CN107760707B - 一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立，通过优化UAS数目及GAL4激活/结合域类型，找到一种增强效果较好的表达盒，由自身强启动子CMV启动，借助Gal4/UAS系统使转录和翻译效率提高，从而产生自动激活、级联放大的效果；在转染后第5‑10天维持较高的增强效果，第8天表达活性最高，说明表达盒增强基因表达的稳定性；在专门生产重组蛋白的CHO细胞中，增强效果大概是9倍。与现有基因表达盒相比，结构简单、增强效果显著，为基因治疗的非病毒转染途径和重组蛋白生产中增强目的基因表达提供了一种途径和新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立，属于生物技术领域。
背景技术
Gal4/UAS系统最早是在酿酒酵母中发现的(Oshima Y et al.1984)，它由两部分组成：编码酵母转录激活蛋白GAL4(Transcription Factor GAL4)的基因和上游激活序列(Upstream Activation Sequence,UAS，Giniger E and Ptashne 1987；Giniger Edwardet al.1985)。酿酒酵母GAL4蛋白由881个氨基酸残基构成，主要包含DNA结合域与DNA激活域两部分(Laughon et al.1984；Oshima Yasuji 1982)。DNA结合域位于蛋白N端的1～65肽段，该结构域内的7-Cys-X2-Cys-X6-Cys-X6-Cys-X2-Cys-X6-Cys40肽段构成一个Zn2Cys6结构，是结合DNA的位点(Hellauer et al.1996；Liang et al.1996)。DNA激活域位于C末端，两个结构域能够独立表达，即分别称为结合蛋白(Binding protein)和激活蛋白(Activating protein)。研究发现DNA结合域在结合DNA前后结构发生了明显的变化，使DNA结合域和特定序列结合的更加稳定。
GAL4的结合域能与特定DNA序列结合，激活下游基因的表达。GAL4结合蛋白的结合位点即上游激活序列位于Gal基因上游的100～300bp处(Guarente Leonard 1984)，Bram等通过DNA印迹法检测发现，不同的基因位点，GAL4的结合位点数不同，大约有1～4个上游结合位点，但位点都是大约30bp的保守DNA序列(Bram et al.1986)。
GAL4是真核细胞中广泛存在的进化相对保守的转录激活因子，它是一个模块化的蛋白，从广义上来讲由DNA结合域(DNA binding domain，BD)和DNA激活域(DNA activatingdomain，AD)两部分组成，结合的UAS区序列一般为CGG-N11-CCG(Bram and Kornberg 1985；Elliott D.A.and Brand A.H.2008)。大量研究表明GAL4能够作为一种转录激活因子在各种生物体比如果蝇和人类细胞中存在，这也突出了它在进化过程的不同物种中对于基因表达机理的保守性。
1993年，Brand和Perrimons首次利用Gal4/UAS系统在果蝇中表达目标基因。在这一体系中，目标基因的表达是被USA调控的，而且只有当GAL4蛋白结合到UAS后，目标基因才可以被转录，因此这是一种典型的双元表达系统(Luan et al.2006)。到目前为止，该系统已经被应用于除果蝇属(Phelps and Brand 1998)以外的其他生物体，诸如非洲爪蟾(Hartley et al.2002)、斑马鱼(Asakawa and Kawakami 2008)、小鼠(Elliott D.A.andBrand A.H.2008)等。
目前，尚未见到利用基于Gal4/UAS的表达系统在人源化细胞中进行目的基因表达的报道，而且现有表达系统还存在目的基因表达量较低、表达时间短，增强表达的稳定性差等不足，因而不利于其在基因治疗的非病毒转染途径以及DNA疫苗等的发展和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立，涉及增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒及其构建方法。所建立的Gal4/UAS系统表达盒具有简单高效性和增强稳定性等显著特点。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒，该系统表达盒包括真核启动子以及依次排列于真核启动子下游的目的基因插入位点、剪切肽序列和带有核定位信号的GAL4蛋白序列，所述真核启动子的上游设置有拷贝数为0～6个的上游激活序列UAS。
所述真核启动子选自CMV。CMV启动子通常被认为是一个强启动子，在体外培养的多种类型的细胞中都有很高的启动外源基因转录的活性，这种转录调控元件也能够在转基因动物的多种组织中启动外源基因的表达(Furth et al.1991；Lai et al.2012)，因此成为各种真核基因表达载体常用的启动子(Mailly et al.2008；Tessitore et al.2008)。
所述剪切肽序列选自T2A、P2A、E2A或F2A序列。在Gal4/UAS系统表达盒中，为了使得报告基因或其他目的基因与表达的GAl4蛋白分离，添加自我剪切肽，据文献报道，自我剪切肽除了T2A，另外还有P2A、E2A和F2A等，而且P2A的自我剪切能力在这四种中是最强的，其次才是T2A(Jin et al.2012)，但是为了实验的方便，选择了本实验室拥有的T2A作为剪切肽，在本发明中，需要强调的是需要加上一段剪切肽，而不仅仅局限于T2A一种。
所述GAL4蛋白序列由DNA结合域序列以及排列于其下游的DNA激活域序列组成；其中，DNA激活域选自VP64、p65、Rta、GAL4AD、VP64中的一种或多种相互串联的形式，DNA结合域选自GAL4BD。
所述核定位信号序列位于GAL4蛋白序列的任意一端或两端。核定位信号(NuclearLocalization Sequence,NLS)，通常为一短的氨基酸序列，作为蛋白质结构域，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核(Nucleus)，正是基于这项重要功能，它在Gal4/UAS系统表达盒中也起到很重要的作用，它能够将细胞质(Cytoplasm)中表达出的GAl4结合蛋白和激活蛋白带入核内，与DNA序列结合。为了保险起见，Gal4/UAS系统表达盒在GAL4蛋白的N-端和C-端可均加核定位信号。本发明使用的是SV40NLS，最初发现存在于猿猴病毒40(SV40)的大T抗原中，为包含7个氨基酸(PKKKRKV)的短肽。
所述上游激活序列UAS的拷贝数优选为4～6个。UAS是GAL4结合蛋白特异结合的位置，Bram等通过DNA印迹法检测发现，不同的基因位点，GAL4的结合位点数不同，大约有1～4个上游结合位点，但位点都是大约30bp的保守DNA序列(Bram et al.1986)，但有个特征是恒定的：在多个位点的情况下有一对最高亲和力的位点位于二分体距离在82～87个碱基处(Bram et al.1986)。DNA印迹法检测还发现UAS上两个30bp左右的GAL4结合位点距离在55bp左右(Elliott David A.and Brand Andrea H.2008)。有文献报道不同酵母转录激活因子GAL4可能会在UAS的控制下影响效应基因的表达，其中的研究发现：在斑马鱼中，UAS的数目在5个拷贝数的转基因表达效果最好，增加UAS数目至14个，效果反而下降(Distel etal.2009)；因此得出在一定范围内增加GAL4结合位点(即UAS)能够显著提高基因表达，但有一个最佳的阈值。也正是基于该报道和本发明实验结果，有理由推断UAS的拷贝数在4～6个应该是更佳的，增加或减少UAS拷贝数都可能会降低增强基因表达的效果。
所述系统表达盒包括顺次排列的以下元件：拷贝数为4的上游激活序列UAS、真核启动子CMV、目的基因插入位点、剪切肽序列、第一核定位信号序列、GAL4蛋白DNA结合域GAL4BD序列、GAL4蛋白DNA激活域VP64序列以及第二核定位信号序列。
