TWI736543B - 檢測靶分子之方法 - Google Patents

檢測靶分子之方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI736543B
TWI736543B TW105122465A TW105122465A TWI736543B TW I736543 B TWI736543 B TW I736543B TW 105122465 A TW105122465 A TW 105122465A TW 105122465 A TW105122465 A TW 105122465A TW I736543 B TWI736543 B TW I736543B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
capture complex
signal amplifier
solid surface
molecule
neutral
Prior art date
Application number
TW105122465A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201721146A (zh
Inventor
維康 詹
楊裕雄
陳文逸
Original Assignee
瀚源生醫股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瀚源生醫股份有限公司 filed Critical 瀚源生醫股份有限公司
Publication of TW201721146A publication Critical patent/TW201721146A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI736543B publication Critical patent/TWI736543B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material

Abstract

本發明係關於一種檢測靶分子之方法，其包含形成包含該靶分子之捕獲複合物；及將該捕獲複合物與訊號放大器結合，其中該捕獲複合物具有淨電荷；該訊號放大器具有對該捕獲複合物之親和力且具有與該捕獲複合物之該淨電荷相同之淨電荷。本發明改進檢測靈敏度及檢測之感測極限。

Description

檢測靶分子之方法
本發明係關於一種分子檢測技術。更特定言之，本發明係關於一種包含訊號放大器之檢測。
分子檢測在臨床診斷及分子生物學研究方面起重要作用。已研發出若干系統來進行分子檢測，以便檢測及/或鑑別樣品中之靶分子。
場效應電晶體(FET)為對表面電荷極其敏感之半導體電子組件。在若干種FET中，矽奈米線(SiNW)FET生物感測器係指矽奈米線之表面經識別分子修飾之感測元件。當FET曝露於包含靶分子，諸如蛋白質、DNA或RNA之水性環境時，靶分子結合至矽奈米線場效應電晶體之表面上之識別分子。在此狀況下，由藉由靶分子攜帶之電荷形成之電場影響SiNW-FET之電子或空穴數目，觸發電導率之上升或下降。藉由監測電導率之變化，可測定靶分子之存在且甚至測定濃度。
已使用場效應電晶體來檢測及/或鑑別靶寡核苷酸以及蛋白質-蛋白質結合，其兩者均受益於不存在試劑標記要求及FET感測器之商業製造來源之簡便可用性。FET感測器之靈敏度高度視電晶體表面與實際檢測分子之間之檢測距離(德拜長度(debye length))而定。在靈敏度方面，大多數當前類型之FET作為基因檢測裝置不能令人滿意。此主要係由於對DNA/DNA或DNA/RNA雜交之相對高鹽濃度之要求。高度 帶電之生物分子之雜交需要適當之離子強度來抑制電荷排斥力。不幸地，雜交緩衝液中之離子亦會減小FET德拜長度且因此削弱檢測靈敏度。在抗體-抗原結合檢測之情況下，相比於其他生物分子，大尺寸抗體亦會降低FET之檢測靈敏度。舉例而言，在應用二次抗體之檢測中，考慮到二次抗體之大尺寸，感測區中之二次抗體之淨電荷(在德拜長度內)較少，且電導率之變化較小；因此訊號較弱。抗體之表面電荷分佈及結合之抗體之結合定向使得難以解決FET檢測及定量分析。另外，結合緩衝液中之鹽之介質濃度亦會減小德拜長度，且轉而亦會降低檢測靈敏度。
為了改進檢測靈敏度及感測極限，提供一種包含訊號放大器之檢測方法。
本發明提供一種檢測靶分子之方法，其包含形成包含靶分子之捕獲複合物；及將捕獲複合物與訊號放大器結合，其中捕獲複合物具有淨電荷；訊號放大器具有與捕獲複合物之親和力且具有與捕獲複合物之淨電荷相同之淨電荷。
本發明亦提供一種檢測靶分子之套組，其包含：訊號放大器，其具有與包含靶分子之捕獲複合物之親和力，其中捕獲複合物具有淨電荷；訊號放大器具有與捕獲複合物之淨電荷相同之淨電荷；及電訊號檢測元件，其用於檢測由於捕獲複合物與訊號放大器之結合而出現之電性變化。
在以下部分中詳細描述本發明。本發明之其他特徵、目的及優點可發現於具體實施方式及申請專利範圍中。
1:FET晶片上之固定抗原
2:第1抗體
3:負電荷
4:RNA適體
5:負電荷
S1:注入第1抗體
S2:注入RNA適體
圖1顯示本發明之一個實施例中之方法的示意圖。
圖2顯示根據本發明之電中性核苷酸之一個較佳實施例。
圖3顯示使用R18 RNA適體作為訊號放大器以放大6×組胺酸tag抗原及抗6×組胺酸-tag家兔抗體之主訊號之檢測的ID-VG曲線。
圖4顯示使用抗家兔山羊抗體作為訊號放大器以放大6×組胺酸tag抗原及抗6×組胺酸-tag家兔抗體之主訊號之檢測的ID-VG曲線。
