暗中になった場合、ＡｐｐＡが細胞における１種のＰｐｓＲ転写因子と結合してＡｐｐＡ−ＰｐｓＲ２複合物を形成し、ＰｐｓＲをＤＮＡに結合されることのできなくなり、強青光の照射はＡｐｐＡを複合物から解離させてＰｐｓＲをリリースすることによって、四量体を形成して特定のＤＮＡ配列に結合し、それによって、相関する遺伝子の転写抑制が導かれる。
過去の研究において、一部のホルモン受容体または受容体の突然変異体が遺伝子及び機能または転写因子の活性の調節に用いられる。例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐシステムにおいて、Ｃｒｅ組換え酵素に対する改造によって、それをＥＲ、ＰＲまたはＧＲと連結し、それのコアに入る能力を変更し、それに、相応するホルモン配位子が存在する場合のみ、Ｃｒｅ組換え酵素が細胞核において機能を発揮させる。ホルモン受容体を転写因子と連結することは、転写因子をホルモンの調節下で機能させることができ、例えば、ホルモン−テトラサイクリン二重制御遺伝子発現システムであって、テトラサイクリンにより制御される転写因子にＥｃＲまたはＧＲを連結し、標的遺伝子の発現がテトラサイクリン及びホルモン配位子に二重制御される。
前記のように、現在汎用されている遺伝子発現システムの多くは化学誘起剤によって制御されており、その誘起効果が比較的よく、背景が低く、発現強度が高いが、多くのシステムは多面作用を持っているため副作用が多く、且つ潜在的な細胞毒性等を有し、また、化学誘起剤が空間において遺伝子の発現を正確に制御できず、物理方法により遺伝子発現が調節されるシステムは現在非常に少なく、空間においてある程度特定細胞または組織の遺伝子発現を制御するが、細胞毒性が強いため不可逆損傷または実際の操作困難に至り、また光感受性蛋白に基づく少数の種類の遺伝子発現システムは、標的蛋白発現の誘起レベルが低く、外因化学物質の添加が必要であり、転写因子が複数種の蛋白によって構成されており、構築物が比較的大きく、細胞を導入しにくい等の原因によって、その応用が制限される。本出願者は、新構想でより優れた新しい光制御転写発現システムを創造することによって、従来の研究の欠陥を解決し、且つ生物医薬科学及び技術研究に汎用されることができると思っている。深い研究によって、本出願者は新型の光制御可能な遺伝子発現システムを発明し、前記システムは組み換え光感受性転写因子とそれに対応するターゲット転写ユニットと２つの部分によって構成され、良好な遺伝子発現制御能力を持っており、時間及び空間において遺伝子の発現を共同に制御できる。同時に、合成生物学のより複雑な研究を満足するため、我々は組み換え光感受性転写因子に対して改良を行い、組み換え光−ホルモン二重制御転写因子を構成して、時間及び空間において光及びホルモンに共同に制御されることができる。
そのため、本発明の第１の目的は新型の光制御可能な遺伝子発現システムを提供することにある。
本発明の第２の目的は光及びホルモン類薬物の共同制御する遺伝子発現システムを提供することにある。
本発明の第３の目的は前記光制御可能な遺伝子発現システムを含有する真核発現ベクターを提供することにある。
本発明の第４の目的は前記光制御可能な遺伝子発現システムを用いて宿主細胞における遺伝子発現を調節する方法を提供することにある。
本発明の第５の目的は前記光制御可能な遺伝子発現システムが装入される試薬キットを提供することにある。
本発明の第６の目的は光制御可能な遺伝子発現システムを用いて遺伝治療を行う方法を提供することにある。
本発明は光制御可能な遺伝子発現システムに関し、ａ）ＤＮＡ結合ドメインとする第１ポリペプチド、光感受性ドメインとする第２ポリペプチド及び転写調節ドメインとする第３ポリペプチドを含む組み換え光感受性転写因子のコード遺伝子と、ｂ）前記第１ポリペプチドを識別／結合する少なくとも１つの応答要素、それと連結するプロモーター及び転写されるべき核酸配列を含むターゲット転写ユニットとの、２つの部分を含む。
本発明の光制御可能な遺伝子発現システムに基づき、第１部分において組み換え光感受性転写因子の第１ポリペプチドがＤＮＡ結合ドメインであり、応答要素を特異的に識別でき、単独では応答要素に結合できないまたは結合能力が非常に弱く、第２ポリペプチドの補助によって応答要素に結合できる。第１ポリペプチドがヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーモチーフまたは亜鉛クラスターＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、高速移動群ＤＮＡ結合ドメイン、Ｂ３ＤＮＡ結合ドメインから選ばれてもよい。第２ポリペプチドが光感受性ドメインであり、通常フラビン類を発色団とする光感受性蛋白から選ばれ、第３ポリペプチドが転写調節ドメインであり、転写活性化ドメイン及び転写抑制ドメインを含む。
第１ポリペプチド、第２ポリペプチド及び第３ポリペプチド間が直接連結されてもよく、操作性にリンカーペプチドによって連結されてもよい。リンカーペプチドのアミノ酸の個数が変更可能である（例えば０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０つ、またはより多い）。
第１ポリペプチド、第２ポリペプチドが１つの光制御可能なＤＮＡ結合蛋白融合蛋白（光制御可能なＤＮＡ結合蛋白と略称する）に構成されることができ、組み換え光感受性転写因子のＤＮＡ結合特徴の体外研究に用いられることができる。本発明の光制御可能な遺伝子発現システムにおいて、第２部分のターゲット転写ユニットにおける応答要素、プロモーター及び転写されるべき核酸配列間も直接連結、または操作性に連結されることができる。
本発明の光制御可能な遺伝子発現システムに基づいて、第１部分における組み換え光感受性転写因子はさらに付加のポリペプチドを含んでもよく、例えば、組み換え光感受性転写因子融合蛋白の細胞核へ輸送することを促進する第４ポリペプチド（即ち細胞核局在信号ペプチド、またはホルモンに制御される第５ポリペプチド。第４ポリペプチドまたは第５ポリペプチドは第１、第２、第３ポリペプチドと直接連結またはリンカーペプチドによって連結される。
本発明はさらに本発明の光制御可能な遺伝子発現システムを含有する真核発現ベクターに関する。前記発現ベクターは組み換え光感受性転写因子コード遺伝子を単独に含有するベクターであってもよく、ターゲット転写ユニットを単独に含有する真核発現ベクターであってもよく、前記ターゲット転写ユニットは応答要素−プロモーターを含有するが、転写されるべき核酸配列を欠く。または、組み換え光感受性転写因子コード遺伝子及びターゲット転写ユニットにおける応答要素−プロモーターを同時に含有する真核発現ベクターであってもよい。
本発明は本発明における光制御可能な遺伝子発現システムを用いて宿主細胞において遺伝子発現を制御する方法も関し、
前記光制御可能な遺伝子発現システムを真核プラスミド発現ベクターに構築するステップａ）と、
制御される遺伝子を含有する宿主細胞を導入するステップｂ）と、
光照射で前記宿主細胞を誘導して、前記宿主細胞における調製されるヌクレオチドを発現させるステップｃ）と、を含む。
本発明の宿主細胞において遺伝子発現を制御する方法に関する光照射方法は、光源の選択及び光源の制御を含む。光源としてはＬＥＤ灯、白熱灯、蛍光灯、レーザが例として挙げられるが、これに限定されず、照射方法は光照射量、光照射時間、光照射強度及び光照射の周波数の選定を含む。走査、投影、光金型などの方法によって空間において標的遺伝子の発現を制御することも本発明の範囲に含まれている。
本発明はさらに試薬キットに関し、該試薬キットは本発明の光制御可能な遺伝子発現システムを含有する真核発現ベクターまたは／及び前記転写因子の真核発現ベクターに形質転換された哺乳動物細胞、及び関係説明文書が装入されている。本発明の試薬キットはさらに応答要素−プロモーターを含有するが、転写されるべき核酸配列が欠如しているターゲット転写ユニットの真核発現ベクターが装入されてもよい。
本発明はさらに光制御可能な遺伝子発現システムを使用して遺伝子治療を行う方法に関する。
図１は６種の、光感受性蛋白の異なるＬＯＶドメインからの相同関係分析であり、黒色は１００％同様であるアミノ酸配列を表し、ダークグレーは類似性の比較高い配列を表し、ライトグレーは類似性の中等である配列を表す。 図２は相同的組換え連結の説明図である。 図３は逆方向ＰＣＲの原理である。 図４は光感受性転写因子を含有する哺乳動物細胞発現ベクターの構築説明図である。上方が各の光感受性転写因子融合蛋白の説明図で、下方がループ状発現ベクターの説明図で、発現ベクターの骨格がｐＥＧＦＰ−Ｎ１であり、元のＥＧＦＰ遺伝子が光感受性転写因子融合蛋白遺伝子によって置換された。＊は２つのポリペプチド処のリンカーペプチドが異なることを表す。 図５はターゲット転写ユニットを含有する哺乳動物発現ベクターの構造説明図である。上方が各のターゲット転写ユニットの説明図で、下方がループ状の発現ベクターの説明図で、発現ベクターの骨格がｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｙｇｒｏであり、元のＣＭＶプロモーター領域及びマルチクローニングサイトがターゲット転写ユニットによって置換された。 図６は光感受性転写因子を含有する出芽酵母細胞発現ベクターの構造説明図である。上方が各の光感受性転写因子融合蛋白の説明図で、下方がループ状の発現ベクターの説明図で、発現ベクターの骨格がｐＧＡポリペプチド７であり、元のＧａｌ４ＡＤ遺伝子及びマルチクローニングサイトが光感受性転写因子融合蛋白によって置換された。＊は２つのポリペプチド処のリンカーペプチドが異なることを表す。 図７はターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母細胞発現ベクターの構造説明図である。上方が各のターゲット転写ユニットの説明図で、下方がループ状の発現ベクターの説明図で、発現ベクターの骨格がｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯである。 図８はＧａｌ４、ＶＩＶＩＤ（ＷＴ）、ＶＰ１６をオーバーラップするＰＣＲ核酸電気泳動画像である。左側の矢印がオーバーラップＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、右側のレーンが分子量標準である。 図９はＰＣＲ増幅ｐ６５ＡＤの核酸電気泳動画像である。左側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、右側のレーンが分子量標準である。 図１０はＰＣＲ増幅ＡｓＬＯＶ２の核酸電気泳動画像である。右側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、左側のレーンが分子量標準である。 図１１はＰＣＲ増幅ＡｕＬＯＶの核酸電気泳動画像である。右側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、左側のレーンが分子量標準である。 図１２はＰＣＲ増幅ＬｅｘＡ（１−８７）の核酸電気泳動画像である。右側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、左側のレーンが分子量標準である。 図１３はＰＣＲ増幅ＬａｃＩ（１−６２）の核酸電気泳動画像である。右側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、左側のレーンが分子量標準である。 図１４はＰＣＲ増幅ｃＩ（１−１０２）の核酸電気泳動画像である。右側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、左側のレーンが分子量標準である。 図１５はＰＣＲ増幅ＴｅｔＲ（１−６３）の核酸電気泳動画像である。左側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、右側のレーンが分子量標準である。 図１６はＰＣＲ増幅Ｇｃｎ４（１−１４４）の核酸電気泳動画像である。右側の矢印がＰＣＲ生成物の標的バンドを指し、左側のレーンが分子量標準である。 図１７は複数種の異なる転写活性化ドメインが第３ポリペプチドである転写因子を発現する哺乳動物細胞において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図１８は複数種のＶＩＶＩＤ突然変異体の第２ポリペプチドの転写因子を発現する哺乳動物細胞において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図１９は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図２０は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現するＣＯＳ−７細胞において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図２１は第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが異なるリンカーペプチドによって連結される組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（ＷＴ）を発現する哺乳動物細胞において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図２２はＡｓＬＯＶ２を第２ポリペプチドとする転写因子を発現する哺乳動物細胞において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図２３はＡｕＬＯＶを第２ポリペプチドとする転写因子を発現する哺乳動物細胞において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図２４はＫＲＡＢを第３ポリペプチドとする転写因子を発現する哺乳動物細胞の発現において、光照射のＦｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図２５は組み換え光感受性誘起転写因子ＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）を発現するＨＥＫ２９３モノクローナル細胞のスクリーンである。 図２６は組み換え光感受性誘起転写因子ＧＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する出芽酵母ＡＨ１０９細胞において、光照射のＥＹＦＰの発現レベルに対する調節である。 図２７は組み換え光感受性誘起転写因子ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する出芽酵母ＡＨ１０９細胞において、光照射のＥＹＦＰの発現レベルに対する調節である。 図２８は組み換え光感受性誘起転写因子ＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する出芽酵母ＡＨ１０９細胞において、光照射のＬａｃＺの発現レベルに対する調節である。 図２９は第２ポリペプチドと第３ポリペプチドとが異なるリンカーペプチドによって連結される組み換え光感受性転写因子ＧＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する出芽酵母ＡＨ１０９細胞において、光照射のＬａｃＺ遺伝子の発現レベルに対する調節である。 図３０は組み換え光感受性誘起転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤを発現する出芽酵母細胞において、転写因子の発現レベルが異なる時に標的遺伝子発現に対する調節を検出する。 図３１は複数種のＶＩＶＩＤ突然変異体の第２ポリペプチドの転写因子を発現する出芽酵母ＡＨ１０９細胞において、光照射のＥＹＦＰ遺伝子の発現レベルに対する調節である。 図３２はＡｓＬＯＶ２を第２ポリペプチドの転写因子とする出芽酵母ＡＨ１０９細胞において、光照射のＥＹＦＰ遺伝子の発現レベルに対する調節である。 図３３は組み換え光感受性転写因子が異なるＧａ１４応答要素を含有するターゲット転写ユニットにおけるＥＹＦＰ遺伝子発現の差異を調節する。 図３４はＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ｃＩ及びＴｅｔＲがそれぞれ第１ポリペプチドである組み換え光感受性転写因子を発現する出芽酵母ＡＨ１０９細胞において、光照射のＥＹＦＰの発現レベルに対する調節である。 図３５は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞において、光照射により誘起される標的遺伝子発現の時間動態学過程及び可逆性過程である。 図３６は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞において、異なる光照射強度の標的遺伝子発現レベルに対する調節である。 図３７は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞において、異なる光照射総量（光照射周波数）の標的遺伝子発現レベルに対する調節である。 図３８は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞において、光照射によりｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光蛋白）遺伝子発現を調節する顕微画像である。上図が位相差の画像で、下図が蛍光画像である。 図３９は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞において、光照射によりｈｒＧＦＰ（緑色蛍光蛋白）遺伝子発現を調節する顕微画像である。上図が位相差の画像で、下図が蛍光画像である。 図４０は非還元ポリアクリルアミ電気泳動（１５％）により蛍光蛋白の発現を検出する。上図の標的バンドがｈｒＧＦＰ（緑色蛍光蛋白）で、下図の標的バンドがｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光蛋白）である。 図４１は光照射／暗中条件下の標的遺伝子Ｆｌｕｃの発現のＲＴ−ＰＣＲ確認である。 図４２は組み換え光−ホルモン二重制御光感受性転写因子を発現する哺乳動物細胞において、光照射のＧｌｕｃの発現レベルに対する調節である。 図４３は組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞において、中性灰色フィルターを用いて空間において９６ウェルプレート内に培養される細胞の蛍光蛋白の発現を制御する。 図４４は印刷図案投影シートを使用して組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の発現する細胞に対して撮影して得たＥＣＵＳＴ図案である。左図が投影シートが貼られているシャーレの写真で、右図が細胞の蛍光画像である。 図４５は純化された後光制御可能なＤＮＡ結合蛋白ＧＡＶ（ＷＴ）の純度である。矢印は標的バンドを指している。 図４６は光制御可能なＤＮＡ結合蛋白ＧＡＶ（ＷＴ）のスペクトル性質である。 図４７は光制御可能なＤＮＡ結合蛋白ＧＡＶ（ＷＴ）のゾル遷移実験である。左右二図のレーンは左から右へ、ＧＡＶ（ＷＴ）蛋白の濃度がそれぞれ５．５μＭ、２．８μＭ、１．４μＭ、０．７μＭ、０．３５μＭで、プローブ濃度が共に１２５ｎＭである。 図４８は光制御可能な蛋白発現システムのＩ型糖尿病マウス遺伝子治療に応用される研究結果である。
本発明は光感受性ポリペプチドに基づく光制御可能な遺伝子発現システムを提供し、時間及び空間において標的遺伝子の真核生物宿主細胞における発現を調節することに用いられる。本発明の光制御可能な遺伝子発現システムは少なくとも２つの部分に関し、第１部分が宿主細胞において発現できる組み換え光感受性転写因子融合蛋白のコードヌクレオチド配列であり、該融合蛋白が３つまたは４つまたは５つのポリペプチドによって構成され、そのうち、第１ポリペプチドがＤＮＡ結合ドメインで、第２ポリペプチドが光感受性ドメインで、第３ポリペプチドが転写調節ドメインで、第４ポリペプチドが核局在シグナル断片で、第５ポリペプチドがホルモンに制御されるポリペプチドであり、第２部分が応答要素−プロモーター−転写されるべきヌクレオチド配列によって構成されるターゲット転写ユニットヌクレオチド配列であり、そのうち、応答要素が前記組み換え光感受性転写因子融合蛋白の第１ポリペプチドが識別／結合するＤＮＡヌクレオチドモチーフであり、プロモーターが通常最小プロモーターであり、その他の完全なプロモーターであってもよい。第１部分の３つまたは４つのポリペプチドまたは５つのポリペプチドが関係する蛋白の短い切断体の機能活性断片（即ちドメイン）を使用するのが好ましい。遺伝子工程技術によって本発明の光制御可能な遺伝子発現システムの第１部分及び第２部分を１つの真核発現ベクターに構築またはそれぞれ２つの真核発現ベクターに構築することができる。特定の宿主細胞類型に対して異なるルーチン方法を使用しそれを宿主細胞に導入し、それに本発明の組み換え光感受性転写因子融合蛋白を発現させ、適当な波長の光照射を使用すればそれの第２光感受性ポリペプチドの二量体化する能力を変更させ、組み換え光感受性転写因子の二量体化する能力を変更させ、二量体化された転写因子が本発明の第２部分ターゲット転写ユニットヌクレオチド配列における応答要素に結合されることができ、且つ該融合蛋白の第３ポリペプチドの転写活性化／抑制ドメイン及び動員の宿主細胞の自身のその他の転写補助因子によって、該ターゲット転写におけるプロモーターに共同に作用することができ、それによって、標的遺伝子の転写及び発現を調節（開始または抑制）する。本発明により提供される前記光制御可能な遺伝子発現システムは、細胞または人間の体にほぼ損傷しない光照射を利用し、時間及び空間において標的蛋白遺伝子の真核宿主細胞における発現を調節できる。
本発明の前記光制御可能な遺伝子発現システムは、異なる光源及び光照射条件を使用して空間において標的蛋白遺伝子の真核宿主細胞における発現を調節できる。使用される光は安価で、取得し易く、細胞に対する毒性がない。
本文に使用される述語の定義及び解釈
「光制御可能」、「光感受性」及び「光誘起」の蛋白は本文において含意が同様で、置き換えて使用されることができるゆえは、光照射に対して敏感である蛋白に対して、相応する波長の光を使用して異なる強度または異なる周波数で照射して、該蛋白の構造または構造型を調節することによって、その活性に影響を与え、またその活性を活性化、増強または抑制することを含むことを指す。
「宿主」は、酵母菌のような単細胞真核生物、及び植物と動物、特にヒトを含む哺乳動物のような多細胞真核生物を含む、真核生物を指す。
「宿主細胞」は、真核生物組織を構成する細胞及び設立された真核生物細胞系を指し、これらの細胞または細胞系が発現待ちの標的蛋白質、使用されるスクリーン体系または発酵培養体系と適応すれば、結構である。単細胞真核生物細胞、例えば培養のＢＹ４７４１及びＡＨ１０９出芽酵母細胞、分裂酵母、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母菌、乳酸クレブシェラ菌、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌（Ｆｌｅｅｒ等Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９２．３（５）：４８６−４９６を参照する）及び真菌細胞を含む。すでに形成した体外継代培養、永遠に死亡しない哺乳動物細胞系は、ヒト胎児腎上皮細胞（ＨＥＫ２９３）、アフリカミドリザル腎繊維芽細胞ＣＯＳ−７、ヒト子宮頸癌細胞（Ｈｅｌａ）、マウス繊維芽細胞等（ＮＩＨ３Ｔ３）が例として挙げられるが、それらに限定されない。宿主細胞は、例えば遺伝子治療の目的のため生体外遺伝子組換えまたは相同的組換された動物胚細胞、造血幹細胞、骨芽細胞、肝細胞、白血球、ニューロン細胞及び皮膚上皮並びに気管上皮細胞を含む遺伝子治療の目的に対して特殊な価値を有する細胞類型のような正常細胞、生体外遺伝子組換えまたは相同的組換された動物胚幹細胞及び受精卵細胞も含む。宿主細胞は、さらに非哺乳動物の真核細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、ミバエ細胞、昆虫細胞、ゼブラフィッシュ細胞、線虫細胞、動物細胞及び哺乳動物細胞を含む。いわゆる遺伝子組換え細胞は本発明の組み換え光感受性転写因子遺伝子及び／または標的蛋白遺伝子の含有するターゲット転写ユニットが転写された細胞を含み、本発明の組み換え光感受性転写因子は制御可能な光照射によって標的遺伝子のこれらの細胞における発現を非常によく調節できる。昆虫細胞における発現はバキュロウイルス発現ベクター（例えばＯ’Ｒｅｉｌｌｙ等（１９９２）《バキュロウイルス発現ベクター：実験マニュアル》，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ出版社を参照する）を使用してもよく、使用可能なバキュロウイルスベクターはｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，及びＭ．Ｊ．Ｆｒａｓｅｒ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９８３．３（１２）：２１５６−２１６５）及びｐＶＬ系（（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．及びＭ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８９．１７０（１）：３１−３９）を含む。
「標的蛋白」は、「興味のある蛋白」とも呼ばれ、いずれの役立つ蛋白、例えば天然的または人工に修飾され、または突然変異した有用な蛋白質、特に翻訳して修飾されたこそ活性を有する蛋白質を含む予防または治療の目的またはその他の用途に使用されることができ、真核宿主細胞において発現することが必要である真核生物蛋白質を指し、それらは真核細胞において発現したこそ前記修飾を得られる。
「レポーター蛋白」は標的蛋白の１種であり、それは検出されやすい有用な蛋白質を発現することを指す。本発明の光感受性ポリペプチドに基づく、光誘起可能な標的蛋白遺伝子発現システムの効果を検出しやすいため、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｓ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等、既知の汎用されているレポーター蛋白を選択してもよいが、本発明の光誘起可能な標的蛋白遺伝子発現システムはレポーター蛋白の発現に限定しなく、いずれか有用な標的蛋白の発現に使用されてもよい。
本文における「遺伝子」、蛋白質の「コードヌクレオチド配列」、「転写されるべきヌクレオチド配列」の含意は同様で置き換えて使用されることができ、天然または組み換えられた、蛋白質アミノ酸配列情報コドンを携わっているＤＮＡ配列を指し、コード機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡのＤＮＡ配列とも指す。
「標的蛋白遺伝子」、「標的蛋白のコードヌクレオチド配列」または略称された「標的遺伝子」は本文において含意が同様で、置き換えて使用されることができ、コード標的蛋白の遺伝子を指し、通常デゾキシリボ核酸ＤＮＡ二重鎖配列である。前記遺伝子は宿主細胞の染色体ＤＮＡ配列にまたは人工に構築された発現ベクター例えば本発明のターゲット転写ユニット配列に含まれてもよい。同様に、「レポーター遺伝子」はコードレポーター蛋白の遺伝子を指す。
「転写」は本文において、真核生物宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼによって標的遺伝子を転写して該遺伝子情報の携わるＲＮＡを生成する過程を特定に指す。真核生物遺伝子の転写は原核生物に比べ遥かに複雑になっており、真核生物の３種類のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩはそれぞれ３種類の真核遺伝子ＤＮＡを転写し、３種類のＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ）及びアンチセンスＲＮＡを生成する。本文における転写因子により調節された転写過程はＲＮＡポリメラーゼＩＩにより開始された転写であり、即ちＤＮＡからｍＲＮＡに転写する。「転写調節」は本文には真核遺伝子転写の調節を指し、転写開始または抑制、転写増強または抑制、転写上向き調節または下向き調節を含む。
「発現」、「標的蛋白遺伝子発現」、「遺伝子発現」の本文における含意が同様または置き換えて使用されることができ、標的遺伝子のＤＮＡ配列が転写して該遺伝子情報の携わるＲＮＡ（ｍＲＮＡ或アンチセンスＲＮＡ）を生成することと、該ＲＮＡの携わる情報がライボソームにおいて翻訳されて標的蛋白を生成することとを指し、即ち、転写して情報ＲＮＡを生成することと翻訳されて標的蛋白を生成することのいずれも発現と呼ばれる。本文には前記２種類の含意を含み、主に標的蛋白の生成を指す。
「転写因子」または「転写因子の融合蛋白」の本文における含意が同様または置き換えて使用されることができ、真核生物の転写因子を指し、それは１つの蛋白質ではなく、複数の互いに作用する蛋白またはポリペプチドの一般名称であり、天然的または人工的に改造されたまたは人為に融合されるものであってもよく、ターゲット転写ユニットヌクレオチド配列における応答要素を識別／結合できるポリペプチド及びその他の転写活性化／抑制補因子を動員できるポリペプチドを含み、ターゲット転写ユニットにおける応答要素との結合及び相互作用によって、動員したその他の転写活性化または抑制補因子と共に転写されるべき核酸配列上流のプロモーターに作用し、それによって、標的蛋白遺伝子の転写を開始且つ調節する。転写因子はそれの組成によって「転写活性化因子」または「転写抑制因子」に分けられ、２つは共に「転写因子」と呼ばれる。
「ターゲット転写ユニット」は応答要素、プロモーター及び転写されるべき核酸配列によって構成される人造のＤＮＡ配列（蛋白質ではない）を指し、そのうち、応答要素は通常プロモーターの上流に位置し、ある時プロモーターの下流に位置してもよく、転写されるべき核酸配列は応答要素及びプロモーターの下流に位置し、３つは直接連結または操作性あるように（即ち複数のヌクレオチドから離れられてもよい）連結されてもよい。
「応答要素」は転写因子が特異的に識別／結合した１つのまたは複数のシス型ＤＮＡモチーフを指し、異なる転写因子はそれの対応する異なる応答要素を有し、転写因子はこれらのＤＮＡモチーフと結合できる結合ドメインを含む。転写因子がそれの対応する応答要素と特異的に結合した後、転写因子の第３ポリペプチドにより動員された補因子がプロモーターに共同作用し、それの下流標的遺伝子転写を活性化または抑制して相応するＲＮＡを生成する。本発明において、応答要素は組み換え光感受性転写因子の第１ポリペプチドと特異的に識別／結合できるＤＮＡモチーフを指し、例えばＧａｌ４の応答要素が長さの１７ｂｐであるＤＮＡモチーフ（配列番号６７）を指す。
「プロモーター」はその下流遺伝子を開始及び転写してＲＮＡを生成させるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは天然遺伝子のプロモーターまたは人工に修飾されたプロモーターであってもよい。異なるプロモーターは遺伝子の、異なる発育段階の異なる類型の組織または細胞における転写、または異なる環境または生理条件に対する応答時の遺伝子発現を引導できる。プロモーターは通常「構成型プロモーター」、「誘導型プロモーター」または「制御可能なプロモーター」に分けられ、組織及び細胞に基づければ「細胞特異的プロモーター」、「組織特異的プロモーター」、「発育特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」に分けられる。発現可能な天然細胞構造蛋白遺伝子の上流には共にそれと配合するプロモーターを有し、異なる遺伝子ＤＮＡ断片は同様なプロモーターを有してもよい。本発明の組み換え光感受性転写因子を発現することに用いられることができる常用構成型プロモーターの例としては、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスＣＭＶ及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組み換え光感受性転写因子を発現することに用いられることができる組織特異的プロモーターの例としては、さらにアルブミン（肝特異的，Ｐｉｎｋｅｒｔ，Ｃ．Ａ．等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１９８７．１（３）：２６８−２７６）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ，Ｋ．及びＳ．Ｅａｔｏｎ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８８．４３：２３５−２７５．）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ，Ａ．及びＤ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＥＭＢＯ Ｊ，１９８９．８（３）：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．，Ｌ．Ｏｌｓｏｎ，及びＷ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｃｅｌｌ，１９８３．３３（３）：７２９−７４０．；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．及びＤ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｅｌｌ，１９８３．３３（３）：７４１−７４８）が挙げられるが、これらに限定されない。ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター、Ｔａｌｂｏｔｔ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９８９．８６（１５）： ５７４３−５７４７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ， Ｔ．等．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５．２３０（４７２８）：９１２−９１６）及び哺乳類アデノ特異的プロモーター（例えば，牛乳乳清プロモーター、米国特許４８７３３１６号）。発育調節のプロモーター例えばラットｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ，Ｍ．及びＰ．Ｇｒｕｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０．２４９（４９６７）：３７４−３７９）及びα−胎児性蛋白（Ｃａｍｐｅｒ，Ｓ．Ａ．及びＳ．Ｍ．Ｔｉｌｇｈｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１９８９．３（４）：５３７−５４６）も含む。多くの真核遺伝子転写開始位置の上流約２５〜３０ヌクレオチドの位置にＡＴに富むアリアを有し、ＴＡＴＡボックスと呼ばれ、本文には「最小プロモーター」と呼ばれ、標的遺伝子の転写開始位置を確定するが、そのものは遺伝子転写を有効に開始できない。ＴＡＴＡボックスの上流にはその他の転写に必要なヌクレオチドモチーフ即ち本文に説明された転写因子のそれの特異的に識別／結合する応答要素を有し、該応答要素はそれの相応する転写因子によって結合された後最小プロモーターに対して応答性を伝達し、且つ転写因子により動員された補因子の共同作用下で最小プロモーターを活性化して、下流標的遺伝子の転写において相応するＲＮＡを生成することを引き起こす。
「ベクター」、「発現ベクター」、「遺伝子発現ベクター」または「プラスミド」は本文において含意が同様でまたは置き換えて使用されることができ、真核細胞において組み換え標的蛋白を発現できるベクターを指し、このような真核発現ベクターが人工に構築されたプラスミドまたは組み換えウィルスベクターであってもよい。
「形質転換」は宿主細胞が物理または化学方法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム共沈殿、リポフェクタミンまたはＤＥＡＥ−グルカン媒介の形質転換、ＤＮＡ粒子衝撃及び顕微注射等の処理方法によって、外因により加えられた遺伝子携帯の発現ベクターを細胞に摂取させ、または生物学媒介、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、受容体により媒介されたＤＮＡ摂取等によって遺伝子の携わる発現ベクターを宿主細胞に伝達することを指す。これらのベクターが宿主細胞に進入した後エピゾームの形でシトプラストに存在し、または細胞染色体に整合されることができ、適当な条件下で該細胞はベクターに携われる遺伝子コードの蛋白質または機能性ＲＮＡを瞬時に発現または長期に発現できる。前記宿主細胞がベクターに形質転換された細胞と呼ばれる。発現ベクターによって宿主細胞を形質転換する方法はＳａｍｂｒｏｏｋａ等（分子クローン実験マニュアル、第２版、冷泉港出版社（１９８９））、及びその他の関係テキストを参照できる。
本発明の光感受性ポリペプチドに基づく、光制御可能な遺伝子発現システムの第１部分の組み換え光感受性転写因子は、３種または４種または５種の機能性ポリペプチド断片がペプチド結合によって連結されまたはリンカーペプチドによって連結して形成された融合蛋白である。適当な波長の光照射下で、該融合蛋白が本発明の第２部分のターゲット転写ユニットヌクレオチド配列の応答要素に結合でき、且つその転写活性化／抑制ドメイン及び宿主細胞のそのものの転写補因子を動員することによって、ターゲット転写ユニットにおけるプロモーターに共同に作用し、それによって、ターゲット転写ユニットにおける標的蛋白遺伝子の発現を開始または抑制する。
本文において、「組み換え光感受性転写因子融合蛋白」と「組み換え光感受性転写因子」との含意が同様で、置き換えて使用されることができる。
