CN103069267A - 生物聚合物的光学的解析装置以及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对生物聚合物的特性进行解析的设备以及方法，所述设备的机械稳定性优异，并且以高的空间分辨率和灵敏度且通过简单的装置构成对生物聚合物的特性进行解析。具体而言，在本发明中，使用生物聚合物的特性解析芯片100a，计量生物聚合物的拉曼散射光，对构成生物聚合物的单体单元的特性进行解析，所述生物聚合物的特性解析芯片100a的特征在于，其具备固体基板110、设置于固体基板110的至少一个纳米孔120、配置于固体基板110的至少一张导电性薄膜130a、130b，在固体基板110的形成纳米孔120的一部分设置导电性薄膜130a、130b，照射外部光，从而产生进入了纳米孔120的生物聚合物的拉曼散射光。

Description

生物聚合物的光学的解析装置以及方法
技术领域
本发明涉及使用开有纳米尺寸的孔的芯片状的设备对生物聚合物的特性进行解析的装置以及方法。本发明特别涉及通过在纳米孔芯片中形成近场、不需标记核酸等生物聚合物而是光学地检测从而进行特性解析的设备、装置以及方法。
背景技术
作为实现更先进的下一代DNA测序仪的方法，使用纳米孔的技术引起了关注。可认为纳米孔方式的大特点在于，能够无需标记DNA、换言之不使用酶、荧光色素等试剂而进行解析。纳米孔根据其形成法大致划分而分类为2种。一种是将形成纳米尺寸的开口(以下称为“纳米孔”)的通道蛋白埋设于双分子膜的所谓的生物纳米孔，另一种是对半导体材料实施微细加工而形成纳米孔的所谓的固态纳米孔。
另外，作为这样的使用纳米孔的DNA的解析法，目前提出了二种方法。第1技术是阻塞电流方式(current blockade mode)。即，在形成有纳米孔的薄膜的两侧设置液槽，在各个液槽中设置电解质溶液和电极，对电极间施加电压时，则离子电流穿过纳米孔而流动。离子电流的大小以一次近似方式与纳米孔的截面积成比例。DNA通过纳米孔时，则DNA阻塞纳米孔，有效截面积减少，因此离子电流减少。将该减少量称为阻塞电流。以阻塞电流的大小为基础，可识别DNA的单链与双链的差异。另外报告了在生物孔的一个形态中，可根据阻塞电流的大小而辨别DNA的碱基的种类(非专利文献1，以下亦称为“第1现有例”)。但是可认为用于生物孔的双分子膜是有机低分子以弱的力而聚集形成的微细的薄膜，在机械稳定性方面存在问题。另外由于通道蛋白质向双分子膜组入的工序依赖于自然现象，因此在通道的数量的控制、重现性方面存在问题。另一方面可认为，由于固态纳米孔使用半导体基板等作为薄膜，从结构的稳定性的观点考虑比生物孔有利。另外由于机械性地形成纳米孔，因而也具有可实现工业化生产这样的优点。另外也报告了除了利用半导体基板以外还利用石墨烯(graphene)来作为薄膜材料，对通过设置于其中的固态纳米孔的生物体分子进行分析的装置以及方法(专利文献1)。然而在固态纳米孔方面没有报告过基于阻塞电流而识别DNA的碱基的种类。
第2技术是隧道电流方式。即，提出了如下方式：将电极对面向纳米孔而对置地设置，对电极间施加电压，测定通过纳米孔的DNA与电极之间的隧道电流，根据隧道电流的大小对DNA进行解析。作为关联技术，存在有如下报告：使用扫描探针显微镜，将对糖进行了修饰的核苷溶解于有机溶剂而导入纳米间距电极间，计量隧道电流时，则隧道电流的平均值因碱基的种类而不同(非专利文献2，以下亦称为“第2现有例”)。然而试样是核苷(不具有磷酸)而不是链状的核酸，存在有需要对试样进行修饰、需要将试样溶解于有机溶剂、没有使用纳米孔等实验条件上的制约，除此以外，在隧道电流上存在有分布，在碱基的种类之间存在有重叠，因此也存在有碱基识别的能力低这样的课题。
此外，作为利用纳米孔或者类似的结构确定碱基序列的方法，报告有使用酶将链状的核酸(聚合物)从核苷酸(单体)分离，使其通过于填充有银微粒等聚集体(尺寸约100nm至200nm)的纳米通道或者微通道，根据银微粒聚集体的表面的表面增强拉曼分光法而鉴定核苷酸的方法(专利文献2)，在纳米孔中设置酶等，使其与DNA序列中的核苷酸发生作用，利用纳米孔来控制它们的结合，从而确定核苷酸的方法(专利文献3)等，但是任一种方法都需要使用酶等试剂，装置构成、工序变复杂。
另一方面，作为不标记单分子的核酸而计量的其它方法，报告了TERS(TipEnhanced Raman Scattering，针尖增强拉曼散射)法(非专利文献3，以下亦称为“第3现有例”)。在此方法中，在AFM(原子力显微镜)的探针的尖端形成银，利用AFM扫描固定于云母基板的链状核酸分子而取得核酸分子的AFM像，然后使探针接近于核酸，照射激光。于是，在探针尖端形成局部性的光的增强场(近场)，将核酸激发。对激发后的核酸所发出的拉曼散射光进行分光计量，从而取得核酸的拉曼散射光谱。所获得的信号的S/N大于近场中所含的核酸碱基的数，因此可获得能够对单个碱基进行计量的灵敏度。另外拉曼散射光谱具有相对于频率的强度图案这样的二维信息，因此具有与阻塞电流、隧道电流等一维信息相比信息量飞跃性地增多、定性上的识别能力高这样的特点。近场的大小由探针尖端的曲率确定，该第3现有例的空间分辨率为约10nm的级别。将其换算为核酸的碱基数而相当于约30碱基部分的长度，因此在由该方法获得的结果中大量的碱基的信息发生重复。为了从重复了的信息算出各个碱基的信息，例如提出了反复进行如下操作而求出序列信息的方法，所述操作为：使探针沿着核酸的链进行扫描，根据拉曼散射光谱的变化(差分)而推测进入近场的碱基和从近场出来的碱基(以下记作“差分法”)。为了实施该方法，需要预先将核酸固定于固体基板，另外在计量中需要包含高分辨率的微动载物台的AFM装置，需要以亚nm的精度将AFM的探针进行三维扫描这样的微细的操作。即，存在有装置构成、操作复杂这样的课题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2009/035647号
专利文献2：国际公开WO2005/030997号
专利文献3：国际公开WO2008/124107号
非专利文献
非专利文献1：Clarke,J.et al.,Nat.Nanotech.(2009年)第4卷第265-270页
非专利文献2：Chang,S.et al.,Nano Lett.(2010年)第10卷第1070-1075页
非专利文献3：Bailo,E.et al.,Angew.Chem.Int.Ed.(2008年)第47卷第1658-1661页
发明内容
发明要解决的问题
利用生物孔根据阻塞电流对生物聚合物进行解析的方法(第1现有例)的机械稳定性低，难以稳定地获得具有重现性的结果。另外利用纳米孔根据隧道电流对生物聚合物进行解析的方法(第2现有例)的碱基的识别能力低，难以高精度地读取核酸的碱基序列。利用TERS对生物聚合物进行解析的方法(第3现有例)的装置构成复杂，需要微细的操作。
因此，本发明的课题在于提供对生物聚合物的特性进行解析的设备以及方法，所述设备的机械稳定性优异，并且以高的空间分辨率和灵敏度且通过简单的装置构成对生物聚合物的特性进行解析。
用于解决问题的方案
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现如下事实，以至于想到本发明：在固态纳米孔方面，通过在基板上按照适当的配置而设置适当的导电性薄膜，从而可提高基于拉曼散射对进入纳米孔的生物聚合物的特性进行解析时的空间分辨率，另外可改善灵敏度。即，本发明包含以下。
[1]一种生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，具备固体基板、设置于前述固体基板的至少一个纳米孔、配置于前述固体基板的至少一张导电性薄膜，
在前述固体基板的形成纳米孔的一部分设置导电性薄膜，照射外部光，从而产生进入了前述纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光。
[2]根据[1]所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，将前述外部光照射于前述导电性薄膜，从而使前述导电性薄膜在面向前述纳米孔的开口部的端部产生近场，产生进入了前述纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光。
[3]根据[1]或[2]所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，前述导电性薄膜具有锐角的端部，该锐角的端部面向前述纳米孔的开口部而配置。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，具备至少2张前述导电性薄膜，至少2张导电性薄膜夹着前述纳米孔的开口部而相互对置地配置。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，前述导电性薄膜由金属形成。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，前述导电性薄膜由石墨形成。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，前述导电性薄膜的厚度为0.1nm～10nm。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的生物聚合物的解析芯片，其特征在于，前述固体基板具有使光实质上透射的薄膜部分，在该薄膜部分设置有纳米孔。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在前述固体基板的表面配置有前述导电性薄膜。