上述增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的构建方法，包括以下步骤：
将拷贝数为0～6个的上游激活序列UAS以及具有核定位信号且可以自行与目的基因翻译产物剪切分离的GAL4蛋白序列分别插入至骨架载体上真核启动子的上游及下游目的基因插入位点之后，得到所述系统表达盒。
所述系统表达盒的构建具体包括以下步骤：
1)从pll3.7-U6-sgVEGF-Gal4BD-hSpCas9载体上扩增一端连接有核定位信号序列的GAL4蛋白DNA结合域GAL4BD的序列NLS-Gal4BD，从Plenti-EF1a-Backbone(NI)、JMB52-SP1.BS-PAM5(GGGTG).Mu4(T)或SP-dCas9-VPR载体上对应扩增GAL4蛋白DNA激活域VP64、GAL4AD或VP64-p65-Rta的序列；然后以NLS-Gal4BD与VP64、GAL4AD或VP64-p65-Rta的序列为模板，通过重叠PCR扩增得到两端均连接有核定位信号序列的GAL4蛋白序列NLS-Gal4BD-VP64-NLS、NLS-Gal4BD-AD-NLS或NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS；
2)以载体pRS426-CMV-T2A-EGFP为骨架，将NLS-Gal4BD-VP64-NLS、NLS-Gal4BD-AD-NLS或NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS插入至骨架中真核启动子CMV的下游，以替换骨架中的报告基因EGFP，得到所述系统表达盒；或者，以载体pRS426-CMV-T2A-EGFP为骨架，将NLS-Gal4BD-VP64-NLS、NLS-Gal4BD-AD-NLS或NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS插入至骨架中真核启动子CMV的下游，以替换骨架中的报告基因EGFP，在替换报告基因EGFP之后，将1～6个拷贝数的上游激活序列UAS插入至骨架中真核启动子CMV的上游，得到所述系统表达盒。
上述增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的应用可以扩展到基因治疗(非病毒载体系统的蛋白表达量较低，可以借助该表达盒增强目的蛋白的表达，进而可以延长基因治疗的时间或者效果)，此外，在重组酵母介导的DNA疫苗中也可以发挥重要作用。总之，理论上只要是想提高目的蛋白的表达量，都是可以利用的。
本发明的有益效果体现在：
本发明在含有真核生物启动子的表达载体的基础上，将Gal4/UAS系统引入，构建Gal4/UAS系统表达盒。该表达盒由自身携带的启动子激活下游目的基因及GAL4结合蛋白和GAL4激活蛋白的表达，GAL4结合蛋白会特异性的识别并结合上游激活序列(或者，在未能够结合上游激活序列情况下)利用与结合蛋白偶联的GAL4激活蛋白招募转录相关因子，激活蛋白、结合蛋白以及转录因子等的结合会使得DNA“弯曲”，即使是距离几千个碱基，也能把它们“拉到”基因启动子附近。之后其他的转录相关因子与结合激活蛋白，形成一个可以和启动子特异结合的蛋白复合体，使得RNA聚合酶更容易的结合到启动子区，从而更快的起始基因转录；转录后翻译出来的GAL4结合蛋白和激活蛋白(在剪切肽以及核定位信号协助下)会再次的和上游激活序列特异性结合(或者，在未能够结合上游激活序列情况下)，进一步增强基因的转录和翻译。因此该系统表达盒不但结构简单、自动激活，还会产生级联放大效果，使转录效率提高、翻译水平相应增强，不仅显著增强了目的基因的表达，而且使得表达盒实现了增强目的基因表达的稳定性，为基因治疗的非病毒转染途径和重组蛋白生产以及重组酵母介导免疫反应中增强目的基因表达提供了新的解决方案。
进一步的，本发明所述的Gal4/UAS系统表达盒由自身携带的启动子CMV启动下游目标基因表达，通过优化GAL4蛋白结合的UAS拷贝数目及GAL4蛋白激活/结合域类，确定了最优及较优的表达盒结构，例如，通过和对照组载体(pRS426-CMV-Luciferase，注：不含Gal4/UAS系统表达盒)比较发现，实验组(pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64–NLS)的增强效果最高可达23倍，而且在转染后第6～10天一直维持较高的增强效果。
附图说明
图1为Gal4/UAS系统表达盒增强基因表达的原理图(Negative Control为对照)；
图2为pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP(简称pRS426-CMV-Luc-T2A-EGFP)载体的质粒图谱；图中，2micro是与质粒在宿主细胞中的扩增有关的元件，URA3是一种筛选基因，含有该基因的酵母就能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长；
图3为pRS426-CMV-Luciferase载体的质粒图谱；
图4为pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简称pRS426-CMV-Luc-BD-VP64)载体的质粒图谱；
图5为pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简称pRS426-2UAS-CMV-Luc-BD-VP64)载体质粒图谱；
图6为表达载体酶切鉴定结果；图中，泳道M表示Trans 2K Plus marker；泳道A、C、D分别代表载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP(A)，pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(C)，pRS426-2UAS-CMV-Lucififerase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(D)经BamHI和XhoI双酶切产物；泳道B表示载体pRS426-CMV-Luciferase(B)经BamHI和KpnI双酶切产物。条带大小依次为(按照泳道从左到右)6631bp+2439bp、6299bp+1970bp、6631bp+1948bp+506bp、6969bp+1948bp+506bp；
图7为HEK293T细胞转染和荧光观察(30h，100×)；图中，(A)pRS426-CMV-T2A-EGFP和pRL-TK共转染HEK293T细胞的转染效率观察；(B)pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP和pRL-TK共转染HEK293T细胞的转染效率观察；
图8为HEK293T细胞上的双荧光素酶活性检测；图中，左边柱子表示仅由CMV启动子(即对照组)激活的Luciferase相对表达量(Relative value of Luciferase)，右边柱子表示由Gal4/UAS系统表达盒(即实验组)激活的Luciferase的相对表达量；实验组和对照组均包含三个重复，萤火虫和海肾荧光素酶活性之比(Firefly Luciferase/RenillaLuciferase)作为一个重复的数值；
图9为pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简称pRS426-4UAS-CMV-Luc-BD-VP64)载体的质粒图谱；
图10为pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS(简称pRS426-2UAS-CMV-Luc-BD-AD)载体的质粒图谱；
图11为pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS(简称pRS426-2UAS-CMV-Luc-BD-VPR)质粒图谱；