本発明の組み換え光感受性転写因子は第１ポリペプチドを含有し、該ポリペプチドは前記ターゲット転写ユニットヌクレオチド配列における応答要素を特異的に識別できるがそれと結合できずまたは結合能力が弱く、第２ポリペプチドの協力下で転写因子が均質二量化を発生したこそ第１ポリペプチドが応答要素と結合できることなり、第１ポリペプチドがヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーモチーフまたは亜鉛クラスターＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、高速移動群ＤＮＡ結合ドメイン、Ｂ３ＤＮＡ結合ドメインから選ばれる。関連文献を分析し、本発明の第１ポリペプチドとして使用可能な例として、Ｇａｌ４蛋白のＤＮＡ結合ドメイン、ＬｅｘＡ蛋白のＤＮＡ結合ドメイン、Ｌａｃ抑制蛋白ＬａｃＩのＤＮＡ結合ドメイン、λファージｃＩ抑制蛋白のＤＮＡ結合ドメイン、テトラサイクリン抑制蛋白ＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン、トリプトファン抑制蛋白ＴｒｐＲの結合ドメイン等が挙げられるが、これらに限定されなく、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン及びＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインがより好ましい。Ｇａｌ４が出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の転写活性化蛋白であり、遺伝子プロモーターの上流応答要素−モチーフ（配列番号６７）を識別／結合できる。Ｇａｌ４のＮ末端第１−９４位置のアミノ酸がＤＮＡ結合ドメインで、該ＤＮＡ結合ドメインが亜鉛クラスターＤＮＡ結合ドメインであり、そのうち、第１−６５位置のアミノ酸がＤＮＡの特異的識別に用いられ、第６６−９４位置のアミノ酸が二量化に用いられ、Ｇａｌ４が同種二量体に形成されなければ応答要素と結合してその役割を発揮することができない［Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，Ｒ．等．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２．３５６（６３６８）：４０８−４１１］。Ｇａｌ４／ＵＡＳに基づくツーハイブリッド系が遺伝子の発現を研究することに用いられる有効なツールである。例えば、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）により生産された哺乳動物ツーハイブリッド系（ＣｈｅｃｋＭａｔｅＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）が該Ｇａｌ４／ＵＡＳの使用したものである。ＬｅｘＡ蛋白が大腸菌細胞内に存在する転写抑制蛋白であり、２０以上の種類の遺伝子の転写を制御でき、二量化された後遺伝子プロモーター上流の応答要素（配列番号６８）を識別／結合でき、パリンドローム構造がＲＮＡポリメラーゼの後ろ遺伝子に対する転写を阻害する。ＬｅｘＡは２０２つのアミノ酸を含有し、そのＤＮＡ結合ドメインが翼状ヘリックス・ターン・ヘリックスのＤＮＡ結合ドメインであり、そのうち、第１−８７位置のアミノ酸がＤＮＡ特異的識別に用いられ、第８８−２０２位置のアミノ酸が二量化に用いられ、二量化されたＬｅｘＡこそは相応する応答要素を特異的に結合できるが、但し単体のＬｅｘＡができない。正常状況下で細胞内に存在するＬｅｘＡが二量体の形であり、細胞が内部または外部のＳＯＳ信号に刺激された時に、二量化されたＬｅｘＡが体内の一部の酵素によって切断されて分けられ且つＤＮＡから解離され、元のＬｅｘＡによって抑制された遺伝子が活性化されたことになる［Ｆｏｇｈ，Ｒ．Ｈ．等，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９４．１３（１７），３９３６−３９４４］。ＬｅｘＡに基づくツーハイブリッド系も遺伝子の発現及び蛋白質の相互作用の研究に用いられる。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社により生産された酵母ツーハイブリッド系（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ ＬｅｘＡ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）が前記システムに基づくものである。Ｌａｃ抑制蛋白ＬａｃＩが大腸菌乳糖システムオペロンを特異的に識別／結合し、それによって関連遺伝子の転写を調節することができる。ＬａｃＩの結合ドメインがヘリックス・ターン・ヘリックスのＤＮＡ結合ドメインであり、そのうち、第１−６２位置のアミノ酸がＤＮＡ特異的識別に用いられ、その特異的識別／結合するＤＮＡ保存配列は配列番号６９を参照し、二量化または四量化されたＬａｃＩこそはそれと結合でき、単体のＬａｃＩ蛋白がほとんど結合できない［Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６．２７１（５２５３），１２４７−１２５４］。ｃＩ蛋白がλファージｃＩ遺伝子コードの転写抑制蛋白であり、λ左、右の２つの早期プロモーターの転写を阻害することによって複製及び細胞分裂を行えなくなる蛋白である。ｃＩ蛋白は２３６つのアミノ酸を含み、そのＤＮＡ結合ドメインがヘリックス・ターン・ヘリックスのＤＮＡ結合ドメインであり、第１−１０２位置のアミノ酸がＤＮＡ特異的識別に用いられ、第１３２−２３６位置のアミノ酸が二量化に用いられ、二量化されたｃＩこそは相応する応答要素と結合できる。ｃＩ蛋白同種二量体がＰＬ及びＰＲの２つのオペロン配列に識別／結合し、いずれのオペロンにはｃＩの３つの識別結合位置を含み、それぞれＰＬのＯＬ１、ＯＬ２及びＯＬ３と、ＰＲのＯＲ１、ＯＲ２及びＯＲ３である。ｃＩとＯＲ１との結合力が比較的強く、ＯＲ１の保存ＤＮＡ配列が配列番号７１を参照し、単体ｃＩ蛋白はほとんどこのような結合力を持っていない［Ｂｕｒｚ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｃｋｅｔｔ，Ｄ．，Ｂｅｎｓｏｎ，Ｎ．及びＡｃｋｅｒｓ，Ｇ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４．３３（２８），８３９９−８４０５，Ｈｕ，Ｊ．Ｃ．，Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｅ．Ｋ．，Ｋｉｍ，Ｐ．Ｓ．及びＳａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０．２５０（４９８６），１４００−１４０３］。テトラサイクリン抑制蛋白（ＴｅｔＲ）が多くのグラム陰性菌に存在する転写因子であり、特定ＤＮＡモチーフを結合することによって関連する遺伝子の転写を抑制する。ＴｅｔＲ蛋白のＤＮＡ結合ドメインがヘリックス・ターン・ヘリックスのＤＮＡ結合ドメインであり、単体ＴｅｔＲ蛋白が均質二量体を形成することによって特性ＤＮＡ配列（配列番号７０）のオペロンに識別／結合でき、単体ＴｅｔＲがほとんどこのような結合力を持っていない［Ｗｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．等，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１．１０（１３），４１４５−４１５２，Ｒａｍｏｓ，Ｊ．Ｌ．等，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ，２００５．６９（２），３２６−３５６］。
本発明の１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドがＧａｌ４蛋白ＤＮＡ結合ドメイン（その核酸及び蛋白質の配列がそれぞれ配列番号１及び配列番号２である）の１−６５位置アミノ酸、即ちそのＤＮＡ結合ドメインの短い切断体であり、それは単独に応答要素と結合できない。本発明の他１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドがＬｅｘＡ蛋白ＤＮＡ結合ドメイン（その核酸及び蛋白質の配列がそれぞれ配列番号５及び配列番号６である）の１−８７位置アミノ酸、即ちそのＤＮＡ結合ドメインの短い切断体であり、それは単独に応答要素と結合できない。本発明のもう１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドがＬａｃＩ蛋白ＤＮＡ結合ドメイン（その核酸及び蛋白質の配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号１０である）の１−６２位置アミノ酸、即ちそのＤＮＡ結合ドメインの短い切断体であり、それも応答要素と単独に結合できない。本発明のもう１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドがＴｅｔＲ蛋白ＤＮＡ結合ドメイン（その核酸及び蛋白質の配列がそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４である）の１−６３位置アミノ酸、即ちそのＤＮＡ結合ドメインの短い切断体であり、それも応答要素と単独に結合できない。本発明のもう１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドがｃＩ蛋白ＤＮＡ結合ドメイン（その核酸及び蛋白質の配列がそれぞれ配列番号１７及び配列番号１８である）の１−１０２位置アミノ酸、即ちそのＤＮＡ結合ドメインの短い切断体であり、それも応答要素と単独に結合できない。
本発明組み換え光感受性転写因子融合蛋白における第２ポリペプチドが光感受性ポリペプチドであり、該ポリペプチドがフラビン類（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を発色団とする光感受性ドメイン、例えば光−酸素−電圧（ＬＯＶ）ドメインの含有する光感受性蛋白、フォトリアーゼに類似する隠れた色素（ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ−ｌｉｋｅ ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅｓ）、ＦＡＤの利用する青光蛋白（ｂｌｕｅ ｌｉｇｈｔ ｕｓｉｎｇ ＦＡＤ，ＢＬＵＦ）から由来する。ＬＯＶドメインの含有する光感受性蛋白が好ましく、適当な波長の光によって照射された後、第２ポリペプチドの二量化能力が変わられ、転写因子の二量化能力に変化を発生させ、二量化された転写因子が相応する応答要素に結合し、それによって、標的遺伝子の発現レベルを調節する。本発明は以下の複数種の好ましい光感受性蛋白またはその機能活性短い切断体を含むが、それらに限定されない。
本発明の第１の好適な第２ポリペプチドがアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）細胞内に青光の細胞信号伝導通路を制御することに参与する光感受性蛋白質であり、青光照射下で、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ，Ｆｌａｖｉｎ Ａｄｅｎｉｎｅ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と蛋白分子間の反応を発生して二量体を形成できる。全長ＶＩＶＩＤ蛋白には１８６つのアミノ酸を含み、光に対して敏感である１つのＬＯＶドメインのみを含む。研究は、ＶＩＶＩＤ蛋白がＮ端３６つのアミノ酸の短い切断体蛋白（ＶＩＶＩＤ−３６）を欠如するため、安定性が全長蛋白よりよく、青光により照射した後形成されたＶＩＶＩＤ−３６二量体は、光照射しなくその単体形状を回復する半減期が１８０００ｓで、点突然変異Ｃ７１Ｖを含有するＶＩＶＩＤ−３６二量体の能力がより強いことを表明した。本発明の１つの好適な実施形態において、第２ポリペプチドが１つの点突然変異を含有する、前１−３６つのアミノ酸を削除したＶＩＶＩＤ（Ｃ７１Ｖ）、ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ）、ＶＩＶＩＤ（Ｙ５０Ｗ）突然変異蛋白（核酸配列がそれぞれ配列番号２３、２５、２９で、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号２４、２６、３０である）である。本発明の１つのより好適な実施形態において、第２ポリペプチドが２つの点突然変異を含有する、前１−３６つのアミノ酸を削除したＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）突然変異蛋白（その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号２７及び配列番号２８）である。
本発明第２の好適な第２ポリペプチドがオート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）光感受性色素１遺伝子のＬＯＶ２ドメイン（ＡｓＬＯＶ２と略する）［Ｐｅｔｅｒ，Ｅ．，Ｂ．Ｄｉｃｋ，ａｎｄＳ．Ａ．Ｂａｅｕｒｌｅ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１０．１（８）：１２２］である。オート麦細胞光感受性色素１のＮ端がＬＯＶ１及びＬＯＶ２光酸素電圧（ＬＯＶ）ドメインであり、青光の照射下で共にフラビンモノヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＭＮ）と結合して付加生成物を生成できる。本発明はオート麦光感受性色素１のＬＯＶ２ドメインを第１ポリペプチドに連結して、光照射で転写因子の第１ポリペプチドと対応する応答要素との結合能力を制御できることを成功に導いた。本発明はＡｓＬＯＶ２（その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号４１及び配列番号４２である）第２ポリペプチドの転写因子ＧＡＬＰを含有し、暗中においてそれの対応する応答要素と結合し、標的遺伝子の発現に至ることができ、光照射において、前記結合が衰弱されて標的遺伝子の発現レベルの減少に至る。
本発明第３の好適な第２ポリペプチドがフシナシミドロ（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅ ａｌｇａｅ Ｖａｕｃｈｅｒｉａ ｆｒｉｇｉｄａ）アウロクローム１蛋白Ｃ端のＬＯＶドメイン（ＡｕＬＯＶと略し、その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号４５及び配列番号４６である。）［Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｆ．等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４９）：１９６２５−１９６３０］である。本発明はＡｕＬＯＶ第２ポリペプチドの組み換え転写因子ＧＡＡＰを含有し、光照射した後二量体化能力が増強され、標的遺伝子の発現レベルを上向き調節させた。
前記第２光感受性ポリペプチドにおいて、ＶＩＶＩＤ及びＡｕＬＯＶは適当な波長光で照射すれば、それにより構成された組み換え光感受性転写因子に二量化を増強させ、応答要素と結合することによって転写を開始または上向き調節させることができ、一方、ＡｓＬＯＶ２により構成された組み換え光感受性転写因子が、暗中において二量化して応答要素と結合し、光照射することは逆にそれの二量化を解離させて単体に形成し、応答要素との結合を減衰しまたはしなくなり、それによって、転写を抑制または下向き調節する。
光感受性蛋白から、それぞれＶＩＶＩＤ（Ｎｃ＿ＶＶＤ）、ホワイトカラー−１（Ｎｃ＿Ｗｃ１）、ＦＫＦ１（Ａｔ＿ＦＫＦ１）、アウロクローム１（Ｖｆ＿Ａｕｒｅｏ１＿ＬＯＶ）、オート麦フォトトロピン１（Ａｓ＿ｐｈｏｔ＿ＬＯＶ１及びＡｓ＿ｐｈｏｔ＿ＬＯＶ２）から由来する６種の異なるＬＯＶドメインに対して、Ａｃｃｅｌｒｙ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ２．１を用いて相同関係を分析し、その結果は、前記複数種の蛋白の完全に同様であるアミノ酸が約１５％で、類似性の有する配列が約３６％である（図１）ことを示した。
第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは光制御可能なＤＮＡ結合蛋白融合蛋白（ＤＮＡ結合蛋白と略称する）を構成できる。光制御可能なＤＮＡ結合蛋白は本発明の各種の組み換え光感受性転写因子のＤＮＡ結合能力の研究、特に体外において組み換え光感受性転写因子の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドにより構成される完全な、ＤＮＡ結合能力の有するＤＮＡ結合ドメイン及び結合特性の分析、例えば結合常数、二量化によって単体に回復する動態学等の研究に使用されることができ、好適なＤＮＡ結合蛋白が第３ポリペプチドと連結すれば転写因子に構成できる。１つの具体的な実施形態において、光制御可能なＤＮＡ結合蛋白の第１ポリペプチドがＧａｌ４（１−６５）で、第２ポリペプチドが野生型ＶＩＶＩＤ−３６であり、構成した融合蛋白Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ（ＷＴ）（ＧＡＶ（ＷＴと略する）は、その核酸及びアミノ酸が配列番号８４と配列番号８５）がＶＩＶＩＤ蛋白のスペクトル性質と類似しており、且つＤＮＡ結合能力が光によって制御され、光照射前後ＤＮＡ結合レベルは顕著な差異を有し、即ち高濃度レベル時、暗中状態の融合蛋白はプローブと結合できるが、結合能力が弱くなる。光照射した後使用された総ての蛋白濃度範囲内においてプローブに対して共に結合能力を有する。
本発明の組み換え光感受性転写因子は第３ポリペプチドを含有し、該ポリペプチドが転写調節ドメインであり、転写構造活性化領域（ＡＤと略する）または転写構造抑制領域であってもよい。本発明第３ポリペプチドの転写構造活性化領域または転写構造抑制領域として使用されることができるのは、酸性アミノ酸に富む転写活性化ドメイン（例えばＶＰ１６及びＧａ１４のＡＤ）、プロリンに富む転写活性化ドメイン（例えばＣＴＦ／ＮＦ１のアミノ酸残基３９９−４９９）、セリン／トレオニンに富む転写活性化ドメイン（例えばＩＴＦ１のアミノ酸残基１−４２７）及びグルタミンに富む転写活性化ドメイン（Ｏｃｔ１のアミノ酸残基１７５−２６９）が例として挙げられるが、これらに限定せず、Ｓｅｉｐｅｌ等がそれらのアミノ酸配列及びその他の有用な転写活性化ドメインを公開した［Ｓｅｉｐｅｌ，Ｋ．， Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｏ．及びＳｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９２．１１（１３），４９６１−４９６８（１９９２）］。さらに報道されたＫｒｕｐｐｅｌ付随ボックス（ＫＲＡＢ）転写抑制ドメイン［Ｐｅｎｇ，Ｈ．等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００．２７５（２４）：１８０００−１８０１０］の配列も挙げられる。
本発明の実施手段において、第３ポリペプチドがＶＰ１６転写活性化ドメイン（ＶＰ１６と略し、その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号５１及び配列番号５２である）、Ｇａ１４転写活性化ドメイン（Ｇａ１４ＡＤと略し、その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号５３及び配列番号５４である）、通用制御蛋白（Ｇｃｎ４）の転写活性化ドメイン（その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号９５及び配列番号９６である）、ＮＦ−κＢ ｐ６５転写活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤと略し、その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号４９及び配列番号５０である）、または亜鉛フィンガー蛋白３５４ＡのＫＲＡＢ転写抑制ドメイン（その核酸及び蛋白質配列がそれぞれ配列番号５５及び配列番号５６である）である。ＮＦ−κＢの２種類のイリデンが常に同種または異種二量体に形成され、最も見られるのはｐ６５／ｐ５０またはｐ６５／ｐ６５二量体であり、ｐ６５イリデンの転写活性化ドメインがすでに遺伝子の発現を誘起する各種のシステムの構築に汎用されており、効果が良好である［Ｗａｎｇ，Ｙ．等，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１９９７．４（５），４３２−４４１］。Ｇａ１４蛋白の転写活性化ドメイン（ＡＤ）がそのＣ−末端７６８〜８８１位置に位置し、この１１４つのアミノ酸において非常に多くの酸性アミノ酸を有し、出芽酵母細胞におけるその他の転写補助蛋白を動員して一緒にプロモーターを活性化させて関連する遺伝子の転写に至ることができる［Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｈｕｑ，Ｅ．，Ｔｅｐｐｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，及びＱｕａｉｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２．２０（１０），１０４１−１０４４］。酵母Ｇｃｎ４の転写活性化ドメインが主にＧｃｎ４蛋白のＮ−末端第１〜１４４位置アミノ酸に位置し、出芽酵母細胞におけるその他の転写補助蛋白を動員して一緒にプロモーターを活性化させて関連する遺伝子の転写に至ることができる［Ｄｒｙｓｄａｌｅ，Ｃ．Ｍ．等．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９５．１５（３）：１２２０−１２３３］。ＶＰ１６が単純疱疹ウイルスＨＳＶ−１のＵＬ４８構造遺伝子発現の、４９０つのアミノ酸残基の含有するウイルス中間層蛋白質であり、そのカルボキシル基端は酸性アミノ酸残基を豊富に含有し、転写活性化ドメインである。ＶＰ１６の転写活性化ドメインがすでに複数種の遺伝子発現システムに成功に応用され、効果が良好である［Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．輪Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９２．８９（１２）：５５４７−５５５１］。本発明の１つの好適な実施形態において、第３ポリペプチドがＶＰ１６の転写活性化ドメインを使用した。本発明の他１つの好適な実施形態において、第３ポリペプチドがＮＦ−κＢ ｐ６５転写活性化ドメインを使用した。本発明のもう１つの好適な実施形態において、第３ポリペプチドが亜鉛フィンガー蛋白３５４ＡのＫＲＡＢ転写活性化ドメインを使用した。本発明のもう１つの好適な実施形態において、第３ポリペプチドがＧａ１４転写活性化ドメインを使用した。本発明のもう１つの好適な実施形態において、第３ポリペプチドがＧｃｎ４転写活性化ドメインを使用した。
本発明の組み換え光感受性転写因子融合蛋白はさらに第４ポリペプチドを含んでもよく、該ポリペプチドは融合蛋白の細胞核へ輸送を促進するように、核定位シグナルペプチドである。もし第１、第２及び第３ポリペプチドが核定位シグナル（ＮＬＳ）を含まない場合、第４ポリペプチドを融合して添加してもよい。核定位シグナルペプチドは代表的に１つのセクションのアルカリ性アミノ酸を含む。本発明の好ましい核定位シグナルペプチドがサル空胞ウイルス４０核定位シグナルペプチドである（ＳＶ４０ ＮＬＳ）［Ｆａｎａｒａ，Ｐ．，等．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００．２７５（２８）：２１２１８−２１２２３．］。１つの具体的な実施手段において、本発明の組み換え光感受性転写因子の第１ポリペプチドが核定位シグナルの含有するＧａ１４蛋白であるため、融合蛋白には第４ポリペプチドを含んでいない。もう１つの具体的な実施手段において、第４ポリペプチドが第１、第２、第３ポリペプチドと直接またはリンカーによって連結される。
本発明の組み換え光感受性転写因子融合蛋白はさらに第５ポリペプチドを含んでもよく、第５ポリペプチドを含有する組み換え光感受性転写因子融合蛋白は組み換え光−ホルモン二重制御転写因子とも呼ばれる。多くの状況下で、第５ポリペプチドが組み換え転写因子の核進入能力を調節し、それによって光と同時に標的遺伝子の発現を制御することに用いられる。第５ポリペプチドが第１、第２、第３ポリペプチドと直接またはリンカーによって連結される。第５ポリペプチドが脱皮ホルモン受容体及びそれの突然変異体、糖質コルチコイド受容体（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びそれの突然変異体、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びそれの突然変異体、プロゲステロン受容体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びそれの突然変異体を含むが、これらに限定されず、ミバエ脱皮ホルモン受容体及びそれの突然変異体、カイコ脱皮ホルモン受容体及びそれの突然変異体、ヒト糖質コルチコイド受容体及びそれの突然変異体、ヒトエストロゲン受容体及びそれの突然変異体、ヒトプロゲステロン受容体及びそれの突然変異体が好ましくは、カイコ脱皮ホルモン受容体（Ｖ４５４Ｉ／Ｙ４７４Ｅ）突然変異体がより好ましく、ヒトエストロゲン受容体（Ｇ４００Ｖ／Ｍ５４３Ａ／Ｌ５４４Ａ）突然変異体がより好ましい。１つの具体的な実施手段において、本発明の組み換え光感受性転写因子第５ポリペプチドがカイコ脱皮ホルモン受容体（Ｖ４５４Ｉ／Ｙ４７４Ｅ）突然変異体第２７２〜６０６位置アミノ酸であり、もう１つの具体的な実施手段において、第５ポリペプチドがヒトエストロゲン受容体第６４０〜９１４位置アミノ酸である。
以上に説明したように、本発明の組み換え光感受性転写因子に含まれる３種または４種または５種のポリペプチドがそれぞれ複数種の選択を有してもよく、３種または４種または５種のポリペプチドを融合蛋白に連結すればまた複数種の組合選択を有してもよく、本発明は良好な活性の有する各ポリペプチドの機能ドメイン断片によって組み換え光感受性転写因子融合蛋白を調製することが好ましく、哺乳動物細胞及び酵母細胞において好適な転写調節能力の強く、即ち光照射及び暗中時標的遺伝子の発現量の差異を大きくする該組み換え光感受性転写因子を発現することによって、転写されるべき核酸配列の発現を調節するが、いずれの選択及び組合は、本発明の構想される光制御遺伝子発現性能を実現できる組み換え光感受性転写因子の各種の組合であれば、全て本発明の範囲に属する。
本発明の光感受性ポリペプチドに基づく光制御可能な遺伝子発現システムの第２部分が、転写因子によって特異的に識別／結合された応答要素−プロモーター−転写されるべきヌクレオチド配列によって構成されたターゲット転写ユニット（ヌクレオチド配列）であり、具体的に、そのうちの応用要素のヌクレオチドモチーフが本発明の異なる実施形態に選択された組み換え光感受性転写因子融合蛋白の第１ポリペプチドによって異なる。言い換えれば、応答要素が第１ポリペプチドの特異的応用要素であり、選択された第１ポリペプチドに基づいてそれに相応する応答要素を選択しなければならない。例えば、第１ポリペプチドがＧａｌ４、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、ｃＩ蛋白のＤＮＡ識別／結合ドメインである時に、それの相応する応答要素が「配列番号６７、６８、６９、７０、７１」モチーフであるべきである。ターゲット転写ユニットにおける応答要素は少なくとも１つまたは複数であってもよく、具体的な実施形態において、応答要素が１、２、３、４または５つであり、必要である時または複数であれば効果がよりよいである場合、複数のが好ましい。
応答要素と操作性に連結するのは通常最小プロモーターであり、該最小プロモーターのそのものは遺伝子転写を有効に開始できず、その上流の応答要素と一緒に転写因子の各メンバーと相互作用したこそ下流標的遺伝子の転写を活性化または上向け調節できる。関係文献を分析した結果、本発明の最小プロモーターとして使用可能なのは、アデノウイルス主要後期プロモーター（核酸配列が配列番号７２である）、サイトメガロウイルスＣＭＶ最小プロモーター（核酸配列が配列番号７５である）、酵母Ｇａｌｌ遺伝子のプロモーター（核酸配列が配列番号７４である）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の具体的な実施形態において、最小プロモーターがアデノウイルス後期プロモーター、酵母Ｇａｌｌプロモーターであるが、その他の最小プロモーターを使用してもよい。応答要素と操作性のあるように連結するプロモーターは完全なプロモーターであってもよく、このようなプロモーターのそのものは遺伝子転写を開始する能力を有し、転写因子が応答要素に結合された後、下流の転写されるべき核酸の発現を増強または抑制でき、他１つの具体的な実施形態において、プロモーターがＳＶ４０プロモーター（核酸配列が配列番号７３である）である。本発明の当業者に周知のように、いわゆる「操作性連結」は、応答要素とプロモーターとの間または複数の応答要素の間が、直接連結されるの代わりに、複数のヌクレオチドによって離隔され、共同作用ができれば結構である。
本発明のターゲット転写ユニットプロモーターの下流が転写されるべきヌクレオチド配列であり、コード標的蛋白または機能性ＲＮＡのヌクレオチド配列であってもよい。前記のように、標的蛋白はいずれの有用な蛋白であってもよい。本発明システムの効果を検証及び検出しやすいため、本発明の実施例において、デモンストレーションのレポーター蛋白が使用され、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ、その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号７６及び配列番号７７である）、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ、その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号７８及び配列番号７９である）、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８０及び配列番号８１である）、緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ、その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号８２及び配列番号８３である）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号９１及び配列番号９２である）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ、その核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号９３及び配列番号９４である）を標的蛋白とするが、本発明の標的蛋白はこれらのレポーター蛋白に限定されない。転写されるべきヌクレオチド配列がコード機能性ＲＮＡ分子、例えばアンチセンスＲＮＡであってもよい。宿主細胞または動物において前記のような機能性ＲＮＡ分子を発現することは宿主細胞内の一部活動を調節でき、例えばコード蛋白ｍＲＮＡの翻訳を抑制することによって標的蛋白の発現を阻害する。
標準組み換えＤＮＡ技術を使用することによって、本発明の光誘起可能な標的蛋白遺伝子発現システムの第１部分及び第２部分を１つの真核発現ベクターに構築しまたはそれぞれ２つの真核発現ベクターに構築することができる。標準技術を使用してこのような発現ベクターを各種の真核宿主細胞群に導入して必要な標的蛋白を発現することができ、または各種の真核宿主細胞群例えば動物胚細胞または植物生殖細胞に導入し、さらに選択して有用な遺伝子転移生物例えば、遺伝子転移ヤギ、シープ、ブタまたはその他の家畜、または遺伝子転移植物を生成できる。
本発明の発現システムは、真核細胞において内因蛋白または外因蛋白を発現することに用いられることができ、遺伝子治療及び遺伝子転移または同族組み換え生物体（例えば動物または植物）における遺伝子の発現に用いられる。
本発明は３種または４種または５種のポリペプチドによって構成される複数種の組み換え光感受性転写因子融合蛋白のアミノ酸配列、そのコード核酸及びその真核発現ベクターを提供する。本発明の１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ＶＰ１６（ＧＡＶＶ（ＷＴ）と略する）のコード核酸（配列番号３）、アミノ酸配列（配列番号４）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＶＶ（ＷＴ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ｐ６５（ＧＡＶＰと略する）のコード核酸（配列番号３１）、アミノ酸配列（配列番号３２）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＶＶ（ＷＴ）を提供する。本発明の１つの実施形態において、そのうちＶＩＶＩＤが点突然変異を含有する３種の組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ｐ６５のコード核酸（配列番号３３、３５、３９）、アミノ酸配列（配列番号３４、３６、４０）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）、ｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ）及びｐＧＡＶＰ（Ｙ５０Ｗ）を提供し、そのうち、括弧中にはＶＩＶＩＤにおける突然変異のサイトである。本発明の他１つの好適な実施形態において、そのうちＶＩＶＩＤにダブル突然変異を含有する組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ｐ６５のコード核酸（配列番号３７）、アミノ酸配列（配列番号３８）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＡｓＬＯＶ２−ｐ６５（ＧＡＬＰと略する）のコード核酸（配列番号４３）、アミノ酸配列（配列番号４４）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＬＰを提供する。本発明の他１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＡｕＬＯＶ−ｐ６５（ＧＡＡＰと略する）のコード核酸（配列番号４７）、アミノ酸配列（配列番号４８）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＡＰを提供する。本発明の他１つの好適な実施形態において、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとが異なるリンカーペプチドによって連結される３種の組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ｐ６５のコード核酸（配列番号５９、６１、６３）、アミノ酸配列（配列番号６０、６２、６４）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＶＰ−９、ｐＧＡＶＰ−１１及びｐＧＡＶＰ−１２を提供し、そのうち、９、１１、１２が異なるリンカーペプチドを表す。本発明の他１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ＫＲＡＢ（Ｃ７１Ｖ）（ＧＡＶＫ（Ｃ７１Ｖと略する）のコード核酸（配列番号５７）、アミノ酸配列（配列番号５８）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＡＶＫ（Ｃ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、１組の組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ−Ｌｎ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）、そのうち、ｎが１、２、３、４、５、６であり、ＧＶＧ−Ｌｎ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）のコード核酸（配列がそれぞれ配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７である）、アミノ酸配列（配列がそれぞれ配列番号９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８である）及び哺乳動物細胞発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌｎ（Ｎ５６ＫＣ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ＶＰ１６（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）のコード核酸（配列番号１０９）、アミノ酸配列（配列番号１１０）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇｃｎ４（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（（ＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）のコード核酸（配列番号１１１）、アミノ酸配列（配列番号１１２）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、１組のそのうちＶＩＶＩＤが点突然変位を含有する組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤのコード核酸（配列がそれぞれ配列番号１１３、１１５、１１７である）、アミノ酸配列（配列がそれぞれ配列番号１１４、１１６、１１８である）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（ＷＴ）、ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｃ７１Ｖ）及びｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｙ５０Ｗ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＡｓＬＯＶ２−Ｇａｌ４ＡＤ（ＧＬＧと略する）のコード核酸（配列番号１１９）、アミノ酸配列（配列番号１２０）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＧＬＧを提供する。本発明の他１つの実施形態において、第４ポリペプチドの含有する組み換え光感受性転写因子ＮＬＳ−ＬｅｘＡ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）のコード核酸（配列番号７）、アミノ酸配列（配列番号８）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、第４ポリペプチドの含有する組み換え光感受性転写因子ＮＬＳ−ｃＩ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＮＣＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）のコード核酸（配列番号１９）、アミノ酸配列（配列番号２０）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＮＣＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、第４ポリペプチドの含有する組み換え光感受性転写因子ＮＬＳ−ＬａｃＩ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＮＬｃＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）のコード核酸（配列番号１１）、アミノ酸配列（配列番号１２）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＮＬｃＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を提供する。本発明の他１つの実施形態において、第４ポリペプチドの含有する組み換え光感受性転写因子ＮＬＳ−ＴｅｔＲ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＮＴＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）のコード核酸（配列番号１５）、アミノ酸配列（配列番号１６）及び出芽酵母発現ベクターｐＧＰＭＡ−ＮＴＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を提供する。本分野の周知されたように、アミノ酸のコドンヌクレオチドは縮重性（即ちアミノ酸が２つ、または３つ、または４つのコドンを有してもよく、それらは該アミノ酸のコドンと呼ばれる）を有し、前記各種の組み換え光感受性転写因子のコード核酸は、本発明はそれらの各自の全ての縮重ヌクレオチド配列を含む。前記各種の組み換え光感受性転写因子のアミノ酸配列は、本発明はそれらの各自の全ての保守性欠如、添加、置換修飾を含むが、その元の機能活性のアミノ酸配列類似物を依然保留した。
