KR20160084503A - 단일분자 검출장치 - Google Patents

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Abstract

광을 방출할 수 있는 대상물을 검출하는 장치에 관한 것이다. 이 장치는 광원(102) 및 도파관(110)을 포함한다. 도파관(110)은 코어층(112) 및 제1 클래딩층(114)을 포함한다. 적어도 하나의 나노웰(120)이 상기 적어도 제1 클래딩층(114)에 형성되어 있다. 상술한 장치는 광검출기(106) 및 광학필터(160)를 더 포함한다. 이 광검출기(106)는 적어도 하나의 나노웰(120)에 함유된 단일분자물로부터 방출되는 광을 검출할 수 있다.

Description

단일분자 검출장치{APPARATUS FOR SINGLE-MOLECULE DETECTION}
본 발명은 검출장치 및 이 장치를 이용하여 대상물(object)을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단일분자물(single molecule object) 등의 대상물로부터 방출되는 저강도 광을 검출할 수 있는 검출장치에 관한 것이다.
인간 게놈 프로젝트(HGP)는 유전자 시퀀싱 즉 서열확인(sequencing)의 증가에 박차를 가했으며 기술적 개선에 따라 서열확인에 드는 비용이 감소하는 결과를 낳았다. 지난 13년간 거의 30억 달러에 달하는 비용 대비 게놈 서열확인 비용은 대폭 감소하였으며, 실제로, 2종의 인간 게놈이 최근 완성되었다(McGuire et al., Science 317:1687 (2007)). 인간 게놈은, 환자 및 의료진 양측에 대해 의학적 치료에 관련한 패러다임 변화를 나타낸다. 질병에 관한 유전적 위험인자를 관리함으로써, 의료진은 보다 수월하게 예방적 의료조치를 취할 수 있으며 개별적인 맞춤형 치료를 제공할 수 있다. 완성 게놈을 보유한 대형 은행의 도움을 받아 약물 설계 및 투약을 더욱 효율적으로 수행할 수 있으며, 초기 약물유전학 분야로 확대되고 있다.
가장 일반적인 화학 혹은 생화학 분석법은 "대량"(bulk) 측정에 기초를 두고 있다. 이러한 측정법에서는, 소정량의 시료액에서 다수의 분자가 일으키는 집단운동을 측정하므로써 이들 분자의 특성을 결정한다. 최근에, 단일분자를 검출하는 것이 가능해졌다. 단일분자 검출방식은 화학 및 생화학 분석법에 있어서 또 다른 선택안으로서 종래의 대량 측정방식과 비교 시 더 우수한 감도 및 더욱 상세한 정보를 제공하는 것이며, 이내 새로운 트렌드가 되었다. 단일분자 검출을 달성하는 기준에 대한 개관은 예컨대, Moerner et al. (Moerner and Fromm, "REVIEW ARTICLE: Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy", Review of Scientific Instruments 74(8): 3597-3619 (2003)) 및 Walter et al. (Walter, et ai., "Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit", Nature Methods 5: 475-489 (2008)) 등의 연구논문에서 검토하였다. 이들 논문은 또한 단일분자 검출에 사용 혹은 제시된 방법과 장치에 대해 검토하고 있다,
미국 특허 제7,10,050호는 0점 모드 도파관(zero-mode waveguide: ZMW)을 개시한다. ZMW는 금속막과 다수의 공동으로 이루어졌으며 이들 공동이 ZMW의 코어 영역을 구성한다. ZMW에 있어서, 컷오프 파장보다 긴 파장을 갖는 광의 전파는 코어 영역 내에서 금지된다. 컷오프 파장보다 긴 파장의 광이 도파관의 입구(10)에 입사하면, 광은 코어 영역의 종방향으로 전파되지 않는다. 대신에, 광의 강도가 상술한 코어 영역의 종방향으로 기하급수적으로 붕괴하여 도파관 입구에 순간 영역을 형성한다. 이 결과로, 분자가 여기하고 방출된 형광광이 공초점 현미경에 포집되는 특이적인 여기 영역이 형성된다. 그러나 공초점 현미경의 개구수(NA)에 따라 검출가능한 ZMW의 수가 제한되며 따라서 처리량도 한정된다. 미국 특허 제7,486,865호에서는 ZMW를 바닥기판의 내부까지 연장시킨 매입형 ZMW를 제공한다. 이와 같은 구성에 따라 도파관 하부에 놓인 광학체에 대하여 더 높은 신호레벨 및 가변성이 더 큰 관측량을 제공할 수 있다. 그러나, 위와 같은 구성은 규모 확대 및 처리량 제한이라는 문제점을 안게 된다.
그러므로 대상물 검출장치, 특히 단일분자물 같은 저강도 광을 방출하는 결합를 검출하는 장치가 요망된다.
본 발명에 따르면, 광을 방출할 수 있는 대상물을 검출하는 장치를 제공한다. 이 장치는 도파관을 포함한다. 이 도파관은 코어층 및 제1 클래딩층(덮개층)을 포함한다. 적어도 하나의 나노웰이 적어도 하나의 제1 클래딩층 내에 형성되어 있다. 상기 장치는 광검출기를 더 포함한다. 광검출기는 적어도 하나의 나노웰에 함유된 단일분자물로부터 방출된 광을 검출할 수 있다.
본 발명에 따르면, 단일분자 검출장치를 제공하되, 해당 단일분자 검출장치는, a) 기판 위에 형성되고, 코어층과 제1 클래딩층을 포함하되, 적어도 상기 제1 클래딩층에 적어도 하나의 나노웰이 형성되어 있는, 도파관(waveguide); b) 상기 기판 상에 또는 상기 기판 내에 형성된 적어도 하나의 광검출기; 및 c) 상기 도파관과 상기 광검출기 사이에 배치되어, 대상체로부터 방출된 광을 통과시키지만 여기광에 의해 발생된 잡음을 저감시키는 광학필터를 포함하고, 상기 적어도 하나의 나노웰과 상기 광검출기는 상기 도파관의 대향면에 각각 배치된다.
참고로, 본 발명에 따르면, 단일분자를 검출하는 방법을 제공하며 이 방법은: (a) 광원을 이용하여 입사광을 방출하는 단계; (b) 커플러를 통해 상기 입사광을 도파관에 결합하고, 도파관 내에 여기광을 형성하는 단계; (c) 여기광 및, 도파관에 있는 적어도 하나의 클래딩층 내에 형성된, 적어도 하나의 나노웰을 이용하여 유효 여기 영역을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 단일분자물이 광을 방출시키고 해당 방출된 광을 검출기로 검출하도록, 상기 여기광을 이용하여 상기 유효 여기 영역 내의 단일분자물을 여기시키는 단계를 포함한다.
참고로, 본 발명에 따르면, 핵산의 서열확인 방법을 제공하며 이 방법은: (a) 코어층 및 제1 클래딩층을 갖는 도파관; 적어도 제1 클래딩층에 형성된 적어도 하나의 나노웰; 및 검출기를 포함하는 검출장치를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 핵산 분자를 제공하는 단계; (c) 적어도 하나의 핵산 분자를 상기 적어도 하나의 나노웰 내에 각각 위치시키는 단계; (d) 단일분자 서열확인 및 적어도 하나의 핵산 분자를 합성하는 단계(상기 단일분자형 핵산 서열확인 및 이의 합성은 핵산내 적어도 하나의 염기의 존재와 상관관계가 있는 광 방출을 유도함); (e) 검출기로 광을 검출하여 출력 신호를 발생하는 단계; 및 (f) 이 출력신호를 처리하여 핵산내 적어도 하나의 염기의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명에 의한 광검출기는 적어도 하나의 나노웰(120)에 함유된 단일분자물로부터 방출되는 광을 검출할 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적 및 장점은 다음과 같은 상세한 설명에 일부 기술되고 또한 일부는 그 내용으로부터 명확히 이해할 수 있을 것이며, 혹은 본 발명의 실현에서 습득할 수도 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 첨부된 특허청구의 범위에서 구체적으로 언급한 원소 및 그의 조합을 이용함으로써 실현 및 성취하게 된다.
상술한 일반적인 내용 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시 및 구체적인 설명을 위한 것이며 본 발명의 권리범위를 한정하지 않는 것으로 이해한다.
본 명세서의 일부로서 수록된 별첨 도면은 본 발명의 하나(혹은 다수)의 양상(혹은 구현예)를 예시하는 것으로서, 상세한 설명과 더불어 본 발명의 기본 원리를 구체적으로 설명하기 위한 것이다.
도 1은 본 발명과 일치하는 검출장치의 개략도;
도 2는 본 발명과 일치하는 상이한 크기의 나노웰을 도시한 개략도;
도 3은 본 발명과 일치하는 나노웰 디자인을 도시한 개략도;
도 4는 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 5는 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 6은 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 7은 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 8은 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 9는 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 10은 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 11은 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 12는 본 발명과 일치하는 흡수-방출광 커플러를 도시한 도면;
도 13은 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 14는 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 15는 본 발명의 한 구현예에 따른 검출장치를 도시한 개략도;
도 16a 내지 도 16d는 상이한 나노웰에 대한 컴퓨터-시뮬레이션 결과를 도시한 도면;
도 17a 및 도 17b는 금속 격자구조의 깊이 및 주기에 대한 도 5에 도시된 금속 격자구조를 통과하는 TE 및 TM 광의 투과율 의존도를 도시한 도면이고, 도 17c는 도 17a에 대한 도 17b에 도시된 데이타의 비를 도시한 도면;
도 18a 및 18b는 광의 입사각에 대한 도 5에 도시된 금속 격자구조를 통과하는 광의 투과율 의존도를 도시한 도면;
도 19는 도 20에 도시된 검출장치에 대한 컴퓨터-시뮬레이션 결과를 도시한 도면;
도 20은 커플러로서 프리즘을 이용하는 검출장치의 예를 개략적으로 도시한 도면;
도 21은 도 7에 도시된 검출장치의 도파관에 결합한 입사광의 모사 반점(simulated speckle)을 도시한 도면;
도 22a 및 도 22b는 도 20에 도시된 시뮬레이션을 위한 검출장치에 이용된 렌즈를 도시한 도면;
도 23은 도 9에 도시된 검출장치의 도파관에 결합한 광의 전력 측정값을 도시한 도면;
도 24는 도 8에 도시된 검출장치에 대한 컴퓨터-시뮬레이션 결과를 도시한 도면;
도 25는 도 9에 도시된 검출장치에 대한 컴퓨터-시뮬레이션 결과를 도시한 도면.
소규모의 벌크 분석(bulk assay)을 포함한 종래의 대량 분석용 장치 및 단일분자 검출장치는 다수의 중요한 구성요소를 공유하기도 하며 유사한 장치 구조를 갖기도 한다. 그러나, 단일분자 검출을 실현함에 있어서, 그 장비는 적어도 다음과 같은 두 가지 기준을 만족할 필요가 있다: 1) 한정된 여기 공간 및 한정된 관측 공간을 확보해야 하는 점, 및 2) 상기 두 공간은 완전 혹은 부분적으로 중복되고, 이 중복 영역은 목표가 되는 단일분자로부터 방출한 광이 검출가능한 신호-노이즈비(SNR)를 제공하는 백그라운드보다 높은 상태를 확보하기에 충분할 정도로 작아야 한다는 점이다. 예를 들어, 중복 영역의 크기는 아토 리터(atto-liter) 내지 젭토 리터(zepto liter) 범위이어야 한다. 더욱이, 여기광이 검출기에 도달하지 않도록 방지하는 것도 중요하다.
본 발명과 일치하는 구현예들은 검출장치 및 이 검출장치를 사용하여 대상물, 예컨대, 단일분자물을 검출하는 방법을 포함한다. 검출장치는 대상물로부터 방출하는 미약한 광을 검출할 수 있다.
이하, 본 발명에 상응하는 구현예들을 도면을 참조하여 상세히 기술한다. 가능한 한 동일한 참조부호는 전 도면에서 동일하거나 유사한 부분에 대하여 일괄 적용하기로 한다.
1. 본 발명의 장치
한 양상에서, 본 발명은 단일분자물 등의 대상물을 검출할 수 있는 검출장치에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 대상물은 발광원 예컨대 형광염료 분자, 인광염료 분자, 양자점 혹은 발광 나노입자 등을 포함한다. 이 대상물은 또한 광산란 입자일 수도 있다. 또한, 상기 대상물은 광 방출능력이 없는 타겟 분자일 수도 있으나 광을 방출할 수 있는 표지체(labeling object)(예컨대, 형광염료 분자, 인광염료 분자, 또는 양자점)에 부착되기도 한다. 어떤 표지체는 특이적인 타겟 분자에 결합할 수 있다. 따라서, 타겟 분자는 표지체를 통해 식별할 수 있다. 하나 이상의 표지체가 타겟 분자에 결합하기도 한다.
1.1. 장치 소개
본 발명과 일치하는 검출장치는 광을 방출하고 또한 대상물을 여기할 여기광인 도파관 속에 적어도 부분적으로 결합될 수 있는 적어도 하나의 광원을 포함한다. 이 광원은 예를 들어, He-Ne 레이저 등의 레이저 및 레이저 다이오드(LD), 발광 다이오드(LED), 유기발광 다이오드(OLED), 양자점 발광 다이오드(QLEOD), 섬유광 혹은 아크 방전 형광램프 등을 들 수 있다.
본 발명과 일치하는 검출장치는 도파관을 포함한다. 도파관은 채널형 도파관이나 평면형 도파관일 수 있다. 도파관은 코어층과 적어도 하나의 클래딩층을 포함한다. 예를 들어, 도파관이 채널형 도파관인 경우 코어층 및 이를 덮는 클래딩층을 포함한다. 또 다른 예로서 평면형 도파관의 경우 코어층과 코어층 상에 배치된 하나의 클래딩층 혹은 코어층을 사이에 끼운 두개의 클래딩층을 구비할 수 있다. 코어층은 적어도 하나의 클래딩층보다 큰 굴절률을 갖는다. 여기광은 도파관의 코어층으로 침투한다.
본 발명에 있어서, 적어도 하나의 나노웰이 상기 적어도 하나의 클래딩층 안에 형성된다. 나노웰은 상측의 개구부 및 바닥면을 포함하며 이 상측 개구부는 바닥면보다 크다. 나노웰은 상기 적어도 하나의 클래딩층의 부분 두께, 적어도 하나의 클래딩층의 전체 두께, 적어도 하나의 클래딩층의 전체 두께 및 코어층의 부분 두께, 혹은 적어도 하나의 클래딩층의 전체 두께 및 코어층의 전체 두께를 관통하여 연장할 수 있다. 유효 여기 영역은 나노웰의 바닥면 근처에 형성된다. 유효 여기 영역의 하부 경계는 나노웰의 바닥이다. 유효 여기 영역의 상부 경계는, 여기광이 코어층의 종방향에 수직인 방향(이하, 수직방향)으로 나노웰에 도달할 수 있는 거리에 의해 결정된다.
