CN108034699A - 一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法 - Google Patents

一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法 Download PDF

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Abstract

一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法，包括：使待测核苷酸与第一模板链反应，第一模板链与第一芯片上的探针连接，待测核苷酸能够与第一模板链的相应碱基配对而使探针延伸一个碱基，第一模板链和待测核苷酸带有产生不同信号的标记；检测第一芯片上的信号，获得第一检测结果；使待测核苷酸与第二模板链反应，第二模板链与第二芯片上的探针连接，第二模板链和待测核苷酸带有不同标记，待测核苷酸与第二模板链的相应碱基不能配对；检测第二芯片上的信号，获得第二检测结果；基于上述检测结果，检测待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附。本方法能够对核苷酸与基底表面或其上探针的特异性和/或非特异性吸附进行检测，用于芯片生产质控。

Description

一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法。
背景技术
在芯片上进行核酸检测，例如利用表面固定有探针的芯片捕获核酸以及进一步对捕获得的核酸进行分析检测，包括序列测定、信息分析等，芯片表面和/或其上的探针/核酸复合物对反应底物(例如测序反应中加入的核苷类似物)的非特异性吸附，会影响获得的有效数据量以及检测结果的准确性。对非特异性吸附情况的定性或定量检测，能够判定芯片的质量以及用于检测结果预测等。
例如在目前的核酸测序中，特别是利用芯片的基因测序中，在芯片上存在底物核苷酸(Terminator)的非特异性吸附，包括芯片表面对底物核苷酸的非特异性吸附和芯片表面上的探针/探针复合物对核苷酸的非特异性吸附。这些非特异性吸附会造成测序结果错误率增加、测序通量和/或测序质量下降等。
另外，核苷酸包括核苷酸类似物，不同的核苷酸类似物对芯片表面、探针/核酸复合物的非特异性吸附能力可能不同。例如，在芯片上进行核酸序列测定，底物即生化反应中加入的核苷酸类似物的分子大小、结构以及在反应体系中的电荷性质等，影响底物与芯片和/或核酸复合物的结合/吸附。
因此，检测这些非特异性吸附情况，对于核苷酸包括核苷酸类似物的结构设计、制备生产，芯片生产，利用芯片进行核酸序列检测等领域具有重要意义。
发明内容
本发明实施例旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一或者至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明提供一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法。
根据第一方面，提供一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法，该方法包括：使待测核苷酸与第一模板链反应，该第一模板链与第一芯片上的探针连接，该第一芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第一模板链带有第一标记，待测核苷酸能够与第一模板链的相应碱基配对，从而使探针的另一端延伸一个碱基，待测核苷酸带有第二标记，第一标记能够产生第一信号，第二标记能够产生第二信号；检测第一芯片上的信号，获得第一检测结果；使待测核苷酸与第二模板链反应，该第二模板链与第二芯片上的探针连接，该第二芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第二模板链带有第一标记，待测核苷酸与第二模板链的相应碱基不能配对，无法使探针的另一端延伸一个碱基；检测第二芯片上的信号，获得第二检测结果；基于第一检测结果和第二检测结果，检测待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附。
根据第二方面，提供一种检测核苷酸非特异性吸附的方法，该方法包括：使待测核苷酸与第三模板链反应，该第三模板链与第三芯片上的探针连接，该第三芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第三模板链带有第三标记，待测核苷酸与第三模板链的相应碱基不能配对，无法使探针的另一端延伸一个碱基，待测核苷酸带有第四标记，第三标记能够产生第三信号，第四标记能够产生第四信号；检测第三芯片上的信号，获得第三检测结果；使待测核苷酸与第四模板链反应，该第四模板链与第四芯片连接，第四芯片包括不带探针的基底表面，第四模板链带有第三标记，待测核苷酸能够与第四模板链的相应碱基配对；检测第四芯片上的信号，获得第四检测结果；基于第三检测结果和第四检测结果，检测待测核苷酸的非特异性吸附。
根据第三方面，提供一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法，该方法包括：使待测核苷酸与第五模板链反应，该第五模板链与第五芯片上的探针连接，该第五芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第五模板链带有第五标记，待测核苷酸能够与第五模板链的相应碱基配对，从而使探针的另一端延伸一个碱基，待测核苷酸带有第六标记，第五标记能够产生第五信号，第六标记能够产生第六信号；检测第五芯片上的信号，获得第五检测结果；使待测核苷酸与第六模板链反应，该第六模板链与第六芯片上的探针连接，该第六芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第六模板链带有第五标记，待测核苷酸与第六模板链的相应碱基不能配对，无法使探针的另一端延伸一个碱基；检测第六芯片上的信号，获得第六检测结果；使待测核苷酸与第七模板链反应，该第七模板链与第七芯片连接，该第七芯片包括不带探针的基底表面；检测第七芯片上的信号，获得第七检测结果；基于第五检测结果、第六检测结果和第七检测结果中的至少两个检测结果，检测待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附。
上述检测核酸特异性和/或非特异性吸附的方法，能够定性或定量检测基底表面和/或基底表面上的探针/模板链对核苷酸的非特异吸附情况和/或特异性吸附情况；通过检测系统检测基底表面的信号，能够定性或定量区分特异性和非特异性吸附，获得非特异性或特异性吸附的定量、分布情况等信息，能够用于核苷类似物结构设计及制备，芯片生产以及所有涉及芯片检测核酸过程的方法或应用中，例如用于核酸序列测定中的反应底物的结构设计、空载芯片(不带探针)或者捕获芯片(带探针)性能的评价、芯片生产的质控，用于芯片检测核酸的效果的预测、分析比较等。