本発明は応答要素−プロモーターを含有するが転写されるべきヌクレオチド配列が欠如するターゲット転写ユニットの真核発現ベクターも提供し、転写されるべきヌクレオチド配列欠如はユーザーに必要な転写されるべきヌクレオチド配列例えば標的蛋白のコード遺伝子を自由に選択し、標準の組み換えＤＮＡ技術によってそれを本発明の前記発現ベクターに挿入し、前記の本発明組み換え光感受性転写因子遺伝子を含有する発現ベクターと共同に宿主細胞を形質転換することによって、転写されるべきヌクレオチド配列（遺伝子）の発現を調節する。
本発明は本発明の各種組み換え光感受性転写因子遺伝子の真核発現ベクターにそれぞれ形質転換された哺乳動物細胞も提供し、同時に、相応する応答要素−プロモーター−転写されるべきヌクレオチド配列が欠如しているターゲット転写ユニットの含有する真核発現ベクターも提供する。ユーザーは標準の組み換えＤＮＡ技術によって、自由に選択した転写されるべきヌクレオチド配列（標的蛋白遺伝子）を該発現ベクターに挿入でき、その後該改めて構築したベクターによってすでに本発明組み換え光感受性転写因子遺伝子の真核発現ベクターに形質転換された哺乳動物細胞を形質転換し、且つ前記細胞を培養し、それらに必要な標的遺伝子を発現し、または如何にして標的遺伝子の発現を調節するかの研究に用いられる。
本発明はさらに本発明の遺伝子発現調節システムの２つ部分の発現ベクター、またはこのようなベクターに形質転換された哺乳動物細胞が装入されている試薬キットも提供する。１つの実施形態において、該試薬キットにおける一部の容器にはそれぞれ本発明の１種または複数種の組み換え光感受性転写因子遺伝子の真核発現ベクターが装入されている。他１つの実施形態において、該試薬キットにおける一部の容器にはそれぞれ本発明の１種または複数種の組み換え光感受性転写因子遺伝子の真核発現ベクターが装入され、他一部の容器には、相応する応答要素−プロモーター−転写されるべきヌクレオチド配列が欠如するターゲット転写ユニットを含有する真核発現ベクターが装入される。もう１つの実施形態において、該試薬キットには一部の容器にはすでに本発明組み換え光感受性転写因子遺伝子の真核発現ベクターに形質転換された哺乳動物細胞が装入され、他一部の容器には、相応する応答要素−プロモーター−転写されるべきヌクレオチド配列が欠如するターゲット転写ユニットを含有する真核発現ベクターが装入される。
本発明の試薬キットはさらに相応する光照射制御設備、例えばＬＥＤ灯及びその制御装置を含んでもよい。本発明の全ての試薬キットには、キットにおける各成分、使用目的及び使用方法を説明するように、相応する添付文書が装入され、且つ関係する参考書類のリストを提供する。
本発明はさらに光制御可能な遺伝子発現システムを用いて宿主細胞において遺伝子発現を制御する方法を含み、
前記光制御可能な遺伝子発現システムを真核プラスミド発現ベクターに構築するステップａ）と、
制御される遺伝子を含有する宿主細胞を導入するステップｂ）と、
光照射で前記宿主細胞を誘導して、前記宿主細胞における調製されるヌクレオチドを発現させるステップｃ）と、を含む。光照射によって宿主細胞を誘起する方法は光源の選択及び光源の使用を含む。光源はＬＥＤ灯、白熱灯、蛍光灯、レーザを含むが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態において、光源は青色ＬＥＤ（４６０−４７０ｎｍ）を選択した。光照射方法は光照射量、光照射強度、光照射時間、光照射周波数及び走査、投影、光金型などの方法を用いて空間において標的遺伝子の発現を制御することも本発明の範囲に含まれる。本発明の１つの実施形態において、光照射強度が０−０．８Ｗ／ｍ２に変動し、本発明の他１つの具体的な実施例において、光照射の総量が異なり、即ち同様な光照射強度及び光照射総時間であり、それぞれ３０ｓ毎に１ｓ光照射し、６０ｓ毎に１ｓ光照射し、１２０ｓ毎に１ｓ光照射するの光照射周波数で光照射して誘起を行い、本発明の他１つの実施形態において、印刷の投影シートを光金型とし、空間において異なる位置の細胞の標的遺伝子の発現レベルを調節し、本発明のもう１つの実施形態において、中性灰色フィルターを光金型とし、空間において異なる位置の細胞の標的遺伝子の発現レベルを調節する。
本発明はさらにＩ型糖尿病の遺伝子治療方法を提供し、治療の必要な哺乳動物（ヒトを含む）に対して請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システムを付与して治療を行うことを含む。
以下、実施例によって本発明に対してさらに説明する。これらの実施例は本発明の説明にのみ用いられるものであり、本発明の範囲に対していかなる制限をしない。本分野の当業者は以下の実施例に基づいて、具体的な状況に応じて略修正及び変更を行えれば本発明を成功に実施できるが、これらの修正及び変更は全て本発明の請求項の範囲内に含まれるべきである。
実施例に使用される方法、機器設備及び試薬
実施例には主に通常の遺伝子工程分子生物学クロナル及び細胞生物学方法を使用しており、例えば、Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ等の「分子生物学実験参考マニュアル」とＪＯＳＥＰＨ ＳＡＭＢＲＯＯＫ、Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ作成、黄培堂等訳の「分子クロナル実験指南」（第３版、２００２年８月、科学出版社出版、北京）、Ｊ Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ等作成、李慎濤等訳「簡明蛋白質科学実験指南」（科学出版社、背景）における関連セクションを参照する。
実施例に使用したｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＧＡポリペプチド７、ｐＧＢＫＴ７プラスミドベクターがＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入され、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｙｇｒｏ、ｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯプラスミドベクターがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入される。ｐＧ５ｌｕｃ、ｐＢＩＮＤ、ｐＡＣＴベクターがＰｒｏｍｅｇａ社から購入され、共に真核発現ベクターである。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｙｇｒｏ及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１が哺乳動物細胞において標的蛋白を発現するための真核発現ベクターを構築することに用いられ、二者は共にＣＭＶプロモーターを有し、前者はハイグロマイシン抵抗性遺伝子を有し、後者はネオマイシン抵抗性遺伝子を有する。ｐＧＡポリペプチド７がＧａ１４転写活性化ドメイン遺伝子を有し、ｐＢＩＮＤが酵母菌Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメイン遺伝子を有し、ｐＡＣＴがＶＰ１６転写活性化ドメイン遺伝子を有する。ｐＧ５ｌｕｃがＧａ１４オペロン、ＴＡＴＡ最小プロモーター及びホタルルシフェラーゼＦｌｕｃ遺伝子を有する。ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰがＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入され、ｈｒＧＦＰ遺伝子を含有する。ｐＧｌｕｃ−ｂａｓｉｃがＮＥＢ社から購入され、Ｇｌｕｃ遺伝子を含有する。ｐＴＲＩＰＺプラスミドがＯｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から購入され、ＳＶ４０プロモーター配列を含有する。ｐＣＤＦＤｕｅｔ１プラスミドがＮｏｖａｇｅｎ社から購入され、ＬａｃＩ遺伝子を含有する。
ＰＣＲに使用される全てのプライマーが共に上海生工生物工程技術有限公司によって合成、純化され且つ質量スペクトル法によって確認されたものである。本発明の実施例において構築された発現プラスミドは共に配列測定され、配列測定が華大遺伝子公司にって完成される。本発明の実施例に使用されるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが東盛生物から購入され、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが天根生化科技（北京）有限公司から購入され、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼがＴａＫａＲａ公司から購入され、３種のポリメラーゼの購入する時は共に対応するポリメラーゼ緩衝液及びｄＮＴＰが付帯に贈与される。ＢｓｒＧＩ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ等制限酵素、Ｔ４リガーゼ、Ｔ４ホスホリラーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）がＦｅｒｍｅｎｔａｓ社から購入され、購入する時に１０×ＴａｎｇｏＴＭ緩衝液等が付加された。実施例において使用されるＣｌｏｎｅＥＺ ＰＣＲクローン試薬キットは南京金斯瑞生物科技有限公司から購入される。特別な声明をしない限りに、無機塩類の化学試薬は全て国薬集団上海化学試剤公司から購入されたものである。カナマイシン、アンピシリン、ＰＮＰＧ，ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）及びジチオトレイトール（ポリペプチドＴ）がＡｍｅｒｅｓｃｏ社から購入され、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ＡＴＰ、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）がＡｌｆａ社から購入され、Ｇｌｕｃ検出試薬キットがＮＥＢ社から購入され、Ｄ−ルシフェリン カリウム塩がＳｙｎｃｈｅｍ社から購入され、ＥＧＴＡがＢＢＩ社から購入され、Ｔｒｉｚｏｌ試薬、トリプシン（Ｔｒｐｓｉｎ−ＥポリペプチドＡ）、特級ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｏｐｔｉ−ｍｅｍ培地、ペニシリン／ストレプトマイシン二重抗体がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、各種のアミノ酸が上海生工生物有限公司から購入され、ＯＮＰＧがＳｉｇｍａ社から購入され、ＤＭＥＭ高グルコース（フェノールレッド無し／フェノールレッド有り）がＨｙｃｌｏｎｅ社から購入される。特に説明しない限りに，細胞培養の使い捨て器材がＣｏｒｎｉｎｇ社から購入される。２０ｍｍ直径のガラス底細胞シャーレがＮＥＳＴ社から購入される。３８４ウェル発光検出ホワイトボード、３８４ウェル発光検出クラックボードがＧｒｅｎｉｅｒ社から購入される。９６正方形孔細胞培養ボードがＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入される。
実施例において使用されるＤＮＡ純化試薬キットがＢＢＩ社（カナダ）から購入され、一般プラスミドエクストラクションキットが天根生化科技（北京）有限公司から購入され、形質転換クラスプラスミドエクストラクションキットがＯｍｅｇａ社から購入され、ＲＮＡエクストラクションキットがＴｉａｎｇｅｎ社から購入され、ＩｍｐｒｏｍＩＩ逆転写試薬キットがＰｒｏｍｅｇａ社から購入され、ＤＣ蛋白定量試薬キットがＢｉｏ−ｒａｄ社から購入される。大腸菌Ｍａｃｈ１がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、大腸菌ＪＭ１０９がＰｒｏｍｅｇａ社から購入され、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）がＮｏｖａｇｅｎ社から購入され、細胞系ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ３Ｔ３がＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関）から購入され、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）が広西師範大学資源及び環境学専門Ｃｈｅｎ Ｂｉｎ先生から贈与され、出芽酵母ＡＨ１０９がＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入され、ＢＹ４７４１がＯｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から購入される。Ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ、４−ＯＨＴａｍｘｏｉｆｅｎがＳｉｇｍａ社から購入され、ＭｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅがＣａｙｍａｎ社から購入される。
主要機器：Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マルチモードリーダー（米国Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社）、Ｘ−１５Ｒ高速冷凍遠心機（米国Ｂｅｃｋｍａｎ社）、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ２２Ｒテーブル型高速冷凍遠心機（米国Ｂｅｃｋｍａｎ社）、ＰＣＲ増幅装置（ドイツＢｉｏｍｅｔｒａ社）、生体内画像形成システム（米国Ｋｏｄａｋ社）。光度計が日本和光（Ｓａｎｗａ）社から購入され、核酸電気泳動装置（上海申能博博彩公司）、Ｔｉシステム倒立型蛍光顕微鏡（日本Ｎｉｋｏｎ社）、四機能紫外分析装置（上海嘉鵬公司）。血糖値計がＲｏｃｈｅ社から購入される。
本文における縮写の含意が以下の通りである：ｈ＝時間、ｍｉｎ＝分間、ｓ＝秒、ｄ＝日、μＬ＝マイクロリットル、ｍＬ＝ミリリットル、Ｌ＝リットル、ｂｐ＝塩基対、ｍＭ＝ミリモル、μＭ＝マイクロモル。
本発明実施例において使用される一部の遺伝子配列がＮＣＢＩ（米国国立生物技術情報センター）検索ネットまたは相応する遺伝子の携わる商業化プラスミドの購買する会社の公式サイトから得られる。各の蛋白コード遺伝子を検索する具体的なサイトが以下の通りである。
Ｇｌｕｃ（ガウシアルシフェラーゼ）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＡＡＧ５４０９５．１）
ｈｒＧＦＰ（ヒト緑色蛍光蛋白）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＹ６１３９９６．１）
Ｆｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｐＧ５ｌｕｃ．ｔｘｔ）
Ｇａｌ４：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＣ＿００１１４８？ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｅｎｂａｎｋ＆ｆｒｏｍ＝ ７９７１１＆ｔｏ＝ ８２３５６＆ｓｔｒａｎｄ＝ｔｒｕｅ）
ＶＰ１６（単純疱疹ウイル顆粒蛋白１６）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｐＡＣＴ．ｔｘｔ）
ＮＦ−κＢ ｐ６５：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／２３９５８３４９？ｒｅｐｏｒｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ）
ＶＩＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＦ３３８４１２．１）
Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ１（フォトトロピン１）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／２７５４８２２？ｒｅｐｏｒｔ＝ ｇｅｎｂａｎｋ＆ｌｏｇ＄＝ｎｕｃｌｔｏｐ＆ｂｌａｓｔ＿ｒａｎｋ＝１＆ＲＩＤ＝Ｐ４９ＲＰＣＡＲ０１Ｓ）
Ａｕｒｅｏｃｈｒｏｍｅ１（アウロクローム１）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＢ２５２５０４．１）
Ｇｃｎ４（酵母通用制御蛋白４）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＣ＿００１１３７？ｒｅｐｏｒｔ＝ ｇｅｎｂａｎｋ＆ｆｒｏｍ＝１３８９１８＆ｔｏ＝１３９７６３＆ｓｔｒａｎｄ＝ｔｒｕｅ）
ＬａｃＩ（乳糖オペロン抑制蛋白）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＣ＿０００９１３？ｒｅｐｏｒｔ＝ ｇｅｎｂａｎｋ＆ｆｒｏｍ＝３６５６５２＆ｔｏ＝３６６７３４＆ｓｔｒａｎｄ＝ｔｒｕｅ）
ＬｅｘＡ：（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ｅｃｏｌｉ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ？ｔｙｐｅ＝ＧＥＮＥ＆ｏｂｊｅｃｔ＝ＥＧ１０５３３）
ＥＹＦＰ（増幅型黄色蛍光蛋白）：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／３７５５１７９５）
ＢｍＥｃＲ（カイコ脱皮ホルモン受容体）：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／２９０５６０６６３？ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｅｎｂａｎｋ＆ｌｏｇ＄＝ｎｕｃｌｔｏｐ＆ｂｌａｓｔ＿ｒａｎｋ＝２＆ＲＩＤ＝Ｋ３Ｚ８ＷＸＴＷ０１Ｒ
ｈＰＲ（ヒトプロゲステロン受容体）：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／３２１１１７１４９？ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｅｎｂａｎｋ＆ｌｏｇ＄＝ｎｕｃｌｔｏｐ＆ｂｌａｓｔ＿ｒａｎｋ＝１＆ＲＩＤ＝Ｋ３ＺＤＫＴＢ９０１Ｒ
ＥＲ（エストロゲン受容体）：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／１７０２９５７９８？ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｅｎｂａｎｋ＆ｌｏｇ＄＝ｎｕｃｌｔｏｐ＆ｂｌａｓｔ＿ｒａｎｋ＝１＆ＲＩＤ＝Ｋ３ＺＰＷ１ＭＴ０１Ｒ
本発明実施例において使用される他一部の遺伝子配列が、ＮＩＢＣ（米国国立生物技術情報センター）またはＵｎｉｐｒｏｔ（全地球蛋白資源エータベース）検索サイトからそのアミノ酸配列を索引した後、ＤＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ２．０ソフトウエアによってアミノ酸配列を宿主細胞種属コドンバイアスに基づいてヌクレオチド配列に転換する。各の蛋白コード遺伝子を検索するサイトが以下の通りである。
ｃＩ（λオペロン抑制蛋白）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０３０３４）
ＴｅｔＲ（Ｔｎ１０ Ｂ ｃｌａｓｓ，テトラサイクリン抑制因子）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０４４８３）
ｍＣｈｅｒｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＹ６７８２６４．１）
実施例１：ＶＰ１６またはｐ６５またはＫＲＡＢを第３ポリペプチドとする本発明の組み換え光感受性転写因子遺伝子を含有する哺乳動物細胞発現ベクターのそれぞれ構築すること：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図４に示す。ＰＣＲ法で、以下のプライマーＰ１、Ｐ２を使用してｐＢＩＮＤプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）におけるＧａ１４（１〜６５位置アミノ酸）遺伝子を増幅し、以下のプライマーＰ３、Ｐ４を使用してｐＡＣＴプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）におけるＶＰ１６転写活性化ドメイン遺伝子を増幅する。Ｔｒｉｚｏｌ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を用いてニューロスポーラの完全ゲノムを抽出した後、以下のプライマーＰ５、Ｐ６を使用してそのうちのＶＩＶＩＤ遺伝子を増幅する。得たＶＩＶＩＤ遺伝子は２つのイントロン配列を有し、以下のプライマーＰ７、Ｐ８及びＰ９、Ｐ１０を使用して、逆方向ＰＣＲ（方法は図３を参照する）で増幅して該イントロン配列を除去し、ｃＤＮＡ（配列番号２１を参照する）を得る。オーバーラップＰＣＲ法によってＧａｌ４、ＶＩＶＩＤ−３６及びＶＰ１６、この３つの遺伝子を連結し（図８）、その後Ｅｃｏ４７ＩＩＩ及びＢｓｒＧＩ、２種類の酵素で切断してｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）内に連結し、得た哺乳動物細胞発現プラスミドはｐＧＡＶＶ（ＷＴ）と命名され、それは組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ＶＰ１６融合蛋白遺伝子（融合蛋白はＧＡＶＶ（ＷＴ）と略する）を含み、その核酸及びアミノ酸配列が配列番号３及び配列番号４であり、そのうち、ＶＩＶＩＤが１〜３６位置アミノ酸の除去された短い切断体であり、後ろの実施例の全ての融合蛋白におけるＶＩＶＩＤが共に短い切断体ＶＩＶＩＤ−３６であるため、再び説明しない。オーバーラップＰＣＲの構築する時に、Ｇａ１４とＶＩＶＩＤとの間に１つのＢｇｌＩＩ酵素の切断サイトを有し、ＶＩＶＩＤとＶＰ１６との間に１つのＥｃｏＲＩ酵素の切断サイトを有する。
Ｇａ１４遺伝子を増幅するプライマーが以下の通りである。
上流プライマー（Ｐ１）：５’−ＣＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣ ＧＡＡＣＡ−３’
下流プライマー（Ｐ２）：５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＣ−３’
ＶＰ１６遺伝子を増幅するプライマーが以下の通りである。
上流プライマー（Ｐ３）：５’−ＣＡＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＣ ＧＡＣ−３’
下流プライマー（Ｐ４）：５’−ＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣ−３’
ＶＩＶＩＤ遺伝子を増幅するプライマーが以下の通りである。
上流プライマー（Ｐ５）：５’−ＡＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧ−３’
下流プライマー（Ｐ６）：５’−ＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＣ−３’
ＶＩＶＩＤイントロン配列を除去する２セットのプライマーがそれぞれ以下の通りである。
イントロン１の除去：
上流プライマー（Ｐ７）：５’−ＣＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＴＧＡＣＣＣＴＣＧＡＡＣＣＧＣＧＣＣＣ−３’
下流プライマー（Ｐ８）：５’−ＣＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＡＴ−３’
イントロン２の除去：
上流プライマー（Ｐ９）：５’−ＡＴＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＣ−３’
下流プライマー（Ｐ１０）：５’−ＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＣＣＧ−３’
ｐ６５転写活性化ドメインを第３ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子遺伝子を構築するため、まずＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で添付文書の方法に基づいてＨＥＫ２９３細胞における総ｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で該ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、さらにプライマーＰ１１及びＰ１２を使用してＮＦ−κＢ ｐ６５遺伝子におけるｐ６５ＡＤ（ＰＣＲ結果は図９を参照する）を増幅し、その後ＥｃｏＲＩ及びＢｓｒＧＩ、２種類の酵素で前記構築されたｐＧＡＶＶ（ＷＴ）プラスミドを切断し、そのうちのＶＰ１６遺伝子をｐ６５遺伝子に切り換え、融合蛋白Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ｐ６５組み換え遺伝子を含有する（融合蛋白がＧＡＶＰ（ＷＴ）と略され、そのコード核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１及び番号３２である）哺乳動物細胞プラスミドを構築し、ｐＧＡＶＰ（ＷＴ）と命名され、ＷＴが野生型を指す。
ｐ６５遺伝子を増幅するプライマーが以下の通りである。
上流プライマー（Ｐ１１）：５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧ−３’
下流プライマー（Ｐ１２）：５’−ＴＧＴＡＣＡＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧ−３’
ＫＲＡＢを第３ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子融合蛋白Ｇａｌ４−ＶＩ
ＶＩＤ−ＫＲＡＢを構築するため、上海捷瑞公司を依頼して両端にそれぞれＥｃｏＲＩ及びＢｓｒＧＩサイトを有するＫＲＡＢ遺伝子を全遺伝子人工に合成し、２種類の酵素で切断した後実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）プラスミドのｐ６５ＡＤ遺伝子をＫＲＡＢ遺伝子に切り換え、Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ＫＲＡＢ（Ｃ７１Ｖ）、ＧＡＶＫ（Ｃ７１Ｖ）と略される融合蛋白を含有することを構築し、そのコード核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号５７及び５８であり、該組み換え融合蛋白遺伝子を含有するプラスミドがｐＧＡＶＫ（Ｃ７１Ｖ）と命名される。
前記プラスミドの構築を完成した後、配列測定によって挿入した配列が完全に正確であることが検証され、形質転換クラスのプラスミドエクストラクションキットによってプラスミドを抽出し、次の形質転換実験に使用されることになる。
実施例２：ＶＩＶＩＤ突然変異体またはＡｓＬＯＶ２またはＡｕＬＯＶを第２ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子遺伝子を含有する哺乳動物細胞発現ベクターのそれぞれ構築すること：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図４に示す。Ｐ１３とＰ１４、Ｐ１５とＰ１６、Ｐ１７とＰ１８、３対のプライマーを使用し、実施例１により構築されたｐＧＡＶＰ（ＷＴ）をパターンとし、逆方向ＰＣＲ法で、ＶＩＶＩＤにＣ７１ＶまたはＹ５０ＷまたはＮ５６Ｋ、３種の点突然変異をそれぞれ導入した組み換えＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ｐ６５融合蛋白遺伝子を構築し、得た哺乳動物細胞発現プラスミドはそれぞれｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）、ｐＧＡＶＰ（Ｙ５０Ｗ）及びｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ）プラスミド［縮写ＧＡＶＰ＝Ｇａｌ４ のＤＮＡ結合ドメイン−ＶＩＶＩＤ（１−３６位置アミノ酸欠如及び点突然変異含有）−ｐ６５転写活性化ドメイン］と命名される。構築する時に使用されるプライマー配列がそれぞれ以下の通りである。
ｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）：
上流プライマー（Ｐ１３）：５’−ＧＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＣＧ−３’
下流プライマー（Ｐ１４）：５’−ＴＧＡＣＧＴＧＴＣＡＡＣＡＧＧＴＣＣＣ−３’
ｐＧＡＶＰ（Ｙ５０Ｗ）：
上流プライマー（Ｐ１５）：５’−ＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣ−３’
下流プライマー（Ｐ１６）：５’−ＣＡＧＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＡＡＣＣＧＣ−３’
ｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ）：
上流プライマー（Ｐ１７）：５’−ＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＡＧ−３’
下流プライマー（Ｐ１８）：５’−ＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣ−３’
また、まず単一点突然変異体ＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）を構築し、さらにそれをベースに同様な方法によってＮ５６Ｋ突然変異を行い、二重突然変異を含有するｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを構築した。組み換えＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）、ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ）、ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）、ＧＡＶＰ（Ｙ５０Ｗ）融合蛋白のコード核酸配列がそれぞれ配列番号３３、３５、３７、３９で、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号３４、３６、３８、４０である。
フォトトロピン１のＬＯＶ２ドメイン（ＡｓＬＯＶ２と略し、そのｃＤＮＡは米国テキサス大学西南医学中心ダラスキャンパスＧａｒｄｎｅｒ実験室によって贈与される）を構築するため、プライマーＰ１９、Ｐ２０を使用してＰＣＲによってＡｓＬＯＶ２遺伝子を増幅し（ＰＣＲの結果は図１０を参照する）、その後ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ、２種類の酵素で、実施例１により構築されたｐＧＡＶＰ（ＷＴ）プラスミドを切断し、そのうちのＶＩＶＩＤ遺伝子をＡｓＬＯＶ２遺伝子に切り換える。構築された組み換えＧａｌ４−ＡｓＬＯＶ２−ｐ６５融合蛋白遺伝子を含有するプラスミドがｐＧＡＬＰと命名される（該融合蛋白がＧＡＬＰと略され、そのコード核酸及びアミノ酸配列が配列番号４３及び配列番号４４を参照する）。
ＡｓＬＯＶ２遺伝子を増幅するプライマーが以下の通りである。
上流プライマー（Ｐ１９）：５’−ＣＴＴＴＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＣＴＴＧＡＡＣ−３’
下流プライマー（Ｐ２０）：５’−ＣＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＴＣ−３’
アウロクローム（Ａｕｒｅｏｃｈｒｏｍｅ）のＬＯＶドメイン（ＡｕＬＯＶと略し、そのｃＤＮＡは日本滋賀県立命館大学Ｈｉｒｏｎａｏ Ｋａｔａｏｋａ実験室によって贈与される）を構築するため、プライマーＰ２１、Ｐ２２を使用してＰＣＲによってＡｕＬＯＶ遺伝子を増幅し（ＰＣＲの結果は図１１を参照する）、その後ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ、２種類の酵素で、実施例１により構築されたｐＧＡＶＰ（ＷＴ）プラスミドを切断し、そのうちのＶＩＶＩＤ遺伝子をＡｕＬＯＶ遺伝子に切り換える。構築された組み換えＧａｌ４−ＡｕＬＯＶ−ｐ６５融合蛋白遺伝子を含有するプラスミドがｐＧＡＡＰと命名される（該融合蛋白がＧＡＡＰと略され、そのコード核酸及びアミノ酸配列が配列番号４７及び配列番号４８を参照する）。
ＡｕＬＯＶ遺伝子を増幅するプライマーが以下の通りである。
上流プライマー（Ｐ２１）：５’−ＣＴＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＴＧＡＴ−３’
下流プライマー（Ｐ２２）：５’−ＣＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＧＣＡＡＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣ−３’
前記プラスミドの構築を完成した後、配列測定によって挿入した配列が完全に正確であることが検証され、形質転換クラスのプラスミドエクストラクションキットによってプラスミドを抽出し、次の形質転換実験に使用されることになる。
実施例３：異なるリンカーペプチドによって第１及び第２ポリペプチドを連結する組み換え光感受性転写因子遺伝子を含有する哺乳動物細胞発現ベクターの構築：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図４に示す。実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（ＷＴ）をベースに、第１と第２ポリペプチドとの間のリンカーペプチドに対して変更を行う。ｐＧＡＶＰ（ＷＴ）をパターンとし、プライマーＰ２５〜Ｐ２８を使用して逆方向ＰＣＲ法で、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間に異なるリンカーペプチドを導入する。得た哺乳動物細胞発現プラスミドはそれぞれｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−９、ｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−１１、ｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−１２と命名される。相応する組み換えＧＡＶＰ（ＷＴ）−９、ＧＡＶＰ（ＷＴ）−１１、ＧＡＶＰ（ＷＴ）−１２融合蛋白のコード核酸配列がそれぞれ配列番号５９、６１、６３で、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号６０、６２、６４である。使用されるプライマー配列が以下の通りである。
ｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−９
上流プライマー（Ｐ２３）：５’−ＡＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧ−３’
下流プライマー（Ｐ２４）：５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＣ−３’
ｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−１１
上流プライマー（Ｐ２５）：５’−ＡＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧ−３’
下流プライマー（Ｐ２６）：５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＣ−３’
ｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−１２
上流プライマー（Ｐ２７）：５’−ＴＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣＧ−３’
下流プライマー（Ｐ２８）：５’−ＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＣＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＣＣＴＴＧ−３’
前記プラスミドの構築を完成した後、配列測定によって挿入した配列が完全に正確であることが検証され、形質転換クラスのプラスミドエクストラクションキットによってプラスミドを抽出し、次の形質転換実験に使用されることになる。
実施例４：ターゲット転写ユニット（そのうちの標的遺伝子が異なる）を含有する哺乳動物細胞発現ベクターの構築：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図５に示す。Ｇｌｕｃ標的遺伝子を含有するターゲット転写ユニットを構築するため、以下のプライマーを使用してＰＣＲによってそれぞれ商品化ｐＧ５ｌｕｃベクターにおける５×ＵＡＳＧ−ＴＡＴＡヌクレオチド配列（ＴＡＴＡがアデノウイルス主要後期プロモーターの略称である）及び購入した商品化のｐＧｌｕｃ−ｂａｓｉｃベクターにおけるＧｌｕｃ標的遺伝子を増幅し、オーバーラップＰＣＲによって連結し、さらにＮｒｕＩ及びＢａｍＨＩ酵素を使用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈｙｇｒｏベクターにおける組成型ＣＭＶプロモーターを切除してその他の骨格を保留し、その後同族組み換え連結法によって前記オーバーラップＰＣＲ生成物を該ベクターに連結し、ｐＵ５Ｇｌｕｃプラスミドを得、それには５×ＵＡＳＧ−ＴＡＴＡ−Ｇｌｕｃ標的遺伝子配列によって構成された完全なターゲット転写ユニットを含み、該ターゲット転写ユニットの全体配列が配列番号８９である。
以下のようにＦｌｕｃ遺伝子、緑色蛍光蛋白ｈｒＧＦＰ遺伝子を含有し、または赤色蛍光蛋白ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を含有するターゲット転写ユニットをそれぞれ構築する。
以上のように得たｐＵ５ＧｌｕｃプラスミドにおけるＧｌｕｃ標的遺伝子の両端にはそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ酵素の切断サイトを有する。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ ２種類の酵素で、購入した商品化のｐＧ５ｌｕｃプラスミドにおけるＦｌｕｃ遺伝子を切断し、同時に、前記２種類の酵素でｐＵ５Ｇｌｕｃプラスミドを切断し、そのうちのＧｌｕｃ遺伝子をＦｌｕｃ遺伝子に切り換え、ｐＧ５Ｆｌｕｃプラスミドを得、それにはＦｌｕｃ標的遺伝子の含有する完全ターゲット転写ユニット５×ＵＡＳＧ−ＴＡＴＡ−Ｆｌｕｃを含む。
