CN110628597A - 拉曼光谱法生物分子测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种拉曼光谱法生物分子测序方法，包括步骤：I、提供纳米孔装置，包括柔性基底纳米孔结构，所述柔性基底纳米孔结构包括纳米孔、金属层，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；II、所述生物分子向所述纳米孔移动，激光拉曼显微镜向所述纳米孔发射激光，所述生物分子通过所述纳米孔时，产生拉曼光谱信号；III、光谱测量装置测量拉曼光谱信号得出测量数据；IV、数据采集分析装置分析系所述测量数据并输出结果。本发明使用表面增强拉曼光谱的检测策略，具有技术效果可实现亚纳米空间分辨率的检测；提供分子特异性指纹信息的振动光谱，各碱基光谱信号不重叠，具有优异的区分度和化学灵敏度。

Description

拉曼光谱法生物分子测序方法

技术领域

本发明属于基因测序领域和生物分子传感领域，尤其涉及一种采用拉曼光谱法进行生物分子测序的系统及其测序方法。

背景技术

遗传信息的测量对生命科学和医学领域具有革命性的推动作用。未来精准医疗与个性化医疗需求成本更低、速度更快、精度更高以及读长更长的新型测序技术。

新一代单分子实时测序技术解决了读长更长和速度更快的需求；最近飞速发展的生物纳米孔测序技术进一步解决了成本更低的需求。生物纳米孔测序技术不需要准备大量的样品，样品制备过程不需要耗费生物与化学试剂，大大降低了测序成本，也节省了DNA克隆和扩增的时间，节约了时间成本。英国Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司发布第一款商用生物纳米孔测序仪MinION，具有手掌大小的体积，便携性非常好，极大地拓展了测序仪的应用场景。比如MinION被用于非洲地区的埃博拉病毒的快速检测和鉴定工作，被美国国家航空航天局用于太空中的测序工作。

然而，目前的生物纳米孔镶嵌在脂双层膜上，对环境敏感(pH，温度，盐浓度等)，稳定性和耐用性比较差，使用寿命有限；另外，生物纳米孔一般只能采用离子阻断电流的检测机制，需要特制低噪电流放大电路达到足够的灵敏度，使测序单元的大规模矩阵化集成具有非常大的挑战性。

为克服生物纳米孔的缺点，具有良好稳定性、耐用性，适合大规模批量生产，容易与光电检测集成的固态纳米孔被广泛研究。目前的固态纳米孔技术主要也是通过测量离子阻断电流来实现测序，但其面临诸多挑战：首先，DNA链在纳米孔中的转运行为不易控制，碱基的朝向不受控制，具有很大的随机性，DNA移动速度太快(0.1～1μs/bp)；DNA与纳米孔表面发生非特异性结合，形成二级或三级结构，阻塞纳米孔，限制DNA链的正常转运行为；在传统的生物和固态纳米孔检测技术中，一般使用离子阻断电流来分辨不同的碱基序列，然而电流检测技术具有一个本质的局限性：纳米孔周围的电场会向两侧延伸，导致纳米孔有效长度延长，限制了检测分辨率。这些问题都严重限制了固态纳米孔测序技术的成功实现。

为了解决上述问题，本发明提出下面几项技术方案，以实现方便快捷准确的纳米孔测序：新型柔性基底固态纳米孔制备技术；模块化的纳米孔装置实时快速组装模式；使用运动蛋白有效地控制DNA或RNA在固态纳米孔中的转运速度；将光谱测量技术结合至固态纳米孔测量中，提高序列测量的准确度。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供基于运动蛋白的DNA转运速度控制装置，用于解决固态纳米孔存在的几个问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种拉曼光谱法生物分子测序系统，包括纳米孔装置、激光拉曼显微镜、光谱测量装置和数据采集分析装置，所述纳米孔装置位于所述激光拉曼显微镜下方；所述纳米孔装置包括壳体、流体腔密封层、柔性基底纳米孔结构、流体腔基座、电源、第一电极和第二电极，所述第一电极和所述第二电极分别与所述电源的两极相连接；所述柔性基底纳米孔结构包括柔性基底、孔基底和纳米孔结构，所述纳米孔结构包括纳米孔腔、纳米孔；所述纳米孔腔贯穿所述孔基底，所述纳米孔是所述纳米孔腔的一端开口，所述纳米孔腔呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔延伸；所述纳米孔结构还包括：光栅，所述光栅围绕所述纳米孔腔，所述光栅形成于所述孔基底上远离所述纳米孔的面上，所述光栅由多组光栅槽构成；孔保护膜，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔；金属层，覆盖所述孔保护膜，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；流体腔，由所述柔性基底不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔、围绕所述光栅和所述纳米孔腔上方形成；所述柔性基底纳米孔结构包括两个第一液体流道，所述第一液体流道连接外部与所述流体腔，以向所述流体腔输入或排出含待测生物分子的溶液；所述流体腔基座包括流体下腔、两个第二液体流道，所述第二液体流道连接外部与所述流体下腔，以输入或排出所述流体下腔内溶液；所述流体腔密封层密封所述流体腔；所述壳体包括流道开口，分别与所述第一液体流道和第二液体流道对应；待测生物分子通过所述纳米孔时，所述激光拉曼显微镜向所述生物分子发射激光，产生拉曼光谱信号，所述光谱测量装置测量所述拉曼光谱信号得出测量数据，所述数据采集分析装置分析所述测量数据并输出结果。

优选地，所述金属层是铜、银、金、锌、汞、镉、钴、镍或铝中的一种。

优选地，所述生物分子是多肽链。

优选地，所述生物分子是DNA、RNA或者甲基化的DNA；所述纳米孔中具有运动蛋白，所述运动蛋白与所述金属层形成金属-硫键。

优选地，所述第一电极和所述第二电极之间电压0.01-10V。

优选地，所述激光拉曼显微镜发射激光的波长为200-1000nm。

优选地，所述光谱测量装置的光栅为150-2400刻线/行。

优选地，所述拉曼光谱信号采集时长1μs-1s。

优选地，所述激光拉曼显微镜向所述生物分子发射泵浦激光、斯托克斯激光和探测激光，以产生所述相干拉曼光谱信号。

优选地，所述拉曼光谱信号是受激拉曼散射光谱信号，相干反斯托克斯拉曼光谱信号或双光梳相干拉曼光谱信号中的一种。

还提供一种拉曼光谱法生物分子测序方法，包括步骤：

I、提供纳米孔装置，包括柔性基底纳米孔结构，所述柔性基底纳米孔结构包括柔性基底、孔基底和纳米孔结构，所述纳米孔结构包括纳米孔腔、纳米孔；所述纳米孔腔贯穿所述孔基底，所述纳米孔是所述纳米孔腔的一端开口，所述纳米孔腔呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔延伸；

所述纳米孔结构还包括：光栅，所述光栅围绕所述纳米孔腔，所述光栅形成于所述孔基底上远离所述纳米孔的面上，所述光栅由多组光栅槽构成；孔保护膜，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔；金属层，覆盖所述孔保护膜，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；流体腔，由所述柔性基底不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔、围绕所述光栅和所述纳米孔腔上方形成；