附图说明
图1为本发明实施方式中的待测核苷酸与模板链上相应碱基的配对/不配对关系示意图；
图2为本发明实施方式中的图像处理方法的流程示意图；
图3为本发明实施方式中的图像处理方法的另一流程示意图；
图4为本发明实施方式中一个基底表面上探针固定、模板链杂交和核苷酸聚合/吸附的原理示意图；
图5为本发明实施方式中另一个基底表面上探针固定、模板链杂交和核苷酸聚合/吸附的原理示意图；
图6为本发明实施方式中又一个基底表面上模板链杂交和核苷酸吸附的原理示意图；
图7为本发明实施例中实验组拍照获得的一个视野中的Cy3荧光点(左图)和ATTO647N荧光点(右图)图像；
图8为本发明实施例中对照组1拍照获得的一个视野中的Cy3荧光点(左图)和ATTO647N荧光点(右图)图像；
图9为本发明实施例中对照组2拍照获得的一个视野中的Cy3荧光点(左图)和ATTO647N荧光点(右图)图像。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员不需创造性劳动可以认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。本领域技术人员能够根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识实现相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
为便于理解，以下结合附图通过举例的方式对本发明实施例进行详细说明。应当理解的是，如下举例中的对具体操作及操作细节的描述为示意，非对发明方案的限定。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”、“第六”、“第七”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性、相对顺序或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”、“第六”、“第七”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
所称的“核苷酸”包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸及其类似物，包括A、T、C、G和U及其类似物。示例中如无特殊说明，利用C表示胞嘧啶或者胞嘧啶类似物，利用G表示鸟嘌呤或者鸟嘌呤类似物，利用A表示腺嘌呤或者腺嘌呤类似物，利用T表示胸腺嘧啶或者胸腺嘧啶类似物，利用U表示尿嘧啶或者尿嘧啶类似物。
本发明实施方式所称的“模板链”可以是DNA和/或RNA等，在一些实施方式中也可称为“杂交链”，例如，在利用芯片检测核酸过程中的目标DNA链。
本发明实施方式所称的“探针”可以是DNA和/或RNA等，在一些实施方式中也可称为“引物”、“捕获链”或“固定链”。所称的“探针”可以在基底表面上随机分布或者规则分布，如阵列分布，例如在目前市面上的捕获芯片，探针在芯片表面上一般呈阵列分布。
所称的“基底”可以是任何可用于固定核酸序列的固体支持物，例如尼龙膜、玻璃片、塑料、硅片、磁珠等，如无特殊说明，芯片表面与基底表面可互换使用。固相探针，探针一般是通过化学键连接/固定在基底表面上，一般地，基底表面为经过化学修饰的表面，带有反应基团，可与探针连接。表面修饰、固定等可利用已知方法进行或者直接定制或者购买。
所称的“非特异性吸附”和“特异性吸附”/“特异性结合”是相对的，“非特异性吸附”一般是指非共价键的作用力导致的吸附，非共价键的作用力包括疏水作用力、范德华力、静电作用力等；在表面带有探针的芯片上、基于碱基互补原则的核酸检测过程中，一般地，核酸非特异性吸附指核酸非共价的连接在芯片表面和/或探针上。
所称的“标记”可以是任何物理、化学或生物可检测标记，相应的，本发明实施方式所称的“信号”，是所述“标记”在特定情形下产生的信号，典型但非限定性的“标记”是光学可检测标记，例如荧光染料，相应的，所述“信号”是荧光信号。在本发明一些实施例中，标记为荧光染料，例如为Cy3和/或ATTO-647N，分别能够在532nm和640nm波长的激发光作用下发出绿色荧光信号和红色荧光信号。
所称的“检测结果”可以是任何合适的定性或定量结果，例如目测结果、仪器检测结果等。在一些不需要精确定量的应用场景下，可以通过目测基底表面上的信号，例如荧光信号的分布、强度等来判断待测核苷酸的非特异性吸附情况。在一些需要精确定量的应用场景下，可以借助仪器/信号检测装置检测基底表面上的信号来判断待测核苷酸的非特异性吸附情况，例如仪器可以是带有成像系统的光学检测装置等，包括光源、物镜以及相机，相应的，所称的“检测结果”包括获得图像。
所称的“亮点”，指图像上的光点/光斑，一个光点/光斑占有至少一个像素点。所称“像素点”同“像素”。利用光学检测系统对带有荧光标记的核酸进行检测时，所称的“亮点检测”对应于对该核酸或者碱基或碱基簇的光学信号的检测。
在本发明的一个实施例中，检测核苷酸非特异性吸附的方法，包括：S100：使待测核苷酸与第一模板链反应，该第一模板链与第一芯片上的探针连接，该第一芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第一模板链带有第一标记，待测核苷酸能够与第一模板链的相应碱基配对，从而使探针的另一端延伸一个碱基，待测核苷酸带有第二标记，第一标记能够产生第一信号，第二标记能够产生第二信号；S200：检测第一芯片上的信号，获得第一检测结果；S300：使待测核苷酸与第二模板链反应，该第二模板链与第二芯片上的探针连接，该第二芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第二模板链带有第一标记，待测核苷酸与第二模板链的相应碱基不能配对，无法使探针的另一端延伸一个碱基；S400：检测第二芯片上的信号，获得第二检测结果；S500：基于第一检测结果和第二检测结果，检测待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附。
利用该方法，能够定性或定量检测基底表面和/或基底表面上的探针/模板链对核苷酸的非特异吸附情况和/或特异性吸附情况；通过检测系统检测基底表面的信号，能够定性或定量区分特异性和非特异性吸附，获得非特异性或特异性吸附的定量、分布情况等信息，能够用于核苷类似物结构设计及制备、芯片生产以及所有涉及芯片检测核酸过程的方法或应用中，例如用于空载芯片(不带探针)或者捕获芯片(带探针)性能的评价、芯片生产的质控，用于芯片捕获核酸的效果的预测、分析比较等。
上述方法中，第一信号和第二信号是检测上可区分的信号，即能够检测到第一信号和第二信号是两个不同的信号，例如不同颜色的荧光信号等。
S100和S300的进行无顺序要求，可先后进行，也可同时进行。类似地，S200和S400也是如此。在一些实施例中，S100和S300为平行试验，同时进行。