類似な方法で、プライマーＰ２９、Ｐ３０を使用してＰＣＲによってｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）における緑色蛍光蛋白ｈｒＧＦＰ遺伝子を増幅し、また、プライマーＰ３１、Ｐ３２を使用してＰＣＲによって人工合成された赤色蛍光蛋白ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を増幅して、ｐＵ５ｈｒＧＦＰ及びｐＵ５ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを得、それらにはそれぞれｈｒＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有するターゲット転写ユニット５×ＵＡＳＧ−ＴＡＴＡ−ｈｒＧＦＰ及び５×ＵＡＳＧ−ＴＡＴＡ−ｍＣｈｅｒｒｙを含有する。ＦｌｕｃまたはｈｒＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙを標的遺伝子とするターゲット転写ユニットの配列はそれぞれ配列番号８６、８７、８８である。
ｈｒＧＦＰ増幅：
上流プライマー（Ｐ２９）：５’−ＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧ−３’
下流プライマー（Ｐ３０）：５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣ ＴＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣ−３’
ｍｃｈｅｒｒｙ増幅：
上流プライマー（Ｐ３１）：５’−ＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’
下流プライマー（Ｐ３２）：５’−ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧ−３’
サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターを含有するターゲット転写ユニットを構築するため、プライマーＰ３３、Ｐ３４を使用してＰＣＲによってｐＴＲＩＰＺプラスミド（Ｏｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）におけるＳＶ４０プロモーターを増幅し、ＫｐｎＩ単一の酵素でｐＧ５ｌｕｃプラスミドを切断し、その後同族組み換え連結法によってＳＶ４０プロモーターをｐＧ５ｌｕｃプラスミドに挿入し、応答要素の上流にＳＶ４０プロモーターを含有するターゲット転写ユニットのプラスミドを得、ｐＳＵ５Ｆｌｕｃと命名し、該ターゲット転写ユニット配列は配列番号９０に示す。
上流プライマー（Ｐ３３）：５’−ＴＣＧＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴ−３’
下流プライマー（Ｐ３４）：５’−ＴＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＡＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ−３’
Ｉｎｓｕｌｉｎレポーター遺伝子を含有するプラスミドを構築するため、出願者が上海捷瑞公司からＩｎｓｕｌｉｎ遺伝子を全遺伝子人工合成し、且つＩｎｓｕｌｉｎ遺伝子の両端にはそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ酵素の切断サイトを有する。この２つの酵素で本実施例により構築されたｐＵ５ＧＬｕｃプラスミドを切断し、Ｇｌｕｃ遺伝子を直接Ｉｎｓｕｌｉｎに切り換え、ｐＵ５−Ｉｎｓｕｌｉｎプラスミドを得、Ｉｎｓｕｌｉｎの核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１３７及び１３８である。
前記プラスミドの構築を完成した後、配列測定によって挿入した配列が完全に正確であることが検証され、形質転換クラスのプラスミドエクストラクションキットによってプラスミドを抽出し、次の形質転換実験に使用されることになる。
実施例５：Ｇａｌ４、ＬｅｘＡ、ｃＩ、ＴｅｔＲ及びＧｃｎ４を第１ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子の遺伝子を含有する出芽酵母発現ベクターのそれぞれ構築すること：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図６に示す。Ｇａ１４を第１ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の融合蛋白遺伝子を含有するプラスミドベクターを構築するため、酵母でｐＧＡポリペプチド７プラスミドをツーハイブリッドする上で、プライマーＰ３５、Ｐ３６を使用してＰＣＲによってｐＧＡポリペプチド７を増幅して、そのもののマルチクローニングサイト（ＭＣＳサイト）及びＧａ１４ＡＤ配列を除去する。プライマーＰ３７、Ｐ３８を使用してＰＣＲによって実施例２に構築されたｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターにおけるＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を増幅し、同族組み換え連結技術を使用して該Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）断片を増幅によって得た線形化ｐＧＡポリペプチド７ベクターに挿入し、ｐＧＡＤ−ＧＶ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを得る。該プラスミドが中間プラスミドであり、第３ポリペプチド（例えばＧａ１４ＡＤ）が加えられた組み換え光感受性転写因子を含有する酵母発現プラスミドの構築に用いられることができる。
同族組み換え実験において、ｐＧＡポリペプチド７そのもののマルチクローニングサイト及びＧａｌ４ＡＤ配列を除去することに用いられるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ３５）：５’−ＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣ−３’
下流プライマー（Ｐ３６）：５’−ＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＴＧ−３’
Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を増幅することに用いられるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ３７）：５’−ＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧ ＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣ−３’
下流プライマー（Ｐ３８）：５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧ−３’
以下のプライマーＰ３９、Ｐ４０（２種の異なる長さのリンカーペプチドを含有するコードヌクレオチド配列）、Ｐ４１を使用して、ＰＣＲによって、ｐＧＡポリペプチド７プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）におけるＧａｌＡＤ遺伝子を増幅して、２種の異なる長さのリンカーペプチドを含有するＧａｌ４ ＡＤ配列を得、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩを使用して、それに対して２種類の酵素で切断を行い、同様にその２種類の酵素で切断されたｐＧＡＤ−ＧＶ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドに連結する。２種の異なる長さのリンカーペプチド（Ｌ１及びＬ２）によって連結される組み換えＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ−Ｌ１（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）及びＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ ＡＤ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有する発現プラスミドｐＧＡＤ−ＧＶＧ−Ｌ１（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）及びｐＧＡＤ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを得る。この２種類の融合蛋白のコード核酸配列が配列番号９７及び９９であり、アミノ酸配列が配列番号９８及び１００である。
２種の異なる長さのリンカーペプチドＧａｌ４ＡＤを増幅する上流プライマー配列がそれぞれ：
リンカーペプチドＬ１（Ｐ３９）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’
リンカーペプチドＬ２（Ｐ４０）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴ−３’
下流プライマーが共に（Ｐ４１）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’である。
プライマーＰ４２、Ｐ４３を使用してｐＧＡポリペプチド７ ベクターに対してＰＣＲ増幅を行い、得た線形化プラスミド断片にはＰＡＤＨ１プロモーター配列が欠如しており、プライマーＰ４４及びＰ４５を使用してｐＺＦ１／２−ＦＲＥＴプラスミド（米国マディソンのウィスコンシン大学のＤａｖｉｄ Ｊ．Ｅｉｄｅ実験室から贈与される）からＰＭＡ１プロモーター遺伝子断片を増幅し、さらに同族組み換え連結技術を使用してＰＭＡ１プロモーター遺伝子断片を線形化のｐＧＡポリペプチド７ベクターに連結し、改造された後のベクターがｐＧＰＭＡと命名され、該ベクターは開始能力のより強いＰＭＡ１プロモーターを有し、転写因子融合蛋白の発現量を向上できる。該ｐＧＰＭＡベクターをベースに以下のプラスミドを構築する：まずＰ４６及びＰ４７プライマーを使用してＰＣＲによって該ベクターを増幅し、その後前記ｐＧＡＤ−ＧＶ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを構築する同様な方法を使用して、同族組み換え連結技術を使用してＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を該ｐＧＰＭＡベクターに挿入し、組み換えＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有する中間ｐＧＰＭＡ−ＧＶ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを得ることによって、後ろの酵母発現プラスミドを構築する。
異なるリンカーペプチドを含有する該組み換え光感受性転写因子の実験における効果を観察し、効果の比較的よいリンカーペプチドをスクリーニングして次の実験を行うように、６種の異なる長さコードヌクレオチド配列を含有するプライマーＰ４８〜Ｐ５４を使用し、ＰＣＲによってｐＧＡＤ−ＧＶ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドにおけるＧａｌ４ＡＤ配列を増幅し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ２種の酵素で増幅配列を切断し、同様に２種の酵素で切断されたｐＧＰＭＡ−ＧＶ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドと連結させ、それぞれ６種の異なる長さのリンカーペプチド（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５またはＬ６）を含有する組み換えＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ−Ｌｎ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子のプラスミドベクターを得、それそれ以下の通りに命名する。
ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ１（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；
ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ３（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ４（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）
ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ５（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ６（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）
各の融合蛋白のコードヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号９７、９９、１０１、１０３、１０５及び１０７で、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号９８、１００、１０２、１０４、１０６及び１０８である。
ｐＧＡポリペプチド７ベクターを増幅してそれを線形化させるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ４２）：５’−ＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡ−３’
下流プライマー（Ｐ４３）：５’−ＣＡＴＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧ−３’
ＰＭＡ１プロモーター遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ４４）：５’−ＴＴＣＧＴＴＧＣＴＴＧＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣ−３’
下流プライマー（Ｐ４５）：５’−ＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’
ｐＧＰＭＡベクターを増幅してそれを線形化させるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ４６）：５’−ＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣ−３’
下流プライマー（Ｐ４７）：５’−ＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴ−３’
Ｇａｌ４ＡＤを増幅することに用いられる６種の異なる長さのリンカーペプチドコードヌクレオチド配列を含有する上流プライマーが異なっており、それらの配列は以下の通りである。
リンカーペプチドＬ１−（Ｐ４８）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’
リンカーペプチドＬ２−（Ｐ４９）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴ−３’
リンカーペプチドＬ３−（Ｐ５０）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧ−３’
リンカーペプチドＬ４−（Ｐ５１）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧ−３’
リンカーペプチドＬ５−（Ｐ５２）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧ−３’
リンカーペプチドＬ６−（Ｐ５３）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧ−３’
下流プライマーは共に（Ｐ５４）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’である。
ＬｅｘＡを第１ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子ＮＬＳ−ＬｅｘＡ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）融合蛋白遺伝子の発現ベクターを構築するため、以下のプライマーＰ５５及びＰ５６を使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムからＬｅｘＡ（１−８７）遺伝子断片を増幅し（ＰＣＲ結果は図１２を参照する）、プライマーＰ５７及びＰ５８を使用して、実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターにおいてＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を増幅し、さらにオーバーラップＰＣＲによってＬｅｘＡ（１−８７）とＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を連結してＬｅｘＡ−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を得る。プライマーＰ５９及びＰ６０を使用して、ＰＣＲによってｐＧＡポリペプチド７プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）におけるＳＶ４０核定位シグナル（ＮＬＳ）遺伝子断片を増幅し、さらにオーバーラップ ＰＣＲによってＬｅｘＡ−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片とＮＬＳ遺伝子断片を連結してＮＬＳ−ＬｅｘＡ−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を得る。プライマーＰ６１及びＰ６２を使用して、本実施例により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターを増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ２種類の酵素で切断し得た線形化ベクターを、同様に前記２種類の酵素で切断されたＮＬＳ−ＬｅｘＡ−ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）断片と連結させて、ｐＧＰＭＡ−ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）発現ベクターを得、該ベクターは組み換えＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有し、該融合蛋白のコード核酸配列及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７及び８に示す。
ＬｅｘＡ（１−８７）遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ５５）：５’−ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧＣ−３’
下流プライマー（Ｐ５６）：５’−ＡＧＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＧ−３’
ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ５７）：５’−ＧＧＴＧＡＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣ−３’
下流プライマー（Ｐ５８）：５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧ−３’
ＮＬＳ遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ５９）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣ −３’
下流プライマー（Ｐ６０）：５’−ＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＣ−３’
ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを増幅しそれを線形化させるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ６１）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧ−３’
下流プライマー（Ｐ６２）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＧＧＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’
出芽酵母細胞においてＬａｃＩを第１ポリペプチドとする組み換え転写因子ＮＬＳ――ＬａｃＩ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＮＬｃＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）を発現するため、相応する出芽酵母菌の発現ベクターを構築することが必要である。以下のプライマーＰ６３及びＰ６４を使用し、ＰＣＲによって商品化したｐＣＤＦＤｕｅｔ１プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）におけるＬａｃＩのＤＮＡ結合ドメイン（１〜６２位置アミノ酸）遺伝子断片を増幅し（ＰＣＲ結果は図１３を参照する）、また、プライマーＰ６５及びＰ６６を使用し、ＰＣＲによって商品化ｐＧＡポリペプチド７ベクターにおけるＮＬＳ遺伝子断片を増幅し、さらにオーバーラップ ＰＣＲ法によってＬａｃＩ遺伝子断片とＮＬＳ遺伝子断片を連結し、ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ２種類の酵素で切断し得たＮＬＳ−ＬａｃＩ遺伝子断片を、同様に前記２種類の酵素で切断された、本実施例により構築されたｐＧＰＭＡ−ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターに連結させる。得た発現ベクターがｐＧＰＭＡ−ＮＬｃＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と命名され、該プラスミドは組み換え転写因子ＮＬｃＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有し、そのコード核酸及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１１及び１２である。
ＬａｃＩのＤＮＡ結合ドメイン遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ６３）：５’−ＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣ−３’
下流プライマー（Ｐ６４）：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＧＣＣ−３’
ＮＬＳ遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ６５）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣ−３’
下流プライマー（Ｐ６６）：５’−ＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＣ−３’
ｃＩを第１ポリペプチドとする組み換え転写因子ＮＬＳ−ｃＩ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子のプラスミドベクターを発現するため、以下のプライマーＰ６７及びＰ６８を使用し、ＰＣＲによって上海捷瑞生物有限公司により全遺伝子合成されたｃＩのＤＮＡ結合ドメイン（１〜１０２位置アミノ酸）遺伝子断片を増幅する（ＰＣＲ結果は図１４を参照する）。また、プライマーＰ６９及びＰ７０を使用し、ＰＣＲによって商品化ｐＧＡポリペプチド７プラスミドにおけるＮＬＳ遺伝子断片を増幅し、さらにオーバーラップ ＰＣＲ法によってｃＩ遺伝子断片とＮＬＳ遺伝子断片を連結する。ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ２種類の酵素で切断し得たＮＬＳ−ｃＩ遺伝子断片を、同様に前記２種類の酵素で切断された、本実施例により構築されたｐＧＰＭＡ−ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターに連結させ、得た発現ベクターがｐＧＰＭＡ−ＮＣＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と命名され、該ベクターは組み換え転写因子ＮＣＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有し、該転写因子のコード核酸及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１９及び２０である。
ｃＩのＤＮＡ結合ドメイン遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ６７）：５’−ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣ−３’
下流プライマー（Ｐ６８）：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＡＴＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＡＡＧＡＣＧ−３’
ＮＬＳ遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ６９）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣ−３’
下流プライマー（Ｐ７０）：５’−ＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＣ−３’
組み換え転写因子ＮＬＳ−ＴｅｔＲ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＮＴＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）融合蛋白遺伝子を含有するプラスミドベクターを構築するため、以下のプライマーＰ７１及びＰ７２を使用し、ＰＣＲによって上海捷瑞生物有限公司により全遺伝子合成されたＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン（１〜６３位置アミノ酸）遺伝子断片を増幅する（ＰＣＲ結果は図１５を参照する）。また、プライマーＰ７３及びＰ７４を使用し、ＰＣＲによって商品化ｐＧＡポリペプチド７プラスミドにおけるＮＬＳ遺伝子断片を増幅し、オーバーラップ ＰＣＲ法によってＴｅｔＲ遺伝子断片とＮＬＳ遺伝子断片を連結する。ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩ２種類の酵素でＮＬＳ−ＴｅｔＲ遺伝子断片を切断し得た後、それを、同様に２種類の酵素で切断された、本実施例により構築されたｐＧＰＭＡ−ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターに連結させ、得た発現ベクターがｐＧＰＭＡ−ＮＴＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と命名され、該ベクターは組み換え転写因子ＮＬＳ−ＴｅｔＲ−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有し、該融合蛋白はＮＴＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略され、そのコード核酸及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１５及び１６である。
ＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ７１）：５’−ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＡＧＧＣＴＡＧＡＴＡＡＧ−３’
下流プライマー（Ｐ７２）：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣ−３’
ＮＬＳ遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ７３）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣ−３’
下流プライマー（Ｐ７４）：５’−ＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＣ−３’
前記プラスミドを構築完成した後、配列測定によって挿入した配列が完全に正確であることが検証され、形質転換クラスのプラスミドエクストラクションキットによってプラスミドを抽出し、次の酵母菌形質転換実験に使用する。
実施例６：ＶＩＶＩＤ突然変異体及びＡｓＬＯＶ２を第２ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子遺伝子を含有する出芽酵母発現ベクターをそれぞれ構築すること：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図６に示す。ＶＩＶＩＤ突然変異体を第２ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子融合蛋白遺伝子を含有する発現ベクターを構築するため、実施例５により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターをＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ、２種類の酵素で切断し、そのうちのＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を除去し、その後それぞれ実施例３により構築されたｐＧＡＶＰ（ＷＴ）、ｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）、ｐＧＡＶＰ（Ｙ５０Ｗ）をパターンとし、以下のプライマーＰ７５、Ｐ７６を使用してＰＣＲによってそのうちのＶＩＶＩＤ（ＷＴ）、ＶＩＶＩＤ（Ｃ７１Ｖ）、ＶＩＶＩＤ（Ｙ５０Ｗ）を増幅し、それらを、ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片が切除されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｙ５０Ｗ）発現ベクターに連結させ、それぞれｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（ＷＴ）、ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｃ７１Ｖ）及びｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｙ５０Ｗ）発現ベクターを得、それらにはそれぞれ組み換えＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（ＷＴ）（ＧＶＧ（ＷＴ）と略する）、Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｃ７１Ｖ）（ＧＶＧ（Ｃ７１Ｖ）と略する）及びＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ（Ｙ５０Ｗ）（ＧＶＧ（Ｙ５０Ｗ）と略する）融合蛋白遺伝子を含有し、それらのコード核酸配列がそれぞれ配列番号１１３、１１５、１１７で、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１４、１１６、１１８である。
ＶＩＶＩＤ遺伝子断片またはその突然変異体遺伝子断片を増幅することに用いられるプライマー配列が：
上流プライマー（Ｐ７５）：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧ−３’
下流プライマー（Ｐ７６）：５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧ−３’
ＡｓＬＯＶ２を第２ポリペプチドとする組み換え転写因子Ｇａｌ４−ＡｓＬＯＶ２−Ｇａｌ４ＡＤ（ＧＬＧと略する）融合蛋白遺伝子を含有する発現ベクターを構築するため、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩを使用して、実施例６により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターを切断し、そのうちのＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を除去し、その後、実施例２により構築されたｐＧＡＬＰをパターンとし、以下のプライマーＰ７７及びＰ７８を使用して、ＰＣＲによってそのうちのＡｓＬＯＶ２遺伝子断片を増幅し、それを、ＶＩＶＩＤ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片が切除されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターに連結させ、ｐＧＰＭＡ−ＧＬＧと命名された発現ベクターを得、該ベクターは組み換え光感受性転写因子ＧＬＧ融合蛋白遺伝子を含有し、該融合蛋白のコード核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１９及び１２０である。
ＡｓＬＯＶ２遺伝子を増幅することに用いられるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ７７）：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＣＴＴ−３’
下流プライマー（Ｐ７８）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＴＣ−３’
前記プラスミドを構築完成した後、配列測定によって挿入した配列が完全に正確であることが共に検証され、形質転換クラスのプラスミドエクストラクションキットによってプラスミドを抽出し、次の酵母菌形質転換実験に使用する。
実施例７：ＶＰ１６またはＧｃｎ４を第３ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子遺伝子を含有する出芽酵母発現ベクターの構築
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図６に示す。ＶＰ１６を第３ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−ＶＰ１６（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）融合蛋白遺伝子を含有する発現ベクターを構築するため、プライマーＰ７９及びＰ８０を使用して、ＰＣＲによって実施例２により構築されたｐＧＡＶＶ（ＷＴ）ベクターにおけるＶＩＶＩＤ−ＶＰ１６（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を増幅し、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ２種類の酵素で切断した後、それを、同様に前記２種類の酵素で切断された実施例により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターに連結させる。得た発現ベクターがｐＧＰＭＡ−ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と命名され、それは組み換え光感受性転写因子ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有し、そのコード核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１０９及び１１０である。
ＶＩＶＩＤ−ＶＰ１６（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ７９）：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＣＧＣＴＣＣＣＧ−３’
下流プライマー（Ｐ８０）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＧＧＧ−３’
Ｇｃｎ４を第３ポリペプチドとする組み換え転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇｃｎ４（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）（ＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と略する）融合蛋白遺伝子を含有する発現ベクターを構築するため、プライマーＰ８１及びＰ８２を使用して、ＰＣＲによって出芽酵母ＢＹ４７４１ゲノムにおけるＧｃｎ４の転写活性化ドメイン遺伝子断片を増幅し（ＰＣＲの結果は図１６を参照する）、また、プライマーＰ８３及びＰ８４を使用して、ＰＣＲによって、実施例６により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターを増幅し、得た線形化ベクター断片の両端にはＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ酵素の切断サイトを含有し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ２種類の酵素で切断した後、それを同様に前記２種類の酵素で切断されたＧｃｎ４の転写活性化ドメイン遺伝子断片と連結させる。得た発現ベクターがｐＭＰＭＡ−ＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）と命名され、それには組み換えＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）融合蛋白遺伝子を含有し、そのコード核酸及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１１１及び１１２である。
Ｇｃｎ４の転写活性化ドメイン遺伝子断片を増幅するプライマーが：
上流プライマー（Ｐ８１）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＣＧＡＡＴＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴ−３’
