CN113454217A - 用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于研究蛋白质‑蛋白质相互作用的方法和系统。这些系统利用彼此可互补的多肽的非功能性片段在体内形成功能性完全的片段。功能性完全的多肽释放可以结合并激活或抑制报道元件的转录调控多肽。

Description

用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统
交叉引用
本申请要求于2018年12月7日提交的美国临时申请号62/776,992的权益，该申请通过引用并入本文。
发明内容
本文描述了用于研究蛋白质-蛋白质相互作用、筛选蛋白质-蛋白质相互作用的拮抗剂或激动剂或者发现新的蛋白质-蛋白质相互作用的核酸、系统和方法。这些核酸和系统用于筛选信号传导通路的小分子或生物激动剂或拮抗剂，诸如G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道和核受体。在一方面，该系统包括编码以下蛋白质的核酸：a)与可以切割靶序列或可被内源性酶切割的酶的非功能性片段融合的诱饵蛋白；b)与可以切割靶序列或可被与a)中的酶或靶序列互补的内源性酶切割的酶的非功能性片段以及转录调控蛋白融合的猎物蛋白(例如，测试蛋白)；以及c)在可被转录调控蛋白结合的调控元件控制下的报道基因。诱饵和猎物的缔合复原功能性完全的酶或靶序列，该酶或靶序列允许转录调控蛋白被切割并激活报道基因。在该系统中，报道基因包含唯一分子标识符(UMI)，其对于每个单独的猎物蛋白是唯一的。这使得可以研究任何给定刺激对诱饵和猎物相互作用的影响的多重性测定能够实现。
在一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽的第一核酸，所述诱饵多肽与遍在蛋白多肽(ubiquitin polypeptide)的第一片段偶联；(b)编码猎物多肽的第二核酸，所述猎物多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和转录调控多肽偶联；以及(c)包含报道元件的第三核酸，其中所述报道元件包括调控元件、第一报道基因和第二报道基因，其中所述调控元件被配置为被所述转录调控多肽结合，其中所述第二报道基因编码对所述猎物多肽唯一的RNA序列；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，并启动所述第一报道基因和所述第二报道基因的转录。在某些实施方案中，所述遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段并且所述遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段。在某些实施方案中，所述遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段并且所述遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段。在某些实施方案中，所述转录调控多肽包含合成转录因子。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含Gal4 DNA结合域和-VPR激活域的融合物。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽是膜结合信号传导多肽。在某些实施方案中，所述膜结合诱饵多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶或离子通道。在某些实施方案中，所述膜结合诱饵多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽是细胞内信号传导多肽。在某些实施方案中，所述细胞内诱饵多肽或所述猎物多肽包含核激素受体。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽包含可能与所述信号传导多肽相互作用的细胞内分子。在某些实施方案中，所述调控元件包括诱导型调控元件。在某些实施方案中，所述诱导型调控元件包含Gal4上游激活序列(Gal4UAS)。在某些实施方案中，所述第一报道基因编码荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌型胎盘碱性磷酸酶。在某些实施方案中，所述第一报道基因编码荧光蛋白或萤光素酶蛋白。在某些实施方案中，所述第一核酸包含编码无启动子荧光蛋白的序列。在某些实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。在某些实施方案中，所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的序列。在某些实施方案中，所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的attB序列。在某些实施方案中，所述第二核酸包含编码选择性表面标志物的序列。在某些实施方案中，所述选择性表面标志物是血凝素多肽。在某些实施方案中，本文描述了包含所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸的细胞。在某些实施方案中，所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在转座元件的整合位点处。在某些实施方案中，所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在预定的基因组位置。在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测测试物质对蛋白质-蛋白质相互作用的影响的方法，包括使包含本文所述的系统的细胞或细胞群接触所述测试物质。在某些实施方案中，所述测试物质是化学品。
在一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽的第一核酸，所述诱饵多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联；(b)编码猎物多肽的第二核酸，所述猎物多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联；以及(c)包含报道元件的第三核酸，其中所述报道元件包括调控元件、第一报道基因和第二报道基因，其中所述调控元件被配置为被所述转录调控多肽结合，其中所述第二报道基因编码对所述猎物多肽唯一的RNA序列；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述第一报道基因和所述第二报道基因的转录。在某些实施方案中，所述蛋白酶多肽的第一片段是蛋白酶多肽的C-末端片段并且所述蛋白酶多肽的第二片段是蛋白酶多肽的N-末端片段。在某些实施方案中，所述蛋白酶多肽的第一片段是蛋白酶多肽的N-末端片段并且所述蛋白酶多肽的第二片段是蛋白酶多肽的C-末端片段。在某些实施方案中，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段衍生自烟草蚀纹病毒核包涵体a内肽酶(TEV蛋白酶)。在某些实施方案中，所述转录调控多肽包含合成转录因子。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含Gal4DNA结合域和-VPR激活域的融合物。在某些实施方案中，所述第二核酸编码与所述猎物多肽偶联的第二转录调控多肽，其中所述第二转录调控多肽被配置为被所述活性蛋白酶切割。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽是膜结合信号传导多肽。在某些实施方案中，所述膜结合诱饵多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶或离子通道。在某些实施方案中，所述膜结合信号传导多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽是细胞内信号传导多肽。在某些实施方案中，所述细胞内诱饵多肽或所述猎物多肽包含核激素受体。在某些实施方案中，所述诱饵多肽或所述猎物多肽包含可能与所述诱饵多肽相互作用的细胞内分子。在某些实施方案中，所述调控元件包括诱导型调控元件。在某些实施方案中，所述诱导型调控元件包含Gal4上游激活序列(Gal4 UAS)。在某些实施方案中，所述第一报道基因编码荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型胎盘碱性磷酸酶。在某些实施方案中，所述第一报道基因编码荧光蛋白或萤光素酶蛋白。在某些实施方案中，所述第一核酸包含编码无启动子荧光蛋白的序列。在某些实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。在某些实施方案中，所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的序列。在某些实施方案中，所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的attB序列。在某些实施方案中，所述第二核酸包含编码选择性表面标志物的序列。在某些实施方案中，所述选择性表面标志物是血凝素多肽。在某些实施方案中，本文描述了包含所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸的细胞。在某些实施方案中，所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在转座元件的整合位点处。在某些实施方案中，所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在预定的基因组位置。在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测测试物质对蛋白质-蛋白质相互作用的影响的方法，包括使包含本文所述的系统的细胞或细胞群接触所述测试物质。在某些实施方案中，所述测试物质是化学品。
附图说明
图1A描绘了在诱饵多肽(ARRB2)与猎物多肽(膜相关)结合之前处于稳态的拆分(split)蛋白酶(左)或拆分遍在蛋白(右)的蛋白质-蛋白质相互作用系统的示意图。
图1B描绘了在诱饵多肽(ARRB2)与猎物多肽(膜相关)结合之后处于稳态的拆分蛋白酶(左)或拆分遍在蛋白(右)的蛋白质-蛋白质相互作用系统的示意图。
图2图示了与双拆分TEV系统相比，发光报道拆分遍在蛋白的诱导倍数。
图3A描绘了使用拆分遍在蛋白蛋白质-蛋白质相互作用系统并用扎莫特罗处理的细胞的剂量反应曲线。
图3B描绘了使用双拆分TEV蛋白质-蛋白质相互作用系统并用扎莫特罗处理的细胞的剂量反应曲线。
具体实施方式
在一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与遍在蛋白多肽的第一片段偶联；(b)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和转录调控多肽偶联；以及(c)包含调控元件的第三核酸，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录。
在另一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与遍在蛋白多肽的第一片段偶联；以及(b)编码猎物多肽或诱饵多肽并且包含调控元件的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和转录调控多肽偶联，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录。
在另一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽或猎物多肽并且包含调控元件的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与遍在蛋白多肽的第一片段偶联，该调控元件被转录调控多肽和报道元件结合；以及(b)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和所述转录调控多肽偶联；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录。
