ES2287287T3 - Secuencia del gen rpob de la bacteria tropheryma whippelii y oligonucleotido para el diagnostico molecular de la enfermedad de whipple. - Google Patents

Secuencia del gen rpob de la bacteria tropheryma whippelii y oligonucleotido para el diagnostico molecular de la enfermedad de whipple. Download PDF

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Abstract

Secuencia total del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelli, caracterizada porque está constituida por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9.

Description

Secuencia del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelli y oligonucleótido para el diagnóstico molecular de la enfermedad de Whipple.
La presente invención se refiere al campo del diagnóstico. Más precisamente, la invención se refiere al diagnóstico molecular de la enfermedad de Whipple mediante las técnicas de detección y/o de amplificación y secuenciado con ayuda de sondas o de iniciadores oligonucleotídicos, y a su aplicación en la búsqueda de la presencia o a la identificación de bacterias de la especie Tropheryma whippelii.
La enfermedad de Whipple es una enfermedad que se presenta en formas variadas. La forma más clásica es la de una fiebre con una diarrea crónica que provoca un adelgazamiento, pero también es una enfermedad que es susceptible de ocasionar daños articulares crónicos, daños cerebrales acompañados de demencia, daños oftalmológicos con uveitis y también un daño cardíaco, en particular una endocarditis de hemocultivo negativo. Desde su descripción en 1907, Whipple evoca la existencia de una bacteria asociada a la "lipodistrofia intestinal" delante de la observación de numerosos microorganismos después de la coloración argéntica de un ganglio mesentérico [Whipple GH (1907) Bull. John Hopkins Hosp. 18: 328]. La puesta en evidencia del carácter PAS (del inglés "periodic acid Schiff") positivo no específico de esta bacteria, y después las observaciones por microscopía electrónica han confirmado la presencia de una especie bacteriana intracelular de estructura Gram positiva [Chears et al. (1961) Gastroenterology 41: 1296]. La herramienta molecular universal 16S ARNr ha permitido confirmar esta hipótesis precisando la taxonomía filogénica de esta nueva especie bacteriana, y asignándole el nombre provisional de Tropheryma whippelii para evocar la noción de mala absorción intestinal y rendir honores al descubridor de la afección [Relman D. et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327: 293]. El secuenciado directo de 721 bases de un fragmento amplificado a partir de una biopsia del intestino delgado de un paciente [Wilson KH et al. (1991) Lancet 338: 474], después a partir de un ganglio de otro paciente [Wilson KH et al. (1992) ASM News 58: 318] confirma la originalidad de la especie bacteriana asociada a la enfermedad de Whipple. El secuenciado por Relman et al. (op. citado) de 1321 bases que representan el 90% del gen 16S ADNr sobre una muestra, y un fragmento de 284 bases en otros cuatro pacientes ha permitido confirmar que la especie bacteriana asociada a la enfermedad de Whipple representaba una nueva especie, precisar su posición taxonómica en el filum de los actinomicetos, es decir de las bacterias de estructura Gram positiva con un alto contenido de guanosina más citosina, que representa un nueva ramificación relativamente cercana a dos especies conocidas en la patología humana, Actinomyces pyogenes y Rothia dentocariosa.
El gen rpoB codifica una de la subunidades de la ARN polimerasa bacteriana y constituye un marcador genético que permite la detección específica de la bacteria de la especie Tropheryma whippelii.
Según Lazcano et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27: 365-376], las ARN polimerasas son divididas en dos grupos según su origen, uno constituido por las ARN polimerasas virales ARN- o ADN- dependientes, y el otro constituido por las ARN polimerasas ADN- dependientes de origen eucariota o procariota (arceobacterias y eubacterias). Las ARN polimerasas ADN-dependientes eubacterianas se caracterizan por una constitución multinumérica simple y conservada llamada "core enzyme", representada por \alpha\beta\beta', o "holoenzima" representada por \alpha\beta\beta'\sigma [Yura y Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13: 59-97]. Numerosos trabajos han puesto en evidencia la funcionalidad, en el seno del complejo enzimático multinumérico, de la subunidad \beta de la ARN polimerasa eubacteriana. Las ARN polimerasas arceobacterianas y eucariota presentan, por su parte, una estructura más compleja que puede alcanzar una decena, incluso una treintena de subunidades [Pühlet et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 88: 4569-
4573].
Los genes que codifican las diferentes subunidades \alpha\beta\beta'\sigma de la ARN polimerasa ADN-dependiente en las eubacterias, respectivamente los genes rpoA, rpoB, rpoC, rpoD, son clasificados en diferentes grupos que comprenden los genes que codifican para unas proteínas constitutivas de unas subunidades ribosómicas o para unas enzimas implicadas en la replicación y la reparación del genoma [Yura y Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13: 59-97]. Algunos autores han mostrado que las secuencias de los genes rpoB y rpoC podían ser utilizadas a fin de construir unos árboles filogenéticos (Rowland et al. Biochem. Soc. Trans (1992) 21: 40S) permitiendo separar las diferentes ramificaciones y subramificaciones entre los reinos vivientes.
El diagnóstico de la enfermedad se realiza actualmente mediante la observación, después de la coloración, de frotis microscópicos obtenidos de la biopsia o por amplificación y secuenciado de la herramienta gen universal 16S ARNr (Relman et al., op. citado).
Sin embargo, el gen 16S es un gen medianamente discriminante para la identificación de las bacterias. Además, es necesario disponer de varias dianas moleculares de identificación de las bacterias, en particular para paliar los problemas de contaminación molecular.
Por otra parte, esta bacteria ha sido aislada y cultivada por primera vez en unos sistemas celulares en el laboratorio de los inventores [Raoult D. et al. (2000) N. Engl. J. Med. 342:620 y WO 00/58440] a partir de la válvula cardiaca extraída de un paciente que presenta una endocarditis con hemocultivo negativo (cepa Twist).