下流プライマー（Ｐ８２）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＡＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＴＴＡＴＣ−３’
ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを増幅し、それを線形化させるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ８３）：５’−ＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣ−３’
下流プライマー（Ｐ８４）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣ−３’
前記プラスミドを構築完成した後、配列測定によって挿入した配列が完全に正確であることが共に検証され、形質転換クラスのプラスミドエクストラクションキットによってプラスミドを抽出し、次の形質転換実験に使用する。
実施例８：Ｇａｌ４、ＬｅｘＡ、ｃＩ、ＴｅｔＲ及びＧｃｎ４の相応する応答要素のターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母発現ベクターをそれぞれ構築すること：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図７に示す。Ｇａ１４を第１ポリペプチドとする本発明の組み換え光感受性転写因子のＥＹＦＰ蛍光蛋白遺伝子転写に対する制御効果を検出するため、Ｇａ１４の相応する応答要素及び蛍光蛋白遺伝子のターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母発現ベクターをそれぞれ構築する。プライマーＰ８５及びＰ８６を使用し、ＰＣＲによってｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を増幅し、得た線形化プラスミドベクター骨格にはＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ酵素の切断サイトを含有する。プライマーＰ８７及びＰ８８を使用し、ＰＣＲによってｐＺＦ１／２−ＦＲＥＴプラスミド（米国ＭａｄｉｓｏｎのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ大学のＤａｖｉｄ Ｊ．Ｅｉｄｅ実験室によって贈与される）におけるＥＹＦＰ遺伝子断片を増幅し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ２種類の酵素で切断した後、それを、同様に２種類の酵素で切断されたｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯ線形化プラスミドに連結させ、５×ＵＡＳＧ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰ遺伝子のターゲット転写因子を含有する出芽酵母発現ベクターｐＹＥ−ＥＹＦＰを得、そのヌクレオチド配列が配列番号１２１である。
ｐＹＥＳ２．１ ＴＯＰＯプラスミドを増幅してそれを線形化させることに使用されるプライマーの配列が：
上流プライマー（Ｐ８５）：５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＣＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＣＡＣＣ−３’
下流プライマー（Ｐ８６）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣＴＴＡＡＴＡＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧ−３’
蛍光蛋白ＥＹＦＰ遺伝子を増幅することに使用されるプライマー配列が：
ＥＹＦＰ上流プライマー（Ｐ８７）：５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧ−３’
ＥＹＦＰ下流プライマー（Ｐ８８）：５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’
ターゲット転写ユニットにおいて異なる個数のＧａ１４応答要素を含有することの、組み換え光感受性転写因子のＥＹＦＰ遺伝子転写に対する調節の効果に差異があるか否かを検出するため、異なる個数のＧａ１４応答要素のターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母発現プラスミドを構築した。本実施例により構築されたｐＹＥ−ＥＹＦＰプラスミドにおいて、ターゲット転写ユニットには５つのＧａ１４応答要素、すなわち５×ＵＡＳＧを含有する。それぞれ以下のプライマーＰ８９〜Ｐ９２を使用し、ＰＣＲによって増幅し、ターゲット転写ユニットにそれぞれ１つ、２つ及び４つのＧａ１４識別／結合領域が欠如された３つのｐＹＥ−ＥＹＦＰ発現ベクターを得、それぞれｐＹＥ−ＥＹＦＰ（１×ＵＡＳＧ）、ｐＹＥ−ＥＹＦＰ（３×ＵＡＳＧ）及びｐＹＥ−ＥＹＦＰ（４×ＵＡＳＧ）と命名し、それらにはそれぞれ１×ＵＡＳＧ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰ、３×ＵＡＳＧ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰまたは４×ＵＡＳＧ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰターゲット転写ユニットを含有し、各のターゲット転写ユニットの核酸配列がそれぞれ配列番号１２２、１２３及び１２４である。増幅に使用される上流プライマーが異なり、下流プライマーが同様で、プライマーの配列が以下の通りである。
汎用下流プライマー（Ｐ８９）：５’−ＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣ−３’
上流プライマー１（Ｐ９０）：５’−ＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＡＧＡＣ−３’
上流プライマー２（Ｐ９１）：５’−ＡＣＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＴＣＧ−３’
上流プライマー３（Ｐ９２）：５’−ＧＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣ−３’
ＬｅｘＡを第１ポリペプチドとする本発明の組み換え光感受性転写因子のＥＹＦＰ蛍光蛋白遺伝子転写に対する制御効果を検出するため、ＬｅｘＡの相応する応答要素のターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母発現プラスミドを構築した。以下のプライマーＰ９３及びＰ９４を使用し、ＰＣＲによって本実施例により構築されたｐＹＥ−ＥＹＦＰプラスミドを増幅することによって、ｐＹＥ−ＥＹＦＰプラスミドにおける５×ＵＡＳＧ配列を除去して、得た線形化プラスミド断片をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ２種類の酵素で切断し、その後該生成物を以下の２つのプライマーのアニーリング生成物と連結させ、ＥＹＦＰ遺伝子を含有する発現ベクターを得、ｐＹＥＬ４−ＥＹＦＰと命名し、それには４×ＬｅｘＡ ＵＡＳ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰのターゲット転写ユニットを含有し、そのヌクレオチド配列が配列番号１２５である。
ｐＹＥ−ＥＹＦＰプラスミドを増幅してそれを線形化させることに使用されるプライマーが：
上流プライマー（Ｐ９３）：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧ−３’
下流プライマー（Ｐ９４）：５’−ＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＣ−３’
アニーリング２プライマーが：
上流プライマー（Ｐ９５）：５’−ＴＣＧＡＧＧＧＣＧＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴ ＡＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡＧＧＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＧＴＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＴＴＣＡ−３’
下流プライマー（Ｐ９６）：５’−ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＧＴＡＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧ ＣＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＣＧＣＣＣ−３’
ＬａｃＩを第１ポリペプチドとする本発明の光誘起転写因子のＥＹＦＰ蛍光蛋白遺伝子転写に対する制御効果を検出するため、ＬａｃＩ応答要素のターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母発現ベクターを構築した。本実施例により構築されたｐＹＥＬ４−ＥＹＦＰベクターに対してＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ２種類の酵素で切断することを行い、その後以下の２つのプライマーＰ９５及びＰ９６のアニーリングで得た遺伝子断片と連結させ、得たＥＹＦＰレポーター遺伝子含有の発現ベクターがｐＹＥＬｃ４−ＥＹＦＰと命名され、それには４×ＬａｃＩ ＵＡＳ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰターゲットターゲット転写ユニットを含有し、その核酸配列が配列番号１２６である。
アニーリング２プライマーが：
上流プライマー（Ｐ９７）：５’−ＴＣＧＡＧ ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ ＡＡ ＴＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＡ−３’
下流プライマー（Ｐ９８）：５’−ＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡ ＴＴＣＡ ＡＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣ−３’
ｃＩを第１ポリペプチドとする本発明の組み換え光感受性転写因子のＥＹＦＰ蛍光蛋白遺伝子転写に対する制御効果を検出するため、ｃＩの相応する応答要素のターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母発現ベクターを構築した。本実施例により構築されたｐＹＥＬ４−ＥＹＦＰプラスミドをＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ２種類の酵素で切断して、その後以下の２つのプライマーのアニーリング生成物と連結させ、得たＥＹＦＰレポーター遺伝子含有のプラスミドがｐＹＥＰＲ−ＥＹＦＰと命名され、それにはＰＲＵＡＳ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰターゲット転写ユニットを含有し、そのヌクレオチド配列が配列番号１２７である。
アニーリング２プライマーが：
上流プライマー（Ｐ９９）：５’−ＴＣＧＡＧＴＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＣＴＡＡＣＡＣＣＧＴＧＣＧ ＴＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＡ−３’
下流プライマー（Ｐ１００）：５’−ＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＣＡＣＧＣ ＡＣＧＧＴＧＴＴＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＴＡＧＡＴＴＴＡＣ−３’
ＴｅｔＲを第１ポリペプチドとする本発明の組み換え光感受性転写因子のＥＹＦＰ蛍光蛋白遺伝子転写に対する制御効果を検出するため、ＴｅｔＲの相応する応答要素のターゲット転写ユニットを含有する出芽酵母発現ベクターを構築した。本実施例により構築されたｐＹＥＬ４−ＥＹＦＰベクターをＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ２種類の酵素で切断して得た遺伝子断片を以下の２つのプライマーＰ９９及びＰ１００とアニーリング連結させて、得たＥＹＦＰ遺伝子含有の発現ベクターがｐＹＥＴ４−ＥＹＦＰと命名され、それには４×ＴｅｔＲ ＵＡＳ−Ｇａｌ１−ＥＹＦＰターゲット転写ユニットを含有し、そのヌクレオチド配列が配列番号１２８である。
アニーリング２プライマーが：
上流プライマー（Ｐ１０１）：５’−ＴＣＧＡＧ ＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣ ＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＡ−３’
下流プライマー（Ｐ１０２）：５’−ＡＧＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣ ＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣ−３’
実施例９：異なる第５ポリペプチドの組み換え光−ホルモン二重制御転写因子を含有する哺乳動物発現ベクターの構築：
本実施例により構築されたプラスミドの説明図は図４に示す。ＰＣＲ法を使用し、プライマーＰ１０３、Ｐ１０４によってｐＣＳ２−ＧＶＶＥｃＲ Ｆ’プラスミド（米国カリフォルニア州スタンフォード大学医学院Ｊａｍｅｓ Ｋ Ｃｈｅｎ実験室によって贈与される）におけるＥｃＲ（カイコ脱皮ホルモン受容体）遺伝子蛋白配列結合領域２７２〜６０６位置アミノ酸を増幅し、以下のプライマーＰ１０５、Ｐ１０６を使用し、ＥＲ−ＣＲＥプラスミド（中国科学院上海神経科学研究所熊志奇テーマグループによって贈与される）におけるＥＲ（エストロゲン受容体蛋白配列結合領域）遺伝子を増幅し、以下のプライマーＰ１０７、Ｐ１０８を使用し、ｐＳｗｉｔｃｈプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）におけるｈＰＲ（フラボノイド類ホルモン蛋白受容体６４０〜８９１位置アミノ酸）遺伝子を増幅する。その後ＭｌｕＩ及びＳｐｅＩ、２種類の酵素で切断し、それぞれＥｃＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子、ｈＰＲ遺伝子を実施例２により構築されたＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドに連結する。得た哺乳動物発現プラスミドがｐＧＡＶＰＥｃＲ、ｐＧＡＶＰＥＲ、ｐＧＡＶＰｈＰＲと命名され、そのコードヌクレオチド及びアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１３１、１３３、１３５及び配列番号１３２、１３４、１３６を参照する。使用されるプライマー配列が：
ｐＧＡＶＰＥｃＲ：
上流プライマー（Ｐ１０３）：ＧＡＣＴＡＣＧＣＧＴＡＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＧＴＧＴＣＡＴＡＣＡＧ
下流プライマー（Ｐ１０４）：ＧＡＣＴＡＣＴＡＧＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＴＧ
ｐＧＡＶＰＥＲ：
上流プライマー（Ｐ１０５）：ＧＡＣＴＡＣＧＣＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧ
下流プライマー（Ｐ１０６）：ＧＡＣＴＡＣＴＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣ
ｐＧＡＶＰｈＰＲ：
上流プライマー（Ｐ１０７）：ＧＡＣＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＴＡＡＡＧＴＣＡＧＡＧＴＴＧＴＧ
下流プライマー（Ｐ１０８）：ＧＡＣＴＡＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧ
実施例１０：組み換え光感受性転写因子の、哺乳動物細胞において標的遺伝子発現に対する調節：
本実施例における細胞は共にＣＯ２インキュベータにおいてウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びストレプトマイシンとペニシリンを含有する高グルコース培地（ＤＭＥＭ）で培養され、生長が８０〜９０％集密度に至る時に細胞を継代培養する。形質転換する時に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用し、添付文書に基づいて操作を行う。Ｆｌｕｃの活性測定はＪａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ等の「分子生物学実験参考マニュアル」を参照する。Ｇｌｕｃの活性測定はＮＥＢ社の相応する製品説明書に従って操作を行う。実施例１１、１３、１４、１５も同様な実験方法を使用した。
Ｆｌｕｃをレポータ遺伝子とし、実施例により構築された、ＶＩＶＩＤ及びその突然変異体を第２ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子の光刺激後標的遺伝子発現に対する調節を測定した。形質転換する前に、ＨＥＫ２９３細胞を同様な密度で２つの４８ウェルプレートに継代し、１６ｈ後細胞の集密度が９０〜９５％に至る時に、実施例４により構築されたｐＵ５Ｆｌｕｃ及び実施例２により構築されたｐＧＡＶＶ（ＷＴ）、またはｐＧＡＶＰ（ＷＴ）、またはｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）、またはｐＧＡＶＰ（Ｙ５０Ｗ）、またはｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ）、またはｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ＋Ｎ５６Ｋ）、またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入する）を使用してＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ共同に形質転換し、２つの４８ウェルプレートの操作が同様である。その後１つのプレートは光を避けて培養し、他１つは形質転換した後の６ｈから光照射培養を行い、光源は前に言及した青色ＬＥＤであり、３０ｓ毎に１ｓ光照射し、２２ｈ後活性Ｆｌｕｃレベルを測定する。結果は、組み換え光感受性転写因子のない細胞孔は、暗中及び光照射条件下の相対発光強度が共に非常に低く、形質転換されなかった細胞に接近することを示した。前記複数種の組み換え光感受性転写因子を発現する細胞光照射群のＦｌｕｃ発現量が共に暗中群より高く、光照射後これらの組み換え光感受性転写因子が標的遺伝子の細胞における発現レベルを調節できることを表明した。具体的は、ＧＡＶＰ（ＷＴ）の発現する細胞を光照射すると標的遺伝子発現レベルが暗中細胞の１３倍で、ＧＡＶＰ（ＷＴ）の発現する細胞を光照射するとＦｌｕｃ発現レベルが、ＧＡＶＶ（ＷＴ）の発現する細胞を光照射することよりＦｌｕｃ発現レベルが何十倍も高く、ｐ６５ＡＤを第３ポリペプチドとする組み換えＧＡＶＰ（ＷＴ）転写因子がより強い転写活性化能力を備えることを表明した（図１７）。第２ポリペプチドが複数種のＶＩＶＩＤ突然変異体である組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）、ＧＡＶＰ（Ｎ５６キロ）、ＧＡＶＰ（Ｙ５０Ｗ）、ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）により引き起こされる誘起発現倍数が共にそれぞれの程度で野生型ＶＩＶＩＤ含有の組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（ＷＴ）より高く、そのうち、ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）二重突然変異組み換え光感受性転写因子により引き起こされる誘起発現の倍数が最も高く、約２００倍も高くなることができる（図１８）。前記複数種のＶＩＶＩＤまたはその突然変異体を第２ポリペプチドとする光感受性転写因子が、光照射された後共に標的遺伝子の発現レベルを上向き調節できる。
本発明のシステムは複数種の哺乳動物細胞に応用されることができる。Ｆｌｕｃを例とし、プラスミドｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）及びプラスミドｐＵ５Ｆｌｕｃを使用してＮＩＨ３Ｔ３またはＣＯＳ−７細胞をそれぞれ共形質転換する。本実施例の第１区切りに記載される方法と同様な方法を使用して細胞培養、形質転換、光照射誘起、細胞処理及び発現の活性Ｆｌｕｃ検出を行う。結果は、ＮＩＨ３Ｔ３またはＣＯＳ−７細胞において組換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の細胞を発現し、光照射はＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞の標的遺伝子（Ｆｌｕｃ）の発現レベルを上向き調節させた（図１９〜２０）ことを示した。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間に異なるリンカーペプチドの含有する組み換え光感受性転写因子の光照射後の標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、Ｆｌｕｃレポート遺伝子を例とし、プラスミドｐＵ５Ｆｌｕｃ及び実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−９またはｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−１１またはｐＧＡＶＰ（ＷＴ）−１２を取って、ＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、本実施例の第１区切りに記載される方法と同様な方法を使用して細胞培養、形質転換、光照射誘起、細胞処理及び発現の活性Ｆｌｕｃ検出を行う。結果は、組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（ＷＴ）−９、ＧＡＶＰ（ＷＴ）−１１、ＧＡＶＰ（ＷＴ）−１２が光照射された後、共に細胞におけるＦｌｕｃ発現レベルを上向き調節させることができるが、発現レベルの上向き調節の倍数がそれぞれ異なっており、そのうち、ＧＡＶＰ（ＷＴ）−１２の誘起発現倍数が最も高いことを示した（図２１）。
ＡｓＬＯＶ２を第２ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子の哺乳動物細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、Ｆｌｕｃレポータ遺伝子を例とし、実施例２により構築された組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＡｓＬＯＶ２−ｐ６５（ＧＡＬＰと略する）の光照射下で遺伝子発現に対する調節作用を測定した。プラスミドｐＵ５Ｆｌｕｃ及び実施例２により構築されたｐＧＡＬＰプラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、本実施例の第１区切りに記載される方法と同様な方法を使用して細胞培養、光照射誘起、細胞処理及び活性Ｆｌｕｃ検出を行う。結果は、光照射群細胞のＦｌｕｃ発現レベルは暗中群細胞より低く、暗中条件群における細胞の約半分であることを示した。組み換えＧＡＬＰ転写因子が光照射された後細胞における標的遺伝子の発現量を下向き調節させることができることを示した（図２２）。
ＡｕＬＯＶを第２ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子の哺乳動物細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、Ｆｌｕｃレポータ遺伝子を例とし、実施例２により構築された組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＡｕＬＯＶ−ｐ６５（ＧＡＡＰと略する）の光照射下で遺伝子発現に対する抑制作用を測定した。プラスミドｐＵ５Ｆｌｕｃ及び実施例２により構築されたｐＧＡＡＰプラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、本実施例の第１区切りに記載される方法と同様な方法を使用して細胞培養、光照射誘起、細胞処理及び活性Ｆｌｕｃ検出を行う。結果は、光照射細胞のＦｌｕｃ発現レベルは暗中細胞より高いことを示した。組み換えＧＡＡＰ転写因子が光照射された後細胞における標的遺伝子の発現量を上向き調節させることができることを示した（図２３）。
ＫＲＡＢを第３ポリペプチドとする組み換え光感受性転写因子の哺乳動物細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、Ｆｌｕｃレポータ遺伝子を例とし、実施例２により構築された組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＫ（Ｃ７１Ｖ）の光照射下で遺伝子発現に対する影響を測定した。実施例４により構築されたプラスミドｐＳＵ５Ｆｌｕｃ及び実施例１により構築されたｐＧＡＶＫ（Ｃ７１Ｖ）プラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、本実施例の第１区切りに記載される方法と同様な方法を使用して細胞培養、光照射誘起、細胞処理及び活性Ｆｌｕｃ検出を行う。結果は、組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＫ（Ｃ７１Ｖ）が光照射された後細胞におけるＦｌｕｃの発現レベルを下向き調節させることができることを示した（図２４）。
実施例１１：共形質転換された後安定に発現する組み換え光感受性転写因子の標的遺伝子発現に対する調節
組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）を安定に発現する細胞株を構築するため、実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ）プラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を形質転換し、４８ｈ形質転換した後ＨＥＫ２９３を取って１００ｍｍ直径シャーレに継代接種する。２４ｈ後Ｇ４１８ ６００μｇ／ｍＬ含有の培地に変更し、二日間毎に１回で変更し、３週間後生存していた単細胞を希釈法で選択してクローニングを行い、１０つのモノクロナル細胞株を得た。各のモノクロナル細胞を４８ウェルプレートに継代接種し、実施例４により構築されたｐＵ５Ｆｌｕｃを使用して形質転換を行うことによって、細胞が該組み換え光感受性転写因子を発現しているか否かを確認し、発現すれば、光照射細胞がＦｌｕｃ蛋白を発現できる。光照射誘起、細胞処理及び活性Ｆｌｕｃ測定が実施例１０と同様である。結果は、１０つのクロナル細胞において、クロナル２、４、５、６、９細胞が該組み換え光感受性転写因子を発現しており、そのうち、クロナル２細胞は光照射された後Ｆｌｕｃの発現レベルが最も高く、誘起発現倍数が該転写因子の細胞を瞬時に形質転換することと接近し、約３０倍である。によって細胞ゲノムに整合されて安定発現する組み換え光感受性転写因子遺伝子が、光照射後標的ゲノムの発現レベルを調整できることを表明した（図２５）。
実施例１２：組み換え光感受性転写因子の、出芽酵母細胞において標的遺伝子発現に対する調節
酵母菌発現のＥＹＦＰ蛍光蛋白の検出方法：酵母菌の形質転換プレートから相応するモノクロナールをそれぞれ選んで５ｍｌ新鮮なＳＣ培地に接種し、３０℃、振盪機２４０ｒｐｍで光を避けて一夜培養する。次の日それぞれ菌液５００μＬ／チューブを取って２つのそれぞれ４．５ｍｌ新鮮なＹＰＤＡ培地を含有するチューブに接種し、１つのチューブは青光で照射し、他１つのチューブはすず箔で被覆して暗中条件の対照とする。３０℃、２４０ｒｐｍ振動培養し細菌がＯＤ６００＝０．８−１．０まで生長した後、それぞれ５００μＬ菌液を取って１．５ｍｌ遠心チューブに移し、４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心して上澄み液を除去し、１ｍＬＰＢＳで細胞を再び浮遊させ、ＰＢＳを使用してさらに前記のように一回洗浄し、ＰＢＳによって約ＯＤ６００＝０．５まで再び浮遊させる（後ろの蛍光測定をより正確にするため）。光照射と暗中との対照がそれぞれ３等分を取り、各組の１００μＬ酵母菌ＰＢＳ浮遊液を９６ウェル黒プレートに加え、Ｂｉｏｔｅｋ社のマルチモードリーダーに置いてＥＹＦＰ蛍光値を測定し、励起光の波長が４８５ｎｍで、蛍光発射波長が５２８ｎｍであり、平均値を計算する。組み換え光感受性転写因子ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の出芽酵母細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、ＥＹＦＰレポート遺伝子を例とし、実施例５により構築された該組み換え光感受性転写因子の光照射下で遺伝子発現に対する影響を測定した。実施例５により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミド及び実施例８により構築されたｐＹＥ−ＥＹＦＰプラスミドを使用してＡＨ１０９細胞を共形質転換し、また、ｐＧＰＭＡヌルベクター及びｐＹＥ−ＥＹＦＰを使用してＡＨ１０９細胞を共形質転換して対照とする。光照射及び暗中培養細胞のＥＹＦＰ相対蛍光強度の差異を測定し、結果は、組み換え光感受性転写因子ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の発現するＡＨ１０９細胞を光照射することは標的遺伝子ＥＹＦＰの発現レベルの上向き調節を有効に至ったことを示した（図２６）。
組み換え光感受性転写因子ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の出芽酵母細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、ＥＹＦＰレポータ遺伝子を例とし、実施例７により構築された該組み換え光感受性転写因子の光照射下で遺伝子発現に対する影響を測定した。実施例７により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミド及び実施例８により構築されたｐＹＥ−ＥＹＦＰプラスミドを使用してＡＨ１０９細胞を共形質転換し、また、ｐＧＰＭＡヌルベクター及びｐＹＥ−ＥＹＦＰを使用してＡＨ１０９細胞を共形質転換して対照とする。光照射及び暗中培養細胞のＥＹＦＰ相対蛍光強度の差異を測定し、結果は、組み換え光感受性転写因子ＧＶＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の発現するＡＨ１０９細胞を光照射することは標的遺伝子ＥＹＦＰの発現レベルの向上を有効に至ったことを示した（図２７）。
組み換え光感受性転写因子ＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の出芽酵母細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、ＬａｃＺレポータ遺伝子を例とし、実施例７により構築された該組み換え光感受性転写因子の光照射下で遺伝子発現に対する影響を測定した。実施例７により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧｃ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを使用してＡＨ１０９細胞を形質転換し、また、ｐＧＰＭＡヌルベクターを使用してＡＨ１０９細胞を形質転換して対照とする。光照射及び暗中条件下培養細胞の発現する活性ＬａｃＺレベルの差異を測定し、測定方法はＣｌｏｎｔｅｃｈ社「Ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ」を参照する。結果は、組み換え光感受性転写因子ＧＶＧｃ （Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の発現するＡＨ１０９細胞を光照射することはＬａｃＺの発現レベルの向上に効果的に至り、誘起発現倍数が約１０であることを示した（図２８）。
異なるリンカーペプチドを含有する組み換え光感受性転写因子ＧＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ１７Ｖ）の酵母細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、実施例５により構築された以下の６種のプラスミドｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ１（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ３（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ４（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ５（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）；ｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ６（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を使用してそれぞれＡＨ１０９細胞を形質転換し、ｐＧＰＭＡヌルベクターを対照とする。光照射及び暗中培養細胞の活性ＬａｃＺ発現レベルの差異を測定し、結果は、異なるリンカーペプチドを含有する組み換え光感受性転写因子ＧＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ１７Ｖ）の発現するＡＨ１０９細胞を光照射することはそのＬａｃＺの発現レベルを調節でき、異なるリンカーペプチドの該組み換え光感受性転写因子の光照射された後に至るＬａｃＺ発現レベルが異なっており、そのうち、リンカーペプチドＬ１、Ｌ３及びＬ６を含有する該組み換え光感受性転写因子の至るＬａｃＺ発現レベルが比較的高く、即ち、リンカーペプチドＬ１、Ｌ３及びＬ６を含有する該組み換え光感受性転写因子の光照射された後の転写活性化能力が最も強いことを示した（図２９）。
組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤが出芽酵母細胞において発現量が異なる時に標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、実施例５により構築されたｐＧＡＤ−ＧＶＧ−Ｌ１（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）またはｐＧＡＤ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）またはｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ１（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）またはｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ−Ｌ２（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）発現ベクターをそれぞれ実施例８により構築されたｐＹＥ−ＥＹＦＰベクターと併用してＡＨ１０９細胞を共形質転換し、光照射及び暗中培養細胞のＥＹＦＰ相対蛍光強度の差異を測定する。ＰＭＡ１プロモーターの開始能力がＧａ１１プロモーターより強いため、ＰＭＡ１により開始された組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ融合蛋白のＡＨ１０９細胞における含有量がより高い。結果は、組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤ融合蛋白のＡＨ１０９細胞における含有量が高いほど、同様な条件下で細胞における標的遺伝子ＥＹＦＰの発現量がより高いことを示した（図３０）。
ＶＩＶＩＤ突然変異体を含有する組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤの出芽酵母細胞おける標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、それぞれ実施例６により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（ＷＴ）またはｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｃ７１Ｖ）またはｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｙ５０Ｗ）プラスミドを実施例８により構築されたｐＹＥ−ＥＹＦＰベクターと併用してＡＨ１０９細胞を共形質転換し、また、ｐＧＰＭＡヌルベクター及びｐＹＥ−ＥＹＦＰベクターを使用してＡＨ１０９細胞を形質転換して対照とする。光照射及び暗中培養細胞のＥＹＦＰ相対蛍光強度の差異を測定し、結果は、異なるＶＩＶＩＤ突然変異体を含有する組み換え光感受性転写因子Ｇａｌ４−ＶＩＶＩＤ−Ｇａｌ４ＡＤの発現するＡＨ１０９細胞を光照射することは共に標的遺伝子ＥＹＦＰの発現量の向上に至ることを示した（図３１）。
組み換え光感受性転写因子ＧＬＧの出芽酵母細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、ＬａｃＺレポータ遺伝子を例とし、実施例６により構築された該組み換え光感受性転写因子の光照射下で遺伝子発現に対する抑制作用を測定した。実施例６により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＬＧプラスミドを使用してＡＨ１０９細胞を形質転換し、また、ｐＧＰＭＡヌルベクターを使用してＡＨ１０９細胞を形質転換して対照とする。光照射及び暗中培養細胞の活性ＬａｃＺ発現レベルの差異を測定する。結果は、組み換え光感受性転写因子ＧＬＧを発現するＡＨ１０９細胞の光照射することは、標的遺伝子ＬａｃＺの発現量の降下に至り、誘起発現倍数が約０．８であることを示した（図３２）。
ターゲット転写ユニットに異なる個数のＧａ１４応答要素を含有する時に組み換え光感受性転写因子のＥＹＦＰ遺伝子転写に対する調節効果に差異があるか否かを測定するため、それぞれ実施例８により構築されたｐＹＥ−ＥＹＦＰ（１×ＵＡＳＧ）またはｐＹＥ−ＥＹＦＰ（３×ＵＡＳＧ）またはｐＹＥ−ＥＹＦＰ（４×ＵＡＳＧ）またはｐＹＥ−ＥＹＦＰプラスミドを実施例５により構築されたｐＧＰＭＡ−ＧＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）ベクターと併用して、ＢＹ４７４１細胞を共形質転換し、光照射及び暗中培養細胞のＥＹＦＰ相対蛍光強度の差異を測定し、結果は、Ｇａ１４応答の減少に伴って、同様な条件下で細胞内の標的蛋白ＥＹＦＰの発現量も連れに下げるが、誘起発現の倍数がほぼ変更しなかったことを示した（図３３）。