본 발명과 일치하는 검출장치는 복수의 나노웰을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 장치는 다수의 대상물을 모니터하는데 이용할 수 있다.
본 발명과 일치하는 검출장치는 대상물로부터 방출된 광을 검출하는 광검출기를 포함한다. 본 발명에 있어서, 광검출기는 적어도 부분적으로 이에 입사된 광을 흡수하고 이 광에 대응하는 출력 신호를 방출할 수 있는 광학센서를 포함한다. 광학센서는 예를 들어, p-n 광다이오드, p-i-n 광다이오드, 다중접합 광다이오드, 아발란체 광다이오드(avalanche photodiode: APD), 광트랜지스터, 양자-우물 적외선 광검출기(quantum-well infrared photodetector: QWIP), 광도전형 광학센서, 광기전력형 광학센서, 박막 온 ASIC(thin-film on ASICTFA), 금속-반도체-금속(metal-semiconductor-metal: MSM) 광검출기, 전하결합 소자(charge coupled device: CCD), CMOS 센서, 혹은 이들의 조합체 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 광검출기는 광검출기의 조작을 조절하는 제어회로를 포함한다. 제어회로는 신호증폭기의 회로, A/O 컨버터, 적분기, 비교기, 논리 회로, 정전용량 측정회로(readout circuit), 메모리, 마이크로프로세서, 시계 및 어드레스 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, 광검출기는 대상물로부터 방출된 광이 도달할 수 있는 장소에 배치된다. 예를 들어, 광검출기는 나노웰에 관련하여 코어층의 반대 측에 배치된다. 즉, 나노웰이 수직 방향으로 코어층의 한 측면에 배치될 경우 광검출기는 상기 코어층의 다른 측면에 수직 방향으로 배치될 수 있다.
본 발명과 일치하는 검출장치는 광 커플러를 포함한다. 광 커플러는 적어도 하나의 광원에서 방출된 광의 일부를 도파관 속으로 결합시킨다. 광 커플러는 예를 들어, 프리즘 커플러, 격자구조 커플러, 측면주사 커플러, 수직주사 커플러, 혹은 양방향 커플러 등이 있다.
1.2. 장치의 예
도 1에는 본 발명과 일치하는 검출장치(100)의 개략도가 도시되어 있다. 어떤 구현예에서, 검출장치(100)는 광원(102), 광 커플러(104), 광검출기(106) 및 평면형 도파관(110)을 포함한다. 이 평면형 도파관(110)은 기판(도시 생략) 상에 설치되어 있다.
광검출기(106)는 기판상에 혹은 기판 내부에 형성되기도 한다. 광원(102)은 광을 방출하며 광 커플러(104)에 의해 평면형 도파관(110)에 부분적으로 결합되기도 한다. 평면형 도파관(110)에 결합된 광은 평면형 도파관(110)의 코어층에 침투하여 여기광 역할을 할 수 있다.
1.2.1. 도파관
도 1에서 보는 바와 같이, 어떤 구현예에 있어서 평면형 도파관(110)은 코어층(112), 상부 클래딩층(114) 및 하부 클래딩층(116)을 포함한다. 코어층(112)은 굴절률이 n2인 물질, 예컨대, 산화 실리콘-티타늄(SixTi1-xO2, 여기서 0 < x < 1), 산화 티타늄, 산화 탄탈륨, 산화 니오븀, 산화 하프늄, 산화 알루미늄, 산화 지르코늄, 질화 실리콘, 질화 알루미늄, 질화 티타늄, 폴리카보네이트(PC), PMMA 혹은 Su8 등을 포함한다. 상부 및 하부 클래딩층(114 및 116)은 굴절률이 각각 n3 및 n4인 물질을 포함할 수 있다. 상부 및 하부 클래딩층(114 및 116)의 재료는 동일하거나 혹은 상이할 수 있다. 이들 상부 클래딩층(114) 및 하부 클래딩층(116)에 적절한 재료는 예를 들어, 산화 실리콘, 플루오르화 마그네슘, 플루오르화 칼슘, 산화 알루미늄, Su8, PMMA, 폴리카보네이트 등을 포함할 수 있다. 코어층(112)의 굴절률 n2는 상부 및 하부 클래딩층(114 및 116)의 각각의 굴절률 n3 및 n4 보다 크다.
상기한 바와 같이, 단일분자 검출에서 여기광이 검출기에 도달하지 않도록 방지하는 것이 필요하다. 평면형 도파관의 경우 코어층의 표면은 원하는 만큼 매끄럽지 않을 수가 있다. 코어층의 거친 표면은 여기광을 일부 산란시킨다. 표면 조도(거칠기)가 약 0.3㎚인 코어층의 경우, 약 0.01%의 여기광이 산란하여 노이즈를 발생할 수 있다. 코어 내부에 침투하는 여기광의 표면 산란에 의해 발생하는 노이즈를 감소시키기 위하여, 코어의 표면 조도는 약 0.3㎚보다 작아야 한다.
1.2.2. 나노웰
어떠 구현예에서, 적어도 하나의 나노웰(120)이 적어도 상부 클래딩층(114)에 형성된다. 나노웰(120)의 상측 개구부는 나노웰(120) 바닥면보다 크다. 나노웰(120)의 형태는 제한이 없다. 예를 들어, 나노웰(120)의 수평 단면(횡단면)은 원형, 타원형, 직사각형, 정사각형 혹은 다이아몬드형 등이 될 수 있다. 도 2에서 보는 바와 같이, 나노웰(120) 바닥면의 크기 또한 제한이 없다. 예를 들어, 나노웰(120) 바닥면의 크기는 대체로 여기광의 파장보다 작다. 어떤 구현예에서, 나노웰(120) 바닥면의 크기는 여기광의 파장의 1/2, 1/4 혹은 1/8보다 작다. 여기서 "크기"란 나노웰(120)의 횡단면이 원형, 타원형 혹은 직사각형인 경우 각각의 직경, 장축의 길이 혹은 긴 변의 길이을 말한다. 나노웰(120)의 횡단면이 정사각형 혹은 다이아몬드형인 경우 상기 "크기"는 한 변의 길이를 말한다. 한 구현예에서, 나노웰(120)의 상측 개구부의 직경이 1 내지 10㎛이고 바닥면의 직경이 약 10 내지 500㎚ 일 경우, 나노웰 바닥면에 수직인 방향에 대한 나노웰 측벽의 각도는 약 60° 미만이 된다. 이러한 구성에 의해, 한 단일분자가 나노웰(120) 바닥면에 근접한 영역에 들어가므로 검출이 가능하다.
본 발명에 있어서, 여기광의 일부는 나노웰(120)에 침투하며 나노웰(120)의 공간적 제약과 더불어 유효 여기 영역(130)을 형성한다. 유효 여기 영역(130)은 나노웰(120)의 바닥면에 근접하여 형성된다. 대상물이 유효 여기 영역(130) 안으로 들어가면, 이는 여기광에 의해 여기되어 광검출기(106)가 검출할 광을 방출한다. 유효 여기 영역(130) 외부에 있는 대상물은 여기광에 의해 여기되지 못하거나 이로부터 방출된 광이 광검출기에 도달할 수 없다. 도면상의 쇄선이 유효 여기 영역(130) 경계부 주변을 개략적으로 도시하며 유효 여기 영역(130)의 상측 경계부의 형태는 이에 한정되지 않는 것으로 본다. 예를 들어, 유효 여기 영역의 상측 경계부는 곡선형태일 수 있다.
상이한 조건 즉, 나노웰의 위치 및/또는 도파관 속으로 연장되는 나노웰의 깊이에 따라, 상이한 유효 여기 영역이 형성된다. 또한, 유효 여기 영역의 전자기장은 예를 들어 소멸장, 소멸장과 전파장(travelling field)의 조합, 혹은 전파장 등이며 이에 대해 아래에서 더 상세히 설명한다.
도 3은 본 발명과 일치하는 상이한 나노웰 디자인의 예를 개략적으로 도시한다. 어떤 구현예에서, 나노웰(121)은 상부 클래딩층의 부분 두께를 통하여 연장한다. 어떤 구현예에서, 나노웰(122)은 상부 클래딩층의 전체 두께를 통하여 연장한다. 나노웰(121 혹은 122)에서, 여기광이 코어층에 침투하면 나노웰(121 혹은 122)의 전파광은 아니어도 상기 코어층에 침투하는 광의 일부가 상기 나노웰(121 혹은 122)에 다소 침투하게 된다. 나노웰(121 혹은 122) 속으로 침투하는 광은 수직 방향으로 기하급수적으로 붕괴하여 소멸장을 형성하게 된다. 이 소멸장은 나노웰(121 혹은 122)의 공간적 제약과 더불어 유효 여기 영역(131 혹은 132)을 형성한다.
어떤 구현예에서, 나노웰(123)은 상부 클래딩층의 전체 두께 및 코어층의 부분 두께를 통하여 연장한다. 상기 나노웰(123)은 소멸장 외에도 전파장이 나노웰 속에 출현하며 이것이 유효 여기 영역(133)을 형성한다.
어떤 구현예에서, 나노웰(124)은 상부 클래딩층의 전체 두께 및 코어층의 전체 두께를 통하여 연장한다. 이 나노웰(124)의 경우, 나노웰의 전자기장은 대부분 전파장이며 또한 유효 여기 영역(134)이 형성된다.
나노웰(122)을 포함하는 평면형 도파관에서, 나노웰의 하단은 코어층 상측면의 우측에 위치하므로 유효 여기 영역(132)의 용적은 소멸장의 유효영역과 같으며 대체로 다음과 같은 식으로 계산할 수 있다.
V = π × (D/2)2 × h
여기서 D는 나노웰 바닥면의 직경이며 h는 나노웰 내의 소멸장 침투 깊이를 나타낸다. 예를 들어 D 및 h가 각각 100㎚ 이면 유효 여기 영역의 용적 계산값은 약 1 × 10-18 리터이며 이는 1 아토(atto) 리터와 같다.
어떤 구현예에서, 나노웰(120)의 표면 및 상부 클래딩층(114)의 표면(하기의 설명과 같이, 상부 클래딩층 위에 형성된 층인 상부 보호층의 표면)은 상이한 표면성질을 가질 수 있다. 이러한 표면성질은 예를 들면, 소수성, 작용기, 작용기 밀도, 재료 밀도, 또는 도전성 등을 포함한다.
어떤 구현예에서, 나노웰(120)의 측벽면은 친수성이고 실리콘, 실리카, 금속 혹은 금속 산화물 중에서 선택된 성분을 포함하는 반면, 나노웰(120)의 바닥면은 소수성이다. 그러나, 나노웰(120)의 바닥면이 친수성 재질로 제작된 경우 이는 소수성으로 개질할 수 있다. 예를 들어, 나노웰(120)의 바닥면이 친수성인 실리케이트 혹은 금속으로 제작된 경우, 예컨대 R1x-Si(O-R2)4-x(여기서 R1은 알킬 사슬 -(CH2)n-CH3 등의 소수성 기이고 R2는 CnH2n+1이며, 또한 여기서 x 는 정수로서 1≤ x ≤3이며 n 역시 정수이다)를 이용하거나 또는 예컨대 -COOH, -PO3H2, -SH 혹은 -NH2 중에서 선택된 작용기를 가진 고분자를 이용하여 상기 바닥면을 소수성으로 개질할 수 있다. 상기 나노웰(120)의 바닥면을 소수성화 하는 반면 나노웰(120)의 측벽면은 친수성을 그대로 유지함으로써, 검출 대상은 나노웰(120)의 바닥면에 근접한 유효 여기 영역 내에 유지되는 한편 나노웰(120)의 측벽면에 달라붙지 않게 된다. 이에 따라 이 대상물은 유효 여기 영역에 들어가는 여기광에 의해 효과적으로 여기된다.
어떤 구현예에서, 복수의 나노웰이 도파관에 형성된다. 또 어떤 구현예에서 복수의 나노웰 중 각각은 나노웰의 유효 여기 영역 내에 있는 대상물로부터 방출된 광을 검출하기 위해 광검출기를 구비할 수 있다. 어떤 구현예에서, 하나의 광검출기가 복수의 나노웰의 유효 여기 영역에 존재하는 대상물로부터 방출되는 광을 검출하는데 이용될 수 있다.
1.2.3. 보호층
어떤 구현예에서, 산란된 여기광을 흡수 및/또는 검출장치 외부의 주변광을 차단하기 위해 검출장치에 보호층을 형성하며, 이 결과로 신호-노이즈(S/N) 비가 증가한다. 도 4를 참고하면 어떤 구현예에서, 상부 보호층(142) 및 하부 보호층(144)이 상부 클래딩층(114)의 상측 및 하부 클래딩층(116)의 하측에 각각 형성된다. 즉, 상부 보호층(142)은 나노웰(120)과 도파관의 동일면 상에 형성되며, 하부 보호층(144)은 도파관의 대향면에 형성 및 하부 클래딩층(116)과 광검출기(106) 사이에 배치된다. 어떤 구현예에서, 검출장치는 그 내부에 상부 보호층(142)을 구비한다. 어떤 구현예에서, 검출장치는 그 내부에 하부 보호층(144)을 구비한다. 또 어떤 구현예에서, 검출장치는 그 내부에 상부 및 하부 보호층(142 및 144)을 모두 구비한다.
어떤 구현예에서, 상기 상부 및 하부 보호층(142 및 144)은 금속이나 합금 등의 불투명 재질로 제작된다. 상부 및 하부 보호층(142 및 144)은 서로 동일하거나 상이한 재질로 제작될 수 있다. 상부 및 하부 보호층(142 및 144)의 재질은 예를 들어, Al, Ti, Ni, Cr, Au, Cu, PT 또는 Pd, 혹은 이들 중 2종 이상으로 이루어진 합금을 포함한다.
어떤 구현예에서, 나노웰(120) 하부에 위치하는 하부 보호층(144) 내부에 핀홀(150)이 형성될 수 있다. 유효 여기 영역(130)에 존재하는 대상물로부터 방출된 광은 핀홀을 통과하며 광검출기(106)에 의해 검출된다.
어떤 구현예에서, 도 5에 도시된 바와 같이, 격자구조 역할을 하는 나노구조의 금속 패턴(152)이 핀홀 대신 하부 보호층(144)에 배치되기도 한다. 금속 패턴(152)의 피치(간격) 및 깊이를 적절히 설계함으로써, 대상물로부터 방출된 광은 대부분 금속 패턴(152)을 통과하지만 여기광에서 발원하는 노이즈는 최소화된다.
