CN106350569A - Dna甲基化检测 - Google Patents
Dna甲基化检测 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106350569A CN106350569A CN201610557520.1A CN201610557520A CN106350569A CN 106350569 A CN106350569 A CN 106350569A CN 201610557520 A CN201610557520 A CN 201610557520A CN 106350569 A CN106350569 A CN 106350569A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecule
- oligonucleotide
- target
- nucleotide
- solids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/55—Specular reflectivity
- G01N21/552—Attenuated total reflection
- G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
- G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
- G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/403—Cells and electrode assemblies
- G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
- G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/552—Glass or silica
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法。所述方法包含获得由于带电甲基化检测分子与所述靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化;其中所述带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。本发明改进所述寡核苷酸甲基化检测的检测灵敏度和精确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子检测技术。更确切地说,本发明涉及DNA甲基化检测。
背景技术
分子检测在临床诊断和分子生物学研究方面起重要作用。举例来说,DNA甲基化检测被视为若干应用中的关键检测。DNA中的胞嘧啶(也称为甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶)的5'碳的甲基化为调节基因表达且在胚胎发育中起关键作用的表观遗传修饰,且被认为涉及癌症、基因组印迹、细胞分化和阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)(栗田(Kurita),亮司(Ryoji)和丹羽治(Osamu Niwa).“通过凸出部分特异性免疫识别触发的DNA甲基化分析(DNA methylation analysis triggered by bulge specific immuno-recognition)”.分析化学(Analytical chemistry)84.17(2012):7533-7538)。
已开发若干系统以进行用于检测和/或鉴别DNA分子中的5-甲基胞嘧啶的数目和/或位置的DNA甲基化检测。DNA甲基化检测的主要方法为亚硫酸氢盐转化法(李斯特(Lister),瑞恩(Ryan)等人“碱基分解下的人类DNA甲基化组显示分布广泛的表观基因组差异(Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomicdifferences)”自然(Nature)462.7271(2009):315-322)。在所述方法中,待测试的DNA分子用亚硫酸氢盐处理以将胞嘧啶核苷酸转化为尿苷核苷酸,留下未经转化的5-甲基胞嘧啶核苷酸。转化的尿苷核苷酸在聚合酶链反应的后续复制中进一步转化为胸腺嘧啶核苷酸。另一方面,未经转化的5-甲基胞嘧啶核苷酸在复制中仍为胞嘧啶核苷酸。为了区分转化的胸腺嘧啶核苷酸与未经转化的胞嘧啶核苷酸,应用基因定序或微阵列方法。举例来说,全基因组鸟枪亚硫酸氢盐定序(WGSGS)用于分析亚硫酸氢盐转化之后的全基因序列,且可通过单碱基分解获得特定情况下的甲基化模式。然而,所述定序为费力且成本高的。为了补救所述缺陷,开发与限制酶联合的简化表示亚硫酸氢盐定序(RRBS)方法以消除不必要片段,但成本仍不符合要求。另一方法为使用微阵列方法,其能够以快速和高通量方式分析特定片段的甲基化模式,且广泛应用于药物筛选。尽管如此,微阵列方法未能测定5-甲基胞嘧啶核苷酸的数目和位置。
也已开发用于DNA甲基化检测生物同切点酶方法。同切点酶为对相同识别位点具有特异性的限制酶对。常用同切点酶中的一个为仅识别未甲基化胞嘧啶核苷酸且并不识别甲基化胞嘧啶核苷酸的甲基化敏感性酶。另一常用同切点酶为仅识别甲基化胞嘧啶核苷酸且并不识别未甲基化胞嘧啶核苷酸的甲基化依赖性酶。通过并入不同种类的同切点酶,可检测5-甲基胞嘧啶核苷酸。不幸的是,所述方法的应用由于同切点酶的固有特性而高度受限,且仅可检测位于特定同切点酶对的识别位点的5-甲基胞嘧啶核苷酸。
DNA甲基化检测的另一方法为亲和力方法。与5-甲基胞嘧啶核苷酸具有特异性亲和力的抗体或蛋白质用于捕获含有5-甲基胞嘧啶核苷酸的片段,且基因定序或微阵列方法随后用于分析捕获片段。亲和力方法的实例为使用抗体的甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)(韦伯(Weber),迈克尔(Michael)等人“与染色体同宽且启动子特异性分析鉴别正常和转化人类细胞中的差异性DNA甲基化的位点(Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal andtransformed human cells.)”自然·遗传学(Nature genetics)37.8(2005):853-862)或使用甲基结合域蛋白质(MBD)的甲基化CGI恢复分析(MIRA)(克洛斯(Cross),萨利H(SallyH.)等人“使用甲基化DNA结合柱的CpG岛的纯化(Purification of CpG islands using amethylated DNA binding column)”自然·遗传学6.3(1994):236-244;栗田,亮司和丹羽治.“通过凸出部分特异性免疫识别触发的DNA甲基化分析”分析化学84.17(2012):7533-7538)。在亲和力方法中,通过如声处理的方式提供片段且必要时还提供单链片段。抗体或蛋白质首先用于捕获含有5-甲基胞嘧啶核苷酸的片段。在与抗体或蛋白质分离之后,捕获片段通过基因定序或微阵列分析。由于需要定序或微阵列方法,由如上所述的方法产生的缺陷无法避免。
发明内容
为了改进DNA甲基化检测灵敏度和精确性,提供一种快速且方便的检测方法。
本发明提供一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法,其包含获得由于带电甲基化检测分子与靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化;其中带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。
本发明还提供一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的试剂盒,其包含:
具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力的带电甲基化检测分子;和
用于检测电性变化的电性变化检测元件。
在以下部分中详细描述本发明。本发明的其它特征、目的和优点可发现于具体实施方式和权利要求书中。