組み換え光感受性転写因子ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）、ＮＬｃＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）、ＮＣＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）及びＮＴＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の出芽酵母細胞において標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、それぞれ実施例５により構築されたｐＧＰＭＡ−ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）またはｐＧＰＭＡ−ＮＬｃＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）またはｐＧＰＭＡ−ＮＣＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）またはｐＧＰＭＡ−ＮＴＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを実施例８により構築された相応するｐＹＥＬ４−ＥＹＦＰ、ｐＹＥＬｃ４−ＥＹＦＰ、ｐＹＥＰＲ−ＥＹＦＰ、ｐＹＥＴ４−ＥＹＦＰベクターと併用してＡＨ１０９細胞を共形質転換し、光照射及び暗中培養細胞のＥＹＦＰ相対蛍光強度の差異を測定し、結果は、前記４種の組み換え光感受性転写因子が光照射された後共に標的蛋白ＥＹＦＰの発現量の向上に至り、そのうち、ＮＬＶＧ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の誘起発現倍数が最も高いことを示した（図３４）。
実施例１３：組み換え光感受性転写因子の発現する細胞を光照射することによって標的遺伝子発現を調節する特徴：
組み換え光感受性転写因子の標的遺伝子発現を調節する時間動態学及び可逆性を測定するため、実施例２により構築されたプラスミドｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を実施例４により構築されたプラスミドｐＵ５Ｇｌｕｃと併用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、細胞を３部に分け、同様な方法によって培養及び形質転換する。２部の細胞が形質転換された後１０ｈから光照射を行い、３０ｓ毎に１ｓ光照射し、そのうちの１部の細胞が１５ｈ光照射された後光を避けて培養して可逆群のサンプルとし、第３部が暗中に置いて暗中群サンプルとする。所定の時間で赤光灯下でサンプリングし、Ｇｌｕｃ発現レベルを測定し、方法は実施例１１に説明されるのと同様である。結果は、光照射群に対し、組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）を発現する細胞を光照射し、光照射を開始した後標的遺伝子Ｇｌｕｃの発現レベルが速く向上され、３ｈ、１２ｈ光照射した後、誘起発現倍数がそれぞれ３０倍、１００倍に達し、可逆群（光照射−暗中）に対し、１５ｈ光照射した後光照射を停止し、Ｇｌｕｃ発現レベルが発現されないまで徐々に減少されることを示した（図３５）。本発明の組み換え光感受性転写因子に至る標的遺伝子発現が時間の延長に伴って増加され、且つ可逆性を有し、光照射を除去した後遺伝子発現が徐々に閉鎖されることを表明した。
組み換え光感受性転写因子の異なる光照射量下で標的遺伝子発現に対する調節作用を測定するため、Ｆｌｕｃを例とし、実施例３により構築されたプラスミドｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）をプラスミドｐＵ５Ｆｌｕｃと併用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、細胞を２部に分け、同様な誘起条件の細胞サンプルは３つ重複しており、１部は６ｈ形質転換した後光照射を開始し、３０ｓ毎に１ｓ光照射し、光照射する時に中性灰色フィルターを使用して異なる孔の光照射強度を２倍に低減させる（日本和光公司光度計によって光照射強度を測定する）。２２ｈ後前記のように細胞調製分裂分解上澄み液を処理して活性Ｆｌｕｃレベル測定を行う。結果は、組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）に至られたＦｌｕｃ発現レベルの向上が光照射強度に決められたことを示した。本発明の組み換え光感受性転写因子により至られた遺伝子の発現レベルが光照射強度に決められることを表明した（図３６）。
組み換え光感受性転写因子の異なる光照射周波数下で標的遺伝子発現に対する調節作用を測定するため、プラスミドｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）をプラスミドｐＵ５Ｆｌｕｃと併用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、３部に分け、同様な誘起条件の細胞サンプルは３つ重複している。６ｈ形質転換した後それぞれ光照射を開始し、光源に連結するデジタル時間継電器の定時スイッチによって光照射及び総量を制御する。３部の細胞を異なるインキュベータ内に置き、同様な光照射総時間及び異なる光照射周波数を使用し、即ち３０ｓ毎に１ｓ光照射、６０ｓ毎に１ｓまたは１２０ｓ毎に１ｓ光照射する。２２ｈ後前記のように処理して活性Ｆｌｕｃレベルを測定する。結果は、３０ｓ毎に１ｓ光照射する細胞Ｆｌｕｃ発現量が最も高く、１２０ｓ毎に１ｓ光照射する細胞Ｆｌｕｃ発現量が最も低く、即ち光照射強度が同様である時に、光照射総量が高いほど、組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）に至られるＦｌｕｃの発現レベルが高いことを示した（図３７）。
組み換え光感受性転写因子の標的遺伝子発現に対する調節を直接観察するため、ｍＣｈｅｒｒｙ及びｈｒＧＦＰレポート遺伝子を例とし、ｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）をｐＵ５ｍＣｈｅｒｒｙとまたはｐＵ５ｈｒＧＦＰと一緒に使用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換して１０ｈ後光照射を開始し、１０ｍｉｎ毎に２０ｓ光照射する。２４ｈ後ニコン会社Ｔｉ系倒立型蛍光顕微鏡を使用して細胞に対して写真を撮る。結果は図３８及び３９を参照し、レポート遺伝子がｍＣｈｅｒｒｙまたはｈｒＧＦＰであり、光照射前後細胞の生長状態が同様であり、光照射した後蛍光蛋白ｍＣｈｅｒｒｙ発現を有する細胞が多くなり、その蛍光強度が背景より遥かに高く、蛍光蛋白発現を有する細胞が総数の５０％以上を占める。組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の蛍光蛋白発現量に対する調節をより直接観察するため、前記細胞画像形成後のサンプルを２８０μｌ細胞分裂分解液で分解分裂させた後、ＤＣ蛋白定量試薬キットを使用して各のサンプルに対して定量を行った後、等質量（１０μｇ）で１５％非還元ポリアクリルアミゾルにローディングし、２０ｍＡで２ｈ電気泳動した後Ｋｏｄａｋ社の生体画像形成装置を使用して撮影し（ｍＣｈｅｒｒｙ激励光波長が５５０ｎｍで、発射光波長が６００ｎｍで、ｈｒＧＦＰ激励光波長が４８０ｎｍで、発射光波長が５３５ｎｍである）、４×４ｂｉｎｎｉｎｇ、露光時間が５ｍｉｎである。非還元ポリアクリルアミゾル電気泳動の方法はＪＥ．科林根等著、李慎濤等訳「簡明蛋白質科学実験指南」、Ｐ３０３〜３０７を参照する。結果は図４０に示し、図中「＋」が「有」を示し、即ち該条件を使用またはこのような真核発現ベクターを添加することを指し、「−」が「無」を示す。明らかになったのは、ターゲット転写ユニットのみを含有し転写因子発現ベクターを含有しない場合、光照射の有無に関らず、共に蛍光蛋白発現がなく、一方、ターゲット転写ユニットと転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）とが同時に存在する場合、光照射サンプルの蛍光蛋白（ｍＣｈｅｒｒｙまたはｈｒＧＦＰ）の発現量が暗中群より遥かに高く、暗中群の条件がほぼ認められず、組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）は非誘起状態下で遺伝子発現量が低く、誘起された後転写活性化能力が強い特長をより一層で証明した。
ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）の方法を使用してＲＮＡレベルにおいて転写因子の転写されるべき核酸の転写に対する調節を測定するため、実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）及び実施例４により構築されたｐＵ５Ｆｌｕｃを使用して２４ウェルプレートにおいてＨＥＫ２９３細胞を共形質転換し、細胞培養、形質転換、誘起方法は実施例１０と同様である。その後Ｔｉａｎｇｅｎ社のＲＮＡエクストラクションキットを使用して説明文書に記載される方法に従ってこれらのサンプルの総ＲＮＡを抽出する。ルーチンの方法で定量を行った後、それぞれ０．５μｇ ＲＮＡを取ってＩｍｐｒｏｍＩＩ逆転写酵素を使用して操作説明文書に基づいてｃＤＮＡに逆転写する。設計プライマーＰ１０９、Ｐ１１０はＲＴ−ＰＣＲにＦｌｕｃのＲＮＡレベルを測定することに使用され、設計プライマーＰ１１１、Ｐ１１２はＲＴ−ＰＣＲにＡｃｔｉｎのＲＮＡレベルを測定することに使用される。Ａｃｔｉｎが発現量がほぼ外部条件に干渉されないハウスキーピング遺伝子であり、ＲＴ−ＰＣＲにおいて等しいローディング量の参照遺伝子とする。ＲＴ−ＰＣＲの増幅方法は普通のＰＣＲと同様であり、即ちＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して１ｋｂ／ｍｉｎの速度で２８つの循環を増幅する。結果は図４１に示し、ターゲット転写ユニットまたは光感受性転写因子の真核発現ベクターを単独に形質転換する時に、標的遺伝子ＦｌｕｃのＲＮＡの発現が検出されず、ターゲット転写ユニットまたは光感受性転写因子の真核発現ベクターを共形質転換する場合、光照射群は１条の非常に明るいバンドを有し、暗中群は１条のやや見えるバンドを有するため、光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）が光照射された後標的遺伝子の転写を活性化でき、光照射と暗中サンプルのＲＮＡレベルには顕著な差異が認められる。
ＰＴ−ＰＣＲでＦｌｕｃを確認するプライマー：
上流プライマー（Ｐ１０９）：５’−ＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧ−３’
下流プライマー（Ｐ１１０）：５’−ＣＧＡＡＡＴＧＣＣＣＡＴＡＣＴＧＴＴＧＡＧ−３’
ＲＴ−ＰＣＲでＡｃｔｉｎを確認するプライマー：
上流プライマー（Ｐ１１１）：５’−ＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣ−３’
下流プライマー（Ｐ１１２）：５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ−３’
実施例１４：組み換え光−ホルモン二重制御転写因子の哺乳動物細胞における標的遺伝子発現に対する調節：
組み換え光−ホルモン二重制御転写因子の哺乳動物細胞における標的遺伝子発現に対する調節を測定するため、Ｇｌｕｃをレポート遺伝子とし、ＨＥＫ細胞においてそれぞれ光照射、ＥｃＲ配位子ホルモン、ＥＲ配位子ホルモン、ｈＰＲ配位子ホルモンのレポータ遺伝子発現に対する影響を測定した。実施例９により構築された３種のプラスミドｐＧＡＶＰＥｃＲ、ｐＧＡＶＰＥＲ、ｐＧＡＶＰｈＰＲを実施例４により構築されたｐＵ５Ｇｌｕｃと併用して４８ウェルプレートにおいて２部の同様なＨＥＫ２９３細胞を共形質転換した。８ｈ光を避けて培養した後、赤灯下でそれぞれ相応する配位子ホルモン（ＥｃＲ：Ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ；ＥＲ：４−ＯＨＴａｍｘｏｉｆｅｎ；ｈＰＲ：Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）を加え、３種のホルモン薬物の最終濃度が共に１μＭである。その後１つのプレートはすず箔を被覆した後暗中インキュベータに入れて光を避けて培養し、他１つのプレートは光照射培養をし始め、光源は前に言及した青色ＬＥＤであり、３０ｓ毎に１ｓ光照射し、２２ｈ後上澄み液を取ってＧｌｕｃレベルを測定する。そのうち、ｐＵ５Ｇｌｕｃと共形質転換したｐＥＧＦＰ−Ｎ１の細胞孔が組み換え転写因子を含有せず、ターゲット転写因子のみを有する対照である。結果は、組み換え光感受性転写因子の有しない細胞孔は暗中か光照射か問わず、測定された相対発光強度が全て非常に低いことを示した。以上の３種の光−ホルモン二重制御転写因子を発現する細胞は光照射、配位子ホルモン薬物に添加れた後Ｇｌｕｃ発現量が、暗中＋配位子ホルモン未添加、暗中＋配位子ホルモン添加、光照射＋配位子ホルモン未添加の複数種条件の細胞Ｇｌｕｃ発現量より顕著に高く、組み換え光−ホルモン二重制御転写因子が光照射及びホルモンを通じて標的遺伝子の細胞における発現レベルを同時に調節できることを表明した。具体的な結果は、ＨＥＫ２９３細胞がｐＧＡＶＰＥｃＲ、ｐＧＡＶＰＥＲ、ｐＧＡＶＰｈＰＲに形質転換された後、暗中で配位子薬物の存在しない状況下で、光−ホルモン二重制御転写因子の形質転換された３種の細胞のＧｌｕｃ発現レベルが共に非常に低く、光−ホルモン二重制御転写因子のない発現レベルに接近し、一方、暗中また配位子薬物の存在するまたは光照射また配位子薬物の存在しない状況下で、ＨＥＫ２９３細胞Ｇｌｕｃの発現量が共に４〜５倍向上し、光照射及び相応する配位子薬物（ＥｃＲ：Ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ；ＥＲ：４−ＯＨＴａｍｘｏｉｆｅｎ；ｈＰＲ：Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）の存在する状況下で、ＨＥＫ２９３細胞Ｇｌｕｃの発現量が顕著に向上され、ｐＧＡＶＰＥｃＲに形質転換された細胞Ｇｌｕｃ発現量が暗中また配位子薬物の存在しない状況下より約１０００倍以上高く、ｐＧＡＶＰＥｃＲ細胞Ｇｌｕｃ発現量が暗中また配位子薬物の存在しない状況下より約５００倍高く、ｐＧＡＶＰＥｃＲ細胞Ｇｌｕｃが暗中また配位子薬物の存在しない状況下の約６０倍である（図４２を参照する）。３種の光−ホルモン二重制御転写因子が共に哺乳動物細胞の遺伝子発現制御に使用されることができることを表明した。
実施例１５：細胞において組み換え光感受性転写因子の空間における標的遺伝子発現に対する調節
一方、中性灰色フィルターを光金型として光照射強度を変更することによって組み換え光感受性転写因子の空間において標的遺伝子発現に対する調節を研究する。ｍＣｈｅｒｒｙレポータ遺伝子を例とし、ｐＵ５ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドをｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドと併用して９６正方形孔培養プレートにおけるＨＥＫ２９３細胞を共形質転換した後１０ｈ後光照射を開始し、３０ｓ毎に１ｓ光照射し、中性灰色フィルターで光照射強度を調節する。２４ｈ後培地を除去し、Ｋｏｄａｋ社の生体画像形成装置によって写真を取り（励起光波長が５５０ｎｍで、発射光波長が６００ｎｍである）、４×４ｂｉｎｎｉｎｇ、露光時間が５ｍｉｎである。結果は、中性灰色フィルターを使用しなかった孔細胞ｍＣｈｅｒｒｙの発現レベルが最も高く、使用された中性灰色フィルターの光強度を低減させる倍数の向上に伴って、光照射細胞のｍＣｈｅｒｒｙ発現量が下げられたことを示した（図４３）。
他一方、印刷した投影シートを光金型とし蛍光蛋白を発現する細胞に対して「撮影」することは、本発明のシステムが光照射を使用して空間において遺伝子の発現を制御できることを示した。黒色背景、白色文字の印刷図案「ＥＣＵＳＴ」を例とし、光度計の測定結果は、黒色背景の光透過率が透明位置の１／３０よりも低いことを示した。また、図案にはさらに１つのグレースケールバーを含む。２０ｍｍのガラスシャーレ（ＮＥＳＴ）に細胞を培養及び形質転換し、ｐＵ５ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド及びｐＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）プラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞を共形質転換して１０ｈ後光照射を開始し、３０ｓ毎に１ｓ光照射し、光照射を開始する前に適当なサイズの印刷図案をシャーレの下方に粘着する。２４ｈ光照射した後、培地を除去し、Ｋｏｄａｋ社の生体画像形成装置を使用して写真を撮り（励起光波長が５５０ｎｍで、発射波長が６００ｎｍである）、４×４ｂｉｎｎｉｎｇ、露光時間が５ｍｉｎである。組み換え光感受性転写因子ＧＡＶＰ（Ｎ５６Ｋ＋Ｃ７１Ｖ）の発現する細胞を光照射すればそのｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルの上向き調節に至った。結果は、左側が印刷投影シートの粘着されたシャーレの写真で、右側の内側円形が対応する細胞の傾向画像であり、二者が略一致しており、即ち、細胞は蛍光「ＥＣＵＳＴ」英文字画像を呈し、また、下方にはグレースケールバー図案を有することを示した。細胞に対して「撮影」（図４４）することは、本発明は空間において標的遺伝子の発現を調節できることを示した。
実施例１６：組み換え光制御可能なＤＮＡ結合蛋白のスペクトル特長及びＤＮＡ識別／結合の分析
本発明の組み換え光感受性融合蛋白のスペクトル特長及びＤＮＡ結合性能を分析するため、純化された該蛋白を使用することが必要である。以下のプライマーＰ１１３及びＰ１１４を使用して、ＰＣＲによって実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（ＷＴ）プラスミドにおけるＧａｌ４−ＶＩＶＩＤ（ＷＴ）遺伝子断片を増幅し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ酵素の切断サイトを通じてｐＥＴ２８ａ原核発現ベクターに連結する。得たプラスミドがｐＥＴ２８ａ−ＧＡＶ（ＷＴ）と命名され、相応する組み換え融合蛋白がＧＡＶ（ＷＴ）であり、そのＮ端にはＨｉｓタグを有し、ニッケルイオンアフィニティカラムを使用して純化することができる。
上流プライマー（Ｐ１１３）：５’−ＣＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＣ−３’
下流プライマー（Ｐ１１４）：５’−ＣＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＴＧ−３’
ｐＥＴ２８ａ−ＧＡＶ（ＷＴ）を使用してＪＭ１０９コンピテントセルを形質転換し、陽性クロナール細胞を選んで培養して該蛋白（Ｈｉｓタグを有し）を発現し、その後ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１ｍＬ ニッケル（Ｎｉ２＋）カラムを使用して純化された組み換え光感受性ＧＡＶ（ＷＴ）融合蛋白を得、さらにＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の５ｍＬ Ｈｉｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ脱塩カラムによって脱塩を行い、サンプルは最終２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０μＭ ＺｎＣｌ２、１０％グリセリン、ｐＨ７．５に保存する。ルーチンの蛋白質測定方法を使用して定量した後、４℃に置いて光を避けて保存する。また、サンプル用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ確認蛋白の純度が約９０％である（図４５）。
そのスペクトル性質を測定するため、まず該蛋白を４℃で３０ｈ以上放置し、それを暗中状態に回復させる。微弱な赤光（光強度＜０．０５Ｗ／ｃｍ２）下で操作し、まず４０μＬを取って３８４ウェル無紫外吸収プレートに加え、Ｓｙｎｅｒｇｙ２マルチモードリーダーを使用してＧＡＶ（ＷＴ）蛋白の暗中時の３００ｎｍ〜７００ｎｍ吸収スペクトルを測定する。その後青光４６０−４７０ｎｍ， ０．４Ｗ／ｃｍ２）を使用してサンプルを５ｍｉｎ照射した後、さらに光照射後のＧＡＶ（ＷＴ）の吸収スペクトルを測定する。文献は、野生型ＶＩＶＩＤ−３６が暗中時に４２８ｎｍ、４５０ｎｍ及び４７８ｎｍ、３つの吸収ピックを有し、さらに１つの３９０ｎｍ吸収ピックを有する［Ｚｏｌｔｏｗｓｋｉ，Ｂ．Ｄ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６（５８２７），１０５４−１０５７（２００７）］ことを報道した。結果は、ＧＡＶ（ＷＴ）融合蛋白のスペクトル性質がＶＩＶＩＤ−３６と類似することを示し、組み換えＧＡＶ（ＷＴ）融合蛋白が野生型ＶＩＶＩＤ−３６のスペクト性質を保留したことを表明した（図４６）。
ゾル遷移実験（ＥＭＳＡ）を使用して組み換えＧＡＶ（ＷＴ）融合蛋白のＤＮＡ識別／結合状況を測定する。関係文献を参照し、純化された該蛋白を４℃、３０ｈ以上放置して、それを単量体状態に回復させる。以下の２つのＤＮＡプローブ（そのうちＧＡＶ識別の応答要素モチーフを含有する）を、
正のセンス鎖（Ｐ１０５）：５’−ＴＣＴＴＣＧＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＣＧＡＡＴＡＴＡ−３’，
負のセンス鎖（Ｐ１０６）：５’−ＡＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧ−３’，
１０μＭに希釈し、それぞれ１０μＬを取って混合した後ＰＣＲ装置に加え、９５℃で５ｍｉｎ変性し、その後１℃／ｍｉｎの速度で２５℃まで温度を下げ、アニーリングして２重鎖プローブを形成する。微弱な赤光下で以下の操作を行い、ＧＡＶ（ＷＴ）蛋白を緩衝液ＲｎＢ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ７．５，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１００μｇ／ｍＬＢＳＡ）によって倍単位ごとに希釈し、毎回２倍希釈する。その後プローブを各のＧＡＶ（ＷＴ）希釈液とそれぞれ混合し、最終濃度が５％であるＦｉｃｏｌを加え、プローブの最終濃度が１２５μＭである。混合した後のサンプルを２等分にし、室温下で、１つは光を避け、他１つは青光（４６０−４７０ｎｍ，０．４Ｗ／ｃｍ２）で３０ｍｉｎ照射する。その後２つのサンプルをそれぞれ２つの６％ポリアクリルアミゾル（０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液）に加え、４℃で、１００Ｖ電圧下３０−５０ｍｉｎ電気泳動し、光避けのサンプルは電気泳動する時に続けて光を避け、光照射のサンプルは電気泳動する時に続けて光照射する。電気泳動した後Ｇｅｌｒｅｄ染料によって５ｍｉｎ染色する。図４７が測定結果であり、ＧＡＶ（ＷＴ）とプローブとの結合する分子が比較的大きく、電気泳動する時に遷移が遅くて上方のバンドに位置し、結合されなかったプローブ分子が小さくて遷移が遅くて下方のバンドに位置する。左図は、暗中時、ＧＡＶ（ＷＴ）が高濃度であった場合のみプローブと結合することを示し、右図は、全ての濃度のＧＡＶ（ＷＴ）が光照射された後共にプローブと結合できることを示した。該組み換えＧＡＶ（ＷＴ）融合蛋白とＤＮＡプローブとの結合が光によって制御されることを表明した。
実施例１７：光制御可能な蛋白発現システムのＩ型糖尿病マウス遺伝子治療に使用されることの研究
１．ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）からＩ型糖尿病を誘起するマウスモデルの形成
（１）メス昆明マウス（体重が約２０ｇで、４週齢、複旦大学動物センターから購入された）に飼料を与えず、水を与えて一夜飢餓処理し、次の日重量を計った後標記を付ける。
（２）クエン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ５）でＳＴＺ注射液を調製し、光を避けて氷上に置く。
（３）マウスにＳＴＺ １５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射する。
（４）マウスに十分な食物を与え、且つ１０％サッカロース水を補給し、一夜飼養する。
（５）ＳＴＺ誘起の第２日目、１０％サッカロース水を撤去し、マウスに正常に水及び食物を摂取させる。
（６）ＳＴＺ誘起の第５〜７日目、ロシュＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ整合型血糖値測定器を使用して各のマウスの血糖を測定し、血糖値が３０ｍＭ以上であるマウス（Ｉ型糖尿病マウス）を次の実験に使用する。
２．投与：投与群が実施例４により構築されたｐＵ５−Ｉｎｓｕｌｉｎプラスミド及び実施例２により構築されたｐＧＡＶＰ（Ｃ７１Ｖ＋Ｎ５６Ｋ）プラスミドで、対照群が実施例により構築されたｐＧＡＶＰ（Ｃ１０８Ｓ）プラスミドである。各種のプラスミドが共にＲｉｎｇｅｒ’液（１４７ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，１．１３ｍＭ ＣａＣｌ２）によって希釈され、各群のマウスに対してそれぞれ前記プラスミド溶液を、２０μｇ及び１０μｇ／匹で（０．１２ｍｌ／ｇマウス、通常約３ｍｌ匹）、尾静脈注射し、５〜７ｓ内注射を完了させる。
３．血糖値測定：カミソリでマウスの腹部の毛を剃り除き、さらに８％硫黄化ナトリウム溶液を使用して残りの毛を徹底に除去し、温水で残留の硫黄化ナトリウム溶液を除去し且つマウスの腹部を擦って乾燥させる。マウスを強度９０ｍＷ／ｃｍ２の青光によって照射されるガラス底飼養シャーレに８ｈ置きまたは暗中条件下で８ｈ置き、その間、水のみを与え、食物を与えない。その後暗中条件に置き、十分な食物及び水を与えて４ｈ飼養し、４ｈ後ロシュ血糖値測定器を使用して各のマウスの血糖値を測定する。
図４８は光によってＩｎｓｕｌｉｎ遺伝子の発現を誘起することはマウスの血糖値を大幅に下げることができ、暗中条件下のマウス及び対照群（ｐＧＡＶＰ（Ｃ１０８Ｓ）注射）マウスの血糖値の降下が顕著ではないことを示した。光制御可能な発現システムはＩ型糖尿病マウスの遺伝子治療に使用されることができる。
理解すべきなのは、本明細書の各の実施例における用量、反応条件等は特別な明記が無い限りに、実際の状況に応じて少々変更を行えれば類似な結果を貰えることができる。専用定義の外、本文に使用された全ての専門及び科学用語は本分野の当業者の理解される含意と同様である。本文に言及された全ての文献は共に本出願に導入して参考とする。本明細書に説明されたのはモデル用の好適な実施手段であり、本分野の当業者は本文に記載された類似な方法及び材料を使用して本発明を実施して同様または類似な結果を得ることができ、本発明に対して行った全ての変更または修正は依然本発明の添付された請求項に限定される範囲内に属する。
参考文献：
1. Gossen, M. and H. Bujard, Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(12): p. 5547-51.
2. Gossen, M., et al., Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 1995. 268(5218): p. 1766-9.
3. Fussenegger, M., et al., Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol, 2000. 18(11): p. 1203-8.
4. Wang, Y., et al., A regulatory system for use in gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(17): p. 8180-4.
5. Weber, W., et al., Gas-inducible transgene expression in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol, 2004. 22(11): p. 1440-4.
6. Keyes, W.M. and A.A. Mills, Inducible systems see the light. Trends Biotechnol, 2003. 21(2): p. 53-5.
7. Kamei, Y., et al., Infrared laser-mediated gene induction in targeted single cells in vivo. Nat Methods, 2009. 6(1): p. 79-81.
8. Rivera, V.M., et al., A humanized system for pharmacologic control of gene expression. Nat Med, 1996. 2(9): p. 1028-32.
9. Shimizu-Sato, S., et al., A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol, 2002. 20(10): p. 1041-4.
10. Yazawa, M., et al., Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol, 2009. 27(10): p. 941-5.
11. Kennedy, M.J., et al., Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods, 2010.
12. Fleer, R., Engineering yeast for high level expression. Curr Opin Biotechnol, 1992. 3(5): p. 486-96.
13. Smith, G.E., M.D. Summers, and M.J. Fraser, Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol, 1983. 3(12): p. 2156-65.
14. Luckow, V.A. and M.D. Summers, High level expression of nonfused foreign genes with Autographa californica nuclear polyhedrosis virus expression vectors. Virology, 1989. 170(1): p. 31-9.
15. Pinkert, C.A., et al., An albumin enhancer located 10 kb upstream functions along with its promoter to direct efficient, liver-specific expression in transgenic mice. Genes Dev, 1987. 1(3): p. 268-76.
16. Calame, K. and S. Eaton, Transcriptional controlling elements in the immunoglobulin and T cell receptor loci. Adv Immunol, 1988. 43: p. 235-75.
17. Winoto, A. and D. Baltimore, A novel, inducible and T cell-specific enhancer located at the 3' end of the T cell receptor alpha locus. EMBO J, 1989. 8(3): p. 729-33.
18. Banerji, J., L. Olson, and W. Schaffner, A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes. Cell, 1983. 33(3): p. 729-40.
19. Queen, C. and D. Baltimore, Immunoglobulin gene transcription is activated by downstream sequence elements. Cell, 1983. 33(3): p. 741-8.
20. Talbott, R.L., et al., Nucleotide sequence and genomic organization of feline immunodeficiency virus. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(15): p. 5743-7.
21. Edlund, T., et al., Cell-specific expression of the rat insulin gene: evidence for role of two distinct 5' flanking elements. Science, 1985. 230(4728): p. 912-6.
22. Kessel, M. and P. Gruss, Murine developmental control genes. Science, 1990. 249(4967): p. 374-9.
23. Camper, S.A. and S.M. Tilghman, Postnatal repression of the alpha-fetoprotein gene is enhancer independent. Genes Dev, 1989. 3(4): p. 537-46.
24. Marmorstein, R., et al., DNA recognition by GAL4: structure of a protein-DNA complex. Nature, 1992. 356(6368): p. 408-14.
25. Fogh, R.H., et al., Solution structure of the LexA repressor DNA binding domain determined by 1H NMR spectroscopy. EMBO J, 1994. 13(17): p. 3936-44.
26. Lewis, M., et al., Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with DNA and inducer. Science, 1996. 271(5253): p. 1247-54.
27. Burz, D.S., et al., Self-assembly of bacteriophage lambda cI repressor: effects of single-site mutations on the monomer-dimer equilibrium. Biochemistry, 1994. 33(28): p. 8399-405.
28. Hu, J.C., et al., Sequence requirements for coiled-coils: analysis with lambda repressor-GCN4 leucine zipper fusions. Science, 1990. 250(4986): p. 1400-3.
29. Wissmann, A., et al., Amino acids determining operator binding specificity in the helix-turn-helix motif of Tn10 Tet repressor. EMBO J, 1991. 10(13): p. 4145-52.
30. Ramos, J.L., et al., The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev, 2005. 69(2): p. 326-56.
31. Peter, E., B. Dick, and S.A. Baeurle, Mechanism of signal transduction of the LOV2-Jalpha photosensor from Avena sativa. Nat Commun, 2010. 1(8): p. 122.
32. Takahashi, F., et al., AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(49): p. 19625-30.
33. Seipel, K., O. Georgiev, and W. Schaffner, Different activation domains stimulate transcription from remote ('enhancer') and proximal ('promoter') positions. EMBO J, 1992. 11(13): p. 4961-8.
34. Peng, H., et al., Biochemical analysis of the Kruppel-associated box (KRAB) transcriptional repression domain. J Biol Chem, 2000. 275(24): p. 18000-10.
35. Wang, Y., et al., Positive and negative regulation of gene expression in eukaryotic cells with an inducible transcriptional regulator. Gene Ther, 1997. 4(5): p. 432-41.
36. Drysdale, C.M., et al., The transcriptional activator GCN4 contains multiple activation domains that are critically dependent on hydrophobic amino acids. Mol Cell Biol, 1995. 15(3): p. 1220-33.
37. Fanara, P., et al., Quantitative analysis of nuclear localization signal (NLS)-importin alpha interaction through fluorescence depolarization. Evidence for auto-inhibitory regulation of NLS binding. J Biol Chem, 2000. 275(28): p. 21218-23.
38. Zoltowski, B.D., et al., Conformational switching in the fungal light sensor Vivid. Science, 2007. 316(5827): p. 1054-7.