所述柔性基底纳米孔结构包括两个第一液体流道，所述第一液体流道连接外部与所述流体腔，以向所述流体腔输入或排出含待测生物分子的溶液；

向所述流体腔输入含待测生物分子的溶液；

II、所述生物分子向所述纳米孔移动，激光拉曼显微镜向所述纳米孔发射激光，所述生物分子通过所述纳米孔时，产生拉曼光谱信号；

III、光谱测量装置测量拉曼光谱信号得出测量数据；

IV、数据采集分析装置分析系所述测量数据并输出结果；

优选地，步骤I中还包括向所述流体下腔输入缓冲液。

优选地，所述生物分子是多肽链，步骤A还包括处理蛋白质形成所述多肽链。

优选地，所述生物分子是DNA、RNA或者甲基化的DNA；所述纳米孔中具有运动蛋白，所述运动蛋白与所述金属层形成金属-硫键。

优选地，所述第一电极和所述第二电极之间电压0.01-10V。

优选地，所述激光拉曼显微镜发射激光的波长为200-1000nm。

优选地，所述光谱测量装置的光栅为150-2400刻线/行。

优选地，所述拉曼光谱信号采集时长1μs-1s。

优选地，所述激光拉曼显微镜向所述生物分子发射泵浦激光、斯托克斯激光和探测激光，以产生所述相干拉曼光谱信号。

优选地，所述拉曼光谱信号是受激拉曼散射光谱信号，相干反斯托克斯拉曼光谱信号或双光梳相干拉曼光谱信号中的一种。

本发明提供的拉曼光谱法生物分子测序系统及其方法，使用表面增强拉曼光谱的检测策略，具有技术效果：金属层表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，因此无论纳米孔的尺寸如何，只利用表面的等离激元增强电场即可以实现亚纳米空间分辨率的检测；传统离子电流生物分子测序技术，20种氨基酸R基、不同碱基的特征电流信号有比较大的重叠区域，限制了区分的灵敏度，而拉曼光谱可以提供分子特异性指纹信息的振动光谱，各碱基或氨基酸残基光谱信号不重叠，具有优异的区分度和化学灵敏度。

附图说明

图1a是在晶圆上预形成纳米孔结构的孔基底阵列的俯视图。

图1b是在晶圆上预形成纳米孔结构的孔基底阵列的立体视图。

图2a～2f是在氮化硅孔基底上形成纳米孔工艺分步骤的剖视图。

图3a～3f是在硅孔基底上形成纳米孔工艺分步骤的剖视图。

图4a～4i是3种光栅结构与3种纳米孔结构的组合俯视图。

图5a～5f是2种光栅结构与3种纳米孔结构的组合俯视图。

图6a～6c是3种光栅槽横截面图。

图7a～7c是在孔基底上形成柔性基底工艺步骤的剖视图。

图8a～8b是图7a的俯视图。

图8c是形成于孔基底上盲孔的俯视示意图。.

图9a～9c是形成柔性基底纳米孔工艺步骤的剖视图。

图10a～10c是形成柔性基底纳米孔工艺步骤的俯视图。

图11是柔性基底纳米孔阵列的立体图。

图12是柔性基底纳米孔制造方法的流程图。

图13是模块化组装纳米孔装置组装剖面示意图。

图14a～b是流道开口密封件装配示意图及其剖面结构图

图15a～b是模块化组装纳米孔装置剖面示意图及其俯视图。

图16a～b是装配结构剖面示意图。

图17a～c是在运动蛋白上修饰DNA长链尾的流程示意图。

图18是将运动蛋白锚定在金属层的流程示意图。

图19是拉曼光谱法生物分子测序系统。

图20a是表面增强拉曼光谱方法DNA测序示意图。

图20b是超快相干拉曼光谱方法DNA测序示意图。

图21是拉曼光谱直接读出的DNA的序列信息。

元件标号说明

1 衬底 74 流体腔基座

2 牺牲层 75 电源

3 孔基底 76 流道系统

4 柔性基底 91 激光拉曼显微镜

5 纳米孔腔 92 光谱测量装置

6 盲孔 93 数据采集分析装置

7 纳米孔装置 711 装配结构

8 运动蛋白 721 流体腔

21 孔下微腔 741 流体下腔

30 孔保护牺牲层 751 第一电极

31 光栅槽 752 第二电极

32 孔保护膜 761 第一流道开口密封件

33 金属层 762 第二流道开口密封件

40 通孔 7110 装配枢轴

51 纳米孔 7111 第一装配件

71 壳体 7112 第二装配件

72 柔性基底纳米孔结构 7610 第一液体流道

73 流体腔密封层 7620 第二液体流道

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

请参阅图1至图21。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，图中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

专利一

本发明提供一种柔性基底纳米孔结构，如图9c所示，柔性基底纳米孔结构72包括柔性基底4和纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构形成于孔基底3上，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51；制备在柔性基底4上的纳米孔结构，可减少外部环境对纳米孔结构的冲击，纳米孔结构不易被外力折断，可满足恶劣环境下的测序工作。

在本实施例中，柔性基底4是高分子聚合材料，包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚异戊二烯、丙烯酸脂、甲基丙烯酸甲酯、邻叠氮萘醌、线性酚醛树脂、硅酮胶、玻璃胶材料、SU-8高分子聚合物中的至少一种；在本实施例中，所述柔性基底4的厚度为 0.1-1000μm，可减少外部环境对纳米孔结构的冲击，纳米孔结构不易被外力折断，可满足恶劣环境下的测序工作。

优选地，所述柔性基底4的厚度为1～10μm。

在本实施例中，孔基底3是氮化硅或硅材料，本发明在此不做限制，在其他实施例中也可以是其他含硅材料，也可以是不含硅的半导体材料，如氮化镓、砷化镓等化合物半导体等。

如图9c所示，所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸。

所述纳米孔结构还包括光栅(未标示)，所述光栅围绕所述纳米孔腔5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51，所述光栅由光栅槽31构成，即光栅槽31定义光栅。

本发明主要用于基因测序领域，尤其是第四代固态纳米孔测序领域，主要功能单位是光栅和纳米孔51，其中光谱法固态纳米孔工作状态时，DNA等含有序列信息的长链生物分子通过纳米孔51，纳米孔51作为天线光学，在激光照射下表面产生高度局域的等离激元电场，激发碱基分子的特异性振动/转动/吸收/反射光谱，光栅将纳米孔51产生的光谱信号反射回去，减少传播损失，具有增强光谱信号强度的技术效果。

如图4a～图5f所示，本发明给出了多种光栅与纳米孔51的组合示意图：纳米孔51的尺寸为1-100nm，孔基底尺寸为1-1000μm，尺寸比较小，具有不容易发生机械折断的技术效果。如图4a～5f所示，本发明给出了不同纳米孔腔5和纳米孔51的结构，在本实施例中，纳米孔腔5为上宽下窄的圆柱状，即纳米孔51的横截面形状呈圆形；在其他实施例中，纳米孔腔5为上宽下窄的倒金字塔状，即纳米孔51的横截面形状也可以是方形或长方形。

如图4a～5f所示，作为与纳米孔51相配合工作的光栅(未标示)由若干光栅槽31定义，光栅槽31的上开口宽度为10-500nm，各光栅槽31之间的距离为10-5000nm，优选地，各光栅槽31之间的距离为100-1000nm。

如图4a～5f所示，本发明给出了不同光栅槽31定义的光栅的结构。在本实施例中，所述光栅槽31的横截面呈多个同心环槽组，在其他实施例中，光栅槽31的横截面呈对称的平行直线槽组或对称的弧度线槽组；

如图6a～6c所示，本发明给出了光栅槽31的剖面槽结构，在本实施例中，光栅槽31的剖面呈倒三角形，在其他实施例中，光栅槽31的剖面可以呈方形或梯形。

如图4a～4i所示，本发明给出了由光栅槽31定义的光栅围绕纳米孔51设置的组合，在本实施例中，由光栅槽31定义的光栅呈四周围绕纳米孔51的方式设置，在其他实施例中，如图5a～5f所示，光栅槽31定义的光栅呈两组对称围绕纳米孔51的方式设置。以上光栅槽31 定义的光栅与纳米孔51的组合方式，在DNA等含有序列信息的长链生物分子通过纳米孔51 时，纳米孔51作为天线光学，在激光照射下表面产生高度局域的等离激元电场，激发碱基分子的特异性振动/转动/吸收/反射光谱，光栅将纳米孔51产生的光谱信号反射回去，具有减少光传播损失，增强光谱信号强度的技术效果。

所述纳米孔结构还包括孔保护膜32，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5，用以保护纳米孔腔5免在制造工艺中产生瑕疵。

在本实施例中，孔保护膜32包括二氧化硅层，优选地，至少有两层二氧化硅层，以形成阶梯保护结构，保护纳米孔腔5免在制造工艺中产生瑕疵。在其他实施例中，孔保护膜32还可以包括至少两层其他氧化物层，如金属氧化物层，用以形成阶梯保护结构，纳米孔腔5免在制造工艺中产生瑕疵。