图12为比较和优化的表达载体酶切鉴定结果；图中，泳道M为2K Plus DNAmarker，泳道A、B、C分别显示载体pRS426-4UAS-CMV-Luc-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(A)、pRS426-2UAS-CMV-Luc-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS(B)、pRS426-2UAS-CMV-Luc-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS(C)经BamHI和EcoRV双酶切产物条带，大小分别为：5284bp+2841bp+1344bp、5238bp+3087bp+1344bp、4247bp+2855bp+2335bp+1399bp；
图13为pRS426-2UAS-CMV-Luciferase载体的质粒图谱；
图14为pRS426-4UAS-CMV-Luciferase载体的质粒图谱；
图15为pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS(简称pRS426-CMV-Luc-BD-AD)载体的质粒图谱；
图16为pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS(简称pRS426-CMV-Luc-BD-VPR)载体的质粒图谱；
图17为检测Gal4/UAS系统表达盒工作有效性的表达载体BamHI和EcoRV双酶切鉴定结果；图中，泳道M为 2K Plus DNA marker；泳道A、B、C、D分别表示载体pRS426-2UAS-CMV-Luciferase(A)、pRS426-4UAS-CMV-Luciferase(B)、pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS(C)、pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS(D)经BamHI和EcoRV双酶切产物条带，大小分别为：5646bp+1974bp+991bp、5669bp+1974bp+1014bp、6291bp+2311bp+721bp、6291bp+3485bp+669bp+45bp；
图18为不同Gal4/UAS系统表达盒的双荧光素酶活性检测；图中各个柱子对应不同的分组，每组均包含三个重复，萤火虫和海肾荧光素酶活性之比(Firefly Luciferase/Renilla luciferase,F/R)作为一个重复的数值；
图19为Gal4/UAS系统表达盒增强基因表达的稳定性检测(检测对照组和实验组的双荧光素酶活性)；图中，下方数据线表示仅由CMV启动子(即对照组)激活的Luciferase相对表达量，上方数据线表示由Gal4/UAS系统表达盒(即实验组)激活的Luciferase的相对表达量；实验组和对照组均包含三个重复，萤火虫和海肾荧光素酶活性之比(FireflyLuciferase/Renilla Luciferase,F/R)作为一个重复的数值；
图20为CHO细胞转染的荧光观察(25h，100×)；图中，(I)和(II)分别代表CHO细胞转染(转染试剂为Lipofectamine-2000，载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP和pRL-TK共转染，质粒总质量为1.5μg)后25h的白光(White light)和对应的绿色荧光(Greenfluorescence)显微观察，(III)代表CHO细胞未转染质粒的空细胞组白光(Whitelight)显微观察；
图21为CHO细胞上的双荧光素酶活性检测；图中，左边柱子表示仅由CMV启动子(即对照组)激活的Luciferase相对表达量，右边柱子表示由Gal4/UAS系统表达盒(即实验组)激活的Luciferase的相对表达量；实验组和对照组均包含三个重复，萤火虫和海肾荧光素酶活性之比(Firefly Luciferase/Renilla Luciferase,F/R)作为一个重复的数值。
具体实施方式
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合附图及增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒建立的具体试验案例对本发明作进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明首先在细胞水平(以人源化胚胎肾细胞系为例，Human Embryonic Kidneycell lines,HEK293T)通过检测双荧光素酶活性验证了系统表达盒工作有效性；其次，比较了不同UAS数目及不同GAL4激活域(Activating Domain,AD)和结合域(Binding Domain,BD)对目标基因增强表达的差异，通过比较优化最终确定最佳串联UAS数目和DNA激活域及结合域的类型，寻找到一种增强目标基因表达的最佳系统表达盒；然后研究了该最佳系统表达盒在HEK293T细胞中增强下游报告基因Luciferase(简称Luc)高效表达的稳定性(通过检测不同时间点的荧光素酶活性来探讨表达盒的增强稳定性)。进一步在专门生产重组蛋白的中国仓鼠卵巢细胞中对该表达盒的增强效果进行了检验，具体过程如下。
1、Gal4/UAS系统表达盒的构建(表达的目的基因为报告基因，诸如GEP、Luciferase，以下以Firefly Luciferase为例，参见图1)
1.1构建载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP
以pGL2basic载体为模板、Luc-F(BamHI)和Luc-R(NheI)为引物扩增目的片段，再将扩增片段利用BamHI和NheI双酶切，连接到用相应的限制性内切酶酶切的pRS426-CMV-T2A-EGFP载体，构建得到pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP，设计的引物如表1所示，所设计的引物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成：
表1.扩增Luciferase基因所需引物
注：小写字母表示酶切位点(内切酶见括号内)，斜体表示保护碱基。
1.1.1 PCR扩增Luciferase片段
以pGL2basic载体(Addgene)为模板、Luc-F(BamHI)和Luc-R(NheI)为引物，PCR扩增Luciferase片段，PCR反应体系如表2所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
表2.扩增Luciferase基因的PCR反应体系
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测Luciferase片段大小(1632bp)正确。
1.1.2构建载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP；
利用BamHI/NheI双酶切胶回收得到的目的片段(酶切体系如表3A所示)与BamHI/NheI双酶切的表达载体pRS426-CMV-T2A-EGFP(酶切体系如表3B)连接，连接体系如表4，16℃连接过夜，构建质粒pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP，其中，表达载体pRS426-CMV-T2A-EGFP来自本实验室(一种口服酵母携带DNA片段作为新型水产口服DNA疫苗的制备方法及应用，公开日：2015.08.26；公开号：CN104857507A；Yan N,K Xu,X Li,Y Liu,Y Bai,XZhang,B Han,Z Chen,Z Zhang.2015.Recombinant Saccharomyces cerevisiae servesas novel carrier for oral DNA vaccines in Carassius auratus.Fish ShellfishImmunol,47(2),758-765)；然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞(生工生物工程(上海)股份有限公司)，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h。
