TWI451075B - 單分子偵測裝置 - Google Patents

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TWI451075B TW100120305A TW100120305A TWI451075B TW I451075 B TWI451075 B TW I451075B TW 100120305 A TW100120305 A TW 100120305A TW 100120305 A TW100120305 A TW 100120305A TW I451075 B TWI451075 B TW I451075B
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Yu Tang Li
Chih Tsung Shih
Ming Chia Li
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Shuang Chao Chung
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Ying Chih Pu
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Description

單分子偵測裝置
本發明關於一偵測裝置，以及利用此偵測裝置來偵測一目標物的方法。此外，本發明尚關於一偵測裝置，其可偵測自一目標物，例如一單分子目標物，發射出之低強度的光。
人類基因體計畫(Human Genome Project,HGP)刺激了DNA定序通量上的快速增加。這種增加，隨著技術的改進，使得定序的成本相對應的下跌。對比於第一組基因體定序費時13年並花費將近三十億美金，目前的基因體定序成本已經明顯降低-實際上最近已經又完成兩組個人基因體定序(McGuire et al.,Science 317:1687(2007))。對於病患及健康照護提供者來說，個人的基因體代表一醫學治療上之方法的典範轉移(paradigm shift)。藉由管理疾病的遺傳危險因子(genetic risk factors)，健康照護提供者可更容易地實踐預防醫學，並且提供病患客製化的醫療照護。利用已建立完成的基因體資料庫，藥物設計以及給藥可更有效率，因此加速了藥物基因體學(pharmacogenomics)之新生領域的發展。
大部分傳統的化學或生物化學分析係根據”集體(bulk)”檢測。在上述檢測中，檢測在樣本溶液之特定體積中的複數個分子的集體行為(collective behavior)，以決定分子的特性。最近幾年，單分子的偵測已經變得可行。單分子偵測提供遠高於傳統上集體檢測的靈敏度，以及提供更詳細的資訊，很快地變成一種新趨勢。Moerner,W.E.與Fromm,D.P在單一分子偵測的方法的回顧評論，”單分子螢光光譜及顯微鏡使用的方法(REVIEW ARTICLE: Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy)”，Review of Scientific Instruments 74(8): 3597-3619(2003)，以及Walter,N.G.等人”自己動手指南：如何使用現代單分子工具組(Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit)”，Nature Methods 5:475-489(2008)中描述討論已經用於或計畫用於單分子偵測的方法與設備的可行性。
美國專利號U.S. Patent No. 7,170,050提供一用於單分子偵測之零階模式導波器(zero-mode waveguide,ZMW)，上述零階模式導波器由一金屬薄膜以及複數個形成於其中的孔洞所組成，上述金屬薄膜以及複數個孔洞構成ZWM的核心區域。當入射光線的波長比在ZMW核心區域中之傳導光線的截止波長(cutoff wavelength)長時，入射光線將會被禁止在ZMW中傳播。因此當具有比在ZMW核心區域中之截止波長更長之波長的光線入射到ZMW的入口時，光線將不會沿著ZMW的方向傳播。相反地，光線的強度將會沿著ZMW方向以指數方式衰退，在ZMW的入口形成一消逝波(evanescent)的光場。因此在消逝波區域內提供一特殊的激發區，在此激發區中分子被可以被激發，並且發射出的光線可以被共軛焦顯微鏡(confocal microscope)所捕捉。然而，ZWM可被偵測的數量受限於共軛焦顯微鏡(confocal microscope)的數值孔徑(numerical aperture，N/A)，並且相對地限制可被觀察分析的樣品數量。美國專利號U.S. Patent No. 7,486,865提供了一種隱藏式(recessed)的ZWM，其中藉由將ZWM延伸進入底層基板(underlying substrate)中以形成上述隱藏式(recessed)的ZWM。這樣的結構配置增加了可被觀測區域的體積(observation volume)以及相對更強之光學訊號(signal level)。然而，上述結構配置仍然有規模放大(scale-up)的問題以及可被觀察分析的樣品數量受限的問題。
因此，業界亟需一種偵測目標物的裝置，尤其是該目標物，例如一單分子目標物，能發射出低強度之光。
本發明提供一種偵測裝置可以用來偵測會發光的物體，包括：(a)一導波器；該導波器包括：一核心層；以及一第一被覆層；其中至少一奈米井形成於至少該第一被覆層中；以及(b)至少一光偵測器，該光偵測裝置可以用來偵測從至少一奈米井中的單一分子所發射出的光。
本發明另提供一種單分子的偵測方法，包括：藉由一光源發射一入射光；藉由一耦合器將該入射光耦合進入一導波器中，以在該導波器中形成一激發光；藉由該激發光及形成於至少一該導波器之被覆層中的至少一奈米井，形成一有效激發區；以及藉由該激發光激發一在有效激發區中的單分子目標物，使該單分子目標物發射出一光線可以被一光偵測器所偵測。
本發明尚提供一種核酸的定序方法，包括下列步驟：提供一偵測裝置，包括：一導波器，該導波器包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一奈米井至少形成於該第一被覆層中；以及至少一光偵測器；提供至少一核酸分子；將該至少一核酸分子個別地定位(localizing)於至少一奈米井中；進行該至少一核酸分子的單分子合成定序，其中該單分子核酸的合成定序導致光線的發射，該發射的光線與至少一該核酸中的鹼基之特性有關；利用該偵測器偵測該發射光，產生一輸出訊號；以及處理該輸出訊號以決定至少一該核酸所包含的鹼基之特性。
為讓本發明所述之目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如後。可藉由在申請專利範圍中所特別指出的要素和組合來瞭解及得到本發明所述之目的、特徵、和優點。
應可瞭解，本發明說明書之描述與圖式亦僅僅作為說明之用而非用來限定本發明。本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
本說明書中所附圖式係用來配合本發明之說明，並成為本發明之說明的一部分，與說明書中所述內容共同描述本發明之多個實施例，用來解釋其原理。
本發明接下來將會提供許多不同的實施例以實施本發明中不同的特徵。各特定實施例中的組成及配置將會在以下作描述以簡化本發明。這些為實施例並非用於限定本發明。此外，一第一元件形成於一第二元件“上方”、“之上”、“下方”或“之下”可包含實施例中的第一元件與第二元件直接接觸，或也可包含第一元件與第二元件之間更有其他額外元件使第一元件與第二元件無直接接觸。各種元件可能以任意不同比例顯示以使圖示清晰簡潔。此外，在本發明各種不同的範例中，為了簡化與清晰的目的，將重複地使用元件符號及字母，然而其本身並不決定各種實施例及/或結構配置之間的關係。
傳統上用於集體檢測(bulk assay)的裝置，其包括小型化的集體檢測(miniaturized bulk assay)，以及用於單分子偵測的裝置可共用許多基本元件並且可具有相似的裝置結構。然而，要實現單分子偵測，系統必須至少滿足下列兩個條件：1)應兼具有一限制的激發空間(confined excitation space)以及一限制的觀測空間(confined observation space)，以及2)上述兩空間應完全或部分重疊，且該重疊的面積應該夠小到足以確保自目標單分子發射出來的光線高於背景值，以提供產生可檢測出來的信號雜訊比(signal-to-noise ratio,SNR)。例如，重疊面積的體積通常必須接近或小於10的-15次方公升(femtoliter)。尤其是，重疊面積的體積通常必須在10的-18次方公升(attoliter)至10的-21次方公升(zeptoliter)的範圍之間。此外，防止激發光到達偵測器也是很重要的條件。
本發明實施例包括一偵測裝置及使用此偵測裝置來偵測一如單分子目標物的目標物的方法。上述偵測裝置可以偵測自目標物發射出來的微弱光線。
下文中，將配合圖式詳細地描述實施例。在整個圖式中任何可能的地方，相似之元件係使用相同之元件符號。
1.　本發明的偵測裝置
此處所描述的偵測裝置可偵測一目標物，如一單分子目標物。上述目標物可為一冷光源(source of luminescence)，例如一螢光染料分子(fluorescent dye molecule)、一磷光染料分子(phosphorescent dye molecule)、一量子點(quantum dot)、或一發光的奈米粒子(light-emitting nanoparticle)。上述目標物亦可為一光散射(light-scattering)粒子。此外，上述目標物可為一沒有發光能力的目標分子(target molecule)，但其可黏附至一標籤對象(labeling object)。因此，可藉由標籤對象來辨識目標分子。不只一個標籤對象可黏附至一目標分子。
1.1　偵測裝置概述
本發明的偵測裝置可包括至少一光源，其可發射出光線，上述光線可至少部分耦合進入導波器中，以作為一激發光來激發目標物。光源可為，例如：如氦氖雷射(He-Ne laser)等的雷射，以及雷射二極體(laser diode,LD)、發光二極體(light emitting diode,LED)、有機發光二極體(organic light emitting diode,OLED)、量子點發光二極體(quantum dot light emitting diode,QLED)、光纖光源(fiber light)、或弧光放電螢光燈(arc discharge fluorescent lamp)。
本發明的裝置可包括一導波器。上述導波器可為管道波導(channel waveguide)或平面波導(planar waveguide)。導波器可包括一核心層以及至少一被覆層。例如，如果導波器為管道波導，其可包括一核心層以及一圍繞著核心層的被覆層。另舉一個範例，若導波器為平面波導，其可包括一核心層以及一配置在核心層上的被覆層，或核心層夾在兩個被覆層中間。核心層可具有比至少一被覆層更高的折射率。激發光可在導波器的核心層中傳播。
依據本發明的實施例，至少一奈米井可形成於至少一被覆層中。上述奈米井可包含一上部開口及一底面，其中的上部開口可比底面大。上述奈米井可延伸穿過上述至少一被覆層的部份厚度、上述至少一被覆層全部厚度、上述至少一被覆層的全部後度與上述核心層的部分厚度、上述至少一被覆層的全部後度與上述核心層全部厚度。上述有效的激發區之下部邊界可形成於奈米井的底部附近。上述有效的激發區之下部邊界可為奈米井的底部。在奈米井中，可由垂直於核心層的縱向方向(亦即在下文中所述之垂直方向)之激發光所能夠到達的距離，來定義有效的激發區之上部邊界(下文中，垂直方向)。
本發明的偵測裝置可包括複數個奈米井。因此，上述裝置亦可用於監測大量的目標物。
本發明的偵測裝置可包括一偵測自目標物發射出來之光線的光偵測器。根據本發明，上述光偵測器可包括一光學感測器(optical sensor)，其能夠至少吸收部份位於其上的入射光線，並產生對應此光線強度的輸出訊號。上述光學感測器可為例如一p-i-n光電二極體、一多接面光電二極體(multi-junction)、雪崩光電二極體(avalanche photodiode,APD)、一光電晶體(phototransistor)、一量子井紅外線光探測器(quantum-well infrared photodetector，QWIP)、光電導型光學感測器(photoconductive type optical sensor)、光電伏打型光學感測器(photovoltaic type optical sensor)、一在特殊應用集成電路(Application Specific Integrated Circuit,ASIC)上的薄膜(thin-film on ASIC,TFA)、一金屬-半導體-金屬(metal-semiconductor-metal,MSM)光探測器、電荷耦合裝置(charge coupled device,CCD)、一互補式金氧半導體(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor,CMOS)、或一上述之結合。
根據本發明，上述光偵測器可包括一控制光偵測器的運作之控制電路。上述控制電路可包括一訊號放大器(signal amplifier)的電路、類比/數位信號轉換器(A/D convertor)、積分器(integrator)、比較器(comparator)、邏輯電路(logic circuit)、讀出電路(readout circuit)、記憶體、微處理器(microprocessor)、時鐘、及/或位址(address)。
根據本發明，上述光偵測器可配置於自目標物發射出來的光可到達的地方。例如，光偵測器可配置於核心層之相對於奈米井的對側。也就是說，若奈米井以垂直方向配置於核心層的一側上，光偵測器則以垂直方向配置於核心層的另一側上。
本發明的偵測裝置可包括一光耦合器。上述光耦合器可將至少部分自至少一光源發射出的光線耦合進入導波器中。上述光耦合器可為，例如，一稜鏡耦合器(prism coupler)、一光柵耦合器(grating coupler)、一側向注入耦合器(side-injection coupler)、一垂直注入耦合器(vertical-injection coupler)、或一同向耦合器(co-directional coupler)。
1.2範例偵測裝置
參見第1圖，說明依據本發明之偵測裝置100的示意圖。在一些實施例中，偵測裝置100可包括一光源102、一光耦合器104、一光偵測器106、以及一平面導波器110。平面導波器110可形成於一基板上(未顯示)。光偵測器106可形成於上述基板上或基板內。
光源102可發射一光線，藉由光耦合器104，可將光線至少部分耦合進入平面導波器110。耦合進入平面導波器110的光線可沿著平面導波器110的核心層傳播，並作為激發光。
1.2.1導波器
如第1圖中所示，在一些實施例中，平面導波器110可包括一核心層112、一上部被覆層114、以及一下部被覆層116。核心層112可包括一具有反射率n2 的材料，例如：矽鈦氧化物(silicon-titanium oxide,Six Ti1-x O2 ，其中0<x<1)、氧化鈦(titanium oxide)、氧化鉭(tantalum oxide)、氧化鈮(niobium oxide)、氧化鉿(hafnium oxide)、氧化鋁(aluminum oxide)、氧化鋯(zirconium oxide)、氮化矽(silicon nitride)、氮化鋁(silicon nitride)、氮化鈦(titanium nitride)、聚碳酸酯(polycarbonate,PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)、或光阻劑(如：Su8)。上部及下部的被覆層114和116可包括分別具有折射率n3 及n4 的材料。上部及下部的被覆層114和116的材料可相同或相異。適用於上部及下部的被覆層114和116的材料可包括，例如：氧化矽(silicon oxide)、氟化鎂(magnesium fluoride)、氟化鈣(calcium fluoride)、氧化鋁、光阻劑(如：Su8)、PMMA、或聚碳酸酯。核心層112的折射率n2 可大於上部及下部的被覆層114和116之折射率n3 及n4 。
如上所述，以單分子偵測而言，需要避免激發光到達偵測器。在平面導波器中，核心層的表面可能不如預期中的平滑。核心層粗糙的表面可散射一部分的激發光。據估計，當核心層的表面粗糙度約0.3 nm，約0.01%的激發光會被散射並產生雜訊。為了降低來自在核心層中傳播的激發光之表面散射的雜訊，核心層的表面粗糙度應小於約0.3 nm。
1.2.2奈米井
在一些實施例中，至少一奈米井120可形成於至少上述之上部被覆層114中。上述奈米井120的上部開口可比奈米井120的底部大。奈米井120的形狀沒有一定。例如，奈米井120的橫截面可為圓形、橢圓形、矩形、正方形、三角形或菱形。如第2圖中所示，奈米井120之底部的尺寸大小亦未受到限制。例如，奈米井120的底部尺寸大小可約小於激發光的波長。在一些實施例中，奈米井120的底部尺寸大小可小於約激發光波長的二分之一、四分之一、或八分之一。此處所述之”尺寸大小”係指直徑、長軸的長度、或長邊的長度。若奈米井120的橫截面為正方形或菱形，”尺寸大小”可表示邊長。在一實施例中，奈米井120之上部開口的長度(亦即所謂的直徑、長軸的長度、或長邊的長度)可為約1μm至約10μm，以及奈米井120的底部的直徑可為約10nm至約500nm，奈米井120的側壁與垂直奈米井的底部的方向之間所形成的夾角約小於60度。上述這樣的結構可確保一個單分子能夠進入奈米井120的底部附近之區域並且被偵測。
根據本發明，部分的激發光可進入奈米井120，且可隨著奈米井120的空間限制，形成一有效的激發區130。有效的激發區130可形成於奈米井120的底部附近。當一目標物進入上述有效的激發區130，其可被激發光所激發，並且發射出光線可以被光偵測器106所偵測。在有效的激發區130之外，目標物可能無法被激發光所激發，或其發射出來的光線無法到達光偵測器。可以了解的是，在圖中的虛線係為概略之有效激發區130的上部邊界，而非用來限制有效的激發區130之上部邊界的形狀。例如，有效的激發區之上部邊界可為彎曲的形狀。
依據不同的情況，例如在導波器中延伸之奈米井的位置及/或奈米井的深度，可形成不同之有效的激發區。此外，在有效的激發區中的電磁場可為，例如，一消逝波場(evanescent field)、一消逝波場與傳輸波場(travelling fields)的混合、或一傳輸波場，其詳細描述如下。
第3圖的示意圖顯示，不同奈米井設計之依據本發明的實施例，以作為範例。在一些實施例中，奈米井121可延伸穿過上部被覆層的部分厚度。在一些實施例中，奈米井122可延伸穿過上部被覆層的全部厚度。對奈米井121及122而言，當激發光在核心層中傳播時，雖然在奈米井121及122中可能沒有傳輸波光線(travelling light)，部分在核心層中的傳輸波光線可稍微滲透進入奈米井121及122中。上述滲透進入奈米井121及122中的光線，可能在垂直方向上以指數衰減，並形成一消逝波場。此消逝波場在奈米井121及122的空間限制下，可形成一有效的激發區131或132。
在一些實施例中，奈米井123可延伸穿過上部被覆層的全部厚度，以及核心層的部分厚度。對奈米井123而言，除了一消逝波場(evanescent field)外，另一傳輸波場組成(travelling field component)亦可同時出現於奈米井中，並且形成一有效的激發區133。
在一些實施例中，奈米井124可延伸穿過上部被覆層的全部厚度以及核心層的全部厚度。對奈米井124而言，大多數在奈米井中的電磁場可為一傳輸波場(travelling field)，並且形成一有效激發區134。
對一包括奈米井122的平面導波器而言，由於奈米井的底端位於核心層的上表面上，有效的激發區132之容量可與衰減場的有效激發區相等，且可利用下列方程式概略計算：
V=πx(D/2)2 x h
其中D為奈米井底部的直徑，而h為在奈米井中衰減場滲透的深度。例如，若D及h分別為100nm及100nm，有效的激發區之計算出來的容量大概為1 x 10-18 公升(1 attoliter)。
在一些實施例中，奈米井120的表面以及上部被覆層114的表面(以及隨後所述的上保護層表面；如果該上保護層是位於上被覆層上面)可具有不同的表面性質。上述表面性質可包括：例如疏水性官能基團、官能基團密度、材料密度、或導電性。
在一些實施例中，奈米井120的側壁面可為親水性，其包括一部分選自矽(silicon)、二氧化矽(silica)、金屬、或金屬氧化物，且奈米井120的底面可為疏水性。然而，若奈米井120的底面是由具有親水性質的材料所製作，則可將其改質成疏水性。例如，若奈米井120的底面是由親水性的矽酸鹽(silicate)或金屬所製作，則可將其改質為疏水性的用途，例如R1x -Si(O-R2)4-x (其中R1為疏水性基團，例如烷鏈－(CH2 )n -CH3 ，以及R2為Cn H2n+1 ，其中x及n為整數，且1x3)，或用途，例如，具有官能基團的聚合物，係選自：－COOH、－PO3 H2 、－SH、或-NH2 。在另一實施例中，若奈米井120的底面是由親水性的金屬氧化物所製作，則可將其改質為疏水性的用途，例如R1x -Si(O-R2)4-x (其中R1為疏水性基團，例如烷鏈-(CH2 )n -CH3 ，以及R2為Cn H2n+1 ，其中x及n為整數，且1x3)，或使用，例如選自：-COOH、-PO3 H2 、-SH、或-NH2 之具有官能基團的聚合物。藉由使奈米井120的底面為疏水性，但維持奈米井120的側壁表面為親水性，可將待測目標物留在鄰近奈米井120之底面的有效激發區內，而不會黏附至奈米井120的側壁表面。因此，上述目標物可有效的被進入有效激發區的激發光所激發。
在一些實施例中，複數個奈米井可形成於導波器中。在一些實施例中，對各個複數個奈米井而言，可形成光偵測器，來偵測在奈米井之有效的激發區中，自一目標物發射出來的光線。在一些實施例中，一個光偵測器可用於偵測在複數個奈米井之有效的激發區中，自目標物發射出來的光線。
1.2.3　保護層
在一些實施例中，保護層可形成於偵測裝置中，用來吸收散射的激發光及/或阻擋來自偵測裝置外的環境光線(ambient light)，以便增加信號雜訊比(signal-to-noise,S/N)。參閱第4圖，在一些實施例中，一上部保護層142及一下部保護層144可分別形成於上部被覆層114之上及下部被覆層116之下。也就是說，上部保護層142可形成於與導波器的同一側上，如同奈米井120，以及下部保護層144可形成於導波器的對側上並且配置於下部被覆層116與光偵測器106之間。在一些實施例中，偵測裝置可具有形成於其中的上部保護層142。在一些實施例中，偵測裝置可具有形成於其中的下部保護層144。在一些實施例中，偵測裝置可兼具形成於其中的上部及下部保護層142及144兩者。
