CN105883714A - 一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构及制备方法 - Google Patents

一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸纳米结构，具体而言是一种新型依赖于拓扑异构酶构建稳定核酸纳米网状结构及其构建技术。本发明所使用的DNA网状结构是由3条DNA单链通过拓扑异构酶构建而成的二维网状结构，其中拥有互补配对片段和活性片段。活性片段可以设计成为实现相关生物学功能的目的序列，携带相关生物基团，发挥相应的生物学效应。本方法具有热稳定性高、拥有活性片段，制作简单方便等特点。

Description

一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构及制备方法
技术领域
本发明涉及一种核酸纳米结构，具体而言是一种新型依赖于核酸拓扑异构酶构建的核酸纳米网状结构及制备方法。
背景技术
DNA纳米技术概念，是纳德里安·西曼(Nadrian Seeman)在1980年代早期提出的，在2000年后开始引起广泛的关注。最近几年，一种被称为DNA Origami(DNA折纸)的技术得到了广泛的发展与应用，这种技术利用已知序列的长链病毒DNA(通常是M13噬菌体的M13mp18的DNA)和大量的短链DNA构造出相对复杂的纳米级形状和图案。这一领域的研究者已经构建了大量的静止结构(如，二维和三维晶体结构、毫微管、多面体和其他多种造型)和功能结构(如，纳米机器和DNA计算机)。该技术的成果被广泛的应用于结构生物学、生物物理学的理论研究；晶体学和光谱学应用研究；其应用领域正在向分子电子学和纳米医学扩展。
DNA折纸技术所需的长链一般通过滚环扩增(RCA)的方法获得，RCA技术模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程发展起来的一种核酸等温扩增方法，可以得到长链DNA。其产物具有序列确定、长度合适的DNA链，因此RCA长链是一种替代DNA折纸中天然长链DNA的理想材料。
现有的DNA折纸技术通过将DNA长链降温退火，在DNA链之间通过碱基互补的氢键，形成富含DNA双链的纳米片层结构；再通过使用小DNA分子(也称DNA订书钉)与剩余的长链DNA中没有形成双链结构的部分形成双链，稳定片层结构。目前的DNA折纸结构能够提供相对稳定的DNA片层结构，但是还存在着以下不足，主要表现在两个方面：
(1)稳定性差
这种DNA折纸结构的稳定性是相对的，由于其结构主要依靠氢键等非共价键维持，因此当温度升高时，结构会解体；
(2)与外源分子结合力差
出于稳定DNA折纸结构稳定性的目的，引入小DNA分子，与长链DNA分子中的单链部分结合，封闭了长链DNA分子上的大量DNA单链，使得与外源分子结合的活性位点减少，造成与外源分子的结合力较差。
本发明为克服以上不足，创造性的使用了DNA拓扑异构酶(DNATopiosomreases)，在DNA折纸纳米片层结构中引入了天然DNA所具备的拓扑结构，使得长链和长链之间相互缠绕形成天然DNA所具备的双链拓扑结构，具有很强的稳定性，而伴随着这种稳定性，可以避免额外使用DNA订书钉，保留大量的DNA单链作为结合其他成分的活性位点。
DNA拓扑酶是能将线状、环状、单键或双键DNA分子进行拓扑变换的一种酶。拓扑变换是指对物体进行不改变其拓扑性质的变换。拓扑性质简单地讲是指将物体进行弹性操作(位移)时物体保持不变的一种狭义的几何性质。DNA通过拓扑酶作用，形成类似于铁丝网的mesh结构。
总之，我们构建的新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构核酸纳米网状结构的优势在于，通过RCA过程获得长链后，仿照″DNA折纸″的构造方法，利用碱基氢键互补作用将DNA长链中的一个循环单元中的50％的碱基配位成双链，使其折叠成特定的形状。由于RCA长链是大量相同的重复序列组成的，因此设计一个循环单元的折叠方式可以拓展到整条长链。通过这种方式，我们利用三条不同序列的DNA长链折叠成所希望的纳米图案。而后使用DNA拓扑异构酶，在双链部分引入超螺旋形成稳定的网状结构。同时，在设计模板链的过程中，我们保留了50％左右的未匹配片段，可以与DNA单链结合，成为多种活性基团的结合位点。