[10]根据[1]～[8]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在前述固体基板的前述纳米孔的中心轴方向上的中间的深度处配置有前述导电性薄膜。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，前述纳米孔的深度是构成生物聚合物的单体单元的3倍以上的尺寸。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，前述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、以及适体组成的组中。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，前述生物聚合物的特性解析是核酸的碱基序列的确定。
[14]一种生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，具备[1]～[13]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片、光源、帧频1kHz以上的一维或二维检测器，
从前述光源将外部光照射于前述解析芯片，使用前述检测器检测该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光。
[15]根据[14]所述的生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，进一步具备记录来自前述检测器的计量值的帧缓冲存储器。
[16]根据[14]或[15]所述的生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，具备具有光电子倍增机构的检测器作为前述检测器。
[17]根据[14]～[16]中任一项所述的生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，其进一步具备与前述帧频同步、使生物聚合物中的单体逐一单元地进入前述纳米孔中的试样移动机构。
[18]一种生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，其包含如下工序：
对[1]～[13]中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片照射外部光，产生进入了纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光的工序、
基于前述拉曼散射光的光谱对生物聚合物的特性进行解析的工序。
[19]根据[18]所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，前述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、以及适体组成的组中。
[20]根据[18]或[19]所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，确定核酸的碱基序列。
[21]根据[18]～[20]中任一项所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，前述生物聚合物存在于包含无法进入前述纳米孔的第2聚合物的试样溶液中。
发明的效果
本发明提供生物聚合物的特性解析芯片。本发明的特性解析芯片基于固态纳米孔方式，因此与基于双分子膜的生物纳米孔方式相比结构的稳定性高，并且可靠性高。
本发明的解析芯片中，以拉曼散射光谱为指标对生物聚合物进行解析，进行生物聚合物中所含的结构单元(单体)的种类的判定。光谱由于具有相对于频率或波长的强度图案这样的二维信息，因此与隧道电流强度等一维信息相比信息量飞跃性地增多，定性上的识别能力高。因此，本发明与基于隧道电流的纳米孔相比碱基的识别能力极其高。
另外，由本发明提供的具有多个纳米孔的特性解析芯片通过与并列地计量多个光谱的分光计量体系一起使用，可同时并行地对多个生物聚合物进行解析。因此，与以往的解析设备以及方法相比为高通量。
本发明进一步提供生物聚合物的特性解析装置以及特性解析方法。本发明的特性解析装置中，可控制进入纳米孔的生物聚合物的速度，无需预先将解析对象的生物聚合物固定于固体基板，不必需要高分辨率的微动载物台、原子力显微镜(AFM)等复杂的装置。另外，不需要进行以亚nm的精度将AFM的探针进行二维扫描这样的微细的操作。因此，与以往的利用了TERS法的解析相比装置构成、操作是简便的。
附图说明
图1所示为生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的示意图。
图2所示为纳米孔芯片的剖面的示意放大图。
图3所示为生物聚合物的特性解析装置的构成概略图。
图4所示为试样单元的构成概略的剖视图。
图5所示为具有锐角的三角形状的金属薄膜的结构的示意图(A)、该金属薄膜的附近中产生的近场的模拟结果(B)。
图6所示为2个三角形状的金属薄膜的结构的示意图(A)、这些金属薄膜的附近中产生的近场的模拟结果(B)。
图7所示为核酸碱基的典型的拉曼散射光谱。
图8所示为根据每1碱基的光谱信息确定碱基序列的顺序所对应的输出画面显示图像。
图9所示为生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的变形例的示意图。
图10所示为纳米孔芯片的变形例的剖面的示意放大图。
图11所示为实施例2的多纳米孔芯片的示意图。
图12所示为使用了多纳米孔芯片的生物聚合物的特性解析装置的构成概略图。
图13所示为实施例3的纳米孔芯片的剖面的示意放大图。
图14所示为实施例4的纳米孔芯片的示意图。
图15所示为实施例5的纳米孔芯片的示意图。
图16所示为实施例5的纳米孔芯片的剖面的示意放大图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。本申请要求2010年9月29日申请的日本专利申请第2010-218623号的优先权，包含上述专利申请的说明书和/或附图中记载的内容。
本发明涉及利用纳米孔和拉曼散射(优选为针尖增强拉曼散射：TERS)对生物聚合物的特性进行解析的设备(以下称为“生物聚合物的特性解析芯片”或“本发明的解析芯片”)、具备有该设备的生物聚合物的特性解析装置、以及使用它们对生物聚合物的特性进行解析的方法。因此，本发明的生物聚合物的特性解析芯片具备：固体基板、设置于前述固体基板的至少一个纳米孔、配置于前述固体基板的形成纳米孔的一部分的至少一张导电性薄膜。
固体基板可由电绝缘体的材料例如无机材料以及有机材料(包括高分子材料)形成。作为电绝缘体材料的例子，列举出硅、玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚丙烯。固体基板的尺寸以及厚度如果可设置纳米孔则没有特别限定，按照与后述的生物聚合物的解析时使用的解析装置的构成要素(检测器等)适合的方式调整。固体基板可以通过本技术领域的公知方法而制作，或者也可以以市售品的方式获取。例如，固体基板可通过使用光刻以及蚀刻、激光烧蚀、注射成型、铸造、分子束外延、化学蒸镀(CVD)、电子射线或会聚离子束等技术而制作。固体基板也可为了避免其它的分子向表面的吸附而进行涂布。
固体基板优选具有用于设置纳米孔的薄膜部分。即，将适于形成纳米尺寸的孔的材料及厚度的薄膜部分设置于固体基板，从而可简便且有效率地将纳米孔形成于固体基板上。这样的薄膜部分可以为与固体基板相同的材料，或者也可由其它的电绝缘体材料形成。从形成纳米孔的观点考虑，薄膜部分的材料优选为例如氧化硅(SiO2)、氮化硅(SiN)、氮氧化硅(SiON)、金属氧化物、金属硅酸盐等。另外，从后述的外部光的激发效率和聚光效率的观点考虑，薄膜部分(以及根据情况为固体基板整体)优选为实质上透明。该处“实质上透明”是指可使外部光的大概50%以上、优选80%以上透射。另外，薄膜部分可以为单层也可以为多层，在多层的情况下，后述的导电性薄膜也可夹于薄膜部分的层而配置。固体基板的薄膜部分的厚度为10nm～200nm，优选为15nm～100nm，更优选为20nm～50nm。薄膜部分可通过本技术领域中公知的技术，例如通过减压化学气相沉积(LPCVD)，从而形成于固体基板上。
在固体基板设置至少1个纳米孔。在本发明中“纳米孔”以及“孔”是纳米(nm)尺寸的孔，并且是贯通固体基板的表里的孔、优选是贯通固体基板的薄膜部分的表里的孔。即，本发明的解析芯片被区分为所谓的固态纳米孔。另外在本发明中“开口”是指孔出去到固体基板表面的部分。在生物聚合物的特性解析时，试样溶液中的生物聚合物、离子等从一侧的开口进入纳米孔，从相同或相反侧的开口露出于纳米孔外。
孔的尺寸(即开口尺寸)可根据解析对象的生物聚合物的种类而选择恰当的尺寸，例如为1nm～100nm，优选为1nm～50nm，具体为1nm以上2nm以下，3nm以上5nm以下，10nm以上50nm以下等等。ssDNA(单链DNA)的直径为约1.5nm，用于对ssDNA进行解析的孔径的恰当的范围为1.5nm～10nm左右，优选为1.5nm～2.5nm左右。dsDNA(双链DNA)的直径为约2.6nm，用于对dsDNA进行解析的孔的直径的恰当的范围为3nm～10nm左右，优选为3nm～5nm左右。以其它的生物聚合物例如蛋白质、糖链等为解析对象的情况下也可同样地选择对应于生物聚合物的外径尺寸的孔径。纳米孔的深度可通过调整固体基板或固体基板的薄膜部分的厚度而调整。纳米孔的深度为构成生物聚合物的单体单元的2倍以上的尺寸，优选为3倍以上的尺寸，更优选为5倍以上的尺寸。例如在选择核酸作为生物聚合物的情况下，纳米孔的深度优选为碱基3个以上的尺寸，例如约1nm以上。由此，可一边控制生物聚合物的形状和移动速度一边使其进入纳米孔，可实现高灵敏度以及高精度的解析。另外孔的形状基本上为圆形，但是也可为椭圆形、多边形。
可在固体基板上设置至少一个孔，在设置多个孔的情况下，优选规则性地排列。孔可通过本技术领域的公知方法，例如通过照射透射型电子显微镜(TEM)的电子束，通过使用纳米光刻技术或离子束刻蚀技术等，从而形成于固体基板。
