JP2021114903A - 核酸の四重鎖構造用ｄｎａプローブ - Google Patents

Abstract

【課題】複数の試料から、核酸の特定四重鎖構造を迅速に解析するためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。【解決手段】核酸の四重鎖構造を形成する領域の隣接部に相補的な塩基配列により構成されてなる、オリゴヌクレオチドプローブにより達成する。【選択図】図５

Description

本発明は、核酸の四重鎖構造用ＤＮＡプローブに関する。

（ゲノム）ＤＮＡのメチル化は、ＣｐＧ（シトシン-ホスホジエステル結合-グアニン）部位で起こることが知られている。ＣｐＧ密度の高い領域はＣｐＧアイランドと呼ばれ、ＤＮＡのメチル化解析において重要な領域である。

ＣｐＧアイランドでは、グアニン四重鎖構造及びシトシン四重鎖構造を形成し易く、その構造自体及び構造安定性が、メチル化により変化することが報告されている。このため、これら四重鎖構造の違いにより、（ゲノム）ＤＮＡのメチル化状態を解析することが可能となる。

一方で、ＣｐＧアイランドには四重鎖構造を形成しうる塩基配列が高密度で存在するため、解析対象の四重鎖構造近傍には、解析対象ではない四重鎖構造が多数存在する。これら解析対象ではない四重鎖構造は、四重鎖構造変化に基づいたＤＮＡのメチル化解析の精度を低下させる要因になることがある。

従来、（ゲノム）ＤＮＡ情報を網羅的に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイがよく用いられるが、そのプローブＤＮＡの設計は四重鎖構造の検出及び解析には適したものではなく、上記したＤＮＡのメチル化解析の精度を十分に上げるには至らないものであった。

例えば、特許文献１（特表２００８−５３８５０７号公報）では、図１に示す通り、マイクロアレイに基づく一塩基多形（ＳＮＰ）検出方法を開示するに止まっており、特定の四重鎖構造の検出に適したプローブＤＮＡの設計及び提案は何らなされていない。

また、非特許文献１では、重亜硫酸ナトリウム処理（バイサルファイト処理）により非メチル化シトシンをウラシルにし、メチル化シトシンはシトシンに変換した後に、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、ウラシル、シトシンとの違いをプロファイリング（解析）する方法が開示されている。この際、ゲノムＤＮＡ断片のメチル化部位の解析に用いるＤＮＡマイクロアレイ用（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ， イルミナ社）ＤＮＡプローブを用いることが開示されている。図２に示す通り、このプローブＤＮＡの設計は、プローブ末端が、メチル化サイトにマッチさせ（ＩｎｆｉｎｉｕｍＩ）、或いは、メチル化サイトの直上の塩基にマッチさせる（ＩｎｆｉｎｉｕｍII）、よ
うに設計されたものである。しかしながら、この方法は、特定部位（１塩基単位）のメチル化検出が目的の為、グアニン四重鎖構造検出に適したプローブＤＮＡ設計には全くなっていないものであった。

特表２００８−５３８５０７号公報

「Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequence」〔Sebastian Moran, et. al., Epigenomics, 8, 389-399 (2016)〕

本発明は、核酸（ＤＮＡ）のメチル化解析において、複数の解析対象以外の四重鎖構造を排斥し、解析対象である四重鎖構造を備えたメチル化ＤＮＡの解析精度を向上させるために、新規なオリゴヌクレオチドプローブを提案するものである。

〔本発明の一の態様〕
本発明によれば、本発明の一の態様として以下のものを提案することができる。
〔１〕核酸の四重鎖構造用オリゴヌクレオチドプローブであって、
核酸の四重鎖構造を形成する領域の隣接部に相補的な塩基配列により構成されてなる、オリゴヌクレオチドプローブ。
〔２〕前記四重鎖構造を形成する領域に相補的な塩基配列を含まないことを特徴とする、〔１〕に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔３〕前記ＤＮＡ四重鎖構造を形成する領域の５’側の隣接部領域に相補的な塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドプローブ１、及び／又は、
前記ＤＮＡ四重鎖構造を形成する領域の３’側の隣接部領域に相補的な塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドプローブ２である、〔１〕に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔４〕前記四重鎖構造が、グアニン四重鎖構造又はシトシン四重鎖構造である、〔１〕〜〔３〕の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔５〕前記オリゴヌクレオチドプローブ１の３’末端又は５’末端が基板に固定され、又は、
前記オリゴヌクレオチドプローブ２の３’末端又は５’末端が基板に固定されている、〔１〕〜〔４〕の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔６〕前記核酸が、一又は複数の断片形態としたものである、〔１〕〜〔５〕の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔７〕前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、〔１〕〜〔６〕の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔８〕前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、〔７〕に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔９〕前記ゲノムＤＮＡが、一又は複数の断片ゲノムＤＮＡである、〔８〕に記載の解析方法。
〔１０〕前記核酸の四重鎖構造を検出するのに使用される、〔１〕〜〔９〕の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
〔１１〕〔１〕〜〔９〕の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブを備えてなる、オリゴヌクレオチドプローブセット。
〔１２〕〔１〕〜〔９〕の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブを備えてなる、マイクロアレイ。

