ES2265688T3 - Sondas inhibidoras reversibles. - Google Patents
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Abstract
Una sonda señuelo purificada que contiene: una primera región de secuencia de reconocimiento de bases nucleotídicas formada por ácidos nucleicos, región que posee una similitud de secuencia de al menos el 35% con una secuencia promotora de la RNA polimerasa seleccionada del grupo formado por una secuencia promotora de la T7 RNA polimerasa, una secuencia promotora de la T3 RNA polimerasa y una secuencia promotora de la SP6 RNA polimerasa; y una segunda región de secuencia de reconocimiento de bases nucleotídicas unida directamente al extremo 5¿ de la primera región o al extremo 3¿ o el 5¿ de la primera región mediante una o varias fracciones químicas que no contienen un grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas que pueda funcionar como un molde en una reacción de la polimerasa, en la que dichas fracciones químicas forman un enlace estable bajo condiciones de amplificación; siempre y cuando, si dicha primera región se puede utilizar para producir un promotor funcional de doble cadena empleando un oligonucleótido complementario, entonces dicha sonda no posea una secuencia de ácido nucleico de longitud mayor de 10 nucleótidos unida directamente al extremo 3¿ de la primera región y dicha sonda no posea un extremo 3¿ que pueda participar en una reacción de la polimerasa.
Description
Sondas inhibidoras reversibles.
La presente invención comprende composiciones,
reactivos y métodos para la potenciación de un protocolo de
amplificación. Las composiciones, reactivos y métodos se utilizan
preferiblemente conjuntamente con un protocolo de amplificación
asociado a la transcripción conducida por una RNA polimerasa.
Ninguna de las referencias aquí descritas se
admite como técnica previa a la invención reivindicada.
La amplificación de ácido nucleico implica la
síntesis enzimática de amplicones de ácido nucleico que contienen
una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico que
está siendo amplificada. La amplificación de ácidos nucleicos se
puede realizar utilizando diferentes técnicas como en las que
interviene la amplificación asociada a la transcripción, la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de
la ligasa (LCR) y amplificación por desplazamiento de cadena
(SDA).
Los usos de la amplificación de ácidos nucleicos
incluyen aplicaciones de diagnóstico y de síntesis. Las aplicaciones
diagnósticas de la amplificación de ácidos nucleicos comprenden
habitualmente el cribado para saber si se han producido amplicones,
la cantidad de amplicones producida o para determinar si los
amplicones producidos contienen una secuencia en particular.
La amplificación asociada a la transcripción de
una secuencia de ácidos nucleicos utiliza generalmente una RNA
polimerasa, una DNA polimerasa, desoxirribonucleósidos trifosfato,
ribonucleósidos trifosfato y un oligonucleótido complementario
promotor-molde. El oligonucleótido complementario
promotor-molde contiene una secuencia 5' reconocida
por una RNA polimerasa y una secuencia 3' que hibrida con un ácido
nucleico molde en situación 3' de una secuencia que se pretende
amplificar. Tras la hibridación del oligonucleótido complementario
promotor-molde con el molde, se forma un promotor
de doble cadena en dirección 5' de la secuencia diana. La formación
de un promotor de doble cadena generalmente implica actividad DNA
polimerasa.
La amplificación asociada a RNA polimerasa se
inicia mediante la unión de una RNA polimerasa a una región del
promotor que generalmente es de doble cadena. La RNA polimerasa
avanza en dirección 3' de la región del promotor y sintetiza ácido
ribonucleico en dirección 5' a 3'. Mediante este método de
amplificación asociada a RNA polimerasa se pueden producir
múltiples copias con un único molde, generalmente del orden de 100 a
3000 tránscritos de RNA.
Se pueden utilizar diferentes formatos para
realizar la amplificación asociada a la transcripción. En diversas
publicaciones se pueden encontrar ejemplos de estos formatos
diferentes, por ejemplo en Burg et al., Patente
Estadounidense Núm. 5 437 990; Kathn et al., Patente
Estadounidense Núm. 5 399 491; Kacian et al., Patente
Estadounidense Núm. 5 554 516; Kacian et al., Núm. de
Solicitud Internacional PCT/US93/04015, Núm. de Publicación
Internacional WO 93/22461; Gingeras et al., Núm. de Solicitud
Internacional PCT/US87/ 01966, Núm. de Publicación Internacional WO
88/01302; Gingeras et al., Núm. de Solicitud Internacional
PCT/US88/02108, Núm. de Publicación Internacional WO 88/10315; Davey
and Malek, Núm. de Patente Europea 88113948.9, Núm. de Publicación
Europea 0 329 822 A2; Malek et al., Patente Estadounidense
Núm. 5 130 238; Urdea, Núm. de Solicitud Internacional
PCT/US91/00213, Núm. de Publicación Internacional WO 91/10746;
McDonough et al., Núm. de Solicitud Internacional,
PCT/US93/07138, Núm. de Publicación Internacional WO 94/03472; y
Líder et al., Núm. de Solicitud Internacional PCT/US94/08307,
Núm. de Publicación Internacional WO 95/03430.
La amplificación por PCR está descrita por
Mullis et a1., Núms. de Patente Estadounidense 4.683.195,
4.683.202 y 4.800.159, y en Methods in Enzymology,
155:335-350 (1987).
En la publicación de patente europea Núm. 320
308 se describe un ejemplo de LCR. Esta técnica utiliza al menos
cuatro oligonucleótidos separados. Dos de los oligonucleótidos
hibridan con un molde de ácido nucleico de modo que el extremo 3'
de un oligonucleótido y el extremo 5' del otro se encuentran
situados en posición de ligación. Una vez tiene lugar esta ligación
de los oligonucleótidos hibridados, éstos forman un complemento de
la secuencia diana en toda su longitud en el molde de ácido
nucleico. Seguidamente, se desnaturaliza el ácido nucleico de doble
cadena, y se hibridan los oligonucleótidos tercero y cuarto con la
cadena complementaria y se unen entre sí. La amplificación se
consigue mediante posteriores ciclos de hibridación, ligación y
desnaturalización, produciendo múltiples copias de la secuencia
diana y de la secuencia complementaria a ésta.
La SDA es una reacción de amplificación
isotérmica que se basa en la capacidad que posee una enzima de
restricción de cortar la cadena no modificada de una forma de
hemifosforotioato de su sitio de reconocimiento, y en la capacidad
de una DNA polimerasa para iniciar la replicación en la muesca y
desplazar una cadena no molde en dirección 3'. (Véase, p. ej.,
Walker, PCR Methods and Applications, 3:25-30
(1993), Walker et al., Nucleic Acids Res.,
20:1691-1996 (1992) y Walker et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 89:392-396 (1991). Se indica que
los pasos utilizados en la generación de fragmentos para llevar a
cabo una amplificación SDA autocatalítica son adaptables para la
generación de fragmentos destinados a la amplificación asociada a la
transcripción o a la amplificación realizada utilizando tecnología
Q-beta. (Walker et al., Nucleic Acids
Res., 20:1691-1696 (1992)).
Savinkova et al. (Mol. Biol. (Moscú)
1988, 22(3), 807-812) describen
oligonucleótidos sintéticos relacionados con las regiones -10 de
los promotores de E. coli. Estos oligonucleótidos se unen a
las cadenas no transcritas del promotor. Los oligonucleótidos
sintéticos que se unen a las cadenas de DNA no transcritas pueden
inhibir la síntesis de RNA catalizada por la RNA polimerasa de
E. coli.
WO 96/41010 está dirigida a un método de
selección de ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que se unen
a DNA polimerasas, más específicamente polimerasas termoestables
como las polimerasas Taq y Tth. Estos ligandos facilitan la
reducción de amplificación de fondo en los procesos de
polimerización. La formación de casquete en los extremos 3' de los
ligandos de alta afinidad evita la extensión de dichos ligandos. La
selección de ligandos se realiza a través del método SELEX y puede
modificarse químicamente en la fracción de ribosa, de fosfato o de
la base para mejorar sus propiedades de unión. Los ligandos se
pueden utilizar en la PCR para mejorar la amplificación específica
del ácido nucleico diana. La adición de ligandos a temperatura
ambiente permite evitar amplificaciones no deseadas de secuencias
de DNA no relacionadas que están presentes en las muestras
biológicas de forma natural. El empleo de ligandos de alta afinidad
permite la detección precisa de moléculas de DNA diana.
La presente invención comprende inhibidores de
la amplificación independiente de diana y la utilización de estos
inhibidores para potenciar un protocolo de amplificación. Se cree
que los inhibidores potencian un protocolo de amplificación
mediante la inhibición de la capacidad de una o más polimerasas de
ácido nucleico para utilizar ácido nucleico en una reacción de la
polimerasa en ausencia de ácidos nucleicos diana.
La "amplificación independiente de diana"
hace referencia a la amplificación de una secuencia de ácido
nucleico que no es una secuencia de ácido nucleico diana. La
secuencia de ácido nucleico diana está presente en un ácido
nucleico diana y se trata de una secuencia, o región, de bases
nucleotídicas que se pretende amplificar.
Se cree que la presente invención aporta
beneficios a la amplificación de ácidos nucleicos mediante el uso
de competidores de oligonucleótidos de amplificación para secuestrar
enzimas de amplificación en solución respecto de los ácidos
nucleicos no diana como los oligonucleótidos de amplificación.
Parece ser que los competidores compiten con los oligonucleótidos
de amplificación en la unión con una o varias enzimas de
amplificación y pueden añadirse en una cantidad en exceso relativa
a los oligonucleótidos de amplificación.
En ausencia de ácido nucleico diana, las enzimas
de amplificación afectadas son ocupadas por los competidores y se
inhibe la capacidad de las enzimas para participar en una reacción
de la polimerasa en la que intervienen ácidos nucleicos no diana.
Los oligonucleótidos de amplificación hibridados con el ácido
nucleico diana compiten favorablemente con los competidores por la
unión con las enzimas de amplificación. Por lo tanto, los
competidores actúan como inhibidores reversibles de enzimas de
amplificación.
Las enzimas de amplificación son polimerasas de
ácidos nucleicos que catalizan la síntesis de polinucleótidos
mediante la polimerización de nucleósidos trifosfato. La inhibición
reversible de enzimas de amplificación se realiza para evitar la
formación de productos secundarios no deseados, como uno o varios de
los siguientes: (1) un dímero de cebadores; (2) un ácido nucleico
de replicación de RNA; (3) un RNA o DNA de cadena única extendido
mediante cebador; y (4) una modificación en un cebador de modo que
inhabilite su participación en la amplificación de una secuencia de
ácidos nucleicos diana. Los tipos de productos secundarios no
deseados que se pueden generar dependerán del protocolo de
amplificación en concreto que se siga.