较佳地，孔保护膜32包括至少两层二氧化硅原子层或二氧化硅膜。

所述纳米孔结构还包括金属层33，覆盖所述孔保护膜32，金属层33厚度为10～500nm，以缩小所述纳米孔51尺寸至1～100nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，在DNA 等含有序列信息的长链生物分子通过纳米孔51时，纳米孔51作为天线光学，在激光照射下表面产生高度局域的等离激元电场，激发碱基分子的特异性振动/转动/吸收/反射光谱，光栅将纳米孔51产生的光谱信号反射回去，具有减少光传播损失，增强光谱信号强度的技术效果。

在本实施例中，金属层33是金材料，在其他实施例中，金属层33可以是铝、亚铅、银、铜、白金或镍材料。

所述纳米孔结构还包括流体腔721，如图9c所示，由所述柔性基底4不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5、围绕所述光栅和所述纳米孔腔5上方形成，用于装载被检测分子溶液，开展纳米孔检测工作。

在本实施例中，孔基底3还包括盲孔6阵列，所述柔性基底4填充所述盲孔6阵列，增加柔性基底4与纳米孔结构的接触面积，保证良好的密封性能。

较佳地，如图8a～8c所示，盲孔6横截面形状可以是正方形，长方形，圆形，十字形，五边形，五角星形或多边形，增加柔性基底4与纳米孔结构的接触面积，保证良好的密封性能。

如图11所示，本发明还提供一种柔性基底纳米孔阵列，若干如上述的所有纳米孔结构以阵列形式设置于一所述柔性基底4中，本阵列中的纳米孔结构与上文中相同，发明人在此不再赘述。其中阵列之间的间隔为0.01-10mm。需要说明的是，纳米孔结构可以用于DNA分子，RNA分子，蛋白质分子的特征光谱检测和测序工作。可以根据需求对柔性基底纳米孔阵列进行剪裁，得到不同形状和数量的纳米孔阵列，用于不同场景的测序或检测应用。

纳米孔51、柔性基底纳米孔结构72和柔性基底纳米孔阵列在使用之前需要完全润湿，否则纳米孔51处容易出现气泡，导致DNA等长链生物分子或被检测分子无法进入纳米孔51 处。

本发明还提供一种纳米孔51、柔性基底纳米孔结构72或柔性基底纳米孔阵列的保管方法：将纳米孔51缓慢浸入醇类物质与水的混合液对纳米孔51进行完全润湿，利用醇类物质蒸发产生的表面张力梯度，使水从表面张力低向张力高的方向流动，将纳米孔51完全润湿，避免纳米孔51处产生气泡。润湿后的纳米孔51、柔性基底纳米孔结构72或柔性基底纳米孔阵列放置在上述醇类物质与水的混合液中等待使用，避免纳米孔51处产生气泡。

在本实施例中，醇类物质与水的混合液中醇类物质与水的体积比1:1，利用醇类物质蒸发产生的表面张力梯度，使水从表面张力低向张力高的方向流动，将纳米孔51完全润湿，避免纳米孔51处产生气泡。润湿后纳米孔51、柔性基底纳米孔结构72或柔性基底纳米孔阵列放置在醇类物质与水混合液中等待使用，避免纳米孔51处产生气泡。

优选地，所述醇类物质是异丙醇。

本发明还提供一种柔性基底纳孔结构的制造方法，考虑到单个纳米孔的尺寸比较小(通常在十微米以下)，不容易发生机械折断。如果将单个或少许脆性的固态纳米孔镶嵌并且密封在柔性的高分子聚合材料中，则可以实现柔性基底固态纳米孔的制备，减少外部环境对脆性纳米孔器件的冲击。因此，如图12结合图1～图10c，我们提出先制备出固态纳米孔结构，再将柔性基底与纳米孔结构镶嵌结合的制造方法。

柔性基底纳孔结构的制造方法包括：

步骤100、形成纳米孔结构；

步骤200、形成柔性基底4的纳米孔结构；

其中步骤100包括：

1001、提供衬底1，所述衬底1是硅晶圆；

1002、在所述衬底1上形成牺牲层2，所述牺牲层2是含硅化合物；

1003、在所述牺牲层2上形成孔基底层(未标示)；

1004、所述孔基底层形成孔基底3；

1005、在所述孔基底3上形成纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51和光栅(未标示)，所述光栅(未示出)由光栅槽31构成，所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸，所述光栅围绕所述纳米孔腔5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51；

1006、形成覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的孔保护膜32，形成覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的金属层33，以缩小所述纳米孔51尺寸至1～100nm；

如图7a～7c、图9a～9c(图10a～10c是图9a～9c对应的俯视图)所示，所述步骤200包括：

2001、如图7b所示，形成覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的孔保护牺牲层30，以保护光栅和纳米孔腔5免受柔性基底4的沾染，保护纳米孔结构的等离激元性质；在本实施例中，孔保护牺牲层30是Al,Cu或Ti材料，厚度为1-500nm，以保护纳米孔结构结构的等离激元性质。

较佳地，还包括在所述孔基底3上形成盲孔6，以增加所述柔性基底4与所述孔基底3 的接触面积。

2002、如图7c所示，形成覆盖所述牺牲层2和所述孔基底3的柔性基底4，亦即，形成覆盖所述牺牲层2、所述孔基底3以及孔保护牺牲层30的柔性基底4；

需要说明的是，为了保证柔性基底4与孔基底3形成紧密贴合，孔基底3上在光栅槽31 (光栅)外周预留足够多的接触区域，以与柔性基底4贴合，接触区域的面积需要大于纳米孔结构(即光栅槽31与纳米孔腔5)的面积，以保证贴合紧密。

需要说明的是，柔性基底4是柔性高分子聚合材料，包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚异戊二烯、丙烯酸脂、甲基丙烯酸甲酯、邻叠氮萘醌、线性酚醛树脂、硅酮胶、玻璃胶材料、SU-8高分子聚合物中的至少一种；在本实施例中，制备柔性基底4工艺，以聚二甲基硅氧烷PDMS为例说明：将聚二甲基硅氧烷PDMS溶液与固化剂按一定比例，优选6:1 比例混合均匀形成柔性基底溶液，在真空设备中抽真空去除气泡后待用；形成孔保护牺牲层30 后，将柔性基底溶液均匀地涂布在孔保护牺牲层30、盲孔6及孔基底3表面上，加热温度40-180 ℃,加热时长10-180min，使柔性基底溶液中的分子发生交联聚合，在孔保护牺牲层30、盲孔6及孔基底3表面上形成厚度均匀的柔性基底4，所述柔性基底4的厚度为0.1-1000μm，可减少外部环境对纳米孔结构的冲击，纳米孔结构不易被外力折断，可满足恶劣环境下的测序工作；优选地，所述柔性基底4的厚度为1-10μm。

2003、如图9a、10a所示，在柔性基底4上形成若干通孔40，以暴露出所述牺牲层2，在本实施例中，光刻柔性基底4，形成若干通孔40组成的阵列，通孔40横截面形状为边长0.01-100μm的正方形，通孔40的底端直接暴露牺牲层2的表面；

2004、如图9b、10b所示，通过所述通孔40加入BHF，以全部刻蚀所述牺牲层2，牺牲层2上面部分形成柔性基底纳米孔结构72，牺牲层2下面部分即衬底1脱落并可被循环使用；

在步骤2005之前还可包括：再次在柔性基底4(含通孔40)的表面涂布一层柔性高分子聚合材料，加热聚合将通孔40堵住。

2005、如图9c、10c所示，去除覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的柔性基底4和孔保护牺牲层30，形成流体腔721，即流体腔721由所述柔性基底4不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5、围绕所述光栅和所述纳米孔腔5上方形成，以装载被检测分子溶液，开展纳米孔测序工作。

纳米孔结构所赖以形成的基础是孔基底3，不同材料的孔基底3是造成步骤100工艺不同的重要影响因素。在本发明中，发明人就孔基底3采取氮化硅或硅材料以形成纳米孔结构，在其他实施例中也可以是其他含硅材料，也可以是不含硅的半导体材料，如氮化镓、砷化镓等化合物半导体，下面分别说明以氮化硅孔基底3和硅孔基底3形成纳米孔结构的步骤100。