圖5顯示藉由使用R18 RNA適體或抗家兔山羊抗體作為訊號放大器以放大6×組胺酸tag抗原及抗6×組胺酸-tag家兔抗體之主訊號之檢測誘導的臨限值電壓位移。
本發明提供一種檢測靶分子之方法，其包含形成包含靶分子之捕獲複合物；及將捕獲複合物與訊號放大器結合，其中捕獲複合物具有淨電荷；訊號放大器具有與捕獲複合物之親和力且具有與捕獲複合物之淨電荷相同之淨電荷。
如本文所用，術語「檢測」係指發現或確定靶分子之存在性或存在度，且較佳地鑑別靶分子。在本發明之一個較佳實施例中，檢測包含定量樣品中之靶分子。本文中應用之反應包括(但不限於)寡核苷酸分子之間之雜交、蛋白質-蛋白質相互作用、受體-配體結合、寡核苷酸-蛋白質相互作用、多糖-蛋白質相互作用或小分子-蛋白質相互作用。
如本文所用，術語「靶分子」係指自分子池檢測或鑑別上文指定小分子或大分子。較佳地，靶分子為大分子，諸如蛋白質、肽、核苷酸、寡核苷酸或聚核苷酸。靶分子為天然存在或人工的。在另一態樣中，靶分子經純化或與其他內容物混合。在本發明之一個較佳實施例中，靶分子之表現模式在正常條件與異常條件(諸如疾病)下不同。在本發明之另一較佳實施例中，靶分子之表現模式在不同細胞類型中不同。在本發明之另一較佳實施例中，靶分子為DNA分子、RNA分 子、抗體、抗原、酶、受質、配體、受體、細胞膜相關蛋白或細胞表面標記物。DNA分子較佳地為基因或未轉錄區。RNA分子較佳地為mRNA、微RNA、長非轉譯RNA、rRNA、tRNA或siRNA。
根據本發明之樣品衍生自天然存在之來源或衍生自人工操縱。較佳地，樣品衍生自天然存在之來源，諸如提取物、體液、組織生檢、液體生檢或細胞培養物。在另一態樣中，樣品根據檢測所需之反應處理。舉例而言，可調節樣品之pH值或離子強度。
如本文所用，術語「捕獲複合物」係指包含至少兩個分子之複合物且捕獲複合物中之分子中之一者為靶分子。捕獲複合物中之其他分子中之一者能夠特異性結合至靶分子，亦即捕獲具有親和力之靶分子，以形成捕獲複合物。較佳地，根據本發明之方法進一步包含與識別分子形成捕獲複合物，該識別分子能夠捕獲具有親和力之靶分子。形成捕獲複合物提供發現或確定靶分子之存在性或存在度之主訊號。識別分子之類型視靶分子之類型而定。
在本發明之一個較佳實施例中，識別分子為根據鹼基互補性能夠與靶寡核苷酸分子形成捕獲複合物之單鏈寡核苷酸分子。捕獲複合物較佳地指雙鏈結構，且一個單鏈為靶寡核苷酸分子且另一單鏈為識別分子。較佳地，識別分子具有與靶寡核苷酸分子之序列匹配之序列；更佳地，具有與靶寡核苷酸分子之序列完全匹配之序列。藉由形成捕獲複合物，靶寡核苷酸分子可捕獲自樣品中之混合物。捕獲步驟亦指特異性選擇靶寡核苷酸分子及在捕獲複合物中呈現靶寡核苷酸分子之純化步驟。
靶寡核苷酸分子可為單鏈分子或雙鏈分子。獲得雙鏈靶寡核苷酸分子之單鏈之方式可例如為加熱或改變雙鏈靶寡核苷酸分子之環境之離子強度。
在本發明之另一較佳實施例中，靶分子為抗原，且識別分子為 其抗體，且根據抗原-抗體親和力形成捕獲複合物。在本發明之另一較佳實施例中，靶分子為抗體，且識別分子為其抗原，且根據抗原-抗體親和力形成捕獲複合物。
形成捕獲複合物之方式視靶分子及識別分子之天然特性而定。形成捕獲複合物之方式之實例包括(但不限於)寡核苷酸分子之間之雜交、蛋白質-蛋白質相互作用、受體-配體結合、寡核苷酸-蛋白質相互作用、多糖-蛋白質相互作用或小分子-蛋白質相互作用。
根據本發明之捕獲複合物可呈現於溶液中或附著於固體表面上。較佳地，捕獲複合物附著於固體表面上或捕獲複合物與固體表面間隔開一定距離。
如本文所用，術語「固體表面」係指固體載體，包括(但不限於)聚合物、紙、織物或玻璃。採用之固體表面視待檢測之訊號而變化。舉例而言，當方法採用場效應電晶體監測訊號時，固體表面為場效應電晶體之電晶體表面；當方法採用表面電漿共振時，固體表面為表面電漿共振之金屬表面。
在本發明之較佳實施例中，固體表面之材料為矽；較佳地多晶矽或單晶矽；更佳地多晶矽。多晶矽比單晶矽更便宜，但由於多晶具有更多晶界，通常在晶界中出現阻礙電子轉導之缺陷。此類現象使得固體表面不均勻且難以定量。此外，離子可能穿透至多晶之晶界中且引起溶液中之檢測失效。另外，多晶矽在空氣中不穩定。然而，上述缺點將不干擾根據本發明之方法之功能。
捕獲複合物附著於固體表面上之方式視固體表面之材料及捕獲複合物之類型而定。在本發明之一個實施例中，捕獲複合物經由共價鍵鍵聯至固體表面。共價鍵之實例包括(但不限於)以下方法，其視固體表面化學性質及靶分子或識別分子而定。在本發明之一個實施例中，當氧化矽用作固體表面時，固體表面藉由使用(3-胺丙基)三乙氧 基矽烷(APTES)修飾。APTES之分子中之矽原子進行與羥基之氧原子之共價結合且其將表面之矽烷醇基團(SiOH)轉化為胺；接著識別單鏈寡核苷酸分子之5'-胺基藉由戊二醛與固體表面胺基共價結合(Roey Elnathan,Moria Kwiat,Alexander Pevzner,Yoni Engel,Larisa Burstein,Artium Khatchtourints,Amir Lichtenstein,Raisa Kantaev及Fernando Patolsky,Biorecognition Layer Engineering：Overcoming Screening Limitations of Nanowire-Based FET Devices,Nano letters,2012,12,5245-5254)。在本發明之另一實施例中，固體表面修飾為自組裝單層分子，該等分子具有用於藉由各種化學反應共價鍵聯至識別單鏈寡核苷酸分子之不同官能基之不同官能基(Srivatsa Venkatasubbarao,Microarrays-status and prospects,TRENDS in Biotechnology第22卷 第12期2004年12月；Ki Su Kim,Hyun-Seung Lee,Jeong-A Yang,Moon-Ho Jo及Sei Kwang Hahn,The fabrication,characterization and application of aptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors,Nanotechnology 20(2009))。