在固体基板的形成纳米孔的一部分，配置至少1张导电性薄膜。关于导电性薄膜相接于纳米孔的部分，基于后述的原由，因而不是纳米孔的整周，仅是整周的一部分。导电性薄膜可由具有导电性或光散射特性的材料形成。作为这样的材料，列举出金属例如铂、钯、铑、钌等铂族，金、银、铜、铝、镍等；石墨例如石墨烯(可以是单层或多层中的任一个)等。
如从薄膜的定义明显可知那样，导电性薄膜形成为平面状。导电性薄膜的厚度根据采用的材料为0.1nm～10nm，优选为0.1nm～7nm。导电性薄膜的厚度越小，则越可对所产生的近场进行限定，可实现高分辨率且高灵敏度的解析。另外导电性薄膜的尺寸没有特别限定，可根据所使用的固体基板以及纳米孔的尺寸、所使用的激发光的波长等来适当选择。予以说明，如果导电性薄膜不是平面状，存在弯曲等，那么在其弯曲部诱发近场并使光能漏出，在目标外的部位产生拉曼散射光。即背景光增大，S/N降低。因此，导电性薄膜优选为平面状，换言之剖面形状优选为没有弯曲的直线状。将导电性薄膜平面状地形成，不仅在背景光的减低、S/N比的增大方面具有效果，而且从薄膜的均匀性、制作中的重现性等观点考虑也优选。
关于导电性薄膜的形状，如果是可通过照射外部光而产生并且增强近场的形状，那么可制成任意的形状。这样的产生近场的探针在本技术领域中是公知的，例如已知：具有可通过针尖增强拉曼散射(TERS)而产生以及增强近场的锐角的端部的形状、金属领结结构等。
作为导电性薄膜的优选的平面形状的一个例子，列举出具有锐角的端部的形状，特别优选将该端部面向纳米孔而设置。在此情况下，该端部的角度为10～80度，优选为20～60度、更优选为20～40度。关于这样的用于形成近场光的导电性薄膜(光散射体)的优选的形状，例如想参照日本特开2009-150899号公报。予以说明，导电性薄膜的端部的顶点部分也可以不是严密的意义上的点，也可以是带有具有一定值以下、优选为10nm以下的曲率半径的圆形的形状等。作为除了锐角的端部以外的导电性薄膜的形状，可采用相比于端部的顶点的角度而言为钝角的角。但是，在角的部分诱发近场并且使光能漏出，因此关于面向纳米孔的锐角的端部以外，尽量避免复杂的形状，优选采用没有角的圆形、直线状等。另外导电性薄膜的整体的形状只要具有锐角的端部，就可制成任意的形状，可制成三角形、四边形以及五边形等多边形、扇形、圆形和三角形的合成形等。
另一方面，也可采用金属领结(bow-tie)结构作为导电性薄膜的形状。即，将圆形、椭圆形或多边形的2张导电性薄膜按照其形状的凸部相互对置的方式配置。关于这样的金属领结结构，想参照例如美国专利第6,649,894号。金属领结结构也可视为在形成近场的区域插入了间隙(开口)的结构。通过插入间隙而导入各向异性，使检测灵敏度得到改善。关于对这样的技术的说明，想参照例如美国专利第6,768,556号以及美国专利第6,949,732号。
关于导电性薄膜，其至少一部分、特别优选产生近场的端部等结构面向纳米孔而设置。关于导电性薄膜，只要其至少一部分、特别优选其端部面向纳米孔而设置，就可配置于固体基板的表面上，或者也可配置于固体基板之间。例如，可在固体基板的表面上面向纳米孔的开口部而配置。或者，可在固体基板上的纳米孔的中心轴方向上的大致中间的位置(深度)处配置导电性薄膜。在此情况下，导电性薄膜优选为由固体基板的薄膜部分夹着的结构。由此，近场是在纳米孔的中心轴方向(深度方向)的中间附近形成，因此可一边控制生物聚合物的形状和移动速度一边在纳米孔内产生生物聚合物的拉曼散射光，可高精度以及高灵敏度地进行解析。予以说明，在将导电性薄膜配置于固体基板的情况下，优选考虑照射的外部光的偏光方向而配置。
另外，导电性薄膜相对于各纳米孔配置至少一张即可，可以是奇数也可以是偶数。例如，导电性薄膜可相对于各纳米孔而配置1张、2张、3张、4张或其以上。如后述的实施例中记载那样，存在多张导电性薄膜时，则形成强的光的部位，因此优选相对于各纳米孔配置2个以上的导电性薄膜。或者，以上述的形状为1单元，导电性薄膜也可制成具有多个单元的1种薄膜。关于具体的例子，可制成实施例5那样的连结着2个单元的薄膜结构物。
此处，叙述将多张导电性薄膜配置特别是连结而配置的情况下的注意点。将多张导电性薄膜连结而配置的情况下，作为所连结的结果的导电性薄膜的全体的形状中，需要使其至少一部分、特别优选其面向纳米孔的部分的形状具有锐角的端部。将多张导电性薄膜在纳米孔附近连结时，则存在有该锐角的端部消失的可能，但是端部对于有效率地形成近场而言是必需的，因此必须避免其消失。关联地，使用1张导电性薄膜的情况下，将其按照包围纳米孔的整周的方式配置时，则存在有产生同样的不良现象的可能。即，存在有如下可能：在激发光作用下在导电性薄膜诱发出的电荷穿过包围纳米孔的整周的导电性薄膜而绕过去，在纳米孔部分不形成双极这样的不良现象。以上是需要将本发明的生物聚合物的特性解析芯片中的至少一张导电性薄膜不配置于纳米孔的整周，仅配置于固体基板的形成纳米孔的一部分的原由。
关于导电性薄膜，优选将其端部面向纳米孔的开口部而配置。更具体而言，将导电性薄膜配置于正交于纳米孔中心轴的面内，且将薄膜的端部面向纳米孔的开口部而配置。另外在配置至少2张导电性薄膜的情况下，优选使这些导电性薄膜夹着纳米孔的开口部而相互对置而配置。在这样的情况下，将外部光照射于导电性薄膜，从而在导电性薄膜面向纳米孔的端部产生近场，产生进入纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光。
导电性薄膜可通过本技术领域的公知方法而制作，配置于固体基板。例如，由银形成导电性薄膜的情况下，可通过溅射将所希望的厚度的银薄膜形成于基板，然后通过电子束而形成所希望的形状。另外由单层的石墨烯形成导电性薄膜的情况下，可通过将由石墨制作的石墨烯放置于支撑基板，照射电子束而形成希望的形状的石墨烯。
通过对本发明的解析芯片照射外部光，从而可将进入了前述纳米孔的生物聚合物激发而产生拉曼散射光，基于该拉曼散射光的光谱对生物聚合物的特性进行解析。优选的是，通过对本发明的解析芯片的导电性薄膜照射外部光，从而在该导电性薄膜面向纳米孔的开口部的端部形成近场，利用该近场光对生物聚合物进行二维性的扫描。所形成的近场的厚度基本上与导电性薄膜的厚度同等、即，导电性薄膜正交于纳米孔的中心轴，因而所形成的近场的中心轴方向的厚度与导电性薄膜的厚度为同程度。因此，通过使用本发明的解析芯片，可以以高空间分辨率且高灵敏度对生物聚合物进行解析。
另外本发明涉及具备有上述的本发明的解析芯片的生物聚合物的特性解析装置(以下亦称为“本发明的解析装置”)。因此，本发明的解析装置具备上述解析芯片、光源、帧频1kHz以上的一维或二维检测器。本发明的解析装置中，从前述光源将外部光照射于本发明的解析芯片，使用前述检测器检测该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光。
光源可使用照射出能够产生拉曼散射光的波长的外部光(激发光)的本技术领域中公知的光源。例如，并非限定，可使用氪(Kr)离子激光器、钕(Nd)激光器、氩(Ar)离子激光器、YAG激光器、氮气激光器、蓝宝石激光器等，并且是照射出波长约400～800nm，优选为500～600nm的外部光的光源。另外，为了从光源将外部光照射并会聚于解析芯片，优选与光源组合而使用共焦透镜以及物镜。为了降低背景信号(background signal)，也可与滤波器、半透明镜(halfmirror)、共焦针孔(pinhole)等组合。这样的用于检测拉曼散射光的装置构成在本技术领域是公知的，本领域技术人员可适当选择优选的构成要素。
产生的拉曼散射光可以是基于通常的拉曼散射、共振拉曼散射、针尖增强拉曼散射(TERS)、表面增强拉曼散射(SERS)等而得到的拉曼散射光。
关于检测器，如果是帧频(运作速度)为1kHz以上、可检测拉曼散射光的检测器则可使用任意的分光检测器。另外，根据所使用的解析芯片中的纳米孔的数量及配置，可使用1个或多个一维或二维检测器。作为这样的分光检测器，列举出CCD(电荷耦合元件)图像传感器、CMOS(互补型金属氧化膜半导体)图像传感器、其它的高灵敏度元件(雪崩光电二极管(avalanche photodiode)等)的图像传感器等。关于检测器，为了防止伴随检测的高速化而发生的灵敏度降低，优选具有光电子倍增机构例如图像增强器(image intensifier)。
另外，检测器优选具备可直接记录拉曼散射光的图像信息的大容量存储器，由此可不需介由电缆、板(board)、电脑等而高速地进行解析。例如，本发明的解析装置优选进一步具备记录来自检测器的计量值的帧缓冲存储器。另外，本发明的解析装置也可与用于将来自前述检测器的计量值进行数字化、输出的输出装置(例如电脑)连接。
另外本发明的解析装置优选具备试样移动机构、即，可控制生物聚合物的移动速度的机构。试样移动机构例如与检测器的帧频同步、使生物聚合物中的单体逐一单元地进入解析芯片的纳米孔中。作为这样的机构，可使用例如通过电泳驱动生物聚合物的试样驱动装置(任意函数发生器(任意関数発生器)、电极等)。利用这样的试样移动机构，从而可按照生物聚合物中的单体依次地进入纳米孔、脱离的方式控制生物聚合物的移动，可随着时间经过而取得对应于各个单体(结构单元)的拉曼散射光谱。
另外，作为控制生物聚合物的移动速度的方法，存在有提高包含生物聚合物的试样溶液的粘性的方法。例如通过控制解析芯片周围的温度，降低试样溶液的温度，使试样溶液的粘性变高，从而可抑制生物聚合物的布朗运动(Brownian motion)。或者，向试样溶液中添加除了测定对象以外的第2聚合物，从而可提高试样溶液的粘性，同时可使生物聚合物的立体结构为直链状，因此可控制生物聚合物的形状和移动速度。此时，作为第2聚合物，优选使用大于纳米孔的内径的尺寸的聚合物，更优选使用三维地交联(crosslink)而得到的聚合物，从而使第2聚合物无法进入纳米孔，可排除由不是测定对象的第2聚合物引起的拉曼散射。
控制生物聚合物的移动速度的其它的方法为：对存在于本发明的解析芯片的上部和下部的各个试样溶液施加压力差的方法。将生物聚合物利用电泳而要通过纳米孔的力和相反方向的力施加于生物聚合物，从而可降低生物聚合物通过纳米孔的速度。