\newpage
Los inventores ya han descrito en el documento WO-A-00/58440 un fragmento de 612 bases del gen rpoB de la bacteria Thropheryma whippelii que corresponde a la SEC ID nº 3 a partir de la que habían determinado dos secuencias nucleotídicas específicas del gen rpoB de la bacteria Thropheryma whippelii que se pueden utilizar como iniciadores de amplificación específicos y sondas de detección específicas de la especie Thropheryma whippelii.
Sin embargo las técnicas descritas en el documento WO-A-00/58440 no habían permitido en cambio obtener la secuencia completa del gen rpoB de Thropheryma whippelii.
Un objetivo de la presente invención es suministrar unos fragmentos adicionales del gen rpoB, en particular la secuencia completa del gen rpoB de Thropheryma whippelii; todavía más particularmente, unas secuencias que presentan una mayor especificidad de detección que las secuencias extraídas de los fragmentos SEC ID nº 3 descritas en el documento WO-A-00/58440.
Varias tentativas para alargar las secuencia SEC ID nº 3 con unos iniciadores consensuados producidos por el gen rpoB de otras bacterias y unos iniciadores específicos desarrollados por los inventores (SEC ID nº 13, 15 y 17) sólo han permitido alargar la secuencia hasta la obtención de la secuencia SEC ID nº 4 de 2750 Pb descrita continuación, pero no han permitido obtener después la secuencia completa del gen. Los inventores han desarrollado una serie de iniciadores específicos para aplicar la técnica denominada "marcha sobre el genoma" ("Genome walker" descrita en Siebert et al Nucleic Acids Research 23: 1087-1088, 1995) a partir de la determinación de una serie de iniciadores de amplificación específica, a saber los iniciadores de amplificación identificados a continuación como SEC ID nº 5 a 8. Estos diferentes iniciadores de amplificación han permitido poco a poco obtener unos fragmentos cada vez más extensos a partir de la SEC ID nº 4, hasta obtener la secuencia completa SEC ID
nº 9.
La presente invención tiene por lo tanto como objeto la secuencia completa del gen rpoB de la bacteria Thropheryma whippelii constituida por la secuencia SEC ID nº 9. La secuencia completa del gen rpoB ha sido determinada por la combinación de dos técnicas, la amplificación enzimática y el secuenciado automático directo con unos iniciadores consensuados entre un gran número de otras bacterias, de género y especies diferentes por un lado; y por secuenciado automático directo a partir de los productos de amplificación obtenidos después de la aplicación de la técnica Genome Walker (marcha sobre el genoma) al ADN extraído de la primera cepa Twist de Thropheryma whippelii, por otro lado. Esta última técnica consiste en marchar a lo largo del gen a partir de un primer fragmento conocido realizando un banco parcial del ADN cromosómico de la bacteria estudiada. Esta técnica, que será descrita más adelante, requiere una cantidad de ADN cromosómico bacteriano que sólo puede ser obtenido después de la extracción de dicho ADN a partir de un cultivo bacteriano puro y supone por lo tanto la disponibilidad de un aislado en cultivo. Es la disponibilidad de este aislado y la determinación de los diferentes iniciadores de amplificación SEC ID nº 5 a 8 a partir de la SEC ID nº 4 los que han permitido la aplicación con éxito de la técnica de marcha sobre el genoma para la determinación de la secuencia competa del gen rpoB en una cepa Twist de la bacteria Thropheryma whippelii.
Por lo tanto, la presente invención se refiere asimismo a unas secuencias de ácidos nucléicos de la especie Thropheryma whippelii, cuya secuencia nucleotídica está comprendida en la SEC ID nº 9 del gen rpoB de dicha bacteria apuntada más arriba y no comprendida por entero en la SEC ID nº 3, o una secuencia complementaria de dicha secuencia nucleotídica.
En efecto, a partir de la secuencia completa SEC ID nº 9, los inventores han determinado una secuencia SEC ID nº 10 de una especificidad mayor con respecto al gen rpoB de la Thropheryma whippelii fuera de la zona correspondiente a la SEC ID nº 3, a partir de la que han podido determinar dos secuencias particulares específicas que enmarcan un fragmento de aproximadamente 500 pares de bases, a saber las secuencias SEC ID nº 11 y 12 que confieren una fiabilidad óptima para la detección específica de la bacteria Thropheryma whippelii por amplificación y secuenciado del producto de amplificación o por hibridación como sonda de detección.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es un oligonucleótido monocatenario seleccionado de entre los oligonucleótidos que tienen una secuencia de al menos 10 motivos nucleotídicos consecutivos incluida en una secuencia seleccionada de entre:
-
la secuencia SEC ID nº 9 y no enteramente comprendida en la secuencia SEC ID nº 3 y preferentemente no comprendida en la SEC ID nº 3, y
-
preferentemente una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12, y
-
las secuencias complementarias de estos oligonucleótidos.
Un oligonucleótido más particularmente preferido tiene una secuencia seleccionada de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias.
\newpage
La presente invención tiene asimismo por objeto un oligonucleótido que presenta una secuencia seleccionada de entre:
-
las secuencias de al menos 10 nucleótiodos consecutivos incluidas en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 5 a 8 y SEC ID nº17, y sus secuencias complementarias, y
-
preferentemente, dichas secuencias SEC ID nº 5 a 8 y SEC ID nº 17 completas y sus secuencias complementarias.
En particular los oligonucleótidos según la presente invención poseen al menos 10 motivos nucleotídicos tales como los descritos anteriormente y a lo sumo 100, preferentemente a lo sumo 50 motivos. Más particularmente, un oligonucleótido según la presente invención posee preferentemente de 12 a 35 motivos, mas preferentemente aún de 18 a 22.