在本發明之另一較佳實施例中，捕獲複合物與固體表面間隔開一定距離。由於電性變化檢測元件應用於檢測因捕獲複合物與訊號放大器之結合所致之電性變化，捕獲複合物無需直接結合至固體表面，其條件為捕獲複合物與固體表面之間之距離足夠短以允許電性變化檢測元件檢測電性變化。較佳地，固體表面與捕獲複合物之間之距離為約0至約10nm；更佳地約0至約5nm。
根據本發明之捕獲複合物具有淨電荷。較佳地，藉由捕獲複合物之淨電荷產生之電訊號太弱而無法檢測，且需要訊號放大器。
如本文所用，術語「訊號放大器」係指具有與捕獲複合物之親和力，且具有與捕獲複合物之淨電荷相同之淨電荷之分子。若捕獲複合物之淨電荷為正性，則訊號放大器之相同淨電荷亦為正性；若捕獲 複合物之淨電荷為負性，則訊號放大器之相同淨電荷亦為負性。儘管訊號放大器具有與捕獲複合物之淨電荷相同之淨電荷，訊號放大器與捕獲複合物之間之親和力結合比此等兩種淨電荷之間之排斥力強。藉由結合訊號放大器及捕獲複合物，捕獲複合物之淨電荷之訊號藉由引入訊號放大器之相同淨電荷而放大。
較佳地，訊號放大器具有小尺寸。在小尺寸之情況下，結合之訊號放大器及捕獲複合物位於電訊號檢測元件之感測區，且放大效應經最大化。舉例而言，當FET用作電訊號檢測元件時，結合之訊號放大器及捕獲複合物位於德拜長度內。更佳地，訊號放大器之分子量為約0.5kDa至約50kDa；更佳地約1.5kDa至約35kDa。
在另一態樣中，訊號放大器具有豐富之淨電荷。較佳地，訊號放大器具有至少一個淨電荷，更佳地至少五個淨電荷；更佳地至少十個電荷。
在本發明之一個較佳實施例中，訊號放大器具有高淨電荷密度。具有高淨電荷密度之分子之意謂分子相比於具有相同分子量之分子具有更多淨電荷。更佳地，訊號放大器具有豐富之淨電荷及小尺寸。
訊號放大器具有與捕獲複合物中之靶分子或識別分子之親和力。較佳地，訊號放大器具有與靶分子之親和力。
在本發明之一個較佳實施例中，訊號放大器為寡核苷酸分子，包括單鏈寡核苷酸分子及雙鏈寡核苷酸分子。藉由具有不同序列及/或結構，寡核苷酸能夠具有與不同分子之親和力。在本發明之再一較佳實施例中，訊號放大器為寡核苷酸適體。
如本文所用，術語「寡核苷酸」或「寡核苷酸分子」係指核苷酸之寡聚物。術語「核苷酸」係指由含氮鹼基、糖及一或多個磷酸酯基，較佳一個磷酸基構成之有機分子。含氮鹼基包括嘌呤或嘧啶之衍 生物。嘌呤包括經取代或未經取代之腺嘌呤及經取代或未經取代之鳥嘌呤；嘧啶包括經取代或未經取代之胸腺嘧啶、經取代或未經取代之胞嘧啶及經取代或未經取代之尿嘧啶。糖較佳地為五碳糖，更佳地經取代或未經取代之核糖或經取代或未經取代之脫氧核糖。磷酸酯基與糖之2碳、3碳或5碳；較佳地與5碳位點形成鍵。為了形成寡核苷酸，藉由磷酸二酯橋將一個核苷酸之糖與相鄰糖接合。較佳地，寡核苷酸為DNA或RNA；更佳地為DNA。
如本文所用，術語「寡核苷酸適體」係指結合至特定分子之寡核苷酸分子。寡核苷酸適體可藉由自大型隨機序列集合，諸如從SELEX(指數富集配體系統進化)方法選擇該適體而獲得。回應於捕獲複合物，可選擇合格寡核苷酸適體。
根據本發明，若靶分子存在於樣品中，則識別分子結合至靶分子以形成具有淨電荷之捕獲複合物。由於捕獲複合物攜有淨電荷，歸因於藉由引入淨電荷形成捕獲複合物而出現主訊號形式之電性變化。另一方面，若靶分子不存在於樣品中，則識別分子無法結合至靶分子。因此，電環境不變，且未出現電性變化。因此，若捕獲複合物存在於樣品中，則訊號放大器結合至捕獲複合物。由於訊號放大器攜有與捕獲複合物之淨電荷相同之淨電荷，歸因於藉由引入更多淨電荷之訊號放大器結合而出現經放大之電性變化。監測出現之電性變化，進而檢測靶分子。因此，根據本發明之方法進一步包含監測由於捕獲複合物與訊號放大器之結合而出現之電性變化。
根據本發明之電性變化包括(但不限於)淨電荷之增加。電性變化可檢測為電訊號。電訊號包括(但不限於)導電性、電場、電容、電流、電子或電子空穴之變化。在本發明之一個較佳實施例中，電性變化為臨限值電壓位移變化。較佳地，電性變化藉由電性變化檢測元件檢測。
較佳地，固體表面與電性變化檢測元件耦接以檢測電性變化。較佳地，電性變化檢測元件為場效應電晶體或表面電漿共振，更佳地場效應電晶體。場效應電晶體之實例包括(但不限於)奈米線場效應電晶體、奈米管場效應電晶體及石墨烯場效應電晶體。
根據本發明，游離形式之訊號放大器較佳地在檢測電性變化之前移除，進而避免藉由由游離形式之訊號放大器攜帶之電荷產生之雜訊。移除方式包括(但不限於)洗滌。
參看圖1，說明本發明之較佳實施例。首先，作為識別分子之抗原1固定於FET晶片之表面上，且注射S1作為靶分子之第一抗體2。捕獲複合物由抗原及第一抗體形成。在此實施例中，捕獲複合物攜有負淨電荷5。此外，注射S2作為訊號放大器之RNA適體4且結合至捕獲複合物。由於RNA適體攜有更多負淨電荷，訊號經放大。