대상물에서 방출된 광은 TM 모드광이며 여기광은 TE 모드광이다. TM 모드광이나 TE 모드광이 금속 격자구조를 통과할 때의 투과율은 금속 패턴(152)의 피치(즉, 격자 주기) 및 깊이에 의존한다. 투과율은 또한 금속과 금속을 에워싸는 재질 간의 굴절 차이에 의존한다. 또한, 투과율은 금속 격자구조에 입사하는 광의 각도에도 의존한다. 따라서, S/N 비가 더 개선된다.
1.2.4. 광 커플러
도 1를 참조하면, 광 커플러(104)는 도파관에 근접 배치되거나 도파관 상에 혹은 그 내부에 형성될 수 있다. 광 커플러(104)는 광원(102)로부터의 입사광 중 적어도 일부를 도파관(110)에 결합시킬 수 있다.
어떤 구현예에서, 프리즘 커플러를 광 커플러(104)로 사용한다. 도 6에서 개략적으로 도시한 바와 같이, 프리즘 커플러는 프리즘(202)과 시준 렌즈(204)를 포함한다. 광원(102)에서 나온 입사광은 상기 시준 렌즈(204)에 의해 도파관(110)의 동일 위치에 촛점을 맞추게 된다. 도 6에서 보는 바와 같이, 입사광의 일부는 프리즘 커플러에 의해 도파관(110)에 결합되며 여기광으로서 코어층(112)에 침투한다. 도 6의 쇄선 곡선으로 표시된 바와 같이, 시준 렌즈(204)에 대한 광원의 위치 및/또는 입사광의 입사각에 따라 상이한 모드의 광이 도파관(110)에 결합되며 코어층(112)에 침투할 수 있다. 따라서, 도파관에 침투하는 여기광의 모드는 조정 및 선별이 가능하다. 어떤 구현예에서, 시준 렌즈(204)는 점 광원이 선 광원으로 확장하도록 특수 설계가 가능하며 이에 따라 측방향, 즉, 도 6에 도시된 도파관(110)의 단면에 수직인 방향으로 더 큰 면적을 커버하는 측확장 여기광을 제공할 수 있다.
어떤 구현예에서, 도 7에 개략적으로 도시한 바와 같이, 측면 커플러(302)를 광 커플러(104)로 사용한다. 측면 커플러(302)는 광학렌즈 모듈이다. 입사광은 측면 커플러(302)에 의해 도파관(110) 상에 초점을 맞추며 이에 결합된다. 또한 여기광으로서 코어층(112)에 침투한다.
어떤 구현예에서, 격자구조 커플러를 광 커플러(104)로 사용한다. 격자구조 커플러는 규칙적인 패턴으로된 광학요소로서 광을 상이한 방향으로 전파되는 수개의 광선으로 분할 및 회절시킨다. 따라서, 입사광의 일부는 도파관(110) 내로 도파되며 이 도파관(110)의 코어층(112)에 침투한다.
어떤 구현예에서, 도 8에 개략적으로 도시한 바와 같이, 격자구조 커플러는 상부 클래딩층(114)과 코어층(112) 사이의 계면에 배치된 제1 격자구조(402)를 포함한다. 하부 클래딩층(116)의 상면 및 하면으로부터 반사된 광의 간섭 탓에, 격자구조 커플러의 결합효율은 하부 클래딩층(116)의 두께에 의존한다.
상술한 바와 같이, 입사광은 코어층(112)에 전체 결합한다. 입사광 중 일부는 수직 방향으로 도파관(110)을 통과하여 사라진다. 어떤 구현예에서, 결합효율을 개선하기 위해, 반사기(도시생략)를 도파관(110) 하부에 배치할 수 있다. 반사기는 코어층(112)의 배면에 있는 하부 클래딩층(116)을 통과하는 광을 반사하므로, 부분적으로 코어층(112)에 결합하고 따라서 코어층(112)에 결합할 광의 총량을 증가시키는 원인이 된다.
어떤 구현예에서, 도 9에서 보는 바와 같이, 격자구조 커플러는 코어층(112)과 제2 클래딩층(116) 사이의 계면에 배치된 제2 격자구조(404)를 더 포함한다. 제2 격자구조(404)는 제1 격자구조(402)의 바로 밑에 배치된다. 어떤 구현예에서, 결합효율은 추가의 격자구조를 이용하면 더 높아진다. 예를 들어, 검출장치가 상부 및 하부 보호층을 구비하는 경우, 격자구조는 도 10에 개략적으로 도시한 바와 같이 상기 보호층과 클래딩층 사이의 계면에 배치될 수 있다.
어떤 구현예에서, 상부 클래딩층(114)의 일부를 제거하여 코어층(112)을 노출한다. 도 11에 도시된 격자구조(406) 등과 같은 격자구조는 코어층(112)의 노출부 상에 배치된다.
격자구조의 형상은 도 8 내지 도 11에 도시된 것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 결합효율을 증대하기 위해 어떤 구현예에서는 곡선 구성의 격자구조를 사용하는데 블레이즈(blaze) 격자구조나 다중레벨의 격자구조 등이 이에 속하며, 여기서 다중레벨 격자구조는 블레이즈 격자구조를 모방한 것으로서 블레이즈를 수개의 단차로 분할하여 형성된다.
어떤 구현예에서, 흡수-방출광 커플러를 이용하여 광을 도파관(110)에 간접적으로 결합시킨다. 도 12는 흡수-방출광 커플러를 개략적으로 도시한다. 흡수-방출광 커플러는 입사광을 흡수 및 형광광을 방출하는 발광층을 포함한다. 광원에서 방출하는 광은 흡수-방출광 커플러의 상면에 입사되며 형광광은 흡수-방출광 커플러의 측면으로부터 방출된다. 형광광의 일부는 도파관에 결합 및 대상물을 여기할 여기광으로서 도파관의 코어층에 침투한다. 전력 결합효율은 하기와 같이 계산된다:
Figure pat00001
여기서 λ1 및 λ2는 각각 입사광의 파장 및 흡수-방출광 커플러의 측면으로부터 방출되는 광의 파장이다. P0(λ1) 및 P(λ2)는 각각 입사광의 전력 및 도파관(110)의 코어층(112)에 결합하는 광의 전력이다. R1은 흡수-방출광 커플러와 하부 클래딩층(116) 간의 계면의 반사율이고, T1은 거리 d1를 투과한 후 흡수층에서 λ1의 파장을 갖는 광의 투과율이며 또한 T2는 거리 d3를 투과한 후 역시 흡수층에서 λ2의 파장을 갖는 광의 투과율이다. ΦFL은 광발광 재료의 광발광 양자이득이며 ηC 은 흡수-방출광 커플러의 결합효율이다. T3는 전체길이 d3의 도파관을 통과하는 흡수-방출광 커플러로부터 방출된 광의 투과율이다.
흡수-방출광 커플러에 있어서, 측면의 면적이 상면의 면적보다 훨씬 작기 때문에 흡수-방출광 커플러에서 방출하여 코어층(112)에 결합한 광의 전력 밀도가 흡수-방출광 커플러에 입사하는 광보다 훨씬 높다.
흡수-방출광 커플러에 이용되는 광발광 물질은 스톡스 변이(Stokes shift)에 근거하여 선별한다. 예를 들어, 광발광 물질은 약 30㎚ 에 상당하거나 이보다 큰 스톡스 변이를 제공한다. 어떤 구현예에서, 광발광 물질은 안트라센, 쿠마린, 피린, 스틸벤, 포르피린, 페릴렌, Alq3, 에코신, 보디피(Bodipy) 염료, 형광물질, 로다민, 폴리메틴 염료, DCM 또는 이의 유도체 등과 같은 광발광 염료이다. 어떤 구현예에서, 광발광 물질은 PPV나 그의 유도체 등의 발광 고분자이다. 어떤 구현예에서, 광발광 물질은 양자점, 산화 알루미나 혹은 산화아연 등의 무기 재료이다.
어떤 구현예에서, 결합효율은 격자구조를 흡수-방출광 커플러와 조합함으로써 더욱 증대한다. 조합형 광 커플러는 격자구조(502)와 흡수-방출광 물질(504)을 포함한다. 어떤 구현예에서, 도 13에 도시한 바와 같이, 조합형 광 커플러는 코어층(112)의 노출부 표면에 배치된다. 어떤 구현예에서, 도 14에 도시한 바와 같이, 조합형 광 커플러는 코어층(112) 내부에 배치된다. 격자구조는 흡수-방출재를 투과하는 입사광의 통과길이 연장에 일조하며 따라서 흡수-방출재에 흡수되는 광의 양이 증가하고 그 결과 광발광 효율이 증가한다. 따라서, 여기광으로 변환되는 입사광이 증가하며 전력 결합효율도 증대된다.
1.2.5. 장치의 그 외 선택적 구성요소
어떤 구현예에서, 도 15에서 보는 바와 같이 광학필터(160)는 하부 보호층(144)과 광검출기(106) 사이에 배치된다. 어떤 구현예에서, 광학필터(160)는 하부 보호층(144) 없이 하부 클래딩층(116)과 광검출기(106) 사이에 배치된다. 어떤 구현예에서, 하부 보호층(144) 자체가 광학필터 역할을 한다. 광학필터는 소정 범위의 파장을 가진 광을 통과시키는 한편 상기 소정 범위 밖의 파장을 가진 광은 적어도 부분적으로 차단한다. 따라서, 광학필터(160)를 적절히 선택함으로써 대상물로부터 방출된 광이 통과하는 반면 여기광이 일으킨 노이즈를 감소시켜 S/N 비를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 대상물은 시료액에 함유되어 있으며 이 시료액은 나노웰(120)에 충전된다. 어떤 구현예에서, 미세유동 채널(도시생략)을 이용하여 시료액을 나노웰(120)에 전달한다. 미세유동 채널은 목표 대상물이 일시에 나노웰을 통과하는 방식으로 설계함으로써, 유동-세포측정형 검출을 실현한다. 어떤 구현예에서, 도파관에 커버(도시생략)를 덮어 시료액을 유지하거나 및/또는 주변광을 차단한다.
본 발명과 일치하는 검출장치의 구조를 개략적으로 도시하는 상술한 도면 중 일부에서, 단순화를 위해 구성요소 중 몇몇은 도시하지 않는다. 예를 들어, 도 6은 도파관(110), 나노웰(120), 또한 프리즘(202)과 시준 렌즈(204)가 구비된 프리즘 커플러를 도시한다. 검출장치의 나머지 구성요소는 도시되어 있지 않다. 이들 도면에 나타낸 검출장치는 이 외에도 상술한 기타의 구성요소도 포함하고 있는 것으로 이해한다. 예를 들어, 도 6에 나타낸 검출장치는 광검출기, 커버, 보호층 및/또는 광학필터를 포함한다.
2. 본 발명의 검출방법 및 응용
또 다른 양상에서, 본 발명은 상술한 검출장치를 이용하여 단일분자물 같은 대상물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 대상물을 포함한 시료액을 검출장치의 도파관(110)에 형성된 나노웰(120)에 채운다. 광원이 방출한 입사광의 일부는 광 커플러에 의해 도파관(110)에 결합하여 도파관(110)의 코어층(112)에 침투한다. 도파관(110)에 결합된 광은 여기광 역할을 한다. 유효 여기 영역을 투과하는 대상물은 상기 여기광에 의해 여기되며 광검출기에 의해 검출될 광을 방출한다.
본 발명과 일치하는 검출장치 및 시스템, 또한 이를 이용하는 방법을 예컨대 핵산 검출, DNA 서열확인, 바이오마커 동정, 유동 세포측정 등에 적용한다. 검출장치는 신호분자물을 검출할 수 있게 하는 저강도 광신호를 검출 및 처리할 수 있다.
2.1. 본 장치에 이용하는 라벨(혹은 표지)
본 발명의 방법에 관한 어떤 구현예에서, 라벨은 분석대상체(예컨대, 검출대상), 프라이머, 항체 등의 프로브, 분석대상체와 결합하는 기타의 시약, 혹은 뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 유사체 포함) 등의 기타 시약에 부착된다. 어떤 라벨은 분석대상체의 양 혹은 존재와 신호 간의 상관관계에 유용할 수 있는 분석대상체나 프로브에 사용할 수 있다.
예를 들어, 광범위한 종류의 형광분자를 본 발명에 활용할 수 있는데, 소분자, 형광단백질 및 양자점 등이 이에 포함된다. 유용한 형광분자(형광체)는, 특별히 한정되지 않으나, 1,5-IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론; 5-카복시-2,7-디클로로플루오레신; 5-카복시플루오레신(5-FAM); 5-카복시나프토플루오레신; 5-카복시테트라메틸로다민(5-TAMRA); 5-FAM(5-카복시플루오레신); 5-HAT(하이드록시트립타민); 5-하이드록시트립타민(HAT); 5-ROX(카복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카복시테트라메틸로다민); 6-카복시로다민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD); 7-하이드록시-4-메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘; ABQ; 애시드 푸치신; ACMA(9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈; 아크리플라빈 페울젠 SITSA; AFPs-오토형광 단백질-(Quantum Biotechnologies); 텍사스 레드; 텍사스 레드-X 20 접합체; 티아디카보사이아닌(DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TCN; 티올라이트; 티오졸 오렌지; 티노폴 CBS(Calcofluor White); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; 트리칼라(PE-Cy5); TRITC(TetramethylRhodaminelso ThioCyanate); 트루 블루; 트루 레드; 울트라라이트; 우라닌 B; 우비텍스 SFC; WW 781; X-로다민; XRITC; 크실렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1; 25 YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3, 사이버 그린, 티아졸 오렌지 등의 인터킬레이트 염료; 광범위한 스펙트럼을 포함하고 통상의 여기원의 기본 출력파장과 매치되는 알렉사 플루오르 염료군(Molecular Probe/Invitrogen)의 일원으로서, 알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700 및 750 등; 또한 광범위한 스펙트럼을 포함하는 Cy 염료 형광체군(GE Healthcare)의 일원으로서, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 등; 오이스터 염료 플루오르군(Denovo Biolabels)의 일원으로서, 오이스터-500, -550, -556, 645, 650, 656 등; 418㎚(DY-415) 내지 844㎚(DY-831)의 최대 흡수파장 범위를 갖는 DY-라벨군(Dyomics)의 일원으로서, DY-415, -495, -505, -547, -548, -549, -550, -554, -555, -556, -560, -590, -610, -615, -630, -631, -632, -633, -634, -635, -636, -647, -648, -649, -650, -651, -652, -675, -676, -677, -680, -681, -682, -700, -701, -730, -731, -732, -734, -750, -751, -752, -776, -780, -781, -782, -831, -480XL, -481XL, -485XL, -510XL, -520XL, -521XL 등; ATTO 시리즈 형광라벨(ATTO-TEC GmbH)로서, ATTO 390, 425, 465, 488, 495, 520, 532, 550, 565,590, 594, 610, 611X, 620, 633, 635, 637, 647, 647N, 655, 680, 700, 725, 740 등; CAL 플루오르군 혹은 쿠아사르군 염료(Biosearch Technologies)의 일원으로서, CAL 플루오르 골드 540, CAL 플루오르 오렌지 560, 쿠아사르 570, CAL 플루오르 레드 590, CAL 플루오르 레드 610, CAL 플루오르 레드 635, 쿠아사르 670; 쿠아사르 670 등; EviTags 시리즈 양자점(EvidentTechnologies)이나 Qdot 시리즈 양자점(Invitrogen) 같은 양자점으로서, Qdot 525, Qdot 565, Qdot 585, Qdot 605, Qdot 655, Qdot 705, Qdot 800 등; 플루오레신; 로다민; 및/또한 피코에리드린; 혹은 이들의 조합물을 포함한다(미국 출원 공보 2008/0081769 참조).