在另一方面，本文描述了一种用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，包括：(a)使细胞受到物理或化学刺激，所述细胞包含：(i)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与遍在蛋白多肽的第一片段偶联；(ii)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和转录调控多肽偶联；以及(iii)包含调控元件的第三核酸，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录；以及(b)进行测量所述报道元件的转录的至少一项测定。
在另一方面，本文描述了一种用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，包括：(a)使细胞受到物理或化学刺激，所述细胞包含：(i)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与遍在蛋白多肽的第一片段偶联；以及(ii)编码猎物多肽或诱饵多肽并且包含调控元件的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和转录调控多肽偶联，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录；以及(b)进行测量所述报道元件的转录的至少一项测定。
在另一方面，本文描述了一种用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，包括：(a)使细胞受到物理或化学刺激，所述细胞包含：(i)编码诱饵多肽或猎物多肽并且包含调控元件的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与遍在蛋白多肽的第一片段偶联，该调控元件被转录调控多肽和报道元件结合；以及(ii)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和所述转录调控多肽偶联；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录；以及(b)进行测量所述报道元件的转录的至少一项测定。
在另一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联；(b)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联；以及(c)包含调控元件的第三核酸，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录。
在另一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联；(b)编码猎物多肽或诱饵多肽并且包含调控元件的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录。
在另一方面，本文描述了一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：(a)编码诱饵多肽或猎物多肽并且包含调控元件的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；(b)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录。
在另一方面，本文描述了一种用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，包括：(a)使细胞受到物理或化学刺激，所述细胞包含：(i)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联；(ii)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联；以及(iii)包含调控元件的第三核酸，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录；以及(b)进行测量所述报道元件的转录的至少一项测定。
在另一方面，本文描述了一种用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，包括：(a)使细胞受到物理或化学刺激，所述细胞包含：(i)编码诱饵多肽或猎物多肽的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联；(ii)编码猎物多肽或诱饵多肽并且包含调控元件的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录；以及(b)进行测量所述报道元件的转录的至少一项测定。
在另一方面，本文描述了一种用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法，包括：(a)使细胞受到物理或化学刺激，所述细胞包含：(i)编码诱饵多肽或猎物多肽并且包含调控元件的第一核酸，该诱饵多肽或猎物多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联，该调控元件被所述转录调控多肽和报道元件结合；(ii)编码猎物多肽或诱饵多肽的第二核酸，该猎物多肽或诱饵多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联；其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放，与所述调控元件结合，并启动所述报道元件的转录；以及(b)进行测量所述报道元件的转录的至少一项测定。
在以下描述中，阐述了某些特定细节以提供对各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践所提供的实施方案。除非上下文另有要求，否则在整个说明书和随后的权利要求书中，词语“包含”及其变体，诸如“包括”应被解释为开放、包容性的，即“包括但不限于”。除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。还应注意，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”通常采用其包括“和/或”的含义。此外，本文提供的标题仅为方便起见，并不解释要求保护的实施方案的范围或含义。
如本文所用的，术语“约”是指与所陈述的量相差10％以内的量。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的多肽链和其他肽，诸如接头和结合肽)可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，只要蛋白质保持期望的活性，多肽可以含有对于原生或天然序列的修饰。这些修饰可以是有意的(如通过定点诱变)，也可以是偶然的(诸如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增而产生的错误)。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在比对序列并引入空位(如果必要)以达到最大的序列同一性百分比之后，并且在不将任何保守性置换认定为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。可以通过各种已知的方式实现用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对，例如使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性值％。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已与用户文档一起提交至美国版权局(Washington D.C.,20559)以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.(South San Francisco,Calif.)公开获得，或者可以从源代码编译。应当编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不改变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对/与/相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者，也可以表述为给定氨基酸序列A与/对/相对于给定氨基酸序列B具有/包含一定的氨基酸序列同一性％)计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的氨基酸序列同一性％将不等于B对A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性％值均如前一段所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
本文所述系统的多肽可由核酸编码。核酸是一种包含两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸。在某些实施方案中，核酸是可用于将编码多肽的多核苷酸转运到细胞中的载体的组分。如本文所用的，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体或“整合载体”，其可以整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是“附加型”载体，例如，能够进行染色体外复制的核酸。能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。合适的载体包括质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体等。在表达载体中，用于控制转录的启动子、增强子、聚腺苷酸化信号等调控元件可以衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫的基因。附加地，可以并入在宿主中的复制能力(通常由复制起点赋予)以及促进转化体识别的选择基因。可以采用衍生自诸如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒的载体。可将质粒载体线性化以用于整合到染色体位置。载体可以包含指导向基因组中的位点特异性整合限定的位置或受限位点组的序列(例如，AttP-AttB重组)。附加地，载体可以包含衍生自用于整合的转座元件的序列。
如本文所用的术语“转染”或“转染的”是指通过实验室常用的方法有意地将外源核酸引入细胞的方法。转染可以通过例如脂质转染、磷酸钙沉淀、病毒转导或电穿孔实现。转染可以是瞬时的或稳定的。
系统概述
本文描述的系统、核酸和方法用于筛选蛋白质-蛋白质相互作用。在某些实施方案中，可以在诸如物理或化学刺激的外部刺激之前和之后测量蛋白质-蛋白质相互作用，或者与平行运行的对照条件进行比较。化学刺激可以是激动性或拮抗性小分子或生物分子。在某些实施方案中，该系统用于筛选以用于药物发现目的。该系统最少包含编码诱饵多肽、猎物多肽和报道元件的核酸。诱饵多肽包含可切割的分子或切割分子(例如，蛋白酶)的第一片段。猎物多肽包含可切割的分子或切割分子的第二片段。在某些实施方案中，猎物多肽是多个猎物多肽的文库，每个猎物多肽由不同的核酸编码并与不同的报道基因(例如唯一分子标识符)配对。猎物多肽或诱饵多肽进一步包含转录调控多肽。当两个片段靠近时，形成完整的功能性的可切割分子或切割分子，并且通过由系统提供的完全形成的蛋白酶或者作用于可切割分子的内源蛋白酶的切割，转录调控多肽被释放。切割后，转录激活多肽被释放。然后，释放的转录激活多肽在能够被转录激活多肽结合的启动子的控制下激活报道基因的转录。在某些实施方案中，报道基因对于某猎物多肽是唯一的。该系统的附加任选特征包括提供的第二转录调控，其和与第一转录调控多肽相同的多肽缀合或提供在另一多肽上。附加地，在某些实施方案中，转录调控多肽被可以结合阻遏元件的转录阻遏多肽取代，该阻遏元件在组成型活性报道元件的5'端，该报道元件包含报道基因和UMI。这使得能够确定蛋白质-蛋白质相互作用的破坏。包含该系统的核酸还可以包含允许识别和选择已用本文所述系统的组分转染的细胞的附加元件。
在某些实施方案中，编码诱饵多肽、猎物多肽并且包含报道元件的核酸存在于单独的核酸分子，例如单独的质粒或病毒载体上。在某些实施方案中，报道元件与诱饵多肽存在于相同的核酸分子上。在某些实施方案中，报道元件与猎物多肽存在于相同的核酸分子上。
