CN102713572B - 单分子侦测装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一用来侦测可发射光线之目标物的装置。此装置包括一光源(102)以及一导波器(110)。上述导波器(110)包括一核心层(112)以及一上部被覆层(114)。至少一奈米井(120)形成于至少上述上部被覆层(114)中。本发明提供的装置更包括一光侦测器(106)。此光侦测器(106)可侦测自一包含于至少一奈米井(120)中的单一分子目标物所发射出来的光。

Description

单分子侦测装置
【发明所属之技术领域】
本发明关于一侦测装置，以及利用此侦测装置来侦测一目标物的方法。此外，本发明尚关于一侦测装置，其可侦测自一目标物，例如一单分子目标物，发射出之低强度的光。
【先前技术】
人类基因体计划（HumanGenomeProject,HGP）刺激了DNA定序通量上的快速增加。这种增加，随着技术的改进，使得定序的成本相对应的下跌。对比于第一组基因体定序费时13年并花费将近三十亿美金，目前的基因体定序成本已经明显降低-实际上最近已经又完成两组个人基因体定序（McGuireetal.,Science317:1687(2007)）。对于病患及健康照护提供者来说，个人的基因体代表一医学治疗上之方法的典范转移（paradigmshift）。藉由管理疾病的遗传危险因子（geneticriskfactors），健康照护提供者可更容易地实践预防医学，并且提供病患客制化的医疗照护。利用已建立完成的基因体数据库，药物设计以及给药可更有效率，因此加速了药物基因体学（pharmacogenomics）之新生领域的发展。
大部分传统的化学或生物化学分析系根据”集体（bulk）”检测。在上述检测中，检测在样本溶液之特定体积中的复数个分子的集体行为（collectivebehavior），以决定分子的特性。最近几年，单分子的侦测已经变得可行。单分子侦测提供远高于传统上集体检测的灵敏度，以及提供更详细的信息，很快地变成一种新趋势。Moerner,W.E.与Fromm,D.P在单一分子侦测的方法的回顾评论，”单分子荧光光谱及显微镜使用的方法（REVIEWARTICLE:Methodsofsingle-moleculefluorescencespectroscopyandmicroscopy）”，ReviewofScientificInstruments74(8):3597-3619(2003)，以及Walter,N.G.等人”自己动手指南：如何使用现代单分子工具组（Do-it-yourselfguide:howtousethemodernsingle-moleculetoolkit）”，NatureMethods5:475-489(2008)中描述讨论已经用于或计划用于单分子侦测的方法与设备的可行性。
美国专利号U.S.PatentNo.7,170,050提供一用于单分子侦测之零阶模式导波器（zero-modewaveguide,ZMW），上述零阶模式导波器由一金属薄膜以及复数个形成于其中的孔洞所组成，上述金属薄膜以及复数个孔洞构成ZWM的核心区域。当入射光线的波长比在ZMW核心区域中之传导光线的截止波长（cutoffwavelength）长时，入射光线将会被禁止在ZMW中传播。因此当具有比在ZMW核心区域中之截止波长更长之波长的光线入射到ZMW的入口时，光线将不会沿着ZMW的方向传播。相反地，光线的强度将会沿着ZMW方向以指数方式衰退，在ZMW的入口形成一消逝波（evanescent）的光场。因此在消逝波区域内提供一特殊的激发区，在此激发区中分子被可以被激发，并且发射出的光线可以被共轭焦显微镜（confocalmicroscope）所捕捉。然而，ZWM可被侦测的数量受限于共轭焦显微镜（confocalmicroscope）的数值孔径（numericalaperture，N/A），并且相对地限制可被观察分析的样品数量。美国专利号U.S.PatentNo.7,486,865提供了一种隐藏式（recessed）的ZWM，其中藉由将ZWM延伸进入底层基板（underlyingsubstrate）中以形成上述隐藏式（recessed）的ZWM。这样的结构配置增加了可被观测区域的体积（observationvolume）以及相对更强之光学讯号（signallevel）。然而，上述结构配置仍然有规模放大（scale-up）的问题以及可被观察分析的样品数量受限的问题。
因此，业界亟需一种侦测目标物的装置，尤其是该目标物，例如一单分子目标物，能发射出低强度之光。
【发明内容】
本发明提供一种侦测装置可以用来侦测会发光的物体，包括：a)一导波器；该导波器包括：一核心层；以及一第一被覆层；其中至少一奈米井形成于至少该第一被覆层中；以及b)至少一光侦测器，该光侦测装置可以用来侦测从至少一奈米井中的单一分子所发射出的光。
本发明另提供一种单分子的侦测方法，包括：藉由一光源发射一入射光；藉由一耦合器将该入射光耦合进入一导波器中，以在该导波器中形成一激发光；藉由该激发光及形成于至少一该导波器之被覆层中的至少一奈米井，形成一有效激发区；以及藉由该激发光激发一在有效激发区中的单分子目标物，使该单分子目标物发射出一光线可以被一光侦测器所侦测。
本发明尚提供一种核酸的定序方法，包括下列步骤：提供一侦测装置，包括：一导波器，该导波器包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一奈米井至少形成于该第一被覆层中；以及至少一光侦测器；提供至少一核酸分子；将该至少一核酸分子个别地定位(localizing)于至少一奈米井中；进行该至少一核酸分子的单分子合成定序，其中该单分子核酸的合成定序导致光线的发射，该发射的光线与至少一该核酸中的碱基之特性有关；利用该侦测器侦测该发射光，产生一输出讯号；以及处理该输出讯号以决定至少一该核酸所包含的碱基之特性。
为让本发明所述之目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举出较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如后。可藉由在权利要求中所特别指出的要素和组合来了解及得到本发明所述之目的、特征、和优点。
应可了解，本发明说明书之描述与图式亦仅仅作为说明之用而非用来限定本发明。本发明之保护范围当视后附之权利要求所界定者为准。
本说明书中所附图式系用来配合本发明之说明，并成为本发明之说明的一部分，与说明书中所述内容共同描述本发明之多个实施例，用来解释其原理。
【图式简单说明】
第1图系依据本发明实施例之侦测装置的示意图。
第2图系依据本发明实施例之不同大小的奈米井的示意图。
第3图系依据本发明实施例之不同的奈米井设计的示意图。
第4图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第5图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第6图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第7图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第8图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第9图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第10图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第11图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第12图系依据本发明实施例，描述一吸收发射光耦合器（absorbing-emittinglightcoupler）。
第13图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第14图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第15图系依据本发明的一实施例之侦测装置的示意图。
第16A-16D图显示不同奈米井之计算机仿真结果。
第17A及17B图显示横向电波（transverseelectric，TE）以及横向磁波（transversemagnetic，TM）光线穿过第5图中所示之金属光栅（metalgrating）的透光性（transmittances），与金属光栅的光栅周期（gratingperiod）及深度的关系。
第17C图显示在第17B图比第17A图中数据的比值。
第18A及18B图显示光线穿过第5图中所示之金属光栅（metalgrating）的透光性（transmittances），与光线之入射角度的关系。
第19图显示第20图中所示之侦测装置的计算机仿真结果。
第20图系一利用棱镜作为耦合器的范例侦测装置之示意图。
第21图系被耦合进入第7图中所示之侦测装置的导波器的入射光线之仿真斑驳噪声（speckle）。
第22A及22B图系一用于第20图所示之仿真的侦测装置中的透镜。
第23图显示耦合进入第9图所示之侦测装置的导波器中之光线的测量功率。
第24图显示第8图中所示之侦测装置的计算机仿真结果。
第25图显示第9图中所示之侦测装置的计算机仿真结果。
【实施方式】
传统上用于集体检测（bulkassay）的装置，其包括小型化的集体检测（miniaturizedbulkassay），以及用于单分子侦测的装置可共享许多基本组件并且可具有相似的装置结构。然而，要实现单分子侦测，系统必须至少满足下列两个条件：1)应兼具有一限制的激发空间（confinedexcitationspace）以及一限制的观测空间（confinedobservationspace），以及2)上述两空间应完全或部分重迭，且该重迭的面积应该够小到足以确保自目标单分子发射出来的光线高于背景值，以提供产生可检测出来的信号噪声比（signal-to-noiseratio,SNR）。例如，重迭面积的体积通常必须接近或小于10的-15次方公升（femtoliter）。尤其是，重迭面积的体积通常必须在10的-18次方公升（attoliter）至10的-21次方公升（zeptoliter）的范围之间。此外，防止激发光到达侦测器也是很重要的条件。
本发明实施例包括一侦测装置及使用此侦测装置来侦测一如单分子目标物的目标物的方法。上述侦测装置可以侦测自目标物发射出来的微弱光线。
下文中，将配合图示详细地描述实施例。在整个图式中任何可能的地方，相似之组件系使用相同之组件符号。
1.本发明的侦测装置
此处所描述的侦测装置可侦测一目标物，如一单分子目标物。上述目标物可为一冷光源（sourceofluminescence），例如一荧光染料分子（fluorescentdyemolecule）、一磷光染料分子（phosphorescentdyemolecule）、一量子点（quantumdot）、或一发光的奈米粒子（light-emittingnanoparticle）。上述目标物亦可为一光散射（light-scattering）粒子。此外，上述目标物可为一没有发光能力的目标分子（targetmolecule），但其可黏附至一卷标对象（labelingobject）。因此，可藉由卷标对象来辨识目标分子。不只一个卷标对象可黏附至一目标分子。
1.1侦测装置概述
本发明的侦测装置可包括至少一光源，其可发射出光线，上述光线可至少部分耦合进入导波器中，以作为一激发光来激发目标物。光源可为，例如：如氦氖雷射（He-Nelaser）等的雷射，以及雷射二极管（laserdiode,LD）、发光二极管（lightemittingdiode,LED）、有机发光二极管（organiclightemittingdiode,OLED）、量子点发光二极管（quantumdotlightemittingdiode,QLED）、光纤光源（fiberlight）、或弧光放电荧光灯（arcdischargefluorescentlamp）。
本发明的装置可包括一导波器。上述导波器可为管道波导（channelwaveguide）或平面波导（planarwaveguide）。导波器可包括一核心层以及至少一被覆层。例如，如果导波器为管道波导，其可包括一核心层以及一围绕着核心层的被覆层。另举一个范例，若导波器为平面波导，其可包括一核心层以及一配置在核心层上的被覆层，或核心层夹在两个被覆层中间。核心层可具有比至少一被覆层更高的折射率。激发光可在导波器的核心层中传播。
依据本发明的实施例，至少一奈米井可形成于至少一被覆层中。上述奈米井可包含一上部开口及一底面，其中的上部开口可比底面大。上述奈米井可延伸穿过上述至少一被覆层的部份厚度、上述至少一被覆层全部厚度、上述至少一被覆层的全部后度与上述核心层的部分厚度、上述至少一被覆层的全部后度与上述核心层全部厚度。上述有效的激发区之下部边界可形成于奈米井的底部附近。上述有效的激发区之下部边界可为奈米井的底部。在奈米井中，可由垂直于核心层的纵向方向（亦即在下文中所述之垂直方向）之激发光所能够到达的距离，来定义有效的激发区之上部边界（下文中，垂直方向）。
本发明的侦测装置可包括复数个奈米井。因此，上述装置亦可用于监测大量的目标物。
本发明的侦测装置可包括一侦测自目标物发射出来之光线的光侦测器。根据本发明，上述光侦测器可包括一光学传感器（opticalsensor），其能够至少吸收部份位于其上的入射光线，并产生对应此光线强度的输出讯号。上述光学传感器可为例如一p-i-n光电二极管、一多接面光电二极管（multi-junction）、雪崩光电二极管（avalanchephotodiode,APD）、一光敏晶体管（phototransistor）、一量子井红外线光探测器（quantum-wellinfraredphotodetector,QWIP）、光电导型光学传感器（photoconductivetypeopticalsensor）、光电伏打型光学传感器（photovoltaictypeopticalsensor）、一在特殊应用集成电路（ApplicationSpecificIntegratedCircuit,ASIC）上的薄膜（thin-filmonASIC,TFA）、一金属-半导体-金属（metal-semiconductor-metal,MSM）光探测器、电荷耦合装置（chargecoupleddevice,CCD）、一互补式金氧半导体（ComplementaryMetal-Oxide-Semiconductor,CMOS）、或一上述之结合。
根据本发明，上述光侦测器可包括一控制光侦测器的运作之控制电路。上述控制电路可包括一讯号放大器（signalamplifier）的电路、模拟／数字信号转换器（A/Dconvertor）、积分器（integrator）、比较器（comparator）、逻辑电路（logiccircuit）、读出电路（readoutcircuit）、内存、微处理器（microprocessor）、时钟、及/或地址（address）。