在一些實施例中，上部及下部保護層142及144可由不透明的材料所製作，例如金屬或合金。上部及下部保護層142及144可由相同的材料所製作，或由不同的材料所製作。適合上部及下部保護層142及144的材料包括：例如，Al、Ti、Ni、Cr、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、或任兩個或更多個上述材料的合金。
在一些實施例中，一針孔150可形成於下部保護層144中，此針孔位於奈米井120的下方。自有效的激發區130中的目標物發射出的光線，可穿過上述針孔，並且被光偵射器106偵測。
在一些實施例中，如第5圖中所示，一作為一光柵(grating)之奈米結構化的金屬圖案152可被配置於下部保護層144中而非針孔中。藉由適當地設計上述金屬圖案152的間距(pitch)及深度，大部分自目標物發射出的光線可穿透過金屬圖案152，但是可將源於激發光的雜訊最小化。
自目標物發射出的光線可為一橫向磁波(transverse magnetic，TM)模態的光線，以及激發光可為一橫向電波(transverse electric，TE)模態的光線。橫向電波(transverse electric，TE)以及橫向磁波(transverse magnetic，TM)的光線穿過金屬光柵(metal grating)的透光性(transmittances)，取決於金屬圖案152的間距(光柵週期，grating period)及深度。上述透光性亦可取決於金屬及金屬周圍材料之間的折射率差(refractive difference)。此外，上述透光性亦可取決於在金屬光柵上的光線入射的角度。因此，可更進一步地改善信號雜訊比(signal-to-noise,S/N)。
1.2.4　光耦合器
再參閱第1圖，一光耦合器104可被配置於導波器附近或形成於導波器上或導波器中。光耦合器104可將至少部分來自光源102的入射光耦合進入導波器110。
在一些實施例中，一稜鏡耦合器可用來作為光耦合器104。如第6圖中所示，上述稜鏡耦合器可包括一稜鏡202以及一準直透鏡(collimating lens)204。藉由準直透鏡(collimating lens)204，自光源102所發射出的入射光可聚焦於導波器110的相同位置上。如第6圖中所示，藉由稜鏡耦合器，部分的入射光可耦合進入導波器110，並且在核心層112中傳播，作為激發光。根據光源的位置及/或相對於準直透鏡(collimating lens)204之入射光的入射角度，具有不同模態的光線可被耦合進入導波器110，並且在核心層112中傳播，例如在第6圖中的虛線所示。因此，可調整或選擇在導波器中傳播之激發光的模態。在一些實施例中，準直透鏡(collimating lens)204可經過特殊設計以便將一點光源(point light source)擴展成為線光源(linear light source)，線光源可提供一橫向擴展(laterally-expanded)的激發光，以橫向方向覆蓋較大的區域，亦即，導波器110之垂直於第6圖中所示之橫截面的方向。
在一些實施例中，如第7圖中所示，一側邊耦合器(side coupler)302可用來作為光耦合器104。側邊耦合器302可為一光學透鏡模組。藉由側邊耦合器302可將入射光聚焦於導波器110上並且耦合進入導波器110中，以及在導波器110的核心層112中傳播，作為激發光。
在一些實施例中，一光柵耦合器可用來作為光耦合器104。一光柵耦合器為一具有規律圖案(regular pattern)的光學組件，其可將光線分離及繞射成為多個以不同方向傳播的光束。因此，部分的入射光可被引導進入導波器110並且在導波器110的核心層112中傳播。
在一些實施例中，如第8圖中所示，一光柵耦合器(grating coupler)可包括一第一光柵402，第一光柵402配置於上部被覆層114與核心層112之間的界面。由於自下部被覆層116的上部與下部表面反射之光線的干擾，這類光柵的耦合效率(coupling efficiency)可取決於下部被覆層116厚度。
如上所述，上述入射光可完全耦合進入核心層112中。部分的入射光可垂直地穿過導波器110並且被消耗掉。在一些實施例中，為了改善耦合效率，可將一反射器(未顯示)配置於導波器110之下。上述反射器可將穿過下部被覆層116的光線反射回到核心層112，使其被部分耦合進入核心層112中，以便增加耦合進入核心層112中之光線的總量。
在一些實施例中，上述光柵耦合器可更包括一第二光柵404，第二光柵404配置於核心層112與下部被覆層116之間的界面，如第9圖中所示。第二光柵404可配置於第一光柵402的正下方。在一些實施例中，藉由增加更多的光柵，可更進一步地增加耦合效率(coupling efficiency)。例如，若上述偵測裝置包括上部及下部保護層，光柵亦可配置於保護層與被覆層之間的界面，如第10圖中所示。
在一些實施例中，可移除部分的上部被覆層114以露出核心層112。一光柵，例如第11圖中所示之光柵406，可配置於核心層112之露出的部分上。
光柵的形狀可不限於第8至11圖中所示的情況。例如，為了增加耦合效率，在一些實施例中，可利用具有彎曲結構(curved structure)的光柵，例如閃燿光柵(blaze grating)或多層光柵(multi-level grating)，其中多層光柵藉由將閃燿(the blaze)劃分成多個階梯(steps)來模擬上述閃燿光柵。
在一些實施例中，利用一吸收發射光耦合器(absorbing-emitting light coupler)，光線亦可直接耦合進入導波器110中。第12圖中顯示一吸收發射光耦合器(absorbing-emitting light coupler)，上述吸收發射光耦合器可包括一發光層(photoluminescent layer)，其可吸收入射光並且發射出一具有較長波長的螢光光線。上述光源發射出的光線可入射至吸收發射光耦合器的上表面上，以及可自吸收發射光耦合器的側邊發射出上述螢光光線。部分的螢光光線可耦合進入導波器中，並且在導波器的核心層中傳播，作為激發光以激發目標物。上述功率耦合效率(power coupling efficiency)可由下列公式計算：
P(λ2 )/P0 (λ1 )=(1-T1 )(1+R1 T1 )xΦFL x T2 x ηc x T3
其中λ1 及λ2 分別為入射光與自吸收發射光耦合器的側邊發射出之光線的波長。P0 (λ1 )及P(λ2 )分別為上述入射光的功率以及耦合進入導波器110之核心層112的入射光的功率。R1 為在吸收發射光耦合器與下部被覆層116之間的界面的反射率。T1 為在移動一距離d1 之後，在吸附層(absorbent layer)中波長為λ1 之光線的透光率(transmittance)，T2 為在移動一距離d2 之後，在吸附層(absorbent layer)中波長為λ2 之光線的透光率(transmittance)。ΦFL 為光致發光材料(photoluminescence material)的光致發光量子效率(photoluminescence quantum yield)。ηc 為吸收發射光耦合器的耦合效率。T3 為自吸收發射光耦合器發射並穿過全長距離d3 之導波器的光線的透光率(transmittance)。
對一吸收發射光耦合器(absorbing-emitting light coupler)而言，由於側表面的面積遠小於上表面的面積，自吸收發射光耦合器發射出並且耦合進入核心層112之光線的功率強度，可遠高於入射至吸收發射光耦合器上的光線的功率強度。
可根據托斯克斯位移(Stokes shift)來選擇上述用於吸收發射光耦合器中的光致發光材料(photoluminescent material)。例如，上述光致發光材料具有大於或等於約30 nm的托斯克斯位移(Stokes shift)。在一些實施例中，上述光致發光材料(photoluminescent material)可為光致發光染劑(photoluminescent dye)，例如：蒽(anthracene)、香豆素(coumarin)、芘(pyrene)、二苯乙烯(stilbene)、紫質(porphyrin)、苝(perylene)、Alq3、曙紅(eosin)、Bodipy dye、螢光素(fluorescein)、若丹明(rhodamine)、聚次甲基染料(polymethine dye)、DCM、或上述之衍生物。在一些實施例中，上述光致發光材料可為光致發光聚合物，例如：PPV或其衍生物。在一些實施例中光致發光材料(photoluminescent material)可為無機材料，例如：量子點(quantum dot)、氧化鋁(alumina oxide)、或氧化鋅。
在一些實施例中，藉由結合光柵與吸收發射光耦合器，可增加耦合效率。上述結合的光耦合器可包括一光柵502以及一吸收發射光耦合器504。在一些實施例中，如第13圖中所示，上述結合的光耦合器可配置於核心層112之露出部分的表面上。在一些實施例中，如第14圖中所示，上述結合的光耦合器可配置於核心層112中。上述光柵可有助於增加入射光線在吸收發射材料中穿過的路徑長度，以便增加被吸收發射材料所吸收之光線的量，並增加光致發光效率(photoluminescence efficiency)。因此，更多的入射光可被轉換成激發光，並且可增加功率耦合效率。
1.2.5　偵測裝置之其他非必需的組件(Optional Components)
在一些實施例中，如第15圖中所示，一光學濾光器(optical filter)160可配置於保護層114與光偵測器106之間。在一些實施例中，光學濾光器160可配置於下部被覆層116與光偵測器106之間，而沒有下部保護層144。在一些實施例中，下部之保護層144本身可作為一光學濾光器。光學濾光器可讓在一特定波長範圍內的光線穿過，但至少部分擋住在上述特定波長範圍以外的光線。因此，藉由適當地選擇光學濾光器160，可讓自目標物發射出來的光線穿過，但卻減弱由激發光所造成的雜訊，以便改善信號雜訊比(S/N ratio)。
依據本發明的實施例，目標物可包含在填充於奈米井120中的樣本溶液中。在一些實施例中，可利用一微流體管道(microfluidic channel)(未顯示)將樣本溶液導入奈米井120中。上述微流體管道可被設計成一次讓一個目標物通過奈米井，以便實現類流氏細胞計數的偵測(flow-cytometry-like detection)。在一些實施例中，一封蓋(未顯示)可形成於導波器上方以留住樣本溶液及/或阻擋環境光線(ambient light)。
在一些上述圖式中，其示意圖顯示偵測裝置的結構，為了簡化的目的，一些組件並未顯示出來。例如，在第6圖中顯示的導波器110、奈米井120、以及包括稜鏡202與準直透鏡(collimating lens)204的稜鏡耦合器。偵測裝置的其他組件則未顯示。應可瞭解，在這些圖式中所示之偵測裝置亦可包括其他如此處所揭示的組件。例如，在第6圖中所示之偵測裝置亦可包括一光偵測器、一封蓋(cover)、保護層、及/或一光學濾光器。
2.本發明之偵測與應用的方法
在另一實施例中，本發明係關於利用此處所揭示的偵測裝置來偵測一目標物的方法，上述目標物例如單分子目標物。根據本發明，一包括目標物的樣本溶液可填充於形成於偵測裝置之導波器110中的奈米井112中。藉由一光耦合器，可將自一光源發射出的入射光部分耦合進入導波器110中，並且在導波器110的核心層112中傳播。上述耦合進入導波器110的光線可作為一激發光。當上述目標物進入有效激發區時，上述目標物可被激發光所激發，並且發射出一光線以被光偵測器所偵測。
上述偵測裝置，以及使用此偵測裝置的方法，可運用於，例如，核酸偵測、DNA定序、生物標記的辨識(biomarker identification)、或流式細胞計數。上述偵測裝置能夠偵測並處理低強度的光訊號，使得單分子偵測變得可能。
2.1用於偵測裝置的標記
在一些本說明書中所描述之方法的實施例中，將標記黏附至分析物(analyte(s))(亦即，代測物質)、或其他反應物)，或黏附至探子(probe(s))，例如引子、抗體、或其他能與待測物反應的反應物、或其他的反應物，例如核苷酸(包括核苷酸的相似物)。任何標記皆能用於單分子目標物或探子上，上述單分子目標物或探子對於得到訊息與目標物的量或存在的相關有幫助。
例如，可使用多種不同的螢光分子，包括小分子、螢光蛋白、以及量子點。有用的螢光分子(螢光團，fluorophore)包括但不限於：1,5 IAEDANS；1,8-ANS；4-Methylumbelliferone；5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein；5-Carboxyfluorescein(5-FAM)5-Carboxynapthofluorescein5-Carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA)；5-FAM(5-Carboxyfluorescein)；5-HAT(Hydroxy Tryptamine)；5-Hydroxy Tryptamine(HAT)；5-ROX(carboxy-X-rhodamine);5-TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine)；6-Carboxyrhodamine 6G;6-CR 6G;6-JOE;7-Amino-4-methylcoumarin；7-Aminoactinomycin D(7-AAD)；7-Hydroxy-4-methylcoumarin；9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine；ABQ；Acid Fuchsin；ACMA(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)；Acridine orange；Acridine Red；Acridine Yellow；Acriflavin；Acriflavin Feulgen SITSA；AFPs-AutoFluorescent Protein-(Quantum Biotechnologies)；Texas Red；Texas Red-X conjugate；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；Thiazine Red R；Thiazole Orange；Thioflavin 5；Thioflavin S；Thioflavin TCN；Thiolyte；Thiozole Orange；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；True Blue；TruRed；Ultralite；Uranine B；Uvitex SFC；WW 781；X-Rhodamine；XRITC；Xylene Orange；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；螯合染劑(interchelating dyes)例如：YOYO-3、Sybr Green、Thiazole orange；Alexa Fluor染劑系列的成員(來自Molecular Probes/Invitrogen)，其涵蓋了寬廣的光譜範圍以及符合一般激發光源的主要輸出波長，例如：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、以及750；Cy螢光染劑系列的成員(GE Healthcare)，其亦涵蓋了寬廣的光譜範圍，例如：Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；Oyster螢光染劑的成員(Denovo Biolabels)，例如：Oyster-500、550、-556、645、650、656；Y-Labels系列的成員(Dyomics)，例如，範圍介於418nm(DY-415)至844nm(DY-831)具有最大吸收質的範圍，例如DY-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL；ATTO螢光標記系列的成員(ATTO-TEC GmbH)，例如：ATTO 390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740；CAL Fluor染劑系列或Quasar染劑系列的家族(Biosearch Technologies)，例如：CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560、Quasar 570、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635、Quasar 670；量子點，例如：EviTags系列的量子點(Evident Technologies)或Qdot系列的量子點(Invitrogen)，例如：Qdot 525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705、Qdot 800；螢光素(fluorescein)；若單明(rhodamine)；及/或藻紅素(phycoerythrin)；或上述之結合。參閱，例如美國專利申請公開號No. 2008/0081769。
在一些實施例中，至少提供一生物發光(bioluminescent)或化學發光(chemiluminescent)系統，其可在一實體，例如一分析物、反應物、或反應產物，的存在下產生光線。例如，一生物發光(bioluminescent)或化學發光(chemiluminescent)系統，可用來偵測在定序中由合成反應所產生的焦磷酸鹽(pyrophosphate)(將於下文中更詳細地描述)；藉由光線產生反應(light-generating reaction)的催化作用，來偵測像是鐵或銅等金屬的存在；或量測與分析物接合之反應物的數量，其中上述反應物包括至少一生物或化學發光系統的成分。
所屬技術領域中已知的生物發光系統的例子包括：包括至少一螢光酵素(luciferase)的系統，例如，螢火蟲螢光酵素(firefly luciferases)，包括：Photinus pyralis 螢光酵素。一生物發光系統可用於偵測焦磷酸鹽(pyrophosphate)與合成反應(其中，dATP可被一例如dATPαS的相似物取代，以避免由於dATP被螢光酵素消耗所產生之非專一性的光線)之定序的成分，例如，藉由提供螢光酵素、三磷酸腺苷硫酸化脢(ATP sulfurylase)、螢光素(luciferin)、以及腺苷5’磷醯硫酸(adenosine 5’phosphosulfate)。當藉由一核苷酸的加入而產生焦磷酸鹽時，三磷酸腺苷硫酸化脢(ATP sulfurylase)會依據腺苷5’磷醯硫酸(adenosine 5’ phosphosulfate)產生ATP。藉由螢光酵素加上光線，ATP能促使螢光素(luciferin)轉變為氧化螢光素(oxyluciferin)。其他的生物發光系統包括：以發光蛋白(photoproteins)為基礎的系統，例如一水母發光蛋白(aequorin)，其將腔腸動物螢光素(coelenterazine)氧化成為會發射光線之激發的coelenteramide。
化學發光系統的例子包括：發光醇(luminol)加上過氧化氫(hydrogen peroxide)，其可在金屬催化劑(metal catalyst)及輔助氧化劑(auxiliary oxidant)的存在下經過一發光反應；草酸二苯酯(diphenyl oxalate)加上過氧化氫與適當的染劑，其可在產生二氧化碳之多步驟的反應中經過激發以及發光【適當之染劑的例子包括：苯基化蒽(phenylated anthracene)的衍生物，例如9,10-diphenylanthracene 9,10-Bis(phenylethynyl)anthracene、及1-Chloro-9,10-bis(phenylethynyl)anthracene；以及若丹明(rhodamines)，例如rhodamine 6G及rhodamine B】；單態氧產生系統(singlet oxygen-producing systems)，例如過氧化氫加上次氯酸鈉(sodium hypochlorite)；以及包括酵素的系統，例如山葵過氧化氫脢(horseradish peroxidase)，其作用於發光醇(luminol)或其他商業上可用之基質上。
在一些實施例中，上述方法包括形成共價連結(covalent attachments)，像是反應物或分析物與標記之間，或反應物(例如用於定序反應中的聚合脢)與表面(例如奈米井的表面)之間。在本技術領域中，已知多種形成共價連結的方法。能夠利用許多不同的化學改質以加速連結的形成。化學改質的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)基團、胺類(amines)、醛類(aldehydes)、環氧衍生物(epoxides)、羧基(carboxyl groups)、羥基(hydroxyl groups)、醯肼(hydrazides)、疏水性基團、薄膜(membranes)、馬來醯亞胺(maleimides)、生物素(biotin)、鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)、硫醇基(thiol groups)、鎳螯合物(nickel chelates)、光敏基團(photoreactive groups)、硼基團(boron groups)、硫酯類(thioesters)、半光胺酸(cysteines)、二硫化物基團(disulfide groups)、烷基與鹵化醯基(acyl halide groups)、麩胺基硫(glutathiones)、麥芽糖(maltoses)、疊氮化物(azides)、磷酸鹽(phosphates)、以及膦類(phosphines)。在一些實施例中，利用改質劑(例如親電性的改質劑或親核性的改質劑)的適當結合，使連結形成於兩個體之間，其中每一個體皆至少包括一改質劑。
在一些實施例中，藉由利用一存在於一上述個體上的化學改質劑，以及一其他個體之自然形成的部分(naturally-occurring moiety)，例如胺類或氫硫基(sulfhydryl)，使連結形成於兩個體之間。此反應的優點為其能夠快速反應且能夠避免有毒副產物的產生。這類的改質劑的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)、醛類(aldehydes)、環氧衍生物(epoxides)、以及硫代酯類(thio-esters)。大部分的蛋白質、胜肽、糖肽(glycopeptides)…等等，具有游離的胺基團，其能夠與這類的改質劑反應，來將這些改質劑共價連結至這些改質劑。亦可合成具有內部或末端之胺基團的核酸探針，且其具有商業利用價值(例如IDT或Operon公司)。因此，利用相似的化學反應，生物分子能夠結合(共價或非共價)至標記或其他的反應物。