(一)、氮化硅纳米孔结构工艺

1001、提供衬底1，所述衬底1是硅晶圆，本发明采用晶向110的硅晶圆，但不限于(100)晶面的硅片，尺寸可以是4、6、8、或者12英寸，但不限于此4种尺寸；

1002、在所述衬底1上形成牺牲层2，所述牺牲层2是含硅化合物；所述牺牲层2是二氧化硅层，本步骤使用氧化或化学气相沉积法形成所述牺牲层2，所述牺牲层2形成方法不限于上述方法，所述牺牲层2厚度为100-2000nm，优选地，所述牺牲层2厚度为500nm，但不限于此范围；

1003、使用低压化学气相沉积(LPCVD)、等离子增强化学气相(PECVD)沉积或电感耦合等离子增强气相沉积(ICPCVD)方法在所述牺牲层2上形成孔基底层(未标示)，所述孔基底层是氮化硅层，所述孔基底层形成方法不限于上述方法，所述孔基底层厚度为100-2000 nm，但不限于此范围，优选地，所述孔基底层厚度为700nm；

1004、所述孔基底层形成孔基底3，具体采取在氮化硅层表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀(RIE)形成氮化硅孔基底3，形成边宽为1-1000μm正方形的氮化硅孔基底3，因实际检测领域不同，优选地，氮化硅孔基底3边宽可以为1μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、 650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1000μm；

1005、使用反应离子刻蚀在所述孔基底3上形成纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51和光栅(未标示)，所述光栅(未示出)由光栅槽31构成，所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸，所述光栅围绕所述纳米孔腔 5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51。

如图2a～2f所示，使用反应离子刻蚀所述孔基底层以依次形成所述光栅、所述纳米孔腔 5。

第一步，氮化硅孔基底3上制作光栅，如图2a～2b所示：氮化硅孔基底3上旋涂光刻胶，光刻制备掩模，使用反应离子刻蚀(RIE)制备由光栅槽31定义的光栅，该光栅是布拉格光栅，光栅槽31的槽表面定义布拉格反射镜，光栅槽31上开口宽度10-500nm，各光栅槽31之间距离10-5000nm，优选地，各光栅槽31之间距离100-1000nm。

第二步，在光栅中央制作纳米孔腔5，如图2c所示：旋涂光刻胶，在布拉格反射镜的中间位置使用反应离子刻蚀(RIE)制备出纳米孔腔5，纳米孔腔5上开口宽度0.1-5μm，纳米孔腔5下开口形成纳米孔51，此时纳米孔51的尺寸控制在10-5000nm，优选地，此时纳米孔51的尺寸控制在50-500nm。

1006、形成覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的孔保护膜32，具体如图2d～e所示，通过所述纳米孔腔5加入BHF，以部分刻蚀所述牺牲层2，形成孔下微腔21，孔下微腔21为椭圆形孔洞，使用原子沉积法形成所述孔保护膜32，所述孔保护膜32包括至少一层二氧化硅层；形成覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的金属层33，具体如2f所示，使用溅射或蒸发工艺形成所述金属层33，以缩小所述纳米孔尺寸至1-100nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率。

氮化硅纳米孔结合光栅，制备出集成光学芯片，用于高通量的片上光学检测模式。

(二)、硅纳米孔结构工艺

1001、提供衬底1，所述衬底1是硅晶圆，本发明采用晶向110的硅晶圆，但不限于(100)晶面的硅片，尺寸可以是4、6、8、或者12英寸，但不限于此4种尺寸；

1002、在所述衬底1上形成牺牲层2，所述牺牲层2是含硅化合物；所述牺牲层2是二氧化硅层，本步骤使用氧化或化学气相沉积法蒸镀形成所述牺牲层2，所述牺牲层2形成方法不限于上述方法，厚度为100-2000nm，但不限于此范围，优选地，所述牺牲层2厚度为500nm；

1003、在所述牺牲层2上形成孔基底层(未标示)，所述孔基底层是硅孔基底层，本步骤使用化学气相沉积法形成所述硅孔基底层，厚度为100-2000nm，但不限于此范围，优选地，硅孔基底层厚度为700nm；

1004、所述孔基底层形成孔基底3，具体采取在硅层表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀(RIE)形成硅孔基底3，形成边宽为1-1000μm正方形的硅孔基底 3；

1005、使用氢氧化钾或羟化四甲铵湿法刻蚀在所述孔基底3上形成纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51和光栅(未标示)，所述光栅(未示出)由光栅槽31构成，所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸，所述光栅围绕所述纳米孔腔5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51。

如图3a～3f所示，使用氢氧化钾或羟化四甲铵湿法刻蚀所述孔基底层以同时形成所述光栅、所述纳米孔腔5。

如图3a～3c所示：硅孔基底3上旋涂光刻胶，光刻制备掩模，使用氢氧化钾或羟化四甲铵湿法刻蚀硅孔基底3形成光栅槽31和纳米孔腔5，光栅槽31定义光栅，该光栅是布拉格光栅，光栅槽31的槽表面定义布拉格反射镜，光栅槽31上开口宽度10-500nm，各光栅槽31之间距离10-5000nm，优选地，各光栅槽31之间距离100-1000nm。纳米孔腔5上开口宽度0.1-5μm，纳米孔腔5下开口形成纳米孔51，此时纳米孔的尺寸控制在10-5000nm，优选地，此时纳米孔51的尺寸控制在50-500nm。

1006、形成覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的孔保护膜32，如图3d～e所示，通过所述纳米孔腔5加入BHF，以部分刻蚀所述牺牲层2，形成孔下微腔21，孔下微腔21为椭圆形孔洞，使用原子沉积法形成所述孔保护膜32，所述孔保护膜32包括至少一层二氧化硅层；形成覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5的金属层33，具体如图3f所示，使用溅射或蒸发工艺形成所述金属层33，以缩小所述纳米孔尺寸至1-100nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51。金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率。

在其他实施例中，步骤100或步骤200中还包括，在每个纳米孔结构上制备合适的标记，便于寻找、对准等。

本发明还提供一种柔性基底纳米孔阵列的制造方法，步骤1004中，在所述孔基底层(未标示)形成由若干孔基底3组成的阵列。具体地，如图1a～1b所示，使用反应离子刻蚀将孔基底层刻蚀成若干边宽为1-1000μm正方形的孔基底3，这些正方形孔基底3形成阵列，阵列间隔为0.01-10mm，后续在阵列中的各个孔基底3上形成纳米孔结构的工艺如图2a～图10c 所示，具体实施步骤及技术细节与柔性基底纳米孔结构72的制造方法相同，本发明在此不再赘述。

综上所述，本发明提供的柔性基底纳米孔结构、阵列及其制造方法，每个纳米孔结构含有一个覆盖金膜的等离激元光谱纳米孔，纳米孔周围是布拉格光栅反射镜，实现柔性基底纳米孔结构或柔性基底纳米孔阵列的制备，单个纳米孔的尺寸比较小，具有不容易发生机械折断，减少外部环境对纳米孔器件的冲击，纳米孔不易被外力折断，满足恶劣环境下的测序工作的有益效果；金属层表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，因此无论纳米孔的尺寸如何，只利用表面的等离激元增强电场即可以实现亚纳米空间分辨率的检测。

本发明还提供一种模块化组装的纳米孔装置7，简化纳米孔设备的维修和部件更替手续，实现用户自助维修和部件更换，节约用户的时间成本，每个模块可以分别储存备用，在需要时可以实现快速组装和测量，大大提高使用的灵活性与便携性。如图13～图16b所示，纳米孔装置7包括壳体71、流体腔密封层73、柔性基底纳米孔结构72、流体腔基座74、电源 75、第一电极751和第二电极752，所述第一电极751镶嵌集成在所述柔性基底4上方，所述第二电极752镶嵌集成在位于所述流体下腔741底部，所述第一电极751和所述第二电极752 分别与所述电源75的两极相连接，用于电泳技术驱动待检测溶液(如含DNA片段的溶液) 穿越纳米孔；所述壳体71包括分离的第一壳体(上壳体，未标示)和第二壳体(下壳体，未标示)，所述第一壳体与所述第二壳体均包括用于组装的装配结构711；所述柔性基底纳米孔结构72包括柔性基底4、孔基底3和纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51；所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸；所述纳米孔结构还包括：光栅(未示出)，所述光栅围绕所述纳米孔腔5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51，所述光栅由光栅槽31构成，孔保护膜32，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5，金属层33，覆盖所述孔保护膜32，以缩小所述纳米孔51尺寸至1～100 nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率；流体腔721，由所述柔性基底4不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5、围绕所述光栅和所述纳米孔腔5上方形成。柔性基底纳米孔结构72 的其余技术细节已在上文充分阐述，发明人在此不再赘述。