根据本发明，上述光侦测器可配置于自目标物发射出来的光可到达的地方。例如，光侦测器可配置于核心层之相对于奈米井的对侧。也就是说，若奈米井以垂直方向配置于核心层的一侧上，光侦测器则以垂直方向配置于核心层的另一侧上。
本发明的侦测装置可包括一光耦合器。上述光耦合器可将至少部分自至少一光源发射出的光线耦合进入导波器中。上述光耦合器可为，例如，一棱镜耦合器（prismcoupler）、一光栅耦合器（gratingcoupler）、一侧向注入耦合器（side-injectioncoupler）、一垂直注入耦合器（vertical-injectioncoupler）、或一同向耦合器（co-directionalcoupler）。
1.2范例侦测装置
参见第1图，说明依据本发明之侦测装置100的示意图。在一些实施例中，侦测装置100可包括一光源102、一光耦合器104、一光侦测器106、以及一平面导波器110。平面导波器110可形成于一基板上（未显示）。光侦测器106可形成于上述基板上或基板内。
光源102可发射一光线，藉由光耦合器104，可将光线至少部分耦合进入平面导波器110。耦合进入平面导波器110的光线可沿着平面导波器110的核心层传播，并作为激发光。
1.2.1导波器
如第1图中所示，在一些实施例中，平面导波器110可包括一核心层112、一上部被覆层114、以及一下部被覆层116。核心层112可包括一具有反射率n2的材料，例如：硅钛氧化物（silicon-titaniumoxide,SixTi1-xO2，其中0<x<1）、氧化钛（titaniumoxide）、氧化钽（tantalumoxide）、氧化铌（niobiumoxide）、氧化铪（hafniumoxide）、氧化铝（aluminumoxide）、氧化锆（zirconiumoxide）、氮化硅（siliconnitride）、氮化铝（siliconnitride）、氮化钛（titaniumnitride）、聚碳酸酯（polycarbonate,PC）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate,PMMA）、或光阻剂(如:Su8)。上部及下部的被覆层114和116可包括分别具有折射率n3及n4的材料。上部及下部的被覆层114和116的材料可相同或相异。适用于上部及下部的被覆层114和116的材料可包括，例如：氧化硅（siliconoxide）、氟化镁（magnesiumfluoride）、氟化钙（calciumfluoride）、氧化铝、光阻剂(如:Su8)、PMMA、或聚碳酸酯。核心层112的折射率n2可大于上部及下部的被覆层114和116之折射率n3及n4。
如上所述，以单分子侦测而言，需要避免激发光到达侦测器。在平面导波器中，核心层的表面可能不如预期中的平滑。核心层粗糙的表面可散射一部分的激发光。据估计，当核心层的表面粗糙度约0.3nm，约0.01%的激发光会被散射并产生噪声。为了降低来自在核心层中传播的激发光之表面散射的噪声，核心层的表面粗糙度应小于约0.3nm。
1.2.2奈米井
在一些实施例中，至少一奈米井120可形成于至少上述之上部被覆层114中。上述奈米井120的上部开口可比奈米井120的底部大。奈米井120的形状没有一定。例如，奈米井120的横截面可为圆形、椭圆形、矩形、正方形、三角形或菱形。如第2图中所示，奈米井120之底部的尺寸大小亦未受到限制。例如，奈米井120的底部尺寸大小可约小于激发光的波长。在一些实施例中，奈米井120的底部尺寸大小可小于约激发光波长的二分之一、四分之一、或八分之一。此处所述之”尺寸大小”系指直径、长轴的长度、或长边的长度。若奈米井120的横截面为正方形或菱形，”尺寸大小”可表示边长。在一实施例中，奈米井120之上部开口的长度（亦即所谓的直径、长轴的长度、或长边的长度）可为约1μm至约10μm，以及奈米井120的底部的直径可为约10nm至约500nm，奈米井120的侧壁与垂直奈米井的底部的方向之间所形成的夹角约小于60度。上述这样的结构可确保一个单分子能够进入奈米井120的底部附近之区域并且被侦测。
根据本发明，部分的激发光可进入奈米井120，且可随着奈米井120的空间限制，形成一有效的激发区130。有效的激发区130可形成于奈米井120的底部附近。当一目标物进入上述有效的激发区130，其可被激发光所激发，并且发射出光线可以被光侦测器106所侦测。在有效的激发区130之外，目标物可能无法被激发光所激发，或其发射出来的光线无法到达光侦测器。可以了解的是，在图中的虚线系为概略之有效激发区130的上部边界，而非用来限制有效的激发区130之上部边界的形状。例如，有效的激发区之上部边界可为弯曲的形状。
依据不同的情况，例如在导波器中延伸之奈米井的位置及/或奈米井的深度，可形成不同之有效的激发区。此外，在有效的激发区中的电磁场可为，例如，一消逝波场（evanescentfield）、一消逝波场与传输波场（travellingfields）的混合、或一传输波场，其详细描述如下。
第3图的示意图显示，不同奈米井设计之依据本发明的实施例，以作为范例。在一些实施例中，奈米井121可延伸穿过上部被覆层的部分厚度。在一些实施例中，奈米井122可延伸穿过上部被覆层的全部厚度。对奈米井121及122而言，当激发光在核心层中传播时，虽然在奈米井121及122中可能没有传输波光线（travellinglight），部分在核心层中的传输波光线可稍微渗透进入奈米井121及122中。上述渗透进入奈米井121及122中的光线，可能在垂直方向上以指数衰减，并形成一消逝波场。此消逝波场在奈米井121及122的空间限制下，可形成一有效的激发区131或132。
在一些实施例中，奈米井123可延伸穿过上部被覆层的全部厚度，以及核心层的部分厚度。对奈米井123而言，除了一消逝波场（evanescentfield）外，另一传输波场组成（travellingfieldcomponent）亦可同时出现于奈米井中，并且形成一有效的激发区133。
在一些实施例中，奈米井124可延伸穿过上部被覆层的全部厚度以及核心层的全部厚度。对奈米井124而言，大多数在奈米井中的电磁场可为一传输波场（travellingfield），并且形成一有效激发区134。
对一包括奈米井122的平面导波器而言，由于奈米井的底端位于核心层的上表面上，有效的激发区132之容量可与衰减场的有效激发区相等，且可利用下列方程式概略计算：
V=πx(D/2)2xh
其中D为奈米井底部的直径，而h为在奈米井中衰减场渗透的深度。例如，若D及h分别为100nm及100nm，有效的激发区之计算出来的容量大概为1x10-18公升（1attoliter）。
在一些实施例中，奈米井120的表面以及上部被覆层114的表面（以及随后所述的上保护层表面；如果该上保护层是位于上被覆层上面）可具有不同的表面性质。上述表面性质可包括：例如疏水性官能基团、官能基团密度、材料密度、或导电性。
在一些实施例中，奈米井120的侧壁面可为亲水性，其包括一部分选自硅（silicon）、二氧化硅（silica）、金属、或金属氧化物，且奈米井120的底面可为疏水性。然而，若奈米井120的底面是由具有亲水性质的材料所制作，则可将其改质成疏水性。例如，若奈米井120的底面是由亲水性的硅酸盐（silicate）或金属所制作，则可将其改质为疏水性的用途，例如R1x-Si(O-R2)4-x（其中R1为疏水性基团，例如烷链–(CH2)n-CH3，以及R2为CnH2n+1，其中x及n为整数，且1≤x≤3），或用途，例如，具有官能基团的聚合物，系选自：–COOH、–PO3H2、–SH、或-NH2。在另一实施例中，若奈米井120的底面是由亲水性的金属氧化物所制作，则可将其改质为疏水性的用途，例如R1x-Si(O-R2)4-x（其中R1为疏水性基团，例如烷链–(CH2)n-CH3，以及R2为CnH2n+1，其中x及n为整数，且1≤x≤3），或使用，例如选自：–COOH、–PO3H2、–SH、或-NH2之具有官能基团的聚合物。藉由使奈米井120的底面为疏水性，但维持奈米井120的侧壁表面为亲水性，可将待测目标物留在邻近奈米井120之底面的有效激发区内，而不会黏附至奈米井120的侧壁表面。因此，上述目标物可有效的被进入有效激发区的激发光所激发。
在一些实施例中，复数个奈米井可形成于导波器中。在一些实施例中，对各个复数个奈米井而言，可形成光侦测器，来侦测在奈米井之有效的激发区中，自一目标物发射出来的光线。在一些实施例中，一个光侦测器可用于侦测在复数个奈米井之有效的激发区中，自目标物发射出来的光线。
1.2.3保护层
在一些实施例中，保护层可形成于侦测装置中，用来吸收散射的激发光及/或阻挡来自侦测装置外的环境光线（ambientlight），以便增加信号噪声比（signal-to-noise,S/N）。参阅第4图，在一些实施例中，一上部保护层142及一下部保护层144可分别形成于上部被覆层114之上及下部被覆层116之下。也就是说，上部保护层142可形成于与导波器的同一侧上，如同奈米井120，以及下部保护层144可形成于导波器的对侧上并且配置于下部被覆层116与光侦测器106之间。在一些实施例中，侦测装置可具有形成于其中的上部保护层142。在一些实施例中，侦测装置可具有形成于其中的下部保护层144。在一些实施例中，侦测装置可兼具形成于其中的上部及下部保护层142及144两者。
在一些实施例中，上部及下部保护层142及144可由不透明的材料所制作，例如金属或合金。上部及下部保护层142及144可由相同的材料所制作，或由不同的材料所制作。适合上部及下部保护层142及144的材料包括：例如，Al、Ti、Ni、Cr、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、或任两个或更多个上述材料的合金。
在一些实施例中，一针孔150可形成于下部保护层144中，此针孔位于奈米井120的下方。自有效的激发区130中的目标物发射出的光线，可穿过上述针孔，并且被光侦射器106侦测。
在一些实施例中，如第5图中所示，一作为一光栅（grating）之奈米结构化的金属图案152可被配置于下部保护层144中而非针孔中。藉由适当地设计上述金属图案152的间距（pitch）及深度，大部分自目标物发射出的光线可穿透过金属图案152，但是可将源于激发光的噪声最小化。
自目标物发射出的光线可为一横向磁波（transversemagnetic，TM）模态的光线，以及激发光可为一横向电波（transverseelectric，TE）模态的光线。横向电波（transverseelectric，TE）以及横向磁波（transversemagnetic，TM）的光线穿过金属光栅（metalgrating）的透光性（transmittances），取决于金属图案152的间距（光栅周期，gratingperiod）及深度。上述透光性亦可取决于金属及金属周围材料之间的折射率差（refractivedifference）。此外，上述透光性亦可取决于在金属光栅上的光线入射的角度。因此，可更进一步地改善信号噪声比（signal-to-noise,S/N）。
1.2.4光耦合器
再参阅第1图，一光耦合器104可被配置于导波器附近或形成于导波器上或导波器中。光耦合器104可将至少部分来自光源102的入射光耦合进入导波器110。
在一些实施例中，一棱镜耦合器可用来作为光耦合器104。如第6图中所示，上述棱镜耦合器可包括一棱镜202以及一准直透镜（collimatinglens）204。藉由准直透镜（collimatinglens）204，自光源102所发射出的入射光可聚焦于导波器110的相同位置上。如第6图中所示，藉由棱镜耦合器，部分的入射光可耦合进入导波器110，并且在核心层112中传播，作为激发光。根据光源的位置及/或相对于准直透镜（collimatinglens）204之入射光的入射角度，具有不同模态的光线可被耦合进入导波器110，并且在核心层112中传播，例如在第6图中的虚线所示。因此，可调整或选择在导波器中传播之激发光的模态。在一些实施例中，准直透镜（collimatinglens）204可经过特殊设计以便将一点光源（pointlightsource）扩展成为线光源（linearlightsource），线光源可提供一横向扩展（laterally-expanded）的激发光，以横向方向覆盖较大的区域，亦即，导波器110之垂直于第6图中所示之横截面的方向。
在一些实施例中，如第7图中所示，一侧边耦合器（sidecoupler）302可用来作为光耦合器104。侧边耦合器302可为一光学透镜模块。藉由侧边耦合器302可将入射光聚焦于导波器110上并且耦合进入导波器110中，以及在导波器110的核心层112中传播，作为激发光。
在一些实施例中，一光栅耦合器可用来作为光耦合器104。一光栅耦合器为一具有规律图案（regularpattern）的光学组件，其可将光线分离及绕射成为多个以不同方向传播的光束。因此，部分的入射光可被引导进入导波器110并且在导波器110的核心层112中传播。
在一些实施例中，如第8图中所示，一光栅耦合器（gratingcoupler）可包括一第一光栅402，第一光栅402配置于上部被覆层114与核心层112之间的界面。由于自下部被覆层116的上部与下部表面反射之光线的干扰，这类光栅的耦合效率（couplingefficiency）可取决于下部被覆层116厚度。
如上所述，上述入射光可完全耦合进入核心层112中。部分的入射光可垂直地穿过导波器110并且被消耗掉。在一些实施例中，为了改善耦合效率，可将一反射器（未显示）配置于导波器110之下。上述反射器可将穿过下部被覆层116的光线反射回到核心层112，使其被部分耦合进入核心层112中，以便增加耦合进入核心层112中之光线的总量。
在一些实施例中，上述光栅耦合器可更包括一第二光栅404，第二光栅404配置于核心层112与下部被覆层116之间的界面，如第9图中所示。第二光栅404可配置于第一光栅402的正下方。在一些实施例中，藉由增加更多的光栅，可更进一步地增加耦合效率（couplingefficiency）。例如，若上述侦测装置包括上部及下部保护层，光栅亦可配置于保护层与被覆层之间的界面，如第10图中所示。
在一些实施例中，可移除部分的上部被覆层114以露出核心层112。一光栅，例如第11图中所示之光栅406，可配置于核心层112之露出的部分上。
光栅的形状可不限于第8至11图中所示的情况。例如，为了增加耦合效率，在一些实施例中，可利用具有弯曲结构（curvedstructure）的光栅，例如闪耀光栅（blazegrating）或多层光栅（multi-levelgrating），其中多层光栅藉由将闪耀(theblaze)划分成多个阶梯(steps)来模拟上述闪耀光栅。