Los oligonucleótidos de amplificación hibridan
con el ácido nucleico diana y participan en una reacción de
amplificación. Algunos ejemplos de oligonucleótidos de amplificación
son sondas complementarias al molde, como los cebadores, o sondas
complementarias al molde-promotor, como los
cebadores-promotores.
A pesar de que se espera que los inhibidores de
la amplificación independiente de diana descritos por la presente
invención actúen compitiendo con los oligonucleótidos de
amplificación por la unión a una enzima de amplificación, excepto
en el caso de que en las reivindicaciones se especifique lo
contrario, las reivindicaciones no se limitan a un mecanismo en
particular. Por ejemplo, las sondas que poseen un elevado grado de
similitud de secuencia con un promotor de RNA polimerasa que
potencia un protocolo de amplificación se describen en los ejemplos
que se proporcionan más adelante. Estos ejemplos ilustran la
efectividad de dichas sondas y permiten el diseño de sondas basado
en la similitud de secuencia con un promotor de RNA polimerasa sin
determinar la unión enzimática o la capacidad de competir con
oligonucleótidos de amplificación.
Por tanto, un primer aspecto de la presente
invención describe una sonda señuelo que contiene:
una primera región de secuencias de
reconocimiento de bases nucleotídicas formada por ácidos nucleicos,
que tiene una similitud de secuencia de al menos el 35% con una
secuencia promotora de RNA polimerasa seleccionada a partir del
grupo formado por una secuencia del promotor de la T7 RNA
polimerasa, una del promotor de la T3 RNA polimerasa o una del de
la SP6 RNA polimerasa; y
una segunda región de secuencias de
reconocimiento de bases nucleotídicas unida directamente al extremo
5' de la primera región o al extremo 3' o 5' de la primera región
mediante una o varias fracciones químicas que no contienen un grupo
de reconocimiento de bases nucleotídicas que pueden funcionar como
un molde en una reacción de la polimerasa, en la que las fracciones
químicas forman un ligamiento estable bajo condiciones de
amplificación,
siempre y cuando en el caso de que se pueda
utilizar la primera región para producir una secuencia promotora de
doble cadena funcional mediante un oligonucleótido complementario,
entonces la sonda no tenga una secuencia de ácido nucleico mayor de
10 nucleótidos de longitud unida directamente al extremo 3' de la
primera región y que la sonda no tenga un extremo 3' que pueda
participar en una reacción de la polimerasa.
La presencia de una segunda región situada 3' o
5' de la primera no impide la presencia de otras regiones. Por
ejemplo, la sonda señuelo puede contener una segunda región en
posición 3' respecto de la primera y también puede contener una
región unida directamente o a través de un ligador no nucleotídico
al extremo 5' de la primera región.
La sonda señuelo es probablemente una sonda
purificada. Por "purificada" se entiende que la sonda señuelo
constituye al menos el 0,1% de las moléculas de reconocimiento que
están presentes en la preparación. En realizaciones preferidas, la
sonda señuelo constituye al menos un 1%, al menos un 5%, al menos un
25%, al menos un 50%, al menos un 75% o el 100% del ácido nucleico
presente en una preparación.
Una "molécula de reconocimiento de secuencias
de bases nucleotídicas" es una molécula que contiene grupos de
reconocimiento de bases nucleotídicas unidos entre sí por un
esqueleto. Algunos ejemplos de moléculas de reconocimiento de
secuencias de bases nucleotídicas son ácidos nucleicos peptídicos,
oligonucleótidos o derivados de los mismos. Un grupo de
reconocimiento de bases nucleotídicas se puede unir por hidrógeno a
adenina, guanina, citosina, timina o uracilo. El esqueleto presenta
los grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas en una
conformación adecuada para la unión mediante puentes de hidrógeno a
un nucleótido complementario presente en una secuencia de ácido
nucleico.
Una "secuencia promotora de doble cadena
funcional" es una secuencia que reconoce una RNA polimerasa y que
puede utilizarse para generar tránscritos de RNA fácilmente
detectables. Un promotor de doble cadena funcional puede estar
formado a partir de una secuencia promotora de cadena única, por
ejemplo mediante la hibridación de la secuencia promotora con un
oligonucleótido complementario.
Un "ligador no nucleotídico" hace
referencia a una o varias fracciones químicas que forman un enlace
estable bajo condiciones de amplificación y que no contienen un
grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas que pueda funcionar
como molde en una reacción de la polimerasa.
La sonda señuelo que se une a una RNA polimerasa
puede medirse utilizando técnicas estándar, como a través del uso
de medios competitivos y no competitivos utilizando oligonucleótidos
marcados con una secuencia promotora de RNA polimerasa. Además,
pueden seleccionarse oligonucleótidos que se unen a RNA polimerasas
y producirse en grandes cantidades utilizando el "Protocolo de
amplificación de unión de proteínas" descrito infra.
Otro aspecto de la presente invención describe
un método para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana
bajo condiciones de amplificación asociadas a la transcripción que
comprende los pasos de:
(a) producir una mezcla que comprende una RNA
polimerasa y la sonda señuelo de cualquiera de las reivindicaciones
l a 12, en la que la sonda señuelo no hibrida con un ácido nucleico
diana que comprende la secuencia de ácido nucleico diana bajo las
condiciones de amplificación, y en la que la mezcla no contiene el
ácido nucleico;
(b) combinar la mezcla con la secuencia de ácido
nucleico diana y oligonucleótidos de amplificación capaces de
amplificar la secuencia de ácido nucleico diana; y
(c) amplificar la secuencia de ácido nucleico
diana bajo las condiciones de amplificación, en la que el paso de
amplificación se lleva a cabo usando los oligonucleótidos de
amplificación y la RNA polimerasa;
en la que no están presentes en la mezcla los
oligonucleótidos de amplificación combinados con la mezcla en el
paso (b) antes del paso (b), y
en la que los oligonucleótidos de amplificación
y la sonda señuelo compiten por unirse a la RNA polimerasa.
Las ventajas esperadas de la presente invención
incluyen una o más de las siguientes: (1) aumento del rendimiento
de los amplicones complementarios diana (2) aumento de la
sensibilidad; y (3) aumento de la disponibilidad de las polimerasas
para la amplificación de la diana. Tales ventajas se espera que
surjan de la reducción de los productos secundarios indeseados.
Otra ventaja de la presente invención es que
puede emplearse a una temperatura casi constante. A una temperatura
casi constante, la reacción no se cicla entre una temperatura alta y
baja para desnaturalizar alternativamente e hibridar el ácido
nucleico, como lo que ocurre en una PCR.
Se utilizan varios ejemplos en la solicitud.
Estos ejemplos no intentan de ninguna manera limitar la invención
reivindicada.
Otras características y ventajas serán evidentes
en las siguientes figuras, descripción detallada de la invención,
ejemplos, y reivindicaciones.
Las figuras 1A y 1B ilustran un posible
mecanismo de competición entre las sondas señuelo y los cebadores
de amplificación sin unir para las enzimas de amplificación en una
amplificación asociada a la transcripción. La Figura 1A ilustra un
esquema de amplificación en ausencia de sondas señuelo. La Figura lB
ilustra sondas señuelo que inhiben la formación de productos
secundarios.
Las Figuras 2A y 2B ilustran dos ejemplos de
sondas señuelo. La sonda señuelo mostrada en la Figura 2A es un
oligonucleótido de cadena sencilla con un extremo 5'
autocomplementario que forma un lazo. La sonda señuelo mostrada en
la Figura 2B contiene dos regiones de oligonucleótidos unidas junto
a sus extremos 5' para formar una sonda señuelo con dos extremos
3'. Los tres grupos carbono (-ccc) ilustrados en las Figuras 2A y 2B
son grupos bloqueadores de propilo unidos a los extremos 3'.
La Figura 3 ilustra los resultados de un
experimento que examina el efecto de una sonda señuelo bloqueada de
ID. de SEC. Núm.: 10 sobre la cinética de amplificación asociada a
la transcripción de T7 del virus de la hepatitis C (VHC). El tiempo
de amplificación se refiere al periodo de tiempo que sigue a la
adición del reactivo enzimático. Las reacciones (volumen de
reacción de 20 \muL) se finalizaron con la adición de reactivo de
sonda HPA. Los resultados sin la presencia de sondas señuelo se
indican con un "-\blacklozenge-". Los resultados con
presencia de sondas señuelo se indican con un
"-\blacksquare-".
La Figura 4 ilustra los resultados de un
experimento que examina el efecto de una sonda señuelo bloqueada de
ID. de SEC Núm. 10 sobre la cinética de la amplificación asociada a
la transcripción de T7 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH).
El tiempo de amplificación se refiere al periodo de tiempo que sigue
a la adición del reactivo enzimático. Las reacciones se finalizaron
con la adición de reactivo de sonda HPA. Los resultados sin la
presencia de sondas señuelo se indican con un
"-\blacklozenge-". Los resultados con presencia de sondas
señuelo se indican con un "-\blacksquare-".
La Figura 5 ilustra los resultados de un
experimento que examina el efecto de una sonda señuelo bloqueada de
ID. de SEC Núm. 10 sobre la cinética de la amplificación asociada a
la transcripción de T3 del VIH. El tiempo de amplificación se
refiere al periodo de tiempo que sigue a la adición del reactivo
enzimático. Las reacciones se finalizaron con la adición de
reactivo de sonda HPA. Los resultados sin la presencia de sondas
señuelo se indican con un "-\blacklozenge-". Los resultados
con presencia de sondas señuelo se indican con un
"-\blacksquare-".
La presente invención comprende composiciones,
reactivos y métodos para la potenciación de un protocolo de
amplificación. Se cree que la presente invención potencia la
amplificación al proporcionar medios para secuestrar enzimas de
amplificación de los oligonucleótidos de amplificación que no están
hibridados con un ácido nucleico diana.
Las Figuras 1A y 1B ilustran un posible
mecanismo mediante el cual se potencia la amplificación con el
empleo de inhibidores reversibles (p. ej., sondas señuelo) de
enzimas de amplificación. El mecanismo ilustrado implica una
amplificación asociada a la transcripción y muestra una inhibición
de la capacidad de la transcripción inversa y la RNA polimerasa
para producir productos no deseados.
La parte superior de la Figura 1 ilustra la
amplificación en ausencia de inhibidores reversibles de enzimas de
amplificación (p. ej., señuelos) y la parte inferior de la Figura 1
ilustra la amplificación en presencia de inhibidores reversibles de
enzimas de amplificación (p. ej., señuelos).
Se cree que las sondas señuelo se unen a las
enzimas de amplificación, ocupando de este modo las enzimas y
reduciendo la capacidad de estas últimas para formar productos no
deseados utilizando oligonucleótidos de amplificación.