許多其他的多功能的交聯劑(cross-linking agents)可用來將一種改質劑的化學活性轉換成另一種。這些基團可為雙官能基團、三官能基團、四官能基團…等等。這些基團亦可為同質功能(homo-functional)或異質功能(hetero-functional)。雙官能基團之交聯劑的例子為X-Y-Z，其中X及Z為兩個活性基團，而Y為一連結之連結物。此外，若X及Z為相同的基團，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)，將會產生交聯劑，NHS-Y-NHS，其為一同質雙官能交聯劑(homo-bi-functional cross-linker)，並且可以連結個別包括一胺類的兩個體。若X為N-羥基琥珀醯亞胺酯，且Z為馬來醯亞胺基團(maleimide group)，將會產生交聯劑，NHS-Y-馬來醯亞胺，其為一異質雙官能交聯劑(homo-bi-functional cross-linker)，並且可以連結分別包括一胺類的個體與包括一硫代基團(thio-group)的個體。具有許多不同官能基團的交聯劑被廣泛的運用。這類官能基團的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)、硫代酯類(thio-esters)、鹵烷類(alkyl halides)、鹵化醯類(acyl halides)(例如碘乙醯胺，iodoacetamide)、硫醇類(thiols)、胺類(amines)、半光胺酸(cysteines)、組胺酸(histidines)、二硫化物(di-sulfides)、馬來醯亞胺(maleimides)、順-二醇類(cis-diols)、硼酸(boronic acid)、異羥肪酸(hydroxamic acid)、疊氮化物(azides)、聯胺(hydrazines)、膦類(phosphines)、光敏基團(photoreactive groups)(例如：蒽醌，anthraquinone；二苯甲酮，benzophenone)、丙烯醯胺(acrylamide)(例如：acrydite)、親和性基團(affinity groups)(例如：生物素，biotin；鏈黴抗生素蛋白，streptavidin；麥芽糖，maltose；麥芽糖接合蛋白，maltose binding protein；麩胺基硫，glutathione；麩胺基硫-硫轉移脢，glutathione-S-transferase)、醛類(aldehydes)、酮類(ketones)、羧酸類(carboxylic acids)、磷酸鹽類(phosphates)、疏水性基團(hydrophobic groups)(例如：苯基，phenyl；膽固醇，cholesterol)…等等。
其他的改質劑替代物(例如光交聯(photo-crosslinking)及熱交聯(thermal crosslinking))已為本技術領域人員所知。產業上可利用的技術包括，例如，來自Mosiac Technologies(Waltham,MA),ExiqonTM(Vedbaek,Denmark)、Schleicher and Schuell(Keene,N.H.),Surmodics TM(St. Paul,MN)、Xenopore TM(Hawthorne,N.J.),Pamgene(Netherlands)、Eppendorf(Germany)、Prolinx(Bothell,WA)、Spectral Genomics(Houston,TX)、and CombimatrixTM(Bothell,WA)等公司的商品。
2.2　核酸偵測
本發明的偵測裝置可作為部分的系統，用於分子偵測的方法或過程中，例如，核酸定序。此裝置，及利用此裝置的方法或過程，有助於像是分析或診斷上的應用。這些應用可為私人的、公開的、商業的、或產業的。
本發明的偵測裝置可用於多種不同的定序方式(sequencing modalities)以及適用於定序單分子。此外，相對於現存的生物晶片裝置，本發明的偵測裝置簡化了設計、裝備、以及生產。
本發明的偵測裝置可作為部分的系統，用於生物分子偵測的方法或過程中，其包括核酸的雜交或定序，例如全基因體定序(transcriptional profiling)、轉錄概況分析(transcriptional profiling)、比對的轉錄概況分析(comparative transcriptional profiling)、或基因鑑定(gene identification)等。生物分子偵測亦可包括接合之交互反應(binding interactions)的偵測或量測，例如：蛋白質/蛋白質、抗體/抗原、受體/配體(receptor/ligand)、核酸/蛋白質。這些應用有助於分析或診斷的過程與方法。
2.2.1　Molecules to be Detected待測分子
本發明所提供之適合偵測的核酸可包括任何核酸，包括，例如：DNA、RNA、或PNA(肽核酸，peptide nucleic acid)，且可包含已知或未知的任何序列，包括自然發生或人工合成的序列。核酸可自然地產生、重組製造(recombinantly produced)、或化學合成。可根據實際應用而改變待測核酸的長度。在一些實施例中，核酸可包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000個鹼基，或更多。在一些實施例中，核酸可為10至20、10至50、10至100、50至100、50至500、50至1000、50至5000、500至2000、500至5000、或1000至5000個鹼基。
用於偵測的核酸可為單股核酸。藉由所屬技術領域已知的方法，例如：加熱、鹼化、或其他化學處理，一單股核酸模板可自一雙股分子衍生得來。單股核酸模板亦可藉由化學合成或體外合成(in vitro synthesis.)的方式來製造而得。
在一些實施例中，待測核酸為環狀。在一些實施例中，上述方法包括：提供一環狀的核酸分子，其包括一段已知序列的插入片段(insert)，上述已知序列可用來作為引子(primer.)的結合位(binding site)。環狀的核酸分子可以單股或雙股的狀態被提供，且一般包括至少一共價閉合鏈段(covalently closed strand)。雙股環狀分子可包括一缺口鏈段(nicked strand)或一第二共價閉合鏈段。
在一些實施例中，藉由自其來源以環狀形態分離之環狀的核酸分子，若已知其中部分的序列，且其已知序列的片段能夠作為核酸的插入片段(例如：可能已知一在包含於環狀分子中的基因序列內的保守序列(conserved motif)，或根據一分子在極嚴苛的條件下，與另一段已知序列的核酸雜交的能力，可知上述分子包含一序列)，則可藉由將環狀的核酸分子以環狀形式自其來源分離，來提供環狀的核酸分子。在一些實施例中，僅不明確(inexactly)的知道核酸的插入片段的序列，像是當對核酸的認知係來自於嚴苛的雜交性質(stringent hybridization properties)時就會如此。在一些實施例中，可明確知道核酸的插入片段的序列，像是當環狀的核酸分子具有一已知的主幹序列(backbone sequence)，或經過精心設計而包含一已知序列時。
在一些實施例中，藉由一體外反應或數個反應的進行，將一線狀的核酸樣本與一核酸的插入片段一起合併進入一環狀的分子，以提供環狀的核酸分子。在一些實施例中，上述體外反應或數個反應能夠包括藉由連結脢(ligase)的接合反應(ligation)，及/或其他參與反應的鏈段，上述反應例如：藉由各種不同的酵素的催化反應，其包含重組脢(recombinases)及拓樸異構脢(topoisomerases)。DNA連結脢(DNA ligase)或RNA連結脢(RNA ligase)可作為酵素加入一線狀的模板(linear template)之兩末端，無論有沒有銜接分子(adapter molecule)或連結劑(linkers)，以形成一環狀，如第8圖中所示範。例如，T4 RNA連結脢(T4 RNA ligase)將單股的DNA或RNA耦合，如Tessier等人在Anal Biochem ,158: 171-78(1986). CIRCLIGASE(TM)(Epicentre,Madison,Wis.)中所描述，亦可用於催化單股核酸之接合反應。此外，一雙股的連結脢，例如E. coli連結脢(E. coli ligase)或T4 DNA連結脢(T4 DNA ligase)，可用於進行環化反應(circularization reaction)。
在一些實施例中，提供環狀核酸分子包括：藉由延伸自至少一包括互補的區域(complementary regions)的引子(上述引子包括：具有已知序列的5’端(5’ flaps)之隨機的引子(random primers)，上述已知序列能夠作為核酸的插入片段)，來複製一核酸的模板；以及將經過放大的核酸變成環狀，例如可藉由一連結脢或一重組脢來催化；上述經過放大的核酸可，例如：藉由限制(restriction)或磷酸化作用(phosphorylation)，在環化(circularization)之前，於其末端進行酵素處理。
在一些實施例中，藉由進行化學的環化作用來提供環狀的核酸分子。化學方法係運用已知的耦合劑(coupling agents)像是BrCN陽性咪唑(BrCN plus imidazole)與二價金屬(divalent metal)、N-cyanoimidazole與ZnCl2 ，1-(3-dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide HCl、以及其他的碳二醯亞胺(carbodiimides)與羰基二咪唑(carbonyl diimidazoles)。藉由縮合(condensing)5’端的磷酸根(5’-phosphate)與3’端的羥基(3’-hydroxyl)，或縮合5’端的羥基(5’-hydroxyl)與3’端的磷酸根(3’-phosphate)，亦可將線狀模板的末端加入。
在一些實施例中，環狀的核酸分子包括一插入的序列，上述插入的序列可被視為一末端的連結引子(end link primer)，除了此分子為環狀因而上述插入的序列不在末端以外。
2.2.1.1　末端連結引子 (End Link Primer)
在一些實施例中，線狀的核酸可更包括一或多個耦合至核酸的5’端、3’端、或同時耦合至5’端及3’端兩者之末端的連結引子。在特定的實施例中，一末端的連結引子可被固定(affixed)至核酸的3’端。末端的連結引子可用來提供一或多個偵測的引子，例如：定序的引子之互補的序列。
末端的連結引子為短的核酸分子，通常由少於100個核苷酸所構成。在一些實施例中，末端的連結引子的長度可為至少5、10、15、20、25、30、50、75、90個核苷酸、或更多個核苷酸。在一些實施例中，末端的連結引子的長度可為8至25個核苷酸、10至20個核苷酸、10至30個核苷酸、10至50個核苷酸。在一些實施例中，末端的連結引子可為無支鏈的(unbranched)，然而，在其他的實施例中，上述末端的連結引子可為有支鏈的(branched)。
末端的連結引子可作為一或多個用於偵測核酸的引子的配對(complement)，例如：定序的引子。在一些實施例中，上述引子可藉由雜交(hybridization)來偵測核酸，例如：上述引子可包含一可偵測的標記，例如一螢光標記(fluorescent label)。在一些實施例中，末端的連結引子之5’端可包括一與定序的引子互補的序列。在一些實施例中，末端的連結引子之與定序的引子互補的序列可被定向(oriented)，使得上述定序的引子之3’端可立刻被調整成在待測核酸中的第一個核苷酸。
在一些實施例中，可藉由連結脢，例如：DNA連結脢，將末端的連結引子加入待測核酸的末端。在一些實施例中，末端的連結引子以及待測核酸，在接合之前兩者皆可為單股。在其他的實施例中，兩者皆可為雙股。在另一實施例中，一個可為單股而另一個可為雙股。接合作用已為所屬技術領域所熟知。例如，在波隆尼定序方法(polony sequencing method)中，Shendure等人，運用New England Biolabs’(NEB)Quick LigationTM 試劑組，將一T30末端的連結引子(T30 end link primer，32個鹼基對)接合至一樣本DNA片段(Science,309:1728-1732[2005])。上述連結反應溶液包括0.26 pMole的DNA、0.8 pMole的T30末端連結引子、4.0 μl T4 DNA連結脢1倍的Quick Ligation Buffer中。在混合之後，將上述反應溶液培養於室溫下10分鐘，接著放置於冰上。藉由將樣本加熱至65℃維持10分鐘，來終止上述連結反應。
在其他的實施例中，可在待測核酸上合成末端的連結引子。例如：末端的連結引子可為一均質的聚合物(homopolymer)，其中藉由例如：末端轉移脢(terminal transferase)來將均質的聚合物(homopolymer)加入。例如，Harris等人(Science 320:106-109[2008])將一多腺嘌呤尾(poly A tail)加至DNA模板，上述DNA模板作為一在病毒基因體的單分子定序中之多胸腺嘧啶定序引子(poly T sequencing primer)的配對(complement)。
2.2.1.2　定序引子
定序的引子為單股的寡核苷酸，其與待測核酸的片段互補，或與其本身相關之末端的連結引子互補。在一些實施例中，上述定序的引子的長度可為至少8、10、15、20、25、30、34、40、45、50個核苷酸，或更多個。在特定的實施例中，定序的引子的長度可為為8至25個核苷酸、10至20個核苷酸、10至30個核苷酸、10至50個核苷酸。上述定序的引子可由任何類型的核苷酸所構成，包括：自然產生的核苷酸、不存在於自然界的核苷酸相似物(analogs)、或經過改質的核苷酸。
在一些實施例中，定序的引子可包含經過改質的核苷酸，例如：鎖核酸(locked nucleic acids，LNAs，經過改質的核糖核酸，其提供在多聚核酸中的經過強化之鹼基堆疊的交互作用(enhanced base stacking interactions))。如Levin等人在Nucleic Acid Research 34(20):142[2006]中所描述之LNAs的功用，說明了包含LNA的引子改進了專一性(specificity)，並且相對於對應之未鎖引子(unlocked primer)，表現出更強的結合作用。產生包含3 LNA核苷酸(於帽蓋(caps)中)之MCP1引子(MCP1 primer，5’-cttaaattttcttgaat-3’)的三個變體(variants)：MCP1-LNA-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)、MCP1-LNA-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)、以及MCP1-LNA-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)，其中上述三個變體在引子中之不同位置處。所有的LNA取代的引子皆具有強化的Tm，雖然MCP1-LNA-5’引子表現出顯著地強化之定序的準確性(Phred Q30計數)。因此，在特殊的實施例中，上述定序引子可包含至少一鎖5’酸(locked nucleotide)於其5’的區域，亦即，上述5’二分之一、三分之一、或四分之一的定序引子。
在應用於本發明的偵測裝置之前，可將定序引子與單股樣本核酸(亦即，包括至少一末端連結引子的待測核酸)進行雜交。可藉由在含鹽溶液中，例如：5X SSC(或5X SSPE),0.1% Tween 20(或0.1% SDS)、以及0.1% BSA緩衝液，混合上述樣本核酸與一莫耳過量之定序的引子，使上述定序的引子及樣本核酸進行雜交。加熱上述混合物至65℃，持續5分鐘，以及緩慢降溫至室溫，好讓引子/模板進行低溫黏著(annealing)。可藉由合適的方法，包括：分子篩(molecular sieve)，來刪除殘留的引子(residual primers)。
可藉由適當的方法，包括：目視檢查(visual inspection)或電腦輔助的引子設計，來設計引子，上述引子包括序列的末端的連結與定序的引子兩者。很多的套裝軟體(software packages)可用來輔助引子的設計，包括：DNAStarTM (DNAStar,Inc.,Madison,WI)、OLIGO 4.0(National Biosciences,Inc.)、Vector NTI(Invitrogen)、Primer Premier 5(Premierbiosoft)、以及Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)。引子的設計可考慮到，例如，待定序的分子、專一性、長度、欲融化的溫度、二級結構、以及使用的酵素(亦即聚合脢或連結脢)。參見，例如，Joseph Sambrook與David Russell，Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，第三版(2001)。
2.2.2　定序模式(Sequencing Modalities)
一些本發明的實施例為定序核酸的方法，其包括下列步驟：(a)提供一偵測裝置，包括：一導波器包括：一核心層；以及一第一被覆層，其中至少一奈米井至少形成於該第一被覆層中；以及至少一光偵測器；(b)提供至少一核酸分子；(c)將該至少一核酸分子個別地定位(localizing)於至少一奈米井中；(d)進行該至少一核酸分子的單分子合成定序，其中該單分子核酸的合成定序導致光線的發射，該發射的光線與至少一該核酸中的鹼基之特性有關；(e)利用該偵測器偵測該發射光，產生一輸出訊號；以及(f)處理該輸出訊號以決定至少一該核酸所包含的鹼基之特性。
在這些方法中，”將至少一核酸分子個別地定位於於至少一奈米井中”，被理解為一單核酸分子可被定位於一位於一奈米井，亦即將一個(且不超過一個)核酸分子定位於至少一奈米井中。在一些實施例中，複數個奈米井皆個別含有一個(且不超過一個)核酸分子。在一些實施例中，在操作過程期間，一些複數個奈米井包含核酸分子，而其他的則不包含。也就是說，核酸分子在樣本溶液中的濃度低於某特定值，如此一來並非所有的奈米井皆具有核酸分子包含於其中。這樣可避免在定序完成前，發生兩個或兩個以上的核酸分子進入相同奈米井中的情形，以便避免包含來自大於一個核酸分子的資訊之定序的結果。例如，在一些本發明的實施例中，少於或等於50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的奈米井將會產生因為低濃度之定位於待檢測或待鑑定的生物分子之訊號。
在一些實施例中，核酸分子在樣本溶液中的濃度取決於有效的激發區的容量。例如，若有效的激發區的容量為10-18 公升，核酸分子在樣本溶液中的濃度可為約1.6 μM。在一些實施例中，核酸分子在樣本溶液中的最佳濃度可為約1-100 pM至約1-100 μM。
在一些實施例中，所提供之待測的核酸分子，其濃度相對於本發明之裝置的奈米井之有效激發區的容量，呈現亞化學劑量(substoichiometric)的關係。例如，若有效的激發區的容量為10-18 公升，核酸分子在樣本溶液中的濃度範圍可為每10-18 公升中有0.01至0.5個分子、每10-18 公升中有0.05至0.2個分子、或每10-18 公升中有約0.1個分子。上述濃度可根據有效激發區的大小適當地縮放(scaled)。在一些應用上，根據像是盡量減少來自相同奈米井的多重訊號與產生來自較大比例之奈米井的訊號之間的相對重要性，可能期望能使用更高或更低之核酸分子在樣本溶液中的濃度。
在一些實施例中，所提供之待測的核酸分子，其濃度相對於本發明之裝置的奈米井之有效激發區的容量，呈現化學劑量等價(stoichiometric equivalence)或過多(excess)的關係。例如，若有效的激發區的容量為10-18 公升，核酸分子在樣本溶液中的濃度範圍可為每10-18 公升中有1至50個分子、每10-18 公升中有2至20個分子、或每10-18 公升中有3至10個分子。這些濃度範圍的使用，可搭配定序核酸分子之酵素以亞化學劑量等級(substoichiometric level)的供應，例如每個奈米井中有0.01至0.5活化之可使用的聚合脢、每個奈米井中有0.05至0.2活化之可使用的聚合脢、或每個奈米井中有約0.1活化之可使用的聚合脢。
用於定序或其他偵測反應之待測酵素對奈米井表面的貼附可導致一些酵素呈現不可使用、無活性或兩者皆有的情況，或同時由於像是貼附的位置，以及酵素的結構是否受到影響等因素。藉由提供過量之正控制(positive control)合成定序反應(sequencing-by-synthesis reaction)的其他成份，以及藉由觀察奈米井產生之螢光訊號的數量，其中上述螢光訊號的數量與活化可使用之酵素的存在一致，可估算每個奈米井中活化可使用之聚合脢的數量。當一相當大比例，例如50%或更多的奈米井產生螢光訊號時，一隨機分佈的模型(random distribution model)可估算出許多的奈米井包含至少兩個活化可使用的酵素(例如，當50%的奈米井產生訊號時，預計會約有25%的奈米井包含至少兩個活化可使用的酵素)。在這類的情況中，為了盡可能的減少兩個不同定序複合物形成於相同奈米井中的頻率，可以考慮限制待定序之核酸分子的濃度。再者，當一相當小比例，例如10%或更少，的奈米井產生螢光訊號時，一隨機分佈的模型(random distribution model)可估算出少數的奈米井包含至少兩個活化可使用的酵素(例如，當10%的奈米井產生訊號時，預計會約有1%的奈米井包含至少兩個活化可使用的酵素)。在這類的情況中，為了盡可能的減少沒有定序複合物形成於奈米井中的頻率(其中上述奈米井的確具有一可使用之活化的酵素)，可以考慮利用相對高濃度的待定序之核酸分子。
在一些實施例中，單分子核酸的合成定序(single molecule nucleic acid sequencing-by-synthesis)導致化學發光(chemiluminescence)的光線發射。值得注意的是，在這些實施例中，當化學發光產生來自化學能的光線時，上述裝置並不需要包括光源。
在一些實施例中，上述裝置更包括一光源，上述光源可用於提供激發的光線，例如，使單分子核酸的合成定序通過螢光發射光線。
