JPH0751061A - 耐熱性ｄｎａポリメラーゼ及びその製造方法 - Google Patents
耐熱性ｄｎａポリメラーゼ及びその製造方法Info
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- JPH0751061A JPH0751061A JP21481993A JP21481993A JPH0751061A JP H0751061 A JPH0751061 A JP H0751061A JP 21481993 A JP21481993 A JP 21481993A JP 21481993 A JP21481993 A JP 21481993A JP H0751061 A JPH0751061 A JP H0751061A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びその
製造方法を提供する。 【構成】 （１）デオキシリボ核酸に相補的なデオキシ
ヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応を触媒す
る。４種類のデオキシリボヌクレオシド ５′−３リン
酸を必要とする。ジデオキシチミジン ５′−３リン酸
に対して感受性を示す。なる作用及び基質特異性、
（２）ｐＨ７．５で９０℃、３０分において安定な熱安
定性、（３）約８０℃の至適温度、（４）約８の至適ｐ
Ｈなる理化学的性質を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
ピロコッカス属の菌体を培養することによる前記ポリメ
ラーゼの製造方法。 【効果】 遺伝子塩基配列の解析、その他遺伝子操作実
験に有用な酵素である。
製造方法を提供する。 【構成】 （１）デオキシリボ核酸に相補的なデオキシ
ヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応を触媒す
る。４種類のデオキシリボヌクレオシド ５′−３リン
酸を必要とする。ジデオキシチミジン ５′−３リン酸
に対して感受性を示す。なる作用及び基質特異性、
（２）ｐＨ７．５で９０℃、３０分において安定な熱安
定性、（３）約８０℃の至適温度、（４）約８の至適ｐ
Ｈなる理化学的性質を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
ピロコッカス属の菌体を培養することによる前記ポリメ
ラーゼの製造方法。 【効果】 遺伝子塩基配列の解析、その他遺伝子操作実
験に有用な酵素である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子解析用として有
用なＤＮＡポリメラーゼ、更に詳細に説明すればピロコ
ッカス（Pyrococcus) 属に属する菌体由来の耐熱性を有
するＤＮＡポリメラーゼ、及びその製造方法に関する。
用なＤＮＡポリメラーゼ、更に詳細に説明すればピロコ
ッカス（Pyrococcus) 属に属する菌体由来の耐熱性を有
するＤＮＡポリメラーゼ、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡポリメラーゼは、そのアミノ酸配
列から大きく４つのファミリーに分類することができ
る。その中でこれまで遺伝子工学用試薬として一般に利
用されているＤＮＡポリメラーゼは、主として大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩに代表されるファミリーＡ（ポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼ）と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼII
やヒトＤＮＡポリメラーゼαに代表されるファミリーＢ
（α型ＤＮＡポリメラーゼ）である。ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション（ＰＣＲ）法が開発されて以来、
耐熱性を示すＤＮＡポリメラーゼが注目されているが、
最近超耐熱性古細菌由来のα型の耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼが発見された。それらはジーン（Gene)、第１０８
巻、第１〜６頁（１９９１）やプロシーディングズ オ
ブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ＵＳＡ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 、第
８９巻、第５５７７〜５５８１頁（１９９２）に記載さ
れており、ＰＣＲ法に適した酵素として市販されてい
る。上記の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはそのアミノ酸配
列から、いずれもα型ＤＮＡポリメラーゼであり、ジデ
オキシヌクレオシド ５′−３リン酸感受性が低いため
塩基配列決定法の１つであるジデオキシ法には汎用され
ない。一方、現在ジデオキシ法に利用されているものは
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、
Ｔ７ファージＤＮＡポリメラーゼ修飾体、サーマスアク
アティカスＤＮＡポリメラーゼ、バチルスカルドテナッ
クスＤＮＡポリメラーゼなどすべてジデオキシヌクレオ
シド ５′−３リン酸に感受性のポルＩ型ＤＮＡポリメ
ラーゼである。
列から大きく４つのファミリーに分類することができ
る。その中でこれまで遺伝子工学用試薬として一般に利
用されているＤＮＡポリメラーゼは、主として大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩに代表されるファミリーＡ（ポルＩ
型ＤＮＡポリメラーゼ）と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼII
やヒトＤＮＡポリメラーゼαに代表されるファミリーＢ
（α型ＤＮＡポリメラーゼ）である。ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション（ＰＣＲ）法が開発されて以来、
耐熱性を示すＤＮＡポリメラーゼが注目されているが、
最近超耐熱性古細菌由来のα型の耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼが発見された。それらはジーン（Gene)、第１０８
巻、第１〜６頁（１９９１）やプロシーディングズ オ
ブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシー
ズ オブ ザ ＵＳＡ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 、第
８９巻、第５５７７〜５５８１頁（１９９２）に記載さ
れており、ＰＣＲ法に適した酵素として市販されてい
る。上記の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはそのアミノ酸配
列から、いずれもα型ＤＮＡポリメラーゼであり、ジデ
オキシヌクレオシド ５′−３リン酸感受性が低いため
塩基配列決定法の１つであるジデオキシ法には汎用され
ない。一方、現在ジデオキシ法に利用されているものは
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、
Ｔ７ファージＤＮＡポリメラーゼ修飾体、サーマスアク
アティカスＤＮＡポリメラーゼ、バチルスカルドテナッ
クスＤＮＡポリメラーゼなどすべてジデオキシヌクレオ
シド ５′−３リン酸に感受性のポルＩ型ＤＮＡポリメ
ラーゼである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ジデオキシ法でシーク
エンシングを行う場合、高温で反応できる耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼは鋳型の２次構造形成の問題も少なく、ま
た反応をＰＣＲ法のように繰返すことでシグナル強度を
上げるサイクルシークエンシングも可能である。本発明
の目的は、ジデオキシ法による遺伝子解析に有用な新規
な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びその製造方法を提供
することにある。
エンシングを行う場合、高温で反応できる耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼは鋳型の２次構造形成の問題も少なく、ま
た反応をＰＣＲ法のように繰返すことでシグナル強度を
上げるサイクルシークエンシングも可能である。本発明
の目的は、ジデオキシ法による遺伝子解析に有用な新規
な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びその製造方法を提供
することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は下記の理化学的性質を示す耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼに関する。 （１）作用及び基質特異性 鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデオキシリボ
ヌクレオシド ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共
有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的な
デオキシヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応
を触媒する。本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオ
シド ５′−３リン酸を必要とする。ジデオキシチミジ
ン ５′−３リン酸（ｄｄＴＴＰ) に対して感受性を示
す。 （２）熱安定性 ｐＨ７．５において、９０℃、３０分の処理では活性の
低下は認められない。 （３）至適温度 ｐＨ７．５において、３７℃〜９０℃の測定範囲で活性
を有し、至適温度は約８０℃である。 （４）至適ｐＨ ７５℃でトリス塩酸緩衝液の緩衝能の範囲であるｐＨ
６．５から８．９において活性を有し、その至適ｐＨは
約８である。 また本発明の第２の発明は第１の発明の耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの製造方法に関する発明であって、ピロコッ
カス属に属する菌体を培養し、培養物より第１の発明の
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とす
る。
発明の第１の発明は下記の理化学的性質を示す耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼに関する。 （１）作用及び基質特異性 鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデオキシリボ
ヌクレオシド ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共
有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的な
デオキシヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応
を触媒する。本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオ
シド ５′−３リン酸を必要とする。ジデオキシチミジ
ン ５′−３リン酸（ｄｄＴＴＰ) に対して感受性を示
す。 （２）熱安定性 ｐＨ７．５において、９０℃、３０分の処理では活性の
低下は認められない。 （３）至適温度 ｐＨ７．５において、３７℃〜９０℃の測定範囲で活性
を有し、至適温度は約８０℃である。 （４）至適ｐＨ ７５℃でトリス塩酸緩衝液の緩衝能の範囲であるｐＨ
６．５から８．９において活性を有し、その至適ｐＨは
約８である。 また本発明の第２の発明は第１の発明の耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの製造方法に関する発明であって、ピロコッ
カス属に属する菌体を培養し、培養物より第１の発明の
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とす
る。
【０００５】本発明者らは、前記課題を解決するため、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで従来の超耐熱性古細菌由来
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが属するαタイプとは異な
り、かつシークエンシングに有用な耐熱性ポリメラーゼ
を見出すことを目的として、鋭意研究を重ねた結果、ピ
ロコッカス属に属する菌株から、よりｄｄＴＴＰ感受性