附图说明
图1显示检测本发明的一个实施例中的靶寡核苷酸分子的甲基化的方法的示意图。
图2显示根据本发明的电中性核苷酸的一个优选实施例。
图3显示具有SEPT9甲基DNA标靶1(C5)的SEPT9DNA探针1的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号;“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶1诱导的电信号;“▲”指示通过1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。
图4显示具有SEPT9甲基DNA标靶2(C14)的SEPT9DNA探针1的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号;“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶2诱导的电信号;“▲”指示通过1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。
图5显示具有SEPT9甲基DNA标靶3(C26)的SEPT9DNA探针1的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号;“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶3诱导的电信号;“▲”指示通过1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。
图6显示通过靶DNA(左侧柱)和抗体(右侧柱)诱导的纳米线FET(NWFET)的阈值电压位移。
图7显示抗体与靶DNA的阈值电压位移比率。
图8显示具有SEPT9甲基DNA标靶6(C2,16,32)的SEPT9DNA探针2的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号;“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶6诱导的电信号;“▲”指示通过0.25μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。
图9显示通过靶DNA(左侧柱)和抗体(右侧柱)诱导的NWFET的阈值电压位移。1×意指靶寡核苷酸分子具有一个甲基化胞嘧啶核苷酸。2×意指靶寡核苷酸分子具有两个甲基化胞嘧啶核苷酸。3×意指靶寡核苷酸分子具有三个甲基化胞嘧啶核苷酸。
图10显示抗体与靶寡核苷酸分子的阈值电压位移比率。
图11显示具有SEPT9甲基DNA标靶7的SEPT9DNA探针2的Id-Vg曲线。
图12显示与SEPT9甲基DNA标靶6(C2,C16,C32)和抗体结合的部分中性单链寡核苷酸(N-DNA)探针的Id-Vg曲线。“■”指示10mM双-三丙烷缓冲液中检测的电信号;“●”指示通过SEPT9甲基DNA标靶6诱导的电信号;“▲”指示通过0.1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗体诱导的电信号。
具体实施方式
本发明提供一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法,其包含获得由于带电甲基化检测分子与靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化;其中带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。
如本文所用,术语“寡核苷酸”或“寡核苷酸分子”是指核苷酸的寡聚物。术语“核苷酸”是指由含氮碱基、糖和一或多个磷酸酯基;优选一个磷酸酯基构成的有机分子。含氮碱基包括嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤包括经取代或未经取代的腺嘌呤和经取代或未经取代的鸟嘌呤;嘧啶包括经取代或未经取代的胸腺嘧啶、经取代或未经取代的胞嘧啶和经取代或未经取代的尿嘧啶。糖优选地为五碳糖,更优选地经取代或未经取代的核糖或经取代或未经取代的脱氧核糖。磷酸酯基与糖的2碳、3碳或5碳;优选地与5碳位点形成键。为了形成寡核苷酸,通过磷酸二酯桥将一个核苷酸的糖与相邻糖接合。优选地,寡核苷酸为DNA或RNA;更优选地为DNA。
如本文所用,术语“靶寡核苷酸分子”是指天然存在的或人工分子。在另一方面中,靶寡核苷酸分子为纯化的或与其它内容物混合。在本发明的一个优选实施例中,靶寡核苷酸分子的甲基化模式在正常条件和异常条件(如疾病)下不同。在本发明的另一优选实施例中,靶寡核苷酸分子的甲基化模式在不同细胞类型中不同。
如本文所用,术语“靶寡核苷酸分子的甲基化”是指靶寡核苷酸分子中的甲基化核苷酸。确切地说,甲基化核苷酸是指甲基化胞嘧啶核苷酸。如本文所用,甲基化胞嘧啶核苷酸具有胞嘧啶的5'碳中的甲基取代,且也称为5-甲基胞嘧啶核苷酸。当靶寡核苷酸分子包含甲基化胞嘧啶核苷酸时,靶寡核苷酸分子具有具有至少一个甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列。
如本文所用,术语“检测靶寡核苷酸分子的甲基化”是指发现或测定靶寡核苷酸分子的甲基化概况或模式,包括(但不限于)靶寡核苷酸分子中的甲基化核苷酸的位置、数目或百分比。
如本文所用,术语“带电甲基化检测分子”是指具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力且携有电荷的分子。优选地,带电甲基化检测分子为特异性结合到甲基化胞嘧啶核苷酸的蛋白质。在本发明的一个优选实施例中,带电甲基化检测分子选自由以下组成的群组:抗甲基胞嘧啶抗体、甲基结合域蛋白质和限制酶。抗甲基胞嘧啶抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。在本发明的一个实施例中,抗甲基胞嘧啶抗体识别单链寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸,且在本发明的另一实施例中,抗甲基胞嘧啶抗体识别双链寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸。在另一方面中,在本发明的一个实施例中,甲基结合域蛋白质结合到单链寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸,且在本发明的另一实施例中,甲基结合域蛋白质结合到双链寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸。甲基结合域蛋白质的实例包括甲基-CpG结合域(MBD)1、MBD2、MBD3和MBD4蛋白质。在另一方面中,在本发明的一个实施例中,限制酶识别单链寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸,且在本发明的另一实施例中,限制酶识别双链寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸。限制酶的实例包括HpaII、MspI、SmaI和XmaI。
根据本发明,如果甲基化胞嘧啶核苷酸存在于靶寡核苷酸分子中,那么带电甲基化检测分子结合到靶寡核苷酸分子的甲基化胞嘧啶核苷酸。由于带电甲基化检测分子携有电荷,由于带电甲基化检测分子与靶寡核苷酸分子的结合而出现电性变化,所述结合是通过将带电甲基化检测分子的电荷引入到由带电甲基化检测分子和靶寡核苷酸分子形成的复合物中。另一方面,如果甲基化胞嘧啶核苷酸不存在于靶寡核苷酸分子中,那么带电甲基化检测分子无法结合到靶寡核苷酸分子的甲基化胞嘧啶核苷酸。因此,电环境不变,且未出现电性变化。通过监测电性变化,检测靶寡核苷酸分子的甲基化,且测定靶寡核苷酸分子的甲基化概况或模式。
根据本发明的电性变化包括(但不限于)电荷的增加。电性变化可检测为电信号。电信号包括(但不限于)导电性、电场、电容、电流、电子或电子空穴的变化。在本发明的一个优选实施例中,电性变化为阈值电压位移变化。