通过一边控制生物聚合物的形状和/或移动速度一边进入解析芯片的纳米孔，从而使生物聚合物的主轴与纳米孔的中心轴大致一致。通过试样移动机构驱动生物聚合物，从而使生物聚合物通过纳米孔，使构成生物聚合物的单元要素(单体)依次通过解析芯片中形成的近场。即，沿着聚合物的主轴方向而排列的单体依次暴露于近场，吸收光，产生拉曼散射光。通过利用检测器计量该拉曼散射光，从而依次获得源自单体的拉曼散射光谱。
在本发明中，使用上述的本发明的生物聚合物的特性解析芯片或特性解析装置，可进行生物聚合物的特性解析。在本发明中“生物聚合物”是指：多个单元结构的低分子(单体、monomer)连结而得到的多聚物(低聚物)、高分子(聚合物)之中，存在于生物体的生物聚合物以及由存在于生物体的生物聚合物衍生的生物聚合物。具体包括：核酸、例如单链DNA(ssDNA)以及双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)以及双链RNA(dsRNA)、包含DNA和RNA的杂交核酸等；肽核酸；蛋白质以及肽、例如由D-以及L-氨基酸形成的蛋白质以及肽；糖链、例如多糖、糖蛋白质中的糖链；适体、例如RNA适体等。予以说明，生物聚合物中包括包含自然中不存在的序列、构成要素的聚合物，例如也包括具有poly(A)、poly(T)、poly(G)、poly(C)等序列或任意的序列的人为地合成出的聚合物分子。另外，生物聚合物中也包括：由本技术领域中公知的核酸扩增技术(例如聚合酶链式反应)制备出的核酸、载体(vector)中克隆的核酸。包含这些生物聚合物的试样的制备方法在本技术领域中是周知的，本领域技术人员可根据生物聚合物的种类适当选择制备方法。
在本发明中“解析”是指生物聚合物的特性解析。在优选的实施方式中，“解析”是指对作为构成生物聚合物的单元的单体的排列顺序进行解析，例如是指对核酸的碱基序列进行解析。为了进行生物聚合物的特性解析，测定每个构成生物聚合物的单体(生物聚合物为核酸的情况下是碱基)的分光光谱，基于光谱显示出峰的频率、波长(以下亦称为“特征带”)的比较等，进行单体的定性(识别)。因此，根据本发明，依次获得构成生物聚合物的单体的拉曼散射光，将所获得的拉曼散射光谱与标准光谱比较，判定单体的定性(即种类)，通过时间序列地依次实行这些工序，从而可进行序列解析，即，确定生物聚合物中单体排列的顺序。
实施例
以下，通过实施例来更具体说明本发明。但是，以下的实施例并非对本发明进行限定。
[实施例1]纳米孔芯片和使用了该纳米孔芯片而进行的生物聚合物的特性解析
使用图1而说明本发明的生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的构成的一个例子。图1为本实施例的生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片100的示意图。如图示那样纳米孔芯片100由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130等构成。如图示那样，将与基板110的最宽广的面(以下基板面)平行的平面定义为xy面，将导电性薄膜130和纳米孔120连结的方向定义为x轴，将与xy面垂直的方向定义为z轴。纳米孔120与基板面大致垂直地形成，换言之纳米孔的中心轴与z轴平行。
图2为本实施例的纳米孔芯片100的包含纳米孔120的中心轴121的xz剖面的示意放大图。基板110在z轴上方的基板面具有薄膜部分111，进一步在其上方具有导电性薄膜130。另外基板在z轴下方具有锥体状的洼部(以下称为“窗部112”)，在该处基板的薄膜部分111露出。在该窗部112的薄膜部分111形成纳米孔120。如图示那样，导电性薄膜130的1个端部131面向着纳米孔120的开口部的上端。如图1中略记那样，该端部131的平面形状为尖锐端，该尖锐端面向着纳米孔120。
下面使用图3说明本发明的生物聚合物的特性解析装置的构成的一个例子。图3为本实施例的生物聚合物的特性解析装置200的构成概略图。解析装置200由光源210、透镜220、半透明镜230、物镜240、滤波器250、分光检测器260、终端270、xyz微动载物台600、试样驱动装置700、试样单元300、个人电脑等计量控制装置(没有图示)等构成。在试样单元300中收纳纳米孔芯片100。
图4所示为试样单元300的构成概略的xz剖视图。试样单元300由纳米孔芯片100、上部部件310、下部部件320、螺丝类(没有图示)等构成。下部部件320在其内部形成O-环330、试样用流路410、420、430、试样用腔室440、电极用腔室450，另外形成试样用连接端口460、470、电极用连接端口480。在下部部件320中介由试样用连接端口460、470而气密性连接试样送液细管(tube)(没有图示)，另外介由电极用连接端口480而气密性连接银氯化银电极(没有图示)。银氯化银电极的具有氯化银的端收纳于电极用腔室450(没有图示)，其具有银的端(以下，银端)露出于电极用连接端口480的外部。在前述试样送液细管(tube)、试样用连接端口460、试样用流路410、试样用腔室440、试样用流路420、电极用腔室450、试样用流路430、试样用连接端口470、试样送液细管(tube)中，没有间隙地(没有气泡的混入)充满试样溶液(没有图示)。因此，试样用腔室440内的试样溶液在电极用腔室450中与银氯化银电极接触，两者电化学性地导通。在上部部件310方面也与下部部件320同样。
下面使用图1至图8说明本发明的纳米孔芯片的运作的概要。首先进行试样单元300的准备。具体而言，在上部部件310与下部部件320之间夹着纳米孔芯片100并且由O-环330压接，气密地形成上部及下部的试样用腔室540以及440。从试样送液细管(tube)导入100mM KCl水溶液作为试样溶液，在试样用腔室540、440、电极用腔室450中装满试样溶液。
下面将试样单元300设置于解析装置200。具体而言，将试样单元300固定于微动载物台600。使用微动载物台600、未图示的目视用光学系统，从而将光学系统的焦点对准到试样单元300内的纳米孔芯片100的薄膜部分111。将设置于试样单元300的2个银氯化银电极连接于试样驱动装置700。试样驱动装置700内置电压源或电流源，可以以上部试样用腔室540为基准，对下部试样用腔室440施加电压。
解析装置的光学系统如以下那样运作。具体而言，使从光源210出射的激光通过透镜220而整形后，被半透明镜230反射，通过物镜240而聚光于纳米孔芯片100的薄膜部分111。激光通过薄膜部分111而照射导电性薄膜130，在其端部131(面向纳米孔120的开口部)产生强的近场光。向形成该近场光的区域(以下近场)导入化学物质(生物聚合物)时则近场光将化学物质激发，产生化学物质特有的拉曼散射光。拉曼散射光由物镜240聚光，通过半透明镜230，在滤波器250的作用下去除瑞利散射光以及反斯托克斯线，使拉曼散射光之中的斯托克斯线入射于分光检测器260，使用分光检测器260对(斯托克斯线的)拉曼散射光谱进行分光、检测。通过了薄膜部分111、导电性薄膜130的光由终端270吸收或扩散向无关系的方向。主要的光路由图3中的虚线表示。
作为测定对象的生物聚合物的一个例子，DNA的测定顺序如以下那样。即，作为试样，使用了例如将长度10kb(knt)的单链DNA按照成为1nM的浓度的方式溶解于100mM KCl水溶液而得到的试样。将其作为下部试样溶液导入试样用腔室440。使用试样驱动装置700对下部试样用腔室440施加100mV的负电压时，则穿过纳米孔120，从而试样溶液中的离子发生电泳，电流(离子电流)流动。在近场最初仅存在水和KCl，因此仅观测到水的拉曼散射光谱。DNA通过电泳从下部试样用腔室440穿过纳米孔120而电泳向上部试样用腔室540。DNA通过纳米孔120时，作为DNA的构成要素的核酸碱基进入于在导电性薄膜130的端部131形成的近场之中。于是，产生该碱基特有的拉曼散射光，通过分光检测器260取得其拉曼散射光谱。继续进行DNA的电泳时，则核酸碱基也移动，脱离到近场之外。于是，该碱基特有的拉曼散射光消失。进一步继续进行泳动时则DNA的序列上的下一个碱基同样地依次进入、脱离近场，反复进行这样的工序，随着时间经过而取得对应碱基的序列的拉曼散射光谱。随着时间经过而取得各碱基特征性的频率(以下特征带)中的散射光强度，根据其时间变化并且使用非专利文献3中记载的差分法等还原为每1碱基的光谱信息而解析，从而求出DNA的碱基序列。以上是本实施例的运作的概要。
以下，对各构成要素进行详细说明。
按照以下的顺序制作出本实施例中的纳米孔芯片100。使用硅基板作为基板110，通过LPCVD(减压化学气相沉积)在其表面形成厚度约20nm的氧化膜(该氧化膜最终成为薄膜部分111)。通过电子束(EB)刻蚀在基板底面形成窗部的图案，通过反应性离子蚀刻而去除表面层，然后通过KOH(氢氧化钾)湿法刻蚀而去除硅，从而形成了具有薄膜部分111的窗部112。作为导电性薄膜130，通过溅射在基板表面上形成了银的薄膜。银的膜厚为约5nm。在银的薄膜之上涂布抗蚀剂，通过EB刻蚀而形成图1所示的三角形样的图案，通过蚀刻去除三角形样图案以外的区域的银，去除了抗蚀剂。最后，用透射型电子显微镜(TEM)观测基板，对三角形的端部131照射TEM的电子束，从而形成了纳米孔120。纳米孔的内径为约10nm。在本实施例中使用氧化硅而形成薄膜部分111，但是也可同样地使用氮化硅等。
本实施例中的导电性薄膜130在光学上也可定义为光的散射体。在本实施例中使用了银作为导电性薄膜130的材料，但是此材料不限定于银，如果是一般而言具有导电性的材料或具有光散射特性的材料则可使用任意的材料，一般而言可优选使用金属。作为可用作导电性薄膜的其它的金属，有铂、钯、铑、钌等铂族的金属，金、铜等。