所述柔性基底纳米孔结构72包括第一液体流道7610和第一流道对准标记(未标示)和第二模块对准标记(未标示)，所述第一液体流道7610连接外部与所述流体腔721，以向所述流体腔721输入或排出溶液；所述流体腔基座74包括流体下腔741、第二液体流道7620 和第二流道对准标记(未标示)和第二模块对准标记(未标示)，所述液体流道7620连接外部与所述流体下腔741，以输入或排出所述流体下腔741内溶液；所述流体腔密封层73密封所述流体腔721，包括模块对准标记(未标示)和第三模块对准标记(未标示)；所述壳体71 包括流道开口(未标示)，分别与所述第一液体流道7610和第二液体流道7620对应；所述第一流道对准标记和所述第二流道对准标记用于所述液体流道和所述流道开口密封件的对准装配，以使所述液体流道和所述流道开口密封件实现快速对准和密封，所述第一模块对准标记、所述第二模块对准标记与所述第三模块对准标记上下对准以实现所述柔性基底纳米孔结构72、所述流体腔基座74和所述流体腔密封层73上下对准装配。所述第一壳体和第二壳体均包括第四模块对准标记(未标示)，以与所述第一模块对准标记、所述第二模块对准标记和所述第三模块对准标记上下对准以实现壳体71、所述柔性基底纳米孔结构72、所述流体腔基座74和所述流体腔密封层73上下对准装配，以使得所述壳体71、所述流体腔密封层73、所述柔性基底纳米孔结构72、所述流体腔基座74进行依次自上而下对准方便装配，同时使得所述第一电极751、所述流体腔721、所述纳米孔51、所述流体下腔741和所述第二电极752 依次自上而下对准，简化纳米孔设备的维修和部件更替手续，实现用户自助维修和部件更换，节约用户的时间成本，每个模块可以分别储存备用，在需要时可以实现快速组装和测量，大大提高使用的灵活性与便携性。

其中，如图13所示，所述模块对准标记均位于模块对准线上，在柔性基底纳米孔结构 72、流体腔基座74、和流体腔密封层73标准化生产、横截面面积大小一致的情况下，可实现第一电极751、所述流体腔721、所述纳米孔51、所述流体下腔741和所述第二电极752 依次自上而下精确对准。

在本实施例中，如图16a～b所示，所述装配结构711是多级结构，其中如图16a所示，装配结构711包括位于下方壳体上的第二装配件7112，以及位于上方壳体上的第一装配件 7111，在紧压上下壳体使内部模块紧密贴合的情况下，第一装配件7111通过装配枢轴7110 旋转与第二装配件7112卡合。其中如图16b所示，装配结构711包括下方壳体上的第二装配件7112，以及位于上方壳体上的第一装配件7111，紧压上下壳体使得第一装配件7111与第二装配件7112交错卡合，使内部模块紧密贴合为止，简化纳米孔设备的维修和部件更替手续，实现用户自助维修和部件更换，节约用户的时间成本，在需要时可以实现快速组装和测量，大大提高使用的灵活性与便携性。

在本实施例中，如图14a所示，还包括第一流道开口密封件761和第二流道开口密封件762，与流道开口(未标示)、第一液体流道7610和第二液体流道7620共同组成流道系统76。所述第一流道开口密封件761和第二流道开口密封件762通过所述流道开口分别与所述第一液体流道7610和第二液体流道7620连接，所述第一流道开口密封件761和流道开口，以及第一液体流道7610的流道对准线同轴，所述第二流道开口密封件762和流道开口，以及第二液体流道7620的流道对准线同轴，以密封衔接外部和所述第一液体流道7610和第二液体流道 7620，以防止液体泄漏进壳体1与柔性基底纳米孔结构72及流体腔基座74之间的缝隙内，造成污染及检测液体流失。

为实现水平精准对准，优选地，如图13所示，壳体1还包括第三壳体(中间壳体)，流道开口位于其上，以与柔性基底纳米孔结构72中的第一液体流道7610对准，其上包括与第一壳体(上壳体)和第二壳体(下壳体)相组装的装配结构711，避免两壳体组装流道开口与第一液体流道7610不能水平精准对准的问题。

优选地，如图14b所示，所述第二流道开口密封件762是楔形管道接头、阶梯渐变管道接头、或阶梯管道接头。

在本实施例中，如图13所示，为了更为精确对准，所述第一壳体(上壳体)和第二壳体(下壳体)均包括模块对准标记(未示出)，以用于上下对准装配，实现壳体71、第一电极751、所述流体腔721、所述纳米孔51、所述流体下腔741和所述第二电极752依次自上而下精确对准。

在本实施例中，所述流体腔密封层73是石英密封片。在其他实施例中，流体腔密封层73 可以是透光性满足分子检测(如DNA等含有序列信息的长链生物分子检测)中光谱检测的透明密封层，如玻璃、透明材料等。

在本实施例中，所述第一电极751和所述第二电极752是银或氯化银电极。在其他实施例中，第一电极751和第二电极752还可以是其他金属或导电电极，如铂、金、银、氮化钛等导电材料及其衍生配对电极材料中的一种，所述第一电极和所述第二电极表面可进行化学修饰，提高电极界面电化学稳定性，所述化学修饰是在所述第一电极和所述第二电极表面形成二茂铁分子层。

在本实施例中，如图13、15a所示，所述电源75位于所述壳体71内部，集成在壳体71内部，所述第一电极751位于所述柔性基底4上方，优选地，所述第一电极751镶嵌集成在所述柔性基底4上方，即镶嵌在柔性基底4上表面内附近；所述第二电极752位于所述流体下腔741底部，优选地，所述第二电极752镶嵌集成在所述流体下腔741底部。

在实际使用过程中，一般需要频繁更换的部件为柔性基底纳米孔结构72，因而，优选地，如图13所示，所述流体腔基座74与所述电源75同时集成于第二壳体(下壳体)中，上述第二流道对准标记和第二壳体(下壳体)上的模块对准标记可实现事先对准，减少装配误差，并且电源75与第二电极752实施固定连接，即正常情况下的金属线连接，避免动态连接，可避免组装过程中第二电极752与电源75之间第二电连接结构(未标示)磨损，造成使用中接触不良甚至失效等问题。

优选地，第一电极751和连接电源75的第一电连接结构(未标示)部分粘附于柔性基底 4表面，或镶嵌集成在所述柔性基底4上方，优选地，所述第一电极751镶嵌集成在所述柔性基底4上方，即镶嵌在柔性基底4上表面内附近。在电源75集成在第二壳体(下壳体)中的情况下，实际组装本模块化组装的纳米孔装置7的过程中，电源75与第一电极751之间的第一电连接结构是动态连接，存在有效连接范围，为避免电源75与第一电连接结构接触不良，在本实施例中，可将第一电连接结构延伸出柔性基底4的部分在上下方向上设置足够长的长度，保证与电源75实现良好接触。

在本实施例中，所述流体腔基座74是柔性高分子聚合材料，包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚异戊二烯、丙烯酸脂、甲基丙烯酸甲酯、邻叠氮萘醌、线性酚醛树脂、硅酮胶、玻璃胶材料、SU-8高分子聚合物中的至少一种。在其他实施例中，所述流体腔基座74 可以是硅基材料，优选地可以是硅或二氧化硅材料。

在本实施例中，所述第一电极751和所述第二电极752是铂、金、银、氮化钛等导电材料及其衍生配对电极材料，所述第一电极和所述第二电极表面可进行化学修饰(如二茂铁分子层)，提高电极界面电化学稳定性。

