TW201713678A - 部分中性單鏈寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種檢測單元,其包含固體表面及部分中性單鏈寡核苷酸,該部分中性單鏈寡核苷酸包含第一部分。該第一部分連接至該固體表面;該第一部分之長度為該部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約50%;且該第一部分包含至少一個中性核苷酸及至少一個未經修飾之核苷酸。本發明改進生物分子檢測之檢測靈敏度及準確度。
Description
本發明係關於一種分子檢測技術。更特定言之,本發明係關於部分中性單鏈寡核苷酸。
分子檢測在臨床診斷及分子生物學研究方面起重要作用。已研發出若干系統來進行分子檢測,以便檢測及/或鑑別樣品中之靶生物分子。其中,根據沃森-克里克鹼基配對規則(Watson-Crick base-pairing rule),在檢測及/或鑑別具有特異性核苷酸序列之標靶時使用單鏈寡核苷酸。
詳言之,標靶之檢測及/或鑑別通常涉及區分單一鹼基變異體之能力。通常,為了在一個操作中進行多次檢測及/或鑑別,在一個微陣列基板上塗佈若干單鏈寡核苷酸以雜交螢光標記之樣品混合物。在此類微陣列中,在每次檢測及/或鑑別中必須調節操作條件,諸如用於雜交各單鏈寡核苷酸之溫度。此外,靈敏度及特異性對於微陣列避免任何假訊號而言為重要的。
增強靈敏度及特異性之最適用之途徑為提高雜交溫度,其與單鏈寡核苷酸之熔融溫度(T m )高度相關。熔融溫度定義為一半寡核苷酸鏈呈隨機捲曲或單鏈狀態所處之溫度。熔融溫度視寡核苷酸及其特異性核苷酸序列之長度而定。
已研發出若干經修飾之寡核苷酸來提高熔融溫度。舉例而言,已經揭示肽核酸(PNA)(Nielsen PE,Egholm M,Berg RH,Buchardt O,1991.「Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide.」Science 254(5037):1497-500),且PNA之主鏈包含由肽鍵連接之重複N-(2-胺基乙基)-甘胺酸單元。各種嘌呤及嘧啶鹼基由亞甲基橋(-CH2-)及羰基(-(C=O)-)連接至主鏈。因為PNA主鏈不含帶負電之磷酸酯基,由於不具有靜電排斥力,PNA與DNA鏈之間之結合比DNA與DNA鏈之間之結合更強。不幸地,此亦使得其實際上為疏水性的,從而使其難以溶液狀態施加。此外,鑒於帶有替代磷酸酯鍵之肽鍵之PNA,因為肽鍵具有雙鍵之特徵,PNA之結構靈活性受限制。當將PNA與針對各種應用之不同靶分子結合時,難以實現穩定構象。
亦研發出嗎啉基,亦稱作嗎啉基寡聚物及二胺基磷酸鹽嗎啉基寡聚物(PMO)(Summerton,J;Weller D,1997.「Morpholino Antisense Oligomers:Design,Preparation and Properties.」Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7(3):187-95)。PMO之結構具有含亞甲基嗎啉環及二胺基磷酸鹽鍵之主鏈。因為為完全非天然主鏈,PMO無法經細胞蛋白質,諸如酶識別,中之其限制涉及蛋白質結合以及酶識別之應用。
鎖核酸(LNA)以經修飾之RNA核苷酸形式提供(Satoshi Obika;Daishu Nanbu; Yoshiyuki Hari;Ken-ichiro Morio;Yasuko In;Toshimasa Ishida;Takeshi Imanishi,1997.「Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine.Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.」Tetrahedron Lett.38(50):8735-8)。LNA核苷酸之核糖部分用連接2'氧及4'碳之額外橋修飾。橋「鎖住」3'-內(北)構象中之核糖,其通常見於A形式雙螺旋體中。鎖定之核糖
構象增強鹼基堆疊及主鏈預組織。此顯著提高了寡核苷酸之熔融溫度。然而,LNA之普及性受到其合成化學及設計並合成LNA之價格限制。
US 2014/0235465 A1揭示了中和DNA(nDNA)。磷酸酯主鏈上所有之帶電氧離子(O-)都已經烷基化,以使得主鏈為完全電中性的。此修飾提高了互補單鏈DNA之間之雜交效率且使雜交所需之鹽減至最少,使得檢測靈敏度更高。然而,施加至雜交之nDNA未產生令人滿意之特異性,且在針對規則DNA雜交條件之鹽濃度下發生非特異性雜交。
已使用場效應電晶體(FET)來檢測及/或鑑別靶寡核苷酸以及抗體-抗原結合,其兩者都受益於不存在試劑標記要求及FET感測器之市售製造來源之簡便可用性。FET感測器之靈敏度高度視電晶體表面與實際檢測分子之間之檢測距離(德拜長度(debye length))而定。在靈敏度方面,大多數現用類型之FET作為基因檢測裝置不能令人滿意。此主要係由於對DNA/DNA或DNA/RNA雜交之相對較高鹽濃度之要求。帶較多電荷之生物分子之雜交需要適當之離子強度來抑制電荷排斥力。不幸地為,雜交緩衝液中之離子亦會減小FET德拜長度且因此削弱檢測靈敏度。在抗體-抗原結合檢測之情況下,相比於其他生物分子,尺寸較大之抗體亦會降低FET之檢測靈敏度。抗體之表面電荷分佈及結合之抗體之結合定向使得難以解決FET檢測及定量分析。另外,結合緩衝液中之鹽之介質濃度亦會減小德拜長度,且轉而亦會降低檢測靈敏度。
為了改進檢測靈敏度及特異性,提供一種無標記檢測方法。