在一平行试验示例中，S100和S300中的第一芯片和第二芯片的基底的材质、表面特性如亲疏水、表面大小等是基本相同或一致的。在一个例子中，第一芯片和第二芯片的基底表面是经过相同表面处理的、相同材料性能的基底。在另一个例子中，第一芯片和第二芯片的基底表面是经过相同表面处理的同一基底的不同表面区域。例如，S100和S300中的第一芯片和第二芯片的基底表面在各方面如表面大小、探针种类和核苷酸序列、探针固定密度、探针分布、待测核苷酸的量、反应条件等基本一致。所称的“基本一致”、“基本相同”同“一致”或“相同”，指不同批次制备、处理和/或平行试验产生的差异在允许的偏差范围内。
第一模板链与第二模板链的差别在于，待测核苷酸能够与第一模板链的相应碱基配对，而与第二模板链的相应碱基不能配对，如图1所示。图1示出了本发明实施方式中一个示例性的待测核苷酸与模板链上相应碱基的配对/不配对关系，在该示例中，待测核苷酸C与第一模板链上的相应碱基G配对，而与第二模板链上的相应碱基A、C、T或U不配对，因此，使待测核苷酸C与第一模板链反应，能够使探针的远离基底表面的一端延伸一个碱基C形成CG配对关系；使待测核苷酸C与第二模板链反应，无法使探针的远离基底表面的一端延伸一个碱基。在待测核苷酸是其它核苷酸的情况下，原理类似。所称的“配对”指碱基的互补结合，如A和T配对、C和G配对等，属于特异性结合。
对探针在基底表面上的分布或排布方式不作限制，在本发明实施例中，第一芯片和第二芯片上的探针随机分布和/或规则分布(例如呈阵列分布)在基底表面上。在平行实验中，探针在不同的芯片表面上或者在同一芯片的不同表面区域的分布状态相同。
第一标记和第二标记可以为不同的荧光染料。在本发明的实施例中，检测第一芯片上的信号，获得第一检测结果包括：通过成像系统对第一芯片表面进行拍照，获得第一图像；以及检测第一图像，以获得第一检测结果。检测第二芯片上的信号，获得第二检测结果包括：通过成像系统对第二芯片表面进行拍照，获得第二图像；以及检测第二图像，以获得第二检测结果。成像系统可以是带有成像系统的光学检测装置等，包括光源、物镜以及相机。
在本发明的实施例中，检测第一图像，以获得第一检测结果进一步包括：检测第一图像，以确定第一芯片表面上同时存在第一信号和第二信号的位置的数量Na1以及只存在第二信号的位置的数量Na3。检测第二图像，以获得第二检测结果进一步包括：检测第二图像，以确定第二芯片表面上同时存在第一信号和第二信号的位置的数量Nb1以及只存在第二信号的位置的数量Nb3。
进一步，进行以下(a)，(b)和(c)中的至少之一，来实现基于第一检测结果和第二检测结果，检测待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附：(a)利用公式(Nb1+Nb3)/(Na1+Na3)确定待测核苷酸非特异性吸附在所述基底表面和第一模板链的比例；(b)利用公式Nb1/(Na1+Na3)确定待测核苷酸非特异性吸附在第一模板链或者第二模板链的比例；(c)利用公式(Na1+Na3-Nb1-Nb3)/(Na1+Na3)确定待测核苷酸与第一模板链的有效正配比例，即核苷酸特异性结合到第一模板链的比例。
以下结合附图说明示例图像的检测方法。本发明实施例中，图像包含多个像素点。以下示例描述中，以第一图像的检测为例进行描述，应当理解以下图像检测方法同样也适用于第二图像的处理，并且在同一核苷酸特异性/非特异性吸附的检测示例的平行试验中，如同一核苷酸特异性/非特异性吸附的检测方案的试验组和对照组的图像，均可采用相同的处理方式，以获得可信的、可对比的检测结果。
如图2所示，在本发明的一个的实施例中，图像检测方法，包括：可选的图像预处理步骤S11，图像预处理步骤S11包括预处理第一图像以获得预处理后的第一图像；亮点检测步骤S12，亮点检测步骤S12包括步骤：S21，分析第一图像以计算亮点判定阈值，S22，分析第一图像以获取候选亮点，S23，根据亮点判定阈值判断候选亮点是否为亮点。
上述图像检测方法，通过图像预处理步骤对第一图像进行处理，可减少亮点检测步骤的计算量，同时，通过亮点判断阈值判断候选亮点是否为亮点，可提高判断图像亮点的准确性。需要说明的是，图像预处理步骤S11是为了获得更好的检测效果所采用的步骤，在其它实施方式中，可以直接对图像进行亮点检测步骤。
具体地，在一个例子中，输入的待检测的第一图像可为512*512或2048*2048的16位tiff格式的图像，tiff格式的图像可为灰度图像。如此，可简化图像检测方法的处理过程。
在某些实施方式中，图像预处理步骤S11包括：对第一图像进行减背景处理，以获得预处理的第一图像。如此，能够进一步减少第一图像的噪声，使图像检测方法的准确性更高。
在某些实施方式中，图像预处理步骤S11包括：对进行减背景处理后的第一图像进行简化处理，以获得预处理的第一图像。如此，可减少后续图像检测方法的计算量。
在某些实施方式中，图像预处理步骤S11包括：对第一图像进行滤波处理，以获得预处理后的第一图像。如此，对第一图像进行滤波可在尽量保留图像细节特征的条件下获取预处理的第一图像，进而可提高图像检测方法的准确性。
在某些实施方式中，图像预处理步骤S11包括：对第一图像进行减背景处理后再进行滤波处理，以获得预处理后的第一图像。如此，对第一图像进行减背景后再进行滤波，能够进一步减少第一图像的噪声，使图像检测方法的准确性更高。
在某些实施方式中，图像预处理步骤S11包括：对进行减背景处理后再进行滤波处理后的第一图像进行简化处理，以获得预处理的第一图像。如此，可减少后续图像检测方法的计算量。
在某些实施方式中，图像预处理步骤S11包括：对第一图像进行简化处理以获得预处理的第一图像。如此，可减少后续图像检测方法的计算量。
在某些实施方式中，请参图3，根据亮点判定阈值判断候选亮点是否为亮点的步骤，包括：步骤S31，在预处理后的第一图像中查找大于(p*p-1)连通的像素点并将查找到的像素点作为候选亮点的中心，p*p与亮点是一一对应的，p*p中的每个值对应一个像素点，p为自然数且为大于1的奇数；步骤S32，判断候选亮点的中心是否满足条件：Imax*ABI*ceofguass>T，其中，Imax为p*p窗口的中心最强强度，ABI为p*p窗口中预处理后的第一图像中为设定值所占的比率，ceofguass为p*p窗口的像素和二维高斯分布的相关系数，T为亮点判定阈值。若满足上述条件，S33，判断候选亮点的中心对应的亮点为待处理图像所包含的亮点；若不满足上述条件，S34，弃去候选亮点的中心对应的亮点。如此，实现了亮点的检测。
具体地，Imax可理解为候选亮点的中心最强强度。在一个例子中，p＝3，查找大于8连通的像素点。将查找到的像素点作为候选亮点的像素点。Imax为3*3窗口的中心最强强度，ABI为3*3窗口中预处理后的第一图像中为设定值所占的比率，ceofguass为3*3窗口的像素和二维高斯分布的相关系数。
预处理后的第一图像为简化处理后的图像，例如预处理后的第一图像可为二值化图像，也就是说，二值化图像中的设定值可为像素点满足设定条件时所对应的值。在另一个例子中，二值化图像可包含表征像素点不同属性的0和1二个数值，设定值为1，ABI为p*p窗口中二值化图像中为1所占的比率。