在一些实施例中，利用一吸收发射光耦合器（absorbing-emittinglightcoupler），光线亦可直接耦合进入导波器110中。第12图中显示一吸收发射光耦合器（absorbing-emittinglightcoupler），上述吸收发射光耦合器可包括一发光层（photoluminescentlayer），其可吸收入射光并且发射出一具有较长波长的荧光光线。上述光源发射出的光线可入射至吸收发射光耦合器的上表面上，以及可自吸收发射光耦合器的侧边发射出上述荧光光线。部分的荧光光线可耦合进入导波器中，并且在导波器的核心层中传播，作为激发光以激发目标物。上述功率耦合效率（powercouplingefficiency）可由下列公式计算：
P(λ2)/P0(λ1)=(1-T1)(1+R1T1)xΦFLxT2xηcxT3
其中λ1及λ2分别为入射光与自吸收发射光耦合器的侧边发射出之光线的波长。P0(λ1)及P(λ2)分别为上述入射光的功率以及耦合进入导波器110之核心层112的入射光的功率。R1为在吸收发射光耦合器与下部被覆层116之间的界面的反射率。T1为在移动一距离d1之后，在吸附层（absorbentlayer）中波长为λ1之光线的透光率（transmittance），T2为在移动一距离d2之后，在吸附层（absorbentlayer）中波长为λ2之光线的透光率（transmittance）。ΦFL为光致发光材料（photoluminescencematerial）的光致发光量子效率（photoluminescencequantumyield）。ηc为吸收发射光耦合器的耦合效率。T3为自吸收发射光耦合器发射并穿过全长距离d3之导波器的光线的透光率（transmittance）。
对一吸收发射光耦合器（absorbing-emittinglightcoupler）而言，由于侧表面的面积远小于上表面的面积，自吸收发射光耦合器发射出并且耦合进入核心层112之光线的功率强度，可远高于入射至吸收发射光耦合器上的光线的功率强度。
可根据托斯克斯位移（Stokesshift）来选择上述用于吸收发射光耦合器中的光致发光材料（photoluminescentmaterial）。例如，上述光致发光材料具有大于或等于约30nm的托斯克斯位移（Stokesshift）。在一些实施例中，上述光致发光材料（photoluminescentmaterial）可为光致发光染剂（photoluminescentdye），例如：蒽（anthracene）、香豆素（coumarin）、芘（pyrene）、二苯乙烯（stilbene）、紫质（porphyrin）、苝（perylene）、Alq3、曙红（eosin）、Bodipydye、荧光素（fluorescein）、若丹明（rhodamine）、聚次甲基染料（polymethinedye）、DCM、或上述之衍生物。在一些实施例中，上述光致发光材料可为光致发光聚合物，例如：PPV或其衍生物。在一些实施例中光致发光材料（photoluminescentmaterial）可为无机材料，例如：量子点（quantumdot）、氧化铝（aluminaoxide）、或氧化锌。
在一些实施例中，藉由结合光栅与吸收发射光耦合器，可增加耦合效率。上述结合的光耦合器可包括一光栅502以及一吸收发射光耦合器504。在一些实施例中，如第13图中所示，上述结合的光耦合器可配置于核心层112之露出部分的表面上。在一些实施例中，如第14图中所示，上述结合的光耦合器可配置于核心层112中。上述光栅可有助于增加入射光线在吸收发射材料中穿过的路径长度，以便增加被吸收发射材料所吸收之光线的量，并增加光致发光效率（photoluminescenceefficiency）。因此，更多的入射光可被转换成激发光，并且可增加功率耦合效率。
1.2.5侦测装置之其它非必需的组件（OptionalComponents）
在一些实施例中，如第15图中所示，一光学滤光器（opticalfilter）160可配置于下部保护层144与光侦测器106之间。在一些实施例中，光学滤光器160可配置于下部被覆层116与光侦测器106之间，而没有下部保护层144。在一些实施例中，下部之保护层144本身可作为一光学滤光器。光学滤光器可让在一特定波长范围内的光线穿过，但至少部分挡住在上述特定波长范围以外的光线。因此，藉由适当地选择光学滤光器160，可让自目标物发射出来的光线穿过，但却减弱由激发光所造成的噪声，以便改善信号噪声比（S/Nratio）。
依据本发明的实施例，目标物可包含在填充于奈米井120中的样本溶液中。在一些实施例中，可利用一微流体管道（microfluidicchannel）（未显示）将样本溶液导入奈米井120中。上述微流体管道可被设计成一次让一个目标物通过奈米井，以便实现类流氏细胞计数的侦测（flow-cytometry-likedetection）。在一些实施例中，一封盖（未显示）可形成于导波器上方以留住样本溶液及/或阻挡环境光线（ambientlight）。
在一些上述图式中，其示意图显示侦测装置的结构，为了简化的目的，一些组件并未显示出来。例如，在第6图中显示的导波器110、奈米井120、以及包括棱镜202与准直透镜（collimatinglens）204的棱镜耦合器。侦测装置的其它组件则未显示。应可了解，在这些图式中所示之侦测装置亦可包括其它如此处所揭示的组件。例如，在第6图中所示之侦测装置亦可包括一光侦测器、一封盖（cover）、保护层、及/或一光学滤光器。
2.本发明之侦测与应用的方法
在另一实施例中，本发明系关于利用此处所揭示的侦测装置来侦测一目标物的方法，上述目标物例如单分子目标物。根据本发明，一包括目标物的样本溶液可填充于形成于侦测装置之导波器110中的奈米井112中。藉由一光耦合器，可将自一光源发射出的入射光部分耦合进入导波器110中，并且在导波器110的核心层112中传播。上述耦合进入导波器110的光线可作为一激发光。当上述目标物进入有效激发区时，上述目标物可被激发光所激发，并且发射出一光线以被光侦测器所侦测。
上述侦测装置，以及使用此侦测装置的方法，可运用于，例如，核酸侦测、DNA定序、生物标记的辨识（biomarkeridentification）、或流式细胞计数。上述侦测装置能够侦测并处理低强度的光讯号，使得单分子侦测变得可能。
2.1用于侦测装置的标记
在一些本说明书中所描述之方法的实施例中，将标记黏附至分析物（analyte(s)）（亦即，代测物质）、或其它反应物），或黏附至探子（probe(s)），例如引子、抗体、或其它能与待测物反应的反应物、或其它的反应物，例如核苷酸（包括核苷酸的相似物）。任何标记皆能用于单分子目标物或探子上，上述单分子目标物或探子对于得到讯息与目标物的量或存在的相关有帮助。
例如，可使用多种不同的荧光分子，包括小分子、荧光蛋白、以及量子点。有用的荧光分子（荧光团，fluorophore）包括但不限于：1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-Methylumbelliferone；5-carboxy-2,7-dichlorofluorescein；5-Carboxyfluorescein(5-FAM)；5-Carboxynapthofluorescein；5-Carboxytetramethylrhodamine(5-TAMRA)；5-FAM(5-Carboxyfluorescein)；5-HAT(HydroxyTryptamine)；5-HydroxyTryptamine(HAT)；5-ROX(carboxy-X-rhodamine);5-TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine)；6-Carboxyrhodamine6G;6-CR6G;6-JOE;7-Amino-4-methylcoumarin；7-AminoactinomycinD(7-AAD)；7-Hydroxy-4-methylcoumarin；9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine；ABQ；AcidFuchsin；ACMA(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)；AcridineOrange；AcridineRed；AcridineYellow；Acriflavin；AcriflavinFeulgenSITSA；AFPs-AutoFluorescentProtein-(QuantumBiotechnologies)；TexasRed；TexasRed-Xconjugate；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；ThiazineRedR；ThiazoleOrange；Thioflavin5；ThioflavinS；ThioflavinTCN；Thiolyte；ThiozoleOrange；TinopolCBS(CalcofluorWhite)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO□PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate)；TrueBlue；TruRed；Ultralite；UranineB；UvitexSFC；WW781；X-Rhodamine；XRITC；XyleneOrange；Y66F；Y66H；Y66W；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；螯合染剂（interchelatingdyes）例如：YOYO-3、SybrGreen、Thiazoleorange；AlexaFluor染剂系列的成员(来自MolecularProbes/Invitrogen)，其涵盖了宽广的光谱范围以及符合一般激发光源的主要输出波长，例如：AlexaFluor350、AlexaFluor405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、以及750；Cy荧光染剂系列的成员(GEHealthcare)，其亦涵盖了宽广的光谱范围，例如：Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7；Oyster荧光染剂的成员(DenovoBiolabels)，例如：Oyster-500、550、-556、645、650、656；Y-Labels系列的成员(Dyomics)，例如，范围介于418nm(DY-415)至844nm(DY-831)具有最大吸收质的范围，例如DY-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL；ATTO荧光标记系列的成员(ATTO-TECGmbH)，例如：ATTO390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740；CALFluor染剂系列或Quasar染剂系列的家族(BiosearchTechnologies)，例如：CALFluorGold540、CALFluorOrange560、Quasar570、CALFluorRed590、CALFluorRed610、CALFluorRed635、Quasar670；量子点，例如：EviTags系列的量子点(EvidentTechnologies)或Qdot系列的量子点(Invitrogen)，例如：Qdot525、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705、Qdot800；荧光素（fluorescein）；若单明（rhodamine）；及/或藻红素（phycoerythrin）；或上述之结合。参阅，例如美国专利申请公开号No.2008/0081769。
在一些实施例中，至少提供一生物发光（bioluminescent）或化学发光（chemiluminescent）系统，其可在一实体，例如一分析物、反应物、或反应产物，的存在下产生光线。例如，一生物发光（bioluminescent）或化学发光（chemiluminescent）系统，可用来侦测在定序中由合成反应所产生的焦磷酸盐（pyrophosphate）（将于下文中更详细地描述）；藉由光线产生反应（light-generatingreaction）的催化作用，来侦测像是铁或铜等金属的存在；或量测与分析物接合之反应物的数量，其中上述反应物包括至少一生物或化学发光系统的成分。
所属技术领域中已知的生物发光系统的例子包括：包括至少一荧光酵素（luciferase）的系统，例如，萤火虫荧光酵素（fireflyluciferases），包括：Photinuspyralis荧光酵素。一生物发光系统可用于侦测焦磷酸盐（pyrophosphate）与合成反应（其中，dATP可被一例如dATPαS的相似物取代，以避免由于dATP被荧光酵素消耗所产生之非专一性的光线）之定序的成分，例如，藉由提供荧光酵素、三磷酸腺苷硫酸化脢（ATPsulfurylase）、荧光素（luciferin）、以及腺苷5’磷醯硫酸（adenosine5’phosphosulfate）。当藉由一核苷酸的加入而产生焦磷酸盐时，三磷酸腺苷硫酸化脢（ATPsulfurylase）会依据腺苷5’磷醯硫酸（adenosine5’phosphosulfate）产生ATP。藉由荧光酵素加上光线，ATP能促使荧光素（luciferin）转变为氧化荧光素（oxyluciferin）。其它的生物发光系统包括：以发光蛋白（photoproteins）为基础的系统，例如一水母发光蛋白（aequorin），其将腔肠动物荧光素（coelenterazine）氧化成为会发射光线之激发的coelenteramide。
化学发光系统的例子包括：发光醇（luminol）加上过氧化氢（hydrogenperoxide），其可在金属催化剂（metalcatalyst）及辅助氧化剂（auxiliaryoxidant）的存在下经过一发光反应；草酸二苯酯（diphenyloxalate）加上过氧化氢与适当的染剂，其可在产生二氧化碳之多步骤的反应中经过激发以及发光【适当之染剂的例子包括：苯基化蒽（phenylatedanthracene）的衍生物，例如9,10-diphenylanthracene、9,10-Bis(phenylethynyl)anthracene、及1-Chloro-9,10-bis(phenylethynyl)anthracene；以及若丹明（rhodamines），例如rhodamine6G及rhodamineB】；单态氧产生系统（singletoxygen-producingsystems），例如过氧化氢加上次氯酸钠（sodiumhypochlorite）；以及包括酵素的系统，例如山葵过氧化氢脢（horseradishperoxidase），其作用于发光醇（luminol）或其它商业上可用之基质上。