本発明は、メチル化ＤＮＡにおける解析対象とした四重鎖構造用オリゴヌクレオチドプローブを提供することにより、複数の近似する四重鎖構造を有するメチル化ＤＮＡから、特定の四重鎖構造を高精度及び高検出能において正確に解析することが可能となる。

図１は、特許文献１に示されたマイクロアレイに基づく一塩基多形（ＳＮＰ）検出方法におけるプローブの概略図である。 図２は、非特許文献１で採用されたＤＮＡマイクロアレイ用ＤＮＡプローブの概略図である。 図３は、グアニン四重鎖構造の概略図である。 図４は、ｉ−ｍｏｔｉｆ構造の概略図である。 図５は、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブとそれを用いたハイブリダイズを示した概略図である。 図６は、本発明による核酸の四重鎖構造の検出又は解析の方法又は装置の構成を概説したフローチャートである。 図７（ａ）は、本発明によるＣｙ５修飾Ｇ４構造リガンドおよび、Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎにより染色されたＤＮＡラダーを検出した結果を示す。図７（ｂ）には、本発明によるＤＮＡを染色し検出した結果を示す。 図８（ａ）は、本発明によるＣｙ５修飾Ｇ４構造リガンドおよび、Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎにより染色されたＤＮＡラダーを検出した結果を示す。図８（ｂ）は、本発明によるＤＮＡを染色し検出した結果を示す。 図９は、本発明による、ＤＮＡ添加前の前記信号値を０とし、ＤＮＡおよびＧ４構造リガンドを添加した際に得られたＳＰＲ信号値の変化を示したものである。

〔定義〕
「ＤＮＡ」とは、一本鎖または二本鎖構造としてのデオキシリボ核酸を意味する。
「ＲＮＡ」とは、一本鎖または二本鎖構造としてのリボ核酸を意味する。
「ＤＮＡ」又は「ＲＮＡ」は、生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳類（特に好ましくは人）のものを意味する。
「ヌクレオチド」とは、１つのＤＮＡ単位（Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミン）又は１つのＲＮＡ単位（Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇ：グアニン、Ｕ：ウラシル）を意味する。
「オリゴヌクレオチド」とは、通常、３０塩基以下程度の短鎖ヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であり、塩基配列自動合成装置によれば、３００塩基程度の長さのものまで存在する。
「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、オリゴヌクレオチドが相補的なヌクレオチドと結合する性質を利用した、相補的ＤＮＡ又はＲＮＡを検出するプローブを意味する。
「ハイブリダイズ：ハイブリダイゼーション」とは、核酸（「ＤＮＡ」又は「ＲＮＡ」）の分子が相補的に複合体を形成することを意味する。
「プローブＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡ配列を意味し、「プローブＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡ配列を意味する。
「ハイブリダイズしたＤＮＡ」とはプローブにハイブリダイズしたターゲットＤＮＡを意味し、「ハイブリダイズしたＲＮＡ」とはプローブにハイブリダイズしたターゲットＲＮＡを意味する。
「一塩基多型」（ＳＮＰ）とは、一本鎖ＤＮＡ配列におけるデオキシヌクレオチドの異なるデオキシヌクレオチドによる置換（一塩基置換）を意味する。
「マイクロアレイ」とは、ＤＮＡ又は核酸試料を複数設置する固体基板である。
「グアニン四重鎖構造」は、図３〔「G-Quadruplexes as An Alternative Recognition Element in Disease-Related Target Sensing」（Jeunice Ida et. al.,Molecules 2019, 24, 1079に掲載された図面を引用）を用いて説明する。
「グアニン四重鎖構造」は、グアニン（Ｇ）塩基４個が非ワトソン−クリック型水素結合を介して同一平面上に環状に配置したＧ−ｑｕａｒｔｅｔ（以下、「Ｇｑ」又は「Ｇ４」という）構造がスタッキング相互作用により積み重なった構造である。Ｇ塩基を有する４本のオリゴヌクレオチド鎖がすべて平行である場合にはパラレル型、反平行である場合はアンチパラレル型、これらが混合している場合はハイブリッド型と呼ばれる。パラレル型とアンチパラレル型の構造の違いは、ＣＤスペクトルにより判別され、具体的には以下のような特徴によって判別される。「パラレル型」は、２６０ｎｍに正のピーク、２４０ｎｍに負のピークが現れ、「アンチパラレル型」は、２９５ｎｍに正のピーク、２６５ｎｍに負のピークが現れる。
「ｉ−ｍｏｔｉｆ構造」は、図４を用いて説明することができる。シトシンが豊富に存在するＤＮＡ配列において形成される四重鎖構造で、シトシン（Ｃ）塩基２個で形成される平面が垂直方向に積み重なることで形成される。