在本发明的另一个实施例中，对于拍照得的图像的检测，图像均包含多个像素点，以第一图像为例，检测第一图像包括：利用k*k矩阵对第一图像进行亮点检测，包括判定该矩阵的中心像素值不小于该矩阵非中心任一像素值的矩阵对应一个亮点，k为大于1的奇数，k*k矩阵包含k*k个像素点。该方法基于标记所产生的信号的亮度/强度与背景亮度/强度的差异，能够简单快速的检测图像，检测到以及获得信号的信息。
在某些实施例中，所述矩阵中心的像素值大于第一预设值，所述矩阵非中心任一像素值大于第二像素值。
第一预设值和第二预设值可以根据经验或者一定量的正常图像的正常亮点的像素/强度数据来设定，所称的“正常图像”、“正常亮点”可以是肉眼看起来正常，如图像看起来清晰、背景较干净，亮点大小及强度较均匀等。在一个实施例中，第一预设值和第二预设值与该图像的平均像素值相关。例如，设定第一预设值为该图像的平均像素值的1.4倍，第二预设值为该图像的平均像素值的1.1倍，能够排除干扰、获得较佳的亮点检测结果。
具体地，在一个示例中，第一图像是彩色图像，彩色图像的一个像素点具有三个像素值，可以将该彩色图像转化为灰度图像，再进行图像检测，以降低图像检测过程的计算量和复杂度。可选择但不限于利用浮点算法、整数方法、移位方法或平均值法等将非灰度图像转换成灰度图像。当然，也可以直接检测彩色图像，上述涉及的像素值的大小比较可看成是三维值或者具有三个元素的数组的大小比较，可根据经验及需要自定义多个多维值的相对大小，例如当三维值a中的任两维数值比三维值b的对应维度的数值大，可认为三维值a大于三维值b。
在另一个示例中，第一图像是灰度图像，灰度图像的像素值为一维数值，灰度图像的像素值同灰度值。
在一个例子中，如图4所示，在一基底表面上，该基底表面也称为芯片表面，为经过表面修饰后带有环氧基团的表面：加入探针(DNA捕获链，Capture DNA)，探针为经过氨基化修饰的探针、末端带有氨基基团，探针通过-NH3与芯片表面的环氧基团反应，固定在基底表面，然后使用钝化液钝化芯片，以封闭未反应的环氧基团。再加入杂交模板链，该模板链为末端带有Cy3荧光染料标记并与探针碱基互补配对的特定序列的DNA链。
杂交完成后，加入与杂交模板链的第一个待测碱基互补配对且带有ATTO-647N荧光染料标记的待测核苷酸，然后通过荧光显微镜例如全内反射荧光显微镜(TIRF)对表面进行拍照，可得到带有信号点/斑的图像。比较可能的结果，(1)如果同一个位置观察到两种荧光信号，倾向说明该位置的核苷酸与模板链发生正配反应或者少量的链上吸附，数量为Na1；(2)如果只观察到绿色荧光信号，倾向说明该位置为模板链的非特异性吸附，数量为Na2；(3)如果只观察到红色荧光信号，倾向说明该位置为核苷酸的非特异性吸附或者模板链的Cy3荧光染料发生猝灭但是反应正常，数量为Na3。
如图5所示，在一基底表面上，该基底表面也称为芯片表面，为经过表面修饰后带有环氧基团的表面：利用相同的反应体系及时间，将同一种、同样浓度的探针，通过-NH3与芯片表面的环氧基团反应，将探针通过化学键连接到芯片表面，然后使用钝化液钝化芯片，以封闭未反应的环氧基团。再加入杂交模板链，该模板链为末端带有Cy3荧光染料标记且杂交部分与探针序列互补配对，但第一个待测碱基与将要加入的待测核苷酸不配对的DNA链。
杂交完成后，加入与待测核苷酸(其与图4的示例中的待测核苷酸相同)，带有ATTO-647N荧光染料标记，然后通过全内反射荧光显微镜(TIRF)对表面进行成像拍照，可得到带有荧光信号点/斑的图像。比较可能的结果，(1)如果同一个位置观察到两种荧光信号，倾向说明该位置的核苷酸与模板链发生非特异性吸附，数量为Nb1；(2)如果只观察到绿色荧光信号，倾向说明该位置为模板链的非特异性吸附，数量为Nb2；(3)如果只观察到红色荧光信号，倾向说明该位置为核苷酸的表面非特异性吸附，数量为Nb3。
基于上述信息，可进一步量化区分特异性吸附和非特异性吸附，评估芯片表面和/或探针对待测核苷酸的非特异性吸附等，例如利用公式(Nb1+Nb3)/(Na1+Na3)确定待测核苷酸非特异性吸附在基底表面和核酸链的比例；利用公式Nb1/(Na1+Na3)确定待测核苷酸非特异性吸附在核酸链的比例；利用公式(Na1+Na3-Nb1-Nb3)/(Na1+Na3)确定待测核苷酸与模板链的有效正配比例。
在本发明的另一个实施例中，检测核苷酸非特异性吸附的方法包括：S1000：使待测核苷酸与第三模板链反应，该第三模板链与第三芯片上的探针连接，该第三芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第三模板链带有第三标记，待测核苷酸与第三模板链的相应碱基不能配对，无法使探针的另一端延伸一个碱基，待测核苷酸带有第四标记，第三标记能够产生第三信号，第四标记能够产生第四信号；S2000：检测第三芯片上的信号，获得第三检测结果；S3000：使待测核苷酸与第四模板链反应，该第四模板链与第四芯片连接，第四芯片包括不带探针的基底表面，第四模板链带有第三标记，待测核苷酸能够与第四模板链的相应碱基配对；S4000：检测第四芯片上的信号，获得第四检测结果；S5000：基于第三检测结果和第四检测结果，检测待测核苷酸的非特异性吸附。
利用该方法，能够定性或定量检测基底表面和/或基底表面上的探针/模板链对核苷酸的非特异吸附情况；通过检测系统检测基底表面的信号，能够定性或定量区分非特异性吸附类型，获得非特异性定量、分布情况等信息，能够用于芯片生产以及所有涉及芯片检测核酸过程的方法或应用中，例如用于空载芯片(不带探针)或者捕获芯片(带探针)性能的评价、芯片生产的质控，用于芯片捕获核酸的效果的预测、分析比较等。
S1000和S3000的进行无顺序要求，可先后进行，也可同时进行。同样的，S2000和S4000的进行也无顺序限制。在一些实施例中，S1000和S3000是平行试验，为同时进行。
在一平行试验示例中，S1000和S3000中的第三芯片和第四芯片的基底的材质、表面特性如亲疏水、表面大小等是基本相同或一致的。在一个例子中，第三芯片和第四芯片的基底表面是经过相同表面处理的、相同材料性能的基底。在另一个例子中，第三芯片和第四芯片的基底表面是经过相同表面处理的同一基底的不同表面区域。例如，S1000和S3000中的第三芯片和第四芯片的基底表面除了是否固定探针以外，其它方面如表面大小、待测核苷酸的量、反应条件等基本一致。所称的“基本一致”、“基本相同”同“一致”或“相同”，指不同批次制备、处理和/或平行试验产生的差异在允许的偏差范围内。
对探针在第三芯片表面上的分布或排布方式不作限制，在本发明实施例中，探针在第三芯片表面上随机分布或规则分布(例如呈阵列分布)。
在一个示例中，第三标记和第四标记为不同的荧光染料。在本发明的实施例中，检测第三芯片上的信号，获得第三检测结果包括：通过成像系统对第三芯片表面进行拍照，获得第三图像；以及检测第三图像，以获得第三检测结果。检测第四芯片上的信号，获得第四检测结果包括：通过成像系统对第四芯片表面进行拍照，获得第四图像；以及检测第四图像，以获得第四检测结果。成像系统可以是带有成像系统的光学检测装置等，包括光源、物镜以及相机。