La presente invención se utiliza preferiblemente
para incrementar el número de productos de amplicón específicos de
diana y minimizar los productos no deseados que consumen los
reactantes y los recursos del sistema de forma no productiva. Al
maximizar la cantidad de producto de amplicón diana específico y
reducir los productos no deseados, es posible mejorar una o varias
características de la amplificación.
En esta sección se presentan las descripciones
junto con las realizaciones preferidas de algunos de los términos
aquí descritos. No se pretende aportar una descripción de todos los
términos utilizados sino más bien proporcionar una sección de
referencia para varios de éstos.
Las "condiciones de amplificación" se
refieren a unas condiciones compatibles con la polimerización de
ácidos nucleicos para producir una cadena complementaria utilizando
un molde de ácido nucleico y una polimerasa de ácido nucleico.
Estas condiciones incluyen la presencia de componentes de
amplificación necesarios como son enzimas, sustratos de nucleósidos
trifosfato, las condiciones del tampón y una temperatura adecuada.
Las condiciones específicas empleadas dependen del tipo de
amplificación que se lleve a cabo. Las condiciones para realizar
diferentes tipos de amplificación se conocen ampliamente en el
sector y aparecen ejemplificadas mediante las publicaciones aquí
citadas, como las comentadas anteriormente en los "ANTECEDENTES DE
LA INVENCIÓN". Algunos ejemplos de diferentes procedimientos de
amplificación que se ilustran en los "ANTECEDENTES DE LA
INVENCIÓN" son: amplificación asociada a la transcripción, PCR,
LCR y SDA.
Las condiciones de amplificación asociada a la
transcripción son aquellas compatibles con la amplificación
asociada a la RNA polimerasa que implica la producción de
tránscritos de RNA. Estas condiciones se conocen ampliamente en el
sector e incluyen los sustratos de nucleósidos trifosfato,
condiciones del tampón, temperatura, oligonucleótidos de
amplificación, RNA polimerasa y transcriptasa reversa adecuados.
Las condiciones de SDA son aquellas compatibles
con la amplificación por desplazamiento de cadena. Estas condiciones
son ampliamente conocidas en el sector e incluyen los sustratos de
nucleósidos trifosfato, condiciones del tampón, temperatura,
oligonucleótidos de amplificación, polimerasa de ácido nucleico y
enzima de restricción adecuados.
Las condiciones de amplificación por DNA
polimerasa son condiciones compatibles con la actividad DNA
polimerasa. Estas condiciones incluyen los sustratos de nucleósidos
trifosfato, condiciones del tampón y temperatura adecuados.
Un "oligonucleótido de amplificación" hace
referencia a un oligonucleótido opcionalmente modificado capaz de
participar en una reacción de amplificación. La composición de un
oligonucleótido de amplificación dependerá del esquema de
amplificación empleado. Algunos ejemplos de oligonucleótidos de
amplificación incluyen cebadores y
cebadores-promotores que pueden ser complementarios
a un molde inicial o a un molde complementario producido a partir
del inicial.
Un "oligonucleótido análogo" hace
referencia a un oligonucleótido opcionalmente modificado que posee
sustancialmente la misma secuencia de ácido nucleico que la
presente en un ácido nucleico diana en una región en dirección 5'
de la secuencia diana. El oligonucleótido análogo posee una
complementariedad suficiente para hibridar con el complemento del
ácido nucleico diana bajo condiciones de amplificación. El
oligonucleótido análogo puede contener una región no
complementaria, como una región promotora. El oligonucleótido
análogo pude contener una o varias modificaciones, como una
modificación que inhiba la actividad de la polimerasa de ácidos
nucleicos. Preferiblemente, el oligonucleótido análogo contiene al
menos unas 15 bases contiguas que son análogas a una región de
bases contiguas del ácido nucleico diana en al menos el 80%, más
preferiblemente en al menos el 90% y aún más preferiblemente en el
100%. El oligonucleótido análogo tiene una longitud de 15 a 60
nucleótidos opcionalmente modificados y, más preferiblemente, los
nucleótidos opcionalmente modificados son nucleótidos no
modificados.
Un "cebador análogo" se refiere a un
oligonucleótido análogo que contiene un extremo 3' que puede
participar en una reacción de la polimerasa de ácidos nucleicos. La
región 5' del cebador análogo puede ser no complementaria con el
ácido nucleico diana y puede ser, por ejemplo, una secuencia
promotora que daría lugar a un cebador-promotor
análogo.
Un "oligonucleótido complementario molde"
se refiere a un oligonucleótido opcionalmente modificado
suficientemente complemetario para hibridar con un ácido nucleico
diana en una región 3' de la secuencia diana. El oligonucleótido
complementario molde puede contener una región no complementaria
como por ejemplo una región 5' promotora. Preferiblemente, el
oligonucleótido complementario molde contiene al menos unas 15 bases
contiguas que son complementarias a una región de bases contiguas
del ácido nucleico diana en al menos el 80%, más preferiblemente en
al menos el 90% y, aún más preferiblemente en el 100%. El
oligonucleótido complementario molde tiene una longitud de 15 a 60
nucleótidos opcionalmente modificados y, más preferiblemente, los
nucleótidos opcionalmente modificados son nucleótidos no
modificados.
Un "cebador complementario molde" se
refiere a un oligonucleótido complementario molde que contiene un
extremo 3' que se puede utilizar fácilmente en una reacción de la
polimerasa. La región 5' del cebador puede ser no complementaria
con el ácido nucleico diana y puede ser, por ejemplo, una secuencia
promotora.
Un "oligonucleótido complementario
molde-promotor" se refiere a un oligonucleótido
complementario molde que presenta una secuencia promotora 5'. La
secuencia promotora es reconocida por una RNA polimerasa.
Un "cebador" se refiere a un
oligonucleótido que contiene un extremo 3' que se puede utilizar
fácilmente en una reacción de la polimerasa. La región 5' del
cebador puede ser no complementaria con el ácido nucleico diana y,
por ejemplo, puede ser una secuencia promotora.
Un "cebador del promotor" se refiere a un
oligonucleótido con una secuencia 5' promotora y una secuencia 3'
cebadora.
La inhibición reversible de la actividad de las
enzimas de amplificación se realiza para inhibir la amplificación
independiente de diana o la actividad de la polimerasa de ácidos
nucleicos. Preferiblemente, el inhibidor utilizado para conseguir
la inhibición reversible está diseñado para inhibir la unión de un
oligonucleótido de amplificación mediante una enzima de
amplificación en ausencia de una ácido nucleico diana. En presencia
de la diana, el oligonucleótido de amplificación forma un complejo
con la diana que compite de forma efectiva con el inhibidor por la
unión enzimática.
La unión de un inhibidor a una enzima de
amplificación, contrariamente a la unión de una enzima de
amplificación a un oligonucleótido de amplificación, puede
intensificarse mediante técnicas como: (1) el aumento de la cantidad
del inhibidor relativa al oligonucleótido de amplificación; y (2)
la combinación de la enzima de amplificación con el inhibidor
previamente a la introducción de los oligonucleótidos de
amplificación.
Los métodos aquí descritos se realizan
preferiblemente utilizando una sonda señuelo. Las sondas señuelo
preferidas no presentan un extremo 3' que se pueda utilizar en una
reacción de la polimerasa. Es aún más preferible que la sonda
señuelo no contenga una secuencia sustancialmente complementaria a
la secuencia del ácido nucleico diana. Las secuencias
sustancialmente complementarias pueden hibridar entre sí bajo las
condiciones empleadas en una reacción de amplificación. Es
preferible que la sonda señuelo no contenga más de 5 grupos de
reconocimiento capaces de unirse mediante puentes de hidrógeno a
una región de 10 o más bases contiguas de secuencia de ácido
nucleico.
Las sondas señuelo se utilizan más
preferiblemente en una cantidad igual a la cantidad de
oligonucleótidos de amplificación o superior. Una razón molar
preferida de sonda señuelo respecto a la cantidad total de
oligonucleótido de amplificación es de 1:3 a 100:1, preferiblemente
2:1 a 5:1. Preferiblemente, la proporción molar entre sonda señuelo
y enzima de amplificación es de alrededor de 1:15 a 5:1, más
preferiblemente 1:2 a 2:1, y aún más preferiblemente 1:1.
Las sondas señuelo se incuban preferiblemente
con una o varias enzimas de amplificación previamente a la
introducción de los oligonucleótidos de amplificación. De forma más
preferible, las enzimas de amplificación son una RNA polimerasa o
una transcriptasa inversa que están combinadas con sondas señuelo
que presentan una secuencia 5' de tipo promotor y un extremo 3'
bloqueado, previamente a la puesta en contacto con un
oligonucleótido de amplificación.
Las sondas señuelo están diseñadas
preferiblemente para no ser utilizadas en una reacción de la
polimerasa de ácido nucleico. Las sondas señuelo preferidas no
presentan una estructura que proporcione un promotor funcional ni
presentan un extremo 3' que pueda participar en una reacción de la
polimerasa.
Es preferible evitar las secuencias promotoras
de DNA monocatenario y bicatenario que una RNA polimerasa pueda
utilizar de forma eficiente. El empleo de sondas señuelo con una
secuencia promotora funcional de DNA bicatenario puede dar lugar a
la producción de productos de amplificación independientes de diana
no deseados.
De forma similar, también es preferible evitar
el RNA que presente una estructura secundaria en forma de horquilla
(stem-loop) y el DNA con una estructura circular que
pueden dar lugar a una amplificación independiente de diana.
Biebricher y Luse, EMBOJ.,13:3458-3465
(1996), indican que las moléculas estructuradas de RNA de
secuencias diferentes pueden participar en la replicación catalizada
por la RNA polimerasa. Daubendiek et al., J. Am. Chem.
Soc., 117:7818-7819 (1995), indican que un
desoxioligonucleótido circular puede servir como molde para la T7
polimerasa en ausencia de cebadores de RNA, en ausencia de
secuencias promotoras de RNA y en ausencia de cualquier estructura
dúplex.
Las sondas señuelo preferidas descritas por la
presente invención van dirigidas contra una polimerasa de ácidos
nucleicos, preferiblemente una RNA polimerasa o una transcriptasa
inversa. Estas sondas se pueden generar, por ejemplo, utilizando
uno o varios de los siguientes procedimientos: (1) selección de
sondas que se unan a una RNA polimerasa o a una transcriptasa
inversa; (2) diseño de sondas con una secuencia promotora similar o
idéntica a una secuencia promotora de RNA polimerasa; y (3) diseño
de sondas con una estructura autocomplementaria en
"horquilla".