Claims (25)

  1. ａ）ＤＮＡ結合ドメインとする第１ポリペプチド、光感受性ドメインとする第２ポリペプチド及び転写調節ドメインとする第３ポリペプチドを含む組み換え光感受性転写因子のコード遺伝子と、ｂ）前記第１ポリペプチドによって識別／結合される少なくとも１つの応答要素、前記第３ポリペプチドによって調節されるプロモーター及び転写されるべき核酸配列を含むターゲット転写ユニットと、を含む、光制御可能な遺伝子発現システム。
  2. 前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド及び前記第３ポリペプチドの間が可操作性に連結され、及び／又は前記応答要素、前記プロモーター及び前記転写されるべき核酸配列の間が可操作性に連結される、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  3. 前記第１ポリペプチドがヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーモチーフ又は亜鉛クラスターＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパーＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、ヘリックス・ループ・ヘリックスＤＮＡ結合ドメイン、高速移動群ＤＮＡ結合ドメイン、Ｂ３ＤＮＡ結合ドメインから選ばれる、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  4. 前記第１ポリペプチドが酵母Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン、大腸菌ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメイン、Ｌａｃ抑制蛋白ＬａｃＩのＤＮＡ結合ドメイン、λファージｃＩ抑制蛋白のＤＮＡ結合ドメイン、及びテトラサイクリン抑制蛋白ＴｅｔＲのＤＮＡ結合ドメインから選ばれる、請求項３に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  5. 前記第２ポリペプチドがフラビン発色団含有の光感受性蛋白の光感受性ドメインから選ばれる、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  6. 前記第２ポリペプチドがＬＯＶドメイン含有の光感受性蛋白の光感受性ドメインから選ばれる、請求項５に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  7. 前記第２ポリペプチドがアカパンカビ菌のＶＩＶＩＤのＬＯＶ２ドメイン、オート麦フィトクロム１遺伝子のＬＯＶ２ドメインＡｓＬＯＶ２、及びフシナシミドロ黄金色植物蛋白１のＬＯＶドメインＡｕＬＯＶから選ばれる、請求項６に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  8. 前記第３ポリペプチドが酸性アミノ酸に富む転写活性化ドメイン、プロリンに富む転写活性化ドメイン、セリン／トレオニンに富む転写活性化ドメインとグルタミンに富む転写活性化ドメイン、及びＫｒｕｐｐｅｌ相関ボックス転写抑制ドメインから選ばれる、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  9. 前記第３ポリペプチドが単純疱疹ウイルスグラニュリンＶＰ１６転写活性化ドメイン、酵母Ｇａ１４転写活性化ドメイン、ＮＦ−κＢ ｐ６５イリデン転写活性化ドメイン、酵母通用抑制蛋白４の転写活性化ドメイン及び亜鉛フィンガー蛋白３５４ＡのＫｒｕｐｐｅｌ相関ボックス転写抑制ドメインから選ばれる、請求項８に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  10. さらに前記組み換え光感受性転写因子の細胞核へ輸送することを促進する核定位シグナル第４ポリペプチドを含み、前記第４ポリペプチドが前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチドと直接、又はリンカーペプチド（linker peptide）によって連結される、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  11. さらにホルモンによって制御される第５ポリペプチドを含み、前記第５ポリペプチドが前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、前記第３ポリペプチドと直接、又はリンカーペプチドによって連結される、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  12. 前記応答要素が、前記第１ポリペプチドによって特異的識別及び結合可能なＤＮＡモチーフである、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  13. 前記応答要素がＧａ１４結合要素、ＬｅｘＡ結合要素、ＴｅｔＲ結合要素、ＬａｃＩ結合要素及びｃＩ結合要素から選ばれる、請求項１２に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  14. 前記プロモーターがアデノウイルス後期プロモーター、サイトメガロウイルスＣＭＶ最小プロモーター、酵母Ｇａｌｌ遺伝子のプロモーター及びＳｖ４０プロモーターから選ばれる、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  15. 前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとが１つの光制御可能なＤＮＡ結合蛋白を構成する、請求項１に記載の光制御可能な遺伝子発現システム。
  16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の光制御可能な遺伝子発現システムを含有する真核発現ベクター。
  17. 前記真核発現ベクターが前記組み換え光感受性転写因子のコード遺伝子、及び／又は前記ターゲット転写ユニットを含み、前記ターゲット転写ユニットは応答要素−プロモーターを含有するが、転写されるべき核酸配列を欠く、請求項１６に記載の真核発現ベクター。
  18. 前記組み換え光感受性転写因子のヌクレオチド配列が配列番号３、７、１１、１５、１９、３１、３３、３５、３７、３９、４３、４７、５７、５９、６１、６３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９から選ばれ、アミノ酸配列が配列番号４、８、１２、１６、２０、３２、３４、３６、３８、４０、４４、４８、５８、６０、６２、６４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０から選ばれる、請求項１６に記載の真核発現ベクター。
  19. 前記光制御可能な遺伝子発現システムを真核プラスミド発現ベクターに構築するステップａ）と、
    制御される遺伝子を含有する宿主細胞を導入するステップｂ）と、
    光照射で前記宿主細胞を誘導して、前記宿主細胞における制御されるヌクレオチドを発現させるステップｃ）と、を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の光制御可能な遺伝子発現システムを用いて宿主細胞において遺伝子発現を制御する方法。
  20. 前記宿主細胞は細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、線虫細胞、ミバエ細胞、昆虫細胞、ゼブラフィッシュ細胞、動物細胞及び哺乳動物細胞を含む、請求項１９に記載の遺伝子発現を制御する方法。
  21. さらに光源の選択及び照射方法の選択を含み、前記光源がＬＥＤ灯、蛍光灯、レーザ及び白熱灯から選ばれ、前記照射方法が持続的な光照射又は非持続的な光照射である、請求項１９に記載の遺伝子発現を制御する方法。
  22. 前記光源の選択及び照射方法の選択は光による走査、投影、又は光金型によって空間において異なる位置における細胞の遺伝子発現レベルを制御することを含む、請求項２１に記載の遺伝子発現を制御する方法。
  23. 前記照射方法はさらに印刷の投影フィルム、又は中性灰色フィルターを用いて空間において異なる位置における細胞の遺伝子発現レベルを制御することを含む、請求項２１に記載の遺伝子発現を制御する方法。
  24. 請求項１６に記載の前記真核発現ベクター及び／又は前記組み換え光感受性転写因子を含有する真核発現ベクターにより形質転換された哺乳動物細胞、及び関係カタログが装入されている試薬キット。
  25. さらに、応答要素−プロモーターを含有するが、転写されるべき核酸配列が欠如しているターゲット転写ユニットの真核発現ベクターが装入されている、請求項２４に記載の試薬キット。
JP2013555733A 2011-02-28 2012-02-27 光制御可能な遺伝子発現システム Active JP6140615B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110048142.1A CN102643852B (zh) 2011-02-28 2011-02-28 光可控的基因表达系统
CN201110048142.1 2011-02-28
PCT/CN2012/071679 WO2012116621A1 (zh) 2011-02-28 2012-02-27 光可控的基因表达系统