本发明提供的模块化组装的纳米孔装置，可灵活组装，简化纳米孔设备的维修和部件更替手续，实现用户自助维修和部件更换，节约用户的时间成本，并且可实现多场景的测序和检测应用，每个模块可以分别储存备用，在需要时可以实现快速组装和测量，大大提高使用的灵活性与便携性；金属层表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，因此无论纳米孔的尺寸如何，只利用表面的等离激元增强电场即可以实现亚纳米空间分辨率的检测。

DNA或RNA等生物大分子链在纳米孔51中的转运速度非常快，纳米孔51中基因链的转运速度一般在0.1～1μs/bp(0.1-1μs/碱基对)，很难满足精确光谱法测序。

本发明还提供一种基于运动蛋白的基因转运速度控制装置，如图13～图18d，包括纳米孔装置7和运动蛋白8，纳米孔装置7包括壳体71、流体腔密封层73、柔性基底纳米孔结构 72、流体腔基座74、电源75、第一电极751和第二电极752，所述第一电极751和所述第二电极752分别与所述电源75的两极相连接；所述柔性基底纳米孔结构72包括柔性基底4、孔基底3和纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51；所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸；所述纳米孔结构还包括：光栅(未示出)，所述光栅围绕所述纳米孔腔5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51，所述光栅由光栅槽31构成，孔保护膜32，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5，金属层33，覆盖所述孔保护膜32，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率；流体腔721，由所述柔性基底4不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5、围绕所述光栅和所述纳米孔腔5上方形成，所述柔性基底纳米孔结构72包括第一液体流道 7610，所述第一液体流道7610连接外部与所述流体腔721，以向所述流体腔721输入或排出溶液；所述流体腔基座74包括流体下腔741、第二液体流道7620，所述第二液体流道7620 连接外部与所述流体下腔741，以输入或排出所述流体下腔741内溶液；所述流体腔密封层73 密封所述流体腔721；所述壳体71包括流道开口(未标示)，分别与所述第一液体流道761 和第二液体流道762对应；如图18c所示，所述运动蛋白8与所述金属层33形成金属-硫键，以使待检测基因链(如DNA链)通过纳米孔51的转运速度至少慢于0.1ms/每碱基对。上述已在前文中模块化组装的纳米孔装置7中阐述细节的技术特征，发明人在此不再赘述。

在本实施例中，所述运动蛋白8包括DNA聚合酶、DNA螺旋酶或RNA聚合酶，以控制DNA链或RNA链通过纳米孔51的速度。

较佳地，所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I-V、DNA聚合酶α,β,γ,δ,ε,ζ中的一种；所述DNA螺旋酶是超家族I-III、类DnaB家族、类ρ家族中的一种。优选地，所述运动蛋白8 是phi29DNA聚合酶。

在本实施里中，所述金属层33是铜、银、金、锌、汞、镉、钴、镍或铝中的一种。优选地，金属层33采用金层，金层与运动蛋白8形成金-硫键。

在本实施例中，所述流体腔基座74是柔性高分子聚合材料，优选地，流体腔基座74是聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚异戊二烯、丙烯酸脂、甲基丙烯酸甲酯、邻叠氮萘醌、线性酚醛树脂、硅酮胶、玻璃胶材料、或SU-8高分子聚合物材料中的一种。在其他实施例中，所述流体腔基座74可以是硅基材料，优选地可以是硅或二氧化硅材料。

本发明还提供一种基于运动蛋白的基因链转运速度控制装置的制造方法，为了制造该基于运动蛋白的基因链转运速度控制装置，我们提出使用点击化学方法，将运动蛋白引导并修饰在纳米孔51的内表面，控制基因链的过孔速度至少慢于0.1ms/碱基对。说明如下：

如图17a～图18c所示，包括步骤：

i)、如图17a～图17c，形成具有多聚阴离子尾的运动蛋白8。所述运动蛋8已在前文详细阐述，发明人在此不再赘述，在本实施例中，以phi29 DNA聚合酶为例，金属层33以金层为例。

如图17a所示，使用基因工程方法对phi29 DNA聚合酶蛋白质表面的特殊氨基酸残基进行定点突变，替换成半胱氨酸，较佳地，选择位于phi29 DNA聚合酶蛋白质表面的氨基酸残基G410和P562进行定点突变，替换为半胱氨酸。

如图17b所示，提供一段巯基修饰的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸长度为5-100nt，将所述巯基修饰的单链寡核苷酸与半胱氨酸连接；优选地，所述单链寡核苷酸长度为8-50nt。

如图17c所示，使用三苯氯甲烷或碘乙酸保护未与单链寡核苷酸结合的半胱氨酸；提供一段含有一段黏性末端的双链DNA，长度50-5000bp(碱基对)，黏性末端与单链寡核苷酸进行碱基互补配对，形成具有多聚阴离子尾的phi29 DNA聚合酶蛋白质。

ii)、将运动蛋白8通过金属-硫键锚定于纳米孔5中，

如图18a所示，提供纳米孔装置7，纳米孔装置7已在前文详细阐述，发明人在此不再赘述；使用电泳方法驱动多聚阴离子尾，多聚阴离子尾牵引phi29 DNA聚合酶蛋白质进入纳米孔腔5中，并将phi29 DNA聚合酶蛋白质在稳定于纳米孔腔5中靠近纳米孔51的位置或者稳定于纳米孔51中。

如图18b～18c所示，将二硫键还原处理为巯基，以切除多聚阴离子尾，暴露出半胱氨酸的巯基，半胱氨酸的巯基与金层33表面结合形成金-硫键，phi29 DNA聚合酶蛋白质通过金- 硫键锚定于纳米孔腔5中近纳米孔51的位置或者稳定于纳米孔51中，以使待检测DNA链通过纳米孔51的转运速度至少慢于0.1ms/每碱基对。

如图18d所示，将待检测DNA链通过第一液体流道761装载至流体腔721中，自发扩散或电泳驱动至纳米孔腔5内，被运动蛋白8捕获后，待检测DNA链发生棘轮运动，以单个碱基为单位在纳米孔中转运，其运动速度可以被降低到至少慢于0.1ms/每碱基对。

进一步地，本发明还提供一种基于运动蛋白的基因链转运速度控制装置的使用方法，如图18d所示，提供温度和pH值可控制的含待检测基因链溶液，通过所述第一液体流道761 装载至所述流体腔721中，自发扩散或电泳驱动至纳米孔腔5内，被运动蛋白8捕获后，待检测基因链发生棘轮运动，以单个碱基为单位在纳米孔51中转运，通过控制溶液的温度或pH 值，控制待检测基因链在纳米孔51中的转运速度降低至数十或数百ms/碱基对，即10～999 ms每碱基对，待检测基因链转运速度降低大大提高光谱信号的强度，能实现更为精确的测序。

优选地，温度范围为0℃～-200℃，pH值范围为1-13，将待检测基因链转运速度降低至数十或数百ms/碱基对，大大提高光谱信号的强度，能实现更为精确的测序。

需要说明的是，图18c所示基于运动蛋白的基因转运速度控制装置，不使用时可以放置在低温环境下储存，优选-20℃～-200℃，以保证运动蛋白8的活性。

优选地，上述基因链是DNA链，还可以是RNA链，多肽链。

本发明提供的基于运动蛋白的基因转运速度控制装置及其制造方法使用点击化学方法将运动蛋白锚定在纳米孔中，以使待检测基因链通过纳米孔51的转运速度至少慢于0.1ms/每碱基对，再调整温度与pH可以有效地控制基因链的转运速度，可将待检测基因链通过纳米孔51 的转运速度进一步降低至数十甚至数百毫秒量级，从而提高光谱检测的灵敏度；金属层表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，因此无论纳米孔的尺寸如何，只利用表面的等离激元增强电场即可以实现亚纳米空间分辨率的检测。

在以上技术的基础上，如图19～图21所示，本发明还提供一种拉曼光谱法生物分子测序系统，利用拉曼光谱可以提供分子特异性指纹信息的振动光谱，相比传统离子电流生物分子测序技术具有优异的区分度和化学灵敏度，可对生物分子进行快速测序，本测序系统介绍如下：