在一些实施例中，上述方法包括形成共价连结（covalentattachments），像是反应物或分析物与标记之间，或反应物（例如用于定序反应中的聚合脢）与表面（例如奈米井的表面）之间。在本技术领域中，已知多种形成共价连结的方法。能够利用许多不同的化学改质以加速连结的形成。化学改质的范例包括：N-羟基琥珀醯亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）基团、胺类（amines）、醛类（aldehydes）、环氧衍生物（epoxides）、羧基（carboxylgroups）、羟基（hydroxylgroups）、醯肼（hydrazides）、疏水性基团、薄膜（membranes）、马来醯亚胺（maleimides）、生物素（biotin）、链霉抗生素蛋白（streptavidin）、硫醇基（thiolgroups）、镍螯合物（nickelchelates）、光敏基团（photoreactivegroups）、硼基团（borongroups）、硫酯类（thioesters）、半光胺酸（cysteines）、二硫化物基团（disulfidegroups）、烷基与卤化醯基（acylhalidegroups）、麸胺基硫（glutathiones）、麦芽糖（maltoses）、迭氮化物（azides）、磷酸盐（phosphates）、以及膦类（phosphines）。在一些实施例中，利用改质剂（例如亲电性的改质剂或亲核性的改质剂）的适当结合，使连结形成于两个体之间，其中每一个体皆至少包括一改质剂。
在一些实施例中，藉由利用一存在于一上述个体上的化学改质剂，以及一其它个体之自然形成的部分（naturally-occurringmoiety），例如胺类或氢硫基（sulfhydryl），使连结形成于两个体之间。此反应的优点为其能够快速反应且能够避免有毒副产物的产生。这类的改质剂的范例包括：N-羟基琥珀醯亚胺酯（NHS-esters）、醛类（aldehydes）、环氧衍生物（epoxides）、以及硫代酯类（thio-esters）。大部分的蛋白质、胜肽、糖肽（glycopeptides）…等等，具有游离的胺基团，其能够与这类的改质剂反应，来将这些改质剂共价连结至这些改质剂。亦可合成具有内部或末端之胺基团的核酸探针，且其具有商业利用价值（例如IDT或Operon公司）。因此，利用相似的化学反应，生物分子能够结合（共价或非共价）至标记或其它的反应物。
许多其它的多功能的交联剂（cross-linkingagents）可用来将一种改质剂的化学活性转换成另一种。这些基团可为双官能基团、三官能基团、四官能基团…等等。这些基团亦可为同质功能（homo-functional）或异质功能（hetero-functional）。双官能基团之交联剂的例子为X-Y-Z，其中X及Z为两个活性基团，而Y为一连结之连结物。此外，若X及Z为相同的基团，例如N-羟基琥珀醯亚胺酯（NHS-esters），将会产生交联剂，NHS-Y-NHS，其为一同质双官能交联剂（homo-bi-functionalcross-linker），并且可以连结个别包括一胺类的两个体。若X为N-羟基琥珀醯亚胺酯，且Z为马来醯亚胺基团（maleimidegroup），将会产生交联剂，NHS-Y-马来醯亚胺，其为一异质双官能交联剂（homo-bi-functionalcross-linker），并且可以连结分别包括一胺类的个体与包括一硫代基团（thio-group）的个体。具有许多不同官能基团的交联剂被广泛的运用。这类官能基团的范例包括：N-羟基琥珀醯亚胺酯（NHS-esters）、硫代酯类（thio-esters）、卤烷类（alkylhalides）、卤化醯类（acylhalides）（例如碘乙醯胺，iodoacetamide）、硫醇类（thiols）、胺类（amines）、半光胺酸（cysteines）、组胺酸（histidines）、二硫化物（di-sulfides）、马来醯亚胺（maleimides）、顺-二醇类（cis-diols）、硼酸（boronicacid）、异羟肪酸（hydroxamicacid）、迭氮化物（azides）、联胺（hydrazines）、膦类（phosphines）、光敏基团（photoreactivegroups）（例如：蒽醌，anthraquinone；二苯甲酮，benzophenone）、丙烯醯胺（acrylamide）（例如：acrydite）、亲和性基团（affinitygroups）（例如：生物素，biotin；链霉抗生素蛋白，streptavidin；麦芽糖，maltose；麦芽糖接合蛋白，maltosebindingprotein；麸胺基硫，glutathione；麸胺基硫-硫转移脢，glutathione-S-transferase）、醛类（aldehydes）、酮类（ketones）、羧酸类（carboxylicacids）、磷酸盐类（phosphates）、疏水性基团（hydrophobicgroups）（例如：苯基，phenyl；胆固醇，cholesterol）…等等。
其它的改质剂替代物（例如光交联（photo-crosslinking）及热交联（thermalcrosslinking））已为本技术领域人员所知。产业上可利用的技术包括，例如，来自MosiacTechnologies(Waltham,MA),ExiqonTM(Vedbaek,Denmark)、SchleicherandSchuell(Keene,N.H.),SurmodicsTM(St.Paul,MN)、XenoporeTM(Hawthorne,N.J.),Pamgene(Netherlands)、Eppendorf(Germany)、Prolinx(Bothell,WA)、SpectralGenomics(Houston,TX)、andCombimatrixTM(Bothell,WA)等公司的商品。
2.2核酸侦测
本发明的侦测装置可作为部分的系统，用于分子侦测的方法或过程中，例如，核酸定序。此装置，及利用此装置的方法或过程，有助于像是分析或诊断上的应用。这些应用可为私人的、公开的、商业的、或产业的。
本发明的侦测装置可用于多种不同的定序方式（sequencingmodalities）以及适用于定序单分子。此外，相对于现存的生物芯片装置，本发明的侦测装置简化了设计、装备、以及生产。
本发明的侦测装置可作为部分的系统，用于生物分子侦测的方法或过程中，其包括核酸的杂交或定序，例如全基因体定序（transcriptionalprofiling）、转录概况分析（transcriptionalprofiling）、比对的转录概况分析（comparativetranscriptionalprofiling）、或基因鉴定（geneidentification）等。生物分子侦测亦可包括接合之交互反应（bindinginteractions）的侦测或量测，例如：蛋白质/蛋白质、抗体/抗原、受体/配体（receptor/ligand）、核酸/蛋白质。这些应用有助于分析或诊断的过程与方法。
2.2.1MoleculestobeDetected待测分子
本发明所提供之适合侦测的核酸可包括任何核酸，包括，例如：DNA、RNA、或PNA（肽核酸，peptidenucleicacid），且可包含已知或未知的任何序列，包括自然发生或人工合成的序列。核酸可自然地产生、重组制造（recombinantlyproduced）、或化学合成。可根据实际应用而改变待测核酸的长度。在一些实施例中，核酸可包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000个碱基，或更多。在一些实施例中，核酸可为10至20、10至50、10至100、50至100、50至500、50至1000、50至5000、500至2000、500至5000、或1000至5000个碱基。
用于侦测的核酸可为单股核酸。藉由所属技术领域已知的方法，例如：加热、碱化、或其它化学处理，一单股核酸模板可自一双股分子衍生得来。单股核酸模板亦可藉由化学合成或体外合成（invitrosynthesis.）的方式来制造而得。
在一些实施例中，待测核酸为环状。在一些实施例中，上述方法包括：提供一环状的核酸分子，其包括一段已知序列的插入片段（insert），上述已知序列可用来作为引子（primer.）的结合位（bindingsite）。环状的核酸分子可以单股或双股的状态被提供，且一般包括至少一共价闭合链段（covalentlyclosedstrand）。双股环状分子可包括一缺口链段（nickedstrand）或一第二共价闭合链段。
在一些实施例中，藉由自其来源以环状形态分离之环状的核酸分子，若已知其中部分的序列，且其已知序列的片段能够作为核酸的插入片段（例如：可能已知一在包含于环状分子中的基因序列内的保守序列（conservedmotif），或根据一分子在极严苛的条件下，与另一段已知序列的核酸杂交的能力，可知上述分子包含一序列），则可藉由将环状的核酸分子以环状形式自其来源分离，来提供环状的核酸分子。在一些实施例中，仅不明确（inexactly）的知道核酸的插入片段的序列，像是当对核酸的认知系来自于严苛的杂交性质（stringenthybridizationproperties）时就会如此。在一些实施例中，可明确知道核酸的插入片段的序列，像是当环状的核酸分子具有一已知的主干序列（backbonesequence），或经过精心设计而包含一已知序列时。
在一些实施例中，藉由一体外反应或数个反应的进行，将一线状的核酸样本与一核酸的插入片段一起合并进入一环状的分子，以提供环状的核酸分子。在一些实施例中，上述体外反应或数个反应能够包括藉由连结脢（ligase）的接合反应（ligation），及/或其它参与反应的链段，上述反应例如：藉由各种不同的酵素的催化反应，其包含重组脢（recombinases）及拓朴异构脢（topoisomerases）。DNA连结脢（DNAligase）或RNA连结脢（RNAligase）可作为酵素加入一线状的模板（lineartemplate）之两末端，无论有没有衔接分子（adaptermolecule）或连结剂（linkers），以形成一环状，如第8图中所示范。例如，T4RNA连结脢（T4RNAligase）将单股的DNA或RNA耦合，如Tessier等人在AnalBiochem,158:171-78(1986).CIRCLIGASE(TM)(Epicentre,Madison,Wis.)中所描述，亦可用于催化单股核酸之接合反应。此外，一双股的连结脢，例如E.coli连结脢（E.coliligase）或T4DNA连结脢（T4DNAligase），可用于进行环化反应（circularizationreaction）。
在一些实施例中，提供环状核酸分子包括：藉由延伸自至少一包括互补的区域（complementaryregions）的引子（上述引子包括：具有已知序列的5’端（5’flaps）之随机的引子（randomprimers），上述已知序列能够作为核酸的插入片段），来复制一核酸的模板；以及将经过放大的核酸变成环状，例如可藉由一连结脢或一重组脢来催化；上述经过放大的核酸可，例如：藉由限制（restriction）或磷酸化作用（phosphorylation），在环化（circularization）之前，于其末端进行酵素处理。
在一些实施例中，藉由进行化学的环化作用来提供环状的核酸分子。化学方法系运用已知的耦合剂（couplingagents）像是BrCN阳性咪唑（BrCNplusimidazole）与二价金属（divalentmetal）、N-cyanoimidazole与ZnCl2，1-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylcarbodiimideHCl、以及其它的碳二醯亚胺（carbodiimides）与羰基二咪唑（carbonyldiimidazoles）。藉由缩合（condensing）5’端的磷酸根（5’-phosphate）与3’端的羟基（3’-hydroxyl），或缩合5’端的羟基（5’-hydroxyl）与3’端的磷酸根（3’-phosphate），亦可将线状模板的末端加入。
在一些实施例中，环状的核酸分子包括一插入的序列，上述插入的序列可被视为一末端的连结引子（endlinkprimer），除了此分子为环状因而上述插入的序列不在末端以外。
2.2.1.1末端连结引子（EndLinkPrimer）
在一些实施例中，线状的核酸可更包括一或多个耦合至核酸的5’端、3’端、或同时耦合至5’端及3’端两者之末端的连结引子。在特定的实施例中，一末端的连结引子可被固定（affixed）至核酸的3’端。末端的连结引子可用来提供一或多个侦测的引子，例如：定序的引子之互补的序列。
末端的连结引子为短的核酸分子，通常由少于100个核苷酸所构成。在一些实施例中，末端的连结引子的长度可为至少5、10、15、20、25、30、50、75、90个核苷酸、或更多个核苷酸。在一些实施例中，末端的连结引子的长度可为8至25个核苷酸、10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、10至50个核苷酸。在一些实施例中，末端的连结引子可为无支链的（unbranched），然而，在其它的实施例中，上述末端的连结引子可为有支链的（branched）。
末端的连结引子可作为一或多个用于侦测核酸的引子的配对（complement），例如：定序的引子。在一些实施例中，上述引子可藉由杂交（hybridization）来侦测核酸，例如：上述引子可包含一可侦测的标记，例如一荧光标记（fluorescentlabel）。在一些实施例中，末端的连结引子之5’端可包括一与定序的引子互补的序列。在一些实施例中，末端的连结引子之与定序的引子互补的序列可被定向（oriented），使得上述定序的引子之3’端可立刻被调整成在待测核酸中的第一个核苷酸。
在一些实施例中，可藉由连结脢，例如：DNA连结脢，将末端的连结引子加入待测核酸的末端。在一些实施例中，末端的连结引子以及待测核酸，在接合之前两者皆可为单股。在其它的实施例中，两者皆可为双股。在另一实施例中，一个可为单股而另一个可为双股。接合作用已为所属技术领域所熟知。例如，在波隆尼定序方法（polonysequencingmethod）中，Shendure等人，运用NewEnglandBiolabs’(NEB)QuickLigationTM试剂组，将一T30末端的连结引子（T30endlinkprimer，32个碱基对）接合至一样本DNA片段（Science,309:1728-1732[2005]）。上述连结反应溶液包括0.26pMole的DNA、0.8pMole的T30末端连结引子、4.0μlT4DNA连结脢1倍的QuickLigationBuffer中。在混合之后，将上述反应溶液培养于室温下10分钟，接着放置于冰上。藉由将样本加热至65°C维持10分钟，来终止上述连结反应。