本發明提供一種部分中性單鏈寡核苷酸,其包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。
本發明亦提供包含如上文所提及之部分中性單鏈寡核苷酸之檢測單元。
本發明亦提供包含多個如上文所提及之檢測單元之檢測系統。
本發明亦提供一種檢測方法,其包含用如上文所提及之檢測單元進行檢測。
在以下部分中詳細描述本發明。本發明之其他特徵、目的及優點可發現於具體實施方式及申請專利範圍中。
圖1顯示根據本發明之電中性核苷酸之一個較佳實施例。
圖2顯示在用於雜交檢測之FET中使用部分中性單鏈寡核苷酸之示意圖。
圖3顯示在用於雜交檢測之FET中使用部分中性單鏈寡核苷酸作為回收探針之示意圖。
圖4顯示在用於雜交檢測之FET中使用部分中性單鏈寡核苷酸作為回收探針及奈米金粒子作為訊號放大器之示意圖。
圖5顯示在FET中根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸之離子強度作用結果。
圖6顯示在FET中在檢測不同靶濃度時,根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸之結果。
圖7顯示在FET中在檢測超低靶濃度時,根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸之結果。
圖8A及8B顯示使用DNA(8A)及根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸(8B)之聚合酶鏈反應的結果。
圖9顯示使用DNA及根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸之定量聚合酶鏈反應的結果。
圖10A至10C顯示藉由原位雜交,使用DNA(miR-524-5p DNA探
針)檢測miRNA之結果。圖10A顯示在1.5ng/μl濃度下之細胞表現陰性miRNA及miR-524-5p DNA探針。圖10B及圖10C顯示在0.3ng/μl(圖10B)及1.5ng/μl(圖10C)之濃度下之細胞表現模擬miR-524-5p及miR-524-5p探針。
圖11A至11C顯示藉由原位雜交,使用nDNA(miR-524-5p全(All)nDNA探針)檢測miRNA之結果。圖11A顯示在1.5ng/μl濃度下之細胞表現陰性miRNA及miR-524-5p nDNA探針。圖11B及圖11C顯示在0.3ng/μl(圖11B)及1.5ng/μl(圖11C)之濃度下之細胞表現模擬miR-524-5p及miR-524-5p探針。
圖12A至12C顯示藉由原位雜交,使用部分中性單鏈寡核苷酸(miR-524-5p 7nDNA探針)檢測miRNA之結果。圖12A顯示在1.5ng/μl濃度下之細胞表現陰性miRNA及miR-524-5p 7nDNA探針。圖12B及圖12C顯示在0.3ng/μl(圖12B)及1.5ng/μl(圖12C)之濃度下之細胞表現模擬miR-524-5p及探針。
圖13A至13C顯示藉由原位雜交,使用LNA(miR-524-5p LNA探針)檢測miRNA之結果。圖13A顯示在1.5ng/μl濃度下細胞表現陰性miRNA及miR-524-5p LNA探針。圖13B及圖13C顯示在0.3ng/μl(圖13B)及1.5ng/μl(圖13C)之濃度下之細胞表現模擬miR-524-5p及探針。
圖14顯示藉由FET,在miRNA檢測中,根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸之結果。
本發明提供一種部分中性單鏈寡核苷酸,其包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。
如本文所使用,術語「寡核苷酸」係指核苷酸寡聚物。術語「核苷酸」係指由含氮鹼基、糖及一或多個磷酸酯基;較佳一個磷酸
酯基構成之有機分子。含氮鹼基包括嘌呤或嘧啶之衍生物。嘌呤包括經取代或未經取代之腺嘌呤及經取代或未經取代之鳥嘌呤;嘧啶包括經取代或未經取代之胸腺嘧啶、經取代或未經取代之胞嘧啶及經取代或未經取代之尿嘧啶。糖較佳為五碳糖,更佳經取代或未經取代之核糖或經取代或未經取代之去氧核糖。磷酸酯基與糖之2碳、3碳或5碳;較佳與5碳位點形成鍵。為了形成寡核苷酸,藉由磷酸二酯橋,將一個核苷酸之糖與相鄰糖接合。可基於本發明之揭示內容,按需要選擇部分中性單鏈寡核苷酸之恰當形式。較佳地,部分中性單鏈寡核苷酸為DNA或RNA;更佳為DNA。
根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。使核苷酸呈電中性之方式不受限制。在本發明之一個實施例中,電中性核苷酸包含經烷基取代之磷酸酯基。較佳地,烷基為C1-C6烷基;更佳地,烷基為C1-C3烷基。C1-C3烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基及丙基。圖1顯示根據本發明之電中性核苷酸之一個較佳實施例。磷酸酯基中之帶負電氧原子改變為不具有電荷之中性原子。用烷基取代磷酸酯基之方式可根據普通化學反應應用。
根據本發明之帶負電核苷酸包含具有至少一個負電荷之磷酸酯基。未經修飾之核苷酸較佳為不具有修飾或取代之天然存在之核苷酸。在本發明之一個較佳實施例中,帶負電核苷酸包含未經取代之磷酸酯基。
根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸被部分賦予電中性。序列或長度不受限制,且部分中性單鏈寡核苷酸之序列或長度可根據靶分子,基於本發明之揭示內容進行設計。