优选地,电性变化通过电性变化检测元件检测。电性变化检测元件应用于检测是否由于带电甲基化检测分子与靶寡核苷酸分子的结合而出现电性变化。优选地,电性变化检测元件为场效应晶体管或表面等离子体共振。
在本发明的一个优选实施例中,检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法包含:
通过识别单链寡核苷酸分子捕获靶寡核苷酸分子的单链以根据碱基互补性形成双螺旋;
提供带电甲基化检测分子;和
将双螺旋与带电甲基化检测分子结合且检测由结合所致的电性变化。
靶寡核苷酸分子可为单链分子或双链分子。获得双链靶寡核苷酸分子的单链的方式可例如为加热或改变双链靶寡核苷酸分子的环境的离子强度。
如本文所用,术语“识别单链寡核苷酸分子”是指根据碱基互补性能够与靶寡核苷酸分子形成双螺旋的单链寡核苷酸分子。换句话说,识别单链寡核苷酸分子充当杂交靶寡核苷酸分子的探针。双螺旋优选地是指双链结构,且一条链为靶寡核苷酸分子的单链且另一条链为识别单链寡核苷酸分子。优选地,识别单链寡核苷酸分子具有与靶序列匹配的序列;更优选地,具有与靶序列完全匹配的序列。通过形成双螺旋,靶寡核苷酸分子可捕获自样品中的混合物。捕获步骤也指特异性选择靶寡核苷酸分子和在双螺旋中呈现靶寡核苷酸分子的纯化步骤。因此,带电甲基化检测分子结合到双螺旋,尤其双螺旋中的靶核苷酸分子的甲基化胞嘧啶核苷酸,且获得由于结合而出现的电性变化。
根据本发明的样品衍生自天然存在的来源或衍生自人工操纵。优选地,样品衍生自天然存在的来源,如提取物、体液、组织生检、液体生检或细胞培养物。在另一方面中,样品根据检测的反应处理。举例来说,可以调节样品的pH值或离子强度。
优选地,由靶寡核苷酸分子的单链和识别单链寡核苷酸分子形成的双螺旋包含凸出部分且甲基化胞嘧啶核苷酸安置于凸出部分中。识别单链寡核苷酸分子的序列优选地经设计以与靶寡核苷酸分子的单链形成凸出部分。凸出部分允许甲基化胞嘧啶核苷酸很好地呈现于双螺旋的三维结构中的带电甲基化检测分子。
根据本发明的识别单链寡核苷酸分子可呈现于溶液中或附接到固体表面。优选地,识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面或识别单链寡核苷酸分子与固体表面间隔开一定距离。
如本文所使用,术语“固体表面”是指固体载体,包括(但不限于)聚合物、纸、织物或玻璃。优选地,采用的固体表面取决于电性变化检测元件而变化。举例来说,当方法采用场效应晶体管检测电性变化时,固体表面为场效应晶体管的晶体管表面;当方法采用表面等离子体共振时,固体表面为表面等离子体共振的金属表面。
在本发明的优选实施例中,固体表面的材料为硅;优选地多晶硅或单晶硅;更优选地多晶硅。多晶硅比单晶硅更便宜,但由于多晶具有更多晶界,通常在晶界中出现阻碍电子转导的缺陷。此类现象使得固体表面不均匀并且难以定量。此外,离子可能穿透到多晶的晶界中且引起溶液中的检测失效。另外,多晶硅在空气中不稳定。然而,上述缺点将不干扰根据本发明的方法的功能。
附接识别单链寡核苷酸分子与固体表面的方式取决于固体表面的材料和识别单链寡核苷酸分子的类型。在本发明的一个实施例中,识别单链寡核苷酸分子经由共价键连接到固体表面。共价键的实例包括(但不限于)以下方法,其取决于固体表面化学性质和寡核苷酸的修饰。在本发明的一个实施例中,当氧化硅用作固体表面时,固体表面通过使用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)修饰。APTES的分子中的硅原子进行与羟基的氧原子的共价结合且其将表面的硅烷醇基团(SiOH)转化为胺;接着识别单链寡核苷酸分子的5'-氨基通过戊二醛与固体表面胺基共价结合(罗伊以利拿单(Roey Elnathan),莫里亚奎亚特(Moria Kwiat),亚历山大佩夫兹纳(Alexander Pevzner),约尼恩格尔(Yoni Engel),拉里萨伯斯坦(Larisa Burstein)阿尔蒂姆卡其托林茨(Artium Khatchtourints),阿米尔利希滕斯坦(Amir Lichtenstein),赖莎坎塔艾夫(Raisa Kantaev)和费尔南多帕托斯基(Fernando Patolsky),生物识别层工程改造:克服基于纳米线的FET装置的筛选限度(Biorecognition Layer Engineering:Overcoming Screening Limitations ofNanowire-Based FET Devices),纳米快报(Nano letters),2012,12,5245-5254)。在本发明的另一实施例中,固体表面修饰为自组装单层分子,所述分子具有用于通过各种化学反应共价键联到识别单链寡核苷酸分子的不同官能团的不同官能团(斯里瓦塔萨文卡塔苏巴劳(Srivatsa Venkatasubbarao),微阵列状态和展望(Microarrays-status andprospects),生物技术趋势(TRENDS in Biotechnology)第22卷第12号2004年12月;金苏文(Ki Su Kim)、李炫升(Hyun-Seung Lee)、杨郑安(Jeong-A Yang)、乔孟何(Moon-Ho Jo)和韩四光(Sei Kwang Hahn),适体官能化Si-纳米线FET生物传感器的制造、表征和应用(Thefabrication,characterization and application of aptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors),纳米技术(Nanotechnology)20(2009))。
在本发明的另一优选实施例中,识别单链寡核苷酸分子与固体表面间隔开一定距离。由于电性变化检测元件应用于检测由带电甲基化检测分子与靶寡核苷酸分子的结合所致的电性变化,识别单链寡核苷酸分子不必直接结合到固体表面,其条件是识别单链寡核苷酸分子与固体表面之间的距离足够短以允许电性变化检测元件检测电性变化。优选地,固体表面与识别单链寡核苷酸分子之间的距离为约0到约10nm;更优选约0到约5nm。
优选地,固体表面与电性变化检测元件耦接以检测电性变化。
根据本发明,自由形式的带电甲基化检测分子优选地在检测电性变化之前去除,进而避免通过由自由形式的带电甲基化检测分子携带的电荷产生的噪音。去除方式包括(但不限于)洗涤。
在本发明的一个优选实施例中,方法用于检测靶寡核苷酸分子的甲基化位置。通过将识别单链寡核苷酸分子附着于固体表面上,双螺旋的不同位置中出现的电性变化能够彼此区分。举例来说,当带电甲基化检测分子结合到接近固体表面安置的甲基化胞嘧啶核苷酸时,通过与固体表面耦接的电性变化检测元件检测到较强电信号,因为通过带电甲基化检测分子引入的电荷接近电性变化检测元件安置。另一方面,当带电甲基化检测分子结合到远离固体表面安置的甲基化胞嘧啶核苷酸时,通过与固体表面耦接的电性变化检测元件检测到较弱电信号,因为通过带电甲基化检测分子引入的电荷远离电性变化检测元件安置。
在本发明的一个优选实施例中,方法用于检测靶寡核苷酸分子的甲基化数目或百分比。通过将识别单链寡核苷酸分子附着于固体表面上,由于双螺旋的不同甲基化胞嘧啶核苷酸数目而出现的电性变化能够彼此区分。举例来说,当较多带电甲基化检测分子结合到具有较多甲基化胞嘧啶核苷酸的靶寡核苷酸分子时,通过与固体表面耦接的电性变化检测元件检测到较强电信号,因为通过带电甲基化检测分子引入更多电荷。另一方面,当较少带电甲基化检测分子结合到具有较少甲基化胞嘧啶核苷酸的靶寡核苷酸分子时,通过与固体表面耦接的电性变化检测元件检测到较弱电信号,因为通过带电甲基化检测分子引入较少电荷。
参看图1,说明本发明的优选实施例。在步骤1中,识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面。在步骤2中,通过识别单链寡核苷酸分子捕获靶寡核苷酸分子以根据碱基互补性形成双螺旋。在步骤3中,带电甲基化检测分子应用于接触双螺旋。在步骤4中,由于靶寡核苷酸分子包含至少一个甲基化胞嘧啶核苷酸,带电甲基化检测分子结合到至少一个甲基化胞嘧啶核苷酸,且由于带电甲基化检测分子与靶寡核苷酸分子的结合而出现电性变化。