这种设计更为简便，具有可控操作区且具有热稳定性的核酸纳米网状结构可以作为模板组装功能纳米材料或分子，能够在光学、电磁学、医学等领域获得广泛的应用，具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的：
本发明旨在构建一种稳定性强，与外源分子结合力强的的新型核酸纳米网状结构。
本发明的技术原理：
本发明主要依靠DNA自主装技术原理实现，DNA自组装是在热力学驱动下，两条互补的单链DNA分子自发杂交的动力学过程。在杂交过程中，DNA双链通过氢键、范德华力和静电力相互作用，严格遵守Watson-Crick碱基互补配对原则，自发形成结构稳定、复杂有序且具有某些特定功能的分子聚集体或超分子结构。而后通过核酸拓扑异构酶引入超螺旋得到稳定性强，与外源分子结合力强的的新型核酸纳米网状结构。
本发明是通过以下技术方案实现的：
1.环状模板链(T1、T2、T3)、成环短链(L1、L2、L3)的设计
本研究所使用的三条DNA长链来源于，三个环状DNA分子。每个环状DNA分子具有四个区域依次分别为结合位点1(I)、活性位点1(II)、结合位点2(III)、活性位点2(IV)。由此环状DNA分子经等温扩增得到的DNA长链分子具有多个重复序列单元，每个重复序列单元具有四个区域，依次分别为I、II、III、IV。
三个环状DNA分子的四个区域的排布分别为：
环状DNA分子一：A、M、B、N。
环状DNA分子二：A’(与A反义互补)、P、C、Q。
环状DNA分子三：B’(与B反义互补)、X、C’(与C反义互补)、Y。
由这三个环状DNA分子得到的DNA长链分子的区域排布分别为：
长链DNA分子一的模式：为A-M-B-N-(-A-M-B-N-)n-A-M-B-N；
长链DNA分子二的模式为A’-P-C-Q-(-A’-P-C-Q-)n-A’-P-C-Q；
长链DNA分子三的模式为：B’-X-C’-Y-(-B’-X-C’-Y-)n-B’-X-C’-Y。
三个环状DNA分子分别使用三条与DNA环状分子等长的线性DNA分子(T1、T2和T3)与另外三个DNA短链分子(L1、L2、L3)两两配对合成。
具体而言，T1的3’端片段与L1的5’端片段反义互补，T1的5’端片段与L1的3’端片段反义互补，且形成的DNA分子为T1的3’端与T1的5’端能够在L1的作用下紧密临近，形成不闭合的不完全双链DNA环状分子。该环状分子能够被DNA连接酶连接，产物为单链闭合的环状DNA分子(由T1连接而成)结合一个短的线性DNA分子(L1)。
T2与L2；T3与L3，同T1与L1的关系。
依据上述原则合成环状模板链(T1、T2、T3)以及成环短链(L1、L2、L3)。
2.单链环状DNA分子的合成
(1)将L分子以及与它匹配的T分子稀释到10mM，依据1∶1比例混合。
(2)取T4连接酶依据说明书加入适当成分。
(3)依据说明书使用恒温装置(PCR仪、水浴锅、金属浴等)在最适反应温度下反应相应的时间。
(4)反应结束后加热至94℃灭活10min。
(5)使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测链接产物。
(6)如果出现分子量与环状DNA分子分子量相应的条带或者出现分子量与环状DNA分子分子量整倍数相应的条带，则证明链接可能成功。
3.纯化
取连接产物加入五倍体积4℃预冷的冰乙醇加入装有产物的PCR管中，在-20℃下静置5min，而后使用高速离心机在12000rpm(转头直径大于12cm)下离心5min，完成后，倒掉上清液，待产物自然风干完全后，加入30μL的双蒸水放入-20℃冰箱中保存待用。
三个环状模板链和对应的成环短链分别使用相同的方法进行连接，合成单链环状DNA分子。
4.RCA滚环扩增
在成环短链的DNA分子的3’端具有活性的基础上，使用具有链置换功能的DNA聚合酶(如Bst DNA聚合酶)进行滚环扩增，具体步骤为：
(1)取Bst DNA聚合酶，依据说明书配置RCA滚环扩增反应混合物。
(2)加入连接产物2μL。
(3)使用恒温装置(PCR仪、水浴锅、金属浴等)65℃孵育该混合物4h。
(4)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