在本發明之一個較佳實施例中，識別分子為包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸之部分中性單鏈寡核苷酸。使核苷酸呈電中性之方式不受限制。在本發明之一個實施例中，電中性核苷酸包含經烷基取代之磷酸酯基。較佳地，烷基為C1-C6烷基；更佳地，烷基為C1-C3烷基。C1-C3烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基及丙基。圖2顯示根據本發明之電中性核苷酸之一個較佳實施例。磷酸酯基中之帶負電氧原子改變為不具有電荷之中性原子。用烷基取代磷酸酯基之方式可根據普通化學反應應用。
根據本發明之帶負電核苷酸包含具有至少一個負電荷之磷酸酯基。未經修飾之核苷酸較佳地為不具有修飾或取代之天然存在之核苷酸。在本發明之一個較佳實施例中，帶負電核苷酸包含未經取代之磷酸酯基。
將根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸被部分賦予電中性。序列或長度不受限制，且部分中性單鏈寡核苷酸之序列或長度可根據靶 分子，基於本發明之揭示內容進行設計。
電中性核苷酸及帶負電核苷酸之數目視部分中性單鏈寡核苷酸之序列及複合物形成之條件而定。電中性核苷酸及帶負電核苷酸之位置亦視部分中性單鏈寡核苷酸之序列及複合物形成之條件而定。可根據可用資訊，基於本發明之揭示內容，設計電中性核苷酸及帶負電核苷酸之數目及位置。舉例而言，可藉由基於雙鏈(ds)結構能量之分子建模計算設計電中性核苷酸之數目及位置，且可接著參考結構能量測定dsDNA/DNA或dsDNA/RNA之熔融溫度(Tm)。
在本發明之一個較佳實施例中，部分中性單鏈寡核苷酸包含複數個電中性核苷酸，且至少一個帶負電核苷酸安置在兩個電中性核苷酸之間；更佳地，至少兩個帶負電核苷酸安置在兩個電中性核苷酸之間。
藉由引入電中性核苷酸，相比於習知DNA探針，根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸之完美匹配雙鏈寡核苷酸與不匹配雙鏈寡核苷酸之間之熔融溫度差值更高。不受理論限制，推測兩條鏈之間之靜電排斥力藉由引入中性寡核苷酸而減小，且熔融溫度從而升高。藉由控制電中性核苷酸之數目及位置，將熔融溫度差值調節至所需點，提供較好工作溫度或溫度範圍以區分完美及不匹配寡核苷酸，從而改進捕獲特異性。此類設計有益於整合至一個晶片或陣列中之不同部分中性單鏈寡核苷酸之熔融溫度的一致性。待檢測反應數目可隨著較高特異性而顯著升高，且更多檢測單元可併入至單一檢測系統中。該設計提供較好微陣列操作條件。
在本發明之一個較佳實施例中，部分中性單鏈寡核苷酸包含附接至固體表面之第一部分；第一部分之長度為部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約50%；且第一部分包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸；更佳地，第一部分之長度為部分中性單鏈寡核苷酸 之總長度之約40%；更佳地，第一部分之長度為部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約30%。
在本發明之一個較佳實施例中，部分單鏈核苷酸進一步包含與第一部分鄰接之第二部分。第二部分位於固體表面之遠端。第二部分包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。電中性核苷酸及帶負電核苷酸之描述與第一部分之描述相同且在本文中不再重複。
在本發明之一個較佳實施例中，在具有低於約50mM；更佳地低於約40mM、30mM、20mM或10mM之離子強度之緩衝液中進行該方法。不受理論限制，推測藉由應用部分中性單鏈寡核苷酸，部分中性單鏈寡核苷酸與靶分子之間之形成之複合物可在不需要抑制部分帶電半中性單鏈寡核苷酸與其靶標之間之靜電排斥力之情況下發生。接著藉由鹼基配對及各鏈之堆疊力驅動雜交。因此，可在較低鹽條件下形成雙螺旋。在FET之情況下，較低離子強度增加檢測長度(德拜長度)，且轉而增強檢測靈敏度。
在本發明之一個實施例中，相比於習知檢測，可主要在FET檢測之兩個態樣中看出就形成捕獲複合物而言改進之雜交特異性。第一，熔融溫度差異較高。第二，緩衝液具有較低鹽條件，且FET檢測長度(德拜長度)增加。此等差異均導致檢測靈敏度之改進。
本發明亦提供一種檢測靶分子之套組，其包含：訊號放大器，其具有與包含靶分子之捕獲複合物之親和力，其中捕獲複合物具有淨電荷；訊號放大器具有與捕獲複合物之淨電荷相同之淨電荷；及電訊號檢測元件，其用於檢測由於捕獲複合物與訊號放大器之結合而出現之電性變化。
較佳地，根據本發明之套組進一步包含如上所述之識別分子。
提供以下實例以幫助之熟習此項技術者實踐本發明。
實例 合成作為識別分子之部分中性單鏈寡核苷酸：
脫氧胞嘧啶核苷(n-ac)對甲氧基亞磷醯胺、胸苷對甲氧基亞磷醯胺、脫氧鳥苷(n-ibu)對甲氧基亞磷醯胺及脫氧腺苷(n-bz)對甲氧基亞磷醯胺(全部購自美國化學基因公司(ChemGenes Corporation,USA))用於根據基於固相磷酸三酯合成之給定順序或由應用生物系統公司(Applied Biosystems)3900高通量DNA合成器(由Genomics® Biosci & Tech或使命生物技術(Mission Biotech)提供)合成寡核苷酸。
合成之寡核苷酸以弱鹼性在甲苯中在室溫下反應24小時，且樣品經受離子交換層析以將pH值調節至7。在樣品經濃縮及乾燥之後，獲得部分中性單鏈寡核苷酸。
合成作為訊號放大器之RNA適體
cDNA R18 RNA適體藉由聚合酶鏈反應(PCR)及轉錄反應合成。