Las secuencias nucleotídicas según la invención pueden ser preparadas por síntesis química utilizando las técnicas sobradamente conocidas por el experto en la materia y que son descritas por ejemplo en el artículo de Itakura K. et al. [(1984) Annu. Rev. Biochem. 53; 323].
Una primera aplicación de un oligonucleótido según la invención es su utilización como sonda de especie para la detección, en una muestra biológica, de bacterias de las especie Thropheryma whippelii. En la continuación de la descripción, una sonda de la invención de este tipo será denominada sonda de especie.
Preferentemente, una sonda de especie según la invención está constituida por un oligonucleótido seleccionado de entre:
-
los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluida en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº11 y SEC ID nº12, y sus secuencias complementarias, y
-
los oligonucleótidos que tienen unas secuencias nucleotídicas seleccionadas de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12, y sus secuencias complementarias.
Las sondas según la invención pueden ser utilizadas, con fines de diagnóstico, en la búsqueda de la presencia o de la ausencia de un ácido nucleico diana en una muestra, según todas las técnicas de hibridación conocidas y en particular las técnicas de depósito puntual sobre filtro, denominadas "DOT-BLOT" [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], las técnicas de transferencia del ADN denominadas"SOUTHERN BLOT" [Southerm E. M., J. Mol. Biol. (1975) 98:503], las técnicas de transferencia de ARN denominadas "NORTHERM BLOT" o las técnicas denominadas "sándwich", con una sonda de captura y/o una sonda de detección, siendo capaces dichas sondas de hibridarse con dos regiones diferentes del ácido nucleico diana, y siendo al menos una de dichas sondas (generalmente la sonda de detección) capaz de hibridarse con una región de la diana que es específica de la especie, entendiéndose que la sonda de captura y la sonda de detección deben tener secuencias nucleotídicas al menos parcialmente
diferentes.
Se puede obtener el ácido nucleico que se ha de detectar (diana) después de una amplificación clásica, es decir dando el ADN, obtenido después de la amplificación por PCR, o del ARN, obtenido después de una amplificación transcripcional por TAM, NASBA, 3SR, etc... En el caso de la detección de una diana del tipo ácido nucleico de doble rama, conviene proceder a la desnaturalización de éste último antes de realizar el procedimiento de detección. El ácido nucleico diana puede ser obtenido por extracción según los métodos conocidos de los ácidos nucleicos de una muestra a examinar. Se puede realizar la desnaturalización de un ácido nucleico de doble rama mediante los métodos conocidos de desnaturalización química, física o enzimática, y en particular por calentamiento a una temperatura apropiada, superior a 80ºC.
Para realizar las técnicas de hibridación citadas anteriormente, y en particular las técnicas "sándwich", se inmoviliza una sonda de la invención, denominada sonda de captura sobre un soporte sólido, y se marca otra sonda de la invención, denominada sonda de detección, con un agente marcador. Los ejemplos de soporte y de agente marcador son tales como los definidos anteriormente.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de determinación de la presencia o de la ausencia de una bacteria Tropheryma whippelii, en una muestra que contiene o es susceptible de contener ácidos nucleicos de al menos una bacteria de este tipo, que comprende las etapas que consisten en poner en contacto dicha muestra con al menos una sonda de especie de la invención, y en determinar a continuación de forma conocida en sí misma la formación o la ausencia de formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda y el ácido nucleico de la
muestra.
Ejemplos de detección de formación o de ausencia de formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda y el ácido nucleico comprenden las técnicas "DOT-BLOT","SOUTHERN BLOT" y "sándwich".
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Según una realización particular de este procedimiento, para la determinación de la presencia o de la ausencia de una especie Tropheryma whippelii, se utilizan varias sondas de especie de la invención, entendiéndose que dichas sondas son capaces de hibridarse con una regiones que no se superponen de un ácido nucleico que corresponde al gen rpoB de Tropheryma whippelii.
De forma ventajosa, se inmoviliza una sonda de especie sobre un soporte sólido, y se marca una segunda sonda por un agente marcador, denominado sonda de detección, no siendo necesariamente ésta una sonda de especie.
Otra aplicación de un oligonucleótido de la invención es su utilización como iniciador nucleotídico que se puede utilizar en la síntesis de un ácido nucleico de Tropheryma whippelii en presencia de una polimerasa mediante un procedimiento conocido en sí mismo, en particular en unos métodos de amplificación que utilizan una síntesis de este tipo en presencia de una polimerasa (PCR, RT-PCR, etc.). En particular, se puede utilizar un iniciador de la invención para la transcripción inversa específica de una secuencia de ARN mensajero de Tropheryma whippelii para obtener la secuencia de ADN complementaria correspondiente. Una transcripción de este tipo puede constituir el primer estadio de la técnica RT-PCR, siendo el siguiente estadio la amplificación por PCR del ADN complementario obtenido. También se pueden utilizar iniciadores de la invención para la amplificación específica por reacción de polimerización en cadena de la secuencia total del ADN del gen rpoB de Tropheryma whippelii.
Según un caso particular, dicho iniciador, que comprende un oligonucleótido de la invención, comprende además la secuencia sentido o antisentido de un promotor reconocido por una ARN polimerasa (promotores T7, T3, SP6 por ejemplo [Studier FW, BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113]: dichos iniciadores se pueden utilizar en unos procedimientos de amplificación de ácido nucleico que hacen intervenir una etapa de transcripción, tales como, por ejemplo, las técnicas NASBA o 3SR [Van Gemen B. et al. Abstract MA 1091, 7th Internacional Conference on AIDS (1991) Florence, Italy].
Mas particularmente, un objeto de la invención es un iniciador nucleotídico que se puede utilizar para el secuenciado total o parcial del gen rpoB de una cepa cualquiera de Tropheryma whippelii, preferentemente una secuencia específica del gen rpoB de Tropheryma whippelii. En particular, el iniciador nucleotídico se puede utilizar para el secuenciado de un ácido nucleico amplificado. El secuenciado es la obtención de la secuencia total o parcial del gen rpoB por un procedimiento conocido en sí mismo, una polimerización abortiva que utiliza los di-desoxinucleótidos [Sanger F., Coulson AR (1975) J. Mol. Biol. 94:441] o hibridaciones múltiples que utilizan los chips de
ADN.