在本发明的一个优选实施例中,识别单链寡核苷酸分子为包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸的部分中性单链寡核苷酸。使核苷酸呈电中性的方式不受限制。在本发明的一个实施例中,电中性核苷酸包含经烷基取代的磷酸酯基。优选地,烷基是C1-C6烷基;更优选地,烷基是C1-C3烷基。C1-C3烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基和丙基。图2显示根据本发明的电中性核苷酸的一个优选实施例。磷酸酯基中的带负电氧原子改变为不具有电荷的中性原子。用烷基取代磷酸酯基的方式可以根据普通化学反应应用。
根据本发明的带负电核苷酸包含具有至少一个负电荷的磷酸酯基。未经修饰的核苷酸优选地为不具有修饰或取代的天然存在的核苷酸。在本发明的一个优选实施例中,带负电核苷酸包含未经取代的磷酸酯基。
根据本发明的部分中性单链寡核苷酸被部分赋予电中性。序列或长度不受限制,并且部分中性单链寡核苷酸的序列或长度可根据靶分子,基于本发明的公开内容进行设计。
电中性核苷酸和带负电核苷酸的数目取决于部分中性单链寡核苷酸的序列和双螺旋形成的条件。电中性核苷酸和带负电核苷酸的位置也取决于部分中性单链寡核苷酸的序列和双螺旋形成的条件。可根据可用信息,基于本发明的公开内容,设计电中性核苷酸和带负电核苷酸的数目和位置。举例来说,可通过基于双链(ds)结构能量的分子建模计算设计电中性核苷酸的数目和位置,并且可接着参考结构能量测定dsDNA/DNA或dsDNA/RNA的熔融温度(Tm)。
在本发明的一个优选实施例中,部分中性单链寡核苷酸包含多个电中性核苷酸,并且至少一个带负电核苷酸安置在两个电中性核苷酸之间;更优选地,至少两个带负电核苷酸安置在两个电中性核苷酸之间。
在本发明的一个优选实施例中,当应用根据本发明的部分中性单链寡核苷酸时,至少一个电中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸附近;更优选地,2、3、4或5个电中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸附近。在另一方面中,至少一个电中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸的下游或上游位点;优选地,至少一个电中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸的下游和上游位点。
通过引入电中性核苷酸,相比于常规DNA探针,根据本发明的部分中性单链寡核苷酸的完美匹配双链寡核苷酸与不匹配双链寡核苷酸之间的熔融温度差异更高。不受理论限制,可推测,两条链之间的静电排斥力通过引入中性寡核苷酸而减小,并且熔融温度从而升高。通过控制电中性核苷酸的数目和位置,将熔融温度差值调节到所需点,提供较好工作温度或温度范围以区分完美和不匹配寡核苷酸,从而改进捕获特异性。此类设计有益于整合到一个芯片或阵列中的不同部分中性单链寡核苷酸的熔融温度的一致性。待检测反应的数目可以随着较高特异性而显著升高,并且更多检测单元可并入到单一检测系统中。所述设计提供较好微阵列操作条件。
在本发明的一个优选实施例中,部分中性单链寡核苷酸包含连接到固体表面的第一部分;第一部分的长度是部分中性单链寡核苷酸的总长度的约50%;并且第一部分包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸;更优选地,第一部分的长度是部分中性单链寡核苷酸的总长度的约40%;更优选地,第一部分的长度是部分中性单链寡核苷酸的总长度的约30%。
在本发明的一个优选实施例中,部分单链核苷酸进一步包含与第一部分邻接的第二部分。第二部分位于固体表面的远端。第二部分包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸。电中性核苷酸和带负电核苷酸的描述与第一部分的描述相同并且在本文中不再重复。
在本发明的一个优选实施例中,另外提供信号放大器以增强电性变化的检测。根据本发明的信号放大器优选是指增强固体表面的电压变化的检测的组件。举例来说,信号放大器可为附接到识别单链寡核苷酸分子的一端的纳米金粒子。
在本发明的一个优选实施例中,在具有低于约50mM;更优选地低于约40mM、30mM、20mM或10mM的离子强度的缓冲液中进行所述方法。不受理论限制,推测通过应用部分中性单链寡核苷酸,部分中性单链寡核苷酸与靶分子之间的形成的双螺旋可在不需要抑制部分带电半中性单链寡核苷酸与其靶标之间的静电排斥力的情况下发生。接着通过每条链的碱基配对和堆叠力驱动杂交。因此,可在较低盐条件下形成双螺旋。在FET的情况下,较低离子强度增加检测长度(德拜长度),并且转而增强检测灵敏度。
在本发明的一个实施例中,相比于常规检测,主要在FET检测的两个方面中可见形成双螺旋的改进的杂交特异性。第一,熔融温度差异较高。第二,缓冲液具有较低盐条件,并且FET检测长度(德拜长度)增加。这些差异均导致检测灵敏度的改进。
在本发明的优选实施例中,若干识别单链寡核苷酸分子包含于一个系统中以在一个操纵中进行若干检测。举例来说,多个识别单链寡核苷酸分子可并入检测系统中。优选地,检测系统是微阵列或芯片。
在本发明的一个优选实施例中,方法包含以下步骤:
(a)提供
靶寡核苷酸分子的单链;
识别单链寡核苷酸分子;
具有无甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列的参考单链寡核苷酸分子;和
带电甲基化检测分子;
(b)分别用识别单链寡核苷酸分子捕获靶寡核苷酸分子的单链以形成靶双螺旋,且用识别单链寡核苷酸分子捕获参考单链寡核苷酸分子以形成参考双螺旋;
(c)分别使带电甲基化检测分子与靶双螺旋接触以形成靶复合物,且使带电甲基化检测分子与参考双螺旋接触;且去除自由形式的带电甲基化检测分子;且
(d)监测靶复合物与参考双螺旋之间的电性变化。
如本文所用,术语“参考单链寡核苷酸分子”是指具有无甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列,提供不具有甲基化的背景的寡核苷酸分子。优选地,参考单链寡核苷酸分子具有与除了甲基化胞嘧啶核苷酸的靶寡核苷酸分子相同的结构。在另一方面中,参考单链寡核苷酸分子和靶寡核苷酸分子均通过识别单链寡核苷酸分子捕获,且同时进行步骤(b)到(d)中与参考单链寡核苷酸分子和靶寡核苷酸分子相关的操纵。
优选地,形成靶双螺旋和参考双螺旋的条件相同。在另一方面中,形成靶复合物与参考复合物的条件相同。
靶复合物与参考双螺旋之间的电性变化表示由于带电甲基化检测分子和靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化。
本发明还提供一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的试剂盒,其包含:
具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力的带电甲基化检测分子;和
用于检测电性变化的电性变化检测元件。
优选地,根据本发明的试剂盒进一步包含如上所述的识别单链寡核苷酸分子。
优选地,根据本发明的试剂盒进一步包含如上所述的信号放大器。
优选地,根据本发明的试剂盒进一步包含具有无如上所述的甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列的参考单链寡核苷酸分子。
提供以下实例来帮助所属领域的技术人员实践本发明。
实例
合成作为识别单链寡核苷酸分子的部分中性单链寡核苷酸:
脱氧胞嘧啶核苷(n-ac)对甲氧基亚磷酰胺、胸苷对甲氧基亚磷酰胺、脱氧鸟苷(n-ibu)对甲氧基亚磷酰胺和脱氧腺苷(n-bz)对甲氧基亚磷酰胺(全部购自美国化学基因公司(ChemGenes Corporation,USA))用于根据基于固相磷酸三酯合成的给定顺序或通过应用生物系统公司(Applied Biosystems)3900高通量DNA合成器(由Biosci&Tech或使命生物技术(Mission Biotech)提供)合成寡核苷酸。
合成的寡核苷酸以弱碱性在甲苯中在室温下反应24小时,且样品经受离子交换色谱以将pH值调节到7。在样品经浓缩和干燥之后,获得部分中性单链寡核苷酸。
识别单链寡核苷酸分子附接:
通过Si-纳米线(SiNW)表面层(SiO2)的功能化进行识别单链寡核苷酸分子附接。首先,使用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)来修饰表面。APTES分子中的硅原子进行与羟基的氧的共价结合并且将表面的硅烷醇基团(SiOH)转化成胺。将样品浸没于2%APTES(99%EtOH)中30分钟,并且接着加热到120℃后维持10分钟。在此步骤完成之后,氨基(NH2)为相对于表面的终端单元。
随后,戊二醛用作DNA附接的接枝剂。戊二醛结合经由其醛基(COH)实现以确保与APTES的氨基的共价结合。对于这一步骤,在室温下将样品浸没于12.5%戊二醛液体(10mM磷酸钠缓冲液)中1小时。
识别单链寡核苷酸分子与浓度为1μM的双-三丙烷缓冲液混合,且经修饰SiNW表面另外浸没于溶液中12小时。
捕获靶寡核苷酸分子
识别单链寡核苷酸分子(探针)的序列和靶寡核苷酸分子(标靶)在表1中列出。
表1:
Cme:甲基化胞嘧啶核苷酸
实例1:检测靶寡核苷酸分子的甲基化位置
靶寡核苷酸分子为SEPT9甲基DNA标靶1(C5)、SEPT9甲基DNA标靶1(C14)和SEPT9甲基DNA标靶1(C26),其分别在位置5、14和26处具有甲基化胞嘧啶核苷酸。
靶寡核苷酸分子与浓度为100pM的双-三丙烷缓冲液混合,且通过附接到SiNW的SEPT9DNA探针1捕获30分钟以形成双螺旋。
将作为带电甲基化检测分子的抗5mC抗体(0.25μg/mL)引入到双螺旋以反应30分钟。
结果显示于图3到7中。
图3显示分析物处理下的pSNWFET的电信号。“■”线示出用10mM pH=7双-三丙烷缓冲液处理所谓pSNWFET所谓Id-Vg曲线。在pSNWFET用互补DNA处理之后,DNA受损缓冲液经相同双-三丙烷缓冲液替换。随后,电信号检测经处理且得出为“●”线。最后,注射包含抗甲基胞嘧啶抗体的缓冲液且在纳米线上培育。双-三丙烷缓冲液替换之后为培育,且电信号显示为“▲”线。进行不同甲基胞嘧啶位点的类似检测且结果显示于图4和图5中。通过靶DNA和抗甲基胞嘧啶抗体诱导的平均ΔVth显示于图6中。以下方程式用于标准化通过抗体诱导的电信号:
图7显示抗体与靶DNA的标准化比率结果,其显著表明根据本发明的方法用于检测靶寡核苷酸分子的甲基化位置。
实例2:检测靶寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸数目
靶寡核苷酸分子为SEPT9甲基DNA标靶4(C2)、SEPT9甲基DNA标靶5(C2+C16)和SEPT9甲基DNA标靶6(C2+C16+C32),其分别具有一个、两个或三个甲基化胞嘧啶核苷酸。
靶寡核苷酸分子与浓度为100pM的双-三丙烷缓冲液混合,且通过附接到SiNW的SEPT9DNA探针1捕获30分钟以形成双螺旋。
将作为带电甲基化检测分子的抗5mC抗体(0.25μg/mL)引入到双螺旋以反应30分钟。
结果显示于图8到10中。
靶寡核苷酸分子用不同数目的甲基胞嘧啶合成,其提供不同数目的抗体结合位点。图8显示SEPT9甲基DNA标靶6的检测结果。作为距离效应的验证,在双-三丙烷缓冲液,含有DNA标靶和抗甲基胞嘧啶抗体的缓冲液的条件下检测Id-Vg曲线。图9表明分别通过靶DNA和抗体诱导的3次阈值电压位移的平均值。图10显示来自图9的阈值电压位移的标准化,且其明显地指示甲基胞嘧啶数目与电压位移具有正相关。
实例3:检测靶寡核苷酸分子中的单链尾上的甲基化胞嘧啶核苷酸
靶寡核苷酸分子为SEPT9甲基DNA标靶7(C39)。
靶寡核苷酸分子与浓度为100pM的双-三丙烷缓冲液混合,且通过附接到SiNW的SEPT9DNA探针2捕获30分钟以形成双螺旋。
将作为带电甲基化检测分子的抗5mC抗体(1μg/mL)引入到双螺旋以反应30分钟。
结果显示于图11中。所述图表明安置于由SEPT9DNA探针2与SEPT9甲基DNA标靶7形成的双螺旋的单链尾上的甲基化胞嘧啶将检测极限增加到1ng/ml抗甲基胞嘧啶抗体。
实例4:检测具有N-DNA的靶寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸
靶寡核苷酸分子为SEPT9甲基DNA标靶6(C2,16,32)。
靶寡核苷酸分子与浓度为100pM的双-三丙烷缓冲液混合,且通过附接到SiNW的SEPT9N-DNA探针捕获30分钟以形成双螺旋。
将作为带电甲基化检测分子的抗5mC抗体(0.1μg/mL)引入到双螺旋以反应30分钟。
结果显示于图12中。所述图表明安置于由SEPT9DNA探针2与SEPT9甲基DNA标靶7形成的双螺旋的单链尾上的甲基化胞嘧啶将检测极限增加到1ng/ml抗甲基胞嘧啶抗体。
图12显示与SEPT9甲基DNA标靶6(C2,C16,C32)和抗体结合的部分中性单链寡核苷酸(N-DNA)探针的Id-Vg曲线。相比于图8,其显示N-DNA在灵敏度中具有改进的效应。
尽管已结合上文阐述的特定实施例描述本发明,对于其的许多替代方案和其修饰和变化将对所属领域的技术人员显而易见。所有此类替代方案、修改和变化被视为落入本发明的范围内。
Claims (28)
1.一种检测靶寡核苷酸分子的甲基化的方法,其包含获得由于带电甲基化检测分子与所述靶寡核苷酸分子的结合而出现的电性变化;其中所述带电甲基化检测分子具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述带电甲基化检测分子选自由以下组成的群组:抗甲基胞嘧啶抗体、甲基结合域蛋白质和限制酶。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述电性变化为阈值电压位移变化。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶寡核苷酸分子具有具有至少一个甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列,且所述方法包含:
通过识别单链寡核苷酸分子捕获所述靶寡核苷酸分子的单链以根据碱基互补性形成双螺旋;
提供所述带电甲基化检测分子;和
将所述双螺旋与所述带电甲基化检测分子结合且检测由所述结合所致的电性变化。
5.根据权利要求4所述的方法,其中由所述靶寡核苷酸分子的单链和所述识别单链寡核苷酸分子形成的所述双螺旋包含凸出部分且所述甲基化胞嘧啶核苷酸安置于所述凸出部分中。
6.根据权利要求4所述的方法,其中所述识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面或所述识别单链寡核苷酸分子与所述固体表面间隔开一定距离。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述固体表面为场效应晶体管FET的晶体管表面或表面等离子体共振SPR的金属表面。
8.根据权利要求6所述的方法,其中所述固体表面的材料为多晶硅或单晶硅。
9.根据权利要求6所述的方法,其中所述固体表面与检测所述电性变化的电性变化检测元件耦接。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述电性变化检测元件为场效应晶体管或表面等离子体共振。
11.根据权利要求4所述的方法,其中所述识别单链寡核苷酸分子为包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸的部分中性单链寡核苷酸。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述电中性核苷酸包含经C1-C6烷基取代的磷酸酯基。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述带负电核苷酸包含未经取代的磷酸酯基。
14.根据权利要求11所述的方法,其中所述识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面,且所述部分中性单链寡核苷酸包含附接到所述固体表面的第一部分;所述第一部分的长度为所述部分中性单链寡核苷酸的总长度的约50%;且所述第一部分包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸。
15.根据权利要求1所述的方法,其包含以下步骤:
(a)提供
所述靶寡核苷酸分子的单链;
所述识别单链寡核苷酸分子;
具有无甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列的参考单链寡核苷酸分子;和