PCR反應溶液含有：2μL 10×PCR緩衝液、0.5μL 10mM dNTP、0.5μL 10μM cDNA引物1(購自美國積體裝置技術(Integrated Device Technology；IDT))、0.5μL 10μM cDNA引物2(購自美國積體裝置技術(IDT))、0.5μL 10μM cDNA R18 RNA適體模板(購自美國積體裝置技術(IDT))、0.5μL Taq DNA聚合酶及15.5μL去離子水。PCR程式為：一個循環之95℃下持續1分鐘、50℃下持續1分鐘及72℃下持續1分鐘；40個循環之95℃下持續45秒、55℃下持續45秒及72℃下持續45秒；及一個循環之72℃下持續3分鐘。PCR產物經純化且在-20℃下儲存。
純化之PCR產物經受轉錄反應。反應混合物含有：25μL 2×緩衝液、2.5μL 1μg PCR產物、17.5μL去離子水及5μL酶T7 Express(T7 RiboMAXTM Express大規模RNA生產系統，美國普洛麥格(Promega,USA))。反應混合物在37℃下反應2小時。轉錄產物經純化。
識別分子附接：
Si奈米線(SiNW)晶片用40mL丙酮洗滌兩次、用40mL乙醇洗滌兩次且用40mL去離子水洗滌兩次。表面用富氮空氣乾燥且引入氧電漿30秒。含有80μL 25%(3-胺丙基)三乙氧基矽烷(APTES)及4mL乙醇之溶液用於修飾表面30分鐘。晶片再次用40mL乙醇洗滌兩次且在120℃下加熱10分鐘。晶片在室溫下浸沒於含戊二醛(3mL 10mM磷酸鈉緩衝劑及1mL戊二醛)之液體中1小時。晶片用磷酸鈉緩衝劑洗滌兩次。
500μL 0.33% 6×組胺酸-tag肽(購自英國阿布凱姆(abcam,U.K.))作為識別分子，且滴於晶片表面上。塗佈之晶片用10mM磷酸鈉緩衝劑洗滌，接著浸沒於4mM NaBH3CN中30分鐘，且浸沒於1% BSA阻斷緩衝液中1h。在富氮空氣乾燥之前，晶片兩次用Tris-HCl洗滌10分鐘，接著用去離子水洗滌。
捕獲及訊號放大
晶片配備有微流體系統。將5mL/h之1mM雙-參丙烷引入至通道中，且訊號監測為基線。
抗-6×組胺酸-tag家兔抗體之0.33%之靶分子以5mL/h引入至通道中，持續10分鐘，接著培育30分鐘。通道用1mM雙-參丙烷緩衝液洗滌10分鐘，且訊號監測為主訊號。
R18 RNA適體之訊號放大器以5mL/h引入至通道中，持續10分鐘，接著培育30分鐘。通道用1mM雙-參丙烷緩衝液洗滌10分鐘，且訊號監測為放大訊號。結果顯示於圖3中。位移電壓為122.6mV(△V=V d1-V d0,at I d1=-9)。
作為比較物之抗家兔山羊抗體以5mL/h引入至通道中，持續10分鐘，接著培育30分鐘。通道用1mM雙-參丙烷緩衝液洗滌10分鐘，且訊號監測為比較訊號。結果顯示於圖4中。位移電壓為20.9mV(△V= V d1-V d0,at I d1=-9)。
參看圖5，捕獲複合物之主訊號藉由使用訊號放大器成功且顯著地放大。相比於習知二次抗體(抗家兔山羊抗體)，根據本發明之訊號放大器改進檢測之靈敏度及感測極限。
儘管已結合上文闡述之特定實施例描述本發明，對於其之許多替代方案及其修改及變化將對之一般技術者顯而易見。所有此類替代方案、修改及變化視為落入本發明之範疇內。
1:FET晶片上之固定抗原
2:第1抗體
3:負電荷
4:RNA適體
5:負電荷
S1:注入第1抗體
S2:注入RNA適體

Claims (26)

  1. 一種檢測靶分子之方法，其包含形成包含該靶分子之捕獲複合物；將該捕獲複合物與訊號放大器結合；及監測由於該捕獲複合物與該訊號放大器之結合而出現之電性變化，其中該捕獲複合物具有淨電荷；該訊號放大器具有對該捕獲複合物之親和力且具有與該捕獲複合物之該淨電荷相同之淨電荷。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含與識別分子形成該捕獲複合物，該識別分子能夠捕獲具有親和力之該靶分子。
  3. 如請求項1之方法，其中該捕獲複合物附著於固體表面上或該捕獲複合物與該固體表面間隔開一定距離。
  4. 如請求項3之方法，其中該固體表面為場效應電晶體(FET)之電晶體表面或表面電漿共振(SPR)之金屬表面。
  5. 如請求項3之方法，其中該固體表面之材料為多晶矽或單晶矽。
  6. 如請求項1之方法，其中該訊號放大器為寡核苷酸分子。
  7. 如請求項2之方法，其中該訊號放大器為寡核苷酸適體。
  8. 如請求項5之方法，其中該固體表面與電訊號檢測元件耦接，該元件用於檢測由於該捕獲複合物與該訊號放大器之結合而出現之電性變化。
  9. 如請求項8之方法，其中該電訊號檢測元件為場效應電晶體或表面電漿共振。
  10. 如請求項5之方法，其中該識別分子包含含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸之部分中性單鏈寡核苷酸。
  11. 如請求項10之方法，其中該電中性核苷酸包含經C1-C6烷基取代之磷酸酯基。
  12. 如請求項10之方法，其中該帶負電核苷酸包含未經取代之磷酸 酯基。
  13. 如請求項10之方法，其中該識別分子附著於固體表面上，且該部分中性單鏈寡核苷酸包含附接至該固體表面之第一部分；該第一部分之長度為該部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約50%；且該第一部分包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。
  14. 一種用於檢測靶分子之套組，其包含：訊號放大器，其具有對包含該靶分子之捕獲複合物之親和力，其中該捕獲複合物具有淨電荷；該訊號放大器具有與該捕獲複合物之該淨電荷相同之淨電荷；及電訊號檢測元件，其用於檢測由於該捕獲複合物與該訊號放大器之結合而出現之電性變化。