Preferentemente, en una utilización como iniciador para el secuenciado de una secuencia específica del gen rpoB de Tropheryma whippelii, se utiliza un oligonucleótido que está constituido por:
-
los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº11 y SEC ID nº12, y sus secuencias complementarias, y
-
los oligonucleótidos que tienen unas secuencias nucleotídicas seleccionadas de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12, y sus secuencias complementarias.
Por lo tanto, la presente invención proporciona asimismo un procedimiento de determinación de la presencia o de la ausencia de una bacteria Thropheryma whippelii en una muestra que contiene, o es susceptible de contener unos ácidos nucléicos de al menos una bacteria de este tipo, caracterizado porque se realiza una amplificación del ADN de la muestra con ayuda de dos iniciadores según la invención y se compara la secuencia obtenida con la secuencia SEC ID nº 9.
Más particularmente, se compara la secuencia del producto de amplificación obtenido realizando previamente su secuenciado.
Preferentemente, se realiza una amplificación del ADN de la muestra con ayuda de los dos iniciadores SEC ID nº 11 y 12 y se compara la secuencia obtenida con la secuencia SEC ID nº 10.
La invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de la siguiente exposición, dividida en dos ejemplos, que se refieren a unos experimentos realizados con el objetivo de realizar la invención y que son dados a título puramente ilustrativo y explicativo.
La figura nº 1 representa las posiciones de los iniciadores específicos y consensuales utilizados para la determinación de los fragmentos sucesivos del gen completo rpoB de la especie bacteriana Thropheryma whippelii.
La figura nº 2 representa la visualización de los productos de amplificación obtenidos con ayuda de los iniciadores SEC ID nº 11 y 12 visualizados por coloración con bromuro de etidio y después electroforesis sobre gel de agarosa del ejemplo 2.
\newpage
Diferentes términos, utilizados en la descripción y las reivindicaciones, son definidos a continuación:
-
por "ácido nucleico extraído de bacterias" se debe entender o bien el ácido nucleico total, o bien el ADN genómico, o bien los ARN mensajeros; o bien el ADN obtenido a partir de la transcripción inversa de los ARN mensajeros; o bien los ARN ribosómicos;
-
un "fragmento nucleotídico" o un "oligonucleótido" son dos términos sinónimos que designan un encadenamiento de motivos nucleotídicos caracterizado por una secuencia informativa de ácidos nucleicos naturales (o eventualmente modificados) y susceptibles de hibridarse, como los ácidos nucléicos naturales, con un fragmento nucleotídico complementario o sensiblemente complementario, en unas condiciones predeterminadas de astringencia estricta. El encadenamiento puede contener unos motivos nucleotídicos con una estructura diferente a la de los ácidos nucléicos naturales. Un fragmento nucleotídico (o oligonucleotídico) puede contener por ejemplo hasta 100 motivos nucleotídicos. Contiene generalmente 10, en particular al menos 12 motivos nucleotídicos y puede ser obtenido a partir de una molécula de ácido nucleico natural y/o por recombinación genética y/o por síntesis química,
-
un motivo nucleotídico es derivado de un monómero que puede ser un nucleótido natural de un ácido nucleico cuyos elementos constitutivos son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada seleccionada de entre la adenina, la guanina, el uracilo, la citosina, la timina; o bien el monómero es un nucleótido modificado en uno al menos de los tres elementos constitutivos anteriores; como ejemplo, la modificación puede intervenir o bien a nivel de las bases, con unas bases modificadas tales como la inosina, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5-desoxiuridina o cualquier otra base modificada capaz de hibridación, o bien a nivel del azúcar, por ejemplo el reemplazo de al menos una desoxirribosa por una poliamida [Nielsen PE et al., Science (1991) 254; 1497-1500], o bien incluso a nivel del grupo fosfato, por ejemplo por reemplazo mediante ésteres seleccionados en particular de entre los difosfatos, los alquilfosfonatos y los fosforotioatos,
-
por "hibridación" se debe entender el proceso durante el cual, en unas condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, que tienen unas secuencias suficientemente complementarias, son susceptibles de asociarse mediante unos enlaces hidrógeno estables y específicos, para formar una doble rama. Las condiciones de hibridación son determinadas por la "astringencia", es decir por el rigor de las condiciones operatorias. La hibridación es tanto más específica cuanto mayor es la astringencia bajo la que ésta se realiza. La astringencia es función en particular de la composición en bases de un duplex sonda/diana, así como del grado de desaparejamiento entre dos ácidos nucléicos. La astringencia también puede ser función de unos parámetros de la reacción de hibridación, tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. La astringencia de las condiciones en las que una reacción de hibridación debe ser realizada, depende en particular de las sondas utilizadas. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas eventualmente en cada caso mediante experimentos de rutina. Por lo general, según la longitud de las sondas utilizadas, la temperatura para la reacción de hibridación se sitúa entre aproximadamente 20 y 65ºC, en particular entre 35ºC y 65ºC en una solución salina con una concentración de aproximadamente 0,8 a 1 M,
-
una "sonda" es un fragmento nucleotídico que comprende por ejemplo de 10 a 100 motivos nucleotídicos, en particular de 12 a 35 motivos nucleotídicos, que posee una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para formar un complejo de hibridación con un ácido nucleico que tiene, en este caso, una secuencia nucleotídica incluida o bien en un ARN mensajero, o bien en un ADN obtenido por transcripción inversa de dicho ARN mensajero, producto de la transcripción; se puede utilizar una sonda con fines de diagnóstico (en particular sondas de captura o de detección) o con fines terapéuticos,
-
una "sonda de captura" es inmovilizada o inmovilizable sobre un soporte sólido mediante cualquier medio apropiado, por ejemplo por covalencia, por adsorción, o por síntesis directa sobre un sólido. Algunos ejemplos de soportes comprenden las placas de microtitulación y los chips de ADN, o unas partículas magnéticas, como las descritas en el documento WO 6 A-99/35500,
-
una "sonda de detección" puede ser marcada mediante un agente marcador escogido por ejemplo entre los isótopos radioactivos, las enzimas, en particular las enzimas susceptibles de actuar sobre un sustrato cromógeno, fluorígeno o luminiscente (en particular la peroxidasa o una fosfatasa alcalina), los compuestos químicos cromóforos, los compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes, los análogos de las bases nucleotídicas y los ligandos tales como la biotina,
-
una "sonda de especie" es una sonda que permite la identificación de la especie de una bacteria,
-
un "iniciador" es una secuencia que comprende por ejemplo de 10 a 100 motivos nucleotídicos y que posee una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo en una técnica de amplificación tal como la PCR, en un procedimiento de secuenciado, en un método de transcripción, etc.