在本发明的实施例中，检测第三图像，以获得第三检测结果进一步包括：检测第三图像，以确定第三芯片表面上同时出现第三信号和第四信号的位置的数量Nc1以及只出现第四信号的位置的数量Nc3。检测第四图像，以获得第四检测结果进一步包括：检测第四图像，以确定第四芯片表面上同时出现第三信号和第四信号的位置的数量Nd1以及只出现第四信号的位置的数量Nd3。图像的检测可参考上述对第一图像的检测示例。
可利用公式(Nc1+Nc3-Nd1-Nd3)/(Nc1+Nc3)确定基底表面经过固定探针后对待测核苷酸非特异性吸附变化比例，来实现基于第三检测结果和第四检测结果，检测待测核苷酸的非特异性吸附。
在一个例子中，如图5所示，在一基底表面上，该基底表面也称为芯片表面，为经过表面修饰后带有环氧基团的表面：加入探针(DNA捕获链，Capture DNA)，探针为经过氨基化修饰的探针、末端带有氨基基团，探针通过-NH3与芯片表面的环氧基团反应，固定在基底表面，然后使用钝化液钝化芯片，以封闭未反应的环氧基团。再加入杂交模板链，该模板链为末端带有Cy3荧光染料标记且杂交部分与探针序列互补配对，但第一个待测碱基与将要加入的待测核苷酸不配对的DNA链。
待杂交反应完成后，加入带有ATTO-647N荧光染料标记的待测核苷酸，进行杂交。杂交完成后，通过荧光显微镜包括全内反射荧光显微镜(TIRF)对表面进行拍照，可得到带有荧光信号的图像。(1)如果同一个位置观察到两种荧光信号，倾向说明该位置同时存在模板链和核苷酸的非特异性吸附，数量为Nc1；(2)如果只观察到绿色荧光信号，倾向说明该位置为模板链的非特异性吸附，数量为Nc2；(3)如果只观察到红色荧光信号，倾向说明该位置为核苷酸的非特异性吸附，数量为Nc3。
如图6所示，在一基底表面上，该基底表面也称为芯片表面，为经过表面修饰后带有环氧基团的表面，与上述基底表面相同，加入不包含探针的固定液，反应体系及反应时间与上述图5示例相同，然后使用钝化液钝化芯片。再加入杂交模板链，该模板链为末端带有Cy3荧光染料标记的特定序列的DNA链。
待反应完成后，加入带有ATTO-647N荧光染料标记的待测核苷酸，然后通过荧光显微镜包括全内反射荧光显微镜(TIRF)对表面进行成像拍照，可得到带有荧光信号的图像。(1)如果同一个位置观察到两种荧光信号，则说明该位置同时存在模板链和核苷酸的非特异性吸附，数量为Nd1；(2)如果只观察到绿色荧光信号，则说明该位置为模板链的非特异性吸附，数量为Nd2；(3)如果只观察到红色荧光信号，则说明该位置为核苷酸的非特异性吸附，数量为Nd3。
可进一步利用公式(Nc1+Nc3-Nd1-Nd3)/(Nc1+Nc3)确定基底表面经过固定探针后对待测核苷酸非特异性吸附变化比例。
在本发明的又一个实施例中，检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法包括：S10000：使待测核苷酸与第五模板链反应，该第五模板链与第五芯片上的探针连接，该第五芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第五模板链带有第五标记，待测核苷酸能够与第五模板链的相应碱基配对，从而使探针的另一端延伸一个碱基，待测核苷酸带有第六标记，第五标记能够产生第五信号，第六标记能够产生第六信号；S20000：检测第五芯片上的信号，获得第五检测结果；S30000：使待测核苷酸与第六模板链反应，该第六模板链与第六芯片上的探针连接，该第六芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，第六模板链带有第五标记，待测核苷酸与第六模板链的相应碱基不能配对，无法使探针的另一端延伸一个碱基；S40000：检测第六芯片上的信号，获得第六检测结果；S50000：使待测核苷酸与第七模板链反应，该第七模板链与第七芯片连接，该第七芯片包括不带探针的基底表面；S60000：检测第七芯片上的信号，获得第七检测结果；S70000：基于第五检测结果、第六检测结果和第七检测结果中的至少两个检测结果，检测待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附。
利用该方法，能够定性或定量检测基底表面和/或基底表面上的探针/模板链对核苷酸的特异性和/或非特异吸附情况；通过检测系统检测基底表面的信号，能够定性或定量区分特异性和/或非特异性吸附类型，获得特异性和/或非特异性定量、分布情况等信息，能够用于核苷酸类似物性能评估、芯片生产以及所有涉及芯片检测核酸过程的方法或应用中，例如用于空载芯片(不带探针)或者捕获芯片(带探针)性能的评价、芯片生产的质控，用于芯片捕获核酸的效果的预测、分析比较等。
S10000、S30000和S50000的进行无顺序要求，可先后进行，也可同时进行。同样的，S20000、S40000和S60000的进行也无顺序限制。在一些实施例中，S10000、S30000和S50000是平行试验，为同时进行。
在一平行试验示例中，S10000、S30000和S50000中的第五芯片、第六芯片和第七芯片的基底的材质、表面特性如亲疏水、表面大小等是基本相同或一致的。在一个例子中，第五芯片、第六芯片和第七芯片的基底表面是经过相同表面处理的、相同材料性能的基底。在另一个例子中，第五芯片、第六芯片和第七芯片的基底表面是经过相同表面处理的同一基底的不同表面区域。例如，S10000和S30000中的第五芯片和第六芯片的基底表面在各方面如表面大小、探针种类和核苷酸序列、探针固定密度、探针分布、待测核苷酸的量、反应条件等基本一致。同时，S50000中的第七芯片与S10000和S30000中的第五芯片和第六芯片相比，除了没有固定探针以外，其它方面如表面大小、待测核苷酸的量、反应条件等基本一致。所称的“基本一致”、“基本相同”同“一致”或“相同”，指不同批次制备、处理和/或平行试验产生的差异在允许的偏差范围内。
对探针在第五芯片和第六芯片表面上的分布或排布方式不作限制，在本发明实施例中，探针在第五芯片和第六芯片表面上随机分布或规则分布(例如呈阵列分布)。在平行实验中，探针在不同的芯片表面上的分布状态相同。
在一个示例中，第五标记和第六标记为不同的荧光染料。在本发明的实施例中，检测第五芯片上的信号，获得第五检测结果包括：通过成像系统对第五芯片表面进行拍照，获得第五图像；以及检测第五图像，以获得第五检测结果。检测第六芯片上的信号，获得第六检测结果包括：通过成像系统对第六芯片表面进行拍照，获得第六图像；以及检测第六图像，以获得第六检测结果。检测第七芯片上的信号，获得第七检测结果包括：通过成像系统对第七芯片表面进行拍照，获得第七图像；以及检测第七图像，以获得第七检测结果。成像系统可以是带有成像系统的光学检测装置等，包括光源、物镜以及相机。