所述带电甲基化检测分子;
(b)分别用所述识别单链寡核苷酸分子捕获所述靶寡核苷酸分子的单链以形成靶双螺旋,且用所述识别单链寡核苷酸分子捕获所述参考单链寡核苷酸分子以形成参考双螺旋;
(c)分别使所述带电甲基化检测分子与所述靶双螺旋接触以形成靶复合物,且使所述带电甲基化检测分子与所述参考双螺旋接触;且去除自由形式的所述带电甲基化检测分子;且
(d)监测所述靶复合物与所述参考双螺旋之间的电性变化。
16.一种用于检测靶寡核苷酸分子的甲基化的试剂盒,其包含:
具有与甲基化胞嘧啶核苷酸的亲和力的带电甲基化检测分子;和
用于检测电性变化的电性变化检测元件。
17.根据权利要求16所述的试剂盒,其中所述带电甲基化检测分子选自由以下组成的群组:抗甲基胞嘧啶抗体、甲基结合域蛋白质和限制酶。
18.根据权利要求16所述的试剂盒,其进一步包含识别单链寡核苷酸分子,所述分子能够捕获所述靶寡核苷酸分子的单链以根据碱基互补性形成双螺旋。
19.根据权利要求18所述的试剂盒,其中所述识别单链寡核苷酸分子能够与所述靶寡核苷酸分子的单链形成包含凸出部分的双螺旋,且所述甲基化胞嘧啶核苷酸安置于所述凸出部分中。
20.根据权利要求19所述的试剂盒,其中所述识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面或所述识别单链寡核苷酸分子与所述固体表面间隔开一定距离。
21.根据权利要求20所述的试剂盒,其中所述固体表面为场效应晶体管的晶体管表面或表面等离子体共振的金属表面。
22.根据权利要求20所述的试剂盒,其中所述固体表面的材料为多晶硅或单晶硅。
23.根据权利要求16所述的试剂盒,其中所述电性变化检测元件为场效应晶体管或表面等离子体共振。
24.根据权利要求17所述的试剂盒,其中所述识别单链DNA分子为包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸的部分中性单链寡核苷酸。
25.根据权利要求24所述的试剂盒,其中所述电中性核苷酸包含经C1-C6烷基取代的磷酸酯基。
26.根据权利要求24所述的试剂盒,其中所述带负电核苷酸包含未经取代的磷酸酯基。
27.根据权利要求24所述的试剂盒,其中所述识别单链寡核苷酸分子附接到固体表面,且所述部分中性单链寡核苷酸包含附接到所述固体表面的第一部分;所述第一部分的长度为所述部分中性单链寡核苷酸的总长度的约50%;且所述第一部分包含至少一个电中性核苷酸和至少一个带负电核苷酸。
28.根据权利要求16所述的试剂盒,其进一步包含具有无甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列的参考单链寡核苷酸分子。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562192987P | 2015-07-15 | 2015-07-15 | |
US62/192,987 | 2015-07-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106350569A true CN106350569A (zh) | 2017-01-25 |
Family
ID=56413587
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610557520.1A Pending CN106350569A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | Dna甲基化检测 |
CN201610557276.9A Pending CN106353504A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | 包含信号放大器的检测 |
CN201610557569.7A Pending CN106350516A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | 部分中性单链寡核苷酸 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610557276.9A Pending CN106353504A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | 包含信号放大器的检测 |
CN201610557569.7A Pending CN106350516A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | 部分中性单链寡核苷酸 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20170015699A1 (zh) |
EP (3) | EP3118332B1 (zh) |
JP (3) | JP2017074035A (zh) |
KR (3) | KR20170009787A (zh) |
CN (3) | CN106350569A (zh) |
TW (3) | TWI684597B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10372659B2 (en) * | 2016-07-26 | 2019-08-06 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Multi-mode NMVE over fabrics devices |
RU2698134C2 (ru) | 2017-12-04 | 2019-08-22 | Общество с ограниченной ответственностью "Биолабмикс" | Способ амплификации нуклеиновых кислот с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов |
CN108957007B (zh) * | 2018-07-24 | 2021-08-17 | 无锡市人民医院 | 一种联合透析装置和硅纳米线场效应管的生物传感器 |
CN110865113B (zh) * | 2019-11-19 | 2024-03-26 | 复旦大学 | 一种基于dna纳米机器修饰场效应晶体管传感器界面的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6087112A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
US20070231790A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-04 | Intel Corporation | Photo-activated field effect transistor for bioanalyte detection |
US20090068649A1 (en) * | 2007-02-26 | 2009-03-12 | Maki Wusi Chen | Methods of DNA Methylation Detection |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5830655A (en) * | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
DE19634873A1 (de) * | 1996-08-29 | 1998-03-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung |
US6046004A (en) * | 1997-02-27 | 2000-04-04 | Lorne Park Research, Inc. | Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones |
US6080544A (en) * | 1998-02-13 | 2000-06-27 | Ohio State University | Methods for identifying nucleic acid mutations using mismatch modification |
US6777188B2 (en) * | 1998-10-01 | 2004-08-17 | Variagenics, Inc. | Genotyping by mass spectrometric analysis of allelic fragments |
JP4688294B2 (ja) * | 1998-12-30 | 2011-05-25 | オリゴス・イーティーシー・インコーポレイテッド | 酸安定性骨格で修飾された末端がブロックされた核酸及びその治療的使用 |
EP1423687A1 (en) * | 2001-08-08 | 2004-06-02 | The Arizona Board of Regents | Nucleic acid field effect transistor |
FR2829580B1 (fr) * | 2001-09-07 | 2004-02-13 | Bio Merieux | Procede de lecture, de detection ou de quantification, hybrides ou complexes utilises dans ce procede et biopuce mettant en oeuvre ledit procede |
CN1584592A (zh) * | 2003-08-22 | 2005-02-23 | 中国科学院上海原子核研究所 | 免疫微阵列蛋白质芯片 |
US20050136550A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Flow control of electrochemical-based assay devices |
JP2007279028A (ja) * | 2006-03-13 | 2007-10-25 | Mitsubishi Chemicals Corp | 孔を有する生体物質構造体及びその製造方法、並びに、それを用いた生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及びセンサーチップ |
EP2069773A2 (en) * | 2006-09-22 | 2009-06-17 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Semiconductor sensor device, diagnostic instrument comprising such a device and method of manufacturing such a device |
EP2164988B1 (en) * | 2006-10-06 | 2016-02-17 | Sirigen Inc. | Fluorescent methods and materials for directed biomarker signal amplification |
JP5211790B2 (ja) * | 2007-03-26 | 2013-06-12 | 住友化学株式会社 | Dnaメチル化測定方法 |
US20090036660A1 (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Joel Myerson | Methods and compositions for generating mixtures of nucleic acid molecules |
US20100260745A1 (en) * | 2007-10-01 | 2010-10-14 | University Of Southern California | Methods of using and constructing nanosensor platforms |
US20100053624A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Kyung-Hwa Yoo | Biosensor |
US20100112719A1 (en) * | 2008-11-06 | 2010-05-06 | Amihood Doron | Electronic signal amplification in field effect device based chemical sensors |
GB201004147D0 (en) * | 2010-03-12 | 2010-04-28 | Dna Electronics Ltd | Method and apparatus for sensing methylation |
US9482615B2 (en) * | 2010-03-15 | 2016-11-01 | Industrial Technology Research Institute | Single-molecule detection system and methods |
US8785132B2 (en) * | 2010-04-23 | 2014-07-22 | Postech Academy-Industry Foundation | Aptamer sandwich assays |
WO2012022482A1 (en) * | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Eth Zurich | Microwell arrays for direct quantification of analytes on a flat sample |
US9481905B2 (en) | 2013-02-19 | 2016-11-01 | Orizhan Bioscience Limited | Method of using neutrilized DNA (N-DNA) as surface probe for high throughput detection platform |
JP6095058B2 (ja) * | 2013-03-14 | 2017-03-15 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | メチルシトシン検出法 |
-
2016
- 2016-07-14 US US15/210,529 patent/US20170015699A1/en not_active Abandoned
- 2016-07-14 US US15/210,515 patent/US20170016051A1/en not_active Abandoned
- 2016-07-14 US US15/210,513 patent/US20170016894A1/en not_active Abandoned
- 2016-07-15 TW TW105122486A patent/TWI684597B/zh active
- 2016-07-15 KR KR1020160090050A patent/KR20170009787A/ko unknown
- 2016-07-15 EP EP16179737.8A patent/EP3118332B1/en active Active
- 2016-07-15 CN CN201610557520.1A patent/CN106350569A/zh active Pending
- 2016-07-15 KR KR1020160090051A patent/KR20170009788A/ko unknown
- 2016-07-15 TW TW105122465A patent/TWI736543B/zh active
- 2016-07-15 CN CN201610557276.9A patent/CN106353504A/zh active Pending
- 2016-07-15 EP EP16179730.3A patent/EP3118330B1/en active Active