Ejemplo 1
Secuencia completa del gen rpoB de Tropheryma whippelii
Se ha determinado la secuencia completa del gen rpoB de Tropheryma whippelii mediante la combinación sucesiva de dos técnicas, la amplificación enzimática y el secuenciado directo automático que utiliza en una primera etapa unos iniciadores conseso y a continuación en una segunda etapa la marcha sobre el gen mediante la técnica de "Genome Walker".
\vskip1.000000\baselineskip
1 - Amplificación enzimática asociada al secuenciado automático
Se han determinado los iniciadores consensuados que han permitido la obtención de un primer fragmento de la secuencia Tropheryma whippelii a partir de la comparación de las secuencias rpoB de Bacillus subtilis, Bartonella henselae, Borrelia burgdorferi, Buchnera aphidicola, Chlamydia peneumoniae, Chlamydia trachomatis, Coxiella bumetii, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Mycobacterium leprae, Mycobacterium smegmatis, Mycobactyerium tuberculosis, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas putida, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Samanolla enterica Typhimurium, Spiroplasma citri, Staphylococcus aureus, Synechocystis spp., Thermotoga maritima, Treponema pallidum y el Human Granulocytic Ehrlichiosis agent. Estas secuencias han sido escogidas por la alineación de las secuencias del ADN del gen rpoB de estas otras bacterias diferentes y seleccionando las que estaban mas conservadas con la hipótesis de que también estaban presentes en el gen rpoB de Tropheryma whippelii. Los iniciadores utilizados tenían como secuencia:
SEC ID nº1 = 5'-TIA TGG GII CIA AIA TGC A- 3' (posición 1967-1985)
SEC ID nº2 = 5'-GCC CAI CAT TCC ATI TCI CC- 3' (posición 3198-3217, inversa), en las que I representa la inopina.
La numeración de las posiciones mencionadas anteriormente y las que se mencionarán a continuación corresponden a unas posiciones sobre la secuencia completa SEC ID nº9.
Estos iniciadores han permitido la amplificación y después el secuenciado de un fragmento de 1400 pares de bases de las cuales 612 pares han sido secuenciados con ayuda de los iniciadores SEC ID nº1 y SEC ID nº2 y corresponde a la SEC ID nº 3 (posiciones 2063-2673) cuya secuencia es:
\vskip1.000000\baselineskip
1
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El secuenciado de este primer fragmento F1 ha permitido determinar unos iniciadores específicos de amplificación que, combinados en unas reacciones de amplificación PCR con unos iniciadores consensuales degenerados, han permitido alargar la secuencia SEC ID nº 3 sobre sus extremos 3' y 5' y han permitido obtener otros tres fragmentos que cabalgan F2, F3 y F4 para una longitud total de 2.750 pares de bases que corresponden a SEC ID nº4. Se indican la posición de los iniciadores y de los fragmentos en la figura nº1. El fragmento F3 (posiciones 1248 a 2163) ha sido obtenido mediante la aplicación de los iniciadores SEC ID nº13 (iniciador específico; posiciones 2145 a 2188): 5'-CGG AAA CAT CCC CCA CAAT- 3' y SEC ID nº14 (iniciador consensuado; posiciones 1248 a 1264): 5'-ACC GAC GAT ATC GAC CA- 3'; el fragmento F2 (posiciones 2592 a 3229) ha sido obtenido mediante la aplicación de los iniciadores SEC ID nº 15 (iniciador específico; posiciones 2592 a 2610): 5'-TTG GTA AGG TGA CCC CAA A- 3' y SEC ID nº 16 (iniciador consensuado: posiciones 3213 a 3229) :5'-GGT AAA GCG CAG TTC GG- 3'; el fragmento F4 (posiciones 484 a 1331) ha sido obtenido mediante la aplicación de los iniciadores SEC ID nº17 ((iniciador específico; posiciones 1315 a 1331): 5'-CCA GCC CGG AGC TGG TT- 3' y SEC ID nº 18 (iniciador consensuado: posiciones 484 a 498) :5'-TTT CAT TTG CCA AGC- 3';
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2
3
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Las siguientes tentativas para alargar esta secuencia mediante la técnica de los iniciadores consensuados han fracasado seguidamente no permitiendo proseguir el secuenciado del gen según esta aproximación. En particular se han testado sin éxito los siguientes iniciadores consensuados seleccionados de entre las secuencias mejor conservadas de los genes rpoB de otras bacterias filogenéticamente cercanas a la Tropheryma whippelii; Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus licheniformis y Salmonella enterica Typhimurium: Balichtf: 5' -GGT AAA GCG CAG TTC GG-3' (SEC ID nº19);Balich 460f: 5' -GTC ATT CCA AAC CGT GG-3' (SEC ID nº20);Balich37f: 5' -CTA TGC ACG CAT TAG CGA-3' (SEC ID nº21); Myco12F: 5' -GAA CCG CTT GAG GTT C-3' (SEC ID nº22); Myco43F: 5' -ACC TTC ATC ATC AAC GG-3' (SEC ID nº23); Myco8R: 5' -GAT TCG TTG CGG GACA-3' (SEC ID nº24).