藉由所屬技術領域中已知的方法，像是回顧例如：美國專利號U.S. Patent No. 6,946,249以及Shendure et al.,Nat. Rev. Genet. 5:335-44(2004)，本發明所提供之偵測裝置及方法可用於偵測及定序核酸。可從所屬技術領域中已知的單分子定序的方法中選擇定序的模式(sequence modalities)。在一些實施例中，上述定序的方法可仰賴無論是DNA聚合脢(DNA polymerase)或DNA連結脢(DNA ligase)的專一性，以及可包括，例如：鹼基延伸定序(base extension sequencing，單一鹼基逐步延伸，single base step wise extensions)、以及多重鹼基的合成定序(包括，例如：利用末端標定的核苷酸之定序)。上述方法典型上包括涉及提供一包括至少一末端連結引子的樣本核酸。上述核酸可為單股形式或可能成為單股，例如，藉由化學變性或熱變性(thermal denaturation)。然後可於一定序的引子開始進行定序。
在一些實施例中，上述方法包括形成共價連結(covalent attachments)，像是反應物或分析物與標記之間，或反應物(例如用於定序反應中的聚合脢)或分析物與表面(例如奈米井的表面)之間。例如，在單分子定序過程中，一核酸分子或一酵素(例如聚合脢)可貼附至奈米井的底部。這類的貼附可在多個定序週期(sequencing cycles)上獲得數據。在本技術領域中，已知多種形成共價連結的方法。能夠利用許多不同的化學改質以加速連結的形成。化學改質的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)基團、胺類(amines)、醛類(aldehydes)、環氧衍生物(epoxides)、羧基(carboxyl groups)、羥基(hydroxyl groups)、醯肼(hydrazides)、疏水性基團、薄膜(membranes)、馬來醯亞胺(maleimides)、生物素(biotin)、鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)、硫醇基(thiol groups)、鎳螯合物(nickel chelates)、光敏基團(photoreactive groups)、硼基團(boron groups)、硫酯類(thioesters)、半光胺酸(cysteines)、二硫化物基團(disulfide groups)、烷基與鹵化醯基(acyl halide groups)、麩胺基硫(glutathiones)、麥芽糖(maltoses)、疊氮化物(azides)、磷酸鹽(phosphates)、以及膦類(phosphines)。這些試樣的準備很容易，例如，使用標準方法(Microarray Biochip Technologies,Mark Schena,Editor,March 2000,Biotechniques Books)。在一些實施例中，利用改質劑(例如親電性的改質劑或親核性的改質劑)的適當結合，使連結形成於兩個體之間，其中每一個體皆至少包括一改質劑。
在一些實施例中，藉由利用一存在於一上述個體上的化學改質劑，以及一其他個體之自然形成的部分(naturally-occurring moiety)，例如胺類或氫硫基(sulfhydryl)，使連結形成於兩個體之間。此反應的優點為其能夠快速反應且能夠避免有毒副產物的產生。這類的改質劑的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)、醛類(aldehydes)、環氧衍生物(epoxides)、以及硫代酯類(thio-esters)。大部分的蛋白質、胜肽、糖肽(glycopeptides)…等等，具有游離的胺基團，其能夠與這類的改質劑反應，來將這些改質劑共價連結至這些改質劑。亦可合成具有內部或末端之胺基團的核酸探針，且其具有商業利用價值(例如IDT或Operon公司)。因此，利用相似的化學反應，生物分子能夠結合(共價或非共價)至標記、表面、或其他的反應物。
許多其他的多功能的交聯劑(cross-linking agents)可用來將一種改質劑的化學活性轉換成另一種。這些基團可為雙官能基團、三官能基團、四官能基團…等等。這些基團亦可為同質功能(homo-functional)或異質功能(hetero-functional)。雙官能基團之交聯劑的例子為X-Y-Z，其中X及Z為兩個活性基團，而Y為一連結之連結物。此外，若X及Z為相同的基團，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)，將會產生交聯劑，NHS-Y-NHS，其為一同質雙官能交聯劑(homo-bi-functional cross-linker)，並且可以連結個別包括一胺類的兩個體。若X為N-羥基琥珀醯亞胺酯，且Z為馬來醯亞胺基團(maleimide group)，將會產生交聯劑，NHS-Y-馬來醯亞胺，其為一異質雙官能交聯劑(homo-bi-functional cross-linker)，並且可以連結分別包括一胺類的個體與包括一硫代基團(thio-group)的個體。具有許多不同官能基團的交聯劑被廣泛的運用。這類官能基團的範例包括：N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS-esters)、硫代酯類(thio-esters)、鹵烷類(alkyl halides)、鹵化醯類(acyl halides)(例如碘乙醯胺，iodoacetamide)、硫醇類(thiols)、胺類(amines)、半光胺酸(cysteines)、組胺酸(histidines)、二硫化物(di-sulfides)、馬來醯亞胺(maleimides)、順-二醇類(cis-diols)、硼酸(boronic acid)、異羥肪酸(hydroxamic acid)、疊氮化物(azides)、聯胺(hydrazines)、膦類(phosphines)、光敏基團(photoreactive groups)(例如：蒽醌，anthraquinone；二苯甲酮，benzophenone)、丙烯醯胺(acrylamide)(例如：acrydite)、親和性基團(affinity groups)(例如：生物素，biotin；鏈黴抗生素蛋白，streptavidin；麥芽糖，maltose；麥芽糖接合蛋白，maltose binding protein；麩胺基硫，glutathione；麩胺基硫硫轉移脢，glutathione-S-transferase)、醛類(aldehydes)、酮類(ketones)、羧酸類(carboxylic acids)、磷酸鹽類(phosphates)、疏水性基團(hydrophobic groups)(例如：苯基，phenyl；膽固醇，cholesterol)…等等。
其他的改質劑替代物(例如光交聯(photo-crosslinking)及熱交聯(thermal crosslinking))已為本技術領域人員所知。產業上可利用的技術包括，例如，來自Mosiac Technologies(Waltham,MA),ExiqOnTM(Vedbaek,Denmark)、Schleicher and Schuell(Keene,N.H.),Surmodics TM(St. Paul,MN)、Xenopore TM(Hawthorne,N.J.),Pamgene(Netherlands)、Eppendorf(Germany)、Prolinx(Bothell,WA)、Spectral Genomics(Houston,TX)、and CombimatrixTM(Bothell,WA)等公司的商品。
以單分子定序模式來說，偵測裝置可提供能夠定序單分子的優勢。例如，可提供一待定序的環狀模板核酸分子以及一定序的引子。例如，一個聚合酶可以貼附在奈米井的底部表面。且提供一環狀具有定序前導物的待定序核酸分子模板。藉由進行複數個定序的週期(sequencing cycles)，以得到比模板核酸分子中的核苷酸數量更多的序列之依序判讀(sequence read)，使重新定序能夠實現。上述定序的依序判讀包含訊息，其中上述訊息多餘地(redundantly)辨識了在至少一位於模板核酸分子中之位置的鹼基。在一些實施例中，上述定序的依序判讀包含訊息，其中上述訊息多餘地辨識了至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的鹼基。在一些實施例中，上述定序的依序判讀包含訊息，其中上述訊息辨識至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的鹼基，其中上述模板核酸分子具有三倍、四倍、五倍、七倍、或十倍或更多的重複(redundancy)。藉由定序相同的分子，定序錯誤可望下降，作為定序之依序判讀的數量之功率(as the power of the number of sequencing reads)。例如，如果每個單一判讀的鹼基錯誤率為10-3 ，那麼在兩次判讀之後，將會掉至(10-3 )2 ，亦即10-6 。既然上述用於定序之經過改質的核苷酸能夠失去其標記或保護基團(blocking group)，導致，例如假性偵測(spurious deletions)，此乃特別有助於單分子定序。
一般而言，在單分子定序中，至少一個待測的核酸分子與引子接觸。例如：藉由進行至少一酵素催化的聚合作用(polymerization)或連結反應(ligation reaction)來改質上述引子。上述至少一個反應造成光線的發射，上述光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關。”造成”光線的發射，其被理解為至少一個反應導致至少一個光線發射的情況發生，上述光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關；此情況的發生可藉由與激發光、化學或生物發光裝置(chemi-or bio-luminescent system)…等等之間的相互作用。上述至少一種情況可為，例如：螢光基團合併進入至少一反應的產物中、或焦磷酸根(pyrophosphate)的釋放。因此，無論是否有外部的激發皆可產生光線。例如，單分子定序的進行可利用可逆性末端終結子之鹼基類似物(reversible terminator base analogs)，其中上述可逆性末端終結子之鹼基類似物(reversible terminator base analogs)包括一共價連結之可偵測的標記，例如：一螢光標記、以及一防止任何二次延伸(secondary extension)的保護基團(blocking group)，其中在上述類似物被加至引子之後，激發並偵測上述類似物，並且在加入之後移除上述標記與保護基團，以進行另一輪的延伸(extension)。此外，藉由提供化學或生物發光的偵測裝置，其中上述偵測裝置以與焦磷酸鹽相關(pyrophosphate-dependent)的方式發射光線，可在沒有外部激發的情況下偵測延伸步驟的產物，例如一焦磷酸鹽。這些模式以及其他的模式將更詳細地描述於下文中。
上述發射的光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關。在一些實施例中，上述相關性能夠為時間的(temporal)，例如，光線發射的時間顯示了至少一個鹼基的性質，像是當提供不同的鹼基類似物(base analogs)以在不同時間用於一聚合反應中的情形。在一些實施例中，上述相關性可能為光譜的(spectral)，例如，發射光線的光譜顯示了至少一個鹼基的性質，像是當提供包括不同螢光基團的不同鹼基類似物以用於一聚合反應中的情形。
在一些實施例中，單分子核酸定序包括多重定序週期。一個定序週期被理解為造成一光線的發射的情形，上述光線與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關，為了在一第一鹼基被辨識之後，辨識至少一在核酸中的第二鹼基，上述情形可被重複。因此，在包括單分子核酸定序的方法中，上述單分子核酸定序能夠包括至少一給定數量的定序週期，如此一來造成至少上述給定數量之光線的發射，上述光線集體(collectively)與至少一個在核酸中的鹼基的性質相關。在一些實施例中，上述給定的數量可為，例如：2、3、4、5、10、20、50、100、200、或500。
定序的方法能夠包括決定一或多個在核酸中的鹼基的性質。在一些實施例中，進行單分子核酸定序造成光線的發射，其中利用至少一包括至少一第一光學感測器(optical sensor)及一第二光學感測器的光偵測器來偵測上述光線，並且處理來自上述至少兩個光學感測器的輸出訊號，藉由將至少一個處理的結果與至少一個已知的結果比對，上述已知的結果對應至少一個已知的類型，能夠決定至少一個在核酸中的鹼基的性質。
例如，一個處理的結果能夠顯示一反應發生的時間；當發射的光線在時間上與至少一個在核酸中之鹼基的性質相關時，上述時間可被用於辨識至少一個在核酸中的鹼基。
在另一個實施例中，一個處理的結果能夠決定將螢光基團合併進入一反應的產物中；當發射的光線在光譜上與至少一個在核酸中之鹼基的性質相關時，上述決定可被用於辨識至少一個在核酸中的鹼基。
2.2.2.1　鹼基延伸定序：逐步延伸(Base Extension Sequencing: Stepwise Extension)
在一些實施例中，偵測裝置可被用於偵測在鹼基延伸定序期間產生的光線。在一些實施例中，藉由提供一包括一待測的單股核酸之部分重複(partial duplex)的樣本核酸、一與待測核酸之3’端相關之末端的連結引子(end link primer)、以及一其黏著(anneal)的定序引子，開始進行鹼基延伸定序。在一些實施例中，在一適合的緩衝溶液中，聚合脢及經過改質的核苷酸可應用於上述光偵測裝置。在一些實施例中，上述核苷酸可包括一共價連結之可偵測的標記，例如，一螢光標記、以及一保護基團(blocking group)以防止任何二次延伸(secondary extension)。因此，上述定序停止於增加一單一核苷酸至定序引子的3’端之後。
在一鹼基延伸定序反應之實施例的第一步驟中，可藉由一DNA聚合脢將具有一螢光保護基團的核苷酸加入至定序引子的3’端。在一些實施例中，上述螢光標記可作為上述保護基團。在其他的實施例中，上述螢光標記可為獨立的基團。一單一核苷酸可在定序引子的3’端被併入，並且藉由其本身的標記被對應的光偵測器辨識。接著，例如，藉由化學或酵素溶解作用(lysis)，移除上述螢光標記及保護基團，以容許鹼基延伸額外增加的週期。在一些實施例中，可同時或依序以及以任何順序，移除標記與保護基團。藉由編排鹼基加入的順序，可以3’至5’的方向，一次一個鹼基地推演出樣本核酸的序列。
一般而言，有兩種在逐步延伸期間辨認增加之核苷酸的方法。在第一種情形中，四個核苷酸可都具有相同之可偵測的標記，但是以一預先決定的順序一次增加一個。延伸的核苷酸的性質可取決於上述核苷酸在延伸反應中加入的順序。在第二種於延伸期間辨認完整(integrated)之鹼基的模式中，四個不同的核苷酸可同時加入，且每個核苷酸個自與不同之可偵測的螢光標記耦合。在不同的實施例中，激發光譜或發射光譜及/或標記的強度可能不同。在延伸反應中加入之核苷酸的性質可取決於上述偵測之標記的強度及/或波長(亦即，激發光譜或發射光譜)。
2.2.2.2　合成定序：多步驟延伸(Sequencing by Synthesis: Multi-step Extension)
在一些實施例中，可利用多重連續的延伸反應(multiple uninterrupted extensions)，例如，不使用保護基團，來處理合成的定序。在這些實施例中，藉由偵測在核苷三磷酸(nucleoside triphosphate)水解之後，亦即β與γ磷酸鹽複合物(phosphate complex)的釋放之後，焦磷酸根(pyrophosphate)的釋放，可監測上述聚合反應。例如，藉由一在此複合物上的螢光部分(fluorescent moiety)，可直接偵測此複合物，或例如，藉由將上述磷酸鹽耦合至一化學或生物發光偵測裝置，可間接偵測此複合物。
在一些實施例中，藉由利用經過末端螢光標定的核苷酸，可基本上(essentially)持續地定序上述樣本核酸。末端螢光標定的核苷酸以及其使用的方法之示範的實施例，描述於，例如美國專利號U.S. Patent No. 7,361,466以及美國專利公開號U.S. Patent Publication No. 2007/0141598，公開於June 21,2007。簡言之，上述核苷酸可應用於上述偵測裝置，並且當此核苷酸在聚合反應期間被水解時，上述被標定的磷酸根可被對應的光偵測器偵測。在一些實施例中，上述核苷酸可包括：不能區別的(indistinguishable)，例如，相同的(identical)標記，並且之後以一預先決定的順序加入。具有不能區別的標記之核苷酸之連續的(Sequential)、循環的(cyclical)增加，還容許多個、不間斷的(uninterrupted)聚合步驟，例如，在均勻聚合物(homopolymer)序列中。
2.2.3　其他的應用
上述偵測裝置可同時偵測數百萬個核酸片段。如果每個片段的長度為，例如，1000個鹼基，一單一裝置可一次獲得數十億個以上的鹼基序列。下文將討論本說明書中所提供的裝置及方法之其他的應用。
2.2.3.1　全基因體定序(Whole-Genome Sequencing)
上述偵測裝置可被用於進行全部或部分基因體的定序，例如：病毒、細菌、真菌、真核細胞、或像是人類等的哺乳動物等之脊椎動物的基因體定序。
染色體DNA(Genomic DNA)可被剪切成至少20、50、100、200、300、500、800、1200、1500個核苷酸或更長之定序的片段。在一些實施例中，被剪切的染色體DNA的長度可為20至50、20至100、20至500、20至1000、500至1200、或500至1500個核苷酸。在一些實施例中，待定序的核酸，與相關之末端的連結引子，可形成單一鏈段、黏著(annealed)至一定序的引子、以及應用於如上述定序的偵測裝置。
2.2.3.2　基因表現分析檢測(Gene Expression Profiling)
在其他的實施例中，上述偵測裝置可用於將基因表現分析檢測(gene expression profiling)的cDNA定序。例如，藉由計算在一裝置上偵測的特定序列之相對頻率(relative frequency)，可量化mRNA的階層(mRNA levels)。在如本說明書中所描述的裝置上，數百萬個cDNA分子可同時被定序。如果一個細胞平均包含350,000個mRNA分子，在一百萬個定序反應中，一呈現甚至每個細胞一個複製的轉錄體(transcript)，預計被定序約三次。因此，利用單一複製數的靈敏度(single-copy-number sensitivity)，上述偵測裝置適用於單分子定序。
cDNA的合成在所屬技術領域中已廣為知悉，其通常包括具有選擇性富集之mRNA(optional enrichment of mRNA)的全RNA之抽取。藉由以下步驟，包括：例如，第一鏈段之合成的反轉錄；核糖核酸水解脢(RNAse)處理；移除殘留的RNA；上述第一鏈段之隨機的六具體啟動(random hexamer priming)；以及藉由DNA聚合脢合成第二鏈段，自mRNA產生cDNA。上述產生的sDNA適用於在本說明書中所述之裝置上的定序。分離與準備DNA及RNA兩者的方法在所屬技術領域中已廣為知悉。參見，例如，Joseph Sambrook及David Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press；第三版(2001)。
2.2.3.3　其他的偵測方法
(a)　螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)
在一些實施例中，可藉由螢光共振能量轉移(Frster resonance energy transfer,FRET)，於偵測裝置上偵測一分子。如所屬技術領域中所知，當一受到激發的供體(donor)分子非輻射地(non-radiatively)轉移能量至一受質(acceptor)分子時，上述分子發射出能量，此能量一般為光線，會發生螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)。藉由提供較大的光譜分離(greater spectral separation)，上述光譜分離介於有效激發區以及偵測中的分子之發射波長之間，螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)能夠有助於減少背景光線。由於FRET的效率會以供體與受質之間距離的六次方的速度衰減，螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)常用於偵測鄰近分子間的交互作用。例如，Zhang等人(Nature Materials 4:826-31[2005])藉由FRET來偵測核酸的雜交(hybridization)。被生物素化的核酸標的(biotinylated nucleic acid target)結合至具有抗生物蛋白塗層的量子點供體(avidin-coated quantum dot donor)，接著，上述量子點供體激發Cy5結合的DNA探針(Cy5-conjugated DNA probe)。在一些實施例中，被標定捕捉的分子以及被標記的樣本分子可形成一供體/受質對(donor/acceptor pair，反之亦然)，以用於FRET的偵測。
在一些利用偵測裝置之核酸定序的實施例中，經螢光標定的核苷酸可作為一黏附至聚合脢或連結脢之供體發色團(chromophore)的受質發色團(chromophore)。因此，在這些實施例中，上述定位於聚合脢或連結脢上的供體發色團可激發一位於核苷酸上的受質發色團，上述核苷酸正在目標核酸上進行聚合，或正在連結至目標核酸。沒有接近聚合脢的核苷酸，由於其螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的效率快速的下降，可能不會被激發。在一些實施例中，上述供體分子可為，例如，另一個螢光基團(fluorophore)，例如：一量子點。量子點，例如：所屬技術領域中已知的半導體量子點，其描述於，例如，國際專利公開號International Patent Publication No. WO 03/003015。將量子點耦合至，例如：所屬技術領域中已知的生物分子，如回顧於，例如：Mednitz et al., Nature Materials 4:235-46(2005)、以及U.S. Patent Publication Nos. 2006/0068506及2008/0087843，其分別公開發表於March 30,2006以及April 17,2008。在一些實施例中，量子點可結合(conjugated)至DNA聚合脢分子。如前面已經討論，將酵素結合至交聯劑位置，熟知技術者應可瞭解，當結合螢光基團至，例如，DNA聚合脢或連結脢，必須注意藉由降低任何因為將螢光基團結合至酵素之初級、二級、三級結構所造成的影響，以保留酵素的功能。