在其它的实施例中，可在待测核酸上合成末端的连结引子。例如：末端的连结引子可为一均质的聚合物（homopolymer），其中藉由例如：末端转移脢（terminaltransferase）来将均质的聚合物（homopolymer）加入。例如，Harris等人(Science320:106-109[2008])将一多腺嘌呤尾（polyAtail）加至DNA模板，上述DNA模板作为一在病毒基因体的单分子定序中之多胸腺嘧啶定序引子（polyTsequencingprimer）的配对（complement）。
2.2.1.2定序引子
定序的引子为单股的寡核苷酸，其与待测核酸的片段互补，或与其本身相关之末端的连结引子互补。在一些实施例中，上述定序的引子的长度可为至少8、10、15、20、25、30、34、40、45、50个核苷酸，或更多个。在特定的实施例中，定序的引子的长度可为为8至25个核苷酸、10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、10至50个核苷酸。上述定序的引子可由任何类型的核苷酸所构成，包括：自然产生的核苷酸、不存在于自然界的核苷酸相似物（analogs）、或经过改质的核苷酸。
在一些实施例中，定序的引子可包含经过改质的核苷酸，例如：锁核酸（lockednucleicacids，LNAs，经过改质的核糖核酸，其提供在多聚核酸中的经过强化之碱基堆栈的交互作用（enhancedbasestackinginteractions））。如Levin等人在NucleicAcidResearch34(20):142[2006]中所描述之LNAs的功用，说明了包含LNA的引子改进了专一性（specificity），并且相对于对应之未锁引子（unlockedprimer），表现出更强的结合作用。产生包含3LNA核苷酸（于帽盖（caps）中）之MCP1引子（MCP1primer，5’-cttaaattttcttgaat-3’）的三个变体（variants）：MCP1-LNA-3’(5’-cttaaattttCtTgaAt-3’)、MCP1-LNA-5’(5’-CtTaAattttcttgaat-3’)、以及MCP1-LNA-even(5’-ctTaaatTttctTgaat-3’)，其中上述三个变体在引子中之不同位置处。所有的LNA取代的引子皆具有强化的Tm，虽然MCP1-LNA-5’引子表现出显著地强化之定序的准确性（PhredQ30计数）。因此，在特殊的实施例中，上述定序引子可包含至少一锁5’酸（lockednucleotide）于其5’的区域，亦即，上述5’二分之一、三分之一、或四分之一的定序引子。
在应用于本发明的侦测装置之前，可将定序引子与单股样本核酸（亦即，包括至少一末端连结引子的待测核酸）进行杂交。可藉由在含盐溶液中，例如：5XSSC(或5XSSPE),0.1%Tween20(或0.1%SDS)、以及0.1%BSA缓冲液，混合上述样本核酸与一莫耳过量之定序的引子，使上述定序的引子及样本核酸进行杂交。加热上述混合物至65°C，持续5分钟，以及缓慢降温至室温，好让引子/模板进行低温黏着（annealing）。可藉由合适的方法，包括：分子筛（molecularsieve），来删除残留的引子（residualprimers）。
可藉由适当的方法，包括：目视检查（visualinspection）或计算机辅助的引子设计，来设计引子，上述引子包括序列的末端的连结与定序的引子两者。很多的软件包（softwarepackages）可用来辅助引子的设计，包括：DNAStarTM(DNAStar,Inc.,Madison,WI)、OLIGO4.0(NationalBiosciences,Inc.)、Vector(Invitrogen)、PrimerPremier5(Premierbiosoft)、以及Primer3(WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA)。引子的设计可考虑到，例如，待定序的分子、专一性、长度、欲融化的温度、二级结构、以及使用的酵素（亦即聚合脢或连结脢）。参见，例如，JosephSambrook与DavidRussell，MolecularCloning:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress，第三版(2001)。
2.2.2定序模式（SequencingModalities）
一些本发明的实施例为定序核酸的方法，其包括下列步骤：(a)提供一侦测装置，包括：一导波器包括：一核心层；以及一第一被覆层，其中至少一奈米井至少形成于该第一被覆层中；以及至少一光侦测器；(b)提供至少一核酸分子；(c)将该至少一核酸分子个别地定位(localizing)于至少一奈米井中；(d)进行该至少一核酸分子的单分子合成定序，其中该单分子核酸的合成定序导致光线的发射，该发射的光线与至少一该核酸中的碱基之特性有关；(e)利用该侦测器侦测该发射光，产生一输出讯号；以及(f)处理该输出讯号以决定至少一该核酸所包含的碱基之特性。
在这些方法中，”将至少一核酸分子个别地定位于于至少一奈米井中”，被理解为一单核酸分子可被定位于一位于一奈米井，亦即将一个（且不超过一个）核酸分子定位于至少一奈米井中。在一些实施例中，复数个奈米井皆个别含有一个（且不超过一个）核酸分子。在一些实施例中，在操作过程期间，一些复数个奈米井包含核酸分子，而其它的则不包含。也就是说，核酸分子在样本溶液中的浓度低于某特定值，如此一来并非所有的奈米井皆具有核酸分子包含于其中。这样可避免在定序完成前，发生两个或两个以上的核酸分子进入相同奈米井中的情形，以便避免包含来自大于一个核酸分子的信息之定序的结果。例如，在一些本发明的实施例中，少于或等于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的奈米井将会产生因为低浓度之定位于待检测或待鉴定的生物分子之讯号。
在一些实施例中，核酸分子在样本溶液中的浓度取决于有效的激发区的容量。例如，若有效的激发区的容量为10-18公升，核酸分子在样本溶液中的浓度可为约1.6μM。在一些实施例中，核酸分子在样本溶液中的最佳浓度可为约1-100pM至约1-100μM。
在一些实施例中，所提供之待测的核酸分子，其浓度相对于本发明之装置的奈米井之有效激发区的容量，呈现亚化学剂量（substoichiometric）的关系。例如，若有效的激发区的容量为10-18公升，核酸分子在样本溶液中的浓度范围可为每10-18公升中有0.01至0.5个分子、每10-18公升中有0.05至0.2个分子、或每10-18公升中有约0.1个分子。上述浓度可根据有效激发区的大小适当地缩放（scaled）。在一些应用上，根据像是尽量减少来自相同奈米井的多重讯号与产生来自较大比例之奈米井的讯号之间的相对重要性，可能期望能使用更高或更低之核酸分子在样本溶液中的浓度。
在一些实施例中，所提供之待测的核酸分子，其浓度相对于本发明之装置的奈米井之有效激发区的容量，呈现化学剂量等价（stoichiometricequivalence）或过多（excess）的关系。例如，若有效的激发区的容量为10-18公升，核酸分子在样本溶液中的浓度范围可为每10-18公升中有1至50个分子、每10-18公升中有2至20个分子、或每10-18公升中有3至10个分子。这些浓度范围的使用，可搭配定序核酸分子之酵素以亚化学剂量等级（substoichiometriclevel）的供应，例如每个奈米井中有0.01至0.5活化之可使用的聚合脢、每个奈米井中有0.05至0.2活化之可使用的聚合脢、或每个奈米井中有约0.1活化之可使用的聚合脢。
用于定序或其它侦测反应之待测酵素对奈米井表面的贴附可导致一些酵素呈现不可使用、无活性或两者皆有的情况，或同时由于像是贴附的位置，以及酵素的结构是否受到影响等因素。藉由提供过量之正控制（positivecontrol）合成定序反应（sequencing-by-synthesisreaction）的其它成份，以及藉由观察奈米井产生之荧光讯号的数量，其中上述荧光讯号的数量与活化可使用之酵素的存在一致，可估算每个奈米井中活化可使用之聚合脢的数量。当一相当大比例，例如50%或更多的奈米井产生荧光讯号时，一随机分布的模型（randomdistributionmodel）可估算出许多的奈米井包含至少两个活化可使用的酵素（例如，当50%的奈米井产生讯号时，预计会约有25%的奈米井包含至少两个活化可使用的酵素）。在这类的情况中，为了尽可能的减少两个不同定序复合物形成于相同奈米井中的频率，可以考虑限制待定序之核酸分子的浓度。再者，当一相当小比例，例如10%或更少，的奈米井产生荧光讯号时，一随机分布的模型（randomdistributionmodel）可估算出少数的奈米井包含至少两个活化可使用的酵素（例如，当10%的奈米井产生讯号时，预计会约有1%的奈米井包含至少两个活化可使用的酵素）。在这类的情况中，为了尽可能的减少没有定序复合物形成于奈米井中的频率（其中上述奈米井的确具有一可使用之活化的酵素），可以考虑利用相对高浓度的待定序之核酸分子。
在一些实施例中，单分子核酸的合成定序（singlemoleculenucleicacidsequencing-by-synthesis）导致化学发光（chemiluminescence）的光线发射。值得注意的是，在这些实施例中，当化学发光产生来自化学能的光线时，上述装置并不需要包括光源。
在一些实施例中，上述装置更包括一光源，上述光源可用于提供激发的光线，例如，使单分子核酸的合成定序通过荧光发射光线。
藉由所属技术领域中已知的方法，像是回顾例如：美国专利号U.S.PatentNo.6,946,249以及Shendureetal.,Nat.Rev.Genet.5:335-44(2004)，本发明所提供之侦测装置及方法可用于侦测及定序核酸。可从所属技术领域中已知的单分子定序的方法中选择定序的模式（sequencemodalities）。在一些实施例中，上述定序的方法可仰赖无论是DNA聚合脢（DNApolymerase）或DNA连结脢（DNAligase）的专一性，以及可包括，例如：碱基延伸定序（baseextensionsequencing，单一碱基逐步延伸，singlebasestepwiseextensions）、以及多重碱基的合成定序（包括，例如：利用末端标定的核苷酸之定序）。上述方法典型上包括涉及提供一包括至少一末端连结引子的样本核酸。上述核酸可为单股形式或可能成为单股，例如，藉由化学变性或热变性（thermaldenaturation）。然后可于一定序的引子开始进行定序。
在一些实施例中，上述方法包括形成共价连结（covalentattachments），像是反应物或分析物与标记之间，或反应物（例如用于定序反应中的聚合脢）或分析物与表面（例如奈米井的表面）之间。例如，在单分子定序过程中，一核酸分子或一酵素（例如聚合脢）可贴附至奈米井的底部。这类的贴附可在多个定序周期（sequencingcycles）上获得数据。在本技术领域中，已知多种形成共价连结的方法。能够利用许多不同的化学改质以加速连结的形成。化学改质的范例包括：N-羟基琥珀醯亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）基团、胺类（amines）、醛类（aldehydes）、环氧衍生物（epoxides）、羧基（carboxylgroups）、羟基（hydroxylgroups）、醯肼（hydrazides）、疏水性基团、薄膜（membranes）、马来醯亚胺（maleimides）、生物素（biotin）、链霉抗生素蛋白（streptavidin）、硫醇基（thiolgroups）、镍螯合物（nickelchelates）、光敏基团（photoreactivegroups）、硼基团（borongroups）、硫酯类（thioesters）、半光胺酸（cysteines）、二硫化物基团（disulfidegroups）、烷基与卤化醯基（acylhalidegroups）、麸胺基硫（glutathiones）、麦芽糖（maltoses）、迭氮化物（azides）、磷酸盐（phosphates）、以及膦类（phosphines）。这些试样的准备很容易，例如，使用标准方法（MicroarrayBiochipTechnologies,MarkSchena,Editor,March2000,BiotechniquesBooks）。在一些实施例中，利用改质剂（例如亲电性的改质剂或亲核性的改质剂）的适当结合，使连结形成于两个体之间，其中每一个体皆至少包括一改质剂。
在一些实施例中，藉由利用一存在于一上述个体上的化学改质剂，以及一其它个体之自然形成的部分（naturally-occurringmoiety），例如胺类或氢硫基（sulfhydryl），使连结形成于两个体之间。此反应的优点为其能够快速反应且能够避免有毒副产物的产生。这类的改质剂的范例包括：N-羟基琥珀醯亚胺酯（NHS-esters）、醛类（aldehydes）、环氧衍生物（epoxides）、以及硫代酯类（thio-esters）。大部分的蛋白质、胜肽、糖肽（glycopeptides）…等等，具有游离的胺基团，其能够与这类的改质剂反应，来将这些改质剂共价连结至这些改质剂。亦可合成具有内部或末端之胺基团的核酸探针，且其具有商业利用价值（例如IDT或Operon公司）。因此，利用相似的化学反应，生物分子能够结合（共价或非共价）至标记、表面、或其它的反应物。
许多其它的多功能的交联剂（cross-linkingagents）可用来将一种改质剂的化学活性转换成另一种。这些基团可为双官能基团、三官能基团、四官能基团…等等。这些基团亦可为同质功能（homo-functional）或异质功能（hetero-functional）。双官能基团之交联剂的例子为X-Y-Z，其中X及Z为两个活性基团，而Y为一连结之连结物。此外，若X及Z为相同的基团，例如N-羟基琥珀醯亚胺酯（NHS-esters），将会产生交联剂，NHS-Y-NHS，其为一同质双官能交联剂（homo-bi-functionalcross-linker），并且可以连结个别包括一胺类的两个体。若X为N-羟基琥珀醯亚胺酯，且Z为马来醯亚胺基团（maleimidegroup），将会产生交联剂，NHS-Y-马来醯亚胺，其为一异质双官能交联剂（homo-bi-functionalcross-linker），并且可以连结分别包括一胺类的个体与包括一硫代基团（thio-group）的个体。具有许多不同官能基团的交联剂被广泛的运用。这类官能基团的范例包括：N-羟基琥珀醯亚胺酯（NHS-esters）、硫代酯类（thio-esters）、卤烷类（alkylhalides）、卤化醯类（acylhalides）（例如碘乙醯胺，iodoacetamide）、硫醇类（thiols）、胺类（amines）、半光胺酸（cysteines）、组胺酸（histidines）、二硫化物（di-sulfides）、马来醯亚胺（maleimides）、顺-二醇类（cis-diols）、硼酸（boronicacid）、异羟肪酸（hydroxamicacid）、迭氮化物（azides）、联胺（hydrazines）、膦类（phosphines）、光敏基团（photoreactivegroups）（例如：蒽醌，anthraquinone；二苯甲酮，benzophenone）、丙烯醯胺（acrylamide）（例如：acrydite）、亲和性基团（affinitygroups）（例如：生物素，biotin；链霉抗生素蛋白，streptavidin；麦芽糖，maltose；麦芽糖接合蛋白，maltosebindingprotein；麸胺基硫，glutathione；麸胺基硫-硫转移脢，glutathione-S-transferase）、醛类（aldehydes）、酮类（ketones）、羧酸类（carboxylicacids）、磷酸盐类（phosphates）、疏水性基团（hydrophobicgroups）（例如：苯基，phenyl；胆固醇，cholesterol）…等等。