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2 - Marcha sobre el gen mediante la técnica del "Genoma Walker"
Este fracaso, que se produce sobre la cepa Tropheryma whippelii en cultivo explica que habría sido imposible obtener a fortiori la totalidad de la secuencia del gen rpoB del Tropheryma whippelii a partir de unas muestras clínicas que contienen la bacteria Tropheryma whippelii. Se ha aplicado una segunda técnica denominada de "marcha sobre el genoma" seguidamente con la finalidad de completar la secuencia de Tropheryma whippelii rpoB en la dirección 3' y en la dirección 5'. Esta técnica ha sido descrita [(1995) Siebert et al. Nucl. Acids Res. 23: 1087-1088] y consiste en realizar un banco del ADN genómico de la bacteria y después amplificar unos fragmentos de este banco con ayuda de unos iniciadores universales independientes de la secuencia buscada y de unos iniciadores específicos de la secuencia buscada. Después de haber extraído una gran cantidad de ADN (del orden de un microgramo) purificado a partir de la cepa bacteriana Tropheryma whippelii Twist descrita en el documento WO 00/58440, el ADN bacteriano es fragmentado por digestión enzimática con ayuda de endonucleasas de restricción y los fragmentos así obtenidos son unidos por uno de sus dos extremos a unos oligonucleótidos sintéticos, denominados adaptadores suministrados en un estuche comercializado (Genome Walker kit®, Clontech Laboratories, Palo Alto, California). Unos oligonucleótidos complementarios de unos adaptadores, también suministrados en el mismo estuche de laboratorio, constituyen entonces unos iniciadores de amplificación para la técnica de amplificación para la técnica de amplificación enzimática en cadena ("polymerase Chain reaction", PCR). Estos oligonucleótidos constituyen por lo tanto unos iniciadores universales que son utilizados en esta técnica independientemente de la secuencia del ADN bacteriano estudiado. Con la finalidad de realizar las reacciones de PCR, un segundo oligonucleótido debe ser incorporado como iniciador de amplificación en las reacciones PCR. Este oligonucleótido iniciador debe responder a varios criterios y la determinación de su secuencia constituye por lo tanto un aspecto de la invención: (1) la secuencia de este oligonucleótido es complementaria de la SEC ID nº 4 (2) este oligonucleótido está posicionado a una cincuentena de bases del extremo de la SEC ID nº 4 (3) este oligonucleótido tiene una longitud superior a 20 bases. La utilización de un primer nucleótido que presenta estas características que corresponden a la secuencia SEC ID nº5 = 5'-CTT ATC TCG CCC GTA TCA TG-3' (posición 627-646, inversa) ha permitido obtener un fragmento F6 (posición 146 a 646) de 500 pares de bases. Sobre la base de la secuencia obtenida de esta forma, la utilización de un segundo oligonucleótido específico que corresponde a la secuencia SEC ID nº 6 = 5'- CCA GTC AAA ACT ATC GAG CTG CAA A-3' (posición 307-331, inversa) ha permitido la amplificación de un fragmento F8 de 1.100 pares de bases que contiene el extremo 3' del gen rpoB (posiciones 1 a 331) y que se extienden corriente abajo de este extremo. Por otra parte, sobre la base de la secuencia SEC ID nº 4, se ha alargado la secuencia SEC ID nº4 en el sentido 5' mediante la utilización de un oligonucleótido SEC ID nº 7: 5' TTC TCT ATG ATG GCC GCA C- 3' (posición 3168-3187) de un fragmento F5 (posiciones 3168 a 3668) de 500 pares de bases. Finalmente, sobre la base de este último fragmento, se ha determinado un oligonucleótido específico de secuencia SEC ID nº 8: 5'-GCA GCG CTT CGG AGA GAT GGA G-3' (posición 3357-3379) que ha permitido obtener un fragmento F7 de 1500 pares de bases que contiene el extremo 5' del gen rpoB (posiciones 3357 a 3657) y que se extiende más allá de este extremo. Esta técnica de marcha sobre el genoma supone la obtención de una gran cantidad de ADN cromosómico de Tropheryma whippelii y su aplicación ha sido posible mediante la obtención de la cepa Twist de la bacteria Tropheryma whippelii y la extracción en gran cantidad de ADN a partir de dicha cepa. La obtención de una cepa aislada y cultivada de Tropheryma whippelii era necesaria para la determinación de la secuencia integra de rpoB en la bacteria Tropheryma whippelii.
La amplificación del banco genómico con ayuda de poligonucleótidos SEC ID nº 5 a SEC ID nº 8 ha permitido alargar en los sentidos 3' y 5' la secuencia SEC ID nº 4 con la finalidad de obtener la secuencia completa del gen rpoB de Tropheryma whippelii cepa Twist. La secuencia completa del gen rpoB de Tropheryma whippelii obtenida por aplicación de estas técnicas de amplificación consensual y de marcha sobre el genoma depositada en el GenBank como número de acceso (accession number) AF243072, corresponde a la SEC ID nº 9.En total, esta secuencia SEC ID nº 9 ha sido obtenida según el esquema de la figura nº 1 que precisa la posición de los iniciadores consensuales y unos fragmentos sucesivos obtenidos:
En la secuencia SEC ID nº 9 representada a continuación, la secuencia SEC ID nº4 está subrayada, y la secuencia en negrita son por orden:
SEC ID nº 6 (secuencia complementaria),
SEC ID nº 5 (secuencia complementaria),
SEC ID nº 11 (secuencia idéntica),
SEC ID nº 12 (secuencia complementaria),
SEC ID nº 7 (secuencia idéntica),
SEC ID nº 8 (secuencia idéntica),
4
5
6
Esta secuencia mide 3.657 pares de bases y presenta un contenido en citosina más guanosina de 50,4%.