在某些实施方案中，本文描述了部署用于药物发现的系统的方法，该系统包含编码诱饵多肽、猎物多肽和报道元件的核酸。在某些实施方案中，该方法包括在足以使核酸被细胞内化和表达(例如，转染)的条件下使核酸与细胞或细胞群接触；使细胞与物理或化学刺激接触；以及通过一个或多个测定确定报道元件的激活。在某些实施方案中，该方法包括接触包含编码诱饵多肽、猎物多肽和报道元件的核酸的细胞或细胞群；并且通过一个或多个测定确定报道元件的激活。
本文所述的系统具有许多用途。图1A和图1B描绘了作为筛选工具的一种用途，其描绘了单个细胞中的单个相互作用。然而，应当理解，该反应在单个细胞中发生多次，并且不同的细胞可以包含不同的特定猎物多肽，这些不同的特定猎物多肽是包含至少101、102、103、104、105种不同猎物多肽的文库的一部分。在某一非限制性实施方案中，参考图1A，猎物多肽与蛋白酶(TEV，左侧)或遍在蛋白(Ub，右侧)的片段偶联。猎物多肽(其是潜在相互作用物的文库)包含TEV或Ub的互补片段，该互补片段可以与诱饵偶联的片段的活性在功能上互补。该示意图示出了跨膜诱饵，但在某些实施方案中，它可以是可溶性胞质多肽，或与细胞内细胞器的膜关联存在的多肽。在诱饵和猎物多肽相互作用时，如图1B所示，功能复原的蛋白酶(TEV，左)切割蛋白酶切割位点(TCS)以释放转录因子(TF)，该转录因子可以结合启动子，该启动子通过其激活域(Gal4)激活报道元件。在遍在蛋白的情况下，内源性脱遍在蛋白化酶(DUB)可以切割完全复原的遍在蛋白以释放转录因子(TF)，该转录因子可以结合启动子，该启动子通过其激活域(Gal4)激活报道元件。
诱饵和猎物多肽
本文描述的系统、核酸和方法可用于研究诱饵多肽与猎物多肽之间的蛋白质-蛋白质相互作用。如果诱饵或猎物多肽在人类疾病的病理学或病因学中发挥作用，那么它们的相互作用可能是令人感兴趣的。因此，可以提供检测诱饵多肽和与诱饵多肽相互作用的猎物多肽之间的相互作用的多重和有效方法的系统具有高实用性。在某些实施方案中，诱饵或猎物多肽包含细胞表面表达的受体或通道蛋白。细胞表面信号传导多肽是被插入或拴系在膜上并且当被配体结合或受到物理刺激影响时转导影响细胞生物学功能的信号的蛋白质。在某些实施方案中，诱饵多肽包含G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶或离子通道。
在某些实施方案中，诱饵或猎物多肽包含G蛋白偶联受体家族成员。G蛋白偶联受体(GPCR)，也称为七(穿)跨膜域受体，是配体结合细胞表面信号传导蛋白。当配体与GPCR结合时，它会导致GPCR的构象变化，从而使其充当鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。然后GPCR可以通过将与G蛋白结合的GDP交换为GTP来激活相关的G蛋白。然后，与结合的GTP一起，G蛋白的α亚基可以与β和γ亚基解离，以进一步影响直接取决于α亚基类型(Gαs、Gαi/o、Gαq/11、Gα12/13)的细胞内信号传导蛋白或靶向功能蛋白。人类基因组中编码有至少约800个GPCR，大致分为A、B和C类。
在某些实施方案中，诱饵或猎物多肽包含受体酪氨酸激酶家族成员。受体酪氨酸激酶(RTK)是对于许多多肽生长因子、细胞因子和激素具有高亲和力的细胞表面受体。受体酪氨酸激酶已被证明不仅是正常细胞过程的关键调控物，而且在许多类型癌症的发展和进展中也具有关键作用。存在许多种类的RTK，其中的任何成员都可以用作本文所述的系统中的诱饵或猎物多肽。在某些实施方案中，RTK诱饵多肽包括RTK I类(EGF受体家族)(ErbB家族)；RTK II类(胰岛素受体家族)；RTK III类(PDGF受体家族)；RTK IV类(VEGF受体家族)；RTK V类(FGF受体家族)；RTK VI类(CCK受体家族)；RTK VII类(NGF受体家族)；RTK VIII类(HGF受体家族)；RTK IX类(Eph受体家族)；RTK X类(AXL受体家族)；RTK XI类(TIE受体家族)；RTK XII类(RYK受体家族)；RTK XIII类(DDR受体家族)；RTK XIV类(RET受体家族)；RTKXV类(ROS受体家族)；RTK XVI类(LTK受体家族)；RTK XVII类(ROR受体家族)；RTK XVIII类(MuSK受体家族)；RTK XIX类(LMR受体)；或RTK XX类(未确定)成员。
在某些实施方案中，诱饵或猎物多肽包含离子通道。离子通道是允许离子通过通道孔的孔形成膜蛋白。离子通道可以按门控分类，诸如电压门控、配体门控、环核苷酸门控、机械敏感门控、由其他离子(例如，钙)门控、光门控或温度门控。离子通道也可以按门控离子类型分类，并且包括钾、钠、钙、质子、非选择性阳离子或氯。
在某些实施方案中，诱饵或猎物多肽包含细胞内信号传导蛋白。在某些实施方案中，细胞内信号传导蛋白包括核激素受体。核激素受体是一类细胞内蛋白质，其被小分子配体结合并与其他蛋白质相互作用以启动在细胞核内的转录。核激素受体可以存在于与伴侣分子相关的细胞质中或与DNA相关的细胞核中。核激素受体分为以下组：甲状腺激素受体；视黄酸受体；过氧化物酶体增殖物激活受体；Rev-ErbA；RAR相关孤儿受体；肝X受体样受体；维生素D受体样受体；具有两个DNA结合域的NR；肝细胞核因子-4；类视黄醇X受体；睾丸受体；TLX/PNR；COUP/EAR；雌激素受体；雌激素相关受体；3-类固醇受体；NGFIB/NURR1/NOR1；SF1/LRH1；GCNF；和DAX/SHP。在这些组中，核激素受体用NRNC符号表示：NR1A1；NR1A2；NR1B1；NR1B2；NR1B3；NR1C1；NR1C2；NR1C3；NR1D1；NR1D2；NR1F1；NR1F2；NR1F3；NR1H3；NR1H2；NR1H4；NR1H5[44]；NR1I1；NR1I2；NR1I3；NR1X1；NR1X2；NR1X3；NR2A1；NR2A2；NR2B1；NR2B2；NR2B3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3A1；NR3A2；NR3B1；NR3B2；NR3B3；NR3C1；NR3C2；NR3C3；NR3C4；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NR0B1；或NR0B2。在某些实施方案中，诱饵或猎物多肽包括以下中的任何一种或多种：NR1A1；NR1A2；NR1B1；NR1B2；NR1B3；NR1C1；NR1C2；NR1C3；NR1D1；NR1D2；NR1F1；NR1F2；NR1F3；NR1H3；NR1H2；NR1H4；NR1H5[44]；NR1I1；NR1I2；NR1I3；NR1X1；NR1X2；NR1X3；NR2A1；NR2A2；NR2B1；NR2B2；NR2B3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3A1；NR3A2；NR3B1；NR3B2；NR3B3；NR3C1；NR3C2；NR3C3；NR3C4；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NR0B1；或NR0B2。
通常，本文使用的方法将用于相对于大量猎物多肽而研究一种或少量诱饵多肽。例如，在GPCR信号传导中，多个GPCR可能与单个Gα亚基相互作用。可以用大量的GPCR(猎物多肽)对常见的Gα(诱饵多肽)进行测试。在某些实施方案中，猎物多肽作为由多个核酸编码的多个猎物多肽提供，该猎物多肽与单个诱饵多肽相互作用或可能与其相互作用。
测定方法
可以使用多种方法有效地利用上述系统。该系统可用于在稳态下以及响应于物理或化学刺激下研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。当报道元件包含与特定猎物多肽配对的UMI时，可将该系统部署在多重测定中。
在一个非限制性的说明性示例中，将多个细胞在多孔板的一个孔中温育。将多个细胞用多种核酸转染，该多种核酸编码与转录调控多肽偶联的猎物多肽文库并且包含具有猎物多肽特异性UMI的报道元件。细胞可以已经包含编码诱饵多肽的核酸，或者可将编码诱饵多肽的核酸与猎物多肽一起转染。然后，将转染的细胞与化学刺激接触，在经历足够长的时间以使包含UMI的报道基因表达后，收获细胞裂解物，将mRNA逆转录，并通过下一代测序技术进行UMI的测序。测序结果将表明转录是否被激活，以及任何激活的程度。在该示例中，激活将表明化学刺激导致猎物多肽与诱饵多肽紧密缔合。如果猎物多肽包含转录阻遏物，则可以研究相反的相互作用(例如，导致蛋白质-蛋白质相互作用破坏的化学刺激)。
在某些实施方案中，测定以多孔格式诸如6、12、24、48、96或384孔格式进行。在某些实施方案中，向每个孔提供不同的测试化学品，或者测试化学品以一式两孔、三孔或四孔提供。测定还可以包括一个或多个阳性或阴性对照孔。
拆分分子
在某些实施方案中，本文所述的系统、核酸和方法依赖于可切割分子的两个片段的分子互补。例如，诱饵多肽包含第一片段并且猎物多肽包含第二片段。虽然第一片段和第二片段可以重叠，但每个片段独立地缺乏完整的功能。因此，当诱饵多肽和猎物多肽接近时，第一片段和第二片段结合形成单个可切割分子。
在某些实施方案中，与本文所述的系统、核酸和方法一起使用的可切割分子是遍在蛋白分子。遍在蛋白是一种76个氨基酸的蛋白质，其在真核生物中高度保守并且在蛋白质稳态中起关键作用。当遍在蛋白被添加到多肽中时，它标记该多肽以供被各种细胞过程破坏。遍在蛋白通过脱遍在蛋白化酶从标记的多肽切割而回收。遍在蛋白-60S核糖体蛋白L40包含以下序列：MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG(SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码长度为至少约25、30、35、40、45或50个氨基酸或其中的任意整数，并且与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的遍在蛋白分子片段。在某些实施方案中，遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段(Cub)，并且遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段(Nub)。在某些实施方案中，遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段(Nub)，并且遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段(Cub)。
在某些实施方案中，本文所述的系统、核酸和方法依赖于蛋白酶分子的两个片段的分子互补。例如，诱饵多肽包含第一片段并且猎物多肽包含第二片段。虽然第一片段和第二片段可以重叠，但每个片段独立地缺乏完整的功能。因此，当诱饵多肽和猎物多肽接近时，第一片段和第二片段结合形成单个功能性蛋白酶分子。
在某些实施方案中，与本文所述的方法、核酸和系统一起使用的功能性蛋白酶来自烟草蚀纹病毒核包涵体a内肽酶(TEV蛋白酶)。TEV是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶PA家族的成员。TEV的氨基酸序列如下所示：SLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN SEQ ID NO:2。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码长度为至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸或其中的任意整数，并且与SEQ ID NO:X所示的序列具有至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的TEV片段。TEV是高度特异性的并且切割包含氨基酸序列
Figure BDA0003199375660000181
的多肽，其中X是任何残基，Φ是任何较大或中等的疏水残基，而
Figure BDA0003199375660000182
是任何较小的疏水或极性残基。TEV对ENLYFQ\S氨基酸序列表现出最佳效率。在某些实施方案中，TEV多肽的第一片段是TEV多肽的C-末端片段(CTEV)，并且TEV多肽的第二片段是TEV多肽的N-末端片段(NTEV)。在某些实施方案中，TEV多肽的第一片段是TEV多肽的N-末端片段(NTEV)，并且TEV多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段(CTEV)。
转录因子