表3A.Luciferase片段BamHI/NheI酶切体系
表3B.pRS426-CMV-T2A-EGFP的BamHI/NheI酶切体系
表4.Luciferase和pRS426-CMV-T2A-EGFP的连接体系
所构建的pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP表达载体的质粒图谱如图2所示，经酶切鉴定正确(参见图6)后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
1.2构建表达载体pRS426-CMV-Luciferase(简称pRS426-CMV-Luc)
利用NheI和XhoI双酶切构建成功的载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP，胶回收较大片段后利用Taq聚合酶将粘性末端补平，溶液回收目的片段，之后采用T4DNA连接酶(T4ligase)将载体自连，16℃连接过夜，构建质粒pRS426-CMV-Luciferase，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h。质粒图谱如图3所示，经酶切鉴定正确(参见图6)后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
1.3构建载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS
首先从pll3.7-U6-sgVEGF-Gal4BD-hSpCas9载体上以BD-F和BD-R扩增NLS-Gal4BD片段，同时利用Plenti-EF1a-Backbone(NI)载体为模板，以VP64-F和VP64-R为引物扩增VP64片段；然后以上面两步扩增的PCR产物为模板，以BD-F和VP64-R为引物扩增NLS-Gal4BD-VP64片段，再次，利用T2A-F(NheI)和NLS-R(BsmBI)为引物，以上一步得到的片段为模板，扩增T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS全序列。最后，用NheI和BsmBI(BsmBI是XhoI的同尾酶，最适活性温度为55℃)双酶切，连接到用NheI和XhoI双酶切的pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP上，构建载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS。载体构建所需引物如表5所示，所设计的引物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成：
表5.载体构建所需引物
注：小写字母表示酶切位点(内切酶见括号内)，斜体表示保护碱基。
1.3.1 PCR扩增片段T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS
1)以pll3.7-U6-sgVEGF-Gal4BD-hSpCas9载体(沈俊岑.2016.哺乳动物细胞中Gal4BD-Cas9系统介导的同源重组效率研究)为模板、BD-F和BD-R为引物，PCR扩增NLS-Gal4BD片段(575bp)，PCR反应体系如表6所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
表6.扩增NLS-Gal4BD片段的PCR反应体系
2)利用Plenti-EF1a-Backbone(NI)载体(张志强.2014.TALE人工核酸酶组装方法及结构优化的研究)为模板，以VP64-F和VP64-R为引物扩增VP64片段(165bp)；PCR反应体系如表7所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
表7.扩增VP64片段的PCR反应体系
3)然后，以上两步扩增的PCR产物为模板，以BD-F和VP64-R为引物通过OverlapPCR(又称为重叠PCR)扩增部分T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS片段(NLS-Gal4BD-VP64，760bp)。PCR反应体系如表8所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
表8.扩增NLS-Gal4BD-VP64片段的PCR反应体系
4)最后，利用T2A-F(NheI)和NLS-R(BsmBI)为引物，以上一步得到的目的片段为模板，扩增T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS全序列。PCR反应体系如表9所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min20s，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
表9.扩增T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS片段的PCR反应体系
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小(834bp)正确。
1.3.2构建载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS
利用BsmBI/NheI双酶切胶回收得到的目的片段(酶切体系如表10所示)，XhoI/NheI双酶切表达载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP(酶切体系如表11所示)，然后16℃连接过夜(连接体系如表12所示)，构建质粒pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简写为pRS26-CMV-Luc-BD-VP64)，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h。
表10.目的片段BsmBI/NheI酶切体系
表11.骨架的XhoI/NheI酶切体系
表12.目的片段和骨架的连接体系
构建的表达载体pRS26-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简写为pRS26-CMV-Luc-BD-VP64)的质粒图谱如图4所示，经酶切鉴定正确(参见图6)后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
1.4构建表达载体pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS
以酵母AH109菌株基因组为模板，利用UAS-F(SacII)和UAS-R(NotI)扩增目的片段，再将扩增片段利用SacII和NotI双酶切，连接到用相应限制性内切酶酶切的pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS载体上，构建pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS，设计的引物如表13所示，所设计的引物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成：
表13.扩增UAS基因所需引物
注：小写字母表示酶切位点(内切酶见括号内)，斜体表示保护碱基。
1.4.1PCR扩增2UAS片段