(b)　多光子激發 (Multi-Photon Excitation )
在一些實施例中，一發色團可被兩個或兩個以上的光子激發。例如，在一些實施例中，在螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)中，無論是供體發色團或受質發色團皆可透過兩個或更多個光子。雙光子以及多光子激發進一步描述於，例如，美國專利U.S. Patent Nos. 6,344,653以及5,034,613。
(c)　時間解析偵測 (Time-Resolved Detection )
在一些實施例中，可調整上述激發光源以及一偵測裝置的光偵測器，以具有特有的相移(characteristic phase shift)。利用所屬技術領域中已知的方法，例如，揭露於美國專利公開號Patent Publication No. 2008/0037008，其公開於February 14,2008，可藉由一對應的光偵測器來測量來自一正在偵測裝置上被偵測的分子所發出的光線，而不被來自激發光源所干擾。
(d)　其他螢光偵測裝置及方法
在一些實施例中，方法係關於由至少一在生物細胞中的目標物所發射之光線的偵測，上述生物細胞可為一活細胞或固定細胞(living or fixed cell)。在一些實施例中，至少一目標物擇自：至少一包括至少一量子點的目標物、至少一包括至少一螢光蛋白的目標物、以及至少一包括至少一螢光小化學部分(fluorescent small chemical moiety)的目標物。在一些實施例中，至少一目標物經螢光標定，且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡胜肽、多胜肽、寡糖、多糖、或脂質。
在一些實施例中，上述至少一個目標物包括一固定並且受限制之數量的螢光基團，例如至少20、10、5、或2個螢光基團，上述螢光基團可擇自量子點、螢光蛋白、以及螢光小化學部分(fluorescent small chemical moiety)。在一些實施例中，螢光小化學部分具有一介於300至800nm之間的發射峰emission peak及/或一至少為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、或0.9的量子效率(quantum yield)(發射的光子/每個峰值吸收波長的光子)。
2.3　生物分子分析服務(Biomolecule Analysis Service)
本發明亦提供利用一本發明實施例的偵測裝置來提供生物分析服務的方法。在一些實施例中，上述方法可包括下列步驟：自服務需求者至服務提供者，提供一樣本，包括一待分析的生物分子，以及上述服務需求者收到來自服務提供者的分析結果，其中可利用本發明所提供的偵測裝置來產生結果。在一些實施例中，可考量報酬來進行上述方法，例如：服務費用或服務協議合約。此外，上述樣本可直接在服務需求者與服務提供者之間傳送，或由供應商當媒介。在一些實施例中，上述服務提供者或供應商可在地理上位於美國以外的地方，例如：在另一個國家。
3.　實施例
3.1　實施例1
第16A-16D圖分別顯示奈米井121、122、123、及124之電腦模擬結果。在上述模擬中，利用時域有限差分法(Finite-Difference Time Domain，FDTD)來運算沿著導波器的垂直方向傳播並且經過或穿過有效激發區之激發光的電場分佈(electric field distribution)。電場的強度(strength of the electric field)可代表在導波器中的光線之電磁場的強度(intensity of the electromagnetic field)。在第16A-16D圖中，電場的強度以任意的單位顯示。
為了使模擬更接近實際情況，在此模擬中，假設粒徑為100 nm的粒子位於奈米井的底部附近。上述粒子的折射率設定為2.5。核心層的折射率設定為2.25，上部及下部的被覆層之折射率設定為1.45，填充奈米井的樣本溶液之折射率設定為1.33。上述核心層的厚度設定為100 nm。此外，四種形式之奈米井121、122、123、及124之底部的直徑皆設定為50 nm，以及奈米井的側壁與介於核心層及上部被覆層之間的界面的夾角角度設定為60度。就奈米井121的模擬而言，奈米井的底部與核心層及上部被覆層之間的界面的距離設定為50 nm。就奈米井123的模擬而言，奈米井延伸進入核心層的深度設定為50 nm。也就是說，奈米井123的底面位於核心層的中央。在第16A-16D各圖中之左手邊的圖式，顯示在不同奈米井121、122、123、及124之導波器中的時間平均電場分佈(time-averaged electric field distribution)。在第16A-16D各圖中之右手邊的圖式，顯示分別在不同奈米井121、122、123、及124之導波器中沿著垂直方向的電場分佈(electric field distribution)。
3.2　實施例2
本實施例係說明，對於穿透過如第5圖中所示之結構的金屬圖案，一波長為473 nm之橫向電波模態(transverse electric mode，TE mode)光線以及一波長為550 nm之橫向磁波模態(transverse magnetic mode，TM mode)光線的穿透性(transmittances)之模擬的結果，分別作為光柵週期(grating period)以及上述金屬圖案的深度之函數。
第17A圖顯示，穿透過金屬圖案，上述橫向電波模態(transverse electric mode，TE mode)光線的模擬穿透性，相對於金屬圖案之光柵週期(grating period)之關係圖。在第17A圖中之不同的曲線代表在不同金屬圖案深度值下的運算結果。第17B圖顯示，穿透過金屬圖案，上述橫向磁波模態(transverse magnetic mode，TM mode)光線的模擬穿透性，相對於金屬圖案之光柵週期(grating period)之關係圖。在第17B圖中之不同的曲線代表在不同金屬圖案深度值下的運算結果。
在第17B圖中可以發現，當上述金屬圖案的光柵週期小於300 nm時，上述橫向磁波模態(transverse magnetic mode，TM mode)光線的穿透性高於約30%，其亦高於橫向電波模態(transverse electric mode，TE mode)光線的穿透性。因此，可預期利用一小於300 nm的光柵週期，可實現一高信號雜訊比(signal-to-noise ratio,SNR)【亦即，介於橫向磁波模態(transverse magnetic mode，TM mode)光線與橫向電波模態(transverse electric mode，TE mode)光線之間的穿透性比】。第17C圖顯示上述信號雜訊比(signal-to-noise ratio,SNR)相對於在不同金屬圖案深度值下的運算出之金屬圖案的光柵週期的關係圖。可以發現，在例如250 nm之光柵週期以及深度150 nm處可獲得一大於10的信號雜訊比(signal-to-noise ratio,SNR)。此外，當上述光柵週期以及深度分別為110 nm及250 nm時，上述信號雜訊比(signal-to-noise ratio,SNR)大於107 。
3.3　實施例3
本實施例係說明，對於穿透過如第5圖中所示之結構的金屬圖案，一橫向電波模態(transverse electric mode，TE mode)光線以及一橫向磁波模態(transverse magnetic mode，TM mode)光線之經過運算的穿透性(transmittances)。在此實施例中，奈米結構的金屬圖案152係由鋁所組成，以及圍繞在鋁金屬圖案周圍之下部保護層144係由氧化矽所組成。鋁金屬圖案的週期及深度分別為110 nm及245 nm。第18A及18B圖分別顯示TE mode光線與TM mode光線的穿透性作為入射角的函數。從第18A及18B圖中可以發現，當入射角的絕對值自0度增加至大於60度時TE mode光線的穿透性自約10-8 下降至約10-12 ；然而在入射角介於約-60度至約60度的範圍內，TE mode光線的穿透性始終高於60%。
3.4　實施例4
第19圖顯示第20圖中所示之稜鏡耦合器之時域有限差分法(Finite-Difference Time Domain，FDTD)的模擬結果。在此模擬中，稜鏡與導波器的間距設定為73 nm。聚碳酸酯(Polycarbonate，n=1.6)用來作為核心層的材料，且上述核心層的厚度為2 μm。利用具有TM mode的入射光(λ=430 nm)。亦進行了量測上述稜鏡耦合器之耦合效率的實驗，其可為，例如約60%。例如，若光源，像是一He-Ne雷射(He-Ne laser)，發射一具有約2 mW之功率的光線，則上述耦合進入導波器以作為激發光的光線之功率為約1.2 mW。
3.5　實施例5
第21圖係顯示被耦合進入第7圖中所示之導波器110的入射光線之模擬斑點(speckle)。對此模擬而言，由PMMA所構成之圓柱形透鏡(cylindrical lens)，其孔鏡為0.5 mm以及其厚度為0.2 mm，上述圓柱形透鏡用於雷射光整形(laser beam shaping)。自透鏡至導波器的投影距離為1 mm。參見第22A及22B圖。斑點(speckle)的大小約300 nm，以及耦合效率為約70%。例如，若上述光源，像是一He-Ne雷射(He-Ne laser)，發射一具有約2 mW之功率的光線，則上述耦合進入導波器以作為激發光的光線之功率為約1.4 mW。
3.6　實施例6
第23圖顯示，一實施例中，耦合進入核心層112之光線的測量功率與第9圖所示之導波器的下部被覆層116的厚度關係。在此量測中，上述光柵週期為約410 nm，且上述核心層的厚度為約100 nm。上述入射光的波長為約633 nm。在第23圖中，依據入射光的功率對耦合進入核心層之光線的功率進行標準化。
3.7　實施例7
分別在第8及9圖中所示之光柵耦合器上進行一時域有限差分法(Finite-Difference Time Domain，FDTD)的模擬。在此模擬中，在第8及9圖中之第一光柵的週期設定為410 nm，以及在第9圖中之第二光柵的週期設定為300 nm。兩光柵的深度皆設定為55 nm。入射光的波長設定為473 nm，且光束半徑(beam radius)設定為5 μm，以及核心層與被覆層的折射率分別設定為2.196與1.445。第24及25圖分別顯示，在第8及9圖中所示之結構中之模擬的瞬間電場分佈(instantaneous electric field distribution)。在第8及9圖中所示之結構的計算耦合效率分別為20%與25%，其證實加入第二光柵404可增加耦合效率。
3.8　實施例8
在第11圖中所示之這類的結構上進行運算。對此運算而言，光柵406的有效折射率(effective refractive index)設定為2.2，核心層112與被覆層114及116的折射率分別設定為1.6與1.45，以及上述光柵的週期與深度分別設定為321 nm與120nm。在這樣的條件下，對一波長為473 nm並且通常入設置光柵406上的入射光而言，上述運算之耦合效率為29%。
3.9　實施例9
表1顯示自一吸收放射光耦合器(absorbing-emitting light coupler)發射出的光線之功率密度(power density)的運算結果，其利用酞花青(phthalocyanine)、4-(dicyanomethylene)-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran(DCM)摻雜的聚乙烯吡咯啶酮(polyvinylphyrodione，PVP)【DCM doped PVP】作為在此條件之下的發光材料。從表1可以發現，對相同的入射光而言，耦合進入導波器之光線的功率密度可高達37.67 W/cm2 。
3.10　實施例10
利用本發明所揭示的偵測裝置將DNA分子定序。本時實施例的偵測裝置包括一光源、一光耦合器、一具有形層於導波器之上部被覆層中的奈米井陣列的平面導波器、以及一形成於導波器下的偵測器陣列。
在本實施例中，光源為一He-Ne雷射，其發射的光波長為約633 nm。He-Ne雷射的功率為約2 mW。光耦合器為一由PMMA所構成之圓柱形透鏡所組成的邊耦合器(side coupler)。上述圓柱形透境的孔鏡為約0.5 mm，其厚度為約0.2 mm，並且配置於與導波器側邊間距約1 mm處。偵測器陣列由1000個光偵測器所組成，其中各個偵測器皆為矽光二極體(silicon photodiode)。
平面導波器包括一厚度為約100 nm的核心層、一上部被覆層、以及一下部被覆層。上述核心層係由氮化矽所構成，其折射率為約2.05。上述上部被覆層係由氧化矽所構成，其折射率為約1.46。形成於上部被覆層中的奈米井陣列包含1000個奈米井。對其中各個奈米井而言，可利用一光偵測器來偵測被留置(trapped)於奈米井中的分子所發射出的光線。
各個奈米井皆為具有一圓形橫截面之漏斗形(funnel shape)。上述奈米井延伸穿過上部被覆層之全部厚度，以便將核心層露出來。上述奈米井底部的直徑為約50 nm。
上述奈米井的側壁與垂直方向之間的夾角角度為約30度。形成於上述各個奈米井中的有效激發區為約10-18 公升(atto liter，al)。
核酸聚合脢以化學方式貼附至奈米井的底面，其平均密度為每個奈米井有效激發區中約有1個活化可使用的聚合脢。
將平均長度為200個核苷酸之環狀單股DNA分子的溶液於適合的定序反應緩衝溶液中，其濃度為每10-18 公升有0.1個分子，用於上述偵測系統。上述環狀的DNA分子包含一約20個核苷酸之已知的插入序列(insert sequence)，其自3’端插入至未知的樣本序列。提供了一與已知之插入序列互補的定序引子，以及提供了具有保護基團之經過標記的dNTP類似物，其中上述保護基團適合用於可逆性末端終結子(reversible terminator)之合成定序。在複數個奈米井中，形成一聚合脢的三元複合物(ternary complex)、DNA分子、以及定序引子，且上述聚合脢將一螢光標記之dNTP類似物加至此定序引子的3’端。
藉由側邊耦合器，將自He-Ne雷射發射出的光線部份地耦核進入導波器中。一些耦合進入導波器的光現在核心層中傳播，作為激發光。在複數個奈米井中，一螢光標記的dNTP類似物被進入形成於奈米井底部附近之有效激發區的激發光所激發，並且發射出螢光。此螢光被偵射器所偵測，其轉而產生待處理的輸出訊號，以辨識被加至上述定序引子之核苷酸類似物所包含的鹼基。
在複數個奈米井中，化學移除螢光基團(fluorophore)以及保護基團。然後，上述聚合脢將另一個螢光標記的dNTP類似物加入，如同上述方式偵測然後移除此螢光標記的dNTP。重複此週期至足夠的次數，以獲得至少兩倍長度之DNA分子的定序讀取。(亦即，對DNA分子進行定序以及再定序)。
100‧‧‧偵測裝置
102‧‧‧光源
104‧‧‧光耦合器
106‧‧‧光偵測器
110‧‧‧導波器
112‧‧‧導波器核心層
114‧‧‧導波器上部被覆層
116‧‧‧導波器下部被覆層
120‧‧‧奈米井
121‧‧‧奈米井
122‧‧‧奈米井
123‧‧‧奈米井
124‧‧‧奈米井
130‧‧‧有效的激發區
131‧‧‧有效的激發區
132‧‧‧有效的激發區
133‧‧‧有效的激發區
134‧‧‧有效的激發區
142‧‧‧上部保護層
144‧‧‧下部保護層
150‧‧‧針孔
152‧‧‧金屬圖案
160‧‧‧光學濾光器
202‧‧‧稜鏡
204‧‧‧準直透鏡
302‧‧‧側邊耦合器
402‧‧‧第一光柵
404‧‧‧第二光柵
406‧‧‧光柵
502‧‧‧光柵
504‧‧‧吸收發射光耦合器
d1‧‧‧距離
d2‧‧‧距離
第1圖係依據本發明實施例之偵測裝置的示意圖。
第2圖係依據本發明實施例之不同大小的奈米井的示意圖。
第3圖係依據本發明實施例之不同的奈米井設計的示意圖。
第4圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第5圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第6圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第7圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第8圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第9圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第10圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第11圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第12圖係依據本發明實施例，描述一吸收發射光耦合器(absorbing-emitting light coupler)。
第13圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第14圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第15圖係依據本發明的一實施例之偵測裝置的示意圖。
第16A-16D圖顯示不同奈米井之電腦模擬結果。
第17A及17B圖顯示橫向電波(transverse electric，TE)以及橫向磁波(transverse magnetic，TM)光線穿過第5圖中所示之金屬光柵(metal grating)的透光性(transmittances)，與金屬光柵的光柵週期(grating period)及深度的關係。
第17C圖顯示在第17B圖比第17A圖中數據的比值。
第18A及18B圖顯示光線穿過第5圖中所示之金屬光柵(metal grating)的透光性(transmittances)，與光線之入射角度的關係。
第19圖顯示第20圖中所示之偵測裝置的電腦模擬結果。
第20圖係一利用稜鏡作為耦合器的範例偵測裝置之示意圖。
第21圖係被耦合進入第7圖中所示之偵測裝置的導波器的入射光線之模擬斑駁雜訊(speckle)。
第22A及22B圖係一用於第20圖所示之模擬的偵測裝置中的透鏡。
第23圖顯示耦合進入第9圖所示之偵測裝置的導波器中之光線的測量功率。
第24圖顯示第8圖中所示之偵測裝置的電腦模擬結果。
第25圖顯示第9圖中所示之偵測裝置的電腦模擬結果。
100．．．偵測裝置
102．．．光源
104．．．光耦合器
106．．．光偵測器
110．．．平面導波器
112．．．導波器核心層
114．．．導波器上部被覆層
116．．．導波器下部被覆層
120．．．奈米井
130．．．有效的激發區

Claims (62)

  1. 一種單分子偵測裝置，包括：一導波器；包括：一核心層；以及一第一被覆層；其中至少一奈米井形成於至少該第一被覆層中；以及至少一光偵測器，形成於一基板上或基板內，其中該至少一奈米井以及該光偵測器配置於該導波器的相對兩側。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中更包括一光源。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之單分子偵測裝置，其中更包括一光耦合器。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的上部開口大於該至少一奈米井的底部。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中藉由自一沿著該核心層傳播之光波所誘導的光場，形成一有效激發區於該至少一奈米井的底部附近。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該光偵測器根據一偵測的光產生一訊號。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該導波器為一平面導波器，其更包括一第二被覆層，該第一被覆層及該第二被覆層配置於該核心層的相對兩側。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其 中至少一奈米井延伸穿過該第一被覆層的部分厚度。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中至少一奈米井延伸穿過該第一被覆層的全部厚度。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井延伸穿過該第一被覆層的全部厚度，以及該核心層之部分厚度。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井延伸穿過該第一被覆層的全部厚度，以及該核心層的全部厚度。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該光偵測器包括一組光學感測器。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，更包括複數個奈米井形成於一奈米井陣列(nanowell array)中。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之單分子偵測裝置，更包括：複數個光偵測器形成一偵測器陣列(detector array)，在該偵測器陣列中的各個光偵測器對應於在該奈米井陣列中之至少一奈米井。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中一包含於該至少一吸收一激發光之奈米井中的單分子目標物，透過螢光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)，更激發另一個單分子目標物，使該另一個單分子目標物發射光線以被該偵測器偵測。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該核心層的折射率比該第一被覆層的折射率高。
  17. 如申請專利範圍第7項所述之單分子偵測裝置，其中該核心層的折射率比該第一及第二被覆層的折射率高。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該核心層係由一材料所構成，且該材料擇自至少下列之一：Six Ti1-X O2 、TiO2 、Ta2 O5 、Nb2 O5 、HfO2 、Al2 O3 、ZrO2 、ZnS、SiNx、AlNx、TiNx、PC、PMMA、或Su8。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該第一被覆層係由一材料所構成，且該材料擇自至少下列之一：SiO2 、MgF2 、CaF2 、Al2 O3 、PMMA、Su8、或聚碳酸酯。