어떤 구현예에서, 분석대상체, 시약 혹은 반응산물 등의 존재하에 광을 생성하는 적어도 하나의 생체발광 혹은 화학발광 시스템이 포함된다. 예를 들어, 생체발광 혹은 화학발광 시스템은 합성반응을 통한 서열확인 시 생성된 피로인산염을 검출하거나(하기에서 상세 설명됨); 철이나 동 같은 금속의 존재 여부를 광생성 반응에 대한 이들의 촉매작용을 통해 검출하거나; 혹은 분석대상체가 결합될 시약의 양을 측정하기 위해 이용되며, 이때의 시약은 상기 생체발광 혹은 화학발광 장치의 적어도 하나의 구성요소이다.
공지의 생체발광 시스템은, 예를 들어, 적어도 하나의 루시페라제, 즉, 포티누스 파이랄리스 루시페라제 등의 개똥벌레 루시페라제를 함유하는 시스템을 들 수 있다. 생체발광 시스템은, 예를 들어, 루시페라제, ATP 설퍼릴라제, 루시페린 및 아데노신 5' 인산황산염 등을 합성반응에 따른 서열확인용 성분과 함께 제공함으로써 피로인산염을 검출하는데 이용할 수 있다(상기 반응에서 dATP는, 루시페라제의 dATP 소모로 인한 비특이적 광을 회피하기 위하여, dATPαS 같은 유사체로 치환할 수 있다). 뉴클레오타이드 혼합시 피로인산염이 발생하면, ATP 술포릴라제가 아데노신 5' 인산황반염 의존 방식으로 ATP를 생성한다. ATP는 루시페라제에 의해 루시페린이 옥시루시페린과 광으로 변환되도록 유도한다. 또 다른 생체발광 시스템은 코엘렌테라진(coelenterazine)을 여기된 코엘렌테라미드로 산화시켜 광을 방출하는 아에쿠오린 등의 광단백질에 기반을 둔 시스템을 포함한다.
화학발광 시스템의 예를 들면, 금속 촉매 혹은 산화보조제의 존재하에 광 방출 반응의 대상이 될 수 있는 루미놀+과산화수소; 이산화탄소를 생성할 다단계 반응에서 여기 및 광 방출의 대상이 되는 적절한 염료 및 다이페닐 옥살레이트+과산화수소(상기 적절한 염료의 예를 들면, 9,10-다이페닐안트라센, 9,10-비스(페닐에티닐)안트라센, 1-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센 등의 페닐레이트화 안트라센 유도체, 로다민 6G 및 로다민 B 등의 로다민을 포함함); 과산화수소+하이포아염소산 나트륨 등의 단일형 산소-발생계; 또한 루미놀이나 기타 시판하는 기질에 작용하는 양고추냉이 페록시다제 같은 효소를 함유한 시스템 등을 포함한다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 방법은 시약이나 분석대상체와 라벨 사이 혹은 서열확인 반응에 시용된 폴리머라제 등의 시약과 나노웰의 표면 등의 면 사이에 공유결합을 형성하는 것을 포함한다. 공유결합, 예컨대, 라벨 및/또는 표면에 대한 시약의 공유결합을 형성하는 다수의 방법이 공지되어 있다. 비공유 결합 방법 역시 이용할 수 있다. 다수의 상이한 화학변형체는 결합의 형성을 촉진하는데 이용할 수 있다. 화학변형체의 예를 들면, N-하이드록시 숙신이미드(NHS)기, 아민, 알데히드,에폭사이드, 카복실기, 하이드록실기, 히드라지드, 소수성 기, 막피, 말레이미드, 비오틴, 스트렙타비딘, 티올기, 니켈 킬레이트, 광반응기, 붕소기, 티오에스터, 시스테인, 다이설파이드기, 알킬 및 아실 할로겐화기, 글루타티온, 말토스, 아자이드, 인산염 및 포스핀 등을 포함한다. 어떤 구현예에서, 결합은 적절한 변형체 조합(예컨대, 친전자성 변형체 및 친핵성 변형체)을 통해 두개의 성분 간에 형성되며, 이들 각각의 성분은 적어도 하나의 변형체를 함유한다.
어떤 구현예에서, 결합은 두개의 성분 중 하나에 존재하는 화학 변형체와 다른 하나에 존재하는 자연발생 성분, 예컨대, 아민이나 술피드릴을 이용함으로써 상기 두 성분 간에 형성된다. 어떤 구현예에서, 아민과 반응하는 변형체를 사용한다. 이 반응의 장점은 빠르고 독성 부산물 생성을 피할 수 있는 것이다. 이러한 변형체의 예를 들면, NHS-에스터, 알데히드, 에폭사이드, 아실 할로겐화물 및 티오-에스터 등이 있다. 대부분의 단백질, 펩타이드, 글리코펩타이드 등은 유리 아민기를 갖고 있으며 이는 변형체와 반응하여 이들 변형체에 공유결합할 수 있다. 내부 혹은 말단 아민기를 가진 핵산 프로브는 합성 가능하며 시판되고 있다(예컨대, IDT 혹은 오페론사). 따라서, 생체분자는 유사한 화학적 방식으로 라벨이나 다른 시약에 (예컨대, 공유 혹은 비공유) 결합할 수 있다.
다수의 기타 다작용성 가교제를 사용하여 한 변형체 종류의 화학 반응성을 또 다른 것으로 변환시킬 수 있다. 이들 작용기는 2-작용기, 3-작용기, 4-작용기 등일 수 있다. 또한 이들은 동형-작용기 혹은 이형-작용기일 수 있다. 2-작용성 가교자(cross-linker)의 예는 X-Y-Z 로서 여기서 X와 Z는 두개의 반응기이며 Y는 연결 링커이다. X와 Z은 동일한 기로서 NHS-에스터 등이며 따라서 연결 링커는 NHS-Y-NHS로서 동형 2-작용성 가교자이며 각각 아민을 함유한 두 성분을 연결할 수 있다. X가 NHS 에스터이고 Z가 말레이미드기이면, 결과로 나온 가교자 NHS-Y-말레이미드는 이형 2-작용성 가교자이며 아민 함유 성분을 티오기 함유 성분과 연결할 수 있다. 다수의 상이한 작용기를 가진 가교자는 광범위하게 이용할 수 있다. 이러한 작용기의 예를 들면, NHS-에스터, 티오-에스터, 알킬 할로겐화물, 아실 할로겐화물(예컨대, 아이오도아세트아마드), 티올, 아민, 시스테인, 히스티딘, 다이설파이드, 말레이미드, 시스-디올, 붕산, 하이드록삼산, 아시드, 히드라진, 포스핀, 광반응기(예컨대, 안트라퀴논, 벤조페논), 아크릴아미드(예컨대, 아크리다이트), 친화기(예컨대, 비오틴, 스트렙타비딘, 말토스, 말토스 결합 단백질, 글루타티온, 글루타티온-S-트란스페라제), 알데히드, 케톤, 카복실산, 인산염, 소수성 기(예컨대, 페닐, 콜레스테롤) 등을 포함한다.
또 다른 변형체 대안물(예컨대, 광가교 및 열가교)이 공지되어 있다. 상용화된 기술의 예를 들면, 모시악 테크놀로지스(Mosiac Technologies; Waltham, MA), 엑시콘 EXIQON(상표명); Vedbaek, Denmark), 슐라이처 앤 슈엘(Schleicher and Schuell; Keene, N.H.), 서모딕스(Surmodics(상표명); St. Paul, MN), 제노포어(XENOPORE(상표명); Hawthorne, N.J.), 팜젠(Pamgene; Netherlands), 에펜도르프(Eppendorf; Germany), 프롤링스(Prolinx; Bothell, WA), 스펙트랄 제노믹스(Spectral Genomics; Houston, TX), 및 컴비마트릭스(COMBIMATRIX(상표명); Bothell) 등에서 유래한 것들을 포함한다.
2.2. 핵산 검출
본 발명과 일치하는 검출장치는 분자 검출방법 또는 공정에 이용되거나 이를 위한 장치의 일부로서, 예컨대, 핵산 서열확인법 등에서 이용될 수 있다. 이 장치, 또한 이를 활용하는 방법 및 공정은 예컨대 분석 및 진단 분야에 이용한다. 이러한 분야는 사적, 공적, 상용적 혹은 공업적 분야일 수 있다.
본 발명과 일치하는 검출장치는 다양한 서열확인 방식에 이용되며 또한 단일분자의 서열확인에 적합하다. 또한, 본 발명과 일치하는 검출장치는 기존의 바이오칩 장치에 비해 단순화된 디자인, 조립형태 및 제조방법을 수반한다.
본 발명과 일치하는 검출장치는, 예컨대, 전체 게놈의 서열확인, 전사 프로파일링, 비교 전사 프로파일링 또는 유전자 동정 등을 위한 서열확인이나 핵산 혼성법(hybridization) 등을 포함하는, 생체분자 검출을 위한 장치 또는 그의 방법 및 공정의 일부로서 이용된다. 생체분자 검출법은 또한 예컨대 단백질/단백질, 항체/항원, 수용체/리간드, 핵산/단백질 등, 결합의 검출 및/또는 측정방법을 포함할 수 있다. 이러한 응용분야는 분석이나 진단 프로세스 및 방법에 유용하다.
2.2.1. 검출 대상분자
본 발명에 따른 방법으로 검출하기 적합한 핵산은 예를 들어, DNA, RNA 혹은 PNA(펩타이드 핵산)을 포함한 어떤 핵산도 될 수 있으며, 자연발생 혹은 인공의 서열을 포함한 공지 혹은 미공지의 서열을 가질 수 있다. 핵산은 자연유래, 재조합 형태로 제조 혹은 화학적으로 합성할 수 있다. 핵산은 자연발생의 뉴클레오타이드, 자연에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 유사체 혹은 변형 뉴클레오타이드를 포함한다. 검출 대상인 핵산의 길이는 실제 응용에 근거하여 변화될 수 있다. 어떤 구현예에서, 핵산은 적어도 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000개 혹은 그 이상의 염기로 구성된다. 어떤 구현예에서, 핵산은 10 내지 20, 10 내지 50, 10 내지 100, 50 내지 100, 50 내지 500, 50 내지 1000, 50 내지 5000, 500 내지 2000, 500 내지 5000, 또는 1000 내지 5000개의 염기로 구성된다.
핵산은 단일가닥 형태로 검출된다. 단일가닥의 핵산 주형(template)은 공지기술, 예를 들어, 가열 또는 알칼리나 다른 화학적 처리방법을 포함하는 기술에 따라 두 가닥 분자로부터 유래된다. 단일가닥의 핵산 주형은 또한 예컨대 화학합성이나 시험관내 합성으로 생성될 수도 있다.
어떤 구현예에서, 검출대상인 핵산은 원형이다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법은 공지의 서열을 가진 인서트가 포함된 원형 핵산분자를 제공하는 것을 포함하며, 상기 분자는 프라이머를 위한 결합부위로써 이용될 수 있다. 원형 핵산분자는 단일가닥 혹은 두 가닥 상태로 제공될 수 있으며 일반적으로 적어도 하나의 폐쇄된 공유가닥을 포함한다. 두 가닥 원형 분자는 새김홈이 있는 가닥 혹은 제2의 폐쇄된 공유가닥을 포함한다.
어떤 구현예에서, 서열 중 일부가 공지되어 핵산 인서트 역할을 할 수 있을 경우(예컨대, 원형 분자에 함유된 유전자의 서열 내의 보존모티프가 공지되거나 혹은 분자는, 엄격한 조건하에 공지 서열의 또 다른 핵산으로 혼성화 하는 능력에 기초하여, 서열을 함유하는 것으로 알려져 있다), 원형 핵산분자는 이를 공급원으로부터 원형으로 분리함으로써 제공된다. 어떤 구현예에서, 서열에 대한 지식이 엄격한 혼성화 특성에서 유래하는 경우처럼, 핵산 인서트 서열은 정확히 알려져 있지 않다. 또 어떤 구현예에서는, 원형 핵산분자가 공지의 골격 서열을 갖거나 혹은 공지 서열을 함유하도록 가공되는 경우처럼, 핵산 인서트의 서열은 정확히 공지되어 있다.
어떤 구현예에서, 원형 핵산분자는 선형 핵산시료를 핵산 인서트와 함께 원형분자에 혼합하기 위한 시험관내 반응을 수행함으로써 제공된다. 시험관내 반응은 어떤 구현예에서는 리가제에 의한 유전자연결(ligation) 및/또는 재조합효소 및 회전효소 등을 포함한 각종 효소에 의해 촉매화 처리되는 등, 기타의 가닥 연결반응(strand joining)을 포함할 수 있다. DNA 리가제나 RNA 리가제는 선형 주형의 두 말단을, 어댑터(adapter) 분자나 링커의 존재하에 혹은 이들의 존재 없이, 효소 연결하는데 이용하며 이에 의해 원이 형성된다. 예를 들어, T4 RNA 리가제는 문헌[Tessier et al. (Anal Biochem, 158: 171-78 (1986))]에 개시된 바와 같이 단일가닥 DNA나 RNA를 결합시킨다. CIRCLIGASE(상표명)(Epicentre, Madison, Wis.)는 또한 단일가닥 핵산의 유전자연결을 촉매화 처리하는데 이용한다. 이와 별도로, 두 가닥 리가제, 예컨대, E. coli 또는 T4 DNA 리가제는 순환반응을 행하는데 이용한다.
어떤 구현예에서 원형 핵산분자의 제조방법은: 가변영역을 포함하는 적어도 하나의 프라이머(핵산 인서트 역할을 할 수 있는 공지 서열의 5' 플랩(flap)을 가진 임의의 프라이머가 포함될 수 있음)를 연장시키고 또한, 예컨대, 리가제나 재조합효소에 의해 촉매화 처리될 수 있는 증폭 핵산을 순환시킴으로써 핵산 주형을 복제하고; 어떤 구현예에서 상기 증폭 핵산은 그 말단을, 예컨대, 순환 단계에 앞서 제한하거나 혹은 포스포릴화 반응을 통해 처리하기도 한다.
