CN105112408B - 一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用 - Google Patents

一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用。所述方法包括：(1)将一基底浸泡在含0.4～3.2nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，其中，所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列；(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液中进行钝化；之后再清洗基底，获得所述表面固定有靶向引物的基底。本发明提供的靶向引物的固定方法操作简单，对靶向引物的固定密度均匀，固定密度约为3000点/视野。

Description

一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测 序试剂盒及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用。
背景技术
单分子测序技术被誉为第三代测序技术，其显著特征是可以高保真地对DNA片段直接进行识别，单分子测序技术由于能识别到单个核酸分子，其具有比第二代测序技术更高的检测灵敏度。DNA芯片的固定是单分子测序的第一步，DNA在芯片上的固定质量及密度决定着后续的单分子测序能否顺利进行。为此国内外研究人员致力于对芯片表面进行改性在表面引入各种官能团，如氨基、醛基、羧基、巯基等形成孔状的立体网架结构，使DNA与芯片表面的官能团共价结合进而稳定地固化于芯片的基底表面，提高DNA固定的密度。
世界上首个基于单分子测序技术(tSMS)的测序仪是由Helicos公司于2008年推向市场的。其原理是通过检测单个碱基荧光信号来实现边合成边测序。其中Helicos公司的单分子测序仪的固定技术中所用的引物为修饰有氨基的polyT序列或与待测DNA互补的DNA序列，然而，发明人通过实验表明，修饰有氨基的polyT的DNA很容易固定到表面修饰有环氧基团的基底表面，固定密度可以达到3000～5000/视野，但在同样的实验条件下，若将修饰有氨基的polyT引物更换为待测DNA互补的引物序列后，其固定密度只有100～200/视野。
为此，针对单分子靶向测序中与待测DNA序列互补的引物，需要进一步改进其固定技术，以推动单分子靶向测序技术(SMTS)的发展。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法、单分子靶向测序试剂盒及应用。本发明提供的靶向引物的固定方法，通过在固定的靶向引物的5’端加了一定数目的PolyT，对靶向引物的固定密度均匀，固定密度可达2500～3200点/视野。
第一方面，本发明提供了一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，包括以下步骤：
(1)将一基底浸泡在含0.4～3.2nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，
其中，所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列；
(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液中进行钝化；之后再清洗基底，获得表面固定有靶向引物的基底。
如本发明所述的，所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列。在该实施方式中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：polyT的5’端修饰的氨基与基底表面的环氧基连接。
优选地，所述靶向引物为5’端顺次连接有10～30bp的polyT以及烷基链的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。
优选地，所述烷基链为-(CH2)n-的烷基链，其中，n为自然数。
更优选地，所述靶向引物为5’端顺次连接有10bp的polyT以及烷基链为-(CH2)6-的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。
在该实施方式中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：-(CH2)6-通过氨基与基底表面的环氧基连接。
优选地，所述靶向引物为通过5’端修饰的氨基连接到表面修饰有环氧基的基底。所述基底包括但不限于玻璃基底、石英基底等。
优选地，步骤(1)中，所述固定液为0.02～0.3M的K2HPO4溶液。
优选地，步骤(1)中，所述固定液中靶向引物的浓度为0.8～3.2nM，进一步优选为0.8～1.6nM。
优选地，步骤(1)中，依次采用3x SSC与0.1％的Triton组成的混合溶液、3x的SSC及浓度为150mM、pH＝8.5的K2HPO4来清洗基底。
SSC(saline sodium citrate)是分子生物学上最为标准的印迹及分子杂交处理液，20x SSC用于杂交实验变性及清洗常用浓缩型缓冲液。其中，20x SSC的配制方法为：在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L。
优选地，步骤(2)中，所述钝化的时间为6～24小时。
进一步优选地，步骤(2)中，所述钝化是在摇晃条件下钝化10～15小时。