在本文所述的方法、核酸和系统中，还存在与诱饵多肽或猎物多肽偶联的转录调控多肽。在拆分切割分子或拆分可切割分子的分子互补时，转录调控多肽被切割并以活性形式释放。这种切割可以通过内源性酶(例如，脱遍在蛋白化酶)或拆分分子本身(例如，复原的TEV蛋白酶)的作用而实现。在某些实施方案中，转录调控多肽与猎物多肽偶联。在某些实施方案中，转录调控多肽与诱饵多肽偶联。在某些实施方案中，该系统包含与相同多肽或不同多肽偶联的两种转录调控多肽。在某些实施方案中，猎物多肽与转录调控多肽偶联；并且诱饵多肽与转录调控多肽偶联。
在某些实施方案中，转录调控多肽是转录因子。本文描述的系统与报道基因测定中通常或潜在可用的任何转录因子兼容。使用的常见转录因子包括LexA、Gal4、VP16(来自单纯疱疹病毒)、热休克因子(HSF)、NFAT或CREB。在某些实施方案中，转录因子是合成转录因子，包含来自第一转录因子的DNA结合域和来自第二转录因子的转录调控域。在某些实施方案中，转录因子包括GAL4-VP16嵌合转录因子。在某些实施方案中，转录因子包括GAL4-VPR嵌合转录因子。Gal4-VPR嵌合转录因子的序列由以下所示的序列给出：MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSASGSGRAGKPIPNPLLGLDSTDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSPKKKRKVGSQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSGSGSGSRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF，SEQ IDNO:10。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码转录因子，该转录因子的氨基酸序列与SEQID NO:10所示的氨基酸序列具有至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，该系统可以通过采用转录阻遏物来提供关于蛋白质-蛋白质相互作用丧失的信息。在某些实施方案中，转录调控多肽是转录阻遏物。在某些实施方案中，转录阻遏物包含KRAB域(序列RTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP)SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，转录阻遏物是合成阻遏物，包含来自第一转录因子的DNA结合域和来自转录阻遏物蛋白的转录阻遏物域。在某些实施方案中，转录阻遏物的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一方面，转录调控多肽是合成转录因子。合成转录因子是能够靶向和调控基因表达的人工蛋白质。一些合成转录因子是包含来自多个不同基因的域的嵌合蛋白。在某些实施方案中，合成转录因子包含来自一个基因的DNA结合域和来自另一个基因的转录调控域。
在某些实施方案中，与任何内源性转录因子相比，所述合成转录因子对于调控元件核苷酸序列具有更高的特异性。在某些实施方案中，所述合成转录因子与不能被内源启动子结合的合成转录因子启动子核苷酸序列结合。在某些实施方案中，与使用内源性转录因子相比，所述合成转录因子导致报道基因的背景产生更少。
在某些实施方案中，所述DNA结合域对于含有本发明的转录中继系统的细胞是非内源的。在某些实施方案中，来自第一转录因子的所述DNA结合域来自Gal 4、PPR1、LexA、Lac9或其组合。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVS，SEQ ID NO:21。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MKKKNSKKSNRTDSKRGDSNGSKSRTACKRCRKKKCDSCKRCAKVCVSDATGKDVRSYVDRAVMMRVKYGVDTKRGNATSDDDKKYSSVSS，SEQ IDNO:22。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MKSRTACKRCRLKKIKCDQEFPSCKRCAKLEVPCYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVS，SEQ ID NO:23。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MKSRTACKRCRLKKIKCDQEFPSCKRCAKLEVPCVSSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVS，SEQ ID NO:24。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MNKKSSEVMHQACDACRKKKWKCSKTVPTCTNCLKYNLDCVYSPQVVRTPLTRAHLTEMENRVAELEQFLKELFPVWDIDRLLQQKDTYRIRELLTMGSTNTVPGLASNNIDSSLEQPVAFGTAQPAQSLSTDPAVQSQAYPMQPV，SEQ ID NO:25。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MNKKSSEVMHQACVECRQQKSKCDAHERAPEPCTKCAKKNVPCIVYSPQVVRTPLTRAHLTEMENRVAELEQFLKELFPVWDIDRLLQQKDTYRIRELLTMGSTNTVPGLASNNIDSSLEQPVAFGTAQPAQSLSTDPAVQSQAYPMQPV，SEQ ID NO:26。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MNKKSSEVMHQACKRCRLKKIKCDQEFPSCKRCLKYNLDCVYSPQVVRTPLTRAHLTEMENRVAELEQFLKELFPVWDIDRLLQQKDTYRIRELLTMGSTNTVPGLASNNIDSSLEQPVAFGTAQPAQSLSTDPAVQSQAYPMQPV，SEQID NO:27。在某些实施方案中，所述DNA结合域包含如下所示的氨基酸序列：MNKKSSEVMHQACKRCRLKKIKCDQEFPSCKRCAKLEVPCVYSPQVVRTPLTRAHLTEMENRVAELEQFLKELFPVWDIDRLLQQKDTYRIRELLTMGSTNTVPGLASNNIDSSLEQPVAFGTAQPAQSLSTDPAVQSQAYPMQPV，SEQ ID NO:28。
在某些实施方案中，所述DNA结合域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列变体。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的氨基酸序列变体是R15W、K23P、K23T、K23W、K23M、K23N、F68R、F68Q、L69P、L70P、Q9E、Q9A、Q9N、R15K、R15A、R15M、K18R、K18A、K18M、K23R、K23A、K23M或其组合。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是R15W。在某些实施方案中，SEQID NO:21的氨基酸序列变体是K23P。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K23T。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K23W。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K23M。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K23N。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是F68R。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是F68Q。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是L69P。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是L70P。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是Q9E。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是Q9A。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是Q9N。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是R15K。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是R15A。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是R15M。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K18R。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K18A。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K18M。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K23R。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K23A。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21的氨基酸序列变体是K23M。
在一些实施方案中，来自第二转录因子的所述转录激活域来自VP64、p65和Rta及其组合。在某些实施方案中，所述转录激活域包含如下所示的氨基酸序列：RAGKPIPNPLLGLDSTDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSPKKKRKVGSQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSGSGSGSRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF，SEQ IDNO:14。
在某些实施方案中，本文所述的核酸编码VPR氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的VPR氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码VPR氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的VPR氨基酸序列具有至少90％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码VPR氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的VPR氨基酸序列具有至少95％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码VPR氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的VPR氨基酸序列具有至少97％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码VPR氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的VPR氨基酸序列具有至少98％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码VPR氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的VPR氨基酸序列具有至少99％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码VPR氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示的VPR氨基酸序列具有100％同一性的转录因子。