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Ejemplo 2
Detección específica del gen rpoB de Tropheryma whippelii
Se han determinado dos iniciadores específicos a partir de la secuencia ID nº 9 de manera que encuadren de forma específica un fragmento de 507 pares de bases del gen rpoB de Tropheryma whippelii de secuencia SEC ID nº 10 = 5'- TTGAGCGCACGCCGGAAAAAAACAGTGAAAAGGATCTTTTTTCGGGCAGAATAATCCCCGCTCGCGGTG
CTTGGCTAGAATTCGAAGTTGACAGGCATGACCAGCTTGGCGTTAGGGTTGACAGGAAGCGCAGGCAGC
CGGTTATTTTCTTTCTGAGAGCAATTGGCATGACTGATGATGAGATCAGGGATGCATTTGGCGAGTTTGAA
CAATAAGCGTCCAGCACGAAAAGAATATTGGGCTGTCCAGAGATGACGCGCTCCGGGAAATATACCGTCG
CGTTCGTCCGGGGGAGCAGGCATCGGCTGAGGCTGGGCGTGCACTCTTAGAGAATTTTTACTTTACCAGC
AGACGTTTTGACCTGCAAGGGTTGGAAGGTACAAAGTAAATCGCAAACTCGGTGTTGATGTTGATCCAAC
TCGGATGGTTCTTACGAGGTCGGATATTATCGCAACAATTCGTTATCTCGCGGCCTTGCATCTCGGTTTCTC
CGAGGTTGCGGTGC - 3'
Se ha realizado in situ la determinación de estos dos iniciadores SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 con el fin de respetar las limitaciones propias de los iniciadores de identificación molecular. El enunciado de estas limitaciones forma parte integrante del proceso inventivo por lo que no está disponible en la actualidad en la bibliografía científica: (1) longitud de 18-22 pares de bases (2) secuencias de los dos iniciadores que presentan un temperatura de fusíón próxima (3) secuencias de los dos iniciadores que no permiten la autohibridación ni la complementariedad (4) secuencia enmarcada por estos dos iniciadores específicos de la bacteria Tropheryma whippelii; esta condición es verificada después del alineación de la SEC ID nº 9 con el conjunto de las secuencias de los genes bacterianos rpoB disponibles en los bancos de datos informáticos; (5) secuencia enmarcada por estos dos iniciadores que presentan una longitud óptima de aproximadamente 500 pares de bases; esta longitud óptima que corresponde a un compromiso entre la búsqueda de una zona de identificación lo más larga posible que permita por lo tanto la mayor discriminación posible entre una secuencia cualquiera salida de la SEC ID nº 9 y el conjunto de secuencias rpoB bacterianas homologas conocidas y la búsqueda de una zona de identificación lo mas corta posible con la finalidad de aumentar lo mas posible la sensibilidad de detección molecular. Es en efecto conocido que existe una relación inversa entre la sensibilidad de detección y la longitud de la secuencia de ADN bacteriano a detectar en una muestra. Finalmente, el tamaño de 500 pares de bases corresponde a la longitud media de la secuencia obtenida después de un paso sobre un secuenciador automático disponible actualmente. Estos dos iniciadores están localizados respectivamente en la posición 713-745 y 1181-1200 de la secuencia SEC ID nº 9 del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelii. La secuencia de estos dos iniciadores es la siguiente:
SEC ID nº 11= 5'-TTG AGC GCA CGC CGG AAA AA-3'
SEC ID nº 12= 5'-GCA CCG CAA CCT CGG AGA AA-3'. (iniciador inverso complementario)
La región del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelii enmarcada por estos dos iniciadores, región denominada SEC ID nº 10 (posición 713-1200) presenta el mayor nivel de discriminación, a saber un porcentaje de homología inferior a 70% con respecto a las otras regiones del mismo gen, incluso con respecto a la región SEC ID nº 3 que presenta un porcentaje de homología de 75 a 85%.
Es importante mantener la proporción de discriminación lo más alta posible con la finalidad de tener en cuenta el margen de error introducido durante las manipulaciones de las muestras en la práctica de laboratorio de diagnóstico y que resultan de los errores de amplificación cometidos por las polimerasas termoestables, en particular la Taq polimerasa y de los errores de secuenciado. Los errores introducidos de esta forma son del orden del 0,5%.
El gen rpoB ha sido amplificado mediante la técnica PCR que utiliza 35 ciclos de amplificación que comprenden cada uno una de las fases de desnaturalización de 94ºC durante 30 segundos, una fase de hibridación de los iniciadores SEC ID nº11 y 12 a 58ºC durante 30 segundos y una fase de elongación a 72ºC durante 60 segundos. El producto de amplificación es visualizado después de la coloración mediante bromuro de etidio (Figura 2). Las bacterias control: Mycobacterium avium, Mycobacterium tuberculosis, Nocardia otitidiscaviarium, Escherichia coli, Staphyloccocus epidermidis, Corynebacterium amycolatum no han sido amplificadas por los oligonucleótidos iniciadores SEC ID nº 11 y 12, demostrando la especificidad de estos iniciadores sobre unas especies bacterianas filogenéticamente próximas de la Tropheryma whippelii. Esta técnica ha sido aplicada a la detección de la presencia o de la ausencia del gen rpoB de Tropheryma whippelii en diez biopsias de yeyuno obtenidas de diez pacientes diferentes de las que tres biopsias habían mostrado contener anteriormente ADN de Tropheryma whippelii de forma independiente y de las que siete se habían mostrado exentas del ADN de Tropheryma whippelii. Se ha aplicado de forma ciega esta técnica después del codificado de las diez muestras, no conociendo los experimentadores los códigos y no conociendo por lo tanto la calidad de las muestras trabajadas. Esta técnica ha permitido detectar el 100% de los verdaderos positivos y el 100% de los verdaderos negativos. Los productos de amplificación obtenidos para las tres biopsias positivas han sido secuenciados y las tres secuencias obtenidas tenían 100% de homología con la SEC ID nº 10.