以酵母AH109菌株(生物风(公司))基因组为模板(含有2UAS)、UAS-F(SacII)和UAS-R(NotI)为引物，PCR扩增UAS片段，PCR反应体系如表14所示，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
表14.扩增2UAS基因的PCR反应体系
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测2UAS片段大小(360bp)正确。
1.4.2构建表达载体pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS；
利用SacII/NotI双酶切胶回收得到的目的片段(酶切体系如表15所示)，利用SacII/NotI双酶切表达载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(酶切体系如表16)，然后16℃连接过夜(连接体系如表17)，构建质粒pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简写为pRS426-2UAS-CMV-Luc-BD-VP64)，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h。
表15.目的片段的SacII/NotI酶切体系
表16.骨架的SacII/NotI酶切体系
表17.目的片段和骨架的连接体系
所构建的pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简写为pRS426-2UAS-CMV-Luc-BD-VP64)表达载体的质粒图谱如图5所示，经酶切鉴定正确(参见图6)后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
2、Gal4/UAS系统表达盒增强效果的检测
2.1细胞培养及转染
100U/mL的青霉素、链霉素以及10％(w/v)的热灭活胎牛血清添加到DMEM高糖培养基(Gibco，pH值范围为7.2～7.4)中，用于HEK293T细胞系(ATCC公司)的生长和增殖。培养条件为：含5％CO2和相对湿度90％，及37℃无菌无毒的细胞操作和培养环境。
当HEK293T细胞密度达到70～80％即细胞处于对数生长期时，以24孔板进行细胞的贴壁转染，具体过程如下：
(1)设置分组，分为含有Gal4/UAS系统表达盒的实验组和不含有该表达盒的对照组两组，每组三个重复，另外设置了转染参照组，实验组、对照组及参照组均以单表达海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)的pRL-TK载体(Addgene)作为内参，所用载体与内参载体的摩尔比为20:1，详细转染体系如表18所示；
(2)计算转染体系，在标记好的1.5mL灭菌离心管中按量将各组质粒分别混合于50μL/孔opti-MEM(Gibco)中，低速涡旋，室温静置孵育约5min，得到质粒混合液；
(3)将1.5μL/孔Sofast-转染试剂悬空滴加到48.5μL/孔opti-MEM中，尽量避免接触到离心管的塑料管壁，轻轻涡旋，室温静置孵育1～2min，得到Sofast混合液；
(4)将充分混匀的Sofast混合液按50μL/孔的量，边轻轻涡旋边悬空滴加于预混的质粒混合液中，室温静置孵育10～15min；
(5)将100μL/孔含有质粒和Sofast转染试剂的opti-MEM混合液加入培养孔中，轻缓地摇匀后置于培养箱中；
(6)转染24～48h后进行观察，细胞换液。
在转染实验组和对照组载体同时，利用转染参照组评估细胞转染效率及与EGFP融合的Luciferase的表达情况。在同批次细胞(生长状况、转染时细胞密度等均相同)、相同实验操作下共转染pRS426-CMV-T2A-EGFP和pRL-TK以及pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP和pRL-TK，转染30h后在荧光显微镜下观察EGFP发光情况，如图7所示，在真核生物强启动子CMV表达载体基础上，通过将Gal4/UAS系统引入，构建一种能够增强目的基因表达的Gal4/UAS系统表达盒。首先选择真核生物强启动子CMV启动下游基因的表达，成功构建了pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP载体，荧光观察结果显示CMV启动子可以在HEK293T细胞中激活报告基因EGFP和Luciferase的表达。
通过比较发现：在相同紫外激发光强下，表达载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP中的EGFP发光强度要明显低于表达载体pRS426-CMV-T2A-EGFP，推断可能是因为细胞内表达的外源蛋白数量越多，细胞内的物质和能量消耗越大，细胞物质代谢的限制导致和Luciferase融合表达的EGFP蛋白总量表达的相对较低。此外，表达载体pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP中Luciferase和EGFP基因是融合表达，根据GFP发光情况，可以估计Luciferase基因的表达情况，也为双荧光素酶活性检测提供参考，以便试验结果更加可靠。
表18.HEK293T细胞转染体系
2.2双荧光素酶活性检测
转染后约65h开始收集HEK293T细胞，首先弃去培养孔中的旧培养基，用PBS小心清洗两次，然后严格按照
报告基因检测系统操作步骤(试剂来自普洛麦格公司)和酶标仪(Model:Varioskan Flash,THERMO)使用方法操作，最后利用GraphpadPrism 5软件数据分析，结果如图8所示，双荧光素酶活性检测显示实验组Luciferase的相对表达量是对照组(不含Gal4/UAS系统表达盒，仅由CMV启动子激活)16倍以上，因此，有理由推断构建的Gal4/UAS系统表达盒对于基因的表达增强效果极其显著。该系统表达盒不仅结构简单、自动激活，还能够产生级联放大效果。很有可能为在基因治疗和重组蛋白生产以及DNA疫苗预防和免疫过程中增强目的基因表达提供一种新方法。
3、比较和优化Gal4/UAS系统表达盒
试验设计如表19所示，首先根据单一变量原则，在控制相同GAL4激活域类型的前提下，改变上游激活序列UAS的数目来构建不同表达载体，通过比较不同组间Luciferase的相对表达量，寻找最佳UAS数目；其次在控制相同UAS数目的情况下，改变GAL4的激活域类型，通过比较不同组间Luciferase的相对表达量，找到最佳激活域类型；此外，通过构建不同系统表达盒(UAS和GAL4激活域的有无)研究Gal4/UAS系统表达盒的结构完整性对增强效果的影响。
表19.比较和优化表达载体的试验设计(+/-：有/无)
3.1构建表达载体pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS
以酵母AH109菌株基因组为模板，利用UAS1-F(SacII)和UAS1-R(NotI)扩增目的片段，再将扩增片段利用SacII和NotI双酶切，连接到用相应限制性内切酶酶切的pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS载体上，构建pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS，设计的引物如表20所示，所设计的引物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成：
表20.扩增4UAS基因所需引物
注：小写字母表示酶切位点(内切酶见括号内)，斜体表示保护碱基。
3.1.1扩增4UAS片段
以酵母AH109菌株基因组为模板、UAS1-F(SacII)和UAS1-R(NotI)为引物，PCR扩增4UAS片段，PCR反应体系如表21所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
表21.扩增4UAS基因的PCR反应体系