在某些实施方案中，合成转录因子上的转录激活域包含增加或减少转录激活的氨基酸序列变体。在某些实施方案中，包含增加或减少转录激活的氨基酸序列变体的所述转录激活域是SEQ ID NO:14的序列变体。
在某些实施方案中，由转录因子核酸的核酸序列编码的合成转录因子包含使所述合成转录因子不稳定的多肽序列，也称为“降解决定子”。在某些实施方案中，使所述转录因子不稳定的所述多肽序列包括PEST多肽序列。PEST多肽序列是含有多个氨基酸的多肽序列，其中所述多肽序列富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在某些实施方案中，使所述转录因子不稳定的所述多肽序列包括CL1多肽序列。CL1多肽序列可充当降解信号，导致所产生的合成转录因子的半衰期缩短。在某些实施方案中，使所述合成转录因子不稳定的所述多肽序列有助于降低报道基因的背景信号。
在某些实施方案中，所述合成转录因子包括GAL4-VP16嵌合转录因子。在某些实施方案中，转录因子包括GAL4-VPR嵌合转录因子。Gal4-VPR嵌合转录因子的序列由以下所示的序列给出：MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVSASGSGRAGKPIPNPLLGLDSTDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSPKKKRKVGSQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSGSGSGSRDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF，SEQ ID NO:10。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的转录因子。在某些实施方案中，本文所述的核酸编码氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有100％同一性的转录因子。
在某些实施方案中，所述合成转录因子包含由SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列给出的Gal4 DNA结合域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的DNA结合域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的DNA结合域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的DNA结合域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的DNA结合域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的DNA结合域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的DNA结合域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有100％同一性的DNA结合域。
在某些实施方案中，所述合成转录因子包含来自VP64的转录激活域，由以下列出的氨基酸序列给出：RAGKPIPNPLLGLDSTDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSPKKKRKV，SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有100％同一性的转录激活域。
在某些实施方案中，所述合成转录因子包含来自p65的转录激活域，由以下列出的氨基酸序列给出：QYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS，SEQ ID NO:12。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQID NO:12所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有100％同一性的转录激活域。
在某些实施方案中，所述合成转录因子包含来自Rta的转录激活域，由以下列出的氨基酸序列给出：RDSREGMFLPKPEAGSAISDVFEGREVCQPKRIRPFHPPGSPWANRPLPASLAPTPTGPVHEPVGSLTPAPVPQPLDPAPAVTPEASHLLEDPDEETSQAVKALREMADTVIPQKEEAAICGQMDLSHPPPRGHLDELTTTLESMTEDLNLDSPLTPELNEILDTFLNDECLLHAMHISTGLSIFDTSLF，SEQ ID NO:13。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少97％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQID NO:13所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的转录激活域。在某些实施方案中，所述合成转录因子包含氨基酸序列与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有100％同一性的转录激活域。
报道元件
报道元件最少包含能够被转录调控多肽和报道基因结合的调控元件。报道基因最少包含唯一分子标识符(UMI)。唯一分子标识符是对给定猎物多肽唯一的核酸序列。切割的转录激活因子对UMI报道基因的激活可以通过测序来确定。在某些实施方案中，报道元件包含UMI和选自荧光蛋白、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖醛酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、分泌型胎盘碱性磷酸酶基因的附加报道基因。这些基因编码报道多肽，可以测定该报道多的特定酶活性，或者在荧光报道基因的情况下可以测定荧光发射。在某些实施方案中，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或青色荧光蛋白(CFP)。
本文描述的系统可以利用许多不同的调控序列，这些序列通过转录因子结合而控制报道基因的激活。调控序列是可被以上详述的转录调控多肽或转录阻遏多肽结合的序列。通常，将配置使得调控序列在UMI、报道基因或两者的5’端。在某些实施方案中，调控序列包含Gal4-UAS，其能够被Gal4-VPR嵌合转录因子结合。
由于UMI的转录将表明特定猎物多肽与诱饵的缔合，UMI使得能够在同一测定中多重检测不同的猎物肽。UMI可具有允许足够多样性的任何长度，以允许对诱饵多肽与至少100、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000个猎物多肽之间相互作用的多重确定。通常，UMI的长度将在8至20个核苷酸之间，但也可以更长。在某些实施方案中，UMI的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
报道基因激活
可以以能够确定UMI序列的任何合适方式测量报道基因激活，优选能够以多重方式确定序列的方法。在某些实施方案中，使用下一代测序技术来确定UMI的序列。下一代测序包括许多种测序，诸如焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、第二代测序、纳米孔测序、连接测序或杂交测序。下一代测序平台是可从Illumina(RNA-Seq)和Helicos(数字基因表达或“DGE”)商购获得的平台。下一代测序方法包括但不限于由以下公司商业化的方法：1)454/Roche Lifesciences，包括但不限于在Margulies等人,Nature(2005)437:376-380(2005)；以及美国专利号7,244,559；7,335,762；7,211,390；7,244,567；7,264,929；7,323,305中描述的方法和装置；2)Helicos Biosciences Corporation(Cambridge,MA)，如在美国申请序列号11/167046和美国专利号7501245；7491498；7,276,720；以及在美国专利申请公开号US20090061439；US20080087826；US20060286566；US2006002471 1；US20060024678；US20080213770；和US20080103058中描述的；3)Applied Biosystems(例如，SOLiD测序)；4)Dover Systems(例如，Polonator G.007测序)；5)Illumina,Inc.，如在美国专利号5,750,341；6,306,597；和5,969,119中描述的；以及6)Pacific Biosciences，如在美国专利号7,462,452；7,476,504；7,405,281；7,170,050；7,462,468；7,476,503；7,315,019；7,302,146；7,313,308；和美国申请公开号US20090029385；US20090068655；US20090024331；和US20080206764中描述的。这样的方法和装置在此通过示例的方式提供并且不旨在进行限制。
可以使用标准测定来检测萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶蛋白、β-葡萄糖醛酸酶蛋白、氯霉素乙酰转移酶蛋白、分泌的胎盘碱性磷酸酶蛋白或荧光蛋白，从而确定附加报道分子的激活。通常，这些是酶测定，其中基于蛋白质对底物的酶活性产生可检测信号。例如，萤光素酶表达可以在萤光素酶底物的存在下通过光度计测量。荧光报道基因不需要底物，并且可以通过荧光显微镜或荧光酶标仪测量信号。荧光报道基因尤其可用于测量活细胞中的报道基因激活。
标志物
在某些实施方案中，本文所述的核酸还包含编码选择多肽或标记多肽的一个或多个附加基因。在某些实施方案中，本文所述的核酸还包含编码赋予转染细胞抗生素抗性的多肽的一个或多个附加基因。例如，核酸可以包含选择性标志物，诸如赋予新霉素/G418抗性、嘌呤霉素抗性、博来霉素抗性或杀稻瘟素抗性的抗生素抗性基因。在某些实施方案中，本文所述的核酸还包含编码包括在细胞表面上表达的表位标签的多肽的一个或多个附加基因。这使得能够进行亲和纯化或细胞分选以收集已用所述核酸转染的细胞。在某些实施方案中，表位标签包括c-Myc标签、血凝素(HA)标签、组氨酸标签、V5标签或FLAG标签。在某些实施方案中，本文所述的核酸还包含编码荧光多肽的一个或多个附加的无启动子基因。当转染旨在引起整合并靶向特定位置或着陆区(landing pad)时，这样的基因是有用的。在这些情况下，细胞基因组中的“着陆区”包含启动子，该启动子可以补充无启动子基因中启动子的缺失，并且只有当无启动子基因整合到预期的基因组位置时才导致无启动子基因的表达。可以通过流式细胞术和细胞分选来选择具有正确整合的细胞。这种类型的标志物还可以确保预期核酸的仅单个拷贝被整合到基因组中，并有助于避免异位过表达。在某些实施方案中，编码诱饵多肽的核酸包含：编码赋予转染细胞抗生素抗性的多肽的基因；编码包括在细胞表面上表达的表位标签的多肽的基因；或编码荧光多肽的无启动子基因。
细胞
可用于本文所述的方法的细胞通常是能够容易地用编码诱饵多肽、猎物多肽或包含报道元件的外源核酸使其变得转基因的细胞。可以使用本领域已知的方法将编码诱饵多肽、猎物多肽并包含报道元件的系统核酸转染或转导到合适的细胞系中，诸如磷酸钙转染、脂质体介导转染(例如，LipofectamineTM、Lipofectamine-2000TM、Lipofectamine-3000TM或
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)、电穿孔或病毒转导。细胞也可以是在合适的组织培养容器中生长至汇合或接近汇合的相同类型的细胞群。
在某些实施方案中，所用细胞包含编码诱饵多肽的核酸、包含报道元件的核酸或两者的稳定整合。可以使用线性化核酸的随机整合、病毒或转座子定向整合或定向整合(例如使用AttP和AttB位点之间的位点特异性重组)来制备稳定的细胞系。在某些实施方案中，细胞包含编码诱饵多肽的核酸的单一基因组整合。在某些实施方案中，细胞包含含有报道元件的核酸的单一基因组整合。在某些实施方案中，细胞包含编码诱饵多肽的核酸的单一整合，以及含有报道元件的核酸的单一基因组整合。