어떤 구현예에서, 원형 핵산분자는 화학 순환반응에 따라 제공된다. 화학적 방법은 공지의 커플링제, 예컨대, BrCN + 이미다졸과 2가 금속, ZnCl2 함유 N-시아노이미다졸, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 HCl, 또한 기타 다른 카보디이미드류와 카보닐 디이미다졸 등을 사용한다. 선형 주형의 말단은 또한 5'-포스페이트와 3'-하이드록실 혹은 5'-하이드록실과 3'-포스페이트를 축합하여 연결하기도 한다.
어떤 구현예에서 원형 핵산분자는, 말단에 존재하지 않는 것을 제외하고 말단 링크 프라이머로 간주할 수 있는 인서트 서열을 함유하는데(하기 검토), 이는 상기 분자가 원형이기 때문이다.
2.2.1.1. 말단 링크 프라이머
어떤 구현예에서, 선형 핵산은 핵산의 5' 말단, 3' 말단 혹은 5' 말단과 3' 말단 양측 모두에 결합된 하나 이상의 말단 링크 프라이머를 더 포함한다. 특정의 구현예에서, 말단 링크 프라이머는 핵산의 3' 말단에 고착된다. 말단 링크 프라이머는 하나 이상의 검출 프라이머, 예컨대, 서열확인 프라이머를 위한 상보서열을 제공하는데 이용된다.
말단 링크 프라이머는 보통 100개 미만의 뉴클레오타이드로 이루어진 짧은 핵산분자이다. 어떤 구현예에서, 말단 링크 프라이머는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 90개 혹은 그 이상의 뉴클레오타이드로 된 길이를 갖는다. 어떤 구현예에서, 말단 링크 프라이머는 8 내지 25개, 10 내지 20개, 10 내지 30개 혹은 10 내지 50개의 뉴클레오타이드로 된 길이를 갖는다. 말단 링크 프라이머는 어떤 구현예에서는 미분기 상태이고 또 다른 구현예에서는 분기되어 있다.
말단 링크 프라이머는 핵산을 검출하는데 이용되는 하나 이상의 프라이머, 예컨대, 서열확인 프라이머에 대한 상보체 역할을 한다. 어떤 구현예에서, 프라이머는 혼성화에 의해 핵산을 검출하는데 사용하며, 예컨대, 프라이머는 형광라벨 등의 검출가능한 라벨을 함유한다. 어떤 구현예에서, 말단 링크 프라이머의 5' 말단은 서열확인 프라이머에 대해 상보적인 서열을 포함한다. 어떤 구현예에서, 서열확인 프라이머에 상보적인 말단 프라이머 서열은 배향성이며 따라서 서열확인 프라이머의 3' 말단은 서열화될 핵산의 제1 뉴클레오타이드에 밀접해 있다.
어떤 구현예에서, 말단 링크 프라이머를 리가제, 예를 들어, DNA 리가제에 의해 검출될 핵산의 말단에 부가한다. 어떤 구현예에서, 말단 링크 프라이머와 검출될 핵산은 양쪽 모두 유전자연결 전에 단일가닥 형태이다. 또 다른 구현예에서, 상기 두 물질은 모두 두 가닥 형태이다. 그 밖의 또 다른 구현예에서, 상기 두 물질 중 하나는 단일 가닥이고 다른 하나는 두 가닥이다. 유전자연결은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 폴로니 시퀀싱법(polony sequencing)에서는, Shendure et al. (Science, 309:1728-1732 (2005))이 뉴잉글랜드 바이오랩스(NEB) 퀵 유전자연결 키트를 이용하여 T30 말단 링크 프라이머(32 bp)를 시료 DNA절편에 유전자연결 하였다. 여기서, 유전자연결 반응액은 1X 퀵 유전자연결 완충액에 0.26 p몰의 DNA, 0.8 p몰의 T30 말단 링크 프라이머, 4.0㎕ 의 T4 DNA 리가제를 넣은 것이다. 혼합 후 반응액을 실온에서 10분간 배양한 뒤 얼음 상에 두었다. 시료를 60℃로 10분간 가열하여 유전자연결 반응을 중단하였다.
또 다른 구현예에서, 말단 링크 프라이머는 검출될 핵산에서 합성된다. 예를 들어, 말단 링크 프라이머는 예컨대, 말단 전이효소에 의해 부가된 동종고분자이다. 예를 들어, 문헌[Harris et al. (Science 320:106-109 (2008))]에서는 폴리 A 말단을 바이러스 게놈의 단일분자 서열확인에서 폴리 T 서열확인 프라이머에 대한 상보체 역할을 하는 DNA 주형에 가했다.
2.2.1.2. 서열확인 프라이머
서열확인 프라이머는 검출될 핵산의 단편에 대해 상보적인 단일가닥 올리고뉴클레오타이드나 또는 이에 연관된 말단 링크 프라이머이다. 어떤 구현예에서, 서열확인 프라이머는 적어도 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 혹은 그 이상의 뉴클레오타이드로 된 길이를 갖는다. 특정의 구현예에서, 서열확인 프라이머는 8 내지 25개, 10 내지 20개, 10 내지 30개 혹은 10 내지 50개의 뉴클레오타이드로 된 길이를 갖는다. 서열확인 프라이머는 자연발생 뉴클레오타이드, 자연에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 유사체 혹은 변형 뉴클레오타이드 등, 불특정 종류의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
어떤 구현예에서, 서열확인 프라이머는 변형 뉴클레오타이드, 예컨대, 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA; 폴리핵산 내에서 개량된 염기중첩 결합을 제공하는 변형 리보뉴클레오타이드) 등을 함유한다. LNA 활용에 관한 예시로서, Levin et al. (Nucleic Acid Research 34(20):142 (2006))은 LNA-함유 프라이머가 개선된 특이성을 갖고 또한 무잠금(unlocked) 프라미어에 비해 더 강한 결합력을 나타내는 것을 보여주었다. 프라이머 내의 상이한 위치에서 3개의 LNA 뉴클레오타이드(캡이 있음)를 함유한 MCP1 프라이머(5'-cttaaattttcttgaat-3')의 3종의 변이체는 다음과 같았다: MCP1-LNA-3'(5'-cttaaattttCtTgaAt-3'); MCP1-LNA-5'(5'-CtTaAattttcttgaat-3'); 및 MCP1-LNA-even(5'-ctTaaatTttctTgaat-3') 등이다. LNA 치환된 프라이머는 모두 Tm이 향상되었으며, 특히 MCP1-LNA-5' 프라이머는 개선된 서열확인 정밀도(Phred Q30 카운트수)를 나타내었다. 따라서, 특정 구현예에서 서열확인 프라이머는 적어도 하나의 잠금 뉴클레오타이드를 5' 영역, 즉, 서열확인 프라이머의 5' 1/2, 1/3 혹은 1/4에 함유한다.
서열확인 프라이머와 단일가닥 시료핵산(즉, 적어도 하나의 말단 링크 프라이머를 포함하는 검출 대상인 핵산)은 본 발명에 일치하는 검출장치에 적용하기 앞서서 혼성화 처리한다. 서열확인 프라이머와 시료핵산은 염-함유액, 예컨대, 5X SSC(또는 5X SSPE), 0.1% 트윈20(혹은 0.1% SDS), 0.1% BSA 완충액 등에, 시료 핵산을 몰랄 과량(molar excess)의 서열확인 프라이머와 함께 혼합함으로써 혼성화 한다. 혼합물을 약 5분간 65℃로 가열한 후 천천히 실온으로 냉각함으로써, 프라이머/주형을 어닐링한다. 잔류 프라이머는 분자체 등의 적절한 수단을 써서 제거한다.
말단 링크 및 서열확인 프라이머를 포함하는 프라이머는 서열의 육안검사나 컴퓨터-보조 프라이머 설계법 등을 포함한 적절한 수단을 써서 설계한다. 다수의 소프트웨어 패키지를 프라이머 설계 보조에 이용할 수 있다. 예를 들어, ONAStar(상표명)(ONAStar Inc., Madison, WI), OLIGO 4.0(National Biosciences, Inc.), 벡터 NTI(등록상표)(Invitrogen), 프라이머 프라이머 5(Premierbiosoft), 및 프라이머 3(Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) 등이 여기에 포함된다. 프라이머는 예를 들어 서열확인할 분자, 특이성, 길이, 원하는 융점, 2차 구조, 프라이머 이량체, GC 함량, pH 값, 완충액의 이온강도, 사용된 효소(즉, 폴리머라제 혹은 리가제) 등을 고려하여 설계한다(예컨대, Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001) 참조).
2.2.2. 서열확인 방식
본 발명의 어떤 구현예는 핵산의 서열확인 방법에 관한 것이며, 이는: (a) 코어층과 제1 클래딩층을 가진 것으로서, 적어도 하나의 나노웰이 적어도 상기 제1 클래딩층 내에 형성되어 있는 것인 도파관; 및 적어도 하나의 광검출기를 포함하는 검출장치를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 핵산분자를 제공하는 단계; (c) 상기 적어도 하나의 핵산분자를 상기 적어도 하나의 나노웰 내에 각각 위치시키는 단계; (d) 상기 적어도 하나의 핵산분자에 대해 합성에 의한 단일분자 서열확인(single molecule sequencing-by-synthesis)을 수행하는 단계(여기서 핵산의 합성에 의한 단일분자 서열확인은 핵산 내의 적어도 하나의 염기의 존재(identity)와 상관관계가 있는 광 방출을 유도함); (e) 검출기로 광을 검출하여 이 결과로 출력신호를 생성하는 단계; 및 (f) 상기 출력신호를 처리하여 핵산에 함유된 적어도 하나의 염기의 존재를 결정하는 단계를 포함한다.
이 방법에서 "상기 적어도 하나의 핵산분자를 상기 적어도 하나의 나노웰 내에 각각 위치시키는" 것은 하나의 단일 핵산분자를 하나의 나노웰에 위치시키는 것 즉, 하나(및 하나를 초과하지 않는)의 핵산분자가 내부에 존재하는 적어도 하나 이상의 나노웰이 존재하는 것으로 이해한다. 어떤 구현예에서, 각각이 하나(및 하나를 초과하지 않는) 핵산분자를 함유하는 복수의 나노웰이 존재한다. 어떤 구현예에서, 조작 시 복수의 나노웰 중 일부는 핵산분자를 함유하며 나머지는 이를 함유하지 않는다. 즉, 시료액의 핵산분자 농도가 소정치보다 낮으며 이에 따라 모든 나노웰이 내부에 핵산분자를 함유하지는 않는다. 그러므로 서열확인이 완료되기 전에 2개 이상의 분자가 동일한 나노웰에 연속으로 침투하는 시나리오는 무산되며, 따라서 하나 이상의 분자로부터 얻은 정보가 서열확인의 결과에 포함되지 않는다. 예를 들어 본 발명의 어떤 구현예에서, 신호를 방출하는 나노웰은 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%과 같거나 이보다 적으며, 이는 검출 혹은 동정 대상인 생체분자의 농도가 낮은 탓이다.
어떤 구현예에서, 시료액 내 핵산분자의 농도는 유효 여기 영역의 용적에 의존한다. 예를 들어, 유효 여기 영역의 용적이 1 아토-리터이면 시료액 내 핵산분자의 농도는 약 1.6 μM이다. 어떤 구현예에서 시료액 내 핵산분자의 최적농도는 약 1 내지 100 pM부터 약 1 내지 100 μM 이다.
어떤 구현예에서, 검출될 핵산분자는 본 발명에 따른 장치에 포함된 나노웰의 유효 여기 영역의 용적에 대한 준화학량론적 양에 해당하는 농도로 제공된다. 예를 들어, 유효 여기 영역이 1 아토-리터이면 핵산분자는 1 아토-리터당 0.01 내지 0.5 분자, 0.05 내지 0.2 분자, 혹은 약 0.1 분자 범위의 농도로서 제공될 수 있다. 농도는 유효 여기 영역의 크기에 근거하여 적절히 조정할 수 있다. 어떤 응용분야에서, 동일한 나노웰에서 발생하는 다중 신호의 최소화 대비 더 큰 비율의 나노웰로부터 신호 발생이라는 상대적 중요성 등, 여러 요인에 근거하여 고농도 혹은 저농도를 이용하는 것이 바람직하다.
어떤 구현예에서, 검출될 핵산분자는 본 발명에 따른 장치에 포함된 나노웰의 유효 여기 영역의 용적에 대해 화학량론적 등가량 혹은 과량의 농도로서 제공된다. 예를 들어, 유효 여기 영역이 1 아토-리터인 경우 핵산분자는 1 아토-리터당 1 내지 50 분자, 2 내지 20 분자 혹은 3 내지 10 분자 범위의 농도로서 제공된다. 상술한 범위의 농도를 이용하는 것과 더불어, 핵산의 서열확인을 위한 효소를 준화학량론적 수준으로 제공할 수 있으며, 예컨대, 나노웰당 0.01 내지 0.5개의 접근가능한 활성 폴리머라제, 나노웰당 0.05 내지 0.2개의 접근가능한 활성 폴리머라제, 혹은 나노웰당 약 0.1개의 접근가능한 활성 폴리머라제 등을 제공할 수 있다.
서열확인에 사용될 효소를 나노웰 표면에 결합시키는 것 혹은 기타의 검출 반응을 통하여, 일부의 효소는 접근 불가하거나 불활성인 사실, 혹은 결합 위치나 효소의 구조에 미치는 영향 여부 등의 요인에 기인하여, 상술한 문제점을 모두 안고 있음을 확인할 수 있다. 서열확인-합성 반응에 양성 대조군으로서 다른 성분을 과량으로 제공하고 또한, 접근가능한 활성 효소의 존재와 일치하는 것으로서, 형광신호를 발생하는 나노웰의 수를 관측함으로써, 나노웰당 접근가능한 활성 폴리머라제의 갯수를 실험을 통해 산출할 수 있다. 고비율, 예컨대, 50% 이상의 나노웰이 형광신호를 발생하면, 다수의 나노웰이 적어도 2개의 접근가능한 활성효소를 함유하는 것을 임의분포 모델을 통해 추산하게 된다(예컨대, 50%의 웰이 신호를 발생하면, 25%의 웰이 적어도 2개의 접근가능한 활성효소를 함유하는 것으로 예측된다). 어떤 경우, 서열확인될 핵산분자의 농도를 한정함으로써 동일한 나노웰에서 형성될 2개의 상이한 서열확인 복합체의 빈도를 최소화하는 것이 유리할 수 있다. 이와 별도로, 소량 예컨대 10% 이하의 나노웰이 형광신호를 발생하면, 적어도 2개의 접근가능한 활성효소를 함유하는 나노웰의 수가 적어 임의분포 모델은 10으로 산정된다(예컨대, 10%의 웰이 신호를 발생하면 약 1%의 웰이 적어도 2개의 접근가능한 활성효소를 함유하는 것으로 예측된다). 어떤 경우, 서열확인할 핵산분자를 비교적 고농도로 이용함으로써 1개의 접근가능한 활성효소를 가진 나노웰에서 형성될 비-서열확인 복합체의 빈도를 최소화하는 것이 유리할 수 있다.