(5)如能观察到分子量大于10000bp的DNA扩增产物则证明得到了所需的长链。
三个单链环状DNA分子分别使用相同的方法进行扩增得到对应的长链。
5.长链DNA分子褪火成网
(1)使用紫外分光光度计依次检测三条长链DNA分子的产物浓度。
(2)依据长链DNA分子的物质的量比1∶1∶1的比例，混合三个长链DNA分子。
(3)加热混合物至95℃恒温20min，逐渐降温，降温至37℃。
(4)加入DNA拓扑异构酶反应混合液，(DNA拓扑异构酶反应混合液依据说明书配置)，37℃孵育2h。
(5)孵育结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测成网产物。
(6)如发现泳道中无DNA样本所形成的条带，而胶孔附近有大量DNA样本则证明成网反应成功，此时DNA网由于分子量过大不能进入琼脂糖凝胶。
6.原子力显微镜(AFM)观察DNA网状结构
将构造所得DNA产物在AFM下观察并拍照，以确证是否获得DNA网状结构。
附图说明
图1为预期得到的核酸纳米网状结构的部分示意图(未加拓扑异构酶修饰)。
图中所示合成的三条DNA链冷却之后互补配对，形成一种二级网状结构。
图2为使用拓扑异构酶修饰后预期的核酸纳米网状结构部分示意图。
图3为拓扑异构酶修饰后期望得到的核酸纳米网状结构。
此时的网状结构和图1所示的网状结构序列相同，结构相似，不同点在于用拓扑异构酶作用后该网状结构由于加入了超螺旋，形成了稳定的网状结构。
图4为实施例1中模板链连接成环产物使用琼脂糖凝胶电泳检测显示连接成功的特异性片段。
图中M为Marker，1，2泳道为环1多阶产物；3，4泳道为环2多阶产物；5，6泳道为环3多阶产物。图中可见多条条带，为链接形成的不同长度的多阶产物。
图5为在原子力显微镜下混合成功产物的形态结构。
图中可以看出，在微观层面我们已经形成了所预期的结构。
具体实施方式
实施例1
1.环状模板链(TP1、TP2、TP3)、成环短链(LP1、LP2、LP3)的设计依据设计原理设计三条100bp的DNA单链，分别为TP1、TP2、TP3。
其中TP1的核苷酸序列为：
TAGCA AGCTT CCTAC TCCGT CATGC AAGTT TTAAC TACTA CTGCAGTCTC TTGCG AGCCC TGTCC GTTCA CTACT GCGCT CGTCG GACCTGATGT GGAGA。
其模式为A、M、B、N。
A区的序列为TCATG CAAGT TTTAA CTACT ACTGC AGTCTC；
B区的序列为ACTAC TGCGC TCGTC GGACC TGATG TGGAG A。
其促环LP1促环引物的核苷酸序列为：
ACGGA GTAGG AAGCT TGCTA TCTCC ACATC AGGTC CGACG。
该序列中包括既能够和TP1的5’端20nt又可以与3’端20nt互补配对的序列。
TP2的核苷酸序列为：
TAGCA AGCTT CCTAC TCCGG AGACT GCAGT AGTAG TTAAA ACTTGCATGA TTGCG AGCCC TGTCC GTTCA CTTCA CACCC CAGCT AAATAGAGGC ACAAG；
其模式为：A’、P、C、Q。
A’区的序列为GAGAC TGCAG TAGTA GTTAAAACTTG CATGA；
C区的序列为ACTTC ACACC CCAGC TAAAT AGAGG CACAA G。
LP2促环引物的核苷酸序列为：
CTTGT GCCTC TATTT AGCTG CCGGA GTAGG AAGCT TGCTA。
该序列中包括既能够和TP2的5’端20nt又可以与3’端20nt互补配对的序列。
TP3的核苷酸序列为：
TCTCC ACATC AGGTC CGACG AGCGC AGTAG TTTGC GAGCC CTGTCCGTTC CTTGT GCCTC TATTT AGCTG GGGTG TGGGG TTAGC AAGCTTCCTA CTCCG。
其模式为：B’、P、C’、Q。
B’区的序列为TCTCC ACATC AGGTC CGACG AGCGC AGTAG T
C’区的序列为CTTGT GCCTC TATTT AGCTG GGGTG TGGGG T
LP3的促环引物的核苷酸序列为：