Se han secuenciado secuencias promotoras de RNA
a partir de una gran variedad de fuentes diferentes (Véase, p. ej.,
Jorgensen et al., J.B.C., 266:645-655
(1991). A continuación se presentan algunos ejemplos de secuencias
promotoras de RNA:
- T3(+)ID. de SEC. Núm.: 1: taatattaac cctcactaaa gggaga;
- T3(-)ID. de SEC. Núm.: 2: tctcccttta gtgagggtta atatta;
- T7(+)ID. de SEC. Núm.: 3: taatacgact cactataggg aga;
- T7(-)ID. de SEC. Núm.: 4: tctccctata gtgagtcgta tta;
- SP6(+)ID. de SEC. Núm.: 5: atttaggtga cactatagaa gag; y
- SP6(-)ID. de SEC. Núm.: 6: ctcttctata gtgtcaccta aat.
Una sonda señuelo puede contener una secuencia
similar a un promotor en cualquier sentido. La referencia a
"similar" también incluye la misma secuencia. La sonda señuelo
utilizada en una reacción de amplificación asociada a la
transcripción posee preferiblemente una secuencia similar a la
secuencia promotora presente en un cebador-promotor
utilizado en la reacción de amplificación asociada a la
transcripción.
Las sondas señuelo tienen preferiblemente una
región con una similitud de secuencia que es por lo menos del 50%
con la secuencia promotora de la T7 RNA polimerasa, de la T3 RNA
polimerasa o de la SP6 RNA polimerasa. Es más preferible que la
similitud de secuencia sea al menos del 75% con la secuencia
promotora de la T7 RNA polimerasa, de la T3 RNA polimerasa o de la
SP6 RNA polimerasa. Es aún más preferible que la similitud de
secuencia sea del 75% al 95% con la secuencia promotora de la T7, T3
o SP6 RNA polimerasa.
El porcentaje de similitud de bases es el número
total de bases en una secuencia de bases contiguas que son las
mismas que las presentes en una secuencia promotora de RNA
polimerasa completa, dividido por el número que hay en la secuencia
promotora de RNA polimerasa completa. Por tanto, por lo que respecta
a la T7 polimerasa proporcionada en el ID. de SEC. Núm. 3, el
número de bases presentes en las sondas señuelo que son iguales a
la secuencia promotora de la T7 polimerasa se divide por 23. Por
ejemplo, el ID. de SEC. Núm. 7: taatacgact cactataggg, tiene una
similitud de secuencia de un 87% con la T7 polimerasa proporcionada
en el ID. de SEC. Núm. 3. Los cambios que se realizasen en las
bases incluidas en el ID. de SEC. Núm. 7 afectarían a la similitud
de secuencia.
Otra manera de diseñar sondas señuelo consiste
en utilizar una secuencia con una región de autocomplementariedad
que producirá una estructura en horquilla
(stem-loop). Las RNA polimerasas, además de
reconocer secuencias promotoras, también parecen reconocer
estructuras secundarias.
Además de tener una secuencia dirigida hacia una
RNA polimerasa, las sondas señuelo pueden contener secuencias
adicionales. Estas secuencias adicionales se pueden generar
aleatoriamente. Es preferible que las secuencias adicionales no
sean complementarias al ácido nucleico diana, al complemento del
mismo o a cualquier otra secuencia presente en la reacción de
amplificación. En una realización de la presente invención, una
sonda señuelo contiene un secuencia adicional para proporcionar a
la sonda señuelo una longitud total que se aproxima a la longitud
total de un oligonucleótido de amplificación utilizado en un
protocolo de amplificación (p. ej. \pm cinco bases).
El protocolo de amplificación de unión de
proteínas se puede utilizar para seleccionar un oligonucleótido
capaz de unirse a una proteína y producir grandes cantidades del
mismo. Es preferible que el protocolo se realice empleando una
enzima de amplificación, como una RNA polimerasa o una transcriptasa
inversa. En Gold et al., Annu. Rev. Biochem.,
64:763-797 (1995) y en Uphoff et al.,
Curr. Opin. Sruct. Biol., 6:281-288 (1996) se
describen varias técnicas de utilidad para la realización del
protocolo de amplificación de unión de proteínas.
El protocolo de amplificación de unión de
proteínas se puede llevar a cabo utilizando un conjunto de dos o
más oligonucleótidos, conteniendo cada uno una región 3', una región
potencial de unión de proteínas y una región 5' conocida. La región
potencial de unión de proteínas puede ser una región de secuencia
generada aleatoriamente.
El conjunto de oligonucleótidos se combina con
la proteína para permitir la unión de la misma. Después se separan
los oligonucleótidos unidos a proteína de los oligonucleótidos no
unidos. La separación se puede conseguir mediante diversas
técnicas, como por ejemplo la inmunoprecipitación empleando un
anticuerpo que reconoce a la proteína.
Otro ejemplo de técnica de separación emplea una
proteína unida a una columna de afinidad en la que los
oligonucleótidos que no están unidos a proteína se pueden eliminar
mediante lavado de la columna bajo unas condiciones en las que se
retienen los oligonucleótidos que sí están unidos a proteína. Es
entonces cuando estos últimos oligonucleótidos se pueden separar de
la proteína.
Los oligonucleótidos que se unen a la proteína
se combinan con una sonda complementaria
molde-promotor bajo unas condiciones en las que se
produce una región promotora de doble cadena. La sonda
complementaria molde-promotor hibrida con una
porción del extremo 3' conocido del oligonucleótido, y seguidamente
se forma un promotor de doble cadena.
La formación de un promotor de doble cadena
puede llevarse a cabo mediante técnicas diferentes, por ejemplo
mediante hibridación con una secuencia promotora complementaria o
mediante la generación de una secuencia promotora complementaria
utilizando la actividad de la DNA polimerasa. Es preferible que se
genere un promotor de doble cadena con el uso de una DNA polimerasa
que extienda el extremo 3' de un oligonucleótido al utilizar como
molde la secuencia promotora de la sonda complementaria
molde-promotor.
El oligonucleótido unido al promotor de doble
cadena se utiliza en una reacción de amplificación asociada a la
transcripción para producir múltiples tránscritos de RNA. Los
tránscritos producidos son complementarios al oligonucleótido de
unión a proteína.
Los tránscritos de RNA se emplean como molde
para producir múltiples copias del oligonucleótido de unión a
proteína en reacciones de extensión del cebador. Estas reacciones se
realizan con un cebador análogo al extremo 5' conocido del
oligonucleótido (y por tanto complementario al extremo 3' del
tránscrito de RNA) y una DNA polimerasa, bajo condiciones de
amplificación mediante DNA polimerasa. La DNA polimerasa es
preferiblemente una transcriptasa inversa. El RNA presente en un
dúplex de RNA:DNA puede eliminarse utilizando la actividad de la
ribonucleasa H. Se pueden llevar a cabo múltiples ciclos para
producir grandes cantidades de oligonucleótidos unidos a la
proteína y para seleccionar secuencias de unión a la polimerasa de
mayor afinidad.
Las sondas señuelo son moléculas de
reconocimiento de secuencias de bases nuecleotídicas que contienen
grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas unidos entre sí por
un esqueleto. Las diferentes subunidades de la sonda señuelo deben
permitir a la sonda señuelo unirse de forma competitiva y reversible
a una enzima de amplificación. Los componentes que se deben evitar
son aquellos que impiden la unión a una enzima de amplificación y
que dan lugar a una inhibición irreversible de las actividades
enzimáticas.
Un grupo de reconocimiento de bases
nucleotídicas que esté presente en una molécula de reconocimiento de
secuencias de bases nucleotídicas puede ser complementario a un
nucleótido en particular (p. ej., adenina, guanina, citosina,
timina y uracilo) y, por tanto, tener la capacidad de unirse
mediante puentes de hidrógeno con ese nucleótido. Un grupo de
reconocimiento de bases nucleotídicas también puede tener la
capacidad de unirse a nucleótidos diferentes mediante puentes de
hidrógeno. Por ejemplo, cuando la inosina es un grupo de
reconocimiento de bases nucleotídicas ésta puede unirse mediante
puentes de hidrógeno a diferentes bases nucleotídicas.
Los grupos de reconocimiento de bases
nucleotídicas preferidos son las bases nitrogenadas purínicas o
pirimidínicas, o derivadas de las mismas, capaces de unirse
mediante puentes de hidrógeno a adenina, guanina, citosina, timina
o uracilo. Algunos ejemplos de estos grupos de reconocimiento son
adenina, guanina, citosina, timina, uracilo o derivados de los
mismos. Algunos ejemplos de los derivados incluyen: bases purínicas
o pirimidínicas modificadas, como N^{4}-metil
desoxiguanosina; desaza- o azapurinas o pirimidinas empleadas en
lugar de bases purínicas o pirimidínicas naturales; bases
pirimidínicas que poseen grupos sustituyentes en la posición 5 o 6;
y bases purínicas que presentan un sustituyente alterado o uno de
reemplazo en la posición 2, 6 u 8. Véase, p. ej., Cook, Núm. de
Solicitud Internacional PCT/US92/11339, Núm. de Publicación
Internacional WO 93/13121. Otros ejemplos adicionales incluyen:
2-amino-6-metilaminopurina,
O6-metilguanina,
4-tio-pirimidinas,
4-amino-pirimidinas,
4-dimetilhidracina-pirimidinas,
O4-alquil-pirimidinas (véase, p.
ej., The Glen Report, Volumen I (1993).
El esqueleto de una molécula de reconocimiento
de secuencias de bases nucleotídicas puede estar formado por varios
grupos. Ejemplos de diferentes grupos incluyen grupos de esqueleto
de tipo fosfodiéster y glucídico y grupos de esqueleto de ácidos
nucleicos peptídicos.
La estructura I representa un esqueleto de tipo
glúcido y fosfodiéster, donde el grupo glucídico es un grupo
pentofuranosilo. Los grupos glucídicos se unen entre sí mediante
enlace, como el enlace fosfodiéster u otros enlaces adecuados.
Estructura I
X representa el grupo de unión de dos glúcidos.
Ejemplos de X incluyen -OP(O)_{2}O-,
-NHP(O)_{2}O-, -OC(O)_{2}O-,
-OCH_{2}C(O)_{2}NH-,
-OCH_{2}C(O)_{2}O-,
-OP(CH_{3})(O)O-, -OP(S)(O)O- y
-OC(O)_{2}NH-. Como en los otros ejemplos
proporcionados aquí, pueden usarse igualmente otros equivalentes
bien conocidos en el sector o que estén disponibles.