〔核酸の四重鎖構造用オリゴヌクレオチドプローブ〕
本発明にあっては、メチル化した核酸（特に、ＤＮＡ）の特定の四重鎖構造を解析するために、解析対象以外の四重鎖構造を除外するために、本発明は核酸の四重鎖構造（検出・解析）用オリゴヌクレオチドプローブを提案する。これにより、特定四重鎖構造を備えたメチル化核酸を高精度、高分解能な検出及び解析することが可能となる。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、核酸の四重鎖構造を形成する領域の隣接部に相補的な塩基配列を有するものである。また、前記四重鎖構造を形成する領域に相補的な塩基配列を含まないものが好ましいものとして提案することができる。また、５’末
端側の隣接部領域に相補的な塩基と、３’末端側の隣接部領域に相補的な塩基との二つの
プローブからなるものである。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、図５に示された通り、断片化され一本化された核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）について四重鎖構造形成領域以外の近傍付近において、５’末端側からのオリゴヌクレオチドプローブ１及び／又は３’末端側から
のオリゴヌクレオチドプローブ２といったものを提案する。無論、当該四重鎖構造を形成する領域に相補的な塩基配列とは全く別の塩基配列（ダミー）を導入した一つのオリゴヌクレオチドプローブとすることができる。

無論、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ、例えば、上記プローブ１、プローブ２は、解析対象のメチル化されたＤＮＡにおいて、特定の四重鎖構造形成領域の近傍領域、例えば、特定の四重鎖構造形成領域の開始塩基と終了塩基からオリゴ数程度（即ち、１桁塩基以上約１００塩基以下であり、好ましくは５０塩基程度以下であり、より好ましくは約３０塩基以下程度である）の塩基配列に対して、相補的な塩基を備えたオリゴヌクレオチドを形成することによってプローブとすることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、既知の方法で、合成することが可能である。

〔用途〕
（核酸の四重鎖構造の検出又は解析）
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、核酸の四重鎖構造の検出又は解析に用いられる。

（マイクロアレイ及びそのキット）
本発明による一又は複数のオリゴヌクレオチドプローブは、マイクロアレイに結合させたものとして用いることができ、または、マイクロアレイキットすることができる。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、マイクロアレイに結合して使用されてよい。例えば、上記二本のプローブ１及びプローブ２の何れか一方がマイクロアレイに結合していればよい。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、そのままマイクロアレイに結合させてもよく、又は、スペーサーを介してマイクロアレイに結合することも可能である。スペーサーとしては、ポリマーブラシ、ヌクレオチドに基づくスペーサー、化学物質スペーサー、又はその他のタイプのスペーサーであってよい。例えば、約１〜５０ヌクレオチド、好ましくは約３〜２５ヌクレオチド、より好ましくは約５〜１５ヌクレオチドを有するスペーサーであってよい。スペーサーは、ＤＮＡ以外の化学種から構成されるスペーサーもまた用いることが可能であり、例えば、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド、化学物質〔例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＥＧ誘導体〕、及びこれらの組合せが挙げられる。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズしたＤＮＡと共有結合を形成しうる修飾塩基を導入してもよい。このような修飾塩基としては、光架橋性オリゴが挙げられる。光架橋性オリゴは、紫外線照射の波長を変化させて架橋と乖離とを自由にすることができるものであり、例えば、光架橋性人工核酸 ＣＮＶシリーズ（北海道システム・サイエンス株式会社）が挙げられる。