在本发明的实施例中，检测第五图像，以获得第五检测结果进一步包括：检测第五图像，以确定第五芯片表面上同时存在第五信号和第六信号的位置的数量Ne1以及只存在第六信号的位置的数量Ne3。检测第六图像，以获得第六检测结果进一步包括：检测第六图像，以确定第六芯片表面上同时存在第五信号和第六信号的位置的数量Nf1以及只存在第六信号的位置的数量Nf3。检测第七图像，以获得第七检测结果进一步包括：检测第七图像，以确定第七芯片表面上同时出现第五信号和第六信号的位置的数量Ng1以及只出现第六信号的位置的数量Ng3。图像的检测可参考上述对第一图像的检测示例。
进一步，进行以下(a)，(b)，(c)和(d)中的至少之一，来实现基于第五检测结果、第六检测结果和第七检测结果中的至少两个检测结果，检测待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附：(a)利用公式(Nf1+Nf3)/(Ne1+Ne3)确定待测核苷酸非特异性吸附在基底表面和核酸链的比例；(b)利用公式Nf1/(Ne1+Ne3)确定待测核苷酸非特异性吸附在核酸链的比例；(c)利用公式(Ne1+Ne3-Nf1-Nf3)/(Ne1+Ne3)确定待测核苷酸与模板链的有效正配比例；(d)利用公式(Ng1+Ng3-Nf1-Nf3)/(Ng1+Ng3)确定基底表面经过固定探针后对待测核苷酸非特异性吸附变化比例。
在一个例子中，如图4所示，在一基底表面上，该基底表面也称为芯片表面，为经过表面修饰后带有环氧基团的表面：加入探针(DNA捕获链，Capture DNA)，探针为经过氨基化修饰的探针、末端带有氨基基团，探针通过-NH3与芯片表面的环氧基团反应，固定在基底表面，然后使用钝化液钝化芯片，以封闭未反应的环氧基团。再加入杂交模板链，该模板链为末端带有Cy3荧光染料标记并与探针碱基互补配对的特定序列的DNA链。
杂交完成后，加入与杂交模板链的第一个待测碱基互补配对且带有ATTO-647N荧光染料标记的待测核苷酸，然后通过荧光显微镜例如全内反射荧光显微镜(TIRF)对表面进行拍照，可得到带有信号点/斑的图像。(1)如果同一个位置观察到两种荧光信号，则说明该位置的核苷酸与模板链发生正配反应或者少量的链上吸附，数量为Ne1；(2)如果只观察到绿色荧光信号，则说明该位置为模板链的非特异性吸附，数量为Ne2；(3)如果只观察到红色荧光信号，则说明该位置为核苷酸的非特异性吸附或者模板链的Cy3荧光染料发生猝灭但是反应正常，数量为Ne3。
如图5所示，在一基底表面上，该基底表面也称为芯片表面，为经过表面修饰后带有环氧基团的表面：利用相同的反应体系及时间，将同一种、同样浓度的探针，通过-NH3与芯片表面的环氧基团反应，将探针通过化学键连接到芯片表面，然后使用钝化液钝化芯片，以封闭未反应的环氧基团。再加入杂交模板链，该模板链为末端带有Cy3荧光染料标记且杂交部分与探针序列互补配对，但第一个待测碱基与将要加入的待测核苷酸不配对的DNA链。
杂交完成后，加入与待测核苷酸(其与图4的示例中的待测核苷酸相同)，带有ATTO-647N荧光染料标记，然后通过全内反射荧光显微镜(TIRF)对表面进行成像拍照，可得到带有荧光信号点/斑的图像。(1)如果同一个位置观察到两种荧光信号，则说明该位置的核苷酸与模板链发生非特异性吸附，数量为Nf1；(2)如果只观察到绿色荧光信号，则说明该位置为模板链的非特异性吸附，数量为Nf2；(3)如果只观察到红色荧光信号，则说明该位置为核苷酸的表面非特异性吸附，数量为Nf3。
如图6所示，在一基底表面上，该基底表面也称为芯片表面，为经过表面修饰后带有环氧基团的表面，与上述基底表面相同，加入不包含探针的固定液，反应体系及反应时间与上述图5示例相同，然后使用钝化液钝化芯片。再加入杂交模板链，该模板链为末端带有Cy3荧光染料标记的特定序列的DNA链。
待反应完成后，加入带有ATTO-647N荧光染料标记的待测核苷酸，然后通过荧光显微镜包括全内反射荧光显微镜(TIRF)对表面进行成像拍照，可得到带有荧光信号的图像。(1)如果同一个位置观察到两种荧光信号，则说明该位置同时存在模板链和核苷酸的非特异性吸附，数量为Ng1；(2)如果只观察到绿色荧光信号，则说明该位置为模板链的非特异性吸附，数量为Ng2；(3)如果只观察到红色荧光信号，则说明该位置为核苷酸的非特异性吸附，数量为Ng3。
基于上述信息，可进行量化区分特异性吸附和非特异性吸附，评估芯片表面和/或探针对待测核苷酸的特异性吸附和非特异性吸附等，例如利用公式(Nf1+Nf3)/(Ne1+Ne3)确定待测核苷酸非特异性吸附在基底表面和核酸链的比例；利用公式Nf1/(Ne1+Ne3)确定待测核苷酸非特异性吸附在核酸链的比例；利用公式(Ne1+Ne3-Nf1-Nf3)/(Ne1+Ne3)确定待测核苷酸与模板链的有效正配比例；利用公式(Ng1+Ng3-Nf1-Nf3)/(Ng1+Ng3)确定基底表面经过固定探针后对待测核苷酸非特异性吸附变化比例。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。涉及的材料、试剂以及序列等，如无特殊说明，可通过自己配制合成或者市售途径获取。
实施例1：考察核苷酸反应过程中的非特异性吸附的影响
芯片：表面带有环氧基团的玻璃(购自肖特)；
固定链(EKB-6P)：人工合成的特定序列，末端带有-NH3的DNA短序列，序列具体为：
TTTTTTTTTTTTACTTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAG-3’(SEQ IDNO：1)；
杂交链1(EKB-6T-2-Cy3)：人工合成的特定序列，与固定链互补配对，带有长度为33bp待测序列，末端带有荧光基团Cy3的DNA短序列，具体序列为：
AGGCAACATGGATCTAGCATGATCACATGACATCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTA-3’(SEQ ID NO：2)；
杂交链2(EKB-6T-6-Cy3)：人工合成的特定序列，与固定链不互补配对，带有长度为33bp待测序列(与EKB-6T-2-Cy3待测序列不一致)，末端带有荧光基团Cy3的DNA短序列，具体序列为：
CCTCAGATGAATATTGAATCACATCACACGATACTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTA-3’(SEQ ID NO：3)。
实验过程：
固定链的固定1(实验组，对照组1)：将玻璃清洗吹干后，置于150mM K2HPO4并含有浓度为1.0M的氨基修饰的EKB-6P核酸序列的溶液中，37℃条件下反应0.5小时，依次用3XSSC溶液(含0.1％的Triton)，3XSSC，0.15M K2HPO4溶液清洗后，加入1M K2HPO4在37℃条件下钝化17小时。
固定链的固定2(对照组2)：将玻璃清洗吹干后，置于150mM K2HPO4溶液中，37℃条件下反应0.5小时，依次用3XSSC溶液(含0.1％的Triton)，3XSSC，0.15M K2HPO4溶液清洗后，加入1M K2HPO4在37℃条件下钝化17小时。
芯片(Flow Cell，流通池)组装：将钝化完成的芯片组装成四通道的流通池。