Y_{1} e Y_{2} son grupos seleccionados de
forma indepen-diente. Ejemplos de Y_{1} e Y_{2}
incluyen H, OH, alcoxi C_{1}-C_{4}, halógeno y
alquilo C_{1}-C_{6}. Preferentemente, Y_{1} e
Y_{2} son de forma independiente H, OH, F o OCH_{3}. Los
radicales alquilo C_{1}-C_{6} y alcoxi
C_{1}-C_{4} pueden ser o incluir grupos de
cadena simple, ramificada o cíclica.
La base 1 y la base 2 son seleccionadas de forma
independiente a partir del grupo formado por: adenina, guanina,
citosina, timina, uracilo o un grupo que no inhiba el apareamiento
complementario de bases de una base adyacente a un ácido nucleico
complementario. Ejemplos de grupos que no inhiben el apareamiento
complementario de bases incluyen grupos de menor tamaño, como
hidrógeno, OH, alquilo C_{l}-C_{6} o alcoxi
C_{1}-C_{4}. En diferentes realizaciones, la
secuencia de reconocimiento de bases nucleotídicas contiene al menos
unas 7, o unas 10, y no más de aproximadamente 40 o 30, bases
seleccionadas de forma independiente a partir del grupo formado
por: adenina, guanina, citosina, timina y uracilo.
R_{1} y R_{2} representan grupos
seleccionados de forma independiente. Ejemplos de R_{1} y R_{2}
incluyen grupos adicionales de tipo glúcido y fosfodiéster,
hidrógeno, hidroxi, ácido nucleico peptídico, fosfato, tiofosfato,
alquilo C_{1}-C_{4} y moléculas que no
proporcionan información de secuencia, tales como polisacáridos,
polipéptidos, péptidos y otras moléculas no nucleotídicas.
Los derivados de la estructura I capaces de ser
un componente de una secuencia de reconocimiento de bases
nucleotídicas son bien conocidos en el sector e incluyen, por
ejemplo, moléculas con un tipo de azúcar diferente. Por ejemplo,
una secuencia de reconocimiento de bases nucleotídicas puede tener
fracciones ciclobutilo conectadas mediante fracciones enlazantes,
donde las fracciones ciclobutilo tienen bases heterocíclicas unidas
a ellas. Véase, p. ej. Cook et al., Núm. de Solicitud
Internacional PCT/US93/01579, Núm. de Publicación Internacional WO
94/19023.
En una realización de la presente invención, una
molécula de reconocimiento de bases nucleotídicas es un
polinucleótido o un derivado del mismo. Un "polinucleótido o
derivado del mismo" es una molécula de reconocimiento de bases
nucleotídicas formada por unidades repetidas de la estructura I,
donde X es - OP(O)_{2}O-; Y_{1} e Y_{2} son
grupos seleccionados de forma independiente a partir del grupo
formado por H, OH, OCH_{3} y F; la Base_{l} y la Base_{2} son
seleccionadas de forma independiente a partir del grupo formado por:
adenina , guanina, citosina, timina y uracilo. La porción terminal
de la molécula contiene R_{1} y R_{2} seleccionados de forma
independiente a partir del grupo formado por OH, alquilo
C_{1}-C_{5}, fosfato y tiofosfato.
Otro esqueleto de molécula de reconocimiento de
secuencias de bases nucleotídicas es el que se encuentra en los
ácidos nucleicos peptídicos. Un ácido nucleico peptídico es un
análogo de DNA en el que el esqueleto de desoxirribosa fosfato es
reemplazado por un esqueleto pseudopeptídico. Los ácidos nucleicos
peptídicos están descritos por Hyrup y Nielsen, Bioorganic &
Medicinal Chemistry, 4:5-23 (1996), y
Hydig-Hielsen and Godskesen, Núm. de Solicitud
Internacional PCT/DK95/00195, Núm. de Publicación Internacional WO
95/32305
Preferentemente, el ácido nucleico peptídico
está formado por unidades de
N-(2-aminoetil)glicina, como se ilustra en
la Estructura II.
Estructura II
\vskip1.000000\baselineskip
R_{1}, R_{2} y Base_{1} son tipos de
compuestos como los descritos en la Estructura I.
Las moléculas de reconocimiento de secuencias de
bases nucleotídicas pueden producirse utilizando técnicas estándar.
Las publicaciones que describen la síntesis orgánica de
oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados incluyen: Eckstein,
F., Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach,
Capítulos 1-5 (1991), que revisa la síntesis
orgánica de oligonucleótidos.; Caruthers et al., In
Methods In Enzymology 154:287 (1987), que describen un
procedimiento para la síntesis orgánica de oligonucleótidos
utilizando el método químico estándar de la fosforamidita en fase
sólida; Bhatt, Núm. de Patente US 5 252 723, que describe un
procedimiento para la síntesis orgánica de oligonucleótidos
modificados que contienen enlaces fosforotioato; y Klem et
al., Núm. de Publicación Internacional WO 92/07864, el cual
describe la síntesis orgánica de oligonucleótidos modificados con
enlaces internucleósido diferentes incluyendo enlaces
metil-fosfonato.
Algunas referencias adicionales que describen
técnicas que pueden ser utilizadas para producir diferentes tipos
de moléculas de reconocimiento de secuencias de bases nucleotídicas
incluyen: Cook, Núm. de Solicitud Internacional PCT/US92/11339,
Núm. de Publicación Internacional WO 93/13121; Miller et al.,
Núm. de Solicitud Internacional PCT/US94/00157, Núm. de Publicación
Internacional WO 94/15619; McGee et al., Núm. de Solicitud
Internacional PCT/US93/06807, Núm. de Publicación Internacional WO
94/02051; Cook et al., Núm. de Solicitud Internacional
PCT/US93/01579, Núm. de Publicación Internacional WO 94/19023; Hyrup
y Nielsen, Bioorganic & Medicinal Chemistry,
4:5-23 (1996); y Hydig-Hielsen y
Godskesen, Núm. de Solicitud Internacional PCT/DK95/00195, Núm. de
Publicación Internacional WO 95/32305.
Las sondas señuelo contienen preferentemente dos
regiones: (1) una primera región que es preferentemente una región
de unión a polimerasa o una región similar a promotor; y (2) una
segunda región que no es sustancialmente complementaria a los
ácidos nucleicos utilizados en un protocolo de amplificación.
En una realización, la primera región está
formada por (a) un esqueleto que contiene uno o más grupos
seleccionados de forma independiente a partir del grupo formado por
uno o más grupos de tipo glúcido-fosfodiéster y uno
o más grupos de ácidos nucleicos peptídicos, y (b) al menos diez
grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas unidos al
esqueleto, donde cada grupo de reconocimiento puede de forma
independiente unirse mediante puentes de hidrógeno con al menos uno
de entre adenina, guanina, citosina, timina o uracilo. En
realizaciones adicionales se encuentran alrededor de al menos 15,
20 o 25 grupos de reconocimiento.
En otra realización, la segunda región está
formada por (a) un esqueleto que contiene uno o más grupos
seleccionados de forma independiente a partir del grupo formado por
uno o más grupos de tipo glúcido-fosfodiéster y uno
o más grupos de ácidos nucleicos peptídicos, y (b) al menos cinco
grupos de reconocimiento de bases nucleotídicas unidos al
esqueleto, donde cada grupo de reconocimiento puede de forma
independiente unirse mediante puentes de hidrógeno con al menos uno
de entre adenina, guanina, citosina, timina o uracilo. En
realizaciones adicionales se encuentran alrededor de al menos 15,
20 o 25 grupos de reconocimiento.
En una realización preferida, la sonda señuelo
está formada por oligonucleótidos modificados opcionalmente. Los
oligonucleótidos modificados opcionalmente pueden contener grupos
glucídicos alterados, enlaces fosfodiéster alterados o bases
nitrogenadas alteradas. Las modificaciones preferidas incluyen
diferentes bases nitrogenadas purínicas o pirimidínicas, o
derivados de ambos, capaces de unirse mediante puentes de hidrógeno
con al menos uno de entre adenina, guanina, timina o citosina;
diferentes fracciones de glúcidos como 2'alcoxirribosa,
2'halorribosa y ciclobutilo; y diferentes enlaces internucleosídicos
como metilfosfonato y fosforotioato. Preferentemente, si la
2'alcoxirribosa está presente, esta es 2'metoxirribosa y, si la
2'halorribosa está presente, esta es 2'fluororribosa.
En una realización preferida, la sonda señuelo
que contiene una primera y segunda región está formada por 15 a 100
nucleósidos modificados opcionalmente y uno o más grupos bloqueantes
localizados en la región 3' terminal de la sonda. Preferentemente,
cada uno de los nucleósidos modificados opcionalmente de forma
independiente tiene una fracción purínica o pirimidínica
seleccionada de forma independiente a partir del grupo formado por
inosina, uracilo, adenina, guanina, timina y citosina; y una
fracción glucídica seleccionada de forma independiente a partir del
grupo formado por desoxirribosa, 2'-metoxirribosa, y
ribosa; y cada uno de los nucleósidos modificados opcionalmente se
encuentra unido entre sí por un enlace internucleosídico
seleccionado de forma independiente a partir del grupo formado por
fosfodiéster, fosforotioato y metilfosfonato. De forma más
preferente, la primera región está unida covalentemente en su
extremo 5' al extremo 3' de la segunda región a través de un grupo
fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato o polisacárido. Más
preferentemente, la sonda contiene de 15 a 75 nucleósidos
modificados opcionalmente y, aún más preferentemente, de 35 a
70.
En una realización más preferida, al menos el
80% de los nucleósidos modificados opcionalmente tienen una
fracción de purina o pirimidina seleccionada de forma independiente
a partir del grupo formado por adenina, guanina, timina y citosina;
y una fracción glucídica desoxirribosa. También, al menos el 80% de
los enlaces internucleosídicos que unen a los nucleósidos
modificados opcionalmente son fosfodiéster. Aún más preferentemente,
la sonda está formada por otros desoxirribonucleótidos y uno o más
grupos bloqueantes seleccionados de forma independiente.
Las sondas señuelo pueden diseñarse con una
primera y una segunda región de reconocimiento de secuencia de
bases nucleotídicas que tienen diferentes configuraciones. Ejemplos
de diferentes configuraciones incluyen el extremo 3' o 5' de una
primera región de ácidos nucleicos unido directamente, o mediante un
enlazante, al extremo 5' o 3' de una segunda región de ácido
nucleico.
Las figuras 2A y 2B proporcionan ilustraciones
de dos configuraciones diferentes de sondas señuelo. La primera
región de reconocimiento de secuencia de bases nucleotídicas está
subrayada en las figuras 2A y 2B. La Figura 2A ilustra una sonda
señuelo donde un extremo 5' de la primera región está unido
directamente a un extremo 3' de la segunda región. La Figura 2B
ilustra una sonda señuelo donde un extremo 5' de la primera región
está unido a un extremo 3' de la segunda región a través de un
conector no nucleotídico (indicado mediante la línea curva). Los
grupos propilo terminales mostrados en las figuras 2A y 2B son
grupos bloqueantes.