En la figura 2 están representados los productos de amplificación PCR obtenidos a partir de diez biopsias de yeyuno tomadas de unos pacientes que presentan una enfermedad de Whipple confirmada (columnas D, I y K) y que no presentan una enfermedad de Whipple (columnas C, E, F, G, H, J y L.). Las columnas A y N representan el marcador de peso molecular, las columnas B y M corresponden a los testigos de amplificación negativos (agua estéril). Los productos de amplificación son obtenidos después de incorporar los iniciadores SEC ID nº 11 y nº 12 según la invención y son visualizados por coloración con bromuro de etidio después de la electroforesis sobre gel de agarosa.
<110> Université de la Méditerranée (Aix-Marseille II)
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<120> Secuencia del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelii y oligonucleótido para el diagnóstico molecular de la enfermedad de Whipple
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<130> H52439-4
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<140>
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<141>
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<160> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 1
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tnatgggnnc naanatgca
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19
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
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<400> 2
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gcccancatt ccatntcncc
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20
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<210> 3
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<211> 610
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<212> ADN
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<213> Tropheryma whippelii
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<400> 3
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7
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<212> ADN
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<213> Tropheryma whippelii
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<400> 4
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8
9
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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cttatcacgc ccgtatcatg
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20
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<210> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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ttctctatga tggccgcac
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19
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<210> 8
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<212> ADN
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10
11
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<211> 507
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<212> ADN
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<213> Tropheryma whippelii
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<213> Secuencia artificial
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccagcccgga gctggtt
\hfill
17
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<210> 18
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskip
tttcatttgc caagc
\hfill
15
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<210> 19
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggtaaagcgc agttcgg
\hfill
17
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<210> 20
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtcattccaa accgtgg
\hfill
17
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<210> 21
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctatgcacgc attagcga
\hfill
18
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<210> 22
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaaccgcttg aggttc
\hfill
16
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<210> 23
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskip
accttcatca tcaacgg
\hfill
17
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<210> 24
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: iniciador
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<400> 24
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\hskip-.1em\dddseqskip
gattcgttgc gggaca
\hfill
16

Claims (14)

1. Secuencia total del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelli, caracterizada porque está constituida por la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9.
2. Oligonucleótido cuya secuencia nucleotídica consiste en una secuencia del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelli de al menos 10 nucleótidos, comprendida en la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9 y no comprendida en su integridad en la secuencia SEC ID nº 3 o una secuencia complementaria de dicha secuencia.
3. Oligonucleótido cuya secuencia es una secuencia específica de la bacteria Tropheryma whippelli, que comprende una secuencia del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelli de al menos 10 nucleótidos, comprendida en la secuencia nucleotídica SEC ID nº 9 y no comprendida en su integridad en la secuencia SEC ID nº 3 o una secuencia complementaria de dicha secuencia.
4. Oligonucleótido según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque presenta una secuencia nucleotídica de al menos 10 motivos nucleotídicos consecutivos, incluida en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias.
5. Oligonucleótido según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque presenta una secuencia seleccionada de entre:
- las secuencias de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluidos en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 5 a 8, y SEC ID nº 17 y sus secuencias complementarias.
6. Oligonucleótido según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque presenta una secuencia seleccionada de entre las secuencias completas SEC ID nº 5 a 8, y SEC ID nº 11, 12 y 17 y sus secuencias complementarias.
7. Sonda para la detección, en una muestra biológica, de bacterias de la especie Tropheryma whippelli, caracterizada porque comprende un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 2 a 6.
8. Sonda según la reivindicación 7, caracterizada porque está constituida por un oligonucleótido seleccionado de entre:
-
los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias, y
-
los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias.
9. Procedimiento para determinar la presencia o la ausencia de una bacteria de la especie Tropheryma whippelli en una muestra que contiene o es susceptible de contener ácidos nucléicos de al menos una bacteria de este tipo, caracterizado porque se pone en contacto dicha muestra con al menos una sonda según una de las reivindicaciones 7 u 8, y se determina a continuación la formación o la ausencia de formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda y el ácido nucleico de la muestra.
10. Iniciador nucleotídico que se puede utilizar para la síntesis de una secuencia específica del gen rpoB de Tropheryma whippelii en presencia de una polimerasa, caracterizado porque comprende un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 2 a 6.
11. Iniciador según la reivindicación 10, caracterizado porque está constituido por un oligonucleótido seleccionado de entre:
-
los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica de al menos 10 nucleótidos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias, y
-
los oligonucleótidos que tienen una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias completas SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12 y sus secuencias complementarias.
12. Procedimiento para determinar de la presencia o de la ausencia de una bacteria de la especie Tropheryma whippelii en una muestra que contiene, o es susceptible de contener, ácidos nucléicos de al menos una bacteria de este tipo, caracterizado porque se realiza una amplificación del ADN de la muestra con ayuda de dos iniciadores según una de las reivindicaciones 10 u 11 y se compara la secuencia obtenida con la secuencia SEC ID
nº 9.
\newpage
13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque se compara la secuencia del producto de amplificación obtenido realizando previamente su secuenciado.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque se realiza una amplificación del ADN de la muestra con ayuda de los dos iniciadores SEC ID nº 11 y 12 y se compara la secuencia obtenida con la secuencia SEC ID nº 10.
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