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2014509196A JP2014509196A (ja) 2014-04-17
JP2014509196A5 JP2014509196A5 (ja) 2016-07-28
JP6140615B2 true JP6140615B2 (ja) 2017-05-31

Family

ID=46656927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013555733A Active JP6140615B2 (ja) 2011-02-28 2012-02-27 光制御可能な遺伝子発現システム

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9839698B2 (ja)
EP (1) EP2682469B1 (ja)
JP (1) JP6140615B2 (ja)
CN (1) CN102643852B (ja)
WO (1) WO2012116621A1 (ja)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031327B (zh) * 2012-08-02 2015-11-25 华东理工大学 原核细菌光诱导基因表达系统及其调控基因表达的方法
EP2956557B1 (en) * 2013-02-14 2018-07-11 The J. David Gladstone Institutes Compositions and methods of use thereof for identifying anti-viral agents
CN103232534B (zh) * 2013-04-25 2014-10-29 山东省农业科学院高新技术研究中心 花生光敏色素AhphyA编码基因及其应用
KR102551324B1 (ko) * 2013-06-05 2023-07-05 듀크 유니버시티 Rna-가이드 유전자 편집 및 유전자 조절
CN109600884B (zh) * 2013-08-02 2021-02-12 昕诺飞北美公司 对家畜进行照明的系统和方法
CN104419711A (zh) * 2013-09-09 2015-03-18 郑明刚 微拟球藻NgAUREO1基因在调控脂肪酸代谢中的应用
WO2015041219A1 (ja) * 2013-09-18 2015-03-26 国立大学法人京都大学 幹細胞の増殖と分化の光遺伝学的制御方法
JP6555677B2 (ja) * 2014-03-03 2019-08-07 国立大学法人 東京大学 光依存的に二量体を形成するタンパク質のセット
CN105177023B (zh) * 2014-05-30 2022-03-11 华东理工大学 一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD
EP3284749A4 (en) * 2015-04-13 2018-11-14 The University of Tokyo Set of polypeptides exhibiting nuclease activity or nickase activity with dependence on light or in presence of drug or suppressing or activating expression of target gene
WO2016197136A2 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Nmc, Inc. Improved productivity and bioproduct formation in phototropin knock/out mutants in microalgae
CN105441476A (zh) * 2015-12-17 2016-03-30 新乡医学院 盐藻的光调控基因表达载体及其制备方法与应用
CN107177499B (zh) * 2016-03-10 2020-08-04 华东师范大学 一种基因环路远程调控系统
CN107177498B (zh) * 2016-03-10 2020-11-13 苏州欣赛生物科技有限公司 一种远程调控的基因环路系统在治疗糖尿病中的应用
CN107177629A (zh) * 2016-03-10 2017-09-19 华东师范大学 一种基因环路远程调控系统进行转基因调控表达的方法
CN107174655B (zh) * 2016-03-10 2020-10-30 华东师范大学 一种远红光基因环路表达控制系统在治疗糖尿病中的应用
CN107177615A (zh) * 2016-03-10 2017-09-19 叶海峰 一种远红光基因环路表达控制系统及其真核表达载体
CN109311931A (zh) * 2016-04-07 2019-02-05 何塞·L·阿瓦洛斯 用于生产化学物质的光基因控制代谢途径的系统和方法
CN107344962B (zh) * 2016-05-04 2021-03-02 中国科学院微生物研究所 阻遏蛋白、调控元件组和基因表达调控系统及其构建方法
CN107674879A (zh) * 2016-08-01 2018-02-09 深圳先进技术研究院 一种光‑基因质粒及其应用
CN106244608B (zh) * 2016-08-08 2019-10-25 中国科学技术大学 诱导的t7 rna聚合酶
CN106279438B (zh) * 2016-08-24 2019-10-22 北京领柯生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
CN106755050A (zh) * 2016-11-22 2017-05-31 深圳大学 一种诱导绿藻持续放氢的光控基因开关系统及其应用
CL2016003010A1 (es) * 2016-11-24 2018-11-09 Univ Pontificia Catolica Chile Sistema de expresión optogenético en levadura
US10801038B2 (en) 2017-02-28 2020-10-13 Trustees Of Boston University Opto-genetic modulator
AU2018231195A1 (en) 2017-03-07 2019-09-26 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Optogenetic induction of neurodegenerative disease pathologies
JP7088520B2 (ja) * 2017-04-10 2022-06-21 国立大学法人 東京大学 光依存的遺伝子組換えに用いられるポリペプチドのセット
CN109868286B (zh) * 2017-12-05 2022-09-16 深圳先进技术研究院 一种慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
JP2021528985A (ja) * 2018-06-27 2021-10-28 ベーリンガー インゲルハイム エルツェーファウ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 転写因子の使用によってタンパク質発現を増加させるための手段及び方法
DE102018216872A1 (de) 2018-10-01 2020-04-02 Leibniz Universität Hannover Analyseverfahren für mRNA einzeln lichtbestrahlter Zellen
US20220154192A1 (en) * 2019-02-19 2022-05-19 The Trustees Of Princeton University System and method for light-regulated oligomerization and phase separation of folded domains and rna granule-associated protein domains for drug- based screening applications
CN114585741A (zh) * 2019-05-28 2022-06-03 奥科坦特公司 转录中继系统
CN110551755A (zh) * 2019-07-26 2019-12-10 天津大学 一种光控蛋白降解系统及构建方法和光调控蛋白降解的方法
CN110747227B (zh) * 2019-08-13 2023-03-31 华东师范大学 蓝光诱导激活的Cre重组优化系统及其应用
CN110547260A (zh) * 2019-10-12 2019-12-10 四川省卫农现代农业科技有限公司 一种释放装置
CN110755449A (zh) * 2019-10-15 2020-02-07 南方科技大学 一种光调控嗜中性粒细胞在治疗癌症的药物中的应用
CN110804098B (zh) * 2019-10-25 2022-09-16 中山大学 一种bk通道光控调节元件
CA3161146A1 (en) * 2019-11-19 2021-05-27 Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy Non-viral transcription activation domains and methods and uses related thereto
CN113136396A (zh) * 2020-01-20 2021-07-20 华东理工大学 细菌光控基因表达系统及其调控基因表达的方法
GB202001211D0 (en) * 2020-01-29 2020-03-11 Imperial College Innovations Ltd Methods
CN114645065A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 华东理工大学 一种新型光-化学小分子双诱导基因表达系统
CN112899157A (zh) * 2020-12-28 2021-06-04 中国科学院长春应用化学研究所 微流控芯片光刺激装置和酵母单细胞光调控基因表达方法及应用
CN115197968A (zh) * 2021-04-09 2022-10-18 新乡医学院 抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建、筛选方法及其应用
CN113652430A (zh) * 2021-09-02 2021-11-16 华东理工大学 一种光控rna代谢调控系统
CN114317389B (zh) * 2021-12-22 2023-06-13 南京工业大学 一种利用重组大肠杆菌共培养发酵产l-苏氨酸的方法
CN117187302A (zh) * 2022-05-31 2023-12-08 华东师范大学 一种哺乳动物红光控制转录激活装置/系统及其构建方法和在基因治疗中的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US6887688B2 (en) * 2001-05-29 2005-05-03 The Regents Of The University Of California Light controlled gene expression utilizing heterologous phytochromes
ATE360680T1 (de) 2001-08-23 2007-05-15 Univ California Universelles, durch licht einschaltbares genpromotorsystem
AU2004235393A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Cornell Research Foundation, Inc Trasngenic expression of a phytochrome a gene
EP1580273A1 (en) * 2004-03-26 2005-09-28 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Peptide-based method for monitoring gene expression in a host cell
US8859232B2 (en) * 2009-07-01 2014-10-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Genetically encoded photomanipulation of protein and peptide activity
US9097703B2 (en) * 2009-10-01 2015-08-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Light controlled protein dimerization in cells
US9506073B2 (en) * 2011-11-18 2016-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Blue-light inducible system for gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
EP2682469A1 (en) 2014-01-08
JP2014509196A (ja) 2014-04-17
US9839698B2 (en) 2017-12-12
EP2682469A4 (en) 2015-01-14
EP2682469B1 (en) 2018-12-26
CN102643852B (zh) 2015-04-08
US20130345294A1 (en) 2013-12-26
CN102643852A (zh) 2012-08-22
WO2012116621A1 (zh) 2012-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6140615B2 (ja) 光制御可能な遺伝子発現システム
JP2014509196A5 (ja)
JP6334527B2 (ja) 原核細菌の光誘起遺伝子表現システム及び遺伝子表現を調整制御する方法
EP2666857B1 (en) Nucleic acid construct for expressing oxidative stress indicator and use thereof
US10221422B2 (en) Blue light-inducible system for gene expression
US20160326219A1 (en) Optically activated receptors
Ma et al. Fine tuning the LightOn light-switchable transgene expression system
Liu et al. Rice black-streaked dwarf virus minor core protein P8 is a nuclear dimeric protein and represses transcription in tobacco protoplasts
US20150376627A1 (en) Inducible Expression System Transcription Modulators Comprising A Distributed Protein Transduction Domain And Methods For Using The Same
JP2023537158A (ja) Ｋｒａｂ融合抑制因子並びに遺伝子発現を抑制する方法及び組成物
Kang et al. An improved Tet-on system in microRNA overexpression and CRISPR/Cas9-mediated gene editing
WO2009107876A1 (ja) 酸化ストレスを測定するためのプローブ試薬
WO2023030330A1 (zh) 一种光控rna代谢调控系统
CN113201543B (zh) 企鹅珍珠贝Tyr基因的启动子及其应用
US20230212592A1 (en) Riboswitch modules and methods for controlling eukaryotic protein translation
Qu et al. Human immunodeficiency virus-1 Rev protein activates hepatitis C virus gene expression by directly targeting the HCV 5′-untranslated region
Collet et al. Establishment of an Atlantic salmon kidney cell line with an inducible gene expression system
Gao et al. Characteristics of the TDRD1 gene promoter in chickens
WO2024015383A1 (en) Engineered hypoxia biosensors and methods of using the same
CN114645065A (zh) 一种新型光-化学小分子双诱导基因表达系统
Varinca Analysis of functional domains of alternative splicing isoforms
Tang Gene therapy for myocardial ischemia using the hypoxia-inducible double plasmid system
TW201809666A (zh) 利用泛素檢測生物毒性的方法
McLachlan Transcription factor engineering: Tools and applications

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150210

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160112

A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20160412

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20160913

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170113

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170214

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20170310

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170404

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170501

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6140615

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250