更优选地，步骤(2)中，所述钝化具体为：将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液中，并置于40～80rpm/min的摇床上摇晃10～15小时。
优选地，步骤(2)中，所述磷酸盐钝化液为0.2～1.0M的K2HPO4溶液。
更优选地，步骤(2)中，所述磷酸盐钝化液为pH＝9.0、浓度为1M的K2HPO4溶液。
优选地，步骤(2)中，依次用PBS溶液、150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液及双蒸水来清洗基底。
第二方面，本发明提供了一种单分子靶向测序试剂盒，包括基底、靶向引物和固定反应试剂。
所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。
可以理解的是，所述单分子靶向测序试剂盒还包括缓冲液或其他测序必要试剂。比如，本领域技术人员根据需要分别配置针对的固定反应试剂、延伸反应试剂、切除光学检测标记分子等不同过程的缓冲液。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的单分子靶向测序中靶向引物的固定方法在DNA或RNA测序中的用途。
本发明第一方面提供的靶向引物的固定方法在用于单分子测序时，单分子靶向测序方案无需在模板核酸的3'末端加上polyA，只需通过靶向引物即可捕获模板核酸，实现实时测序，可使固定密度达到2500-3200点/视野以上。
附图说明
图1为本发明实施例提供的单分子测序中靶向引物的固定方法的流程示意图；
图2为本发明实施例对靶向引物进行固定的原理图；
图3～6为本发明实施例提供的核酸芯片的固定反应结果。
具体实施方式
结合图1，本发明提供的单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，包括以下步骤：
(1)将一基底浸泡在含0.4～3.2nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，
其中，所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列；
(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液中进行钝化；之后再清洗基底，获得表面固定有靶向引物的基底。
靶向引物(与待测核酸片段的部分序列)互补尽可能覆盖所需待测序基因片段的长度，稳定高效的捕获靶向DNA片段，比如针对HBV病毒的测序，需要覆盖所有的基因突变点和耐药位点。靶向引物一般固定在光学透明的经过修饰的基底上面。基底表面需要经过化学修饰以便于靶向引物通过化学键或者物理吸附作用固定在基底表面。基底为具有低的天然荧光或基本上不发荧光的任何合适的载体。
在一个优选的实施方案中，用于本发明的基底可以是二维或三维的，并且可以包括一个平坦表面(例如，玻璃载玻片)，或者可以是其他形状。本发明的基底可以包括玻璃(例如，可控孔度玻璃(CPG))，石英，塑料(如聚苯乙烯，不限于低交联和高交联的聚苯乙烯)，聚碳酸酯，聚丙烯和聚methymethacrylate，丙烯酸共聚物，聚酰胺，硅，金属(例如，alkanethiolate-衍生金)，纤维素，尼龙，乳胶，葡聚糖，凝胶基质(例如，硅胶)，聚丙烯醛，或复合材料。
合适的三维基底包括，例如，球，微粒，珠，膜，载玻片，平板，微机械加工的芯片，管(例如，毛细管)，微孔，微流体装置，通道，过滤器，或任何其它合适用于锚定核酸的结构。基底可包括具有靶向引物区域的平面阵列或矩阵，比如包括核苷衍生的CPG和聚苯乙烯基底片；衍生的磁基底片等。
靶向引物通过行业内常规的化学键或者物理吸附作用固定在基底表面，可以直接或间接(如通过生物素)固定在基底表面。在一个具体实施方案中，我们使用的是经环氧硅烷处理的低荧光玻璃表面，其表面的环氧键可以和靶向引物末端的氨基进行化学键合。
如图2所示，本发明实施例对靶向引物进行固定的原理图。图2包括a-b，图2包括a-b，a为在环氧基玻片上固定靶向引物DNA示意图，b为在修饰有其他基团的玻片上固定靶向引物的反应流程示意图。该技术利用了环氧基团本身不稳定，张力较大，能和修饰有-NH2的DNA发生化学反应的优点，通过新的-CH2-NH-这个共价键将待固定的DNA单链固定在修饰有环氧基团的芯片表面。该固定技术仅是本发明的一种具体实施例，本发明方法的优化对所有的固定载体和DNA序列均有效。DNA序列5’端连有可以和芯片发生化学反应的基团，如氨基、醛基、羧基、巯基等；3’端用单分子荧光物质修饰，如Cy3、Cy5，目的在于统计固定的数目，便于考察靶向引物的固定效果。
在一些实施方案中，靶向引物分子的5’连接聚胸腺嘌呤核苷酸(聚dT)的寡核酸链的3端，聚dT寡核酸链的5’通过氨基与基底表面的环氧基键合。在一个优选的实施方案中，靶向引物分子的5’顺次连接有聚胸腺嘌呤核苷酸(聚dT)的寡核酸链和烷基链(比如，-(CH2)n-的烷基链，其中，n为自然数，优选为-(CH2)6-的烷基链)，其中，聚dT寡核酸链的3’端与靶向引物分子的5’相连，聚dT寡核酸链的5端与烷基链相连，烷基链通过氨基与基底表面的环氧键键合。
固定好的引物密度要求为在保证单分子级别的分散度上，尽可能的密度高一些，这样可以保证尽可能高的测序通量。在一实施方案中，基底可以采用行业内其他处理方式，以改善核酸附着效率。在其他实施方案中，可以对本发明中使用的基片进行处理，以降低背景噪音。用于对基底进行修饰的环氧化物还可以为环氧化物的衍生物。
在一些实施方案中，步骤(1)中，所述固定液为0.02～0.3M的K2HPO4溶液。
在一些实施方案中，步骤(1)中，所述固定液中靶向引物的浓度为0.8～3.2nM，进一步优选为0.8～1.6nM。
在一些实施方案中，步骤(1)中，依次采用3x SSC与0.1％的Triton组成的混合溶液、3x的SSC及浓度为150mM、pH＝8.5的K2HPO4来清洗基底。