電中性核苷酸及帶負電核苷酸之數目視部分中性單鏈寡核苷酸之序列及待檢測反應所處之條件而定。電中性核苷酸及帶負電核苷酸
之位置亦視部分中性單鏈寡核苷酸之序列及待檢測反應所處之條件而定。可根據可用資訊,基於本發明之揭示內容,設計電中性核苷酸及帶負電核苷酸之數目及位置。舉例而言,可藉由基於雙鏈(ds)結構能量之分子建模計算設計任何探針中之電中性核苷酸之數目及位置,且可接著參考結構能量測定dsDNA/DNA或dsDNA/RNA之熔融溫度(Tm)。
在本發明之一個較佳實施例中,部分中性單鏈寡核苷酸包含複數個電中性核苷酸,且至少一個帶負電核苷酸安置在兩個電中性核苷酸之間;更佳地,至少兩個帶負電核苷酸安置在兩個電中性核苷酸之間。
在本發明之一個較佳實施例中,當在檢測及/或鑑別單一鹼基變異體過程中應用根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸時,靠近單一鹼基變異體安置至少一個電中性核苷酸;更佳地,靠近單一鹼基變異體安置2、3、4或5個電中性核苷酸。在另一態樣中,至少一個電中性核苷酸安置在單一鹼基變異體之下游或上游位點;較佳地,至少一個電中性核苷酸安置在單一鹼基變異體之下游及上游位點。
藉由引入電中性核苷酸,相比於習知DNA探針,根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸之完美匹配雙鏈寡核苷酸與不匹配雙鏈寡核苷酸之間之熔融溫度差異更高。不受理論限制,可推測,兩條鏈之間之靜電排斥力藉由引入中性寡核苷酸而減小,且熔融溫度從而升高。藉由控制電中性核苷酸之數目及位置,將熔融溫度差異調節至所需點,提供較佳工作溫度或溫度範圍以區分完美匹配及不匹配寡核苷酸,從而改進檢測特異性。此類設計有益於整合至一個晶片或陣列中之不同部分中性單鏈寡核苷酸之熔融溫度的一致性。待檢測反應數目可隨著較高特異性而顯著升高,且更多檢測單元可併入至單一檢測系統中。該設計提供較佳微陣列操作條件。
本發明亦提供包含如上文所提及之部分中性單鏈寡核苷酸之檢測單元。
如本文所使用,術語「檢測」係指發現或測定靶分子之存在(existence或presence)之方法,且較佳地,鑑別靶分子之方法。在本發明之一個較佳實施例中,檢測包含定量樣品中之靶分子。檢測中應用之反應包括(但不限於)寡核苷酸分子之間之雜交、蛋白質-蛋白質相互作用、受體-配體結合、寡核苷酸-蛋白質相互作用、多糖-蛋白質相互作用或小分子-蛋白質相互作用。
本發明亦提供包含複數個如上文所提及之檢測單元之檢測系統。
如本文所使用,術語「單元」係指用於進行檢測中應用之反應之組件。較佳地,該單元用於進行單一反應。在本發明之一個較佳實施例中,一個系統中所含有之若干單元在一個操作中進行若干檢測。舉例而言,複數個檢測單元可併入在一個檢測系統中。較佳地,檢測系統為微陣列或晶片。
如本文所使用,術語「分子」係指小分子或大分子。較佳地,分子為大分子,諸如蛋白質、肽、核苷酸、寡核苷酸或聚核苷酸。分子為天然存在的或人工的。在另一態樣中,分子經純化或與其他內容物混合。在本發明之一個較佳實施例中,分子之表現模式在正常條件與異常條件(諸如疾病)下不同。在本發明之另一較佳實施例中,分子之表現模式在不同細胞類型中不同。在本發明之又一個較佳實施例中,分子為DNA分子、RNA分子、抗體、抗原、酶、受質、配體、受體、細胞膜相關蛋白或細胞表面標記物。DNA分子較佳為基因或未轉錄區。RNA分子較佳為mRNA、微RNA、長非轉譯RNA、rRNA、tRNA或siRNA。
本文所使用之術語「靶分子」係指待自分子庫中檢測或鑑別出
之指定分子。
根據本發明之樣品衍生自天然存在之來源或衍生自人工操作。較佳地,樣品衍生自天然存在之來源,諸如提取物、體液、組織活檢、液體活檢、細胞培養物。在另一態樣中,樣品根據檢測所需之反應處理。舉例而言,可調節樣品之pH值或離子強度。
檢測單元中根據本發明之部分中性單鏈寡核苷酸可按溶液形式呈現或連接至載體上。在本發明之一個較佳實施例中,檢測單元進一步包含固體表面;且部分中性單鏈寡核苷酸連接在該固體表面上或位於該固體表面附近。
如本文所使用,術語「固體表面」係指固體載體,包括(但不限於)聚合物、紙、織物或玻璃。採用之固體表面視待檢測之反應訊號而變化。舉例而言,當檢測採用場效應電晶體監測訊號時,固體表面為場效應電晶體之電晶體表面;當檢測採用表面電漿共振時,固體表面為表面電漿共振之金屬表面;當檢測採用微陣列檢測系統時,固體表面為微陣列之基板表面。
在本發明之一個較佳實施例中,固體表面之材料為矽;較佳多晶矽或單晶矽;更佳多晶矽。多晶矽比單晶矽更便宜,但由於多晶具有更多晶界,通常在晶界中出現阻礙電子轉導之缺陷。此類現象使得固體表面不均勻且難以定量。此外,離子可能穿透至多晶之晶界中且引起溶液中之檢測失效。另外,多晶矽在空氣中不穩定。然而,上述缺點將不會干擾根據本發明之檢測單元之功能。
在本發明之一個實施例中,檢測單元進一步包含訊號檢測組件。應用訊號檢測組件以便檢測在部分中性單鏈寡核苷酸與靶分子之間是否發生雜交及/或結合。較佳地,檢測組件為場效應電晶體、表面電漿共振、顯微鏡、光譜儀、電泳裝置或電化學感測器。在本發明之一個實施例中,參考圖2,當DNA或RNA之靶分子與部分中性單鏈
寡核苷酸雜交以形成複合物時,電荷相比於部分中性單鏈寡核苷酸發生改變,因為DNA或RNA之靶分子帶有豐富之負電荷。若部分中性單鏈寡核苷酸與靶分子之間發生不匹配,諸如單核苷酸多態性檢測,則不會形成複合物。訊號檢測組件用於檢測電荷改變且監測雜交是否發生。訊號檢測組件通常與固體表面整合以便於檢測固體表面之電壓。熟習此項技術者能夠設計根據本發明之檢測組件。