- 2016-07-15 EP EP16179734.5A patent/EP3118331A1/en not_active Withdrawn
- 2016-07-15 TW TW105122489A patent/TW201713678A/zh unknown
- 2016-07-15 KR KR1020160090049A patent/KR20170009786A/ko unknown
- 2016-07-15 CN CN201610557569.7A patent/CN106350516A/zh active Pending
- 2016-07-15 JP JP2016140488A patent/JP2017074035A/ja active Pending
- 2016-07-15 JP JP2016140489A patent/JP6998574B2/ja active Active
- 2016-07-15 JP JP2016140487A patent/JP2017060461A/ja active Pending
-
2019
- 2019-04-05 US US16/376,498 patent/US20190233464A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6087112A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
US20070231790A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-04 | Intel Corporation | Photo-activated field effect transistor for bioanalyte detection |
US20090068649A1 (en) * | 2007-02-26 | 2009-03-12 | Maki Wusi Chen | Methods of DNA Methylation Detection |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
RYOJI KURITA等: "DNA Methylation Analysis Triggered by Bulge Specific Immuno-Recognition", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
WUSI C. MAKI等: "Nanowire-transistor based ultra-sensitive DNA methylation detection", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 * |
杨瑾: "《环境肿瘤和表观遗传学》", 31 May 2014, 军事医学科学出版社 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TW201721146A (zh) | 2017-06-16 |
JP2017074035A (ja) | 2017-04-20 |
JP6998574B2 (ja) | 2022-02-04 |
US20170015699A1 (en) | 2017-01-19 |
KR20170009788A (ko) | 2017-01-25 |
CN106353504A (zh) | 2017-01-25 |
CN106350516A (zh) | 2017-01-25 |
KR20170009787A (ko) | 2017-01-25 |
TW201713677A (zh) | 2017-04-16 |
EP3118330A1 (en) | 2017-01-18 |
EP3118330B1 (en) | 2019-09-11 |
EP3118332B1 (en) | 2018-06-06 |
US20170016051A1 (en) | 2017-01-19 |
JP2017046684A (ja) | 2017-03-09 |
TWI684597B (zh) | 2020-02-11 |
EP3118331A1 (en) | 2017-01-18 |
EP3118332A1 (en) | 2017-01-18 |
KR20170009786A (ko) | 2017-01-25 |
JP2017060461A (ja) | 2017-03-30 |
TWI736543B (zh) | 2021-08-21 |
TW201713678A (zh) | 2017-04-16 |
US20190233464A1 (en) | 2019-08-01 |
US20170016894A1 (en) | 2017-01-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10870881B2 (en) | Biomolecular processing platform and uses thereof | |
Paleček et al. | Magnetic beads as versatile tools for electrochemical DNA and protein biosensing | |
CN104703700B (zh) | 用于核酸测序的方法和试剂盒 | |
Timp et al. | Nanopore sequencing: electrical measurements of the code of life | |
CN104379761B (zh) | 纳米孔的制备方法和其用途 | |
CN106350569A (zh) | Dna甲基化检测 | |
Adampourezare et al. | Application of lateral flow and microfluidic bio-assay and biosensing towards identification of DNA-methylation and cancer detection: recent progress and challenges in biomedicine | |
KR101569249B1 (ko) | 앱타머를 이용한 광학 기반 그래핀 바이오센서, 그의 제조방법 및 그를 이용한 타겟 물질의 검출 방법 | |
Wang et al. | Biomedical diagnosis perspective of epigenetic detections using alpha-hemolysin nanopore | |
US20210268503A1 (en) | Nanofluidic analytical devices and methods of using thereof | |
CN108118084A (zh) | 用于定量图谱分析核酸的方法 | |
Pourbeyram et al. | Electrochemical monitoring of the interaction of UO22+ with immobilized DNA | |
Irving | Sterically controlled nuclease enhanced DNA assembly in rapid sepsis diagnostics |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170821 Address after: Taiwan County, Hsinchu city China Chupei Applicant after: Han Yuan, biological medicine, Limited by Share Ltd Address before: Taipei City, Taiwan, China Applicant before: Huiyuan biotech Co. Ltd. |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170125 |