杂交链的杂交1(实验组，对照组2)：将组装好的四通道流通池加入Rinse buffer(1XSSC+150mM HEPES+0.1％SDS)，在55℃条件下复溶0.5小时，然后再加入杂交链(EKB-6T-2-Cy3)浓度为1nM的3XSSC溶液，在55℃条件下反应0.5小时。然后依次使用Rinse buffer(1XSSC+150mM HEPES+0.1％SDS)和Buffer H(150mM HEPES+150mM NaCl)冲洗通道。
杂交链的杂交2(对照组1)：将组装好的四通道流通池加入Rinse buffer(1XSSC+150mM HEPES+0.1％SDS)，在55℃条件下复溶0.5小时，然后再加入杂交链(EKB-6T-6-Cy3)浓度为1nM的3XSSC溶液，在55℃条件下反应0.5小时。然后依次使用Rinse buffer(1XSSC+150mM HEPES+0.1％SDS)和Buffer H(150mM HEPES+150mM NaCl)冲洗通道。
核苷酸反应：加入含有浓度为200nM的核苷酸A的反应溶液到通道，37℃条件下反应90s，然后使用Rinse buffer(1XSSC+150mM HEPES+0.1％SDS)和Buffer H(150mM HEPES+150mM NaCl)依次冲洗通道，然后加入成像缓冲液。
拍照检测：使用TIRF对芯片通道的拍照。
实验组结果如图7所示，其中左图显示一个视野中的Cy3荧光点，统计多个通道全部视野的Cy3荧光点数为19852，右图显示相同视野中的ATTO647N荧光点，统计多个通道全部视野的ATTO647N荧光点数为16744，二者重合点数为13358。
对照组1结果如图8所示，其中左图显示一个视野中的Cy3荧光点，统计多个通道全部视野的Cy3荧光点数为数19971，右图显示相同视野中的ATTO647N荧光点，统计多个通道全部视野的ATTO647N荧光点数为619，二者重合点数为358。
对照组2结果如图9所示，其中左图显示一个视野中的Cy3荧光点，统计多个通道全部视野的Cy3荧光点数为603，右图显示相同视野中的ATTO647N荧光点，统计多个通道全部视野的ATTO647N荧光点数为524，其中Cy3荧光点为芯片表面的杂质，亮度较弱，ATTO647N荧光点为核苷酸在芯片表面的非特异性吸附。
依据上述数据可以确定：待测核苷酸非特异性吸附在基底表面和核酸链的比例为3.25％；待测核苷酸非特异性吸附在核酸链的比例为1.19％；待测核苷酸与模板链的有效正配比例为96.75％；基底表面经过固定探针后对待测核苷酸非特异性吸附变化比例-86.5％。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市瀚海基因生物科技有限公司
<120> 一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法
<130> 17I25116
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
tttttttttt ttactttgcc tccttctgca tggtattctt tctcttccgc acccag 56
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
aggcaacatg gatctagcat gatcacatga catctgggtg cggaagagaa agaataccat 60
gcagaaggag gcaaagta 78
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
cctcagatga atattgaatc acatcacacg atactgggtg cggaagagaa agaataccat 60
gcagaaggag gcaaagta 78

Claims (10)

1.一种检测核苷酸特异性和/或非特异性吸附的方法，其特征在于，所述方法包括：
使待测核苷酸与第一模板链反应，所述第一模板链与第一芯片上的探针连接，所述第一芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，所述第一模板链带有第一标记，所述待测核苷酸能够与所述第一模板链的相应碱基配对，从而使所述探针的另一端延伸一个碱基，所述待测核苷酸带有第二标记，所述第一标记能够产生第一信号，所述第二标记能够产生第二信号；
检测所述第一芯片上的信号，获得第一检测结果；
使所述待测核苷酸与第二模板链反应，所述第二模板链与第二芯片上的探针连接，所述第二芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，所述第二模板链带有所述第一标记，所述待测核苷酸与所述第二模板链的相应碱基不能配对，无法使所述探针的另一端延伸一个碱基；
检测所述第二芯片上的信号，获得第二检测结果；
基于所述第一检测结果和所述第二检测结果，检测所述待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附。
2.一种检测核苷酸非特异性吸附的方法，其特征在于，所述方法包括：
使待测核苷酸与第三模板链反应，所述第三模板链与第三芯片上的探针连接，所述第三芯片包括基底表面以及一端固定在该基底表面的探针，所述第三模板链带有第三标记，所述待测核苷酸与所述第三模板链的相应碱基不能配对，无法使所述探针的另一端延伸一个碱基，所述待测核苷酸带有第四标记，所述第三标记能够产生第三信号，所述第四标记能够产生第四信号；
检测所述第三芯片上的信号，获得第三检测结果；
使所述待测核苷酸与第四模板链反应，所述第四模板链与第四芯片连接，所述第四芯片包括不带探针的基底表面，所述第四模板链带有所述第三标记，所述待测核苷酸能够与所述第四模板链的相应碱基配对；
检测所述第四芯片上的信号，获得第四检测结果；
基于所述第三检测结果和所述第四检测结果，检测所述待测核苷酸的非特异性吸附。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一芯片和第二芯片上的探针随机分布和/或规则分布在基底表面上；和/或
所述第三芯片上的探针随机分布和/或规则分布在基底表面上。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
(i)所述检测所述第一芯片上的信号，获得第一检测结果包括：通过成像系统对所述第一芯片表面进行拍照，获得第一图像；以及检测所述第一图像，以获得所述第一检测结果；
所述检测所述第二芯片上的信号，获得第二检测结果包括：通过所述成像系统对所述第二芯片表面进行拍照，获得第二图像；以及检测所述第二图像，以获得所述第二检测结果；和/或
(ii)所述检测所述第三芯片上的信号，获得第三检测结果包括：通过成像系统对所述第三芯片表面进行拍照，获得第三图像；以及检测所述第三图像，以获得所述第三检测结果；
所述检测所述第四芯片上的信号，获得第四检测结果包括：通过所述成像系统对所述第四芯片表面进行拍照，获得第四图像；以及检测所述第四图像，以获得所述第四检测结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