其它的改质剂替代物（例如光交联（photo-crosslinking）及热交联（thermalcrosslinking））已为本技术领域人员所知。产业上可利用的技术包括，例如，来自MosiacTechnologies(Waltham,MA),ExiqonTM(Vedbaek,Denmark)、SchleicherandSchuell(Keene,N.H.),SurmodicsTM(St.Paul,MN)、XenoporeTM(Hawthorne,N.J.),Pamgene(Netherlands)、Eppendorf(Germany)、Prolinx(Bothell,WA)、SpectralGenomics(Houston,TX)、andCombimatrixTM(Bothell,WA)等公司的商品。
以单分子定序模式来说，侦测装置可提供能够定序单分子的优势。例如，可提供一待定序的环状模板核酸分子以及一定序的引子。例如，一个聚合酶可以贴附在奈米井的底部表面。且提供一环状具有定序前导物的待定序核酸分子模板。藉由进行复数个定序的周期（sequencingcycles），以得到比模板核酸分子中的核苷酸数量更多的序列之依序判读（sequenceread），使重新定序能够实现。上述定序的依序判读包含讯息，其中上述讯息多余地（redundantly）辨识了在至少一位于模板核酸分子中之位置的碱基。在一些实施例中，上述定序的依序判读包含讯息，其中上述讯息多余地辨识了至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的碱基。在一些实施例中，上述定序的依序判读包含讯息，其中上述讯息辨识至少25%、50%、75%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%之在模板核酸分子中的碱基，其中上述模板核酸分子具有三倍、四倍、五倍、七倍、或十倍或更多的重复（redundancy）。藉由定序相同的分子，定序错误可望下降，作为定序之依序判读的数量之功率（asthepowerofthenumberofsequencingreads）。例如，如果每个单一判读的碱基错误率为10-3，那么在两次判读之后，将会掉至(10-3)2，亦即10-6。既然上述用于定序之经过改质的核苷酸能够失去其标记或保护基团（blockinggroup），导致，例如假性侦测（spuriousdeletions），此乃特别有助于单分子定序。
一般而言，在单分子定序中，至少一个待测的核酸分子与引子接触。例如：藉由进行至少一酵素催化的聚合作用（polymerization）或连结反应（ligationreaction）来改质上述引子。上述至少一个反应造成光线的发射，上述光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关。”造成”光线的发射，其被理解为至少一个反应导致至少一个光线发射的情况发生，上述光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关；此情况的发生可藉由与激发光、化学或生物发光装置（chemi-orbio-luminescentsystem）…等等之间的相互作用。上述至少一种情况可为，例如：荧光基团合并进入至少一反应的产物中、或焦磷酸根（pyrophosphate）的释放。因此，无论是否有外部的激发皆可产生光线。例如，单分子定序的进行可利用可逆性末端终结子之碱基类似物（reversibleterminatorbaseanalogs），其中上述可逆性末端终结子之碱基类似物（reversibleterminatorbaseanalogs）包括一共价连结之可侦测的标记，例如：一荧光标记、以及一防止任何二次延伸（secondaryextension）的保护基团（blockinggroup），其中在上述类似物被加至引子之后，激发并侦测上述类似物，并且在加入之后移除上述标记与保护基团，以进行另一轮的延伸（extension）。此外，藉由提供化学或生物发光的侦测装置，其中上述侦测装置以与焦磷酸盐相关（pyrophosphate-dependent）的方式发射光线，可在没有外部激发的情况下侦测延伸步骤的产物，例如一焦磷酸盐。这些模式以及其它的模式将更详细地描述于下文中。
上述发射的光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关。在一些实施例中，上述相关性能够为时间的（temporal），例如，光线发射的时间显示了至少一个碱基的性质，像是当提供不同的碱基类似物（baseanalogs）以在不同时间用于一聚合反应中的情形。在一些实施例中，上述相关性可能为光谱的（spectral），例如，发射光线的光谱显示了至少一个碱基的性质，像是当提供包括不同荧光基团的不同碱基类似物以用于一聚合反应中的情形。
在一些实施例中，单分子核酸定序包括多复位序周期。一个定序周期被理解为造成一光线的发射的情形，上述光线与至少一个在核酸中的碱基的性质相关，为了在一第一碱基被辨识之后，辨识至少一在核酸中的第二碱基，上述情形可被重复。因此，在包括单分子核酸定序的方法中，上述单分子核酸定序能够包括至少一给定数量的定序周期，如此一来造成至少上述给定数量之光线的发射，上述光线集体（collectively）与至少一个在核酸中的碱基的性质相关。在一些实施例中，上述给定的数量可为，例如：2、3、4、5、10、20、50、100、200、或500。
定序的方法能够包括决定一或多个在核酸中的碱基的性质。在一些实施例中，进行单分子核酸定序造成光线的发射，其中利用至少一包括至少一第一光学传感器（opticalsensor）及一第二光学传感器的光侦测器来侦测上述光线，并且处理来自上述至少两个光学传感器的输出讯号，藉由将至少一个处理的结果与至少一个已知的结果比对，上述已知的结果对应至少一个已知的类型，能够决定至少一个在核酸中的碱基的性质。
例如，一个处理的结果能够显示一反应发生的时间；当发射的光线在时间上与至少一个在核酸中之碱基的性质相关时，上述时间可被用于辨识至少一个在核酸中的碱基。
在另一个实施例中，一个处理的结果能够决定将荧光基团合并进入一反应的产物中；当发射的光线在光谱上与至少一个在核酸中之碱基的性质相关时，上述决定可被用于辨识至少一个在核酸中的碱基。
2.2.2.1碱基延伸定序：逐步延伸（BaseExtensionSequencing:StepwiseExtension）
在一些实施例中，侦测装置可被用于侦测在碱基延伸定序期间产生的光线。在一些实施例中，藉由提供一包括一待测的单股核酸之部分重复（partialduplex）的样本核酸、一与待测核酸之3’端相关之末端的连结引子（endlinkprimer）、以及一其黏着（anneal）的定序引子，开始进行碱基延伸定序。在一些实施例中，在一适合的缓冲溶液中，聚合脢及经过改质的核苷酸可应用于上述光侦测装置。在一些实施例中，上述核苷酸可包括一共价连结之可侦测的标记，例如，一荧光标记、以及一保护基团（blockinggroup）以防止任何二次延伸（secondaryextension）。因此，上述定序停止于增加一单一核苷酸至定序引子的3’端之后。
在一碱基延伸定序反应之实施例的第一步骤中，可藉由一ＤＮＡ聚合脢将具有一荧光保护基团的核苷酸加入至定序引子的3’端。在一些实施例中，上述荧光标记可作为上述保护基团。在其它的实施例中，上述荧光标记可为独立的基团。一单一核苷酸可在定序引子的3’端被并入，并且藉由其本身的标记被对应的光侦测器辨识。接着，例如，藉由化学或酵素溶解作用（lysis），移除上述荧光标记及保护基团，以容许碱基延伸额外增加的周期。在一些实施例中，可同时或依序以及以任何顺序，移除标记与保护基团。藉由编排碱基加入的顺序，可以3’至5’的方向，一次一个碱基地推演出样本核酸的序列。
一般而言，有两种在逐步延伸期间辨认增加之核苷酸的方法。在第一种情形中，四个核苷酸可都具有相同之可侦测的标记，但是以一预先决定的顺序一次增加一个。延伸的核苷酸的性质可取决于上述核苷酸在延伸反应中加入的顺序。在第二种于延伸期间辨认完整（integrated）之碱基的模式中，四个不同的核苷酸可同时加入，且每个核苷酸个自与不同之可侦测的荧光标记耦合。在不同的实施例中，激发光谱或发射光谱及/或标记的强度可能不同。在延伸反应中加入之核苷酸的性质可取决于上述侦测之标记的强度及/或波长（亦即，激发光谱或发射光谱）。
2.2.2.2合成定序：多步骤延伸（SequencingbySynthesis:Multi-stepExtension）
在一些实施例中，可利用多重连续的延伸反应（multipleuninterruptedextensions），例如，不使用保护基团，来处理合成的定序。在这些实施例中，藉由侦测在核苷三磷酸（nucleosidetriphosphate）水解之后，亦即β与γ磷酸盐复合物（phosphatecomplex）的释放之后，焦磷酸根（pyrophosphate）的释放，可监测上述聚合反应。例如，藉由一在此复合物上的荧光部分（fluorescentmoiety），可直接侦测此复合物，或例如，藉由将上述磷酸盐耦合至一化学或生物发光侦测装置，可间接侦测此复合物。
在一些实施例中，藉由利用经过末端荧光标定的核苷酸，可基本上（essentially）持续地定序上述样本核酸。末端荧光标定的核苷酸以及其使用的方法之示范的实施例，描述于，例如美国专利号U.S.PatentNo.7,361,466以及美国专利公开号U.S.PatentPublicationNo.2007/0141598，公开于June21,2007。简言之，上述核苷酸可应用于上述侦测装置，并且当此核苷酸在聚合反应期间被水解时，上述被标定的磷酸根可被对应的光侦测器侦测。在一些实施例中，上述核苷酸可包括：不能区别的（indistinguishable），例如，相同的（identical）标记，并且之后以一预先决定的顺序加入。具有不能区别的标记之核苷酸之连续的（Sequential）、循环的（cyclical）增加，还容许多个、不间断的（uninterrupted）聚合步骤，例如，在均匀聚合物（homopolymer）序列中。
2.2.3其它的应用
上述侦测装置可同时侦测数百万个核酸片段。如果每个片段的长度为，例如，1000个碱基，一单一装置可一次获得数十亿个以上的碱基序列。下文将讨论本说明书中所提供的装置及方法之其它的应用。
2.2.3.1全基因体定序（Whole-GenomeSequencing）
上述侦测装置可被用于进行全部或部分基因体的定序，例如：病毒、细菌、真菌、真核细胞、或像是人类等的哺乳动物等之脊椎动物的基因体定序。
染色体DNA（GenomicDNA）可被剪切成至少20、50、100、200、300、500、800、1200、1500个核苷酸或更长之定序的片段。在一些实施例中，被剪切的染色体DNA的长度可为20至50、20至100、20至500、20至1000、500至1200、或500至1500个核苷酸。在一些实施例中，待定序的核酸，与相关之末端的连结引子，可形成单一链段、黏着（annealed）至一定序的引子、以及应用于如上述定序的侦测装置。
2.2.3.2基因表现分析检测（GeneExpressionProfiling）
在其它的实施例中，上述侦测装置可用于将基因表现分析检测（geneexpressionprofiling）的cDNA定序。例如，藉由计算在一装置上侦测的特定序列之相对频率（relativefrequency），可量化mRNA的阶层（mRNAlevels）。在如本说明书中所描述的装置上，数百万个cDNA分子可同时被定序。如果一个细胞平均包含350,000个mRNA分子，在一百万个定序反应中，一呈现甚至每个细胞一个复制的转录体（transcript），预计被定序约三次。因此，利用单一复制数的灵敏度（single-copy-numbersensitivity），上述侦测装置适用于单分子定序。
cDNA的合成在所属技术领域中已广为知悉，其通常包括具有选择性富集之mRNA（optionalenrichmentofmRNA）的全RNA之抽取。藉由以下步骤，包括：例如，第一链段之合成的反转录；核糖核酸水解脢（RNAse）处理；移除残留的RNA；上述第一链段之随机的六具体启动（randomhexamerpriming）；以及藉由DNA聚合脢合成第二链段，自mRNA产生cDNA。上述产生的sDNA适用于在本说明书中所述之装置上的定序。分离与准备DNA及RNA两者的方法在所属技术领域中已广为知悉。参见，例如，JosephSambrook及DavidRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress;第三版(2001)。
2.2.3.3其它的侦测方法
(a)荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）
在一些实施例中，可藉由荧光共振能量转移（resonanceenergytransfer,FRET），于侦测装置上侦测一分子。如所属技术领域中所知，当一受到激发的供体（donor）分子非辐射地（non-radiatively）转移能量至一受质（acceptor）分子时，上述分子发射出能量，此能量一般为光线，会发生荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）。藉由提供较大的光谱分离（greaterspectralseparation），上述光谱分离介于有效激发区以及侦测中的分子之发射波长之间，荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）能够有助于减少背景光线。由于FRET的效率会以供体与受质之间距离的六次方的速度衰减，荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）常用于侦测邻近分子间的交互作用。例如，Zhang等人(NatureMaterials4:826-31[2005])藉由FRET来侦测核酸的杂交（hybridization)。被生物素化的核酸标的（biotinylatednucleicacidtarget）结合至具有抗生物蛋白涂层的量子点供体（avidin-coatedquantumdotdonor），接着，上述量子点供体激发Cy5结合的DNA探针（Cy5-conjugatedDNAprobe）。在一些实施例中，被标定捕捉的分子以及被标记的样本分子可形成一供体/受质对（donor/acceptorpair，反之亦然），以用于FRET的侦测。