어떤 구현예에서, 핵산의 합성에 의한 단일분자 서열확인을 이용하여 화학발광을 통한 광방출을 유도한다. 보다 구체적으로, 이들 구현예에서는 화학발광을 통해 화학에너지로부터 광을 발생하기 때문에 광원이 구비된 장치를 이용할 필요가 없다.
어떤 구현예에서, 이 장치는 여기광을 제공하기 위해 이용되는 광원, 예컨대, 핵산의 합성에 의한 단일분자 서열확인 시 형광을 통해 광 방출을 야기하는 광원을 포함한다.
본 발명에 따른 검출장치와 방법은, 예컨대, 미국 특허 제6,946,249호 및 문헌[Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004]) 등에 기술된 공지 방법에 따라 핵산을 검출 및 서열확인 하는데 이용한다. 서열확인 방식은 공지된 단일분자 서열확인 방법 중에서 선택할 수 있다. 어떤 구현예에서, 서열확인 방법은 DNA 폴리머라제나 DNA 리가제의 특이성에 의존하며, 예컨대, 염기 연장 서열확인(단계적 단일염기 연장), 합성에 따른 다중염기 서열확인(말단표지 뉴클레오타이드를 이용한 서열확인 등도 포함) 등을 포함한다. 상기 방법은 통상적으로 적어도 하나의 말단 링크 프라이머를 포함하는 시료핵산을 제공하는 것도 포함한다. 핵산은 단일가닥 형태로 제공되거나 또는, 화학변성이나 열변성 등을 통해, 단일가닥 형태로 형성될 수 있다. 서열확인은 서열확인 프라이머에서부터 개시된다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 방법은 예컨대 시약이나 분석대상체와 표면 혹은 라벨 간에 공유결합을 형성하는 것을 포함한다. 예를 들어, 단일분자 서열확인 절차에서, 핵산분자 또는 폴리머라제 등의 효소는 나노웰 바닥면에 부착된다. 이러한 부착에 의해 복수의 서열확인 주기 동안 데이타를 수득할 수 있다. 예컨대, 시약과 표면 또는 라벨 간의 공유결합을 형성하는 다수의 방법이 현재 공지되어 있다. 비공유 결합 방법 역시 이용될 수 있다. 다수의 상이한 화학변형체를 이용하여 결합 형성을 촉진할 수 있다. 이러한 화학변형체의 예를 들면, N-하이드록시 숙신이미드기(NHS), 아민, 알데히드, 에폭사이드, 카복실기, 하이드록실기, 히드라지드, 소수성 기, 막피, 말레이미드, 비오틴, 스트렙타비딘, 티올기, 니켈 킬레이트, 광반응기, 붕소기, 티오에스터, 시스테인, 다이설파이드기, 알킬 및 아실 할로겐화기, 글루타티온, 말토스, 아지드, 인산염 및 포스핀 등을 포함한다. 이들은 예를 들어 표준방법(Microarray Biochip Technologies, Mark Schena, Editor, March 2000, Biotechniques Books)을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 어떤 구현예에서, 변형체의 적절한 조합(예컨대, 친전자성 변형체와 친핵성 변형체)에 따라 두 성분 사이에 결합이 형성되며, 상기 각 성분은 적어도 하나의 변형체를 함유한다.
어떤 구현예에서, 두 성분 중 하나에 존재하는 화학변형체 및 나머지 하나에 존재하는 자연발생 성분, 예를 들어, 아민이나 술피드릴을 이용하여 이들 두 성분 사이에 결합을 형성한다. 어떤 구현예에서, 아민에 반응하는 변형체를 사용한다. 이러한 반응의 장점은 빠르며 독성 부산물 등의 생성을 피할 수 있다는 것이다. 상술한 변형체의 예를 들면, NHS 에스터, 알데히드, 에폭사이드, 아실 할로겐화물 및 티오-에스터 등이 있다. 대부분의 단백질, 펩타이드, 글리코펩타이드 등은 유리 아민기를 갖고 있으며 이는 변형체와 반응하여 이들 변형체에 공유결합할 수 있다. 내부 혹은 말단 아민기를 가진 핵산 프로브는 합성 가능하며 시판하고 있다(예컨대, IDT 혹은 오페론사). 따라서, 생체분자는 유사한 화학적 방식으로 라벨이나 다른 시약에(예컨대, 공유 혹은 비공유) 결합할 수 있다.
다수의 기타 다작용성 가교제를 사용하여 한가자 변형체의 화학 반응성을 또 다른 것으로 변환시킬 수 있다. 이들 작용기는 2-작용기, 3-작용기, 4-작용기 등일 수 있다. 또한 이들은 동형-작용기 혹은 이형-작용기일 수 있다. 2-작용성 가교자의 예는 X-Y-Z 로서, 여기서 X와 Z는 두개의 반응기이며 Y는 연결 링커이다. X와 Z은 동일한 기로서 NHS-에스터 등이며 따라서 연결 링커는 NHS-Y-NHS로서 동형 2-작용성 가교자이며 각각 아민을 함유한 두 성분을 연결할 수 있다. X가 NHS 에스터이고 Z가 말레이미드기이면, 결과로 나온 가교자 NHS-Y-말레이미드는 이형 2-작용성 가교자이며 아민 함유 성분을 티오기 함유 성분과 연결할 수 있다. 다수의 상이한 작용기를 가진 가교자는 광범위하게 이용할 수 있다. 다수의 상이한 작용기를 가진 가교자는 광범위하게 이용할 수 있다. 이러한 작용기의 예를 들면, NHS-에스터, 티오-에스터, 알킬 할로겐화물, 아실 할로겐화물(예컨대, 아이오도아세트아마이드), 티올, 아민, 시스테인, 히스티딘, 다이설파이드, 말레이미드, 시스-디올, 붕산, 하이드록삼산, 아시드, 히드라진, 포스핀, 광반응기(예컨대, 안트라퀴논, 벤조페논), 아크릴아미드(예컨대, 아크리다이트), 친화기(예컨대, 비오틴, 스트렙타비딘, 말토스, 말토스 결합 단백질, 글루타티온, 글루타티온-S-트란스페라제), 알데히드, 케톤, 카복실산, 인산염, 소수성 기(예컨대, 페닐, 콜레스테롤) 등을 포함한다.
다른 변형체 대안물(예컨대, 광가교 및 열가교)이 공지되어 있다. 상용화된 기술의 예를 들면, 모시악 테크놀로지스(Mosiac Technologies; Waltham, MA), 엑시콘 EXIQON(상표명); Vedbaek, Denmark), 슐라이처 앤 슈엘(Schleicher and Schuell; Keene, N.H.), 서모딕스(Surmodics(상표명); St. Paul, MN), 제노포어(XENOPORE(상표명); Hawthorne, N.J.), 팜젠(Pamgene; Netherlands), 에펜도르프(Eppendorf; Germany), 프롤링스(Prolinx; Bothell, WA), 스펙트랄 제노믹스(Spectral Genomics; Houston, TX), 및 컴비마트릭스(COMBIMATRIX(상표명); Bothell) 등에서 유래한 것들을 포함한다.
단일분자 서열확인 방식에 있어서, 본 발명은 단일분자를 서열 재확인(resequencing)할 수 있는 장점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제는 바닥면 등 나노웰의 표면에 부착될 수 있다. 서열확인될 주형 핵산분자는 서열확인 프라이머와 함께 원형으로 제공될 수 있다. 주형 핵산분자 내의 뉴클레오타이드의 수보다 큰 서열확인 리드(sequence read)를 얻는 방식으로 복수의 서열확인 주기를 수행함으로써, 서열 재확인이 달성될 수 있다. 따라서 서열확인 리드는 주형 핵산분자 내 적어도 한 위치에 있는 염기에 대한 불필요하게 중복되는 정보를 포함한다. 어떤 구현예에서, 서열확인 리드는 주형 핵산분자 내의 적어도 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 염기에 대한 불필요하게 중복되는 정보를 포함한다. 어떤 구현예에서, 서열확인 리드는 주형 핵산분자 내의 적어도 25%, 50%, 75%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 염기에 대해 3배, 4배, 5배, 7배 혹은 10배의 중복도로 확인되는 정보를 포함한다. 동일한 분자에 대한 서열 재확인을 통해, 서열확인 리드의 개수가 갖는 영향만큼 서열확인 오류가 감소하는 것으로 예측된다. 예를 들어, 단일 리드에 대한 염기당 오류율이 10-3이면, 2개의 리드 뒤에 상기 오류율은 (10-3)2, 즉, 10-6으로 감소한다. 상기 사실은 특히 단일분자 서열확인에 유리한데, 이는 서열확인에 이용된 변형 뉴클레오타이드가 라벨(혹은 표지)이나 차단기를 잃을 수 있고 따라서 허위 유전자결실(spurious deletion) 등의 결과를 가져오기 때문이다.
일반적으로 단일분자 서열확인에서, 서열확인될 적어도 하나의 핵산분자는 프라이머와 접촉한다. 프라이머는 예컨대 적어도 1회의 효소-촉매화 중합반응 또는 유전자연결 반응에 의해 변형된다. 상기 적어도 1회의 반응은 핵산 내 적어도 한 염기의 존재와 관련된 광 방출을 유도한다. 광 방출을 "유도"한다는 것은, 적어도 1회의 반응이 핵산 내 적어도 한 염기의 존재와 상관관계가 있는 광 방출이 일어나는 적어도 한가지 조건을 야기함을 의미하는 것으로 이해한다. 상기 광 방출은 여기광, 화학 혹은 생체 발광계 등과의 상호작용을 통한 것이다. 상술한 적어도 한가지의 조건은, 예를 들면, 형광물질을 적어도 한 반응의 산물에 첨가하거나 피로인산염을 방출하는 것 등이 될 수 있다. 따라서, 광은 외부 여기가 있거나 없는 상태에서 발생한다. 예를 들어, 공유결합된 검출성 라벨, 예컨대, 형광라벨과 2차 연장을 방지하는 차단기 등을 함유하는 가역성 종결자 염기 유사체를 이용하여 단일분자 서열확인을 수행할 수 있으며, 이때 상기 유사체는 프라이머에 부가된 후에 여기 및 검출되고 또한 상기 라벨 및 차단기는 추가 연장을 위해 부가한 뒤 제거한다. 이와 별도로, 피로인산염-의존 방식으로 광을 방출하는 화학 혹은 생체발광 검출계를 제공함으로써, 외부 여기를 가하지 않고 연장 단계의 산물, 예컨대, 피로인산염을 검출할 수도 있다. 이들 방법 및 기타의 방식에 대해서는 이하 더 상세히 검토한다.
방출된 광은 핵산 내 적어도 하나의 염기의 존재와 상관관계가 있다. 어떤 구현예에서, 상기 상관관계는 일시적일 수도 있으며, 예컨대, 광 방출시간은 상이한 염기 유사체가 상이한 시간에 중합반응 용도로 공급되는 경우와 같이 적어도 하나의 염기의 존재를 나타낸다. 어떤 구현예에서, 상기 상관관계는 스펙트럼 형태일 수도 있으며, 예컨대, 방출광의 스펙트럼은 상이한 형광체를 함유한 상이한 염기 유사체가 중합반응 용도로 공급되는 경우와 같이 적어도 하나의 염기의 존재를 나타낸다.
어떤 구현예에서, 단일분자 핵산 서열확인은 복수의 서열확인 주기를 포함한다. 서열확인 주기는 적어도 하나의 염기의 존재와 상관관계가 있는 광 방출을 유도하는 공정을 의미하는 것으로 이해하며, 이는 첫 번째 염기가 확인된 후 핵산 내의 두 번째 염기를 확인하기 위해 반복 수행될 것이다. 따라서, 단일분자 핵산 서열확인을 포함하는 본 발명에 따른 방법에서 상기 단일분자 핵산 서열확인은, 핵산에 함유된 적어도 소정수의 염기의 존재와 전반적으로 상관관계가 있는 적어도 소정 횟수의 광 방출을 유도하는 적어도 소정 횟수의 서열확인 주기를 포함할 수 있다. 또한 상기 방법은 핵산에 함유된 적어도 소정수의 염기를 확인하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서 소정수란 예를 들어, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100, 200 혹은 500 등이다.
서열확인법은 핵산 내 하나 이상의 염기의 존재를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 어떤 구현예에서, 단일분자 핵산 서열확인을 수행하여 적어도 제1 광학센서 및 제2 광학센서가 포함된 적어도 하나의 광검출기에 의해 검출되는 광의 방출을 유도하고, 적어도 상기 2개의 광학센서로부터 나온 출력신호를 처리하고, 또한 상기 처리에 따른 적어도 한가지의 결과를 적어도 한가지 공지형태에 상응하는 한가지의 공지 결과와 비교함으로써 적어도 하나의 염기의 존재를 결정할 수 있다.
예를 들어, 처리 결과는 반응이 일어난 시간을 표시할 수 있다; 방출광이 일시적으로 핵산 내 적어도 하나의 염기의 존재와 상관관계가 있을 때, 상술한 시간을 이용하여 상기 핵산 내 적어도 하나의 염기의 존재를 결정할 수 있다.
또 다른 예에서, 처리 결과는 형광체가 반응 산물에 혼합하는 결정일 수 있다; 방출광이 스펙트럼 측면에서 핵산 내 적어도 하나의 염기의 존재와 상관관계가 있을 때, 상기 결정을 통해 핵산 내 적어도 하나의 염기의 존재를 결정할 수 있다.
2.2.2.1. 염기 연장 서열확인: 단계식 연장
어떤 구현예에서, 본 발명에 의한 검출장치를 이용하여 염기 연장 서열확인 시 발생한 광을 검출한다. 어떤 구현예에서, 염기 연장 서열확인은 서열확인할 단일가닥 핵산, 서열확인할 핵산의 3' 말단과 연계된 말단 링크 프라이머 및 여기에 결합된 서열확인 프라이머를 포함하는 부분 이중형 시료핵산을 제공하면서 개시된다. 어떤 구현예에서, 폴리머라제와 변형 뉴클레오타이드를 적절한 완충액내에서 광 검출장치에 가한다. 어떤 구현예에서, 뉴클레오타이드는 공유연결된 검출성 라벨, 예컨대, 형광라벨과 2차 연장을 방지할 차단기를 포함한다. 따라서, 서열확인은 단일 뉴클레오타이드를 상기 서열확인 프라이머의 3' 말단에 부가한 뒤 휴지한다.