本实施例中的导电性薄膜130的形状为三角形状，作为其端部131的顶点的角度采用了30度，另外作为三角形的x方向的长度，采用了比后述的激发光的波长(531nm)充分短的100nm。用于形成近场光的导电性薄膜(散射体)的优选的形状详述于日本特开2009-150899号公报(以下亦称为“第4现有例”)，本发明中的导电性薄膜130的形状也可按照第4现有例而选择。例如如第4现有例中记载的那样，端部131的顶点的角度越为小的(锐角)角度，越容易在端部集中电荷并且近场的增强效果越高。但是在本发明中导电性薄膜的除了端部131以外的端的部分(以下其它端部)可采用由基板110屏蔽的配置，在此情况下不受到形成于其它端部的近场光的影响。因此，顶点的角度的适当值可向小于第4现有例的方向扩张。话虽如此，但是过于减小该角度时，则导电性薄膜的面积减少，入射光的能量的利用效率降低。因此顶点的角度可适宜采用10度至80度、更优选20度至60度。
如第4现有例中记载的那样，三角形的端部131的顶点部分也可以不是严密的意义上的点，也可以是带有了具有一定值以下、优选10nm以下的曲率半径的圆形的形状等。三角形的除了端部131以外的角优选相比于端部131的角度为钝角。另外导电性薄膜130的形状不限于三角形，具有顶点的角度为上述那样的锐角的端部131即可，在其它的部分的形状为没有角的圆形、具有角的情况下，如果相比于端部131的顶点的角度为钝角，那么可自由选择。即，作为导电性薄膜130的形状，可从扇形、圆形和三角形的合成形、三角形、四边形以及五边形等多边形等各种形状中选择。另外在本实施例中纵使在由基板110屏蔽的区域形成近场光，其也不对测定产生影响，因此可自由选择该屏蔽区域中的导电性薄膜的形状。
在本实施例中试样单元300、特别是上部部件310和下部部件320的中央部(将试样用腔室440、540与外部隔开的部分)采用了透明的部件。作为可采用的透明部件，有玻璃、石英、在光源波长中透明度高的丙烯酸类树脂等塑料材料。下部部件320的中央部采用透明的部件，从而可将源自光源210的激光高效地照射于纳米孔芯片100。另外上部部件310的中央部采用透明的部件，从而通过了纳米孔芯片100的透射光、散射光可没有发生反射地通过，抑制背景光。关联地，在图3中为了简单，如从光源210出射的激光被半透明镜230反射、然后在大致垂直于纳米孔芯片100的方向入射那样进行图示，但是实际上优选使激光的入射角度相对于纳米孔芯片100的法线倾斜。另外，在图3中为了简单，如在物镜240与纳米孔芯片100之间什么也没有设置那样进行图示，但是优选在物镜240与纳米孔芯片100之间的恰当的位置处设置恰当的形状的狭缝。通过采用这些构成，从而具有避免源自纳米孔的薄膜部分111的反射光入射于分光检测器260的不良现象，抑制背景光，获得高的S/N这样的效果。
在图3和图4中物镜240与试样单元300(中所含的纳米孔芯片100)稍稍离开而图示，但是在实际的装置中优选两者尽量靠近。优选物镜240与纳米孔芯片100的距离为3mm以下，优选为1mm以下地接近。由此，可提高基于激发光的激发效率、散射光的聚光效率，进行高灵敏度的测定。另外物镜240优选使用液浸型。物镜优选为高数值孔径，数值孔径≥0.8是特别良好的。
本实施例中的生物聚合物的特性解析装置以与第3现有例同样的显微镜一体型激光器拉曼分光装置为基础而构筑。其中，作为xyz微动载物台600，使用显微镜附带的载物台，没有使用AFM用的压电载物台(piezo stage)。在本实施例中使用了输出1mW、波长531nm的Kr离子激光器作为光源210。可适当选择激光器以及其波长。作为试样驱动装置700，使用任意函数发生器，根据需要将任意函数发生器与衰减器(电阻分压器)组合而使用。试样驱动装置700可输出输出电压范围为0至±10V的DC、或任意的波形。作为任意波形的典型例，列举出脉冲波，脉冲的峰的时间宽度为10纳秒单位，并且脉冲的峰的电压值也在前述的输出电压范围中，可任意输出。
以下，对本实施例的运作进行详细说明。
纳米孔芯片100的基板110主要由硅(Si)形成。基板的厚度为约700μm。基板的薄膜部分111由氧化硅(SiO2)形成，厚度也为约20nm之薄。因此，基板的窗部112中，激光通过薄膜部分111而照射导电性薄膜130。通过用激光照射导电性薄膜130，从而在其端部131产生强的近场。激光优选使用朝向端部尖端的方向、即x轴方向偏光了的激光。该近场的z方向的厚度与导电性薄膜130的厚度为同程度，即5～10nm左右。
在窗部112以外，基板110具有约700μm厚度。作为基板110材料的Si将激光吸收、反射、散射，因而激光基本上不到达在窗部112以外的区域之上形成的薄膜部分111、在其上形成的导电性薄膜130。因此，除了该窗部112以外的区域中可抑制导电性薄膜130中的近场的形成。即，通过上述的构成，具有如下特点：可将导电性薄膜130中的近场的形成主要限定于窗部112的区域、特别限定于作为目标的端部131，可抑制除了目标以外的区域中的背景光的产生。另外，优选对除了窗部112以外的区域中的基板110的表面实施抗反射处理，具体而言，优选例如制成粗糙面，或者涂布吸光性材料。通过该构成，具有如下效果：抑制激光在作为目标的窗部112以外发生反射，可抑制背景光。
以下，关于本实施例以及后述的变形例中采用的结构，叙述通过模拟对近场的形成进行解析并且比较而得到的结果。
如本实施例那样使光入射于三角形的导电体时，使用FTDT法(时间区域光传播Solver OptiFDTD,Optiwave System Inc.)计算其附近中产生的近场光分布。在该计算中，将解析区域的尺寸在X、Y、Z各个方向，制成0.3×0.2×2.6um(予以说明，X、Y、Z是仅仅图5和图6中使用的坐标系，Y是垂直于XZ平面的方向)。另外导电体的材料设为银，厚度为10nm，尖端尖角设为90度。入射波设为波长780nm的平面波，在远离导电体的面一个波长的位置产生了波源(λ=780nm)。入射波的偏光方向为X方向。关于边界条件，XY侧面为周期的边界条件，Z方向侧面为吸收边界条件。网目尺寸在计算区域全体中均匀地为2.6nm。
图5的A是解析出的结构的示意图。另外，在图5的B中，将近场强度密度(I)的计算结果与入射波的强度密度(Iin)之比的XY平面分布绘制于纵轴。如图示那样在薄膜三角形的尖端产生最强的光的部位，其最大值按照入射强度比为约1100倍。
另外，设置2个该三角形的薄膜、使顶点相互隔开3nm而对置的情况下，也进行计算，将其结果示于图6的A和B。这相当于后述的变形例。在此情况下，可获得约7100倍的增强效果。
总结以上的模拟的结果时，则示出了，通过使用如本实施例、特别是如后述的变形例那样的结构以及形状的导电性薄膜，从而形成较强地具有光电场的增强效果的近场。
DNA刚进入纳米孔120后，在观测了源自碱基的拉曼散射光的时间点，使用试样驱动装置700，从而可降低施加于下部试样用腔室440的电压的绝对值，可降低DNA的电泳速度。另外，在降低施加电压的绝对值的状态下使电压的极性反转(将下部试样用腔室440设为阳电压)，从而可以以低的速度使DNA链在反方向上泳动。在此条件下，直到观测不到源自碱基的拉曼散射光为止进行泳动，从而可将DNA链的尖端推回至近场之外。从该状态起，在降低施加电压的绝对值的状态下将电压的极性进行归原(将下部试样用腔室440设为阴电压)，从而可从DNA链的先头起慢慢泳动，反复进行拉曼散射计量。由此可以在以充分的精度计量拉曼散射光谱所必需的时间中，将作为测定对象的碱基留在近场之中。
使用试样驱动装置700，可将施加于下部试样用腔室440的电压设为一定(DC)，此外也可设为脉冲波，以短的周期反复进行DNA的泳动和停止。在此情况下，可调节脉冲波的脉冲宽度(脉冲宽度调变)。降低1周期之内的脉冲为ON的时间的比例(占空比)并且提高该OFF的时间的比例，从而可缩短1周期之内的泳动时间并且使该停止时间变长。例如使用频带(周波数帯域)100MHz的任意函数发生器，从而以10ns单位使脉冲宽度可变，因此将1周期的长度设为例如10ms的情况下，占空比可以以1/1,000,000的分辨率进行调节。即，可根据占空比以极其高的分辨率(低)调节DNA链的平均移动速度。另外通过与脉冲高度(pulse-height)的调节(脉冲高调变)组合，也可进一步精密地调节泳动速度。通过控制泳动电压、其脉冲宽度，从而在以充分的精度计量拉曼散射光谱所必需的时间中，可将作为测定对象的碱基留在近场之中。另外，通过在停止时间内取得拉曼散射光谱，从而也可避免因测定对象在计量中进入或脱离近场而导致信号变动的不良情况，也可使计量值高精度化。
另外，也可使施加于下部试样用腔室440的电压在正压与负压之间周期性地反复。此时，按照通过时间平均而得到的电压为稍稍负压的方式进行调节，从而与将电压简单地设为一定的负压的情况相比，可将DNA链稳定地拉长，且可慢慢地穿过纳米孔120而泳动到上部试样用腔室540，可灵敏度良好地计量基于DNA链中的各个碱基的拉曼散射。
作为控制DNA链的泳动速度的其它的手段，提高试样溶液的粘性是有效的。如果追加控制纳米孔芯片周围的温度的机构，降低试样溶液的温度，则试样溶液的粘性变高，同时可抑制DNA链的布朗运动，因此成为对于DNA链的拉曼散射计量而言良好的条件。另外，向试样溶液中添加除了测定对象以外的聚合物，从而可提高试样溶液的粘性，同时可将DNA链的立体结构制成直链状，因此成为对于DNA链的拉曼散射计量而言良好的条件。作为聚合物，也可使用毛细管电泳用的分离介质。优选使用大于纳米孔的内径、进一步优选三维地交联而得到的聚合物，从而不会妨碍测定，可仅仅提高粘性。特别是根据后述的实施例的图13，可将增强场即计量区域闭入于纳米孔内部，在此情况下，不是测定对象的聚合物不进入计量区域，而可仅仅使作为测定对象的生物聚合物例如DNA链进入测定区域，可排除由不是测定对象的聚合物引起的拉曼散射。