（核酸の四重鎖構造の検出又は解析の方法又は装置）
本発明による核酸の四重鎖構造の検出又は解析の方法又は装置は、図６に示す通り、
核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）試料を用意し、
前記核酸を断片化し、一本鎖化し、
前記一本鎖化核酸を本発明によるプローブ（必要に応じて検出基板固定）とハイブリダイズし、ターゲット核酸を得てなり、
前記ターゲット核酸にリガンドを導入し、
リガンドが結合したグアニン四重鎖構造をその構造の違いにより検出し、
前記核酸のメチル化状態を解析することができる。

〈核酸試料〉
核酸は、一又は複数の断片形態であってよく、ＤＮＡ又はＲＮＡである。ＤＮＡは、好ましくは、ゲノムＤＮＡであり、より好ましくは、一又は複数の断片ゲノムＤＮＡである。

〈断片化及び一本鎖化〉
核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を試料とし、断片化し、一本鎖化する。
「断片化」は、通常の手法、即ち、化学的手法（制限酵素）、物理的手法（機械的破砕、超音波等）によって、所望の核酸を断片化することができる。
「一本鎖化」は、通常の手法、即ち、熱変性、アルカリ変性等によって、所望の断片化核酸を一本鎖化することができる。

〈ハイブリダイズ〉
図５に示す通り、断片化一本鎖化核酸（ゲノムＤＮＡ）ＤＮＡと、検出用基板（必要に応じて）上のプローブＤＮＡを接触させハイブリダイズし、グアニン四重鎖構造を形成する塩基配列を含むターゲットＤＮＡ断片のみを捕捉させる。捕捉させたターゲットＤＮＡ断片は、メチル化の有無により、異なる構造のグアニン四重鎖を形成する。一例によれば、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、２本（プローブ１とプローブ２）となっており、プローブ２は検出用基板に固定されており、プローブ１は固定されていない。
そして、好ましくは、光架橋性オリゴを含むプローブ１と断片化したゲノムＤＮＡを混合し、ハイブリダイズし、次に、これに、プローブ２が固定された基板に添加し、ハイブリダイズすることとなる。

〈リガンド〉
前記ハイブリダイズしたターゲットＤＮＡに、特定のグアニン四重鎖構造に結合するリガンドを導入（結合）する。これによって、マイクロアレイ（ＤＮＡチップ）が形成されることとなる。リガンドは、グアニン四重鎖構造に結合する低分子リガンドが好ましくは使用することができる。

（核酸のメチル化状態を解析する装置）
本発明にあっては、試料導入部、処理部、検出用基板、固定部、解析部とを備えた核酸のメチル化状態を解析する装置、取り分け、上記した核酸のメチル化状態を解析する方法を実現しる装置を提案する。従って、その内容は、核酸のメチル化状態を解析する方法で説明したのと同様であってよい。また、本発明による解析部は、ＣＰＵ、メモリー、データ入力、データ出力を備えたコンピュータシステムを備えてなるものであり、また、解析にあっては、ソフトウェアーを用いて行ってもよい。

本発明の内容を以下の実施例を用いて説明するが、本発明の範囲は、これら実施例に限定して解釈されるものではない。また、本明細書に開示された様々な本発明の態様は、本実施例から当業者が容易に本発明を実施することができるものである。

〔調製〕
下記表１に記載した通り、試料としてＤＮＡ１とＤＮＡ２、本発明によるオレゴヌクレオチドプローブとしてプローブ１及びプローブ２を用意した。

〔実施例１〕：オリゴヌクレオチドプローブ１本及び電気泳動
（１）ＤＮＡ塩基配列
ターゲットＧ４形成配列は、既知のＧ４構造形成配列であるｂｃｌ−２ Ｇ４（５’−ＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣ−３’）とし、ヒトゲノム配列において、ｂｃｌ２の上下流３０塩基を含む８７塩基のＤＮＡを、ターゲットモデルＤＮＡ（ＤＮＡ１）とした。ｂｃｌ−２ Ｇ４の塩基配列の上下流３０塩基は、遺伝子検索システムＧＧＧｅｎｏｍｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｇｇｅｎｏｍｅ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／ｊａ／）により検索した。コントロールＤＮＡとして、ＤＮＡ１の５′側から３１〜５７の塩基配列をチミンに置き換えた８７塩基のＤＮＡ（ＤＮＡ２）を用いた。