염기 연장 서열확인 반응에 관한 한 구현예의 제1 단계에서, 형광 차단기를 가진 뉴클레오타이드를 DNA 폴리머라제를 통해 서열확인 프라이머의 3' 말단에 부가한다. 어떤 구현예에서는 형광라벨이 차단기 역할을 한다. 또 다른 구현예에서 이들은 각각 별개의 성분이다. 단일 뉴클레오타이드는 서열확인 프라이머의 3' 말단에 결합시켜 이에 상응하는 광검출기를 이용하여 상기 뉴클레오타이드의 라벨을 통해 확인한다. 형광라벨 및 차단기는 모두 화학 혹은 효소분해로 제거하여 추가의 염기 연장 주기를 진행할 수 있게 한다. 어떤 구현예에서, 라벨 및 차단기는 동시에 혹은 순서에 관계없이 차례로 제거할 수 있다. 염기의 첨가 순서를 조정하면, 시료핵산의 서열을 3' 내지 5'의 방향에서 유추할 수 있다.
일반적으로 단계식 연장 과정에서 가한 뉴클레오타이드를 인지한 방법은 두 가지이다. 첫 번째 경우는, 4개의 뉴클레오타이드가 모두 동일한 검출성 라벨을 구비하며 이들 뉴클레오타이드를 소정의 순서대로 첨가한다. 연장된 뉴클레오타이드의 존재는 연장 반응 시 뉴클레오타이드를 첨가한 순서에 따라 결정된다. 연장 시 합체된 염기를 인지하는 두 번째 방식에서, 4개의 서로 다른 뉴클레오타이드를 동시에 첨가하며 각각은 서로 구별되는 검출성 라벨과 결합한다. 또 다른 구현예에서, 여기 혹은 방출 스펙트럼 및/또는 라벨의 강도는 서로 상이하다. 연장 시 첨가된 뉴클레오타이드의 존재는 강도 및/또는 파장(예컨대, 여기 혹은 방출 스펙트럼)으로 확인한다.
2.2.2.2. 합성에 의한 서열확인: 다단계 연장
어떤 구현예에서, 합성에 의한 서열확인은 다수의 비차단식(즉, 연속식) 연장을, 예컨대, 차단기 없이 수행한다. 이러한 구현예에서, 중합반응은 누클레오시드 트리포스페이트 가수분해후 피로인산염의 방출, 즉, β 및 γ 인산염 착체의 방출을 검출함으로써 관측할 수 있다. 상기 착체는 예를 들어 착체의 형광성분을 통해 직접적으로 또는 예를 들어, 위에서 검토한 바와 같이, 피로인산염을 화학- 혹은 생체발광 검출장치에 결합시킴으로써 간접적으로 검출할 수 있다.
어떤 구현예에서, 시료핵산은 기본적으로 말단-인산염 라벨의 뉴클레오타이드를 이용하여 연속적으로 서열확인한다. 말단-인산염 라벨의 뉴클레오타이드 및 이의 사용방법에 관한 실시예는 예컨대, 미국특허 제7,361,466호 및 2007년 6월 21일에 공고된 미국 특허공보 제2007/0141598호에 개시되어 있다. 요약하면 뉴클레오타이드를 본 발명에서 제공한 장치에 가하고, 이것이 중합반응 시 가수분해되면 상기 라벨의 피로인산염을 상응하는 광검출기를 이용하여 검출할 수 있다. 어떤 구현예에서, 4가지 뉴클레오타이드는 모두 서로 상이한 라벨을 포함하며 동시에 첨가된다. 어떤 구현예에서, 뉴클레오타이드는 서로 구별되지 않는, 즉, 동일한 라벨을 포함하고 소정의 순서로 차례대로 첨가된다. 서로 구별되지 않는 라벨을 가진 뉴클레오타이드를 순서에 따라 순환식으로 첨가해도, 예컨대, 동종고분자 서열 내에서 복수의 연속 중합단계가 허용된다.
2.2.3. 기타 응용분야
본 발명과 일치하는 검출장치는 수백만개의 핵산 절편을 동시에 검출할 수 있다. 각 절편이 예를 들어 100개의 염기로 된 길이를 갖는 경우, 단일장치로 수십억 이상의 염기 서열을 한번에 수득할 수 있다. 본 발명에서 제공한 장치와 방법의 또 다른 응용분야를 다음과 같이 검토한다.
2.2.3.1. 전체 게놈 서열확인
본 발명과 일치하는 검출장치를 사용하여, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 진균류, 진핵세포, 혹은 인간 등의 포유류 같은 척추동물의 전체 혹은 부분 게놈 서열확인을 수행한다.
게놈 DNA는 서열확인을 위해, 적어도 20, 50, 100, 200, 300, 500, 800, 1200, 1500개의 뉴클레오타이드 혹은 그 이상의 길이로 된 단편으로 분할한다. 어떤 구현예에서, 분할된 게놈 DNA는 20 내지 50개, 20 내지 100개, 20 내지 500개, 20 내지 1000개, 500 내지 1200개 또는 500 내지 1500개의 뉴클레오타이드로 된 길이를 갖는다. 어떤 구현예에서, 서열확인할 핵산은 이에 연계된 말단 링크 프라이머와 더불어 10개의 단일가닥을 형성하고, 서열확인 프라이머에 결합하고, 또한 상술한 바와 같이 본 발명에서 제공한 서열확인 장치에 적용된다.
2.2.3.2. 유전자 발현 프로파일링
또 다른 구현예에서, 본 발명과 일치하는 검출장치를 이용하여 유전자 발현 프로파일링 용도의 cDNA를 서열확인한다. 예를 들어, 하나의 장치에서 특정 서열을 검출하는 횟수를 측정하여 mRNA 레벨을 정량분석한다. 수백만개의 cDNA 분자를 본 발명에서 제공한 장치로 동시에 서열확인한다. 1개의 세포가 평균 350,000개의 mRNA 분자를 함유하는 경우, 세포당 1회 복제 시 존재하는 전사체는 100만 서열확인 반응 시 대략 3회 서열확인 하는 것으로 예측된다. 따라서, 본 발명에서 제공한 장치는 단일 복제수 민감도(sensitivity)를 갖는 단일분자 서열확인에 적합하다.
cDNA 합성은 널리 공지되어 있으며 통상 mRNA를 선택적으로 농축하는 총 RNA 추출법을 포함한다. cDNA는 mRNA로부터 단계식으로 생성되며, 예를 들어: 첫 번째 가닥을 합성하기 위한 역전사; 잔류 RNA를 제거하기 위한 RNAse 처리; 첫 번째 가닥의 무작위 헥사머 프라이밍 및 DNA 폴리머라제를 이용한 두 번째 가닥의 합성 등을 포함한다. 결과로 나온 cDNA는 본 발명에서 제공한 장치에서 서열확인 하기에 적합하다. DNA와 RNA를 모두 분리 및 제조하는 방법은 널리 공지되어 있다. 아에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Joseph Sam brook and David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd 30 edition (2001)]을 참조할 수 있다.
2.2.3.3. 기타 검출방법
(a) FRET
어떤 구현예에서, 때로 형광 공명에너지 전달이라고도 하는 포스터 공명에너지 전달(FRET)에 따라 본 발명에서 제공한 검출장치로 분자를 검출한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 여기된 공여체 분자가 비방사적으로 수용체 분자에 에너지를 전달할 때 FRET가 일어하고 이에 따라 에너지를 통상 광 형태로 방출한다. FRET는, 예컨대, 검출될 분자에 관한 유효 여기와 방출 파장 간의 스펙트럼 분리를 통하여 후광(background light) 감소에 조력할 수 있다. FRET는 종종 분자간 밀접한 상호작용을 검출하는데 이용되며 이는 그 효과가 공여체와 수용체 분자간 거리의 6제곱 비율로 감소하기 때문이다. 예를 들어, Zhang 등(Nature Materials 4:826-31 (2005))은 FRET에 따라 핵산 혼성화를 검출하였다. 여기서, 비오티닐화 핵산 타겟은 아비딘 코팅된 양자점 공여체에 결합하고 이에 따라 Cy5-결합 DNA 프로브를 여기시켰다. 어떤 구현예에서, 라벨화된 포집분자와 라벨화된 시료분자는 FRET로 검출하기 위한 공여체/수용체쌍(혹은 그 반대)을 형성한다.
본 발명에 의한 핵산 서열확인의 어떤 구현예에서, 형광라벨 뉴클레오타이드는 폴리머라제나 리가제에 부착된 공여체 발색단을 위한 수용체 발색단 역할을 한다. 따라서 이 구현예에서, 폴리머라제나 리가제 상에 위치한 공여체 발색단은 시료핵산에서 중합되거나 또는 이에 유전자연결되는 뉴클레오타이드에 수용체 발색단을 여기한다. 폴리머라제에 근접하지 않은 뉴클레오타이드는 FRET 효과의 급속감소 탓에 여기되지 않는다. 어떤 구현예에서, 공여체 분자는 예컨대 양자점 등의 또 다른 형광체이다. 반도체 양자점 같은 양자점은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 국제 특허공보 WO 제03/003015호 등에 개시되어 있다. 양자점을 생체분자 등에 결합시키는 방법도 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 문헌[Mednitz et aI., Nature Materials 4:235-46 (2005)], 또한 2006년 3월 30일 및 2008년 4월 17일에 각각 공고된 미국 특허공보 제2006/0068506호 및 제2008/0087843호 등에서 이를 개시하고 있다. 어떤 구현예에서, 양자점은 DNA 폴리머라제 분자에 접합된다. 연결자 부위에 대한 효소 접합에 관하여 상술한 바와 같이 숙련된 기술자라면, 형광체를 DNA 폴리머라제나 리가제 등에 접합하는 경우, 형광제를 효소의 1차, 2차 및 3차 구조에 접합할 때의 영향을 감소시켜 효소의 기능을 보존하기 위해 신중을 기해야 한다는 점을 숙지할 것이다.
(b) 다중광양자 여기
어떤 구현예에서, 발색단은 2개 이상의 광양자에 의해 여기된다. 예를 들어, 어떤 구현예에서 FRET 과정에서 공여체나 수용체 발색단의 여기는 2개 이상의 광양자를 통해 이루어진다. 2개의 광양자 및 다중광양자의 여기는 예컨대 미국특허 제6,344,653호 미 제5,034,613호에 기술되어 있다.
(c) 시간 분해 검출
어떤 구현예에서, 본 발명에 의한 장치의 여기 광원 및 광검출기는 특성상(characteristic phase) 변이를 갖도록 조절한다. 예를 들어, 2008년 2월 14일 공고된 미국 특허공보 제2008/0037008호에 발표된 바와 같은 공지의 방법을 이용하면, 본 발명에서 제공한 장치로 검출할 분자에서 방출된 광을 이에 상응하는 광검출기로 여기 광원의 간섭없이 측정할 수 있다.
(d) 기타의 형광 검출장치 및 방법
어떤 구현예에서, 본 발명의 방법은 살아있는 세포 혹은 고정세포 등 생물학적 세포 내의 적어도 하나의 대상물로부터 방출된 광을 검출하는 것과 관계가 있다. 어떤 구현예에서 상기 적어도 하나의 대상물은, 적어도 하나의 양자점을 함유한 적어도 하나의 대상물, 적어도 하나의 형광단백질을 함유한 적어도 하나의 대상물, 및 작은 형광성 화학성분을 함유한 적어도 하나의 대상물 중에서 선택된다. 어떤 구현예에서, 상기 적어도 하나의 대상물은 형광라벨화 되어 있으며 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 또는 지질 등을 포함한다.
어떤 구현예에서, 상기 적어도 하나의 대상물은 한정된 소정수의 형광체, 예컨대, 최대 20개, 10개, 5개 또는 2개의 형광체를 포함하며, 이는 양자점, 형광단백질 및 작은 형광성 화학성분 등에서 선택될 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 적어도 하나의 대상물은 양자점, 형광단백질 및 작은 형광성 화학성분 등에서 선택된 단일 형광체를 포함한다. 작은 형광성 화학성분에 대한 다수의 예를 위에서 검토하였다. 어떤 구현예에서, 작은 형광성 화학성분은 300 내지 800㎚ 범위의 방출피크 및/또는 최소한 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9의 양자장(정점 흡수파장의 광양자 당 방출된 광양자의 비율)을 갖는다.
2.3. 생체분자 분석 서비스(혹은 용역)
본 발명은 또한 본 발명과 일치하는 구현예에 따른 검출장치를 이용하여 생체분자 분석을 수행하는 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 방법은 용역(분석) 의뢰자에게서 얻은 분석대상인 생체분자가 포함된 시료를 용역 제공자에게 제공하고 다시 용역 의뢰자가 상기 분석의 결과를 상기 용역 제공자로부터 수용하는 것을 포함하며, 상기 결과는 본 발명에서 제공한 장치를 이용하여 얻을 수 있다. 어떤 구현예에서, 예컨대 상기 방법은 용역 비용이나 용역 계약 동의서 등의 이익을 고려하여 수행한다. 또한, 시료는 용역 의뢰자와 용역 제공자 사이에서 직접 전달하거나 판매자가 이를 중개할 수도 있다. 어떤 구현예에서, 용역 제공자나 판매자는 지리학적으로 미국 이외의 지역, 즉, 타국에 존재할 수 있다.
3. 실시예
3.1. 실시예 1
도 16a 내지 16d는 도 3에 도시한 나노웰(121, 122, 123 및 124)에 대한 컴퓨터-시뮬레이션 결과를 각각 도시한다. 상기 시뮬레이션에서, 유한-차분-시간-구역법(FDTD)을 이용하여 파장의 종방향으로 전파 및 유효 여기 영역을 지나치거나 이를 통과하는 여기광의 전기장 분포를 계산하였다. 전기장의 강도는 도파관 내의 광의 전자기장 강도를 나타낸다. 도 16a 내지 16d 에서, 전기장의 강도는 임의의 단위로 도시한다.
실제 상황을 더욱 가깝게 모사하기 위해, 상기 시뮬레이션에서 100㎚ 직경의 입자는 나노웰의 바닥면에 근접하는 것으로 가정하였다. 입자의 굴절률은 2.5로 설정하였다. 코어층의 굴절률을 2.25로 설정하고 상부 및 하부 클래딩층의 굴절률을 1.45로 설정하였으며, 나노웰에 충전된 시료액의 굴절률은 1.33으로 설정하였다. 코어층 두께는 100㎚로 설정했다. 또한, 나노웰 바닥면의 직경은 4종류의 나노웰(121, 122, 123 및 124) 모두에 대해 50㎚로 설정했고, 코어층과 상부 클래딩층 사이의 계면에 대한 나노웰 측벽의 각도는 60°로 설정했다. 나노웰(121)의 시뮬레이션에서, 나노웰의 바닥면은 클래딩층과 코어층 사이의 계면으로부터 이격된 거리를 50㎚로 했다. 나노웰(123)의 시뮬레이션에서, 코어층 속으로 연장한 나노웰의 깊이는 50㎚로 설정했다. 즉, 나노웰(123)의 바닥면은 코어층의 중심에 위치하도록 했다. 도 16a 내지 16d의 좌측 도면은 각각 상이한 나노웰(121, 122, 123, 124)을 구비한 도파관 내에서 시간평균의 전기장 분포를 도시한다. 도 16a 내지 16d의 우측 도면은 각각 상이한 나노웰(121, 122, 123, 124)을 구비한 도파관 내에서 수직 방향으로의 전기장 분포를 도시한다.