在基底固定了靶向引物之后，还需要经过化学钝化处理以消除未封闭的环氧基团和防止测序过程中的产生的非特异性吸附带来的噪声。表面钝化处理有很多种方法，由于测序中的荧光标记的碱基分子是负电的，在我们的具体实验中，使用高浓度的磷酸盐来封闭玻璃基底表面的环氧基团，并产生负电层，以减小负电性的碱基吸附。
在本发明一些实施方案中，步骤(2)中，所述钝化的时间为6～24小时。
在本发明一些优选实施方案中，步骤(2)中，所述钝化是在摇晃条件下钝化10～15小时。
在本发明一些优选实施方案中，步骤(2)中，所述钝化具体为：将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液中，并置于40～80rpm/min的摇床上摇晃10～15小时。
在本发明一些实施方案中，步骤(2)中，所述磷酸盐钝化液为0.2～0.8M的K2HPO4溶液。
在本发明一些优选实施方案中，步骤(2)中，所述磷酸盐钝化液为pH＝9.0、浓度为1M的K2HPO4溶液。
本发明还提供了一种单分子靶向测序试剂盒，包括基底、靶向引物和固定反应试剂。
所述靶向引物为5’端具有10～30bp的polyT的引物序列，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。
可以理解的是，所述单分子靶向测序试剂盒还包括缓冲液或其他测序必要试剂。比如，本领域技术人员根据需要分别配置针对的固定反应试剂、延伸反应试剂、切除光学检测标记分子等不同过程的缓冲液。
最后，本发明还提供了一种如第一方面所述的单分子靶向测序中靶向引物的固定方法在DNA或RNA测序中的用途。
本发明提供的靶向引物的固定方法在用于单分子测序时，单分子靶向测序方案无需在模板核酸的3'末端加上polyA，只需通过靶向引物即可捕获模板核酸，实现实时测序，可使固定密度达到2500-3200点/视野以上。
具体实施例
材料及试剂说明：
非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
20x的SSC:在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/lNaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。SSC是分子生物学上最为标准的印迹及分子杂交处理液，20xSSC用于杂交实验变性及清洗常用浓缩型缓冲液。
实施例1
本实施例提供了一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，具体包括如下步骤：
(1)将待固定序列的基底用氮气枪吹净待用，所述基底表面带有环氧基，基底玻片来自于为SCHOTT公司的环氧基修饰的玻片；
用0.2M的K2HPO4的固定液将靶向引物稀释成浓度为0.8nM，将基底浸泡在上述含0.8nM靶向引物的固定液中，浸泡60min；
之后依次采用3x SSC与0.1％的Triton组成的混合溶液、3x的SSC及浓度为150mM、pH＝8.5的K2HPO4来清洗基底；
(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液，所述磷酸盐钝化液为pH＝9、浓度为1M的K2HPO4溶液，并于室温下以80rpm/min的转速在摇床上进行钝化15h；
之后再依次用PBS溶液、150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液及双蒸水来清洗基底，获得所述表面固定有靶向引物的基底；
(3)通过荧光显微镜对固定好的芯片进行照相，每个芯片拍摄连续的20个视野，然后统计每张照片的单分子荧光点数，计算每个视野下荧光点数的平均值。
具体地，为观察引物尾部polyT对固定密度的影响，本发明如下DNA进行(下划线部分为-NH2(CH2)6-)固定：
T50-Cy3(5’→3’)：
AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy3，
具体地，所述
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
为SEQUENCE NO.1所示。
T10C50-Cy3(5’→3’)：
AmMC6TTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
TTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.2所示。
C50-Cy3(5’→3’)：
AmMC6CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3
具体地，所述
CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.3所示。
在本实施例中，将T50-Cy3、C50-Cy3、T10C50-Cy3分别固定在基底上，按上述的固定步骤进行操作，重复六次并统计固定上的序列数目。结果如图3所示。由图3可知，当靶向引物由T50-Cy3换为C50-Cy3时(即将修饰有氨基的polyT引物更换为待测DNA互补的引物序列)，固定密度会由2800降为150；当在C50的5’端加入10bp的polyT时，固定密度又增加至2800，基本上与Helicos直接采用polyT作引物的固定密度相当，这说明DNA的5’端存在一段碱基T会大大提高固定的密度。(经后续实验验证，10～20bp的polyT均可将固定密度提高至2800左右，固定密度优选为2500～3200)，当固定密度高于4000时，靶向引物的固定密度过高会造成后续待杂交的DNA分子的空间位阻过大，进而会导致杂交密度过低。因此，本发明优选在待固定靶向引物的5’端连接10～20bp(优选10bp)的polyT。