在本發明之一個較佳實施例中,部分中性單鏈寡核苷酸包含連接至固體表面之第一部分;第一部分之長度為部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約50%;且第一部分包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸;更佳地,第一部分之長度為部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約40%;再更佳地,第一部分之長度為部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約30%。
在本發明之一個較佳實施例中,部分單鏈核苷酸進一步包含靠近第一部分之第二部分。第二部分位於相對於固體表面之遠端。第二部分包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。電中性核苷酸及帶負電核苷酸之描述與第一部分之描述相同且在本文中不再重複。
連接部分中性單鏈寡核苷酸及固體表面之方式視固體表面之材料及部分中性單鏈寡核苷酸之類型而定。在本發明之一個實施例中,部分中性單鏈寡核苷酸經由共價鍵連接至固體表面。共價鍵之實例包括(但不限於)以下方法,其視固體表面化學性質及寡核苷酸之修飾而定。在本發明之一個實施例中,當使用氧化矽作為固體表面時,固體表面藉由使用(3-胺丙基)三乙氧基矽烷(APTES)修飾。APTES之分子中之矽原子進行與羥基之氧原子之共價結合且其將表面之矽烷醇基團(SiOH)轉化成胺;接著部分中性單鏈寡核苷酸之5'-胺基藉由戊二醛與固體表面胺基共價結合(Roey Elnathan,Moria Kwiat,Alexander
Pevzner,Yoni Engel,Larisa Burstein,Artium Khatchtourints,Amir Lichtenstein,Raisa Kantaev,及Fernando Patolsky,Biorecognition Layer Engineering:Overcoming Screening Limitations of Nanowire-Based FET Devices,Nano letters,2012,12,5245-5254)。在本發明之一個其他實施例中,固體表面修飾為自組裝單層分子,該等分子具有用於藉由各種化學反應共價連接至部分中性單鏈寡核苷酸之不同官能基之不同官能基(Srivatsa Venkatasubbarao,Microarrays-status and prospects,TRENDS in Biotechnology第22卷第12期2004年12月;Ki Su Kim,Hyun-5eung Lee,Jeong-A Yang,Moon-Ho Jo及Sei Kwang Hahn,The fabrication,characterization and application of aptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors,Nanotechnology 20(2009))。
在本發明之一個其他較佳實施例中,部分中性單鏈寡核苷酸位於固體表面附近。鑒於應用檢測組件以便監測固體表面之電壓變化,部分中性單鏈寡核苷酸並不必須直接結合至固體表面,其限制條件為部分中性單鏈寡核苷酸與固體表面之間之距離足夠短以允許檢測組件檢測電壓變化。較佳地,固體表面與部分中性單鏈寡核苷酸之間之距離為約0至約10nm;更佳約0至約5nm。
在本發明之一個較佳實施例中,根據本發明之檢測單元進一步包含訊號放大器。根據本發明之訊號放大器較佳係指增強固體表面之電壓變化之檢測之組件。舉例而言,訊號放大器為連接至部分中性單鏈寡核苷酸一端之奈米金粒子。
在本發明之一個較佳實施例中,檢測單元進一步包含離子強度低於約50mM;更佳低於約40mM、30mM、20mM或10mM之緩衝液。不受理論限制,可推測,藉由應用部分中性單鏈寡核苷酸,部分中性單鏈寡核苷酸與靶DNA或RNA分子之間之雜交可發生,而不需要抑制部分帶電半中性單鏈寡核苷酸與其標靶之間之靜電排斥力。接著
藉由各鏈之鹼基配對及堆疊力驅動雜交。因此,雜交可在較低鹽條件下進行。在FET之情況下,較低離子強度提高檢測長度(德拜長度),且轉而增強檢測靈敏度。
在本發明之一個較佳實施例中,檢測單元進一步包含用於擴展檢測單元應用之生物分子。生物分子之實例包括(但不限於)單鏈DNA分子、單鏈RNA分子、多肽或蛋白質。
在本發明之一個更佳實施例中,檢測單元進一步包含連接至部分中性單鏈寡核苷酸之蛋白質。熟習此項技術者可例如藉由特異性親和性結合完成蛋白質與部分中性單鏈寡核苷酸之間之連接。經由連接至各種蛋白質,檢測系統用作對於檢測與所連接之蛋白質之靶相互作用具有改進之雜交特異性之蛋白質晶片。
在本發明之另一實施例中,參考圖3,檢測單元進一步包含單鏈DNA作為直探針,且部分中性單鏈寡核苷酸用作回收探針。作為直探針之單鏈DNA可為經修飾之單鏈DNA或未經修飾之單鏈DNA;較佳為部分中性單鏈DNA。回收探針及直探針都對標靶具有結合親和性;更佳地,回收探針與直探針相比,對標靶具有更高親和性。回收探針與直探針競爭用直探針及標靶形成之複合物。此類置換可例如用場效應電晶體容易地觀測到。在本發明之一個實施例中,直探針經設計以檢測標靶之存在,且回收探針經設計以檢測單核苷酸多態性與不匹配核苷酸之存在。直探針首先與標靶形成複合物,且回收探針接著結合至複合物中之標靶。監測訊號以檢測回收探針與標靶之間是否存在不匹配。
在本發明之一個更佳實施例中,參考圖4,回收探針連接至用於擴增訊號之奈米金粒子。
本發明亦提供一種檢測方法,其包含用如上文所提及之檢測單元進行檢測。