  20. 如申請專利範圍第7項所述之單分子偵測裝置，其中該第一及第二被覆層係由一材料所構成，且該材料擇自至少下列之一：SiO2 、MgF2 、CaF2 、Al2 O3 、PMMA、Su8、或聚碳酸酯。
  21. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，更包括一保護層配置於該第一被覆層上方。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之單分子偵測裝置，其中該保護層不透明。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之單分子偵測裝置，其中該保護層係由一材料所構成，且該材料擇自至少下列之一：A1、Ti、Ni、Cr、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、或任兩個或更多個上述材料的合金。
  24. 如申請專利範圍第7項所述之單分子偵測裝置，更包括一不透明層配置於該第二被覆層與該偵測器之間。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之單分子偵測裝置， 其中該不透明層係由一材料所構成，且該材料擇自至少下列之一：Al、Ti、Ni、Cr、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、或任兩個或更多個上述材料的合金。
  26. 如申請專利範圍第24項所述之單分子偵測裝置，其中該不透明層具有一孔洞配置於該至少一奈米井與該光偵測器之間，以允許一自一包含於至少一奈米井中的單分子目標物發射出的光線到達該光偵測器。
  27. 如申請專利範圍第24項所述之單分子偵測裝置，其中該不透明層具有一奈米圖案化的結構(nanopatterned structure)配置於該至少一奈米井與該光偵測器之間，以允許一自一包含於至少一奈米井中的單分子目標物發射出之光線的傳播，並且阻斷雜訊的傳播。
  28. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中一光學濾光器配置於該導波器與該光偵測器之間。
  29. 如申請專利範圍第7項所述之單分子偵測裝置，其中一光學濾光器配置於該第二被覆層與該光偵測器之間。
  30. 如申請專利範圍第24項所述之單分子偵測裝置，其中一光學濾光器配置於該不透明層與該光偵測器之間。
  31. 如申請專利範圍第7項所述之單分子偵測裝置，其中該第二被覆層亦作為一光學濾光器。
  32. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，更包括一封蓋(cover)位於該至少一奈米井的上方。
  33. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的至少一第一表面具有與該至少一奈米井的至少一第二表面之不同的表面性質。
  34. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的一側壁表面為親水性，該側壁表面包括一材料擇自：矽、二氧化矽、金屬、或金屬氧化物。
  35. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的一底面為疏水性。
  36. 如申請專利範圍第35項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的該底面形成自一矽酸鹽，或形成自一親水性的金屬，其被R1x -Si(O-R2)4-x 或被一具有官能基團的聚合物改質成為疏水性，以及其中R1為一疏水性基團，該疏水性基團擇自：烷鏈(alkyl chain)-(CH2 )n -CH3 ：且R2為Cn H2n+1 ，以及該官能基團擇自：-COOH、-PO3 H2 、-SH、或NH2 。
  37. 如申請專利範圍第35項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的該底面形成自一親水性金屬氧化物，其被R1x -Si(O-R2)4-x 或被一具有官能基團的聚合物經親水性改質成為疏水性，以及其中R1為一疏水性基團，該疏水性基團擇自：烷鏈(alkyl chain)-(CH2 )n -CH3 ：且R2為Cn H2n+1 ，以及該官能基團擇自：-COOH、-PO3 H2 、-SH、或NH2 。
  38. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的一底面具有與該至少一奈米井的一側壁表面之不同的表面性質。
  39. 如申請專利範圍第33項所述之單分子偵測裝置，其中該表面性質包括：疏水性(hydrophobicity)、官能基團、官能基團密度、材料密度、或導電性。
  40. 如申請專利範圍第38項所述之單分子偵測裝置，其中該表面性質包括：疏水性(hydrophobicity)、官能基團、官能基團密度、材料密度、或導電性。
  41. 如申請專利範圍第3項所述之單分子偵測裝置，其中該光耦合器為一光柵耦合器(grating coupler)，其位於該核心層之上、該核心層之中、或該核心層之下。
  42. 如申請專利範圍第3項所述之單分子偵測裝置，其中該光耦合器為一稜鏡耦合器(prism coupler)。
  43. 如申請專利範圍第3項所述之單分子偵測裝置，其中該光耦合器為一側邊耦合器(side coupler)。
  44. 如申請專利範圍第3項所述之單分子偵測裝置，其中該光耦合器為一吸收發射耦合器(absorbing-emitting coupler)，其吸收一自該光源發射出的入射光並發射出一激發光。
  45. 如申請專利範圍第44項所述之單分子偵測裝置，其中該吸收發射耦合器(absorbing-emitting coupler)包括一光致發光材料(photoluminescent material)，上述光致發光材料具有大於或等於30nm的托斯克斯位移(Stokes shift)。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之單分子偵測裝置，其中該光致發光材料(photoluminescent material)摻雜於一聚合物中。
  47. 如申請專利範圍第45項所述之單分子偵測裝置，其中該光致發光材料(photoluminescent material)包括一光致發光染劑(photoluminescent dye)，上述光致發光染 劑包括：蒽(anthracene)、香豆素(coumarin)、芘(pyrene)、二苯乙烯(stilbene)、紫質(porphyrin)、苝(perylene)、Alq3、曙紅(eosin)、Bodipy dye、螢光素(fluorescein)、若丹明(rhodamine)、聚次甲基染料(polymethine dye)、DCM、或上述之衍生物。
  48. 如申請專利範圍第45項所述之單分子偵測裝置，其中該光致發光材料(photoluminescent material)包括一光致發光聚合物，上述光致發光聚合物包括：PPV或其衍生物。
  49. 如申請專利範圍第45項所述之單分子偵測裝置，其中該光致發光材料(photoluminescent material)包括一無機化合物，上述無機化合物包括量子點(quantum dot)、氧化鋁(alumina oxide)、或氧化鋅。
  50. 如申請專利範圍第3項所述之單分子偵測裝置，其中該光源為一同向耦合器(co-directional coupler)。
  51. 如申請專利範圍第2項所述之單分子偵測裝置，其中該光源為一雷射、一雷射二極體、一LED、一OLED、一QLED、一光纖光源(fiber light source)、或一電弧放電螢光燈(arc discharge fluorescent lamp)。
  52. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該第一被覆層的折射率約等於一樣本溶液的折射率。
  53. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該第一被覆層的折射率大於一樣本溶液的折射率。
  54. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該至少一奈米井的一底部的尺寸小於一在核心層中之激 發光的波長、小於該波長的一半、小於該波長的四分之一、或小於該波長的八分之一。
  55. 如申請專利範圍第2項所述之單分子偵測裝置，其中該光源形成於一該導波器的支撐基板(supporting substrate)上。
  56. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該光偵測器為一光學感測器，其擇自：一CCD、一CMOS光學感測器、一光導電(photoconductive)型光學感測器、一光伏打(photovoltaic)型光學感測器、一APD、一p-n光電二極體(p-nphotodiode)、一p-i-n光電二極體(p-i-n photodiode)、或一多接面光電二極體(multi-junction photodiode)。
  57. 如申請專利範圍第1項所述之單分子偵測裝置，其中該光偵測器為一組光學感測器，其擇自：CCD、CMOS光學感測器、光導電(photoconductive)型光學感測器、光伏打(photovoltaic)型光學感測器、APDs、p-n光電二極體(p-n photodiode)、p-i-n光電二極體(p-i-n photodiode)、或多接面光電二極體(multi-junction photodiode)。
  58. 如申請專利範圍第57項所述之單分子偵測裝置，其中在一組中的該光學感測器具有不同的敏感波段(sensitive wavelength band)。
  59. 一種單分子的偵測方法，包括：藉由一光源發射一入射光；藉由一耦合器將該入射光耦合進入一導波器中，以在 該導波器中形成一激發光；藉由該激發光及形成於至少一該導波器之被覆層中的至少一奈米井，形成一有效激發區；以及藉由該激發光激發一在有效激發區中的單分子目標物，使該單分子目標物發射出一光線以被一光偵測器所偵測，該光偵測器形成於一基板上或基板內，其中該至少一奈米井以及該光偵測器配置於該導波器的相對兩側。
  60. 一種核酸的定序方法，包括下列步驟：提供一偵測裝置，包括：一導波器，包括：一核心層；以及一第一被覆層；其中至少一奈米井至少形成於該第一被覆層中；以及至少一光偵測器，形成於一基板上或基板內，其中該至少一奈米井以及該光偵測器配置於該導波器的相對兩側；提供至少一核酸分子；將該至少一核酸分子個別地定位(locating)於至少一奈米井中；進行該至少一核酸分子的單分子合成定序，其中該單分子核酸的合成定序導致光線的發射，該發射的光線與至少一該核酸中的鹼基之特性有關；利用該偵測器偵測該發射光，產生一輸出訊號；以及處理該輸出訊號以決定至少一該核酸所包含的鹼基之特性。
  61. 如申請專利範圍第60項所述之核酸的定序方法，其中該單分子核酸的合成定序透過化學發光(chemiluminescence)導致光線的發射。
  62. 如申請專利範圍第60項所述之核酸的定序方法，其中該偵測裝置更包括一光源，以及該單分子核酸合成定序透過螢光導致光線的發射。
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WO (1) WO2011153962A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI701472B (zh) * 2018-05-29 2020-08-11 精準基因生物科技股份有限公司 檢測裝置

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3543357A1 (en) 2007-05-08 2019-09-25 Trustees of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
US9778188B2 (en) 2009-03-11 2017-10-03 Industrial Technology Research Institute Apparatus and method for detection and discrimination molecular object
US9482615B2 (en) 2010-03-15 2016-11-01 Industrial Technology Research Institute Single-molecule detection system and methods
US9670243B2 (en) 2010-06-02 2017-06-06 Industrial Technology Research Institute Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US9184099B2 (en) 2010-10-04 2015-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosensor devices, systems and methods therefor
KR101963462B1 (ko) 2010-10-04 2019-03-28 제납시스 인크. 재사용 가능한 자동화 평행 생물 반응 시스템 및 방법
US9926596B2 (en) 2011-05-27 2018-03-27 Genapsys, Inc. Systems and methods for genetic and biological analysis
US8466484B2 (en) * 2011-06-21 2013-06-18 Kateeva, Inc. Materials and methods for organic light-emitting device microcavity
CN106591103B (zh) 2011-12-01 2021-06-04 吉纳普赛斯股份有限公司 用于高效电子测序与检测的系统和方法
US20130330711A1 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 National Taiwan University Sensor for detection of a target of interest
US9372308B1 (en) * 2012-06-17 2016-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of integrated analytical devices and methods for production
KR101672980B1 (ko) * 2012-07-27 2016-11-04 가부시키가이샤 무라타 세이사쿠쇼 틈 배치 구조체 및 그것을 이용한 측정 방법
US9490148B2 (en) 2012-09-27 2016-11-08 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Adhesion promoter apparatus and method
US9651539B2 (en) 2012-10-28 2017-05-16 Quantapore, Inc. Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment
KR101977662B1 (ko) * 2012-11-09 2019-05-13 삼성전자주식회사 광 바이오 센서 및 상기 광 바이오 센서의 제조 방법
KR101411917B1 (ko) * 2012-12-17 2014-06-26 전자부품연구원 도파로 센서를 이용한 휴대용 유사 석유 감별기
WO2014099776A1 (en) * 2012-12-18 2014-06-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Illumination of optical analytical devices
KR101989560B1 (ko) 2012-12-31 2019-06-14 엔라이트 인크. Ltps 크리스탈화를 위한 짧은 펄스 섬유 레이저
US9464985B2 (en) * 2013-01-16 2016-10-11 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Plasmon resonance imaging apparatus having nano-lycurgus-cup arrays and methods of use
KR101383830B1 (ko) 2013-02-01 2014-04-10 서강대학교산학협력단 Atp 검출용 센서
EP2959283B1 (en) * 2013-02-22 2022-08-17 Pacific Biosciences of California, Inc. Integrated illumination of optical analytical devices
WO2014152625A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Genapsys, Inc. Systems and methods for biological analysis
CN105283560B (zh) 2013-05-24 2018-11-30 昆塔波尔公司 基于纳米孔的通过混合的fret检测的核酸分析
EP3004847B1 (en) * 2013-06-03 2019-04-10 Ventana Medical Systems, Inc. Fluorescence imaging system for tissue detection
WO2014207089A1 (en) * 2013-06-28 2014-12-31 Gothenburg Sensor Devices Ab Waveguide structure
JP6573899B2 (ja) 2013-11-17 2019-09-11 クアンタム−エスアイ インコーポレイテッドＱｕａｎｔｕｍ−Ｓｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 分子をプローブし、検出し、及び分析するための、外部光源を備えた集積デバイス
BR112016012347B1 (pt) * 2013-12-03 2020-12-15 Koninklijke Philips N.V Dispositivo óptico para o processamento de luz de entrada, aparelho de detecção e método para o processamento de luz de entrada
US9540688B2 (en) 2014-02-19 2017-01-10 Personal Genomics, Inc. Real-time sequencing method for single molecule
KR102405110B1 (ko) * 2014-03-14 2022-06-02 에이엠에스 센서스 싱가포르 피티이. 리미티드. 비행시간 센서를 포함하는 광학 이미징 모듈들 및 광학 검출 모듈들
EP2930497A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-14 Institut Pasteur Enzyme-independent photon emission
US9822401B2 (en) 2014-04-18 2017-11-21 Genapsys, Inc. Methods and systems for nucleic acid amplification
EP2940504B1 (en) * 2014-04-25 2023-06-07 Personal Genomics, Inc. Optical sensor
WO2015167791A2 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 Felder Mitchell S Method for treating infectious diseases using emissive energy
KR102384909B1 (ko) 2014-08-08 2022-04-11 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 수신된 광자들의 시간 비닝을 위한 집적 디바이스
JP6812341B2 (ja) * 2014-08-08 2021-01-13 クアンタム−エスアイ インコーポレイテッドＱｕａｎｔｕｍ−Ｓｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 分子の探索、検出及び解析のための光学システム及びアッセイチップ
CN106796176B (zh) * 2014-08-08 2021-02-05 宽腾矽公司 用于对分子进行探测、检测和分析的带外部光源的集成装置
TWI591834B (zh) 2014-08-12 2017-07-11 Pgi股份有限公司 光學感測器及其製造方法
WO2016033207A1 (en) * 2014-08-27 2016-03-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of integrated analyitcal devices
CA2961743A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Ibis Biosciences, Inc. Sequencing by synthesis using pulse read optics
JP6239479B2 (ja) * 2014-09-30 2017-11-29 富士フイルム株式会社 暗視野顕微鏡及び照明方法
CN107109472B (zh) 2014-10-10 2021-05-11 昆塔波尔公司 利用互相猝灭的荧光标记物的基于纳米孔的聚合物分析