在某些实施方案中，在系统中使用的细胞或细胞群是真核细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞群是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞群是人类细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞群是SH-SY5Y，人神经母细胞瘤；Hep G2，白种人肝细胞癌；293(也称为HEK 293)，人胚肾；RAW 264.7，小鼠单核巨噬细胞；HeLa，人宫颈上皮样癌；MRC-5(PD19)，人胎肺；A2780，人卵巢癌；CACO-2，白种人结肠腺癌；THP 1，人单核细胞白血病；A549，白种人肺癌；MRC-5(PD 30)，人胎肺；MCF7，白种人乳腺癌；SNL 76/7，小鼠SIM品系胚胎成纤维细胞；C2C12，小鼠C3H肌肉成肌细胞；Jurkat E6.1，人白血病T细胞淋巴母细胞；U937，白种人组织细胞淋巴瘤；L929，小鼠C3H/An结缔组织；3T3 L1，小鼠胚胎；HL60，白种人早幼粒细胞白血病；PC-12，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤；HT29，白种人结肠腺癌；OE33，白种人食管癌；OE19，白种人食管癌；NIH 3T3，Swiss鼠NIH胚胎；MDA-MB-231，白种人乳腺癌；K562，白种人慢性粒细胞白血病；U-87MG，人胶质母细胞瘤星形细胞瘤；MRC-5(PD25)，人胎肺；A2780cis，人卵巢癌；B9，小鼠B细胞杂交瘤；CHO-K1，中国仓鼠卵巢；MDCK，可卡犬肾；1321N1，人脑星形细胞瘤；A431，人鳞癌；ATDC5，小鼠129畸胎癌AT805衍生；RCC4 PLUS VECTOR ALONE，用赋予新霉素抗性的空表达载体pcDNA3稳定转染的肾细胞癌细胞系RCC4；HUVEC(S200-05n)，人预筛选的脐静脉内皮细胞(HUVEC)；新生儿；Vero，非洲绿猴肾；RCC4 PLUS VHL，用pcDNA3-VHL稳定转染的肾细胞癌细胞系RCC4；Fao，大鼠肝癌；J774A.1，小鼠BALB/c单核巨噬细胞；MC3T3-E1，小鼠C57BL/6颅盖；J774.2，小鼠BALB/c单核巨噬细胞；PNT1A，人正常青春期后前列腺，用SV40永生化；U-2OS，人骨肉瘤；HCT 116，人结肠癌；MA104，非洲绿猴肾；BEAS-2B，人正常支气管上皮细胞；NB2-11，大鼠淋巴瘤；BHK 21(克隆13)，叙利亚仓鼠肾；NS0，小鼠骨髓瘤；Neuro 2a，小鼠白化神经母细胞瘤；SP2/0-Ag14，小鼠x小鼠骨髓瘤，非生产性；T47D，人乳腺肿瘤；1301，人T细胞白血病；MDCK-II，可卡犬肾；PNT2，人正常前列腺，用SV40永生化；PC-3，白种人前列腺癌；TF1，人红白血病；COS-7，非洲绿猴肾，SV40转化；MDCK，可卡犬肾；HUVEC(200-05n)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)；新生儿；NCI-H322，白种人细支气管肺泡癌；SK.N.SH，白种人神经母细胞瘤；LNCaP.FGC，白种人前列腺癌；OE21，白种人食管鳞状细胞癌；PSN1，人胰腺癌；ISHIKAWA，亚洲人子宫内膜腺癌；MFE-280，白种人子宫内膜腺癌；MG-63，人骨肉瘤；RK 13，兔肾，BVDV阴性；EoL-1细胞，人嗜酸性粒细胞白血病；VCaP，人前列腺癌转移；tsA201，人胚肾，SV40转化；CHO，中国仓鼠卵巢；HT 1080，人纤维肉瘤；PANC-1，白种人胰腺；Saos-2，人原发性成骨性肉瘤；成纤维细胞生长培养基(116K-500)，成纤维细胞生长培养基试剂盒；ND7/23，小鼠神经母细胞瘤x大鼠神经元杂合体；SK-OV-3，白种人卵巢腺癌；COV434，人卵巢颗粒细胞瘤；Hep 3B，人肝细胞癌；Vero(WHO)，非洲绿猴肾；Nthy-ori 3-1，人甲状腺滤泡上皮细胞；U373 MG(Uppsala)，人胶质母细胞瘤星形细胞瘤；A375，人恶性黑色素瘤；AGS，白种人胃腺癌；CAKI 2，白种人肾癌；COLO 205，白种人结肠腺癌；COR-L23，白种人肺大细胞癌；IMR 32，白种人神经母细胞瘤；QT 35，日本鹌鹑纤维肉瘤；WI 38，白种人胎肺；HMVII，人阴道恶性黑色素瘤；HT55，人结肠癌；TK6，人淋巴母细胞，胸苷激酶杂合子；SP2/0-AG14(AC-FREE)，小鼠x小鼠杂交瘤不分泌、无血清、无动物成分(AC)；AR42J，或大鼠胰腺外分泌肿瘤，或其任何组合。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的组合物和方法的实施方案并且不意味着以任何方式进行限制。
实施例1——示例蛋白质相互作用筛选
在该实施例中，如图1A和图1B所配置，将使用拆分遍在蛋白或拆分TEV系统的筛选用于筛选诱导GPCR信号传导的潜在化合物。在第1天，以30,000个细胞/孔将细胞接种在96孔测定板中。将细胞接种在100uL DMEM+10％FBS中，并添加含有50-300ng/mL多西环素(取决于期望的GPCR诱导水平)、15ug/mL cumate(对于拆分遍在蛋白)或7.5ug/mL cumate(对于双拆分TEV)的50uL OPTIMEM。本实施例中的细胞包含编码诱饵蛋白的稳定整合的核酸，以及编码瞬时转染的猎物蛋白的多个核酸。在第2天，将50uL OPTIMEM中期望浓度的测试化合物添加到每个孔中。约24小时后，添加裂解缓冲液用于萤光素酶活性测定或RNA提取。可以使用标准方法或试剂盒提取RNA。可以通过诸如RT-qPCR或RNASeq的标准下游测定对RNA进行量化。萤光素酶活性可以使用Promega Bright-Glo系统进行测定并且可以在诸如Thermo Fisher Luminoskan的标准光度计上进行读数，而RNAseq可以在测序文库制备后在Illumina MiSeq上进行。萤光素酶的示例性诱导如图2所示。
实施例2——拆分TEV和拆分Ub系统的剂量反应
在该实施例中，部署拆分-TEV或拆分UB系统来确定对给定化学刺激(该情况下为β1肾上腺素能激动剂扎莫特罗)的激动反应。
在该实施例中，以拆分遍在蛋白(图3A)或拆分TEV(图3B)配置来构建细胞系文库。该文库包含细胞文库，该细胞各自表达均与唯一RNA条形码配对的不同GPCR猎物蛋白。在第1天，以22,000个细胞/孔将细胞接种在涂覆聚-L-赖氨酸的384孔测定板中的25uL DMEM+10％FBS中。在第2天，将培养基更换为含有1000ng/mL多西环素和120ug/mL cumate的25uLOPTI-MEM。在第3天，将培养基更换为含有媒介物DMSO或剂量范围浓度的测试化合物扎莫特罗的20uL OPTI-MEM。约24小时后，添加裂解缓冲液用于RNA提取。用Luna One-Step RT-qPCR mix通过一步法逆转录并扩增所提取的RNA以制备测序文库，并通过RNAseq量化RNA条形码的水平。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅通过示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变体、变化和替换。应当理解，本文所述本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。
本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文件均通过引用并入本文，如同明确和单独地指出每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文件均通过引用以其整体并入。通过引用并入的文本中包含的定义在与本公开内容中的定义相矛盾时则被排除在外。

Claims (59)

1.一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：
a)编码诱饵多肽的第一核酸，所述诱饵多肽与蛋白酶多肽的第一片段、蛋白酶切割位点和转录调控多肽偶联；
b)编码猎物多肽的第二核酸，所述猎物多肽与蛋白酶多肽的第二片段偶联；以及
c)包含报道元件的第三核酸，其中所述报道元件包括调控元件、第一报道基因和第二报道基因，其中所述调控元件被配置为被所述转录调控多肽结合，其中所述第二报道基因编码对所述猎物多肽唯一的RNA序列。
2.如权利要求1所述的系统，其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段形成活性蛋白酶，接着所述蛋白酶切割位点被所述活性蛋白酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放、与所述调控元件结合、并启动所述第一报道基因和所述第二报道基因的转录。
3.如权利要求1所述的系统，其中所述蛋白酶多肽的第一片段是蛋白酶多肽的C-末端片段，并且所述蛋白酶多肽的第二片段是蛋白酶多肽的N-末端片段。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述蛋白酶多肽的第一片段是蛋白酶多肽的N-末端片段，并且所述蛋白酶多肽的第二片段是蛋白酶多肽的C-末端片段。
5.如权利要求1-4中任一项所述的系统，其中所述蛋白酶多肽的第一片段和所述蛋白酶多肽的第二片段衍生自烟草蚀纹病毒核包涵体a内肽酶(TEV蛋白酶)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其中所述转录调控多肽包含合成转录因子。
7.如权利要求6所述的系统，其中所述合成转录因子包含Gal4DNA结合域和-VPR激活域的融合物。
8.如权利要求7所述的系统，其中所述转录调控多肽包含转录阻遏物。
9.如权利要求1-8中任一项所述的系统，其中所述第二核酸编码与所述猎物多肽偶联的第二转录调控多肽，其中所述第二转录调控多肽被配置为被所述活性蛋白酶切割。
10.如权利要求1-9中任一项所述的系统，其中所述诱饵多肽或所述猎物多肽是膜结合信号传导多肽。
11.如权利要求10所述的系统，其中所述膜结合诱饵多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶或离子通道。
12.如权利要求11所述的系统，其中所述膜结合信号传导多肽或所述猎物多肽包含G蛋白偶联受体。
13.如权利要求1-9中任一项所述的系统，其中所述诱饵多肽或所述猎物多肽是细胞内信号传导多肽。
14.如权利要求13所述的系统，其中所述细胞内诱饵多肽或所述猎物多肽包含核激素受体。
15.如权利要求1-14中任一项所述的系统，其中所述诱饵多肽或所述猎物多肽包含可能与所述诱饵多肽相互作用的细胞内分子。
16.如权利要求1-14中任一项所述的系统，其中所述调控元件包括诱导型调控元件。
17.如权利要求16所述的系统，其中所述诱导型调控元件包含Gal4上游激活序列(Gal4UAS)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的系统，其中所述第一报道基因编码荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型胎盘碱性磷酸酶。
19.如权利要求1-18中任一项所述的系统，其中所述第一报道基因编码荧光蛋白或萤光素酶蛋白。
20.如权利要求1-19中任一项所述的系统，其中所述第一核酸包含编码无启动子荧光蛋白的序列。
21.如权利要求20所述的系统，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
22.如权利要求1中任一项所述的系统，其中所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的序列。
23.如权利要求22所述的系统，其中所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的attB序列。
24.如权利要求1-23中任一项所述的系统，其中所述第二核酸包含编码选择性表面标志物的序列。
25.如权利要求24所述的系统，其中所述选择性表面标志物是血凝素多肽。
26.一种包含如权利要求1至25中任一项所述的所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸的细胞。
27.如权利要求26所述的细胞，其中所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在转座元件的整合位点处。
28.如权利要求26所述的细胞，其中所述第一核酸、所述第二核酸和/或所述第三核酸被整合在预定的基因组位置。