在一些利用侦测装置之核酸定序的实施例中，经荧光标定的核苷酸可作为一黏附至聚合脢或连结脢之供体发色团（chromophore）的受质发色团（chromophore）。因此，在这些实施例中，上述定位于聚合脢或连结脢上的供体发色团可激发一位于核苷酸上的受质发色团，上述核苷酸正在目标核酸上进行聚合，或正在连结至目标核酸。没有接近聚合脢的核苷酸，由于其荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）的效率快速的下降，可能不会被激发。在一些实施例中，上述供体分子可为，例如，另一个荧光基团（fluorophore），例如：一量子点。量子点，例如：所属技术领域中已知的半导体量子点，其描述于，例如，国际专利公开号InternationalPatentPublicationNo.WO03/003015。将量子点耦合至，例如：所属技术领域中已知的生物分子，如回顾于，例如：Mednitzetal.,NatureMaterials4:235-46(2005)、以及U.S.PatentPublicationNos.2006/0068506及2008/0087843，其分别公开发表于March30,2006以及April17,2008。在一些实施例中，量子点可结合（conjugated）至DNA聚合脢分子。如前面已经讨论，将酵素结合至交联剂位置，熟知技术者应可了解，当结合荧光基团至，例如，DNA聚合脢或连结脢，必须注意藉由降低任何因为将荧光基团结合至酵素之初级、二级、三级结构所造成的影响，以保留酵素的功能。
(b)多光子激发（Multi-PhotonExcitation）
在一些实施例中，一发色团可被两个或两个以上的光子激发。例如，在一些实施例中，在荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）中，无论是供体发色团或受质发色团皆可透过两个或更多个光子。双光子以及多光子激发进一步描述于，例如，美国专利U.S.PatentNos.6,344,653以及5,034,613。
(c)时间解析侦测（Time-ResolvedDetection）
在一些实施例中，可调整上述激发光源以及一侦测装置的光侦测器，以具有特有的相移（characteristicphaseshift）。利用所属技术领域中已知的方法，例如，揭露于美国专利公开号PatentPublicationNo.2008/0037008，其公开于February14,2008，可藉由一对应的光侦测器来测量来自一正在侦测装置上被侦测的分子所发出的光线，而不被来自激发光源所干扰。
(d)其它荧光侦测装置及方法
在一些实施例中，方法系关于由至少一在生物细胞中的目标物所发射之光线的侦测，上述生物细胞可为一活细胞或固定细胞（livingorfixedcell）。在一些实施例中，至少一目标物择自：至少一包括至少一量子点的目标物、至少一包括至少一荧光蛋白的目标物、以及至少一包括至少一荧光小化学部分（fluorescentsmallchemicalmoiety）的目标物。在一些实施例中，至少一目标物经荧光标定，且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡胜肽、多胜肽、寡糖、多糖、或脂质。
在一些实施例中，上述至少一个目标物包括一固定并且受限制之数量的荧光基团，例如至少20、10、5、或2个荧光基团，上述荧光基团可择自量子点、荧光蛋白、以及荧光小化学部分（fluorescentsmallchemicalmoiety）。在一些实施例中，荧光小化学部分具有一介于300至800nm之间的发射峰emissionpeak及/或一至少为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、或0.9的量子效率（quantumyield）（发射的光子/每个峰值吸收波长的光子）。
2.3生物分子分析服务（BiomoleculeAnalysisService）
本发明亦提供利用一本发明实施例的侦测装置来提供生物分析服务的方法。在一些实施例中，上述方法可包括下列步骤：自服务需求者至服务提供者，提供一样本，包括一待分析的生物分子，以及上述服务需求者收到来自服务提供者的分析结果，其中可利用本发明所提供的侦测装置来产生结果。在一些实施例中，可考量报酬来进行上述方法，例如：服务费用或服务协议合约。此外，上述样本可直接在服务需求者与服务提供者之间传送，或由供货商当媒介。在一些实施例中，上述服务提供者或供货商可在地理上位于美国以外的地方，例如：在另一个国家。
3.实施例
3.1实施例1
第16A-16D图分别显示奈米井121、122、123、及124之计算机仿真结果。在上述模拟中，利用时域有限差分法(Finite-DifferenceTimeDomain，FDTD)来运算沿着导波器的垂直方向传播并且经过或穿过有效激发区之激发光的电场分布（electricfielddistribution）。电场的强度（strengthoftheelectricfield）可代表在导波器中的光线之电磁场的强度（intensityoftheelectromagneticfield）。在第16A-16D图中，电场的强度以任意的单位显示。
为了使模拟更接近实际情况，在此模拟中，假设粒径为100nm的粒子位于奈米井的底部附近。上述粒子的折射率设定为2.5。核心层的折射率设定为2.25，上部及下部的被覆层之折射率设定为1.45，填充奈米井的样本溶液之折射率设定为1.33。上述核心层的厚度设定为100nm。此外，四种形式之奈米井121、122、123、及124之底部的直径皆设定为50nm，以及奈米井的侧壁与介于核心层及上部被覆层之间的界面的夹角角度设定为60度。就奈米井121的模拟而言，奈米井的底部与核心层及上部被覆层之间的界面的距离设定为50nm。就奈米井123的模拟而言，奈米井延伸进入核心层的深度设定为50nm。也就是说，奈米井123的底面位于核心层的中央。在第16A-16D各图中之左手边的图式，显示在不同奈米井121、122、123、及124之导波器中的时间平均电场分布（time-averagedelectricfielddistribution）。在第16A-16D各图中之右手边的图式，显示分别在不同奈米井121、122、123、及124之导波器中沿着垂直方向的电场分布（electricfielddistribution）。
3.2实施例2
本实施例系说明，对于穿透过如第5图中所示之结构的金属图案，一波长为473nm之横向电波模态（transverseelectricmode，TEmode）光线以及一波长为550nm之横向磁波模态（transversemagneticmode，TMmode）光线的穿透性（transmittances）之模拟的结果，分别作为光栅周期（gratingperiod）以及上述金属图案的深度之函数。
第17A图显示，穿透过金属图案，上述横向电波模态（transverseelectricmode，TEmode）光线的模拟穿透性，相对于金属图案之光栅周期（gratingperiod）之关系图。在第17A图中之不同的曲线代表在不同金属图案深度值下的运算结果。第17B图显示，穿透过金属图案，上述横向磁波模态（transversemagneticmode，TMmode）光线的模拟穿透性，相对于金属图案之光栅周期（gratingperiod）之关系图。在第17B图中之不同的曲线代表在不同金属图案深度值下的运算结果。
在第17B图中可以发现，当上述金属图案的光栅周期小于300nm时，上述横向磁波模态（transversemagneticmode，TMmode）光线的穿透性高于约30%，其亦高于横向电波模态（transverseelectricmode，TEmode）光线的穿透性。因此，可预期利用一小于300nm的光栅周期，可实现一高信号噪声比（signal-to-noiseratio,SNR）【亦即，介于横向磁波模态（transversemagneticmode，TMmode）光线与横向电波模态（transverseelectricmode，TEmode）光线之间的穿透性比】。第17C图显示上述信号噪声比（signal-to-noiseratio,SNR）相对于在不同金属图案深度值下的运算出之金属图案的光栅周期的关系图。可以发现，在例如250nm之光栅周期以及深度150nm处可获得一大于10的信号噪声比（signal-to-noiseratio,SNR）。此外，当上述光栅周期以及深度分别为110nm及250nm时，上述信号噪声比（signal-to-noiseratio,SNR）大于107。
3.3实施例3
本实施例系说明，对于穿透过如第5图中所示之结构的金属图案，一横向电波模态（transverseelectricmode，TEmode）光线以及一横向磁波模态（transversemagneticmode，TMmode）光线之经过运算的穿透性（transmittances）。在此实施例中，奈米结构的金属图案152系由铝所组成，以及围绕在铝金属图案周围之下部保护层144系由氧化硅所组成。铝金属图案的周期及深度分别为110nm及245nm。第18A及18B图分别显示TEmode光线与TMmode光线的穿透性作为入射角的函数。从第18A及18B图中可以发现，当入射角的绝对值自0度增加至大于60度时TEmode光线的穿透性自约10-8下降至约10-12；然而在入射角介于约-60度至约60度的范围内，TEmode光线的穿透性始终高于60%。
3.4实施例4
第19图显示第20图中所示之棱镜耦合器之时域有限差分法(Finite-DifferenceTimeDomain，FDTD)的模拟结果。在此模拟中，棱镜与导波器的间距设定为73nm。聚碳酸酯（Polycarbonate，n=1.6）用来作为核心层的材料，且上述核心层的厚度为2μm。利用具有TMmode的入射光（λ=430nm）。亦进行了量测上述棱镜耦合器之耦合效率的实验，其可为，例如约60%。例如，若光源，像是一He-Ne雷射（He-Nelaser），发射一具有约2mW之功率的光线，则上述耦合进入导波器以作为激发光的光线之功率为约1.2mW。
3.5实施例5
第21图系显示被耦合进入第7图中所示之导波器110的入射光线之模拟斑点（speckle）。对此模拟而言，由PMMA所构成之圆柱形透镜（cylindricallens），其孔镜为0.5mm以及其厚度为0.2mm，上述圆柱形透镜用于雷射光整形（laserbeamshaping）。自透镜至导波器的投影距离为1mm。参见第22A及22B图。斑点（speckle）的大小约300nm，以及耦合效率为约70%。例如，若上述光源，像是一He-Ne雷射（He-Nelaser），发射一具有约2mW之功率的光线，则上述耦合进入导波器以作为激发光的光线之功率为约1.4mW。
3.6实施例6
第23图显示，一实施例中，耦合进入核心层112之光线的测量功率与第9图所示之导波器的下部被覆层116的厚度关系。在此量测中，上述光栅周期为约410nm，且上述核心层的厚度为约100nm。上述入射光的波长为约633nm。在第23图中，依据入射光的功率对耦合进入核心层之光线的功率进行标准化。
3.7实施例7
分别在第8及9图中所示之光栅耦合器上进行一时域有限差分法(Finite-DifferenceTimeDomain，FDTD)的模拟。在此模拟中，在第8及9图中之第一光栅的周期设定为410nm，以及在第9图中之第二光栅的周期设定为300nm。两光栅的深度皆设定为55nm。入射光的波长设定为473nm，且光束半径（beamradius）设定为5μm，以及核心层与被覆层的折射率分别设定为2.196与1.445。第24及25图分别显示，在第8及9图中所示之结构中之仿真的瞬间电场分布（instantaneouselectricfielddistribution）。在第8及9图中所示之结构的计算耦合效率分别为20%与25%，其证实加入第二光栅404可增加耦合效率。
3.8实施例8
在第11图中所示之这类的结构上进行运算。对此运算而言，光栅406的有效折射率（effectiverefractiveindex）设定为2.2，核心层112与被覆层114及116的折射率分别设定为1.6与1.45，以及上述光栅的周期与深度分别设定为321nm与120nm。在这样的条件下，对一波长为473nm并且通常入设置光栅406上的入射光而言，上述运算之耦合效率为29%。
3.9实施例9
表1显示自一吸收放射光耦合器（absorbing-emittinglightcoupler）发射出的光线之功率密度（powerdensity）的运算结果，其利用酞花青（phthalocyanine）、4-(dicyanomethylene)-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran(DCM)掺杂的聚乙烯吡咯啶酮（polyvinylphyrodione，PVP）【DCMdopedPVP】作为在此条件之下的发光材料。从表1可以发现，对相同的入射光而言，耦合进入导波器之光线的功率密度可高达37.67W/cm2。
表1
3.10实施例10
利用本发明所揭示的侦测装置将DNA分子定序。本时实施例的侦测装置包括一光源、一光耦合器、一具有形层于导波器之上部被覆层中的奈米井数组的平面导波器、以及一形成于导波器下的侦测器数组。
在本实施例中，光源为一He-Ne雷射，其发射的光波长为约633nm。He-Ne雷射的功率为约2mW。光耦合器为一由PMMA所构成之圆柱形透镜所组成的边耦合器（sidecoupler）。上述圆柱形透境的孔镜为约0.5mm，其厚度为约0.2mm，并且配置于与导波器侧边间距约1mm处。侦测器数组由1000个光侦测器所组成，其中各个侦测器皆为硅光二极管（siliconphotodiode）。
平面导波器包括一厚度为约100nm的核心层、一上部被覆层、以及一下部被覆层。上述核心层系由氮化硅所构成，其折射率为约2.05。上述上部被覆层系由氧化硅所构成，其折射率为约1.46。形成于上部被覆层中的奈米井数组包含1000个奈米井。对其中各个奈米井而言，可利用一光侦测器来侦测被留置（trapped）于奈米井中的分子所发射出的光线。
各个奈米井皆为具有一圆形横截面之漏斗形（funnelshape）。上述奈米井延伸穿过上部被覆层之全部厚度，以便将核心层露出来。上述奈米井底部的直径为约50nm。上述奈米井的侧壁与垂直方向之间的夹角角度为约30度。形成于上述各个奈米井中的有效激发区为约10-18公升（attoliter，al）。
核酸聚合脢以化学方式贴附至奈米井的底面，其平均密度为每个奈米井有效激发区中约有1个活化可使用的聚合脢。