（２）プローブ試験
１．ＤＮＡ１又はＤＮＡ２と、プローブＤＮＡ１又は２を、濃度１μＭとなるようにＴＫ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４）で調製した。調製したＤＮＡ溶液を、９５℃で１０分間熱処理後、１時間かけて室温まで徐冷した。
２．熱処理したＤＮＡ（終濃度５００ｎＭ）と、Ｃｙ５で修飾されたＧ４構造リガンド（Ｃｙ５修飾７ＯＴＤ、終濃度２．５μＭ）を、ＴＫ ｂｕｆｆｅｒ中で、室温で１時間、インキュベートした。
３．２０ｂｐＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（タカラバイオ社製）５μｌを、Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎ（日本ジェネティクス社製）と混合し、これを泳動用ＤＮＡラダーとした。１５％未変性ポリアクリルアミドゲルに、上記２で調製したサンプル、及び、ＤＮＡラダーをロードし、ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，８９ｍＭ Ｈ₃ＢＯ₄，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．３）を用いて、２０ｍＡ（ゲル１枚あたり）で電気泳動を行った。
４．電気泳動後、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ８６００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてスキャンし、ゲルの画像を得た。
５．その後、ゲルをＤＮＡ染色液（ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ １／１０００希釈溶液）に１５分間浸漬後、Ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒ （ＢｉｏＲａｄ社製）によりスキャンし、ゲルの画像を得た。

（３）評価結果
図７（ａ）に、Ｃｙ５修飾Ｇ４構造リガンドおよび、Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎにより染色されたＤＮＡラダーを検出した結果を示す。図７（ｂ）には、ＤＮＡを染色し検出した結果を示す。
プローブ１とＤＮＡ１又はＤＮＡ２をハイブリダイズさせた系では、ｂｃｌ−２ Ｇ４を含むＤＮＡ１では、ＤＮＡのバンド（図７（ｂ））と同位置にＧ４構造リガンドによるバンドが検出されたが（図７（ａ））、ｂｃｌ−２ Ｇ４を含まないＤＮＡ２では検出されなかった。これより、プローブ１とハイブリダイズさせた場合は、ターゲットモデルであるＤＮＡ１のみがＧ４構造を形成することが示された。一方、プローブ２とＤＮＡ１又はＤＮＡ２をハイブリダイズさせた系では、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２いずれにおいても、ＤＮＡのバンドと同位置に、Ｇ４構造リガンドによるバンドが検出され、Ｇ４構造リガンドはＤＮＡ１、ＤＮＡ２のいずれにも結合していることが示された。これは、ｂｃｌ−２ Ｇ４だけでなく、ＤＮＡ１およびＤＮＡ２の５’側から３０塩基の領域にもＧ４構造形成配
列が存在し、プローブ２とハイブリダイズさせた場合は、上記領域が一本鎖ＤＮＡとして存在するため、Ｇ４構造を形成し、ＤＮＡ２においても、Ｇ４構造リガンドとの結合を示すバンドが検出されたと考えられる。

〔実施例２〕：オリゴヌクレオチドプローブ２本及び電気泳動
（１）ＤＮＡ塩基配列
実施例１と同様のものを使用した。
（２）プローブ試験
プローブ１とプローブ２の両方を、ＤＮＡ１又はＤＮＡ２と混合したＤＮＡサンプルに対し、実施例１と同様に試験した。
（３）評価結果
図８（ａ）に、Ｃｙ５修飾Ｇ４構造リガンドおよび、Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎにより染色されたＤＮＡラダーを検出した結果を示す。図８（ｂ）には、ＤＮＡを染色し検出した結果を示す。ＤＮＡ１では、ｂｃｌ−２ Ｇ４を含むＤＮＡ１では、ＤＮＡのバンド（図８（ｂ））と同位置にＧ４リガンドによるバンドが検出されたが（図８（ａ）、Ｌｉｇａｎｄ＋レーン）、ｂｃｌ−２ Ｇ４を含まないＤＮＡ２ではＤＮＡのバンドが検出された位置にＧ４構造リガンドによるバンドは検出されなかった。これより、プローブ１とプローブ２の両方をハイブリダイズさせた場合は、ターゲットモデルであるＤＮＡ１のみがＧ４構造を形成することが示された。