提供根據本發明之方法之各種應用。檢測包括(但不限於)非標記基因表現、聚合酶鏈反應、原位雜交、單核苷酸多態性(SNP)檢測、RNA檢測、DNA結合蛋白質及蛋白質檢測。
特定言之,藉由應用根據本發明之檢測單元,可在不擴增聚合酶鏈反應中之靶分子之情況下在樣品中檢測到極少量之靶分子。檢測較佳包含在樣品中檢測小於10-9莫耳濃度之標靶,且方法不含聚合酶鏈反應。
在本發明之一個實施例中,相比於習知檢測,主要在FET檢測之兩個態樣中可見基因檢測之改進之雜交特異性。第一,完美匹配與不匹配之間之熔融溫度差異更高。第二,緩衝液具有較低鹽條件,且FET檢測長度(德拜長度)增加。此等差異都導致檢測靈敏度之改進。
在本發明之再另一實施例中,經設計在場效應電晶體微陣列或表面電漿共振微陣列上之部分中性單鏈寡核苷酸以非標記且高通量方式提供定量之基因表現、蛋白質及SNP檢測。
提供以下實例來幫助熟習此項技術者實踐本發明。
脫氧胞苷(n-ac)對甲氧基亞磷醯胺、胸苷對甲氧基亞磷醯胺、脫氧鳥苷(n-ibu)對甲氧基亞磷醯胺及脫氧腺苷(n-bz)對甲氧基亞磷醯胺(全部購自美國化學基因公司(ChemGenes Corporation,USA))用於根據基於固相磷酸三酯合成之給定順序或藉由應用生物系統公司(Applied Biosystems)3900高通量DNA合成器(由Genomics® Biosci & Tech或使命生物技術(Mission Biotech)提供)合成寡核苷酸。
合成之寡核苷酸以弱鹼性在甲苯中在室溫下反應24小時,且樣品經受離子交換層析以將pH值調節至7。在樣品經濃縮及乾燥之後,獲得部分中性單鏈寡核苷酸。
互補H1:5'-CCATTGTGACTGTCCTCAAGTAGGTTGACAGAGTGTG-3'(SEQ ID No.1)
非互補H5:5'-TGATAACCAATGCAGATTTG-3'(SEQ ID No.2)
DNA探針:5'-NH2-C6-CACACTCTGTCAACCTAC-3'(SEQ ID No.3)
nDNA探針:5'-NH2-C6-CACACTCTGTCAACCTAC-3'(全部中性)(SEQ ID No.4)
部分中性單鏈探針1(下文稱為「經修飾之1」):5'-NH2-C6-CnACnACnTCnTGnTCAACCTAC-3'(SEQ ID No.5)
部分中性單鏈探針2(下文稱為「經修飾之2」):5'-NH2-C6-CnACAnCTCnTGTnCAACCTAC-3'(SEQ ID No.6)
上標n表示電中性核苷酸。
藉由SiNW表面層(SiO2)之官能化進行探針固定。首先,使用(3-胺丙基)三乙氧基矽烷(APTES)來修飾表面。APTES分子中之矽原子進行與羥基之氧之共價結合且將表面之矽烷醇基團(SiOH)轉化成胺。將樣品浸沒在2% APTES(99% EtOH)中30分鐘,且接著加熱至120℃ 10分鐘。此步驟後,胺基(NH2)為來自表面之末端單元。
隨後,戊二醛用作DNA固定之接枝劑。戊二醛結合經由其醛基(COH)實現以確保與APTES之胺基之共價結合。對於此步驟,在室溫下將樣品浸沒在12.5%戊二醛液體(10mM磷酸鈉緩衝液)中1小時。為了固定探針,將DNA鏈之5'-胺基連接至連接基團之醛基。將500μL 1μmol DNA探針之滴落溶液沈積至NW上18小時。
在探針固定之後,研發出PDMS(聚二甲基矽氧烷)流體系統以便
將DNA標靶泵送至奈米線表面,從而與DNA探針雜交。使用互補及非互補標靶,其經雙-參丙烷[1,3-雙(參(羥基甲基)甲胺基)丙烷]溶液之稀釋而具有各種濃度。雜交30分鐘後,用雙-參緩衝液洗滌樣品10分鐘以移除過量標靶。最終,使用吉時利(Keithley)2400來檢測NWFET電特徵(Id與Vg曲線)。
離子強度作用之結果顯示於圖5中。較低鹽濃度下之nDNA及部分中性單鏈DNA在較高鹽濃度下之DNA之△V方面具有更高FET靈敏度。含3'末端修飾之部分中性單鏈DNA具有最高FET靈敏度。
在1mM雙-參下不同標靶濃度之檢測結果顯示於圖6中。nDNA及部分中性單鏈DNA探針具有更高濃度靈敏度(V之斜率與濃度),尤其在較低標靶濃度範圍內。
在1mM雙-參下超低標靶濃度之檢測結果顯示於圖7中。在FET上,用部分中性單鏈DNA探針可檢測到低至0.1fM之標靶濃度。
若與H5T之非特異性雜交發生,則分析特異性。結果顯示於表1中。
如表1中所指示,當使用nDNA作為探針時,H5T之△V/mV(指示非特異性雜交)更高。當在較低鹽濃度下使用部分中性DNA探針時,非特異性雜交減少。
在SYBRTM格林(Green)系統之聚合酶鏈反應(PCR)及定量之聚合
酶鏈反應(qPCR)中應用部分中性單鏈寡核苷酸。
模板:pUC19
產物長度:202bp
上標n表示電中性核苷酸;「_」表示不匹配之核苷酸
PCR結果顯示於圖8A及8B中。比較使用DNA之結果及使用部分中性單鏈寡核苷酸(圖8A:規則DNA引物(表2之FP-R及RP-R)與中和DNA修飾引物(表2之FP-n 10、14);圖8B:規則DNA引物(表2之FP-R及RP-R)與中和DNA修飾引物(表2之FP-n 11、13))之彼等結果,部分中性單鏈寡核苷酸之引物特異性明顯改進。
qPCR結果顯示於圖9及表5中。
比較使用DNA之結果及使用部分中性單鏈寡核苷酸之彼等結果,部分中性單鏈寡核苷酸之引物特異性明顯改進。
測試細胞:經模擬miR-524-5p轉染之SK MEL19細胞及經miR-67轉染之SK MEL19細胞(陰性對照)
探針:
陰性對照miRNA(Cel-miR-67):TCACAACCTCCRAGAAAGAGTAGA(SEQ ID No.14)