将平均长度为200个核苷酸之环状单股DNA分子的溶液于适合的定序反应缓冲溶液中，其浓度为每10-18公升有0.1个分子，用于上述侦测系统。上述环状的DNA分子包含一约20个核苷酸之已知的插入序列（insertsequence），其自3’端插入至未知的样本序列。提供了一与已知之插入序列互补的定序引子，以及提供了具有保护基团之经过标记的dNTP类似物，其中上述保护基团适合用于可逆性末端终结子（reversibleterminator）之合成定序。在复数个奈米井中，形成一聚合脢的三元复合物（ternarycomplex）、DNA分子、以及定序引子，且上述聚合脢将一荧光标记之dNTP类似物加至此定序引子的3’端。
藉由侧边耦合器，将自He-Ne雷射发射出的光线部份地耦核进入导波器中。一些耦合进入导波器的光现在核心层中传播，作为激发光。在复数个奈米井中，一荧光标记的dNTP类似物被进入形成于奈米井底部附近之有效激发区的激发光所激发，并且发射出荧光。此荧光被侦射器所侦测，其转而产生待处理的输出讯号，以辨识被加至上述定序引子之核苷酸类似物所包含的碱基。
在复数个奈米井中，化学移除荧光基团（fluorophore）以及保护基团。然后，上述聚合脢将另一个荧光标记的dNTP类似物加入，如同上述方式侦测然后移除此荧光标记的dNTP。重复此周期至足够的次数，以获得至少两倍长度之DNA分子的定序读取。（亦即，对DNA分子进行定序以及再定序）。

Claims (60)

1.一种单分子侦测装置，包括：
一导波器；包括：
一核心层，包括一图案化光栅配置于该核心层之露出的部分上；以及
一第一被覆层；其中至少一奈米井形成于至少该第一被覆层中；以及
至少一光侦测器，形成于一基板上或基板內，其中该至少一奈米井以及该光侦测器配置于该导波器的相对两侧，
其中该至少一奈米井的上部开口大于该至少一奈米井的底部，且该导波器为一平面导波器，其还包括一第二被覆层，该第一被覆层及该第二被覆层配置于该核心层的相对两侧。
2.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中还包括一光源。
3.如权利要求第2项所述之单分子侦测装置，其中还包括一光耦合器。
4.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中藉由自一沿着该核心层传播之光波所诱导的光场，形成一有效激发区于该至少一奈米井的底部附近。
5.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该光侦测器根据一侦测的光产生一讯号。
6.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中至少一奈米井延伸穿过该第一被覆层的部分厚度。
7.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中至少一奈米井延伸穿过该第一被覆层的全部厚度。
8.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井延伸穿过该第一被覆层的全部厚度，以及该核心层之部分厚度。
9.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井延伸穿过该第一被覆层的全部厚度，以及该核心层的全部厚度。
10.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该光侦测器包括一组光学感測器。
11.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，还包括复数个奈米井形成于一奈米井阵列。
12.如权利要求第11项所述之单分子侦测装置，还包括：复数个光侦测器形成一侦测器阵列，在该侦测器阵列中的各个光侦测器对应于在该奈米井阵列中之至少一奈米井。
13.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中一包含于该至少一吸收一激发光之奈米井中的单分子目标物，透过荧光共振能量转移，更激发另一个单分子目标物，使该另一个单分子目标物发射光线以被该侦测器侦测。
14.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该核心层的折射率比该第一被覆层的折射率高。
15.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该核心层的折射率比该第一及第二被覆层的折射率高。
16.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该核心层是由一材料所构成，且该材料择自至少下列之一：SixTi1-XO2、TiO2、Ta2O5、Nb2O5、HfO2、Al2O3、ZrO2、ZnS、SiNx、AlNx、TiNx、PC、PMMA、或Su8。
17.如权利要求第1项所述之侦测装置，其中该第一被覆层是由一材料所构成，且该材料择自至少下列之一：SiO2、MgF2、CaF2、Al2O3、PMMA、Su8、或聚碳酸酯。
18.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该第一及第二被覆层是由一材料所构成，且该材料择自至少下列之一：SiO2、MgF2、CaF2、Al2O3、PMMA、Su8、或聚碳酸酯。
19.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，还包括一保护层配置于该第一被覆层上方。
20.如权利要求第19项所述之单分子侦测装置，其中该保护层不透明。
21.如权利要求第20项所述之单分子侦测装置，其中该保护层是由一材料所构成，且该材料择自至少下列之一：Al、Ti、Ni、Cr、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、或任两个或更多个上述材料的合金。
22.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，还包括一不透明层配置于该第二被覆层与该侦测器之间。
23.如权利要求第22项所述之侦测装置，其中该不透明层是由一材料所构成，且该材料择自至少下列之一：Al、Ti、Ni、Cr、Au、Ag、Cu、Pt、Pd、或任两个或更多个上述材料的合金。
24.如权利要求第22项所述之单分子侦测装置，其中该不透明层具有一孔洞配置于该至少一奈米井与该光侦测器之间，以允许一自一包含于至少一奈米井中的单分子目标物发射出的光线到达该光侦测器。
25.如权利要求第22项所述之单分子侦测装置，其中该不透明层具有一奈米图案化的结构配置于该至少一奈米井与该光侦测器之间，以允许一自一包含于至少一奈米井中的单分子目标物发射出之光线穿透，并且阻断噪声的穿透。
26.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中一光学滤光器配置于该导波器与该光侦测器之间。
27.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中一光学滤光器配置于该第二被覆层与该光侦测器之间。
28.如权利要求第22项所述之单分子侦测装置，其中一光学滤光器配置于该不透明层与该光侦测器之间。
29.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该第二被覆层亦作为一光学滤光器。
30.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，还包括一封盖位于该至少一奈米井的上方。
31.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井的至少一第一表面具有与该至少一奈米井的至少一第二表面之不同的表面性质。
32.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井的一侧壁表面为亲水性，该侧壁表面包括一材料择自：硅、二氧化硅、金属、或金属氧化物。
33.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井的一底面为疏水性。
34.如权利要求第33项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井的该底面形成自一硅酸盐，或形成自一亲水性的金属，其被R1x-Si(O-R2)4-x或被一具有官能基团的聚合物改质成为疏水性，以及
其中R1为一疏水性基团，该疏水性基团择自：烷链-(CH2)n-CH3：且R2为CnH2n+1，以及
该官能基团择自：-COOH、-PO3H2、-SH、或NH2。
35.如权利要求第33项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井的该底面形成自一亲水性金属氧化物，其被R1x-Si(O-R2)4-x或被一具有官能基团的聚合物经亲水性改质成为疏水性，以及
其中R1为一疏水性基团，该疏水性基团择自：烷链-(CH2)n-CH3：且R2为CnH2n+1，以及
该官能基团择自：-COOH、-PO3H2、-SH、或NH2。
36.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井的一底面具有与该至少一奈米井的一侧壁表面之不同的表面性质。
37.如权利要求第31项所述之单分子侦测装置，其中该表面性质包括：疏水性、官能基团、官能基团密度、材料密度、或导电性。
38.如权利要求第36项所述之单分子侦测装置，其中该表面性质包括：疏水性、官能基团、官能基团密度、材料密度、或导电性。
39.如权利要求第3项所述之单分子侦测装置，其中该光耦合器为一光栅耦合器，其位于该核心层之上、该核心层之中、或该核心层之下。
40.如权利要求第3项所述之单分子侦测装置，其中该光耦合器为一棱镜耦合器。
41.如权利要求第3项所述之单分子侦测装置，其中该光耦合器为一侧边耦合器。
42.如权利要求第3项所述之单分子侦测装置，其中该光耦合器为一吸收发射耦合器，其吸收一自该光源发射出的入射光并发射出一激发光。
43.如权利要求第42项所述之单分子侦测装置，其中该吸收发射耦合器包括一光致发光材料，上述光致发光材料具有大于或等于30nm的托斯克斯位移。
44.如权利要求第43项所述之单分子侦测装置，其中该光致发光材料掺杂于一聚合物中。
45.如权利要求第43项所述之单分子侦测装置，其中该光致发光材料包括一光致发光染剂，上述光致发光染剂包括：蒽、香豆素、芘、二苯乙烯、紫质、苝、Alq3、曙红、Bodipydye、荧光素、若丹明、聚次甲基染料、DCM、或上述之衍生物。
46.如权利要求第43项所述之单分子侦测装置，其中该光致发光材料包括一光致发光聚合物，上述光致发光聚合物包括：PPV或其衍生物。
47.如权利要求第43项所述之单分子侦测装置，其中该光致发光材料包括一无机化合物，上述无机化合物包括量子点、氧化铝、或氧化锌。
48.如权利要求第3项所述之单分子侦测装置，其中该光源为一同向耦合器。
49.如权利要求第2项所述之单分子侦测装置，其中该光源为一雷射、一雷射二极管、一LED、一OLED、一QLED、一光纤光源、或一电弧放电荧光灯。
50.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该第一被覆层的折射率约等于一样本溶液的折射率。
51.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该第一被覆层的折射率大于一样本溶液的折射率。
52.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该至少一奈米井的一底部的尺寸小于一在核心层中之激发光的波长、小于该波长的一半、小于该波长的四分之一、或小于该波长的八分之一。
53.如权利要求第2项所述之单分子侦测装置，其中该光源形成于一该导波器的支撑基板上。
54.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该光侦测器为一光学感測器，其择自：一CCD、一CMOS光学感測器、一光导电型光学感測器、一光伏打型光学感測器、一APD、一p-n光电二极管、一p-i-n光电二极管、或一多接面光电二极管。
55.如权利要求第1项所述之单分子侦测装置，其中该光侦测器为一组光学感測器，其择自：CCD、CMOS光学感測器、光导电型光学感測器、光伏打型光学感測器、APDs、p-n光电二极管、p-i-n光电二极管、或多接面光电二极管。
56.如权利要求第55项所述之单分子侦测装置，其中在一组中的该光学感測器具有不同的敏感波段。
57.一种单分子的侦测方法，包括：
藉由一光源发射一入射光；
藉由一耦合器将该入射光耦合进入一导波器中，以在该导波器中形成一激发光；
藉由该激发光及形成于至少一该导波器之被覆层中的至少一奈米井，形成一有效激发区；以及
藉由该激发光激发一在有效激发区中的单分子目标物，使该单分子目标物发射出一光线以被一光侦测器所侦测，该光侦测器形成于一基板上或基板內，其中该至少一奈米井以及该光侦测器配置于该导波器的相对两侧，
其中该至少一奈米井的上部开口大于该至少一奈米井的底部，且该导波器为一平面导波器，其还包括一第二被覆层，该被覆层及该第二被覆层配置于一核心层的相对两侧，其中，一图案化光栅配置于该核心层之露出的部分上。
58.一种核酸的定序方法，包括下列步骤：
提供一侦测装置，包括：
一导波器，包括：
一核心层，包括一图案化光栅配置于该核心层之露出的部分上；以及
一第一被覆层；其中
至少一奈米井至少形成于该第一被覆层中；以及
至少一光侦测器，形成于一基板上或基板內，其中该至少一奈米井以及该光侦测器配置于该导波器的相对两侧；
提供至少一核酸分子；
将该至少一核酸分子个别地定位于至少一奈米井中；
进行该至少一核酸分子的单分子合成定序，其中该单分子核酸的合成定序导致光线的发射，该发射的光线与至少一该核酸中的碱基之特性有关；
利用该侦测器侦测该发射光，产生一输出讯号；以及
处理该输出讯号以决定至少一该核酸所包含的碱基之特性，
其中该至少一奈米井的上部开口大于该至少一奈米井的底部，且该导波器为一平面导波器，其还包括一第二被覆层，该第一被覆层及该第二被覆层配置于该核心层的相对两侧。
59.如权利要求第58项所述之核酸的定序方法，其中该单分子核酸的合成定序透过化学发光导致光线的发射。
60.如权利要求第58项所述之核酸的定序方法，其中该侦测装置还包括一光源，以及该单分子核酸合成定序透过荧光导致光线的发射。
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Assignor: Industrial Technology Research Institute

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