29.一种用于检测测试物质对蛋白质-蛋白质相互作用的影响的方法，包括使如权利要求26-28中任一项所述的细胞或细胞群接触所述测试物质。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述测试物质是化学品。
31.一种用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的系统，包括：
a)编码诱饵多肽的第一核酸，所述诱饵多肽与遍在蛋白多肽的第一片段偶联；
b)编码猎物多肽的第二核酸，所述猎物多肽与遍在蛋白多肽的第二片段和转录调控多肽偶联；以及
c)包含报道元件的第三核酸，其中所述报道元件包括调控元件、第一报道基因和第二报道基因，其中所述调控元件被配置为被所述转录调控多肽结合，其中所述第二报道基因编码对所述猎物多肽唯一的RNA序列。
32.如权利要求31所述的系统，其中当所述诱饵多肽与所述猎物多肽相互作用时，所述遍在蛋白多肽的第一片段和所述遍在蛋白多肽的第二片段形成可切割的遍在蛋白分子，接着所述可切割的遍在蛋白分子被脱遍在蛋白化酶切割，所述转录调控多肽从所述诱饵多肽释放并启动所述第一报道基因和所述第二报道基因的转录。
33.如权利要求31所述的系统，其中所述遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段，并且所述遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段。
34.如权利要求31所述的系统，其中所述遍在蛋白多肽的第一片段是遍在蛋白多肽的N-末端片段，并且所述遍在蛋白多肽的第二片段是遍在蛋白多肽的C-末端片段。
35.如权利要求31-34中任一项所述的系统，其中所述转录调控多肽包含合成转录因子。
36.如权利要求35所述的系统，其中所述合成转录因子包含Gal4DNA结合域和-VPR激活域的融合物。
37.如权利要求31-34中任一项所述的系统，其中所述转录调控多肽包含转录阻遏物。
38.如权利要求31-37中任一项所述的系统，其中所述诱饵多肽或所述猎物多肽是膜结合信号传导多肽。
39.如权利要求38所述的系统，其中所述膜结合信号传导多肽包含G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶或离子通道。
40.如权利要求39所述的系统，其中所述膜结合信号传导多肽包含G蛋白偶联受体。
41.如权利要求31-36中任一项所述的系统，其中所述诱饵多肽或所述猎物多肽是细胞内信号传导多肽。
42.如权利要求41所述的系统，其中所述细胞内诱饵多肽或所述猎物多肽包含核激素受体。
43.如权利要求31-42中任一项所述的系统，其中所述诱饵多肽或所述猎物多肽包含可能与所述信号传导多肽相互作用的细胞内分子。
44.如权利要求31-43中任一项所述的系统，其中所述调控元件包括诱导型调控元件。
45.如权利要求44所述的系统，其中所述诱导型调控元件包含Gal4上游激活序列(Gal4UAS)。
46.如权利要求31-45中任一项所述的系统，其中所述第一报道基因编码荧光蛋白、萤光素酶蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌型胎盘碱性磷酸酶。
47.如权利要求31-45中任一项所述的系统，其中所述第一报道基因编码荧光蛋白或萤光素酶蛋白。
48.如权利要求31-47中任一项所述的系统，其中所述第一核酸包含编码无启动子荧光蛋白的序列。
49.如权利要求48所述的系统，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
50.如权利要求31-49中任一项所述的系统，其中所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的序列。
51.如权利要求50所述的系统，其中所述第一核酸包含指导向基因组中的位点特异性整合的attB序列。
52.如权利要求31-51中任一项所述的系统，其中所述第二核酸包含编码选择性表面标志物的序列。
53.如权利要求52所述的系统，其中所述选择性表面标志物是血凝素多肽。
54.一种包含如权利要求31至53中任一项所述的所述第一核酸、所述第二核酸或所述第三核酸的细胞。
55.如权利要求54所述的细胞，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第三核酸被整合在转座元件的整合位点处。
56.如权利要求54所述的细胞，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第三核酸被整合在预定的基因组位置。
57.如权利要求54所述的细胞，其中所述第一核酸、所述第二核酸或所述第三核酸被作为单个拷贝整合在基因组位置。
58.一种用于检测测试物质对蛋白质-蛋白质相互作用的影响的方法，包括使如权利要求54-57中任一项所述的细胞或细胞群接触所述测试物质。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述测试物质是化学品。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7026111B2 (ja) * 2016-06-20 2022-02-25 バタフライ ネットワーク，インコーポレイテッド 微細加工超音波トランスデューサのための電気接点配置
US11501562B2 (en) 2019-04-30 2022-11-15 Bfly Operations, Inc. Ultrasound face scanning and identification apparatuses and methods
US11087109B1 (en) * 2020-07-27 2021-08-10 Qualcomm Incorporated Apparatus and method for ultrasonic fingerprint and force sensing
WO2022187467A2 (en) * 2021-03-04 2022-09-09 Butterfly Network, Inc. Micromachined ultrasound transducer with pedestal

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050106636A1 (en) * 2002-03-24 2005-05-19 Igor Stagljar Method and kit for detecting membrane protein-protein interactions
US20060188890A1 (en) * 2003-10-31 2006-08-24 Proteologics, Inc. Ubiquitin-based protein interaction assays and related compositions
CN1845994A (zh) * 2003-08-06 2006-10-11 诺瓦提斯公司 遍在蛋白特异性蛋白酶
US20070224615A1 (en) * 2003-07-09 2007-09-27 Invitrogen Corporation Methods for assaying protein-protein interactions
US20090053701A1 (en) * 2006-06-30 2009-02-26 Ambit Biosciences Corp. Detectable nucleic acid tag
US20110265192A1 (en) * 2008-09-05 2011-10-27 Syddansk Universitet Nuclear receptor sensor system in transgenic animal
US20180203017A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Protein-protein interaction detection systems and methods of use thereof

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6936702B2 (en) 2000-06-07 2005-08-30 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
ATE497603T1 (de) * 2001-03-02 2011-02-15 Gpc Biotech Ag Drei-hybrid-assaysystem
DE10211063A1 (de) * 2002-03-13 2003-10-09 Axaron Bioscience Ag Neue Verfahren zur Detektion und Analyse von Protein-Interaktionen in vivo
DE602004024034D1 (de) 2003-01-29 2009-12-24 454 Corp Nukleinsäureamplifikation auf basis von kügelchenemulsion
US7745116B2 (en) 2003-04-08 2010-06-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
KR100561851B1 (ko) 2003-11-18 2006-03-16 삼성전자주식회사 지문 인식 센서 및 그 제조 방법
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
US7276720B2 (en) 2004-07-19 2007-10-02 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
US20060024678A1 (en) 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
JP2008513782A (ja) 2004-09-17 2008-05-01 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド 分子解析のための装置及び方法
WO2006042144A2 (en) 2004-10-07 2006-04-20 Ultra-Scan Corporation Ultrasonic fingerprint scanning utilizing a plane wave
EP1817572A2 (en) 2004-11-16 2007-08-15 Helicos Biosciences Corporation An optical train and method for tirf single molecule detection and analysis
US7462468B1 (en) 2005-01-28 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. DNA intercalating agents and methods of use
AU2006211150A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Use of reversible extension terminator in nucleic acid sequencing
US20060286566A1 (en) 2005-02-03 2006-12-21 Helicos Biosciences Corporation Detecting apparent mutations in nucleic acid sequences
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US20080269476A1 (en) 2006-04-26 2008-10-30 Helicos Biosciences Corporation Molecules and methods for nucleic acid sequencing
CA2653202A1 (en) 2006-05-25 2008-06-05 Ultra-Scan Corporation Biometrical object reader having an ultrasonic wave manipulation device
US8354997B2 (en) 2006-10-31 2013-01-15 Navisense Touchless user interface for a mobile device