  15. 如請求項14之套組，其進一步包含能夠捕獲具有親和力之該靶分子以形成該捕獲複合物之識別分子。
  16. 如請求項14之套組，其中該捕獲複合物附著於固體表面上或該捕獲複合物與該固體表面間隔開一定距離。
  17. 如請求項16之套組，其中該固體表面為場效應電晶體(FET)之電晶體表面或表面電漿共振(SPR)之金屬表面。
  18. 如請求項16之套組，其中該固體表面之材料為多晶矽或單晶矽。
  19. 如請求項14之套組，其中該訊號放大器為寡核苷酸分子。
  20. 如請求項15之套組，其中該訊號放大器為寡核苷酸適體。
  21. 如請求項18之套組，其中該固體表面與用於檢測電訊號之該電訊號檢測元件耦接。
  22. 如請求項14之套組，其中該電訊號檢測元件為場效應電晶體或表面電漿共振。
  23. 如請求項17之套組，其中該識別分子包含含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸之部分中性單鏈寡核苷酸。
  24. 如請求項23之套組，其中該電中性核苷酸包含經C1-C6烷基取代之磷酸酯基。
  25. 如請求項23之套組，其中該帶負電核苷酸包含未經取代之磷酸酯基。
  26. 如請求項23之套組，其中該識別分子附著於固體表面上，且該部分中性單鏈寡核苷酸包含附接至該固體表面之第一部分；該第一部分之長度為該部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約50%；且該第一部分包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。
TW105122465A 2015-07-15 2016-07-15 檢測靶分子之方法 TWI736543B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562192987P 2015-07-15 2015-07-15
US62/192,987 2015-07-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201721146A TW201721146A (zh) 2017-06-16
TWI736543B true TWI736543B (zh) 2021-08-21

Family

ID=56413587

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105122486A TWI684597B (zh) 2015-07-15 2016-07-15 Ｄｎａ甲基化檢測
TW105122465A TWI736543B (zh) 2015-07-15 2016-07-15 檢測靶分子之方法
TW105122489A TW201713678A (zh) 2015-07-15 2016-07-15 部分中性單鏈寡核苷酸

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105122486A TWI684597B (zh) 2015-07-15 2016-07-15 Ｄｎａ甲基化檢測

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105122489A TW201713678A (zh) 2015-07-15 2016-07-15 部分中性單鏈寡核苷酸

Country Status (6)

Country Link
US (4) US20170016894A1 (zh)
EP (3) EP3118330B1 (zh)
JP (3) JP2017074035A (zh)
KR (3) KR20170009786A (zh)
CN (3) CN106350569A (zh)
TW (3) TWI684597B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10372659B2 (en) * 2016-07-26 2019-08-06 Samsung Electronics Co., Ltd. Multi-mode NMVE over fabrics devices
RU2698134C2 (ru) 2017-12-04 2019-08-22 Общество с ограниченной ответственностью "Биолабмикс" Способ амплификации нуклеиновых кислот с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов
CN108957007B (zh) * 2018-07-24 2021-08-17 无锡市人民医院 一种联合透析装置和硅纳米线场效应管的生物传感器
CN110865113B (zh) * 2019-11-19 2024-03-26 复旦大学 一种基于dna纳米机器修饰场效应晶体管传感器界面的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050136550A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Flow control of electrochemical-based assay devices