Los grupos bloqueantes son fracciones químicas
que pueden añadirse a un ácido nucleico para inhibir la
polimerización de ácidos nucleicos catalizada por una polimerasa de
ácidos nucleicos. Los grupos bloqueantes se localizan de forma
típica en el extremo terminal (o extremos terminales) 3' de una
sonda señuelo formada por nucleótidos o derivados de los mismos. Si
se adhiere un grupo bloqueante a un OH 3' terminal, el grupo OH 3'
ya no está disponible para aceptar un nucleótido trifosfato en una
reacción de polimerización.
Se pueden añadir numerosos grupos diferentes
para inhibir el extremo 3' de la secuencia de una sonda. Ejemplos
de dichos grupos incluyen grupos alquilo, conectores no
nucleotídicos, fosforotioato, residuos alcanodiol, ácidos nucleicos
peptídicos y derivados de nucleótidos que carecen de OH 3' (p. ej.,
cordicepina).
Un grupo alquilo bloqueante es un hidrocarbono
saturado de hasta 12 carbonos de longitud que puede ser de cadena
sencilla o ramificada, o contener un grupo cíclico. Más
preferentemente, el grupo alquilo bloqueante es un alquilo
C_{2}-C_{6} que puede ser de cadena sencilla o
ramificada, o contener un grupo cíclico.
La presente invención puede ser utilizada en
conjunción con diferentes procedimientos de amplificación. Los
procedimientos aplicables son aquellos que implican el uso de una
polimerasa de ácidos nucleicos. Combinando una polimerasa de ácidos
nucleicos con un inhibidor reversible, como una sonda señuelo, se
puede inhibir la capacidad de la polimerasa para formar productos
indeseables.
La sección "ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN"
vista anteriormente proporciona ejemplos de procedimientos de
amplificación que implican el uso de DNA o RNA polimerasas. Se
dispone ya de DNA o RNA polimerasas adecuadas para llevar a cabo
estos u otros procedimientos de amplificación que implican la
polimerización de ácidos nucleicos e incluyen, por ejemplo, DNA
polimerasas dependientes de DNA, tal como la DNA polimerasa I, DNA
polimerasa T4, Taq polimerasa y klenow carente de actividad
exonucleasa; RNA polimerasa dependiente de DNA , tal como la T7 RNA
polimerasa, la T3 RNA polimerasa y la SP6 RNA polimerasa; y DNA
polimerasas dependientes de RNA tales como la transcriptasa inversa
del virus de la mieloblastosis aviar (AMLV), la transcriptasa
inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) y la
transcriptasa inversa del VIH.
Una ventaja de la presente invención es que
proporciona una manera de reducir productos secundarios indeseables
en condiciones isotérmicas. Esta ventaja es particularmente adecuada
para diferentes protocolos, tales como la amplificación asociada a
la transcripción y la SDA que pueden llevarse a cabo en condiciones
isotérmicas. La sección vista anteriormente "ANTECEDENTES DE LA
INVENCIÓN" proporciona distintos formatos que pueden emplearse
para llevar a cabo la amplificación asociada a la transcripción y la
SDA. Ejemplos de los diferentes formatos incluyen, Burg et
al., Núm. de Patente US 5 437 990, que incluye una descripción
de un formato general de una amplificación asociada a la
transcripción; y Kacian et al., Núm. de Patente US 5 399 491,
que contiene una descripción de un formato de amplificación
asociada a la transcripción que incluye la utilización de la
actividad ribonucleasa H presente en la transcriptasa inversa para
conseguir la separación de cadenas.
Procedimientos adicionales a los que se hace
referencia en la sección "ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN" vista
anteriormente incluyen Kacian et al, Núm. de Patente US 5 554
516; Kacian et al., Núm. de Solicitud Internacional
PCT/US93/04015, Núm. de Publicación Internacional W0 93/22461;
Gingeras et al., Núm. de Solicitud Internacional
PCT/US87/01966, Núm. de Publicación Internacional WO 88/01302;
Gingeras et al., Núm. de Solicitud Internacional
PCT/US88/02108, Núm. de Publicación Internacional WO 88/10315; Davey
y Malek, Núm. de Solicitud Europea 88113948.9, Núm. de Publicación
Europea 0 329 822 A2; Malek et al., Núm. de Patente US 5 130
238; Urdea, Núm. de Solicitud Internacional PCT/US91/00213, Núm. de
Publicación Internacional WO 91/10746; McDonough et al., Núm.
de Solicitud Internacional PCT/US93/07138, Núm. de Publicación
Internacional WO 94/03472; Ryder et al., Núm. de Solicitud
Internacional PCT/US94/ 08307, Núm. de Publicación Internacional WO
95/03430; Walker, PCR Methods and Applications,
3:25-34 (1993); Walker et al.,
Nucleic Acids Res., 20:1691-1696 (1992); y
Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
89:392-396 (1991).
Preferentemente, la amplificación de una
secuencia de ácido nucleico se lleva a cabo combinando primero una
enzima de amplificación junto con un inhibidor reversible de la
enzima en ausencia de oligonucleótidos de amplificación capaces de
hibridar con el ácido nucleico diana. Tras el paso de combinación,
la enzima combinada con el inhibidor es entonces utilizada en una
reacción de amplificación.
El primer paso de combinación debe considerarse
como un paso de preincubación que permite al inhibidor reversible
unirse o, de otra forma secuestrar, una enzima de amplificación.
Preferiblemente, el inhibidor reversible es una sonda señuelo. De
forma aún más preferible, el procedimiento de amplificación es una
amplificación asociada a la transcripción o una SDA.
En una realización preferida por lo que respecta
a la amplificación asociada a la transcripción, la enzima(s)
de transcripción es una RNA polimerasa o una transcriptasa inversa,
y la preincubación tiene lugar en ausencia de oligonucleótidos
complementarios dirigidos al promotor.
Más preferiblemente, la preincubación tiene
lugar en ausencia de cebadores y oligonucleótidos complementarios
dirigidos al promotor.
En realizaciones preferidas dirigidas hacia SDA,
la enzima de amplificación es una DNA polimerasa que carece de
actividad exonucleasa 5'-3', y la preincubación
ocurre en ausencia de oligonucleótidos de amplificación SDA.
A continuación se proporcionan ejemplos que
ilustran diferentes aspectos y realizaciones de la presente
invención. Estos ejemplos no pretenden limitar la invención
reinvindicada.
Con la excepción de la concentración diana
variante, las reacciones de amplificación estándar de VIH por T7
contenían 15 pMol/reacción de un cebador-promotor
T7, 15 pMol/reacción de un cebador análogo, KCl 35 mM,
Tris-Cl 75 mM pH 7,5, HEPES 9 mM pH 7,5, MgCl_{2}
20 mM, dATP 1 mM, dCTP l mM, dGTP 1 mM, dTTP 1 mM, ATP 4 mM, CTP 4
mM, GTP 4 mM, UTP 4 mM, 5% p/v PVP, ZnOAc 0,15 mM, 10% v/v glicerol,
NALC 12,5 mM, EDTA 0,75 mM, 2,5% Tritón® X-102
(Sigma, St. Louis, MO), 0,0025% de rojo fenol,
100-200 unidades Epicentre de transcriptasa inversa
(Epicentre Technologies Inc., Madison, WI) y unas 500 unidades
Epicentre de T7 RNA polimerasa (Epicentre Technologies Inc.) en 20
ml o 100 \mul de volumen de reacción, si no se especifica de otro
modo.
Las reacciones de amplificación estándar de VIH
por T3 contenían 15 pMol/reacción de un
cebador-promotor T3 con 15 pMol/reacción de un
cebador análogo, KCl 35 mM, NaCl 2,5 mM, Tris-Cl 65
mM pH 7,5, MgCl_{2} 20 mM, ATP 1 mM, dCTP 1 mM, dGTP 1 mM, dTTP 1
mM, ATP 4 mM, CTP 4 mM, GTP 4 mM, UTP 4 mM, 2,5% v/v glicerol, DTT
10 mM, EDTA 0,25 mM, 0,0025% Tritón® X-100 (Sigma),
100-200 unidades Epicentre de transcriptasa
inversa(Epicentre Technologies Inc.) y unas 500 unidades
Epicentre de T3 RNA polimerasa (Epicentre Technologies Inc.) en 20
ml o 100 \mul de volumen de reacción, si no se especifica de otro
modo.
Para reacciones de amplificación de 100 \mul
(reacciones de amplificación por T7 o T3), se alicuotaron 25 \mul
de reactivo de amplificación a tubos individuales, seguido de la
adición de 200 \mul de aceite mineral. El RNA diana (sintetizado
mediante reacciones de transcripción in vitro) se diluyó en
agua al número de copias adecuadas y se añadió a un volumen de 50
\mul. Las reacciones se incubaron a 60ºC (en un incubador de baño
seco o baño de agua) durante 10 minutos, seguido de una incubación
a 42ºC durante 5 minutos. Después se añadieron veinticinco
microlitros del reactivo de la enzima, que contiene la transcriptasa
inversa y la T7 o T3 RNA polimerasa con o sin sondas señuelo, y los
tubos de reacción se incubaron a 42ºC durante otros
60-90 minutos, excepto en los experimentos sobre la
cinética de amplificación asociada a la transcripción en los que las
reacciones se terminaron prematuramente. Las reacciones se hicieron
finalizar mediante la adición de reactivo de sonda HPA, que fue el
paso inicial en el método de detección de amplicón. Para las
reacciones de amplificación asociada a la transcripción de 20
\mul (T7 o T3) todos los reactivos se añadieron a una quinta parte
del volúmen descrito para las reacciones de 100 \mul.
La producción de amplicón se detectó mediante
hibridación con sondas de detección de oligonucleótidos marcadas
con ésteres de acridinio (véase, p. ej., Arnold et al.,
Patente Estadounidense US 5 283 174, incorporada aquí a modo de
referencia). En algunos casos se utilizaron uno o más
oligonucleótidos adyuvantes para facilitar la hibridación con el
ácido nucleico que presentaba la secuencia diana (Véase, p.ej.,
Hogan et al., Patente Estadounidense US 5 030 557).
La hibridación de las sondas de detección se
realizó en reactivo de sondas HPA compuesto de succinato de litio
0,05 M, pH 5, cloruro de litio 0,6 M, laurilsulfato de litio al
1%(p/v) (LLS), EDTA 10 mM, aldritiol 7,5 mM y EGTA 10 mM a 60ºC
durante 10 minutos. El reactivo de sondas HPA se produjo normalmente
como un patrón 2X que contiene sonda de detección, y se añadió un
volumen igual a cada reacción de amplificación. Siguiendo a una
hibridación de 10 minutos a 60ºC, a cada tubo se le añadieron 300
\mul (3X volumen de reacción) de una solución que contenía
tetraborato sódico 0,15 M, pH 8,5, y Tritón® X-100
al 1 % y las reacciones se incubaron a 60ºC durante otros 15
minutos.