(i)中检测所述第一图像，以获得所述第一检测结果包括：检测所述第一图像，以确定所述第一芯片表面上同时存在第一信号和第二信号的位置的数量Na1以及只存在第二信号的位置的数量Na3；
检测所述第二图像，以获得所述第二检测结果包括：检测所述第二图像，以确定所述第二芯片表面上同时存在第一信号和第二信号的位置的数量Nb1以及只存在第二信号的位置的数量Nb3；和/或
(ii)中检测所述第三图像，以获得所述第三检测结果包括：检测所述第三图像，以确定所述第三芯片表面上同时出现第三信号和第四信号的位置的数量Nc1以及只出现第四信号的位置的数量Nc3；
检测所述第四图像，以获得所述第四检测结果包括：检测所述第四图像，以确定所述第四芯片表面上同时出现第三信号和第四信号的位置的数量Nd1以及只出现第四信号的位置的数量Nd3。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
进行(i)后，所述基于所述第一检测结果和所述第二检测结果，检测所述待测核苷酸的特异性和/或非特异性吸附包括进行以下(a)，(b)和(c)中的至少之一：
(a)利用公式(Nb1+Nb3)/(Na1+Na3)确定所述待测核苷酸非特异性吸附在所述基底表面和第一模板链的比例；
(b)利用公式Nb1/(Na1+Na3)确定所述待测核苷酸非特异性吸附在第一模板链上的比例；
(c)利用公式(Na1+Na3-Nb1-Nb3)/(Na1+Na3)确定所述待测核苷酸特异性结合到所述第一模板链的比例；和/或
进行(ii)后，所述基于所述第三检测结果和所述第四检测结果，检测所述待测核苷酸的非特异性吸附包括：利用公式(Nc1+Nc3-Nd1-Nd3)/(Nc1+Nc3)确定基底表面经过固定所述探针后对所述待测核苷酸非特异性吸附变化比例。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，
(i)中，所述第一图像和/或所述第二图像包含多个像素点，检测所述第一图像和/或检测所述第二图像包括：
利用k*k矩阵对所述第一图像和/或所述第二图像进行亮点检测，包括判定所述矩阵的中心像素值不小于该矩阵非中心任一像素值的矩阵对应一个亮点，k为大于1的奇数，k*k矩阵包含k*k个像素点；
任选的，所述矩阵的中心像素值大于第一预设值，所述矩阵非中心任一像素值大于第二预设值；
任选的，所述第一预设值和所述第二预设值与该图像的平均像素值相关；和/或
(ii)中，所述第三图像和/或所述第四图像包含多个像素，检测所述第三图像和/或检测所述第四图像包括：
利用k*k矩阵对所述第三图像和/或所述第四图像进行亮点检测，包括判定所述矩阵中心的像素值不小于该矩阵非中心任一像素值的矩阵对应一个亮点，k为大于1的奇数，k*k矩阵包含k*k个像素点；
任选的，所述矩阵中心的像素值大于第一预设值，所述矩阵非中心任一像素值大于第二预设值；
任选的，所述第一预设值和所述第二预设值与该图像的平均像素值相关。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，
(i)中，所述第一图像和/或所述第二图像包含多个像素点，检测所述第一图像和/或检测所述第二图像包括：
亮点检测步骤，所述亮点检测步骤包括：分析所述第一图像和/或分析所述第二图像以计算亮点判定阈值，分析所述第一图像和/或所述第二图像以获取候选亮点，根据所述亮点判定阈值判断所述候选亮点是否为所述亮点，和/或
(ii)中，所述第三图像和/或所述第四图像包含多个像素点，检测所述第三图像和/或检测所述第四图像包括：
亮点检测步骤，所述亮点检测步骤包括：分析所述第三图像和/或分析所述第四图像以计算亮点判定阈值，分析所述第三图像和/或所述第四图像以获取候选亮点，根据所述亮点判定阈值判断所述候选亮点是否为所述亮点。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，(i)和/或(ii)的亮点检测步骤之前还包括：
图像预处理步骤，所述图像预处理步骤包括预处理所述第一图像、第二图像、第三图像和/或第四图像，以获得预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像；
所述图像预处理步骤包括进行以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)至少之一：
(a)对所述第一图像、第二图像、第三图像和/或第四图像进行减背景处理，以获得预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像；
(b)对进行减背景处理后的第一图像、减背景处理后的第二图像、减背景处理后的第三图像和/或减背景处理后的第四图像进行简化处理，以获得预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像；
(c)对所述第一图像、第二图像、第三图像和/或所述第二图像进行滤波处理，以获得预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像；
(d)对所述第一图像、第二图像、第三图像和/或第四图像进行减背景处理后再进行滤波处理，以获得预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像；
(e)对进行减背景处理后再进行滤波处理的第一图像、进行减背景处理后再进行滤波处理的第二图像、进行减背景处理后再进行滤波处理的第三图像和/或进行减背景处理后再进行滤波处理的第四图像进行简化处理，以获得预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像；
(f)对所述第一图像、第二图像、第三图像和/或第四图像进行简化处理，以获得预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像。
10.根据权利要求9所述的(b)、(e)和(f)任一方法，其特征在于，所述根据所述亮点判定阈值判断所述候选亮点是否为所述亮点，包括：在所述预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像中查找大于(p*p-1)连通的像素点并将查找到的所述像素点作为所述候选亮点的中心，p为自然数且为大于1的奇数；
判断所述候选亮点的中心是否满足条件：Imax*ABI*ceofguass>T，其中，Imax为p*p窗口的中心最强强度，ABI为p*p窗口中所述预处理后的第一图像、预处理后的第二图像、预处理后的第三图像和/或预处理后的第四图像中为设定值所占的比率，ceofguass为p*p窗口的像素和二维高斯分布的相关系数，T为所述亮点判定阈值，
若满足上述条件，判定所述候选亮点为一个亮点。
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