TWI461684B (zh) * 2010-03-15 2014-11-21 Ind Tech Res Inst 單分子偵測系統及方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830655A (en) * 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
DE19634873A1 (de) * 1996-08-29 1998-03-12 Boehringer Mannheim Gmbh System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung
US6046004A (en) * 1997-02-27 2000-04-04 Lorne Park Research, Inc. Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones
US6080544A (en) * 1998-02-13 2000-06-27 Ohio State University Methods for identifying nucleic acid mutations using mismatch modification
US6777188B2 (en) * 1998-10-01 2004-08-17 Variagenics, Inc. Genotyping by mass spectrometric analysis of allelic fragments
US6087112A (en) * 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
JP4688294B2 (ja) 1998-12-30 2011-05-25 オリゴス・イーティーシー・インコーポレイテッド 酸安定性骨格で修飾された末端がブロックされた核酸及びその治療的使用
EP1423687A1 (en) * 2001-08-08 2004-06-02 The Arizona Board of Regents Nucleic acid field effect transistor
FR2829580B1 (fr) * 2001-09-07 2004-02-13 Bio Merieux Procede de lecture, de detection ou de quantification, hybrides ou complexes utilises dans ce procede et biopuce mettant en oeuvre ledit procede
CN1584592A (zh) * 2003-08-22 2005-02-23 中国科学院上海原子核研究所 免疫微阵列蛋白质芯片
JP2007279028A (ja) 2006-03-13 2007-10-25 Mitsubishi Chemicals Corp 孔を有する生体物質構造体及びその製造方法、並びに、それを用いた生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及びセンサーチップ
US7923240B2 (en) * 2006-03-31 2011-04-12 Intel Corporation Photo-activated field effect transistor for bioanalyte detection
EP2069773A2 (en) * 2006-09-22 2009-06-17 Koninklijke Philips Electronics N.V. Semiconductor sensor device, diagnostic instrument comprising such a device and method of manufacturing such a device
CN101553579B (zh) * 2006-10-06 2016-01-20 赛里根有限公司 用于定向生物标志物信号放大的荧光方法和材料
US7794939B2 (en) * 2007-02-26 2010-09-14 University Of Idaho Methods of DNA methylation detection
JP5211790B2 (ja) * 2007-03-26 2013-06-12 住友化学株式会社 Ｄｎａメチル化測定方法
US20090036660A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Joel Myerson Methods and compositions for generating mixtures of nucleic acid molecules
US8609333B2 (en) * 2007-10-01 2013-12-17 University Of Southern California Detection of methylated DNA and DNA mutations
US20100053624A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Kyung-Hwa Yoo Biosensor
US20100112719A1 (en) * 2008-11-06 2010-05-06 Amihood Doron Electronic signal amplification in field effect device based chemical sensors