La detección y cuantificación de moléculas
híbridas se efectuó utilizando un luminómetro (p. ej., LEADER^{TM}
50; Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA). El
luminómetro inyecta automáticamente dos reactivos, el primero
compuesto de ácido nítrico 1 mM y peróxido de hidrógeno al 1%, el
segundo compuesto de hidróxido sódico 1 N. Los reactivos causan la
aparición de quimioluminiscencia de los ésteres de acridinio
inalterados presentes en los oligonucleótidos marcados con ésteres
de acridinio. Los resultados del ensayo se proporcionaron en
Unidades de Luz Relativas (RLU), una medida del número de fotones
detectados por el luminómetro.
Las siguientes secuencias de ácido nucleico son
ejemplos de sondas señuelo que pueden utilizarse en la presente
invención:
ID. de SEC. NÚM. 8 gtactcagat gctgcactga
aattattaac cctcactaaa gggatataa;
ID. de SEC. NÚM. 9 gtactcagat gctgtcactg
atcataatac gactcactat agggagataa;
ID. de SEC. NÚM. 10 gtactcagat gctgcactga
aatcaattcg actcactaaa gggatataa;
ID. de SEC. NÚM. 11 gtactcagat gctgcactga
aatcaattcg actcactaaa tccatataa;
ID. de SEC. NÚM. 12 gtactcagat gctgcactga
aattaatacg actcactata gccatataa;
ID. de SEC. NÚM. 13 gaaatcaatt cgactcacta
aagggatataa; y
ID. de SEC. NÚM. 14 gtactcagat gctgtcactg
atcagtactc agatgctgtg atgcactgat caaa.
La fracción en negrita de ID. DE SEC. NÚM.
8-13 se refiere a secuencias similares a la
promotora. El ID. DE SEC. NÚM.: 14 corresponde a una secuencia
aleatoria. Las sondas señuelo utilizadas en los ejemplos descritos a
continuación se bloquearon en el extremo OH 3' terminal mediante un
grupo n-propilo.
Ejemplo
1
Se sometieron a prueba sondas señuelo que
contenían secuencias similares o idénticas a un promotor nativo de
RNA polimerasa en relación a su capacidad para potenciar la
amplificación utilizando el sistema de amplificación asociado a
transcripción con T7 RNA polimerasa. Se utilizó un
cebador-promotor y un cebador complementario en una
reacción estándar de amplificación asociada a la transcripción (20
\mul de volumen) para amplificar 20 copias de RNA diana de VIH en
presencia o ausencia de 10-20 pMol de
oligonucleótidos inhibidos en 3’ de ID. DE SEC. NÚM.: 8, 9, 10 o
14.
El amplicón producido con las reacciones se
cuantificó mediante HPA con una sonda de detección marcada con
éster de acridinio a una concentración de 0,1 pMol por reacción. Se
cuantificó el número de reacciones que produjeron una amplificación
positiva. Una amplificación se consideró positiva si se observaban
30.000 RLU o más durante el paso de detección HPA. El valor de
30.000 RLU es 30 veces superior a la señal de fondo y representa un
mínimo de 10^{9} veces de la amplificación de diana. Los
resultados se muestran en la Tabla 1.
| Amplificación Asociada a la Transcripción con T7 | |||||
| NÚM. de | ID. de SEC. | ID. de SEC. | ID. de SEC. | ID. de SEC. | |
| Señuelos | NÚM 8. | NÚM. 10 | NÚM. 9 | NÚM. 14 | |
| Cantidad de | (10-20 | (10-20 | (10-20 | (6-20 | |
| oligonucleótido | pMol/rxn) | pMol/rxn) | pMol/rxn) | pMol/rxn) | |
| Reacciones | 144 | 128 | 248 | 208 | 72 |
| totales | |||||
| Número de | 94 | 74 | 222 | 164 | 33 |
| positivos | |||||
| Porcentaje de | 67% | 58% | 90% | 79% | 46% |
| sensibilidad |
Tabla 1: Resumen de los resultados de los
experimentos sobre los efectos de diferentes sondas señuelo sobre
el rendimiento de la amplificación asociada a la transcripción con
T7 utilizando 20 copias de diana (20 \muL de volumen de reacción).
Las reacciones se consideraron positivas cuando las RLU fueron
iguales o superiores a 30.000.
Una tasa elevada de positivos equivale a una
sensibilidad elevada. Los mejores resultados se obtuvieron con la
sonda señuelo de ID. de SEC. NÚM.: 10, que contiene una secuencia
similar, pero no idéntica, a un promotor de las RNA polimerasas T3
y T7. La sonda señuelo de ID. de SEC. NÚM.: 10 presenta 16/23
coincidencias con la secuencia consenso de T3 y 19/23 con la
secuencia consenso T7. La tasa de positivos aumentó de un 67% con
sondas señuelo a un 90% con la sonda señuelo de ID. de SEC. NÚM.:
10. Las reacciones que incluyeron una sonda señuelo con una
secuencia promotora T7 de consenso (ID. de SEC. NÚM.: 9) produjeron
una mayor sensibilidad que las que fueron sin sonda señuelo, o con
sondas señuelo sin una secuencia promotora similar, pero no tan
buenas como las reacciones con la sonda señuelo de ID. de SEC. NÚM.:
10.
Ejemplo
2
Se sometieron a prueba sondas señuelo que
contenían secuencias similares o idénticas a un promotor nativo de
RNA polimerasa en relación a su capacidad para potenciar la
amplificación utilizando el sistema de amplificación asociado a la
transcripción con T3 RNA polimerasa. Las reacciones de amplificación
asociadas a la transcripción con T3 fueron similares a aquellas
descritas en el ejemplo 1, exceptuando que se utilizó un
cebador-promotor T3 y una T3 RNA polimerasa.
Inicialmente había 20 copias de RNA diana de VIH (20 \muL de
volumen de reacción). Los resultados se muestran en la tabla 2.
| Amplificación Asociada a la Transcripción con T3 | |||||
| NÚM. de | ID. de SEC. | ID. de SEC. | ID. de SEC. | ID. de SEC. | |
| Señuelos | NÚM 8. | NÚM. 10 | NÚM. 9 | NÚM. 14 | |
| Cantidad de | (10-20 | (10-20 | (10-20 | (6-20 | |
| oligonucleótido | pMol/rxn) | pMol/rxn) | pMol/rxn) | pMol/rxn) | |
| Reacciones | 256 | 160 | 224 | 144 | 40 |
| totales | |||||
| Número de | 126 | 104 | 166 | 104 | 20 |
| positivos | |||||
| Porcentaje de | 49% | 65% | 74% | 73% | 50% |
| sensibilidad |
Tabla 2: Resumen de los resultados de los
experimentos sobre los efectos de sondas señuelo sobre el
rendimiento de la amplificación asociada a la transcripción con T3.
Se muestra la identidad y cantidad de cada sonda señuelo añadida al
reactivo de enzima T3 en 20 \mul de volumen de reacción. Las
reacciones se consideraron positivas cuando las RLU fueron iguales
o superiores a 30.000.
Como en el Ejemplo 1, los mejores resultados se
obtuvieron con la sonda señuelo de ID. de SEC. NÚM.: 10, que
contiene una secuencia similar, pero no idéntica, a un promotor de
la T3 o T7 RNA polimerasa. Las reacciones que incluyeron una sonda
señuelo con una secuencia promotora T3 (ID. de SEC. NÚM.: 8) o la
secuencia promotora T7 (ID. de SEC. NÚM.: 9) produjeron una mayor
sensibilidad que las que fueron sin sonda señuelo, o con sondas
señuelo sin una secuencia promotora similar.
Ejemplo
3
La longitud de la sonda señuelo se examinó
mediante la sonda de ID. de SEC. NÚM.: 13, que es una versión
truncada de la sonda de ID. de SEC. NÚM.: 10. La capacidad de la
sonda ID. de SEC. NÚM.: 13 para potenciar la amplificación se midió
utilizando la amplificación con T7 y la detección que se describen
en el Ejemplo 1. La tabla 3 resume todos los resultados. Una
comparación de los resultados de la Tabla 2 y Tabla 3 indica que la
longitud más corta de la sonda de ID. de SEC. NÚM.: 13 potenciaba
significativamente el rendimiento de la amplificación asociada a la
transcripción, aunque en menor medida que la sonda de ID. de SEC.
NÚM.: 10.
| Amplificación Asociada a la Transcripción por T7 | ||
| Sin señuelo | ID. de SEC. NÚM. 13 | |
| Cantidad de oligonucleótido | (20-22 pMol/rxn) | |
| Reacciones totales | 64 | 64 |
| Número d Positivose | 37 | 44 |
| Porcentaje de sensibilidad | 59% | 69% |
Tabla 3. Resumen de los resultados de los
experimentos sobre los efectos de una sonda señuelo truncada sobre
la amplificación asociada a la transcripción por T7. Inicialmente se
encontraban presentes veinte copias de RNA diana de VIH en 20
\muL de volumen de reacción. Las reacciones se consideraron
positivas cuando las RLU fueron iguales o superiores a 30.000.
Ejemplo
4
Este ejemplo confirma que la potenciación de la
amplificación utilizando sondas señuelo no está limitada a un tipo
en particular de ácido nucleico diana. Se realizaron reacciones de
amplificación asociada a la transcripción por T7 utilizando 20
copias de una diana VHC bajo condiciones similares a aquellas
descritas para las reacciones de amplificación asociada a la
transcripción de VIH por T7 del Ejemplo 1. La diferencia principal
respecto a las condiciones de amplificación del Ejemplo 1 fue la
utilización de oligonucleótidos de amplificación específicos de
secuencia de VHC.
Las reacciones contuvieron 18 pMol de un
cebador-promotor T7 junto con 10 pMol/reacción de
cebadores análogos, y 20 copias de diana. El amplicón producido por
las reacciones se cuantificó mediante HPA como se describe en el
Ejemplo 1, pero en este caso se utilizaron sondas marcadas con éster
de acridinio a una concentración de 0,05 pMol cada por reacción,
con sondas adyuvantes a una concentración de 2,5 pMol cada por
reacción.
La adición de sonda señuelo de ID. de SEC. NÚM.:
10 a la enzima reactiva mejoró significativamente el rendimiento de
este ensayo. El porcentaje de reacciones positivas que contienen 10
copias de RNA de VHC aumentó del 78% (25/32) al 100% (25/25) en
presencia de sondas señuelo de ID. de SEC. NÚM.: 10.