CGTCGGACCTGATGTGGAGACGGAGTAGGAAGCTTGCTAA。
该序列中包括既能够和TP3的5’端20nt又可以与3’端20nt互补配对的序列。
其余区域为非匹配区。
2.单链环状DNA分子的合成
(1)将LP1、LP2、LP3分子以及与它匹配的TP1、TP2、TP3分子稀释到10mM，将LP1与TP1依据1∶1比例混合；将LP2与TP2依据1∶1比例混合；LP3与TP3依据1∶1比例混合。
(2)取T4连接酶依据说明书加入适当成分。
(3)依据说明书使用恒温装置(PCR仪、水浴锅、金属浴等)在16℃下反应12小时。
(4)反应结束后加热至94℃灭活10min。
(5)使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测链接产物。
(6)发现分子量为100bp以及相当于100的整数倍碱基对所折合分子量的相对应的条带，证明链接可能成功。
3.纯化
取LP1与TP1的连接产物100uL，加入五倍体积4℃预冷的冰乙醇加入装有产物的PCR管中，在-20℃下静置5min，而后使用高速离心机在12000rpm(转头直径大于12cm)下离心5min，完成后，倒掉上清液，待产物自然风干完全后，加入30μL的双蒸水放入-20℃冰箱中保存待用。
使用同样的方法处理LP2与TP2的连接产物和LP3与TP3的连接产物。
4.RCA滚环扩增
(1)取Bst DNA聚合酶，依据说明书配置RCA滚环扩增反应混合物。
(2)分别取3管反应混合物，每管取23μL。
(3)每管内加入连接产物2μL。各管分别加入LP1与TP1的连接产物、LP2与TP23的连接产物、LP3与TP3的连接产物。
(4)使用PCR仪65℃孵育该混合物4h。
(6)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
(7)观察到分子量大于10000bp的DNA扩增产物，证明得到了所需的长链。
5.长链DNA分子褪火成网
(1)使用紫外分光光度计依次检测三条长链DNA分子的产物浓度。
(2)依据长链DNA分子的物质的量比1∶1∶1的比例，混合三个长链DNA分子。
(3)取混合物25μL，加热混合物至95℃恒温20min，逐渐降温，降温速度为0.5℃/min降温至37℃。
(4)加入DNA拓扑异构酶反应混合液，(含DNA拓扑异构酶III 2μL约200U)，37℃孵育2h。
(5)孵育结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测成网产物。
(6)发现泳道中无DNA样本所形成的条带，而胶孔附近有大量DNA样本，证明成网反应成功，此时DNA网由于分子量过大不能进入琼脂糖凝胶。
6.原子力显微镜(AFM)观察DNA网状结构
将构造所得DNA产物在AFM下观察并拍照，能够观察到相应的网状结构。
7.稳定性比较
取本实施例中的5.(3)步骤中的混合物25μL，加热混合物至95℃恒温20min，骤冷至4℃。将所得DNA产物在AFM下观察并拍照，不能够观察到网状结构。证明拓扑异构酶的作用确实起到了引入超螺旋，提高DNA纳米网稳定性的作用。
8.与外源分子结合能力分析
(1)取本实施例5.(6)验证过的DNA网状结构溶液25μL，加入能够和非匹配区的DNA单链通过碱基互补配对结合的DNA单链，该单链的5’端进行地高辛标记。
(2)加热混合物至95℃恒温20min，然后按本实施例中5.(3)的步骤逐渐降温处理。
(3)取混合物加入1倍体积冰乙醇，10000rpm离心5分钟，此时分子量巨大的DNA网状结构以沉淀的形式存在，而小分子量的DNA单链则在溶液中。将得到的DNA网状结构溶液滴加在载玻片上，加热固定。
(4)向载玻片上均匀涂布一层标记荧光基团的地高辛抗体溶液，而后进入荧光显微镜，使用该荧光基团发射光波长的滤光片观察载玻片。
(5)可见在滴加网状结构的位置形成明显的光斑，证明其具备与外源分子结合的能力。
实施例2：
1.环状模板链(TF1、TF2、TF3)、成环短链(LF1、LF2、LF3)的设计
本实施例以三条290nt长度的DNA单链(以下分别简称TF1、TF2、TF3)为模板，构建核酸纳米网状结构。
其中TF1的核苷酸序列为：