如图19所示，拉曼光谱法生物分子测序系统包括纳米孔装置7，激光拉曼显微镜91，光谱测量装置92和数据采集分析装置93，纳米孔装置7置于激光拉曼显微镜91的下方。

纳米孔装置7包括壳体71、流体腔密封层73、柔性基底纳米孔结构72、流体腔基座74、电源75、第一电极751和第二电极752，所述第一电极751和所述第二电极752分别与所述电源75的两极相连接；所述柔性基底纳米孔结构72包括柔性基底4、孔基底3和纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51；所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸；所述纳米孔结构还包括：光栅(未示出)，所述光栅围绕所述纳米孔腔5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51，所述光栅由光栅槽31构成，孔保护膜32，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5，金属层33，覆盖所述孔保护膜32，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率；流体腔721，由所述柔性基底4不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5、围绕所述光栅和所述纳米孔腔5上方形成，所述柔性基底纳米孔结构72包括第一液体流道7610，所述第一液体流道7610 连接外部与所述流体腔721，以向所述流体腔721输入或排出溶液；所述流体腔基座74包括流体下腔741、第二液体流道7620，所述第二液体流道7620连接外部与所述流体下腔741，以输入或排出所述流体下腔741内溶液；所述流体腔密封层73密封所述流体腔721；所述壳体71包括流道开口(未标示)，分别与所述第一液体流道761和第二液体流道762对应。纳米孔装置7包括的以上技术特征在上文已作详细介绍，发明人在此不再赘述。需要说明的是，纳米孔51应保持完全湿润，保持完全湿润的方法在上文已作详细介绍，发明人在此不再赘述。

含待测量生物分子溶液通过第一液体流道7610进入流体腔721，自发扩散或电泳驱动至纳米孔腔5内；生物分子通过纳米孔51时，激光拉曼显微镜91向所述溶液发射激光，产生生物分子特征振动峰位的拉曼光谱信号，具有优异的区分度和化学灵敏度，光谱测量装置92 测量拉曼光谱信号得出测量数据，数据采集分析装置93分析测量数据并输出结果。

其中，如图19～20a所示，所述金属层33厚度为10～500nm，以缩小所述纳米孔51尺寸至1～100nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，在生物分子通过纳米孔51时，纳米孔51作为天线光学，在激光照射下表面产生高度局域的等离激元电场，激发生物分子的特异性振动/转动/吸收/反射光谱，光栅将纳米孔51产生的光谱信号反射回去，具有减少光传播损失，增强光谱信号强度的技术效果。

优选地，所述纳米孔51尺寸为1～100nm，以形成等离激元增强效果更好的光谱纳米孔，进一步增强光谱信号强度。

在本实施例中，所述生物分子是DNA、RNA，但不限于此类生物分子。如图19所示，需要在纳米孔51中锚定运动蛋白8，以降低DNA链和RNA链在纳米孔51中的转运速度，所述运动蛋白8与所述金属层33形成金属-硫键。运动蛋白8的其余技术细节在上文已作详细介绍，发明人在此不再赘述。

如使用电泳驱动，所述第一电极751和所述第二电极752之间加0.01-10V的偏置电压，电泳驱动溶液中的DNA和RNA向纳米孔51移动，增加运动蛋白8捕获DNA链和RNA链的概率，激光拉曼显微镜91向DNA链和RNA链发射激光，碱基产生特征振动峰位的拉曼光谱信号，具有优异的区分度和化学灵敏度。

在其他实施例中，所述生物分子是多肽链，所述多肽链可以是蛋白质处理后形成的多肽链。

较佳地，激光拉曼显微镜91的发射的激光波长为200-1000nm，优选地，激光拉曼显微镜91发射的激光波长为400～800nm；光谱测量装置92的光栅为150-2400刻线/行；拉曼光谱信号采集时长1μs-1s。

较佳地，如图20b，为了缩短光谱采集时间，提高检测效率，使用超快相干拉曼光谱法大幅缩减光谱采集时间，激光拉曼显微镜91向生物分子发射泵浦激光(未示出)、斯托克斯激光(未示出)和探测激光，产生相干拉曼光谱信号，具有优异的区分度和化学灵敏度。超快相干拉曼光谱法包括受激拉曼散射光谱法，相干反斯托克斯拉曼光谱法和双光梳相干拉曼光谱法。优选地，超快相干拉曼光谱方法使用激光源包括超快激光光源与连续波激光光源。

如图21所示，是采用本拉曼光谱法生物分子测序系统得到的光谱图，可以非常清晰地读取碱基序列。

本发明还提供一种拉曼光谱法生物分子测序方法，如图19～图21所示，包括步骤：

步骤I、提供纳米孔装置7，纳米孔装置7包括壳体71、流体腔密封层73、柔性基底纳米孔结构72、流体腔基座74、电源75、第一电极751和第二电极752，所述第一电极751和所述第二电极752分别与所述电源75的两极相连接；所述柔性基底纳米孔结构72包括柔性基底4、孔基底3和纳米孔结构(未标示)，所述纳米孔结构包括纳米孔腔5、纳米孔51；所述纳米孔腔5贯穿所述孔基底3，所述纳米孔51是所述纳米孔腔5的一端开口，所述纳米孔腔5呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔51延伸；所述纳米孔结构还包括：光栅(未示出)，所述光栅围绕所述纳米孔腔5，所述光栅形成于所述孔基底3的上表面并远离所述纳米孔51，所述光栅由光栅槽31构成，孔保护膜32，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔 5，金属层33，覆盖所述孔保护膜32，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率；流体腔721，由所述柔性基底4不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔5、围绕所述光栅和所述纳米孔腔5上方形成，所述柔性基底纳米孔结构72包括第一液体流道7610，所述第一液体流道7610连接外部与所述流体腔721，以向所述流体腔721输入或排出溶液；所述流体腔基座74包括流体下腔 741、第二液体流道7620，所述第二液体流道7620连接外部与所述流体下腔741，以输入或排出所述流体下腔741内溶液；所述流体腔密封层73密封所述流体腔721；所述壳体71包括流道开口(未标示)，分别与所述第一液体流道761和第二液体流道762对应。纳米孔装置7包括的以上技术特征在上文已作详细介绍，发明人在此不再赘述。需要说明的是，纳米孔51应保持完全湿润，保持完全湿润的方法在上文已作详细介绍，发明人在此不再赘述。

向所述流体腔721输入含待测生物分子的溶液；

步骤II、所述生物分子向所述纳米孔51移动，激光拉曼显微镜91向所述纳米孔51发射激光，所述生物分子通过所述纳米孔51时，产生拉曼光谱信号，具有优异的区分度和化学灵敏度；

步骤III、光谱测量装置92测量拉曼光谱信号得出测量数据；

步骤IV、数据采集分析装置93分析系所述测量数据并输出结果；

在本实施例中，如图19～20a所示，所述金属层33厚度为10～500nm，以缩小所述纳米孔51尺寸至1～100nm，形成具有等离激元增强效果的光谱纳米孔51，金属层33表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，在生物分子通过纳米孔51 时，纳米孔51作为天线光学，在激光照射下表面产生高度局域的等离激元电场，激发生物分子的特异性振动/转动/吸收/反射光谱，光栅将纳米孔51产生的光谱信号反射回去，具有减少光传播损失，增强光谱信号强度的技术效果。

优选地，所述纳米孔51尺寸为1～100nm，以形成等离激元增强效果更好的光谱纳米孔，进一步增强光谱信号强度。

在本实施例中，步骤I中还包括向所述流体下腔741输入缓冲液，缓冲液可以是去离子水，KCl溶液，KNO3溶液，TE缓冲液，PBS缓冲液，HEPES缓冲液等中的一种。

所述生物分子是多肽链，所述多肽链可以是蛋白质处理后形成的多肽链：

步骤I中，还包括处理蛋白质形成所述多肽链的过程，将待测蛋白质溶液使用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，拆分成多肽链；使用过量的二硫苏糖醇，β-巯基乙醇或磷酸三(2- 氯乙基)酯将二硫键断裂，使用碘乙酸保护巯基防止重新形成二硫键；经过处理后的蛋白质分解成多肽链，装载到纳米孔装置7中；