Ejemplo
5
Las sondas señuelo aumentan la cinética de las
reacciones de amplificación asociadas a la transcripción de VHC por
T7. Las reacciones y la detección de VHC por T7 se realizaron como
se describe en el Ejemplo 4, pero la cantidad de amplicón producido
se cuantificó en función del tiempo de amplificación. El amplicón
producido por las reacciones se cuantificó mediante HPA con sondas
VHC como se describe en el ejemplo 4, y se obtuvo un positivo con
señales de 30.000 RLU o superiores. Los resultados se muestran en la
Figura 3.
La adición de 22 pMol/rxn de sonda señuelo con
ID. de SEC. NÚM.: 10 a 20 \muL de reacciones de amplificación
asociadas a la transcripción de VHC que contenían 20 copias del RNA
diana, aumentó la tasa de producción de amplicón. Diez minutos tras
la adición del reactivo de la enzima, el 75% (30/40) de las
reacciones que contenían sondas señuelo fueron positivas
(>30.000 RLU) mientras que sólo el 10% (4/40) de las reacciones
sin señuelo fueron positivas. Además, tras un tiempo de
amplificación de 10 minutos, la media de RLU por muestras que
contenían señuelo fue 4 veces superior (64.95l RLU) que las que no
tenían (16.317 RLU).
Ejemplo
6
Este ejemplo ilustra la capacidad de las sondas
señuelo para aumentar la cinética del sistema de amplificación
asociada a la transcripción de VIH por T7. Se realizaron reacciones
de amplificación asociada a la transcripción de VIH por T7 en
presencia o ausencia de sonda señuelo de ID. de SEC. NÚM.: 10. La
amplificación y la detección de amplicón se llevaron a cabo como se
describe en el Ejemplo 1. Los resultados, ilustrados en la Figura 4,
muestran que la señal media aumentó a una tasa más rápida que los
valores medios de RLU para la población de muestra.
Ejemplo
7
Este ejemplo ilustra la capacidad de las sondas
señuelo para aumentar la cinética del sistema de amplificación
asociada a la transcripción de VIH por T3. Se realizaron reacciones
de amplificación asociada a la transcripción de VIH por T3 en
presencia o ausencia de sonda señuelo con ID. de SEC. NÚM.: 10. La
amplificación y la detección de amplicón se llevaron a cabo como se
describe en el Ejemplo 2.
Los resultados, ilustrados en la Figura 5,
muestran que el porcentaje de reacciones positivas aumentó a una
tasa más rápida que los valores medios de RLU para la población de
prueba cuando se utilizó la sonda señuelo.
Las siguientes reivindicaciones incluyen otras
realizaciones.
<110> GEN-PROBE
INCORPORATED
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SONDAS SEÑUELO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Listado de sec. de PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Para asignar
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-07-30
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/094 979
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-07-31
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatattaac cctcactaaa gggaga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccttta gtgagggtta atatta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
<212 DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg aga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctccctata gtgagtcgta tta
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttaggtga cactatagaa gag
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcttctata gtgtcaccta aat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtactcagat gctgcactga aattattaac cctcactaaa gggatataa
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción sintética
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<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtactcagat gctgtcactg atcataatac gactcactat agggagataa
\hfill50
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
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<212> DNA
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<213> construcción sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgtactcagat gctgcactga aatcaattcg actcactaaa gggatataa
\hfill49
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<211> 49
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<212> DNA
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<213> construcción sintética
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipgtactcagat gctgcactga aatcaattcg actcactaaa tccatataa
\hfill49
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<210> 12
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<211> 49
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<212> DNA
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<213> construcción sintética
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipgtactcagat gctgcactga aattaatacg actcactata gccatataa
\hfill49
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<210> 13
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> construcción sintética
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgaaatcaatt cgactcacta aagggatata a
\hfill31
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<210> 14
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<212> DNA
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<213> construcción sintética
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipgtactcagat gctgtcactg atcagtactc agatgctgtg atgcactgat caaa
\hfill54
Claims (20)
1. Una sonda señuelo purificada que
contiene:
una primera región de secuencia de
reconocimiento de bases nucleotídicas formada por ácidos nucleicos,
región que posee una similitud de secuencia de al menos el 35% con
una secuencia promotora de la RNA polimerasa seleccionada del grupo
formado por una secuencia promotora de la T7 RNA polimerasa, una
secuencia promotora de la T3 RNA polimerasa y una secuencia
promotora de la SP6 RNA polimerasa; y una segunda región de
secuencia de reconocimiento de bases nucleotídicas unida
directamente al extremo 5' de la primera región o al extremo 3' o
el 5' de la primera región mediante una o varias fracciones químicas
que no contienen un grupo de reconocimiento de bases nucleotídicas
que pueda funcionar como un molde en una reacción de la polimerasa,
en la que dichas fracciones químicas forman un enlace estable bajo
condiciones de amplificación;
siempre y cuando, si dicha primera región se
puede utilizar para producir un promotor funcional de doble cadena
empleando un oligonucleótido complementario, entonces dicha sonda no
posea una secuencia de ácido nucleico de longitud mayor de 10
nucleótidos unida directamente al extremo 3' de la primera región y
dicha sonda no posea un extremo 3' que pueda participar en una
reacción de la polimerasa.
2. La sonda de la reivindicación 1, en la que
dicha segunda región está unida directamente al extremo 5' de la
primera región, y en la que dicha sonda no contiene una secuencia de
ácido nucleico de longitud mayor de 10 nucleótidos unida
directamente a su extremo 3'.
3. La sonda de la reivindicación 1, en la que
dicha segunda región está unida al extremo 5' de la primera región
mediante una o más de las fracciones químicas mencionadas, y en la
que dicha sonda no contiene una secuencia de ácido nucleico de
longitud mayor de 10 nucleótidos unida directamente a su extremo
3'.
4. La sonda de la reivindicación 1, en la que
dicha segunda región está unida al extremo 3' de la primera región
mediante una o más de las fracciones químicas mencionadas.
5. Las sonda de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha primera región no posee una
secuencia de ácido nucleico de longitud mayor de 5 nucleótidos
unidad directamente a su extremo 3' si la primera región puede
utilizarse para producir la secuencia promotora funcional de doble
cadena funcional.
6. La sonda de la reivindicación 1, en la que la
segunda región está formada por ácido nucleico, y en la que el
extremo 3' de dicha segunda región está unido directamente al
extremo 3' de la primera región mediante una o más de las
fracciones químicas mencionadas.
7. La sonda de la reivindicación 3, en la que
dicha primera región no puede utilizarse para producir dicha
secuencia promotora funcional de doble cadena.
8. La sonda de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha segunda región incluye una
región de autocomplementariedad que generará una estructura en
forma de horquilla (stem-loop).
9. La sonda de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha sonda no contiene una
secuencia que sea sustancialmente complementaria a una secuencia de
ácido nucleico diana.
10. La sonda de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que además contiene grupos bloqueantes
situados en el extremo (o extremos) 3' terminal de dicha sonda.
11. La sonda de la reivindicación 1, en la que
dicha sonda está formada por 15 a 100 desoxirribonucleótidos
seleccionados independientemente y uno o más grupos bloqueantes
situados en el extremo 3' terminal de dicha sonda.
12. La sonda de la reivindicación 10 u 11, en la
que dichos grupos bloqueantes están seleccionados del grupo formado
por fosforotioato, residuo de alcanodiol, cordicepina y un grupo
alquilo.
13. La sonda de la reivindicación 1, en la que
dicha sonda está formada por 35 a 70 nucleótidos seleccionados
independientemente y uno o más grupos bloqueantes situados en el
extremo 3' terminal de dicha sonda, en el que dichos grupos
bloqueantes están seleccionados a partir del grupo formado por
fosforotioato, residuo de alcanodiol, cordicepina y un grupo
alquilo, y en el que la segunda región contiene al menos 10
nucleótidos.
14. La sonda de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha secuencia promotora de la
RNA polimerasa es la secuencia promotora de la T7 RNA polimerasa
mencionada, y en la que la primera región posee una similitud de
secuencia con dicha secuencia promotora de la T7 RNA polimerasa de
al menos el 50%.
15. La sonda de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha secuencia promotora de la
RNA polimerasa es la secuencia promotora de la T3 RNA polimerasa
mencionada, y en la que la primera región posee una similitud de
secuencia con dicha secuencia promotora de la T3 RNA polimerasa de
al menos el 50%.
16. La sonda de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha secuencia promotora de la
RNA polimerasa es la secuencia promotora de la SP6 RNA polimerasa
mencionada, y en la que la primera región posee una similitud de
secuencia con dicha secuencia promotora de la SP6 RNA polimerasa de
al menos el 50%.
17. La sonda de la reivindicación 1, en la que
dicha primera región posee una similitud de secuencia de bases
nucleotídicas de al menos el 75% con al menos uno de los siguientes:
ID. de SEC. Núm. 1, ID. de SEC. Núm. 2, ID. de SEC. Núm. 3, ID. de
SEC. Núm. 4, ID. de SEC. Núm. 5 y ID. de SEC. Núm. 6.
18. La sonda de la reivindicación 17, en la que
dicha primera región posee una similitud de secuencia de bases
nucleotídicas del 75% al 95% con el ID. de SEC. Núm. 3.
19. Un método para la amplificación de una
secuencia de ácido nucleico diana bajo condiciones de amplificación
asociada a la transcripción que comprende los siguientes pasos:
(a) producir una mezcla que contenga una RNA
polimerasa y dicha sonda señuelo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, donde dicha sonda señuelo no hibrida con
un ácido nucleico diana que contenga dicha secuencia de ácido
nucleico diana bajo dichas condiciones de amplificación, y donde la
mezcla no contiene dicho ácido nucleico diana;
(b) combinar esta mezcla con dicha secuencia de
ácido nucleico diana y con oligonucleótidos de amplificación
capaces de amplificar la secuencia de ácido nucleico diana; y
(c) amplificar dicha secuencia de ácido nucleico
diana bajo las condiciones de amplificación mencionadas, llevando a
cabo este paso de amplificación utilizando dichos oligonucleótidos
de amplificación y dicha RNA polimerasa;
método en el que, previamente al paso (b), en la
mezcla del paso (b) no está presente ningún oligonucleótido de
amplificación combinado con dicha mezcla, y
en el que dichos oligonucleótidos de
amplificación y dicha sonda señuelo compiten por la unión a dicha
RNA polimerasa.
20. El método de la reivindicación 19, siendo
dicho método llevado a cabo empleando condiciones isotérmicas.
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