ACTATCAGTACGATATTCAGCACTGTAGCAATGACGACCTCCTTCTGCAGTAAGGACCCGAGGAGGGTAAGAATGGTCGGCTTGTATCCCCGCACGACCAACATGGACGTTGATTATGGTAAGCTTATGGATTCATCACAGCGTTTGTGTTATGCTAAGCATCAGAACAGTCATGCCTAACATATGCAGAATTCATTCGTTGACAGGGTCACTAGAGGAAGCCAAGTTGCTCTGAGGCGTCCTTGTCAGATAGGCCTAAATATAAGTGAAAAATCTGTAACTTTTAATC。
其模式为A、M、B、N。
其促环LF1促环引物的核苷酸序列为：
TACAAGCCGACCATTCTTACCCTCCTCGGGTCCTTACTGCAGAAGGAG。
该序列中包括既能够和TF1的5’端又可以与3’端互补配对的序列。
TF2的核苷酸序列为：
ACCCTGTCAACGAATGAATTCTGCATATGTTAGGCATGACTGTTCTGATGCTTAGCATAACACAAAGTGCGCAGCGGATTATGAGCATCTGACTTAAGCTTCTTTTCTCTATCTTGAACGATCGAGTAGCAGTCTTTACTAAAACTTGGGCATGTCGCCGGTACCGAAACATTGTCATCAAGATTTCGGTGCTGGACGCACGGATAAGACGTCCTTGTCAGATAGGCCTAAATATAAGTGAAAAATCTGTAACTTTTAATCCCTCACGAGCAACTTGGCTTCCTCTAGTG。
其模式为：A’、P、C、Q。
LF2促环引物的核苷酸序列为：
ATATGCAGAATTCATTCGTTGACAGGGTCACTAGAGGAAGCCAAGTTGCTCGTGAG。
该序列中包括既能够和TF2的5’端又可以与3’端互补配对的序列。
TF3的核苷酸序列为：
TGATGACAATGTTTCGGTACCGGCGACATGCCCAAGTTTTAGTAAAGACTGCTACTCGATCGTTAAGTGCGCAGCGGATTATGAGCATCTGACTTAAGCTTCTTTTCTCTATCTTGGCGGGGATACAAGCCGACCATTCTTACCCTCCTCGGGTCCTTACTGCAGAAGGAGGTCGTCATTGCTACAGTGCTGAATATCGTACTGATAGTCGTCCTTGTCAGATAGGCCTAAATATAAGTGAAAAATCTGTAACTTTTAATCTCTTATCCGTGCGTCCAGCACCGAAATCT。
其模式为：B’、P、C’、Q。
LF3的促环引物的核苷酸序列为：
TGTCGCCGGTACCGAAACATTGTCATCAAGATTTCGGTGCTGGACGCACGGATAAG
该序列中包括既能够和TF3的5’端又可以与3’端互补配对的序列。
其余区域为非匹配区。
2.单链环状DNA分子的合成
(1)将LF1、LF2、LF3分子以及与它匹配的TF1、TF2、TF3分子稀释到10mM，将LF1与TF1依据1∶1比例混合；将LF2与TF2依据1∶1比例混合；LF3与TF3依据1∶1比例混合。
(2)取T4连接酶依据说明书加入适当成分。
(3)依据说明书使用恒温装置(PCR仪、水浴锅、金属浴等)在16℃下反应12小时。
(4)反应结束后加热至94℃灭活10min。
(5)使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测链接产物。
(6)发现分子量为300bp以及相当于300的整数倍碱基对所折合分子量的相对应的条带，证明链接可能成功。
3.纯化
取LF1与TF1的连接产物100μL，加入五倍体积4℃预冷的冰乙醇加入装有产物的PCR管中，在-20℃下静置5min，而后使用高速离心机在12000rpm(转头直径大于12cm)下离心5min，完成后，倒掉上清液，待产物自然风干完全后，加入30μL的双蒸水放入-20℃冰箱中保存待用。
使用同样的方法处理LF2与TF2的连接产物和LF3与TF3的连接产物。
4.RCA滚环扩增
(1)取Bst DNA聚合酶，依据说明书配置RCA滚环扩增反应混合物。
(2)分别取3管反应混合物，每管取23μL。
(3)每管内加入连接产物2μL。各管分别加入LF1与TF1的连接产物、LF2与TF23的连接产物、LF3与TF3的连接产物。
(4)使用PCR仪65℃孵育该混合物4h。