模擬miR-524-5p:CUACAAAGGGAAGCACUUUCUC(SEQ ID No.15)
MiR-524-5p LNA探針:EX-38630-05- LNA檢測探針,hsa-miR-524-5p,250pmol 3`-DIG標記的
MiR-524-5p 7N-DNA探針:5'-GAnGAAnAGTnGCTnTCCnCTTnTGTnAG-3'Dig(SEQ ID No.16)上標n表示電中性核苷酸。
MiR-524-5p全nDNA探針:5' GAGAAAGTGCTTCCCTTTGTAG/3'Dig/(SEQ ID No.17)
MiR-524-5p DNA探針:5'-GAGAAAGTGCTTCCCTTTGTAG-3'Dig(SEQ ID No.18)
根據ISHyb原位雜交套組之製造商說明書(美國加利福尼亞州紐瓦
克之博誠公司(BioChain,Newark,CA,USA))進行原位雜交。用4%多聚甲醛(DEPC-PBS)使測試細胞固定化20分鐘且接著用DEPC-PBS洗滌三次(每次5分鐘)。測試細胞用蛋白酶(10μg/ml)處理8分鐘且用DEPC-PBS洗滌5分鐘。細胞進一步用4% PFA(DEPC-PBS)固定化15分鐘,接著用DEPC-PBS洗滌三次(每次5分鐘)。在65℃下,用預雜交溶液(美國加利福尼亞州紐瓦克之博誠公司)處理經洗滌之測試細胞4小時。接著添加不同濃度之探針以便在55℃下反應12至16小時。在45℃下用2×SSC洗滌樣品10分鐘,在45℃下用1.5×SSC洗滌10分鐘,且接著在37℃下用0.2×SSC洗滌20分鐘。用1×阻斷溶液(美國加利福尼亞州紐瓦克之博誠公司)阻斷雜交1小時。添加抗體溶液(1:200)(美國加利福尼亞州紐瓦克之博誠公司)以便反應4小時,且測試細胞用DEPC-PBS洗滌三次(每次10分鐘),且接著用鹼性磷酸酶緩衝液(美國加利福尼亞州紐瓦克之博誠公司)洗滌兩次(每次5分鐘)。接著添加NBT/BCIP(硝基藍四唑/5-溴-4-氯-3吲哚基磷酸酯)6.6μl NBT+3.3μl BCIP)溶液持續2至20小時。樣品用水洗滌且在顯微鏡下觀測。
結果顯示於圖10A至13C中。更高濃度之探針可產生與此等四個不同探針(DNA、全nDNA、7nDNA、LNA)中之較低濃度探針相比更佳之染色影像。此等結果指示所有四個探針可特異性檢測到細胞中之miR-524-5p表現。應注意,與LNA、全nDNA及DNA探針相比,7nDNA探針產生對miR-524-5p表現之最大靈敏度,因為相比於相同濃度之LNA或nDNA探針,當在7nDNA探針中施用細胞時,觀測到更強強度之影像。
靶miRNA:
miR107(1pM):AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA(SEQ ID No.19)
miR579-3p(1pM):UUCAUUUGGUAUAAACCGCGAUU(SEQ ID No.20)
miR885-5p(1pM):UCCAUUACACUACCCUGCCUCU(SEQ ID No.21)
探針顯示於表6中。
用於探針固定之表面修飾如實例2中所描述。將一種於雙-參丙烷緩衝液中之1pM miRNA(與探針互補)添加至探針固定化晶片中以便反應30分鐘。晶片用雙-參丙烷緩衝液洗滌10分鐘。如實例2中所描述監測訊號。
結果顯示於圖14中。部分單鏈寡核苷酸探針之△V/mV高於DNA探針之△V/mV。部分中性單鏈探針具有更高靈敏度。
儘管已結合上文闡述之特定實施例描述本發明,對於其之許多替代方案及其修飾及變化將對之一般技術者顯而易見。所有此類替代方案、修改及變化視為落入本發明之範疇內。
<110> 慧源生技有限公司
<120> 部分中性單鏈寡核苷酸
<130> none
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 互補H1
<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非互補H5
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探針
<400> 3
<210> 4
<211> 244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nDNA探針
<400> 4
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分中性單鏈探針1
<220>
<221> misc_difference
<222> (7)..(7)
<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (9)..(9)
<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (11)..(11)
<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (13)..(13)
<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (15)..(15)
<223> n表示電中性g
<400> 5
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分中性單鏈探針2
<220>
<221> misc_difference
<222> (7)..(7)
<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (10)..(10)