为了实现降低DNA的电泳速度的目的，也可采用可实现微小的泳动速度、且将其准确地控制的其它的方法。作为第1方法，可将能够高灵敏度地检测上下的试样用腔室(440以及540)间的电压的一对计量电极分别新地(除了既存的银氯化银电极另外)设置于上下的试样用腔室。在此情况下，以使用一对计量电极计量出的实际的电压为基础，通过反馈控制施加于银氯化银电极的电压，从而可准确地对上下的试样用腔室之间施加规定的微小电压。作为第2方法，可采用恒电位方式。在此情况下，将既存的1对银氯化银电极分别视为试样极和对电极，并且在对电极侧的试样用腔室440以及540新地设置参照极，可按照试样极与参照极之间的电压成为设定了的值的方式，控制在试样极和对电极中流动的电流。通过以上的方法，可将规定的微小电压准确地施加于上下的试样用腔室440以及540间，可实现微小的泳动速度、且将其准确地控制。作为第3方法，可采用恒电流方式(Galvano Stat mode)。在此情况下，将既存的1对的银氯化银电极分别视为试样极和对电极，可一边监控从一方流向另一方的电流一边按照成为规定值的方式反馈控制。通过此方法，从而可将规定的微小电流准确地流到上下的试样用腔室440以及540间，可实现微小的泳动速度、且将其准确地控制。作为第5方法，可采用使用掺杂有杂质的半导体制作纳米孔基板，使纳米孔基板具有导电性，控制纳米孔基板表面的电位的方法。通过使用恒电位等，可相对于液中的电位控制纳米孔基板表面的电位，例如对基板施加阳电压，从而可将具有阴电荷的试样DNA吸附于基板，抑制其运动速度。将基板的电压控制为脉冲状，也可实现试样的阶段运送。另外，相反对基板施加阴电压，也可抑制DNA的非特异性的吸附，使试样交换容易进行。
说明控制DNA链通过纳米孔120的速度的进一步其它的方法。如果使充满于下部试样用腔室440的试样溶液和充满于上部试样用腔室540的试样溶液中具有压力差，从而将DNA链想要利用电泳而通过纳米孔的力、相反方向的力施加于DNA链，那么可降低DNA链通过纳米孔的速度。例如，对充满于下部试样用腔室440的试样溶液施加大气压，另一方面通过泵机构、压电机构对充满于上部试样用腔室540的试样溶液施加大气压以上的压力时，则可产生从上部试样用腔室540朝向下部试样用腔室440的方向、即，与DNA链的电泳为反方向的压力。该压力差也可通过基于上部和下部的试样溶液的组成差例如离子浓度差等的渗透压而控制。通过该压力差，从而在与DNA链的电泳相反的方向，即，从上部试样用腔室540朝向下部试样用腔室440的方向，使试样溶液在纳米孔120中以块体运动的方式流动，也可降低DNA链的通过速度。该试样溶液流动也可通过使纳米孔120的内表面具有电荷，使纳米孔120内部产生电渗透流从而实施。试样溶液流动也可进一步产生以下那样的效果。试样溶液按照包入DNA链的方式流动，使DNA链在纳米孔120内部在其中心轴附近局部存在，同时可将DNA链在中心轴方向拉长。这可使DNA链的各碱基稳定地通过增强场的中央，可实现精度高的拉曼散射计量。
图7表示核酸碱基的典型的拉曼散射强度(光谱)的例子。4种碱基A、C、T以及G，分别在特征性的频率(以下亦称为“特征带”)中，散射光强度显示为峰。该例子中的A、T、G的特征带的峰分别由a1、t1、g1表示，频率分别为约730、1180、650cm-1。C的峰位置c1(即约1730cm-1)与T的峰位置t2(即1600cm-1)稍稍重复，但是通过考虑T所固有的特征带t1的有无而可辨别T和C。在上述以外，作为C和T的特征带，也存在有可适用C：1260cm-1、T：1360cm-1的可能性。
使用图8，说明根据作为差分法的结果而获得的每1个碱基的光谱信息而确定碱基序列的顺序。图8为对应该顺序的PC的输出画面显示图像。在画面下部，作为差分法的结果而获得的每1个碱基的光谱信息中，以横轴：时间、纵轴：信号强度(频率)的方式，表示各特征带a1、t1、g1、c1、t2。特征带c1与t2如前所述具有重复，因此表示包含两者的频率范围c1～t2。与时间一同出现的各特征带的峰，在图8的例子中根据a1、c1～t2(没有t1)、g1、a1、c1～t2(具有t1)，分别确定为A、C、G、A、T。所确定的序列显示在画面上部，并且存储于PC，作为结果，输出到外部。
在本实施例中例示出取得A、C、T、G的光谱而进行DNA的解析的情况，但是本发明的应用范围不受限于此。例如通过对U的光谱进行解析，从而可进行RNA的解析。另外通过取得甲基化C的光谱，从而可直读DNA的甲基化。进一步通过取得氨基酸的光谱，从而可进行肽、蛋白质的解析，另外通过取得糖的光谱，从而可进行糖链的解析。
本实施例的生物聚合物的特性解析芯片基于固态纳米孔，因此具有结构的稳定性高并且可靠性高这样的特点。另外本实施例以拉曼波谱为指标进行单体的种类的判定。光谱具有相对于频率的强度图案这样的二维信息，因此与隧道电流强度等一维信息相比信息量飞跃性地增多，定性上的识别能力高，因此具有碱基的识别能力高这样的特点。本实施例将近场固定于纳米孔120的开口部，使用试样驱动装置700，使DNA泳动，控制了与近场的相对位置关系。由此，无需将核酸预先固定于固体基板110，不必需要高分辨率的微动载物台、AFM。另外不必需要以亚nm的精度将AFM的探针二维地扫描这样的微细的操作。即，具有装置构成、操作变得简便这样的特点。
[实施例1的变形例]
作为实施例1的变形例，可实施如下述的构成那样的纳米孔芯片100a。图9为基于本变形例的纳米孔芯片100a的示意图。如图示那样纳米孔芯片100a由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130a、130b等构成。即，具有2个相当于实施例1中的导电性薄膜130的导电性薄膜，使它们(导电性薄膜130a、130b)中的一个旋转180度，使端部面对于纳米孔而配置这一点与实施例1不同。图10是本变形例的纳米孔芯片100a的包含纳米孔120的中心轴121的xz剖面的示意放大图。如图示那样，导电性薄膜130a、130b形成于薄膜部分111的z轴上方，它们的端部131a、131b分别面向纳米孔120的开口部的上端，相互地对置。即，导电性薄膜130a和130b隔着与纳米孔120的孔径大致同样的距离而设置。
用于本变形例的纳米孔芯片100a的解析装置、运作与实施例1同样。激光也与实施例1同样，优选使用在连结2个端部的方向、即，x轴方向偏光了的激光。不同的是，通过激光照射而生成的近场光在导电性薄膜130a、130b的端部131a、131b的间隙中产生。另外，如从由实施例1表示的模拟结果(图6)获知的那样，源自两者的导电性薄膜的近场光相互地增强叠合，近场的强度增强。另外，通过导电性薄膜130a、130b的存在，使得近场的x方向的分布受限制，局限于纳米孔120的孔径程度。作为结果，本变形例的近场的形状的对称性高，因此均匀性高。另外本变形例中，近场的强度如前述那样按照入射光量比为约7,000倍左右之高(图6)，因此为高灵敏度，近场具有在空间上均匀并且空间分辨率也高这样的特点。
作为本变形例的更进一步的应用，也可采用使用3张以上导电性薄膜的结构。例如可采用：配置4张导电性薄膜，将各自的端部面对于纳米孔而十字型地配置的结构。在此情况下，导电性薄膜以中心轴为中心按照具有90度的旋转对称的形式而配置，如果将激光在中心轴的方向入射，则具有即使不控制激光的偏光的xy方向相关的朝向，也可在面对的一对导电性薄膜中任一个的端部诱发强的近场这样的特点。
[实施例2]多纳米孔解析装置构成
使用图11说明本发明的生物聚合物特性解析用的多纳米孔芯片的构成的一个例子。图11是本实施例2的生物聚合物特性解析用的多纳米孔芯片1100的示意图。如图示那样多纳米孔芯片1100由基板1110、纳米孔1120、1121、以及导电性薄膜1130a、1130b、1131a、1131b等构成。如图示那样，本实施例的多纳米孔芯片1100是，在1个基板1110上具有多个由纳米孔以及对置的导电性薄膜等形成的上述变形例的单元结构、即，图10中例示的单元结构。
下面，使用图12说明本实施例中的生物聚合物的特性解析装置的构成的一个例子。图12是本实施例2的进行生物聚合物的特性解析的多通道解析装置2000的构成概略图。多通道解析装置2000由光源210、透镜220、半透明镜230、物镜240、滤波器250、棱镜2261、成像透镜2262、二维检测器2263、终端270、xyz微动载物台600、试样驱动装置700、试样单元300、个人电脑等计量控制装置(没有图示)等构成。试样单元300中收纳多纳米孔芯片1100。
下面说明本实施例的运作的概略。本实施例2的运作与实施例1同样，但是使用具有多个单元结构的多纳米孔芯片1100作为纳米孔芯片。因此，在多纳米孔芯片1100上的多个部位，分别独立地产生源自试样的拉曼散射光。该拉曼散射光由物镜240聚光，通过半透明镜230，在滤波器250的作用下去除瑞利散射光，然后由棱镜2261进行分光，使用成像透镜2262在二维检测器2263的检测面上成像。由棱镜2261分光出的瑞利线在图12的z’轴的方向折射。源自多纳米孔芯片1100上的x轴方向、y轴方向的各单元结构的纳米孔开口部的瑞利散射光分别在二维检测器2263的检测面上在x’轴方向、y’轴方向成像。另外在棱镜2261的作用下，拉曼散射光(斯托克斯线)在x’轴方向色散。按照拉曼散射光之中强度相对强的水的拉曼线(斯托克斯线、拉曼位移约-3000cm-1)不到达在x’轴方向相邻的邻近的纳米孔的瑞利线的方式，对波长色散进行空间性调节，从而不会使源自各单元结构的纳米孔的拉曼散射光重复在二维检测器2263的检测面上，可以二维地展开并且同时取得。另外，作为滤波器250，采用不仅可去除瑞利散射光而且进一步还添加有带通滤波器的滤波器，从而预先排除水的拉曼线等不必要的光，不会使仅仅的作为目标的拉曼线重复在二维检测器2263的检测面上，可二维地展开并且同时取得。
在本实施例中，如图11所示，在基板1100上在x方向以及y方向有规则地晶格状地排列了大量的纳米孔。另外，使作为其中的一个方向的x方向的检测面上的方向与，波长色散方向、以及二维检测器的像素排列的一个方向为一致(x’方向)。进一步，将基板1100上的大量的纳米孔的x方向的序列间隔设为dx，将y方向的序列间隔设为dy时，成为了dx≥dy。通过这些各个条件，从而可无浪费地有效地活用二维检测器2263的像素。换言之，可一边使用具有相同尺寸的像素的二维检测器，一边取得源自更多的纳米孔的拉曼散射信号，因而可提高解析的通量。