GB201004147D0 (en) * 2010-03-12 2010-04-28 Dna Electronics Ltd Method and apparatus for sensing methylation
US8785132B2 (en) * 2010-04-23 2014-07-22 Postech Academy-Industry Foundation Aptamer sandwich assays
EP2606336A1 (en) * 2010-08-20 2013-06-26 ETH Zurich Microwell arrays for direct quantification of analytes on a flat sample
US9481905B2 (en) * 2013-02-19 2016-11-01 Orizhan Bioscience Limited Method of using neutrilized DNA (N-DNA) as surface probe for high throughput detection platform
JP6095058B2 (ja) * 2013-03-14 2017-03-15 国立研究開発法人産業技術総合研究所 メチルシトシン検出法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050136550A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Flow control of electrochemical-based assay devices
TWI461684B (zh) * 2010-03-15 2014-11-21 Ind Tech Res Inst 單分子偵測系統及方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017060461A (ja) 2017-03-30
CN106353504A (zh) 2017-01-25
KR20170009787A (ko) 2017-01-25
TWI684597B (zh) 2020-02-11
EP3118330A1 (en) 2017-01-18
CN106350569A (zh) 2017-01-25
EP3118331A1 (en) 2017-01-18
KR20170009788A (ko) 2017-01-25
TW201713677A (zh) 2017-04-16
US20170015699A1 (en) 2017-01-19
JP2017046684A (ja) 2017-03-09
KR20170009786A (ko) 2017-01-25
TW201713678A (zh) 2017-04-16
EP3118332B1 (en) 2018-06-06
US20170016894A1 (en) 2017-01-19
JP6998574B2 (ja) 2022-02-04
TW201721146A (zh) 2017-06-16
JP2017074035A (ja) 2017-04-20
CN106350516A (zh) 2017-01-25
US20170016051A1 (en) 2017-01-19
US20190233464A1 (en) 2019-08-01
EP3118330B1 (en) 2019-09-11
EP3118332A1 (en) 2017-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220373495A1 (en) Active-electrode integrated biosensor array and methods for use thereof
US20190233464A1 (en) Detection Comprising Signal Amplifier
Patolsky et al. Nanowire-based biosensors
TWI723321B (zh) 生物場效電晶體感測器、微流體系統及其使用方法
Velasco-Garcia et al. New trends in aptamer-based electrochemical biosensors
Liu et al. Label-free and ultrasensitive electrochemiluminescence detection of microRNA based on long-range self-assembled DNA nanostructures
Xiang et al. Sensitive detection of microRNAs using hemin/G-quadruplex concatamers as trace labels and RNA endonuclease-aided target recycling for amplification
Zhou et al. Programmable bidirectional dynamic DNA nano-device for accurate and ultrasensitive fluorescent detection of trace MUC1 biomarker in serums
TWI736713B (zh) 用於定量圖譜分析核酸的方法