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测4UAS(即UAS拷贝数为4)目的片段大小(406bp)正确。
3.1.2构建表达载体pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS
利用SacII/NotI双酶切胶回收得到的目的片段(酶切体系如表22所示)，SacII/NotI双酶切表达载体pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(酶切体系如表23所示)，然后16℃过夜连接(连接体系如表24)，构建质粒pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(简写为pRS426-4UAS-CMV-Luc-BD-VP64)，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养基中37℃培养8h。
表22.目的片段SacII/NotI酶切体系
表23.骨架的SacII/NotI酶切体系
表24.目的片段和骨架的连接体系
所构建的pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS表达载体(简写为pRS426-4UAS-CMV-Luc-BD-VP64)质粒图谱如图9所示，经酶切鉴定正确(参见图12)后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
3.2构建表达载体pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS
以pll3.7-U6-sgVEGF-Gal4BD-hSpCas9载体为模板、BD-F和BD-R(AD)为引物，PCR扩增NLS-Gal4BD片段，PCR反应体系如表6所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。
以JMB52-SP1.BS-PAM5(GGGTG).Mu4(T)载体(Xu K,C Ren,Z Liu,T Zhang,TZhang,D Li,L Wang,Q Yan,L Guo,J Shen,Z Zhang.2015.Efficient genomeengineering in eukaryotes using Cas9from Streptococcus thermophilus.Cell MolLife Sci,72(2),383-399)为模板，利用AD-F和AD-R扩增目的片段，即GAL4AD片段(414bp)，然后利用BD-F和AD-R引物通过重叠PCR连接NLS-Gal4BD片段，接着利用T2A-F和NLS-R(AD)引物将T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS目的片段(1083bp)扩增，再将该目的片段利用BsmBI和NheI双酶切，连接到用XhoI和NheI双酶切的pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP，构建质粒pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS(简写为pRS26-CMV-Luc-BD-AD)，然后再构建pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS，此过程与pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS载体构建非常类似，详细步骤不再复述。所需引物如表25所示，所设计的引物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成：
表25.载体构建所需引物
注：小写字母表示酶切位点，斜体表示保护碱基。
所构建的pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS表达载体(简写为pRS426-2UAS-CMV-Luc-BD-AD)的质粒图谱如图10所示，经酶切鉴定正确(参见图12)后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
3.3构建载体pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS
以pll3.7-U6-sgVEGF-Gal4BD-hSpCas9载体为模板、BD-F和BD-R(VPR)为引物，PCR扩增NLS-Gal4BD片段，PCR反应体系如表6所述，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃，保持。以SP-dCas9-VPR(Addgene)载体为模板，利用VPR-F和VPR-R扩增目的片段，即VP64-p65-Rta片段(968bp)，然后利用BD-F和VPR-R引物通过重叠PCR连接NLS-Gal4BD片段，接着利用T2A-F和NLS-R(VPR)引物将T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS目的片段(1637bp)扩增，再将该目的片段利用BsmBI和NheI双酶切，连接到用XhoI和NheI双酶切的pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP，构建质粒pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS(简写为pRS26-CMV-Luc-BD-VPR)，然后构建pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS，此过程与pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS载体构建非常类似，详细步骤略。所需引物如表26所示，所设计的引物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成：
表26.载体构建所需引物
注：小写字母表示酶切位点，斜体表示保护碱基。
所构建的pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS表达载体(简写为pRS426-2UAS-CMV-Luc-BD-VPR)的质粒图谱如图11所示，经酶切鉴定正确(参见图12)后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
3.4缺失UAS或GAL4激活域的表达载体
为了检验Gal4/UAS系统表达盒工作有效性，即表达盒改变或缺失某些元件是否还能正常工作，构建了仅含上游激活序列UAS和仅含GAL4基因的表达载体，所构建的载体如下：pRS426-2UAS-CMV-Luciferase、pRS426-4UAS-CMV-Luciferase、pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS(简写为pRS426-CMV-Luc-BD-AD)、pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS(简写为pRS426-CMV-Luc-BD-VPR)，表达载体的质粒图谱分别如图13、14、15、16所示；以上载体经过BamHI与EcoRV双酶切鉴定结果如图17所示，酶切鉴定正确后送阳性质粒到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，保存测序正确的质粒备用。
4、不同Gal4/UAS系统表达盒的优化比较及工作有效性探究
4.1细胞培养及转染
首先进行HEK293T细胞培养，接着进行细胞转染实验，该过程和【2.1细胞培养及转染】类似，不再复述；
4.2双荧光素酶活性检测
转染后约65h收集开始细胞，弃去培养孔中的旧培养基，用PBS小心清洗两次，严格按照