为了可将多纳米孔芯片1100相对于光学系统中心轴的设置位置在每个测定中变动，因而需要每次对每个纳米孔，根据其在检测面上的位置，进行像素坐标与波长的关系、即，波长校正。因此，在测定对象的聚合物的拉曼散射光谱的计量之前，取得了不包含测定对象的试样溶液、即，参照溶液的散射光谱。由于参照溶液的组成是预先知晓的，因此可以以其结果为基础而对每个纳米孔进行波长校正。例如在参照溶液中包含水，因此以水的拉曼散射、或者水的瑞利散射的检测像素坐标为基准，根据每单位像素的波长色散进行了波长校正。瑞利散射被滤波器阻断，无法检测的情况下，仅在此时也可卸下滤波器。通过该工序，可将由各纳米孔获得的光检测结果转换为拉曼散射光谱。此时，如果进行减去参照溶液的散射光谱的处理，则可获得测定对象实质的拉曼散射光谱，因此可实现更加高精度的解析。但是，每纳米孔的被测定体积(增强场体积)与、测定对象聚合物的横切体积为同等的情况下、即，测定对象聚合物进入被测定区域时将参照溶液中的分子的多半排除的情况下，可以宁可不进行上述的处理，或者可以部分性地进行。关于测定对象聚合物的拉曼散射光谱，也可在可取得的全部波长区域中取得，但是如果限定于碱基识别所必需的波长区域、即，限定于特定的像素区域而取得，则不仅可使检测速度高速化，并且可削减其后的数据量。
利用电泳通过纳米孔的DNA链一般为高速。例如施加电压100mV时，碱基长10kb(knt)的单链DNA的纳米孔通过时间为约1ms，每一碱基的增强场停留时间(假定增强场的空间性的变宽为无限小)不过于0.1μs。因此，在此条件下为了独立地计量源自各碱基的拉曼散射信号，需要将二维检测器2263的运作速度设为1MHz以上。利用以往的显微镜系统高灵敏度地计量荧光、磷光、散射光等的情况下，特别是同时计量二维状地分布的测定对象的情况下，检测器的运作速度(帧频)通常为30Hz以下，特别快速的速度也是不足1KHz。因此将检测器的运作速度(帧频)设为1KHz以上、优选为1MHz，这是在本发明中通过组合纳米孔和通过纳米孔的DNA链的拉曼散射光谱计量而产生的新的课题。作为实现这样的超高速检测的手段，与以往的显微镜系统中通常使用的CCD(电荷耦合元件)相比，优选为CMOS(互补型金属氧化膜半导体)。在CCD中按照检测元件1个单元、或者1列单元进行AD转换，与此相对，在CMOS中可对二维状地排列的全部检测元件同时进行AD转换，可将AD转换所需要的时间缩短数百～数千倍。不限于CMOS，如果每个检测元件是具有AD转换功能的检测器则可获得同样的效果。另外，为了削减将由检测器取得的大量的信号介由电缆、板(board)转送于控制用电脑、书写入内脏的硬盘等所需要的时间，因而在检测器中内置大容量的存储器，从而不经由上述而保管大量的信号，这也有效。另一方面，伴随着检测的高速化，各个计量的曝光时间显著降低。为了防止由此导致的灵敏度降低，对于本发明而言优选的构成是：导入增强场、使用液浸型的高数值孔径物镜、或者检测器使用雪崩光电二极管等高灵敏度元件，或具有图像增强器等增强机构，等等。即，在本发明中，优选使用具有光电子倍增机构的检测器。另外，在本实施例中优选使通过各纳米孔的DNA链的运动相互同步，进一步特别优选的是设置使全部的纳米孔中的DNA链的运动停止的时间，在该时间同时地计量拉曼散射信号。通过该构成，具有可高精度地计量全部纳米孔中的DNA链的拉曼散射信号这样的效果。
在本实施例中用于获得拉曼散射光谱的波长色散手段使用了棱镜2261，但是为了提高波长色散的分辨率，也可使用衍射光栅。由此，可实现更精度高的碱基种类的识别。
也可不使用波长色散手段而基于拉曼散射光谱的差异进行碱基识别。例如，可使用双向分色镜(dichroic mirror)而取得多个纳米孔的二分割像，根据它们的强度比而提取拉曼散射光谱的差异。如果组合多个双向分色镜，取得三分割像或四分割像，则根据它们的强度比，可更高精度地识别碱基种类。该方法与使用波长色散的方法相比，优点在于，每像素的信号强度变大因而灵敏度提高，使用相同像素尺寸的二维检测器可同时计量更多的纳米孔。
根据本实施例2则可对于多个纳米孔同时取得拉曼散射光谱，因此具有计量的多重度高，结果的可靠性高这样的特点。具有在进行多重度高的计量的情况下通量高这样的特点。
作为本实施例的变形例，也可对各个纳米孔逐一地设置独立的试样用腔室，使用各个纳米孔同时地计量不同的试样。另外，该变形例具有可并列地计量多个试样因而通量高这样的特点。
[实施例3]三明治结构的纳米孔芯片
使用图13说明本发明的进行生物聚合物特性解析的纳米孔芯片的构成的一个例子。图13是本实施例3的纳米孔芯片100b的包含纳米孔120的中心轴121的xz剖面的示意放大图。基板110在z轴上方的基板面具有薄膜部分111a，在其上具有导电性薄膜130a、130b，进一步在其上具有薄膜部分111b。其它与实施例1的变形例(图10)同样。
本实施例3的纳米孔芯片100b的制作法与实施例1(的变形例)类似，但是通过EB刻蚀形成导电性薄膜130a、130b的图案后，通过溅射形成膜厚约20nm的由SiO2形成的薄膜部分111b，其后通过TEM而形成纳米孔这一点不同。薄膜部分111b薄因此纳米孔芯片100b的外观与实施例1(的变形例)同样，即如图9那样。
本实施例3的运作与实施例1(的变形例)同样，但是以下的点不同。第1，导电性薄膜130a、130b由薄膜部分111b被覆着，因此可与试样相互作用的近场局限于纳米孔120的内部。剩余的近场被封入薄膜部分111a、薄膜部分111b的内部，因此无法与包含生物聚合物的试样相互作用。因此具有如下特点：不产生源自存在于除了作为目标的纳米孔120内部以外的空间中的试样的背景信号，S/N高。予以说明，在本实施例中将薄膜部分111b的材料设为SiO2，其通过溅射而形成，但是薄膜部分111b的材料、形成方法不限定于上述。作为薄膜部分111b的材料，可采用各种非导电性材料，它们可通过恰当的表面涂布法而形成，由此可获得同样的效果。第2，近场形成于纳米孔120的中心轴方向的恰好中央附近，因而通过纳米孔而限制着作为试样的DNA等生物聚合物的xy方向的运动，因此试样可与均匀的近场相互作用，因此具有所获得的信号的重现性高这样的特点。第3，在通过纳米孔120的过程中DNA在轴方向伸长，因而具有如下特点：可消除高级结构，可按顺序将各个碱基导入近场，试样的序列上的观测区域与测定时刻的对应关系简单化，容易解析这样。
[实施例4]通电于导电性薄膜的纳米孔芯片
使用图14而说明本发明的生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的构成的一个例子。图14是本实施例4的生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片100c的示意图。如图示那样纳米孔芯片100c由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130a、130b、布线图案132a、132b、触点133a、133b等构成。布线图案132a、132b、触点133a、133b分别与导电性薄膜130a、130b电导通。
布线图案132a、132b、触点133a、133b与前述的实施例中的导电性薄膜130a、130b同样地形成了。不同的是，使用了金作为布线图案、触点的材质，布线图案采用了1微米作为厚度，触点采用了100微米作为厚度等等。
本实施例4的生物聚合物的特性解析装置与实施例1～3同样，但是以下的点不同。即，本实施例4中，从触点133a、133b介由卡缘连接器(card edgeconnector)(没有图示)，按照成为反相位的方式连接于试样驱动装置700的第2电压输出。
本实施例4的运作与前述的各实施例同样，但是以下的点不同。即，在本实施例4中，从试样驱动装置700将脉冲状的电压施加于试样用腔室，从而使生物聚合物穿过纳米孔120而泳动了。另外，通过激光器照射而在导电性薄膜130a、130b的端部形成了近场。试样驱动装置700的脉冲为OFF之时，泳动电压被解除，并且触点133a、133b被施加反相位、即，ON脉冲，该脉冲电压通过布线图案132a、132b传输到导电性薄膜130a、130b，施加于其端部131a、131b(没有图示)。于是，作为生物聚合物的DNA的磷酸基被诱引到导电性薄膜130a、130b的阳极侧的端部，因而这个期间可暂时地强制性地停止DNA的泳动。在这个期间，取得生物聚合物的拉曼散射光谱。同样地，试样驱动装置700的脉冲为ON之时，施加泳动电压，并且触点133a、133b被施加反相位、即OFF、脉冲，解除DNA的泳动的暂时强制停止，因而再次开始DNA的泳动。这个期间得不到拉曼散射光谱。
在本实施例4中具有如下特点：不仅通过泳动电流的脉冲驱动，而且通过使基于对导电性薄膜的电压施加而进行的生物聚合物的强制停止/解除与泳动电流的脉冲同步地进行，从而可更精密地控制生物聚合物通过纳米孔的移动。
[实施例5]使用了石墨烯作为导电性薄膜的纳米孔芯片
使用图15和图16而说明本发明的生物聚合物特性解析用的纳米孔芯片的构成的一个例子。图15是本实施例5的纳米孔芯片100d的示意图。纳米孔芯片100d由基板110、纳米孔120、以及导电性薄膜130c、130d等构成。如图示那样本实施例5与实施例3类似，但是主要是以下的点不同。第1，使用了单层的石墨、即，石墨烯(graphene)作为导电性薄膜130c、130d。第2，导电性薄膜130c、130d的平面形状按照由框状的结构将周围包围的形式而相互地连结着。换言之，导电性薄膜130c、130d是具有空隙134a、134b的1张薄膜状的结构物。(空隙134a、134b也在纳米孔120的部分处相互地连结着)。第3，纳米孔120的直径采用了2nm这一点不同。予以说明，框状的结构与纳米孔120的距离成为了与等离激元(plasmon)的衰减距离同等或稍长的距离。这样地将2张导电性薄膜130c、130d的长度设为与等离激元的衰减距离同程度的距离，从而可使导电性薄膜130c、130d中产生的等离激元充分到达纳米孔附近。
图16是包含纳米孔120的中心轴121的xz剖面的示意放大图。由于放大率高，因此未图示导电性薄膜130c、130d的外框。