具体地，为进一步观察引物尾部polyT的数量以及不同靶向引物序列对固定密度的影响，本发明如下DNA进行(下划线部分为-NH2(CH2)6-)固定：
T10C20-Cy3(5’→3’)：
AmMC6TTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
TTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.4所示。
C20-Cy3(5’→3’)：
AmMC6CAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
CAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.5所示。
T10C30-Cy3(5’→3’)：
AmMC6TTTTTTTTTTTAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
TTTTTTTTTTTAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为
SEQUENCE NO.6所示。
C30-Cy3(5’→3’)：
AmMC6AAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
AAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为
SEQUENCE NO.7所示。
T10C40-Cy3(5’→3’)：
AmMC6TTTTTTTTTTAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
TTTTTTTTTTAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.8所示。
C40-Cy3(5’→3’)：
AmMC6AGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
AGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.9所示。
T20C20-Cy3(5’→3’)：
AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCENO.10所示。
C20-Cy3(5’→3’)：
AmMC6CAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
CAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.11所示。
T20C50-Cy3(5’→3’)：
AmMC6TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.12所示。
C50-Cy3(5’→3’)：
AmMC6CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC-Cy3，
具体地，所述
CAGGATGCAGAGGAAGATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAAC为SEQUENCE NO.13所示。
采用前述DNA芯片固定方法进行固定，实验结果显示，上述DNA均获得与T10C50-Cy3类似的固定效果，以及“T10C50-Cy3和C50-Cy3”类似的固定规律：DNA由polyT-(CH2)n-DNA-Cy3换为-(CH2)n-DNA-Cy3时，固定密度会由2000-3500降为150左右；在-(CH2)n-的5’端加入10-30bp的polyT时，固定密度又增加至2000-3500，这说明DNA的5’端存在一段碱基T会大大提高固定的密度。本实施方式中的部分实验结果如图3所示。
实施例2
钝化中摇晃转速对固定照片中荧光斑点的影响及不同浓度的靶向引物对固定效果的影响
按照上述实施例1中记载的实验方法进行操作，不同的是：
步骤1)中，待固定的靶向引物为T10C50-Cy3，其浓度分别为0.4nM、0.8nM、1.6nM、3.2nM；此外，步骤2)中，在钝化时，分为两批进行平行试验，两组实验分别在0rpm/min和80rpm/min摇晃条件下钝化15h。
重复三次并统计基底上固定的序列数目，荧光显微镜的拍照结果如图4和图5所示。图4为钝化过程中转速为0rpm/min时荧光显微镜拍照结果，包括a-d，分别0.4nM、0.8nM、1.6nM、3.2nM的T10C50-Cy3的固定效果。图5为钝化过程中转速为80rpm/min时荧光显微镜拍照结果，包括a-d，分别0.4nM、0.8nM、1.6nM、3.2nM的T10C50-Cy3的固定效果。
图6为转速设置为80rpm/min，不同浓度固定DNA的固定密度。
由图4-6可知：
1.当靶向引物在固定液中的浓度相同的情况下，在Cy3的激发波长为532nm时，通过对比拍摄到的荧光照片可以看出，在钝化过程中将摇床的转速设置为40～80rpm/min(在一些实施例中，优选为80rpm/min)可以显著消除掉固定照片中的大荧光斑点，而在钝化过程中不进行摇晃时，在拍摄到的荧光照片观察到大块的光斑，这可能是环氧基基底对不带氨基的DNA的非特异性吸附，也可能是DNA分子的团聚，总之，这将会影响固定的效果；
2.在钝化过程中转速一定的条件下(如同为80rpm/min)，靶向引物的固定密度会随着待固定靶向引物浓度的提高而提高，由此可以根据我们需要的固定浓度来选择最佳的固定浓度。经后续的杂交实验验证，当固定密度高于4000以上时，即靶向引物的固定密度过高，这会造成后续待杂交的DNA分子空间位阻过大，会导致杂交密度过低，故根据杂交实验结果，我们选择较为适宜的固定浓度为0.8～1.6nM。