JP6757316B2 (ja) 2014-10-24 2020-09-16 クアンタポール， インコーポレイテッド ナノ構造のアレイを使用するポリマーの効率的光学分析
KR20160073016A (ko) * 2014-12-16 2016-06-24 삼성전자주식회사 광학분석용 구조체 및 광학분석용 구조체 제조용 잉크 조성물
US10119915B2 (en) * 2015-04-09 2018-11-06 Visera Technologies Company Limited Detection device for specimens
US10605730B2 (en) 2015-05-20 2020-03-31 Quantum-Si Incorporated Optical sources for fluorescent lifetime analysis
US11466316B2 (en) 2015-05-20 2022-10-11 Quantum-Si Incorporated Pulsed laser and bioanalytic system
WO2016201387A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated target waveguide devices and systems for optical coupling
EP3133386B1 (en) * 2015-07-27 2023-03-15 Personal Genomics, Inc. Sensing module and sensing method
PL3334839T3 (pl) * 2015-08-14 2021-08-02 Illumina, Inc. Systemy i sposoby wykorzystujące czujniki reagujące na pole magnetyczne do określania informacji genetycznej
US10488639B2 (en) * 2015-10-08 2019-11-26 Visera Technologies Company Limited Detection device for specimens
TWI585482B (zh) * 2015-11-25 2017-06-01 國立臺北科技大學 側向光柵耦光系統
US9778191B2 (en) * 2016-02-05 2017-10-03 Personal Genomics, Inc. Optical sensing module
AU2017219894B2 (en) 2016-02-17 2021-12-09 Tesseract Health, Inc. Sensor and device for lifetime imaging and detection applications
CN105758821B (zh) * 2016-03-01 2018-12-14 中国科学院西安光学精密机械研究所 具有超窄线宽光谱响应的高灵敏度超材料纳米传感系统
GB2549298B (en) * 2016-04-12 2022-02-02 Univ I Tromsoe Norges Arktiske Univ Super-resolution imaging
EP4224219A3 (en) * 2016-04-22 2023-08-30 Illumina Inc Photonic stucture-based devices and compositions for use in luminescent imaging of multiple sites within a pixel, and methods of using the same
US11226290B2 (en) 2016-06-01 2022-01-18 Quantum-Si Incorporated Photonic structures and integrated device for detecting and analyzing molecules
EP3482196B1 (en) 2016-07-05 2022-02-23 Quantapore, Inc. Optically based nanopore sequencing
CN116397014A (zh) 2016-07-20 2023-07-07 测序健康公司 用于核酸测序的系统和方法
KR102020956B1 (ko) * 2016-08-30 2019-10-18 삼성전자주식회사 광학필터 및 이를 이용한 광학 디바이스
US10890528B2 (en) * 2016-10-27 2021-01-12 Sharp Kabushiki Kaisha Fluorescent testing system, molecular testing method, and fluorescent testing method
EP3555591B1 (en) * 2016-12-16 2022-07-06 Quantum-Si Incorporated Optical coupler and waveguide system
JP6913169B2 (ja) 2016-12-16 2021-08-04 クアンタム−エスアイ インコーポレイテッドＱｕａｎｔｕｍ−Ｓｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ コンパクトなモードロックレーザモジュール
KR20220084181A (ko) 2016-12-16 2022-06-21 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 콤팩트한 빔 셰이핑 및 스티어링 어셈블리
BR112019012540A2 (pt) 2016-12-22 2019-11-12 Quantum-Si Incorporated fotodetector integrado com pixel de acondicionamento direto
US11001885B2 (en) * 2017-06-13 2021-05-11 Personal Genomics Taiwan, Inc. Apparatus for single molecular sequencing and method of sequencing nucleic acid molecules
TW201909245A (zh) * 2017-07-24 2019-03-01 美商康寧公司 精密結構玻璃物件、積體電路封裝、光學元件、微流體元件及其製造方法
US11237326B2 (en) 2017-07-24 2022-02-01 Quantum-Si Incorporated Optical rejection photonic structures using two spatial filters
KR101944272B1 (ko) * 2017-09-13 2019-01-31 한국과학기술연구원 중적외선 광 위상 변조기 및 이의 제조방법
EP3684951A4 (en) 2017-09-21 2021-06-16 Genapsys, Inc. NUCLEIC ACID SEQUENCING SYSTEMS AND METHODS
EP3737503A2 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Quantum-Si Incorporated System and methods for electrokinetic loading of sub-micron-scale reaction chambers
JP6856558B2 (ja) * 2018-01-23 2021-04-07 浜松ホトニクス株式会社 光測定装置及び光測定方法
US11538556B2 (en) 2018-01-26 2022-12-27 Quantum-Si Incorporated Machine learning enabled pulse and base calling for sequencing devices
BR112020021337A2 (pt) 2018-05-03 2021-01-19 Quantum-Si Incorporated Caracterização de um elemento ótico
JP7317050B2 (ja) 2018-05-14 2023-07-28 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド 異なるデータモダリティの統計モデルを統合するためのシステムおよび方法
US11971963B2 (en) 2018-05-30 2024-04-30 Quantum-Si Incorporated Methods and apparatus for multi-modal prediction using a trained statistical model
US11967436B2 (en) 2018-05-30 2024-04-23 Quantum-Si Incorporated Methods and apparatus for making biological predictions using a trained multi-modal statistical model
CN112424587A (zh) 2018-06-15 2021-02-26 宽腾矽公司 用于具有脉冲光源的先进分析仪器的数据采集控制
WO2019246328A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Quantum-Si Incorporated Integrated photodetector with charge storage bin of varied detection time
KR102099336B1 (ko) * 2018-08-13 2020-04-09 한국과학기술연구원 저마늄을 이용한 적외선 광 도파관 및 이의 제조 방법
CN112955401A (zh) 2018-08-29 2021-06-11 宽腾矽公司 用于集成传感器器件的样本井制造技术及结构
KR102080688B1 (ko) * 2018-10-23 2020-02-24 인하대학교 산학협력단 격자 결합기
TW202041847A (zh) * 2019-01-03 2020-11-16 美商寬騰矽公司 用於傳遞光至光子元件之陣列的光學波導及耦合器
CN110148658A (zh) * 2019-05-28 2019-08-20 中国计量大学 一种基于量子点发光二极管发光的有机光敏三极管光耦器件
NL2023516B1 (en) * 2019-05-28 2020-12-08 Illumina Inc Manufacturing a flowcell with a planar waveguide
WO2020240453A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 Illumina, Inc. Manufacturing a flowcell with a planar waveguide
US11747561B2 (en) 2019-06-14 2023-09-05 Quantum-Si Incorporated Sliced grating coupler with increased beam alignment sensitivity
CA3144003A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Quantum-Si Incorporated Optical nanostructure rejecter for an integrated device and related methods
EP3990185A4 (en) * 2019-06-28 2023-05-31 Illumina Cambridge Limited FLOW CELLS WITH LINEAR WAVEGUIDES
CA3144668A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Quantum-Si Incorporated Optical and electrical secondary path rejection
AU2020326781A1 (en) 2019-08-08 2022-03-17 Quantum-Si Incorporated Increased emission collection efficiency in integrated optical devices
NL2023679B1 (en) * 2019-08-09 2021-04-13 Illumina Inc System and method for patterning flow cell substrates
WO2021028815A1 (en) * 2019-08-09 2021-02-18 Illumina Inc. System and method for patterning flow cell substrates
CN110628601B (zh) * 2019-10-19 2023-06-30 上海新微技术研发中心有限公司 柔性基底纳米孔结构和纳米孔阵列制造方法
TW202143465A (zh) 2020-01-14 2021-11-16 美商寬騰矽公司 用於壽命特性分析之整合感應器
US11885744B2 (en) 2020-01-14 2024-01-30 Quantum-Si Incorporated Sensor for lifetime plus spectral characterization
US11719639B2 (en) 2020-03-02 2023-08-08 Quantum-Si Incorporated Integrated sensor for multi-dimensional signal analysis
US20210318238A1 (en) 2020-04-08 2021-10-14 Quantum-Si Incorporated Integrated sensor with reduced skew
KR20230007915A (ko) * 2020-04-24 2023-01-13 일루미나 케임브리지 리미티드 플로우 셀
FR3110979A1 (fr) * 2020-05-28 2021-12-03 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Dispositif de répartition de lumière basé sur des réseaux de diffraction
KR102423723B1 (ko) * 2020-08-27 2022-07-21 성균관대학교산학협력단 플라즈모닉 우물 기반 핵산 검출장치 및 롤투롤 공정을 이용한 이의 제조방법
WO2022087240A2 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Quantum-Si Incorporated Integrated circuit with sequentially-coupled charge storage and associated techniques

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020110839A1 (en) * 2000-04-28 2002-08-15 David Bach Micro-array evanescent wave fluorescence detection device
JP2005127795A (ja) * 2003-10-22 2005-05-19 Toyo Glass Co Ltd ウエルプレート及びその製造方法
US20050201899A1 (en) * 2002-10-30 2005-09-15 Genewave Device for supporting chromophore elements
JP2006220645A (ja) * 2005-01-14 2006-08-24 Inoac Corp 診断用容器およびその処理方法
US7361466B2 (en) * 1999-05-19 2008-04-22 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid analysis using terminal-phosphate-labeled nucleotides
US20100065726A1 (en) * 2006-09-01 2010-03-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates and optical systems and methods of use thereof

Family Cites Families (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4748111A (en) 1984-03-12 1988-05-31 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay
US4790614A (en) * 1985-11-21 1988-12-13 Hitachi, Ltd. Optical filter and optical device using same
JP2771532B2 (ja) 1986-01-16 1998-07-02 三洋電機株式会社 光センサ
US4746111A (en) 1986-06-09 1988-05-24 Xerox Corporation System for controlling sorter indexing
US4962037A (en) 1987-10-07 1990-10-09 United States Of America Method for rapid base sequencing in DNA and RNA
US5162887A (en) 1988-10-31 1992-11-10 Texas Instruments Incorporated Buried junction photodiode
AU5640090A (en) 1989-03-21 1990-11-05 Collaborative Research Inc. A dna diagnostic test using an exonuclease activity
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
US5034613A (en) 1989-11-14 1991-07-23 Cornell Research Foundation, Inc. Two-photon laser microscopy
US6013434A (en) 1989-12-22 2000-01-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
DE4013307A1 (de) * 1990-04-26 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung eines optischen kopplers fuer polymerlichtwellenleiter
DE4103167A1 (de) * 1991-02-02 1992-08-06 Boehringer Mannheim Gmbh Diphenylmethanderivate, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur verdraengung von jodthyroninen von diesen bindenden proteinen
JPH04303972A (ja) 1991-03-30 1992-10-27 Kobe Steel Ltd 受光素子
JPH05198739A (ja) * 1991-09-10 1993-08-06 Mitsubishi Electric Corp 積層型半導体装置およびその製造方法
US5405747A (en) 1991-09-25 1995-04-11 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Method for rapid base sequencing in DNA and RNA with two base labeling
JPH05118991A (ja) 1991-10-29 1993-05-14 Hitachi Ltd 塩基配列決定方法およびその装置
WO1994018218A1 (en) 1993-02-01 1994-08-18 Seq, Ltd. Methods and apparatus for dna sequencing
US5556790A (en) 1994-12-05 1996-09-17 Pettit; John W. Method for Automated DNA sequencing
US6362002B1 (en) 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5795782A (en) 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
JPH10512959A (ja) 1995-09-19 1998-12-08 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 多光子レーザ顕微鏡法
US5717602A (en) 1996-02-05 1998-02-10 Kenning; Gregory G. Automated electrophoresis and analysis system
US6984491B2 (en) 1996-07-29 2006-01-10 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
NL1006323C2 (nl) * 1997-06-16 1998-12-17 Mierij Meteo Bv Geintegreerd optisch golfgeleider systeem.