报告基因检测系统步骤(试剂来自普洛麦格公司，来自美国)和酶标仪(Model:Varioskan Flash,from THERMO company,USA)使用方法进行操作，然后利用GraphpadPrism5软件数据分析，结果如图18所示。
在Gal4/UAS系统表达盒概念验证成立的基础上，对上游激活序列UAS和GAL4激活蛋白进行改造，通过比较Luciferase的相对表达量寻找一种较好的表达盒以及说明表达盒工作完整性的问题。参考相关文献，将上游激活序列UAS的数目由2个增加到4个，构建表达盒pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS(如图9所示)；同时，GAL4激活域VP64换成GAL4AD(图10)和VP64-p65-Rta(三个激活域串联，图11)。在研究Gal4/UAS系统表达盒结构完整性的过程中，构建了仅含有UAS上游激活序列和仅含有GAL4结合蛋白与激活蛋白的表达载体(分别如图13、14、15、16所示)。
经过细胞培养、转染、荧光观察、收集细胞、双荧光素酶活性检测、数据分析等过程，结果显示由pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS表达盒催化的Luciferase相对表达量(是对照组的23倍)高于pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS；另外，对于仅含有UAS序列的表达载体而言，不管上游激活序列UAS数目如何，和对照组相比均没有明显效果；但对于仅含有GAL4结合蛋白和激活蛋白的表达载体来讲，均有不同程度的增强作用，特别是对于pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS而言更是如此；在Gal4/UAS系统表达盒中，不同GAL4激活蛋白对Luciferase相对表达量贡献不同，在实验中发现GAL4激活蛋白VP64要优于AD以及三个激活域串联的情况；就Luciferase相对表达量来讲，pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS最高，pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS其次，pRS426-2UAS-CMV-Luciferase最低；pRS426-2UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS最高，pRS426-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-AD-NLS其次，pRS426-2UAS-CMV-Luciferase最低；通过比较发现：由完整Gal4/UAS系统表达盒激活的Luciferase相对表达量要高于仅含部分原件的系统表达盒，具体结果如图18。
根据比较和优化及重复试验的结果推断：在一定程度上，增加上游激活序列UAS的数目可以增强表达盒增强效果；不管UAS的数目如何，对于仅含上游激活序列的表达载体而言，可能均不会产生明显增强效果，这也验证或更加确定Gal4/UAS系统是一个二元表达系统。但对于仅含GAL4结合蛋白和激活蛋白的表达载体而言，会产生不同程度的增强效果，且效果还比较显著，根据相关文献(Triezenberg S J et al.1988)，在I型单纯性疱疹病毒的基因中，会优先翻译病毒的裂解细胞和感染的基因，这些基因中也会编码5种早期蛋白(immediate early proteins,IE proteins)，而病毒体里被称作VP16蛋白(O'Hare 1993；Triezenberg Steven J 1995)会强有力和特异性的诱导病毒早期蛋白的合成(Ottosen etal.2006)。先前的研究显示和IE基因特异关联的VP16蛋白激活性能被IE基因上游调控元件所调节的，然而在这个报道中VP16蛋白并没有和DNA结合序列特异结合。他们也进行了进一步研究，也正是基于实验结果，作者猜想VP16获得特异活性可能是通过蛋白与蛋白相互作用而不是蛋白与DNA。如果这种假设成立的话，在本实验中就可以解释为什么仅含有GAL4激活蛋白依然可以发挥增强基因表达的功能，而且相较于对照组，增强效果还非常显著。即表达出的GAL4激活蛋白也可能单独地和细胞内转录相关的蛋白因子作用，从而影响基因的表达。另一方面，结构完整的系统表达盒增强效果要好于仅含部分原件的Gal4/UAS系统表达盒，这也说明了该表达载体结构完整性对发挥作用有益；不同GAL4激活蛋白对Luciferase相对表达量贡献不同，在实验中发现GAL4激活蛋白VP64要优于AD以及三个激活域(VP64-p65-Rta，即VPR)串联的情况。有理由相信GAL4激活蛋白之间可能存在结合到特定序列的竞争机制(Pan et al.2014)，从而导致串联三个或多个GAL4激活蛋白的增强效果弱于单个。
5、Gal4/UAS系统表达盒稳定性检测
在比较和优化系统表达盒后，得到了最佳增强基因表达效果的表达载体pRS426-4UAS-CMV-Luciferase-T2A-NLS-Gal4BD-VP64-NLS。通过查阅资料和及结合本实验室的操作，对表达盒的稳定性进行检测。在转染HEK293T细胞后不同时间点(转染后24h，48h、72h、96h/4day、120h/5day……12day，13day)分别对实验组和对照组进行检测报告基因Luciferase酶活性(均以单表达海肾荧光素酶活pRL-TK表达载体为内参，其他处理条件相同)。检测后发现实验组在细胞转染后的第6～10天均维持较高的Luciferase表达量，说明它能够持久高效地增强基因的表达，而且在转染后的第8天细胞内Luciferase的表达量即细胞总的Luciferase累积量达到峰值，为利用该表达盒生产其他重组蛋白如促红细胞生成素、干扰素、白细胞介素等提供了重要参考；上述实验所得结论和对照组的变化趋势基本一致，且总是保持较高的Luciferase相对表达量，而对照组则维持较低水平的表达，具体结果如图19所示。这些结果和分析提示：在重组蛋白生产和通过非病毒导入途径来提高目的基因表达的基因治疗以及重组DNA疫苗预防和免疫中，Gal4/UAS系统表达盒能够成为增强目的基因表达的强有力工具。
6、CHO细胞上检测Luciferase基因的表达
6.1 CHO细胞转染和荧光观察
先在CHO细胞(赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)上比较实验组和对照组的Luciferase报告基因相对表达；CHO细胞转染实验组和对照组载体的同时，利用转染参照组进行评估细胞转染效率及与EGFP融合的Luciferase的表达情况。在同批次细胞(生长状况、转染时细胞密度等均相同)、相同实验操作共转染pRS426-CMV-Luciferase-T2A-EGFP和pRL-TK，转染30h后在荧光显微镜下观察EGFP发光，从图20可以看出利用Lipofectamine-2000转染CHO细胞系的效率在50％左右，理论上可以根据融合表达载体pRS426-CMV-Luc-T2A-EGFP中EGFP的发光情况可以大致判断Luciferase报告基因的表达，进而可为后来的比较对照组和实验组在CHO细胞系上的增强效果做铺垫，提供检测参考或依据。另外，通过未转染的空细胞组，可以大致评估CHO细胞的生长状况，细胞密度、以及转染试剂Lipofectamine-2000对细胞的毒性。
6.2 CHO细胞上的双荧光素酶活性检测
转染后约65h开始收集CHO细胞，首先弃去培养孔中的旧培养基，用PBS小心清洗两次，然后严格按照
报告基因检测系统操作步骤(试剂来自普洛麦格公司)和酶标仪(Model:Varioskan Flash,THERMO)使用方法进行操作，最后利用Graphpad Prism5软件数据分析，从图21可以看出在CHO细胞上利用构建的Gal4/UAS系统表达盒来增强Luciferase报告基因的表达，与对照组相比，实验组Luciferase的相对表达量是对照组的8倍以上，两者达到了极显著水平，该实验结果表明在专门生产重组蛋白的CHO细胞上，该系统表达盒依然能够发挥强有力的增强作用，这也提示将报告基因Luciferase换成其他功能性基因，增强效果依然显著。