<223> n表示電中性a
<220>
<221> misc_difference
<222> (13)..(13)
<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (16)..(16)
<223> n表示電中性t
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FP_R
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RP_R
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FP_R_m12
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FP_n10,14
<220>
<221> misc_difference
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<223> n表示電中性t
<220>
<221> misc_difference
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<223> n表示電中性t
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<211> 2(0
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FP_m12_n10,14
<220>
<221> misc_difference
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<221> misc_difference
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<223> n表示電中性t
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<212> DNA
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<220>
<223> FP_n11,13
<220>
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<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (13)..(13)
<223> n表示電中性t
<400> 12
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FP_m12_n11,13
<220>
<221> misc_difference
<222> (11)..(11)
<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
<222> (13)..(13)
<223> n表示電中性t
<400> 13
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 陰性對照miRNA(Cel-miR-67)
<400> 14
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模擬miR-524-5p
<400> 15
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MiR-524-5p 7N-DNA探針
<220>
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<222> (2)..(2)
<223> n表示電中性a
<220>
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<222> (5)..(5)
<223> n表示電中性a
<220>
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<222> (8)..(8)
<223> n表示電中性t
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<222> (11)..(11)
<223> n表示電中性t
<220>
<221> misc_difference
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<222> (20)..(20)
<223> n表示電中性t
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MiR-524-5p All nDNA探針
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<212> DNA
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<223> MiR-524-5p DNA探針
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<212> RNA
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<223> miR107