步骤II中，使用微流体控制多肽链穿过纳米孔51；激光拉曼显微镜91发射激光，激发多肽链中的氨基酸残基，得到具有特征振动峰位的拉曼光谱信号，具有优异的区分度和化学灵敏度；

步骤III中，光谱测量装置92可以直接测量得到N端，C端和二硫键的位置信息；

步骤IV中，数据采集分析装置93进行数据分析，得到多肽链的氨基酸序列信息。

所述生物分子是DNA、RNA或者甲基化的DNA，但不限于此类生物分子：

如图19所示，需要在纳米孔51中锚定运动蛋白8，以降低DNA链和RNA链在纳米孔51中的转运速度，所述运动蛋白8与所述金属层33形成金属-硫键。运动蛋白8的其余技术细节在上文已作详细介绍，发明人在此不再赘述。

对于所述生物分子是DNA而言：

步骤I中，向纳米孔装置7中装载含待测DNA的溶液，电泳驱动DNA链被运动蛋白8捕获，在运动蛋白8的辅助下DNA发生逐个碱基步进的棘轮运动；

优选地，所述运动蛋白8为DNA聚合酶。

步骤II中，DNA链进入纳米孔51中，被激光拉曼显微镜91发射的激光激发，链中不同碱基成分发射出具有特征振动峰位的拉曼光谱信号，各碱基光谱信号不重叠，具有优异的区分度和化学灵敏度；

步骤III中、光谱测量装置92测量随时间变化的拉曼光谱信号；

步骤IV中、数据采集分析装置93分析拉曼光谱信号，计算DNA在纳米孔51中的转运速度，根据四种碱基的特征拉曼光谱进行种类归属转化为DNA的序列信息。

对于所述生物分子是RNA而言：

步骤I中，向纳米孔装置7中装含载待测RNA的溶液，额外添加RNA酶抑制剂防止RNA降解；电泳驱动RNA链被运动蛋白8捕获，在运动蛋白8的辅助下RNA发生逐个碱基步进的棘轮运动；

优选地，所述运动蛋白8为RNA聚合酶。

步骤II中，RNA链进入纳米孔51中，被激光拉曼显微镜91发射的激光激发，链中不同碱基成分发射出具有特征振动峰位的拉曼光谱信号，各碱基光谱信号不重叠，具有优异的区分度和化学灵敏度；

步骤III中、光谱测量装置92测量随时间变化的拉曼光谱信号；

步骤IV中、数据采集分析装置93分析拉曼光谱信号，计算RNA在纳米孔51中的转运速度，根据四种碱基的特征拉曼光谱进行种类归属转化为RNA的序列信息。

对于所述生物分子是甲基化的DNA而言：

步骤I中，向纳米孔装置7中装载含待测甲基化的DNA溶液，电泳驱动DNA链被运动蛋白8捕获，在运动蛋白的辅助下DNA发生逐个碱基步进的棘轮运动；

优选地，所述运动蛋白8为DNA聚合酶。步骤II中，DNA链进入纳米孔51中，被激光拉曼显微镜发射的激光激发，链中甲基化的碱基成分发射出具有甲基化特征振动峰位的拉曼光谱信号，各碱基光谱信号不重叠，具有优异的区分度和化学灵敏度；

步骤III中、光谱测量装置92测量随时间变化的拉曼光谱信号；

步骤IV中、数据采集分析装置93分析拉曼光谱信号，计算DNA在纳米孔51中的转运速度，根据四种碱基的特征拉曼光谱进行种类归属转化为DNA的甲基化序列信息。

上述电泳驱动通过在所述第一电极751和所述第二电极752之间加0.01-10V的偏置电压，电泳驱动溶液中的DNA和RNA向纳米孔51移动，增加运动蛋白8捕获DNA链和RNA链的概率，激光拉曼显微镜91向DNA链和RNA链发射激光，碱基产生特征振动峰位的拉曼光谱信号。

较佳地，激光拉曼显微镜91的发射的激光波长为200-1000nm；光谱测量装置92的光栅为150-2400刻线/行；拉曼光谱信号采集时长1μs-1s。

较佳地，如图20b，为了缩短光谱采集时间，提高检测效率，使用超快相干拉曼光谱法大幅缩减光谱采集时间，激光拉曼显微镜91向生物分子发射泵浦激光(未示出)、斯托克斯激光(未示出)和探测激光，产生相干拉曼光谱信号，包括受激拉曼散射光谱信号，相干反斯托克斯拉曼光谱信号和双光梳相干拉曼光谱信号。优选地，超快相干拉曼光谱方法使用激光源包括超快激光光源与连续波激光光源。

如图21所示，是采用本拉曼光谱法生物分子测序方法得到的光谱图，可以非常清晰地读取碱基序列。

本发明的拉曼光谱测量模式，还可以被替代为荧光光谱，红外光谱，吸收光谱，反射光谱测量模式；

本发明提供的拉曼光谱法生物分子测序系统及其方法，使用表面增强拉曼光谱的检测策略，具有技术效果：金属层表面局域等离激元增强电场与距离呈指数衰减，可以提供亚纳米的空间分辨率，因此无论纳米孔的尺寸如何，只利用表面的等离激元增强电场即可以实现亚纳米空间分辨率的检测；相比传统离子电流生物分子测序技术，20种氨基酸R基、不同碱基的特征电流信号有比较大的重叠区域，限制了区分的灵敏度，而拉曼光谱可以提供分子特异性指纹信息的振动光谱，各碱基光谱信号不重叠，具有优异的区分度和化学灵敏度。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (12)

1.一种拉曼光谱法生物分子测序方法，包括步骤：

I、提供纳米孔装置，包括柔性基底纳米孔结构，所述柔性基底纳米孔结构包括柔性基底、孔基底和纳米孔结构，所述纳米孔结构包括纳米孔腔、纳米孔；所述纳米孔腔贯穿所述孔基底，所述纳米孔是所述纳米孔腔的一端开口，所述纳米孔腔呈非线性缩小腔体或线性缩小腔体向所述纳米孔延伸；

所述纳米孔结构还包括：光栅，所述光栅围绕所述纳米孔腔，所述光栅形成于所述孔基底上远离所述纳米孔的面上，所述光栅由多组光栅槽构成；孔保护膜，覆盖所述光栅和所述纳米孔腔；金属层，覆盖所述孔保护膜，以缩小所述纳米孔尺寸至1～100nm；流体腔，由所述柔性基底不覆盖所述光栅和所述纳米孔腔、围绕所述光栅和所述纳米孔腔上方形成；

所述柔性基底纳米孔结构包括第一液体流道，所述第一液体流道连接外部与所述流体腔，以向所述流体腔输入或排出含待测生物分子的溶液；

向所述流体腔输入含待测生物分子的溶液；

II、所述生物分子向所述纳米孔移动，激光拉曼显微镜向所述纳米孔发射激光，所述生物分子通过所述纳米孔时，产生拉曼光谱信号；

III、光谱测量装置测量拉曼光谱信号得出测量数据；

IV、数据采集分析装置分析系所述测量数据并输出结果。

2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述纳米孔装置还包括流体腔基座，所述流体腔基座具有流体下腔，位于所述流体腔下方，步骤I中还包括向所述流体下腔输入缓冲液。

3.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述生物分子是多肽链，步骤I还包括处理蛋白质形成所述多肽链。

4.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述生物分子是DNA、RNA或者甲基化的DNA；所述纳米孔中具有运动蛋白，所述运动蛋白与所述金属层形成金属-硫键。

5.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第一电极和所述第二电极之间电压0.01-10V。

6.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述激光拉曼显微镜发射激光的波长为200-1000nm。

7.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述光谱测量装置的光栅为150-2400刻线/行。

8.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述拉曼光谱信号采集时长1μs-1s。

9.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述激光拉曼显微镜向所述生物分子发射泵浦激光、斯托克斯激光和探测激光，以产生相干所述拉曼光谱信号。

10.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于，所述拉曼光谱信号是受激拉曼散射光谱信号，相干反斯托克斯拉曼光谱信号或双光梳相干拉曼光谱信号中的一种。

11.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于使用拉曼光谱测量模式和表面增强拉曼光谱测量模式进行测序。

12.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于使用荧光光谱，红外光谱，吸收光谱，反射光谱测量模式进行测序。