值得一提的是，本发明进一步在专门生产重组蛋白的中国仓鼠卵巢细胞中，检验该表达盒的增强效果，结果显示相对于对照组来说，实验组载体的增强效果大概是8倍以上。
<110>西北农林科技大学
<120>一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立
<160> 20
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 1
cgcggatcca tggaagacgc caaaaacat 29
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 2
gatgctagcc ttcttggcct ttatgaggat c 31
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 3
catgcggtga cgtcgaggag aatcctggcc caccaaagaa gaagcggaag gttcggc 57
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 4
cagcccgtcc caggtcctcc tctgagatca gcttc 35
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 5
ggaggacctg ggacgggctg acgcattg 28
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 6
acctttctct tcttcttggg gttaatcagc atgtccaggt cg 42
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 7
gtagctagcg gcagtggaga gggcagagga agtctgctaa catgcggtga cgtcgagg 58
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
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ttgcgtctcc tcgagctagg aaccgctggc ctccaccttt ctcttcttct tggg 54
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cagcccgtcc caggtcctcc tctgagatca gcttc 35
Claims (10)
1.一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒，其特征在于：该系统表达盒包括真核启动子以及依次排列于真核启动子下游的目的基因插入位点、剪切肽序列和带有核定位信号的GAL4蛋白序列，所述真核启动子的上游设置有拷贝数为0~6个的上游激活序列UAS，所述表达盒由自身携带的启动子激活下游目的基因及GAL4 结合蛋白和GAL4激活蛋白的表达，GAL4结合蛋白会特异性的识别并结合上游激活序列，或者，在未能够结合上游激活序列情况下，利用与结合蛋白偶联的GAL4激活蛋白招募转录相关因子，使得DNA弯曲，形成一个可以和启动子特异结合的蛋白复合体，从而更快的起始基因转录；转录后翻译出来的GAL4结合蛋白和激活蛋白，在剪切肽以及核定位信号协助下会再次的和上游激活序列特异性结合，或者，在未能够结合上游激活序列情况下，进一步增强基因的转录和翻译。
2.根据权利要求1所述一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒，其特征在于：所述真核启动子选自CMV。
3.根据权利要求1所述一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒，其特征在于：所述剪切肽序列选自T2A、P2A、E2A或F2A序列。
4.根据权利要求1所述一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒，其特征在于：所述GAL4蛋白的DNA激活域选自VP64、p65、Rta、GAL4AD、VP64中的一种或多种相互串联的形式，DNA结合域选自GAL4BD。
5.根据权利要求1所述一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒，其特征在于：所述上游激活序列UAS的拷贝数优选为4~6个。
6.根据权利要求1所述一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒，其特征在于：所述系统表达盒包括顺次排列的以下元件：拷贝数为4的上游激活序列UAS、真核启动子CMV、目的基因插入位点、剪切肽序列、第一核定位信号序列、GAL4蛋白DNA结合域GAL4BD序列、GAL4蛋白DNA激活域VP64序列以及第二核定位信号序列。
7.一种如权利要求1所述的增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
将拷贝数为0~6个的上游激活序列UAS以及具有核定位信号且可以自行与目的基因翻译产物剪切分离的GAL4蛋白序列分别插入至骨架载体上真核启动子的上游及下游目的基因插入位点之后，得到所述系统表达盒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述系统表达盒的构建具体包括以下步骤：
1）从pll3.7-U6-sgVEGF-Gal4BD-hSpCas9载体上扩增一端连接有核定位信号序列的GAL4蛋白DNA结合域GAL4BD的序列NLS-Gal4BD，从Plenti-EF1a-Backbone(NI)、JMB52-SP1.BS-PAM5(GGGTG).Mu4(T)或SP-dCas9-VPR载体上对应扩增GAL4蛋白DNA激活域VP64、GAL4AD或VP64-p65-Rta的序列；然后以NLS-Gal4BD与VP64、GAL4AD或VP64-p65-Rta的序列为模板，通过重叠PCR扩增得到两端均连接有核定位信号序列的GAL4蛋白序列NLS-Gal4BD-VP64-NLS、NLS-Gal4BD-AD-NLS或NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS；
2）以载体pRS426-CMV-T2A-EGFP为骨架，将NLS-Gal4BD-VP64-NLS、NLS-Gal4BD-AD-NLS或NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS插入至骨架中真核启动子CMV的下游，以替换骨架中的报告基因EGFP，得到所述系统表达盒；或者，以载体pRS426-CMV-T2A-EGFP为骨架，将NLS-Gal4BD-VP64-NLS、NLS-Gal4BD-AD-NLS或NLS-Gal4BD-VP64-p65-Rta-NLS插入至骨架中真核启动子CMV的下游，以替换骨架中的报告基因EGFP，在替换报告基因EGFP之后，将1~6个拷贝数的上游激活序列UAS插入至骨架中真核启动子CMV的上游，得到所述系统表达盒。
9.如权利要求1所述的增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒在重组蛋白表达中的应用，其特征在于：所述重组蛋白包括医用或药用的蛋白类酶制剂、抗体、免疫抗原。
10.如权利要求1所述的增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒在基因治疗用非病毒过表达载体系统或重组酵母介导的DNA疫苗的构建中的应用。
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