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<223> 探針107(經修飾之2)
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<222> (7)..(7)
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<220>
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<222> (10)..(10)
<223> n表示電中性t
<220>
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<223> n表示電中性c
<220>
<221> misc_difference
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<223> n表示電中性t
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<223> 探針579-3p(DNA)
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<212> DNA
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<220>
<223> 探針579-3p(經修飾之2)
<220>
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<220>
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<223> n表示電中性t
<400> 25
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<212> DNA
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<220>
<223> 探針885-5p (DNA)
<400> 26
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<211> 28
<212> DNA
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<223> 探針885-5p(經修飾之2)
<220>
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<222> (7)..(7)
<223> n表示電中性a
<220>
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<222> (10)..(10)
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<220>
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<222> (16)..(16)
<223> n表示電中性g
<400> 27
Claims (20)
- 一種部分中性單鏈寡核苷酸,其包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。
- 如請求項1之部分中性單鏈寡核苷酸,其中該電中性核苷酸包含經C1-C6烷基取代之磷酸酯基。
- 如請求項1之部分中性單鏈寡核苷酸,其中該帶負電核苷酸包含未經取代之磷酸酯基。
- 如請求項1之部分中性單鏈寡核苷酸,其包含複數個該等電中性核苷酸,且至少一個帶負電核苷酸安置在兩個該等電中性核苷酸之間。
- 一種檢測單元,其包含如請求項1之部分中性單鏈寡核苷酸。
- 如請求項5之檢測單元,其進一步包含固體表面;且該部分中性單鏈寡核苷酸連接在該固體表面上或位於該固體表面附近。
- 如請求項6之檢測單元,其中該部分中性單鏈寡核苷酸包含連接至該固體表面之第一部分;該第一部分之長度為該部分中性單鏈寡核苷酸之總長度之約50%;且該第一部分包含至少一個電中性核苷酸及至少一個帶負電核苷酸。
- 如請求項6之檢測單元,其中該固體表面為場效應電晶體(FET)之電晶體表面、表面電漿共振(SPR)之金屬表面或微陣列之基板表面。
- 如請求項6之檢測單元,其中該固體表面之材料為多晶矽或單晶矽。
- 如請求項5之檢測單元,其進一步包含訊號檢測組件。
- 如請求項10之檢測單元,其中該檢測組件為場效應電晶體、表面電漿共振、顯微鏡、光譜儀、電泳裝置或電化學感測器。
- 如請求項5之檢測單元,其進一步包含訊號放大器。
- 如請求項12之檢測單元,其中該訊號放大器為連接至該部分中性單鏈寡核苷酸一端之奈米金粒子。
- 如請求項5之檢測單元,其進一步包含離子強度低於約50mM之緩衝液。
- 如請求項5之檢測單元,其進一步包含生物分子。
- 如請求項15之檢測單元,其中該生物分子選自由以下各者組成之群:單鏈DNA分子、單鏈RNA分子、多肽及蛋白質。
- 一種檢測系統,其包含複數個如請求項5之檢測單元。
- 如請求項17之檢測系統,其為微陣列或晶片。
- 一種檢測方法,其包含用如請求項5之檢測單元進行檢測。
- 如請求項19之方法,其中該檢測選自由以下各者組成之群:非標記基因表現、聚合酶鏈反應、原位雜交、單核苷酸多態性(SNP)檢測、RNA檢測、DNA結合蛋白質及蛋白質檢測。
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