(8)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
(9)观察到分子量大于10000bp的DNA扩增产物，证明得到了所需的长链。
5.长链DNA分子褪火成网
(1)使用紫外分光光度计依次检测三条长链DNA分子的产物浓度。
(2)依据长链DNA分子的物质的量比1∶1∶1的比例，混合三个长链DNA分子。
(3)取混合物25μL，加热混合物至95℃恒温20min，逐渐降温，降温速度为0.5℃/min降温至37℃。
(4)加入DNA拓扑异构酶反应混合液，(含DNA拓扑异构酶III 2μL约200U)，37℃孵育2h。
(5)孵育结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测成网产物。
(6)发现泳道中无DNA样本所形成的条带，而胶孔附近有大量DNA样本，证明成网反应成功，此时DNA网由于分子量过大不能进入琼脂糖凝胶。
6.原子力显微镜(AFM)观察DNA网状结构
将构造所得DNA产物在AFM下观察并拍照，能够观察到相应的网状结构。

Claims (8)

1.一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构及制备方法，其特征在于，一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构，该结构由三条不同的长链DNA组成。
2.根据权利要求1所述的一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构，其特征在于，这三条不同的DNA长链，每条都具有多个重复序列单元，每个重复序列单元具有四个区域，长链分子一的模式为A-M-B-N-(-A-M-B-N-)n-A-M-B-N；长链DNA分子二的模式为A’-P-C-Q-(-A’-P-C-Q-)n-A’-P-C-Q；长链DNA分子三的模式为：B’-X-C’-Y-(-B’-X-C’-Y-)n-B’-X-C’-Y；其中A’与A反义互补，B’与B，C’与C反义互补。
3.根据权利要求1所述的一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构，其特征在于，这三条长链组成的DNA纳米网状结构，在彼此之间的双链配对区存在DNA超螺旋。
4.根据权利要求1所述的一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构，其特征在于，这三条长链组成的DNA纳米网状结构，在彼此之间的非双链配对区存在能够和其他核酸分子结合的DNA单链。
5.一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构的制备方法，其特征在于，使用滚环扩增的方法制备三条不同的DNA长链。
6.根据权利要求5所述的一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构的制备方法，其特征在于，使用三条线性DNA分子与另外三个DNA短链分子两两配对DNA环形分子，该DNA环形分子的碱基序列又线性DNA分子决定，其序列具有以下特点，环状DNA分子一的区域为A、M、B、N；环状DNA分子二的区域为A’(与A反义互补)、P、C、Q；环状DNA分子三：B’(与B反义互补)、X、C’(与C反义互补)、Y。
7.根据权利要求5所述的一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构的制备方法，其特征在于，长链DNA分子褪火成网的方法为，将使用紫外分光光度计依次检测三条长链DNA分子的产物浓度；依据长链DNA分子的物质的量比1∶1∶1的比例，混合三个长链DNA分子；加热混合物至95℃恒温20min，逐渐降温降温速度为每分钟0.5摄氏度，降温至37℃。
8.根据权利要求5所述的一种新型基于拓扑异构酶的核酸纳米网状结构的制备方法，其特征在于，取DNA长链混合——加热——降温后的混合物25μL，加入DNA拓扑异构酶III 200U，37℃孵育2h，处理DNA纳米网状结构，引入超螺旋。
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