本实施例5的纳米孔芯片100d的制作法与实施例3类似，但是在基板110上形成薄膜部分111a后的工序不同。即，另行，使用机械剥离法从石墨制作石墨烯(graphene)，通过光学显微镜确认是单层。使用Schneider等人的NanoLetters(2010)10,1912中记载的wedging法，将该石墨烯转送于作业用的支撑基板之上。使用高焦点的TEM(加速电压300kV)，从而对支撑基板连同石墨烯照射电子束而对碳进行冲压，形成了空隙134a、134b及其连结部分。从TEM取出支撑基板，再次使用wedging法，从而将实施了上述加工的石墨烯转送于基板110的薄膜部分111a之上。其后与实施例3同样地，通过溅射形成薄膜部分111b，进一步使用TEM(对空隙134a、134b的连结部分照射电子束)形成了纳米孔120。这样地，以连结于框的形式形成2张导电性薄膜130c、130d，从而可重现性良好地且容易地形成两者间的极其狭小的间隙，空隙134a、134b的复杂形状等。
本实施例5的运作与实施例3同样，但是以下的点不同。第1，由石墨烯形成导电性薄膜130c、130d，因此其厚度为约0.3nm、极其薄。因此，在其端部131a、131b之间形成的近场的厚度也为1nm以下、极其薄，就连DNA的碱基数也为1～3碱基左右，具有空间分辨率高这样的特点。即，具有如下特点：基于前述的差分法的解析的误差少，并且可以以更高的准确度识别碱基的种类。第2，由于导电性薄膜130c、130d由石墨烯形成，因此其端部131a、131b的厚度为极其薄，在厚度方向考虑时则锐尖。关于近场，尖端是锐尖时则具有电场集中而增强效果变高这样的特点。第3，具有如下特点：由于导电性薄膜130c、130d由石墨烯(即碳原子)形成，因而与银相比对于在水溶液中的氧化等的稳定性高。予以说明，在本实施例中使用了单层的石墨烯，但是也可使用2层至15层左右的石墨烯。即使在使用这些多层的石墨烯或石墨的情况下，也可形成5nm以下的极其薄的导电性薄膜，因此不仅可获得与上述同样的效果，而且也具有强度高这样的特有的效果。第4，具有纳米孔的内径小因而可抑制试样的通过速度这样的特点。
作为本实施例5的变形例，可采用撤去导电性薄膜130c、130d的外框而分别独立，如实施例4那样拉出布线而连接于外部装置的方法。通过采用隧道电流的计量装置作为外部装置，从而可计量出穿过导电性薄膜130c、130d的端部131a、131b间的试样而流动的隧道电流。该变形例具有端部的厚度薄因而隧道电流计量中的空间分辨率高这样的特点。将该变形例与实施例1至实施例5组合，从而可同时进行拉曼测定和隧道电流测定。通过互补地使用两者的结果，从而可提高解析结果的可靠性。另外，也可通过使用一方的结果而检测出DNA的碱基的存在，取得另一方的计量时机的同步，从而提高计量的S/N，提高解析结果的可靠性。
另外，可将本发明的设置有导电性薄膜的纳米孔芯片适用于荧光计量方式、例如，使用荧光探针的纳米孔测序仪。在此情况下，通过活用利用导电性薄膜而形成的近场，从而可实现高灵敏度、且高的空间分辨率。
进一步，将构成上述的本发明的各要素、以往的技术组合2种以上，从而进一步提高解析精度，这也是有效的。
本说明书中引用了的全部的刊物、专利以及专利申请，以参考方式将其全文并入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明提供生物聚合物的特性解析芯片以及特性解析装置。本发明的解析芯片以及解析装置基于固态纳米孔方式，因此结构的稳定性高并且可靠性高，另外可以通过拉曼散射而二维地、以高空间分辨率及高灵敏度对生物聚合物的特性进行解析。因此，本发明可用于期望着对生物聚合物的特性进行解析的领域例如生物技术、生物化学、医疗等领域中。
附图标记说明
100、100a、100b、100c、100d纳米孔芯片，110基板，111、111a基板的薄膜部分，111b薄膜部分，112基板的窗部，120纳米孔，121纳米孔的中心轴，130、130a、130b、130c、130d导电性薄膜，131、131a、131b导电性薄膜的端部，132a、132b布线图案，133a、133b触点，134a、134b空隙，200解析装置，210光源，220透镜，230半透明镜，240物镜，250滤波器，260分光检测器，270终端，300试样单元，310上部部件，320下部部件，330O-环，410、420、430试样用流路，440(下部)试样用腔室，450电极用腔室，460、470试样用连接端口，480(下部)电极用连接端口，540(上部)试样用腔室，580(上部)电极用连接端口，600xyz微动载物台，700试样驱动装置，1100多纳米孔芯片，1110基板，1120、1121纳米孔，1130a、1130b、1131a、1131b导电性薄膜，2000多通道解析装置，2261棱镜，2262成像透镜，2263二维检测器。

Claims (21)

1.一种生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，具备固体基板、设置于所述固体基板的至少一个纳米孔、配置于所述固体基板的至少一张导电性薄膜，
在所述固体基板的形成纳米孔的一部分设置导电性薄膜，照射外部光，从而产生进入了所述纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光。
2.根据权利要求1所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，将所述外部光照射于所述导电性薄膜，从而使所述导电性薄膜在面对所述纳米孔的开口部的端部产生近场，产生进入了所述纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光。
3.根据权利要求1或2所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述导电性薄膜具有锐角的端部，该锐角的端部面向所述纳米孔的开口部而配置。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，具备至少2张所述导电性薄膜，至少2张导电性薄膜夹着所述纳米孔的开口部而相互对置地配置。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述导电性薄膜由金属形成。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述导电性薄膜由石墨形成。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述导电性薄膜的厚度为0.1nm～10nm。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的生物聚合物的解析芯片，其特征在于，所述固体基板具有使光实质上透射的薄膜部分，在该薄膜部分设置有纳米孔。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在所述固体基板的表面配置有所述导电性薄膜。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，在所述固体基板的所述纳米孔的中心轴方向上的中间的深度处配置有所述导电性薄膜。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述纳米孔的深度是构成生物聚合物的单体单元的3倍以上的尺寸。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，其特征在于，所述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、以及适体所组成的组中。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片，所述生物聚合物的特性解析是核酸的碱基序列的确定。
14.一种生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，具备权利要求1～13中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片、光源、帧频1kHz以上的一维或二维检测器，
从所述光源将外部光照射于所述解析芯片，使用所述检测器检测该解析芯片中的生物聚合物的拉曼散射光。
15.根据权利要求14所述的生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，进一步具备记录来自所述检测器的计量值的帧缓冲存储器。
16.根据权利要求14或15所述的生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，作为所述检测器，具备具有光电子倍增机构的检测器。
17.根据权利要求14～16中任一项所述的生物聚合物的特性解析装置，其特征在于，进一步具备与所述帧频同步、使生物聚合物中的单体逐一单元地进入所述纳米孔中的试样移动机构。
18.一种生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，包含如下工序：
对权利要求1～13中任一项所述的生物聚合物的特性解析芯片照射外部光，产生进入了纳米孔的生物聚合物的拉曼散射光的工序，
基于所述拉曼散射光的光谱对生物聚合物的特性进行解析的工序。
19.根据权利要求18所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，所述生物聚合物选自由核酸、肽核酸、蛋白质、糖链、以及适体所组成的组中。
20.根据权利要求18或19所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，确定核酸的碱基序列。
21.根据权利要求18～20中任一项所述的生物聚合物的特性解析方法，其特征在于，所述生物聚合物存在于包含无法进入所述纳米孔的第2聚合物的试样溶液中。
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