3.2. 실시예 2
이 실시예는 473㎚의 파장을 가진 TE 모드광 및 550㎚의 파장을 가진 TM 모드광이 각각, 도 5에서 도시한 구조와 같이, 금속 패턴을 통과할 때의 투과율의 시뮬레이션 결과를 격자구조 주기 및 금속 패턴의 깊이에 대한 함수로서 예시한다.
도 17a는 금속 패턴을 통과한 TE 모드광의 모의 투과율 대 금속 패턴의 격자구조 주기를 도시한다. 도 17a의 상이한 곡선은 상이한 값의 금속 패턴 깊이에서 계산한 결과를 나타낸다. 도 17b는 금속 패턴을 통과한 TM 모드광의 모의 투과율 대 금속 패턴의 격자구조 주기를 도시한다. 도 17b의 상이한 곡선은 상이한 값의 금속 패턴 깊이에서 계산한 결과를 나타낸다.
도 17b에서 금속 패턴의 격자구조 주기가 300㎚ 미만인 경우 TM 모드광의 투과율은 약 30% 이상인 것을 볼 수 있으며, 이는 TE 모드광의 투과율보다 훨씬 높은 값이다. 따라서, 고 SNR(즉, TM 모드광과 TE 모드광의 투과율 비)는 격자구조 주기가 300㎚ 미만일 때 인지되는 것으로 예상한다. 도 17c는 SNR 대 상이한 값의 금속 패턴 깊이에서 계산한 금속 패턴의 격자구조 주기를 도시한다. 예를 들어, 격자구조 주기가 250㎚ 이고 깊이가 150㎚ 일 때 SNR이 10을 초과할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 격자구조 주기와 깊이가 각각 110㎚ 및 250㎚ 인 경우 SNR은 107 이상이다.
3.3. 실시예 3
이 실시예는 도 5에 도시한 구조에서 금속 패턴을 통과하는 TE 모드광과 TM 모드광의 투과율 계산값을 예시한다. 이 실시예에서, 나노구조의 금속 패턴(152)은 알루미늄으로 제작되며 알루미늄 패턴을 둘러싸는 하부 보호층(144)은 산화실리콘으로 제작된다. 알루미늄 패턴의 주기값 및 깊이는 각각 110㎚ 및 245㎚ 이다. 도 18a 및 18b는 TE 모드광 및 TM 모드광의 각각의 투과율을 입사각의 함수로서 도시한다. 상기 도 18a 및 18b에서, 입사각의 절대값이 0에서 60°이상으로 증가할 때 TE 모드광의 투과율이 10-8에서 10-12으로 감소하는 것을 볼 수 있다. 반면에 TM 모드광의 투과율은 -60 내지 60°의 입사각 범위에서 항상 60%를 상회한다.
3.4. 실시예 4
도 19는 도 20에 도시한 프리즘 커플러의 FDTD 시뮬레이션 결과를 도시한다. 이 시뮬레이션에서, 프리즘과 도파관 간의 틈새 간격은 73㎚로 설정했다. 폴리카보네이트(n=1.6)을 코어층 물질로 사용하였고 코어층 두께는 2㎛으로 설정했다. TM 모드의 입사광(λ=430㎚)을 사용하였다. 약 60% 정도인 프리즘 커플러의 결합효율을 측정하기 위하여 실험하였다. 예를 들어, He-Ne 레이저 등의 광원이 약 2 ㎽ 전력의 광을 방출할 경우, 여기광으로서 도파관에 결합된 광의 전력은 약 1.2 ㎽이다.
3.5. 실시예 5
도 21은 도 7에 도시된 도파관(110)에 결합한 입사광의 모사 반점을 도시한다. 상기 시뮬레이션에서, 구경의 직경이 0.5 mm이고 두께가 0.2 mm인 PMMA 재질의 원통형 렌즈를 레이저빔 형상화에 이용했다. 렌즈에서 도파관까지의 투영거리는 1 mm이다. 도 22a 및 22b를 참조한다. 반점의 두께는 약 300㎚이고 결합효율은 약 70% 이었다. 예를 들어, He-Ne 레이저 같은 광원이 약 2 ㎽ 전력의 광을 방출할 경우, 여기광으로서 도파관에 결합한 광의 전력은 약 1.4 ㎽이다.
3.6. 실시예 6
도 23은 도 9에 도시된 도파관에 있어서 하부 클래딩층의 두께에 대한 코어층(112)에 결합된 광의 전력 의존도를 측정한 값을 한가지 예로서 도시한다. 상기 측정에서, 격자구조 주기는 410㎚이고 코어층의 두께는 100㎚이었다. 또한, 입사광의 파장은 약 633㎚이었다. 도 23에서, 코어층에 결합한 광의 전력은 입사전력에 대해 표준화한다.
3.7. 실시예 7
FDTD 시뮬레이션은 도 8 및 9 각각에 도시된 격자구조 커플러에서 실행하였다. 시뮬레이션에서, 도 8 및 9에 나타낸 제1 격자구조의 주기값은 410㎚로 설정했고 도 9에 나타낸 제2 격자구조의 주기값은 300㎚로 설정했다. 양측 격자구조의 깊이는 모두 55㎚로 설정되었다. 입사광은 473㎚의 파장 및 5㎛의 빔직경을 갖도록 설정했으며; 코어 및 클래딩층의 굴절률은 각각 2.196 및 1.445로 정했다. 도 24 및 25는 도 8 및 9에 각각 도시한 구조의 모의 순간전기장(instantaneous electric field) 분포를 도시한다. 상기 도 8 및 9에 나타낸 구조의 결합효율 계산값은 각각 20% 및 25%이었으며, 이는 제2 격자구조(404)를 추가함으로써 결합효율이 증가함을 입증한다.
3.8. 실시예 8
도 11에 도시한 구조에 대해 계산 처리했다. 계산시, 격자구조(406)의 유효 굴절률은 2.2, 코어층(112) 및 클래딩층(114)과 (116)의 유효 굴절률을 각각 1.6과 1.45로 설정했다. 또한 격자구조의 주기값과 깊이는 321㎚ 및 120㎚로 각각 설정했다. 이와 같은 조건하에, 473㎚의 파장을 갖고 격자구조(406)에 수직 입사되는 입사광의 경우, 결합효율은 29%로 계산되었다.
3.9. 실시예 9
표 1은 상이한 조건에서 광발광 물질인 4-(다이사이아노메틸렌)-2-메틸-6-(p-다이메틸아미노스티릴)-4H-피란(DCM) 도핑된 폴리비닐피로디온(PVP) 및 프탈로사이아닌을 이용하는 흡수-방출광 커플러로부터 방출된 광의 전력밀도를 계산한 결과를 나타낸다. 표 1로부터, 동일한 입사광에 있어서 도파관에 결합된 광의 전력밀도가 37.67 W/㎠ 로 높은 것을 알 수 있다.
광발광 물질 DCM 도핑된 PVP DCM 도핑된 PVP DCM 도핑된 PVP
d1 (㎝) 0.0002 0.0002 0.0002
d2 (㎝) 2.0 2.0 2.0
L (㎝) 3.0 3.0 3.0
광발광 물질의 농도(M) 0.04 0.04 0.04
λ1 (nm) 465 465 465
λ2 (nm) 630 630 630
스톡스 변이 (λ1-λ2,㎚) 165 165 165
Po (λ1) (w) 1.0 1.0 1.0
λ1에서의 입사광의 전력밀도 (W/㎠) 1.0 1.0 1.0
ΦFL 0.6 0.6 0.6
R1 0.90 0.90 0.90
ηC 0.0850 0.0850 0.1850
P(λ2)/Po(λ1) 0.0060 0.0103 0.0226
λ2에서의 여기광의 전력밀도 (W/㎠) 9.92 17.17 37.67
3.10. 실시예 10
DNA 분자는 여기서 개시한 검출장치를 이용하여 서열확인 한다. 본 실시예의 검출장치는 광원, 광 커플러, 도파관의 상부 클래딩층에 나노웰 어레이를 구비한 평면형 도파관 및 도파관 아래에 형성된 검출 어레이를 포함한다.
이 실시예에서, 광원은 약 633㎚ 파장의 광을 방출하는 He-Ne 레이저이다. He-Ne 레이저의 전력은 약 2 ㎽이다. 광 커플러는 PMMA 재질의 원통형 렌즈로 구성된 측면 커플러이다. 원통형 렌즈는 구경의 직경이 약 0.5㎜이고 두께는 약 0.2㎜이며, 도파관의 측면에서 약 1㎜의 간격을 두고 배치되어 있다. 검출 어레이는 1000개의 광검출기로 구성되며 이들 각각은 실리콘 광다이오드이다.
평면형 도파관은 약 100㎚ 두께의 코어층과 상부 및 하부 클래딩층을 포함한다. 코어층은 굴절률이 약 2.05인 질화실리콘으로 제작한다. 상부 및 하부 클래딩층은 굴절률이 약 1.46인 산화실리콘으로 제작한다. 상부 클래딩층 내에 형성된 나노웰 어레이는 1000개의 나노웰을 포함한다. 각각의 나노웰에는, 나노웰에 포집된 분자가 방출한 광을 검출하는데 이용되는 광검출기가 존재한다.
각 나노웰은 원형의 수평 단면을 가진 깔대기 형태이다. 나노웰은 상부 클래딩층의 전체 길이를 통해 연장하므로 코어층을 노출시킨다. 나노웰의 바닥면의 직경은 약 50㎚이다. 나노웰의 측벽과 수직방향 사이의 각도는 약 30°이다. 각 나노웰에 형성된 유효 여기 영역은 약 1 아토-리터(al)이다.
핵산 폴리머라제는, 나노웰 유효 여기 영역당 접근가능한 활성 폴리머라제의 평균 밀도가 약 1인 나노웰의 바닥면에 화학 결합한다.
1 아토-리터당 0.1 분자의 농도에서 평균길이가 200 nt인 원형 단일가닥 DNA 분자를 적절한 서열확인 반응 완충액에 가하여 얻은 용액을 검출장치에 이용한다. 원형 DNA 분자는 불명의 시료서열에 대해 약 20 nt 3'의 공지된 인서트 서열을 포함한다. 상기 공지된 인서트 서열에 대해 상보적인 서열결정 프라이머, 또한 합성에 의한 가역성 종결자 서열확인에 적합한 차단기를 가진 형광라벨 dNTP 유사체를 제공한다. 복수의 나노웰에는 폴리머라제, DNA 분자 및 서열확인 프라이머로 된 3성분 착체가 형성되어 있으며, 상기 폴리머라제는 형광라벨 dNTP 유사체를 상기 서열확인 프라이머의 3' 말단에 부가한다.
He-Ne 레이저에서 방출된 광은 측면 커플러에 의해 부분적으로 도파관에 결합한다. 도파관에 결합한 광의 일부는 코어층에 침투하여 여기광 역할을 한다. 복수의 나노웰에서, 형광라벨 dNTP 유사체는 나노웰 바닥면 근처에 형성된 유효 여기 영역에 들어간 여기광에 의해 여기되며 형광광을 방출한다. 이 형광광은 검출기에 의해 검출되고 그 뒤 출력신호를 발생하며, 이 신호를 처리하여 서열확인 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드 유사체에 포함된 염기를 확인한다.
복수의 나노웰에서, 형광체 및 차단기는 화학적 방법으로 제거한다. 그 다음, 폴리머라제는 또 다른 형광라벨 dNTP 유사체를 가하고 이는 다시 상술한 바와 같이 검출한 후 제거한다. 이와 같은 사이클을 충분한 시간과 횟수로 반복하여(예컨대, DNA 분자를 서열확인 및 서열 재확인하여) DNA 분자의 길이의 적어도 2배에 해당하는 서열확인 리드를 얻는다.

Claims (9)

  1. 단일분자 검출장치로서,
    a) 기판 위에 형성되고, 코어층, 제 1클래딩층, 및 상기 제 1클래딩층 위에 직접 배치되는 제 1불투명 보호층을 포함하는 도파관(waveguide)으로서, 곡선 구성(curved structure)의 패턴화된 격자구조가 상기 코어층의 노출부 위에 배치되고, 적어도 하나의 나노웰이 적어도 상기 제 1클래딩층 내에 형성되는, 도파관;
    b) 상기 기판 상에 또는 상기 기판 내에 형성된 적어도 하나의 광검출기; 및
    c) 상기 도파관과 상기 광검출기 사이에 배치되어, 대상체로부터 방출된 광을 통과시키지만 여기광에 의해 발생된 잡음을 저감시키는 광학필터를 포함하고,
    상기 적어도 하나의 나노웰과 상기 광검출기는 상기 도파관의 대향면에 각각 배치되는 것인 단일분자 검출장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 광검출기는 다중접합 광다이오드인 것인 단일분자 검출장치.
  3. 제 1항에 있어서, 여기광을 흡수하는 상기 적어도 하나의 나노웰에 함유된 단일분자물(single molecule object)이 다른 단일분자물을 형광 공명(fluorescence resonance) 에너지 전달을 통해 더 여기시킴으로써 상기 다른 단일분자물은 상기 검출기에 의해 검출될 광을 방출하는 것인 단일분자 검출장치.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 코어층과 상기 검출기 사이에 배치된 제2의 불투명 보호층을 더 포함하는 단일분자 검출장치.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제 1불투명 보호층과 제 2불투명 보호층은 Al, Ti, Ni, Cr, Au, Ag, Cu, Pt, Pd 또는 이들 중 두 가지 이상의 합금 중에서 선택된 물질로 제작되는 것인 단일분자 검출장치.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 제 2불투명 보호층은 상기 적어도 하나의 나노웰에 함유된 단일분자물에서 방출된 광이 상기 광검출기에 도달할 수 있도록 상기 적어도 하나의 나노웰과 상기 광검출기 사이에 배치된 홀(hole)을 구비하는 것인 단일분자 검출장치.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 코어층의 표면 조도(surface roughness)가 0.3㎚ 미만인 것인 단일분자 검출장치.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 나노웰의 바닥부의 크기가 대략 상기 여기광의 파장보다 더 작은 것인 단일분자 검출장치.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 나노웰의 바닥부에 수직인 방향에 대한 상기 적어도 하나의 나노웰의 측벽의 각도가 60도 미만인 것인 단일분자 검출장치.
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