〔実施例３〕：オリゴヌクレオチドプローブ２本及びＳＰＲ法
（１）ＤＮＡ塩基配列
実施例１と同様のものを使用した。

（２）プローブ試験
ＳＰＲ測定装置として、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を使用した。
１．５’末端にビオチン修飾されたプローブ２を、９５℃で１０分間、熱処理後、急冷
した後、Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＳＡのフローセル２に固定した。
２．ＤＮＡ１又はＤＮＡ２とプローブ１を混合後、９５℃１０分間加熱後、６０分間かけて２５℃まで徐冷した。熱処理したＤＮＡサンプル（濃度１μＭ）を、流速２μｌ／ｍｉｎで、フローセル１及び２にインジェクトし、フローセル２上のプローブ２にハイブリダイズさせることで、ＤＮＡ１又はＤＮＡ２を固定した。その後、２μＭのＧ４リガンド（７ＯＴＤ）を、流速３０μｌ／ｍｉｎで３００秒間、インジェクトし、その後、３００秒間、Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを流した。
３．ＳＰＲの測定は室温で行い、ＤＮＡとリガンドの調製及びＳＰＲのｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにはＴＫ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４）を、再生化溶液には２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＯＨを用いた。

（３）評価結果
１．ＤＮＡ及びＧ４構造リガンドの添加による信号変化量として、フローセル２の信号値からフローセル１の信号値を差し引いた値を用いた。ＤＮＡ添加前の前記信号値を０とし、ＤＮＡおよびＧ４構造リガンドを添加した際に得られたＳＰＲ信号値の変化を図９に示す。ＤＮＡ１、ＤＮＡ２いずれにおいても、ＤＮＡ添加によりＳＰＲ信号値が増加したことから、フローセル２上にこれらのＤＮＡが捕捉されたことが示された。さらに、ＤＮＡ１が捕捉された場合でのみ、Ｇ４構造リガンド添加によるＳＰＲ信号値の上昇が確認された。ＤＮＡが基板に捕捉された状態においても、プローブ１とプローブ２の両方をハイブリダイズさせることで、ターゲットモデルであるＤＮＡ１のみがＧ４構造を形成することが示された。
２．ＤＮＡインジェクト前後のＳＰＲ信号値の変化量（図９）から、Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＳＡ表面に捕捉されたＤＮＡ量を算出し、Ｇ４構造リガンドのインジェクト前後のＳＰＲ信号値の変化量から、結合したＧ４構造リガンド量を算出した。その結果は、下記表２に記載した通りであった。

本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、核酸の四重鎖構造の検出又は解析に用いられる。

Claims (12)

1. 核酸の四重鎖構造用オリゴヌクレオチドプローブであって、
   核酸の四重鎖構造を形成する領域の隣接部に相補的な塩基配列により構成されてなる、オリゴヌクレオチドプローブ。
2. 前記四重鎖構造を形成する領域に相補的な塩基配列を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
3. 前記ＤＮＡ四重鎖構造を形成する領域の５’側の隣接部領域に相補的な塩基配列を有す
   るオリゴヌクレオチドプローブ１、及び／又は、
   前記ＤＮＡ四重鎖構造を形成する領域の３’側の隣接部領域に相補的な塩基配列を有す
   るオリゴヌクレオチドプローブ２である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
4. 前記四重鎖構造が、グアニン四重鎖構造又はシトシン四重鎖構造である、請求項１〜３の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
5. 前記オリゴヌクレオチドプローブ１の３’末端又は５’末端が基板に固定され、又は、
   前記オリゴヌクレオチドプローブ２の３’末端又は５’末端が基板に固定されている、請求項１〜４の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
6. 前記核酸が、一又は複数の断片形態としたものである、請求項１〜５の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
7. 前記核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１〜６の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
8. 前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
9. 前記ゲノムＤＮＡが、一又は複数の断片ゲノムＤＮＡである、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
10. 前記核酸の四重鎖構造を検出するのに使用される、請求項１〜９の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
11. 請求項１〜１０の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブを備えてなる、オリゴヌクレオチドプローブセット。
12. 請求項１〜１０の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブを備えてなる、マイクロアレイ。

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