JPH1138241A (ja) * 1997-07-14 1999-02-12 Tomoegawa Paper Co Ltd フレキシブル光導波路素子及びその製造方法
US6123819A (en) 1997-11-12 2000-09-26 Protiveris, Inc. Nanoelectrode arrays
US6322968B1 (en) 1997-11-21 2001-11-27 Orchid Biosciences, Inc. De novo or “universal” sequencing array
CA2320390C (en) 1998-02-11 2010-06-08 Perkin-Elmer Corporation Pna and dna conjugates and methods for preparation thereof
US5965875A (en) 1998-04-24 1999-10-12 Foveon, Inc. Color separation in an active pixel cell imaging array using a triple-well structure
SE520951C2 (sv) * 1998-06-17 2003-09-16 Ericsson Telefon Ab L M Multivåglängdsselektiv switch för switchning och omdirigering av optiska våglängder
US6432364B1 (en) * 1998-07-06 2002-08-13 Suzuki Motor Corporation SPR sensor cell and immunoassay apparatus using the same
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
JP2000173093A (ja) 1998-12-07 2000-06-23 Hitachi Ltd 光学素子および情報記録再生装置
DE69930310T3 (de) 1998-12-14 2009-12-17 Pacific Biosciences of California, Inc. (n. d. Ges. d. Staates Delaware), Menlo Park Kit und methode zur nukleinsäuresequenzierung einzelner moleküle durch polymerase synthese
US6834149B1 (en) * 1999-02-09 2004-12-21 Xoetronics, Llc Optically confined birefringent chalcopyrite heterostructure devices and operating methods
FR2790005B1 (fr) 1999-02-22 2004-01-30 Commissariat Energie Atomique Procede de fabrication de morpholino-nucleotides, et utilisation de ceux-ci pour l'analyse et le marquage de sequences d'acides nucleiques
US7123844B2 (en) 1999-04-06 2006-10-17 Myrick Michael L Optical computational system
US6680377B1 (en) 1999-05-14 2004-01-20 Brandeis University Nucleic acid-based detection
WO2000077861A1 (en) 1999-06-14 2000-12-21 Augusto Carlos J R P Stacked wavelength-selective opto-electronic device
US7060440B1 (en) 1999-09-01 2006-06-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Template-dependent nucleic acid polymerization using oligonucleotide triphosphates building blocks
DE60016533T2 (de) 1999-09-29 2005-12-15 Fuji Photo Film Co. Ltd., Minamiashigara Vorrichtung zur Erfassung eines Fluoreszenzbildes
JP4245787B2 (ja) 1999-09-29 2009-04-02 富士フイルム株式会社 蛍光画像取得方法および装置
GB9928849D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Secr Defence Brit Surface plasmon resonance
US6510263B1 (en) * 2000-01-27 2003-01-21 Unaxis Balzers Aktiengesellschaft Waveguide plate and process for its production and microtitre plate
US6413792B1 (en) 2000-04-24 2002-07-02 Eagle Research Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US6917726B2 (en) 2001-09-27 2005-07-12 Cornell Research Foundation, Inc. Zero-mode clad waveguides for performing spectroscopy with confined effective observation volumes
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
WO2002004680A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
US20070172866A1 (en) 2000-07-07 2007-07-26 Susan Hardin Methods for sequence determination using depolymerizing agent
EP2371942A3 (en) 2000-08-14 2012-11-28 University of Maryland, Baltimore County Bioreactor and bioprocessing technique
FR2813121A1 (fr) 2000-08-21 2002-02-22 Claude Weisbuch Dispositif perfectionne de support d'elements chromophores
US7384797B1 (en) * 2000-10-12 2008-06-10 University Of Utah Research Foundation Resonant optical cavities for high-sensitivity high-throughput biological sensors and methods
JP3690271B2 (ja) 2000-11-29 2005-08-31 株式会社島津製作所 核酸の塩基配列決定のためのマトリックス値を得る方法
MXPA03007070A (es) 2001-02-07 2004-10-15 Massachusetts Inst Technology Sistema de deteccion optoelectronico.
JP2005507489A (ja) 2001-02-23 2005-03-17 ジェニコン サイエンスィズ コーポレーション 検体分析において拡張ダイナミックレンジを提供する方法
CA2440656A1 (en) 2001-03-09 2002-09-19 Apollo Biotechnology, Inc. Conjugate probes and optical detection of analytes
EP1368497A4 (en) 2001-03-12 2007-08-15 California Inst Of Techn METHOD AND DEVICE FOR ANALYZING POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ASYNCHRONOUS BASE EXTENSION
US6892002B2 (en) 2001-03-29 2005-05-10 Ibsen Photonics A/S Stacked planar integrated optics and tool for fabricating same
AU2002322348A1 (en) 2001-06-28 2003-03-03 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Methods of preparing multicolor quantum dot tagged beads and conjugates thereof
JP4061057B2 (ja) 2001-12-04 2008-03-12 Ｎｔｔエレクトロニクス株式会社 フォトダイオード
AU2003209361A1 (en) 2002-01-25 2003-09-02 Large Scale Proteomics Corporation Microarrays produced by cross-sectioning multi-sample plates
US7157229B2 (en) 2002-01-31 2007-01-02 Nimblegen Systems, Inc. Prepatterned substrate for optical synthesis of DNA probes
JP4280720B2 (ja) 2002-02-14 2009-06-17 日本碍子株式会社 試料解析装置および試料解析方法
JP2003270131A (ja) 2002-03-19 2003-09-25 Matsushita Electric Ind Co Ltd 特定成分の濃度測定方法
JP4156856B2 (ja) 2002-03-29 2008-09-24 オリンパス株式会社 レーザ走査型顕微鏡システム、システム制御方法およびシステム制御をコンピュータに実行させる制御プログラム
JP2004029205A (ja) 2002-06-24 2004-01-29 Olympus Corp レーザ走査型顕微鏡
CA2518588A1 (en) 2002-07-25 2004-02-05 Mj Bioworks Incorporated Hybrid dna polymerase proteins having increased polymerase to exonuclease activity
US20040038331A1 (en) 2002-08-23 2004-02-26 Reddy M. Parameswara Solid phase synthesis of biomolecule conjugates
US7666645B2 (en) 2002-10-23 2010-02-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sso7-polymerase conjugate proteins
JP3968425B2 (ja) * 2002-11-13 2007-08-29 独立行政法人産業技術総合研究所 光導波路への光導入方法及びそれを用いた光導波路分光測定装置
JP3848623B2 (ja) 2003-01-16 2006-11-22 松下電器産業株式会社 蛍光測定装置
WO2004071155A2 (en) 2003-02-05 2004-08-26 Amersham Biosciences Corp Solid phase sequencing
US7316930B1 (en) 2003-04-21 2008-01-08 National Semiconductor Corporation Use of vertically stacked photodiodes in a gene chip system
EP1496362B1 (en) 2003-07-09 2006-12-13 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Turbidimetric immunoassay and an apparatus therefor
WO2005019419A2 (en) 2003-07-31 2005-03-03 Singulex, Inc. Co-detection of single polypeptide and polynucleotide molecules
US7218812B2 (en) * 2003-10-27 2007-05-15 Rpo Pty Limited Planar waveguide with patterned cladding and method for producing the same
JP4498082B2 (ja) 2003-10-30 2010-07-07 パナソニック株式会社 光学分析装置およびその粒子カウント方法
JP2005165256A (ja) 2003-11-11 2005-06-23 Nitto Denko Corp 保護層付き光導波路
CA2557177A1 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Stephen Quake Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
JP4214523B2 (ja) 2004-02-27 2009-01-28 オプテックス株式会社 受動型赤外線感知器
US7445898B2 (en) 2004-04-01 2008-11-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Quantitative amplification with a labeled probe and 3′ to 5′ exonuclease activity
WO2005098379A1 (en) 2004-04-08 2005-10-20 Purdue Research Foundation Multi-spectral detector and analysis system
US20080026380A1 (en) 2006-07-31 2008-01-31 Siddiqi Suhaib M Nucleotide analogs
JP4899344B2 (ja) * 2004-06-29 2012-03-21 富士ゼロックス株式会社 表面発光型半導体レーザおよびその製造方法
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
JP2008513782A (ja) 2004-09-17 2008-05-01 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド 分子解析のための装置及び方法
JP2006090718A (ja) * 2004-09-21 2006-04-06 Fuji Photo Film Co Ltd 全反射減衰を利用した測定装置
US7361516B2 (en) 2004-09-24 2008-04-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Field of modular multifunctional ligands
CN100539246C (zh) * 2004-09-27 2009-09-09 皇家飞利浦电子股份有限公司 照明系统
EP1817572A2 (en) 2004-11-16 2007-08-15 Helicos Biosciences Corporation An optical train and method for tirf single molecule detection and analysis
US20070273290A1 (en) * 2004-11-29 2007-11-29 Ian Ashdown Integrated Modular Light Unit
US20070141598A1 (en) 2005-02-09 2007-06-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleotide Compositions and Uses Thereof
US7682816B2 (en) * 2005-04-07 2010-03-23 454 Life Sciences Corporation Thin film coated microwell arrays and methods of using same
US7738086B2 (en) 2005-05-09 2010-06-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Active CMOS biosensor chip for fluorescent-based detection
JP2009503548A (ja) 2005-08-02 2009-01-29 ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデイション 金属ナノキャビティを含むバイオセンサー
US7805081B2 (en) 2005-08-11 2010-09-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for monitoring multiple optical signals from a single source
US20100304358A1 (en) 2005-08-15 2010-12-02 Shuming Nie Methods of identifying biological targets and instrumentation to identify biological targets
CN1940529B (zh) 2005-09-29 2010-09-01 株式会社东芝 光波导型生物化学传感器芯片及其制造方法
US7986989B2 (en) 2005-09-29 2011-07-26 The Research Foundation Of The City University Of New York Phosphorescence and fluorescence spectroscopy for detection of cancer and pre-cancer from normal/benign regions
JP2009511896A (ja) * 2005-10-12 2009-03-19 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 全ポリマー光導波路センサ
TWI337254B (en) * 2005-11-11 2011-02-11 Nat Univ Chung Cheng Localized surface plasmon resonance sensing system and method thereof
ATE518010T1 (de) 2005-12-22 2011-08-15 Pacific Biosciences California Aktive oberflächengekoppelte polymerasen
WO2007091280A1 (en) 2006-02-06 2007-08-16 Stmicroelectronics S.R.L. Optical apparatus and method for the inspection of nucleic acid probes by polarized radiation
EP1989925A1 (en) 2006-02-23 2008-11-12 TIR Technology LP System and method for light source identification
US7858386B2 (en) 2006-03-07 2010-12-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method of controlling quantum dot photoluminescence and other intrinsic properties through biological specificity
US20080050747A1 (en) * 2006-03-30 2008-02-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing and using same
US8975216B2 (en) * 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
US7282337B1 (en) 2006-04-14 2007-10-16 Helicos Biosciences Corporation Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
US9377407B2 (en) 2006-04-19 2016-06-28 It-Is International Limited Reaction monitoring
US7709808B2 (en) 2006-05-16 2010-05-04 Applied Biosystems, Llc Systems, methods and apparatus for single molecule sequencing
WO2007137119A2 (en) 2006-05-17 2007-11-29 Luminex Corporation Chip-based flow cytometer type systems for analyzing fluorescently tagged particles
US8637436B2 (en) 2006-08-24 2014-01-28 California Institute Of Technology Integrated semiconductor bioarray
US7486865B2 (en) 2006-06-12 2009-02-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates for performing analytical reactions
KR100796985B1 (ko) 2006-06-30 2008-01-22 연세대학교 산학협력단 금박막이 부분 증착된 다기능성 나노입자
EP2067021A2 (en) 2006-09-14 2009-06-10 Oxford Gene Technology IP Limited Apparatus for imaging single molecules
US7652767B2 (en) * 2006-10-19 2010-01-26 Sporian Microsystems, Inc. Optical sensor with chemically reactive surface
AU2007309504B2 (en) 2006-10-23 2012-09-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US7853108B2 (en) * 2006-12-29 2010-12-14 Massachusetts Institute Of Technology Fabrication-tolerant waveguides and resonators
JP2010516304A (ja) * 2007-01-19 2010-05-20 サニーブルック・ヘルス・サイエンシズ・センター 超音波と光学を複合した画像手段を有する撮像プローブ
CA2677833C (en) 2007-01-22 2016-05-03 Wafergen, Inc. Apparatus for high throughput chemical reactions
EP2115433A1 (en) * 2007-02-08 2009-11-11 Koninklijke Philips Electronics N.V. Biosensor with evanescent waveguide and integrated sensor
EP2126072A4 (en) 2007-02-21 2011-07-13 Life Technologies Corp MATERIALS AND METHOD FOR THE INDIVIDUAL MOLECULE SEQUENCING OF NUCLEIC ACIDS
CN101802220B (zh) 2007-07-26 2013-07-31 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 分子冗余测序法
US7960116B2 (en) 2007-09-28 2011-06-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleic acid sequencing methods and systems
CN101168773B (zh) 2007-10-16 2010-06-02 东南大学 一种基于荧光淬灭的核酸测序方法
US7767441B2 (en) 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
WO2009067628A1 (en) 2007-11-20 2009-05-28 Applied Biosystems Inc. Reversible di-nucleotide terminator sequencing
EP2274446B1 (en) 2008-03-31 2015-09-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Two slow-step polymerase enzyme systems and methods
CA2720247C (en) 2008-03-31 2020-07-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single molecule loading methods and compositions
US7893468B2 (en) 2008-05-30 2011-02-22 International Business Machines Corporation Optical sensor including stacked photodiodes
GB2461026B (en) * 2008-06-16 2011-03-09 Plc Diagnostics Inc System and method for nucleic acids sequencing by phased synthesis
US8481264B2 (en) 2008-09-19 2013-07-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Immobilized nucleic acid complexes for sequence analysis
US8486630B2 (en) 2008-11-07 2013-07-16 Industrial Technology Research Institute Methods for accurate sequence data and modified base position determination
WO2010141105A2 (en) 2009-01-23 2010-12-09 Bae Systems Information And Electronic Systems Integration Inc. Quantum dot-sensory array for biological recognition
US9778188B2 (en) 2009-03-11 2017-10-03 Industrial Technology Research Institute Apparatus and method for detection and discrimination molecular object
US8603792B2 (en) 2009-03-27 2013-12-10 Life Technologies Corporation Conjugates of biomolecules to nanoparticles
WO2011031313A2 (en) * 2009-09-11 2011-03-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. Zero-mode waveguides with non-reflecting walls
US8367159B2 (en) * 2009-09-11 2013-02-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for producing ZMWs with islands of functionality
CN101654712A (zh) 2009-10-10 2010-02-24 上海交通大学 核酸单分子测序方法
WO2011063332A2 (en) 2009-11-23 2011-05-26 3M Innovative Properties Company Microwell array articles and methods of use
US8603741B2 (en) 2010-02-18 2013-12-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps
US9482615B2 (en) 2010-03-15 2016-11-01 Industrial Technology Research Institute Single-molecule detection system and methods
US9670243B2 (en) 2010-06-02 2017-06-06 Industrial Technology Research Institute Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US8865077B2 (en) 2010-06-11 2014-10-21 Industrial Technology Research Institute Apparatus for single-molecule detection

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7361466B2 (en) * 1999-05-19 2008-04-22 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid analysis using terminal-phosphate-labeled nucleotides
US20020110839A1 (en) * 2000-04-28 2002-08-15 David Bach Micro-array evanescent wave fluorescence detection device
US20050201899A1 (en) * 2002-10-30 2005-09-15 Genewave Device for supporting chromophore elements
JP2005127795A (ja) * 2003-10-22 2005-05-19 Toyo Glass Co Ltd ウエルプレート及びその製造方法
JP2006220645A (ja) * 2005-01-14 2006-08-24 Inoac Corp 診断用容器およびその処理方法
US20100065726A1 (en) * 2006-09-01 2010-03-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates and optical systems and methods of use thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI701472B (zh) * 2018-05-29 2020-08-11 精準基因生物科技股份有限公司 檢測裝置

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