实施例3
一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，包括如下步骤：
(1)将待固定序列的基底用氮气枪吹净待用，所述基底表面带有环氧基；
用0.3M的K2HPO4的固定液将靶向引物稀释成浓度为0.8nM，将基底浸泡在上述含0.8nM靶向引物的固定液中，浸泡120min，所述靶向引物为T20C20-Cy3；
之后依次采用3x SSC与0.1％的Triton组成的混合溶液、3x的SSC及浓度为150mM、pH＝8.5的K2HPO4来清洗基底；
(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液，所述磷酸盐钝化液为pH＝9、浓度为0.8M的K2HPO4溶液，并于室温下以80rpm/min的转速在摇床上进行钝化24h；
之后再依次用PBS、150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液及双蒸水来清洗基底，获得所述表面固定有靶向引物的基底；
(3)通过荧光显微镜对固定好的芯片进行照相，每个芯片拍摄连续的20个视野，然后统计每张照片的单分子荧光点数，计算每个视野下荧光点数的平均值。
重复三次并统计基底上固定的序列数目，通过计算发现，T20C20-Cy3固定平均密度为2716，标准方差是128.16，T20C20-Cy3的固定结果与T10C50-Cy3的固定结果类似(见图3)。
实施例4
一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，包括如下步骤：
(1)将待固定序列的基底用氮气枪吹净待用，所述基底表面带有环氧基；
用0.02M的K2HPO4的固定液将靶向引物稀释成浓度为0.8nM，将基底浸泡在上述含0.8nM靶向引物的固定液中，浸泡60min，所述靶向引物为T20C50-Cy3；
之后依次采用3x SSC与0.1％的Triton组成的混合溶液、3x的SSC及浓度为150mM、pH＝8.5的K2HPO4来清洗基底；
(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液，所述磷酸盐钝化液为pH＝9、浓度为0.2M的K2HPO4溶液，并于室温下以80rpm/min的转速在摇床上进行钝化6h；
之后再依次用PBS溶液、150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液及双蒸水来清洗基底，获得所述表面固定有靶向引物的基底。
实施例5
一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，包括如下步骤：
(1)将待固定序列的基底用氮气枪吹净待用，所述基底表面带有环氧基；
用0.05M的K2HPO4的固定液将靶向引物稀释成浓度为0.8nM，将基底浸泡在上述含0.8nM靶向引物的固定液中，浸泡45min，所述靶向引物分别为T10C20-Cy3、T10C30-Cy3、T10C40-Cy3；
之后依次采用3x SSC与0.1％的Triton组成的混合溶液、3x的SSC及浓度为150mM、pH＝8.5的K2HPO4来清洗基底；
(2)将清洗后的基底浸入磷酸盐钝化液，所述磷酸盐钝化液为pH＝9、浓度为0.6M的K2HPO4溶液，并于室温下以80rpm/min的转速在摇床上进行钝化12h；
之后再依次用PBS溶液、150mM的HEPES缓冲液与150mM的NaCl溶液组成的混合溶液及双蒸水来清洗基底，获得所述表面固定有靶向引物的基底。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种单分子靶向测序中靶向引物的固定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将一基底浸泡在含0.8～1.6nM靶向引物的固定液中，之后清洗基底，
其中，所述靶向引物为5’端修饰有氨基的顺次连接有10-20bp的polyT，以及与模板核酸的至少部分序列互补的序列；所述固定液为0.02～0.3M的K2HPO4溶液；所述基底表面修饰有环氧基；在所述浸泡过程中，所述靶向引物通过5’端修饰的氨基连接到表面修饰有环氧基的基底；
(2)将清洗后的基底浸入钝化液为0.2～1.0M的K2HPO4溶液中进行钝化；之后再清洗基底，获得表面固定有靶向引物的基底。
2.如权利要求1所述的靶向引物的固定方法，其特征在于，所述靶向引物为5’端顺次连接有烷基链、10～20bp的polyT以及与模板核酸的至少部分序列互补的序列。
3.如权利要求1所述的靶向引物的固定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸泡的时间为45min～120min。
4.如权利要求1所述的靶向引物的固定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述钝化的时间为6～24小时。
5.如权利要求1所述的靶向引物的固定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述钝化是在摇晃条件下钝化10～15小时。
6.一种单分子靶向测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于实施权利要求1-5任一项所述的靶向引物的固定方法，所述试剂盒包括权利要求1-5任一项中所用的基底、靶向引物、固定液和钝化液。
7.如权利要求1所述的单分子靶向测序中靶向引物的固定方法在DNA或RNA测序中的应用。
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