US7767805B2 (en) 2007-05-03 2010-08-03 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for sequencing a nucleic acid
CA2689626C (en) 2007-06-06 2016-10-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods
CN101802220B (zh) 2007-07-26 2013-07-31 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 分子冗余测序法
AU2009243918A1 (en) 2008-05-07 2009-11-12 Signostics Limited Docking system for medical diagnostic scanning using a handheld device
US9533873B2 (en) 2013-02-05 2017-01-03 Butterfly Network, Inc. CMOS ultrasonic transducers and related apparatus and methods
CN105307975B (zh) 2013-03-15 2017-04-26 蝴蝶网络有限公司 互补金属氧化物半导体(cmos)超声换能器及其形成方法
CA2903479C (en) 2013-03-15 2023-10-10 Butterfly Network, Inc. Monolithic ultrasonic imaging devices, systems and methods
JP6315893B2 (ja) * 2013-04-18 2018-04-25 キヤノン株式会社 被検体情報取得装置、被検体情報取得方法、及びプログラム
KR102305274B1 (ko) 2013-07-16 2021-09-24 더 리젠트스 오브 더 유니이버시티 오브 캘리포니아 Mut 지문 id 시스템
US9592030B2 (en) * 2013-07-23 2017-03-14 Butterfly Network, Inc. Interconnectable ultrasound transducer probes and related methods and apparatus
US9984270B2 (en) 2013-08-05 2018-05-29 Apple Inc. Fingerprint sensor in an electronic device
CA2929723C (en) 2013-12-12 2020-09-15 Qualcomm Incorporated Micromechanical ultrasonic transducers and display
US9067779B1 (en) 2014-07-14 2015-06-30 Butterfly Network, Inc. Microfabricated ultrasonic transducers and related apparatus and methods
US9524415B2 (en) 2014-07-18 2016-12-20 Qualcomm Incorporated Test techniques for assessing ultrasonic fingerprint sensors
US10008659B2 (en) 2014-12-09 2018-06-26 Lg Innotek Co., Ltd. Fingerprint sensor
WO2016091624A1 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Koninklijke Philips N.V. Two-terminal cmut device
US20160009544A1 (en) 2015-03-02 2016-01-14 Butterfly Network, Inc. Microfabricated ultrasonic transducers and related apparatus and methods
EP3265801B1 (en) * 2015-03-05 2020-06-17 Koninklijke Philips N.V. Ultrasound system and method
US10497748B2 (en) 2015-10-14 2019-12-03 Qualcomm Incorporated Integrated piezoelectric micromechanical ultrasonic transducer pixel and array
US9710689B2 (en) 2015-10-30 2017-07-18 Essential Products, Inc. Fingerprint sensors for mobile devices
US11813639B2 (en) * 2016-05-03 2023-11-14 Vanguard International Semiconductor Singapore Pte. Ltd. Electrode arrangement for a pMUT and pMUT transducer array
US10445547B2 (en) 2016-05-04 2019-10-15 Invensense, Inc. Device mountable packaging of ultrasonic transducers
US10452887B2 (en) 2016-05-10 2019-10-22 Invensense, Inc. Operating a fingerprint sensor comprised of ultrasonic transducers
US10408797B2 (en) 2016-05-10 2019-09-10 Invensense, Inc. Sensing device with a temperature sensor
JP7026111B2 (ja) 2016-06-20 2022-02-25 バタフライ ネットワーク，インコーポレイテッド 微細加工超音波トランスデューサのための電気接点配置
US10856840B2 (en) 2016-06-20 2020-12-08 Butterfly Network, Inc. Universal ultrasound device and related apparatus and methods
US10235552B2 (en) 2016-10-12 2019-03-19 Qualcomm Incorporated Hybrid capacitive and ultrasonic sensing
US10410034B2 (en) * 2016-11-07 2019-09-10 Qualcomm Incorporated Ultrasonic biometric system with harmonic detection
US10196261B2 (en) 2017-03-08 2019-02-05 Butterfly Network, Inc. Microfabricated ultrasonic transducers and related apparatus and methods
KR102433315B1 (ko) * 2017-12-27 2022-08-16 삼성전자주식회사 초음파 트랜스듀서가 임베디드된 유기 발광 다이오드 패널 및 이를 포함하는 표시 장치
EP3745961A4 (en) 2018-01-30 2021-11-10 Butterfly Network, Inc. METHODS AND DEVICES FOR PACKAGING ULTRASONIC-ON-A-CHIP
EP3762155B1 (en) 2018-03-09 2023-12-13 BFLY Operations, Inc. Methods for fabricating ultrasound transducer devices
WO2019213448A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Butterfly Network, Inc. Vertical packaging for ultrasound-on-a-chip and related methods
WO2019213449A2 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Butterfly Network, Inc. Ultrasound devices
US11018068B2 (en) 2018-07-06 2021-05-25 Butterfly Network, Inc. Methods and apparatuses for packaging an ultrasound-on-a-chip
US20200184176A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Butterfly Network, Inc. Ultrasound fingerprint detection and related apparatus and methods

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050106636A1 (en) * 2002-03-24 2005-05-19 Igor Stagljar Method and kit for detecting membrane protein-protein interactions
US20070224615A1 (en) * 2003-07-09 2007-09-27 Invitrogen Corporation Methods for assaying protein-protein interactions
CN1845994A (zh) * 2003-08-06 2006-10-11 诺瓦提斯公司 遍在蛋白特异性蛋白酶
US20060188890A1 (en) * 2003-10-31 2006-08-24 Proteologics, Inc. Ubiquitin-based protein interaction assays and related compositions
US20090053701A1 (en) * 2006-06-30 2009-02-26 Ambit Biosciences Corp. Detectable nucleic acid tag
US20110265192A1 (en) * 2008-09-05 2011-10-27 Syddansk Universitet Nuclear receptor sensor system in transgenic animal
US20180203017A1 (en) * 2016-12-30 2018-07-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Protein-protein interaction detection systems and methods of use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNA BOTVINNIK等: "Integrated analysis of receptor activation and downstream signaling with EXTassays", 《NATURE METHODS》, vol. 07, no. 01, pages 1 - 6 *
JULIA PETSCHNIGG等: "Interactive proteomics research technologies: recent applications and advances", 《CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY》, vol. 22, no. 01, pages 50 *
陈丽霞等: "基于蛋白质结构的天然产物活性筛选研究进展", 《药学进展》, vol. 42, no. 01, pages 39 - 51 *

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