の高い耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを見出すことに成功し
た。すなわち、本発明はαタイプポリメラーゼが感受性
を示すアフィジコリン（Aphidicolin)には耐性で、しか
も塩基配列決定の１つの手段であるジデオキシ法に有用
なｄｄＴＴＰに対して他の耐熱性ポリメラーゼより高い
感受性を有する耐熱性ポリメラーゼ、及びその製造方法
に関する。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで従来の超耐熱性古細菌由来
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが属するαタイプとは異な
り、かつシークエンシングに有用な耐熱性ポリメラーゼ
を見出すことを目的として、鋭意研究を重ねた結果、ピ
ロコッカス属に属する菌株から、よりｄｄＴＴＰ感受性
の高い耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを見出すことに成功し
た。すなわち、本発明はαタイプポリメラーゼが感受性
を示すアフィジコリン（Aphidicolin)には耐性で、しか
も塩基配列決定の１つの手段であるジデオキシ法に有用
なｄｄＴＴＰに対して他の耐熱性ポリメラーゼより高い
感受性を有する耐熱性ポリメラーゼ、及びその製造方法
に関する。
【０００６】本発明の酵素を生産する菌株としては、ピ
ロコッカス属に属する菌株、例えばピロコッカス フリ
オサス（ Pyrococcus furiosus )ＤＳＭ ３６３８が挙
げられ、該菌株はドイッチェ ザムルンク フォン ミ
クロオルガニスメン ウントツェルクルチェウレンＧｍ
ｂＨより入手可能である。該菌株を適当な増殖培地中で
培養し、次いで、培養物より本発明の酵素を得ることが
できる。
ロコッカス属に属する菌株、例えばピロコッカス フリ
オサス（ Pyrococcus furiosus )ＤＳＭ ３６３８が挙
げられ、該菌株はドイッチェ ザムルンク フォン ミ
クロオルガニスメン ウントツェルクルチェウレンＧｍ
ｂＨより入手可能である。該菌株を適当な増殖培地中で
培養し、次いで、培養物より本発明の酵素を得ることが
できる。
【０００７】以下、ピロコッカス属の菌株を例として説
明する。本発明の酵素を製造するに当っては、通常の超
耐熱性菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地に加
える栄養源は使用する菌株が利用し得るものであればよ
い。炭素源としては、例えばでんぷん等が利用でき、窒
素源としては、例えばトリプトン、ペプトン等が利用で
き、他の栄養源としては、例えば、酵母エキス等が利用
できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウム塩、
鉄塩などの金属塩を微量元素として加えてもよい。また
例えば、本発明の実施例におけるごとく培地の調製に人
工海水を用いることが有利である。また、培地は固形の
硫黄元素を含んでいない透明な培地が望ましく、該培地
を用いれば、菌体の増殖は光学密度を測定することによ
り容易に監視することができる。培養に当っては、静置
培養又はかくはん培養で行うことができるが、例えば特
表平４−５０３７５７号公報に記載のごとく、通気培養
を行ってもよいし、例えばアプライド アンド エンバ
イロンメンタル マイクロバイオロジー（ Appl. Env.
Microbiol. )、第５５巻、第２０８６〜２０８８頁（１
９９２）に記載のように、透析培養法を用いてもよい。
一般に培養温度は、９５℃前後が好ましく、通常７．５
時間程度で本発明のＤＮＡポリメラーゼが培養物中に蓄
積する。培養条件は、使用する菌体、培地組成に応じ本
発明のＤＮＡポリメラーゼの生産量が最大になるように
設定するのは当然のことである。
明する。本発明の酵素を製造するに当っては、通常の超
耐熱性菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地に加
える栄養源は使用する菌株が利用し得るものであればよ
い。炭素源としては、例えばでんぷん等が利用でき、窒
素源としては、例えばトリプトン、ペプトン等が利用で
き、他の栄養源としては、例えば、酵母エキス等が利用
できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウム塩、
鉄塩などの金属塩を微量元素として加えてもよい。また
例えば、本発明の実施例におけるごとく培地の調製に人
工海水を用いることが有利である。また、培地は固形の
硫黄元素を含んでいない透明な培地が望ましく、該培地
を用いれば、菌体の増殖は光学密度を測定することによ
り容易に監視することができる。培養に当っては、静置
培養又はかくはん培養で行うことができるが、例えば特
表平４−５０３７５７号公報に記載のごとく、通気培養
を行ってもよいし、例えばアプライド アンド エンバ
イロンメンタル マイクロバイオロジー（ Appl. Env.
Microbiol. )、第５５巻、第２０８６〜２０８８頁（１
９９２）に記載のように、透析培養法を用いてもよい。
一般に培養温度は、９５℃前後が好ましく、通常７．５
時間程度で本発明のＤＮＡポリメラーゼが培養物中に蓄
積する。培養条件は、使用する菌体、培地組成に応じ本
発明のＤＮＡポリメラーゼの生産量が最大になるように
設定するのは当然のことである。
【０００８】本発明のＤＮＡポリメラーゼを採取するに
当っては、例えば培養液から遠心分離、ろ過などによっ
て菌体を集め、次いで菌体を破砕すればよく、菌体の破
砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌酵素処
理等があり、これらの方法を利用して菌体中より本発明
のＤＮＡポリメラーゼを抽出することができる。なお、
酵素の抽出は使用する菌体によって最も抽出効果の高い
方法を採用して粗酵素液を調製すればよい。かくして得
られた粗酵素液からＤＮＡポリメラーゼを単離するに当
っては、通常の酵素の精製に用いられる方法を使用でき
る。例えば、硫安塩析処理、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等の方法を組
合せて使用できる。
当っては、例えば培養液から遠心分離、ろ過などによっ
て菌体を集め、次いで菌体を破砕すればよく、菌体の破
砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌酵素処
理等があり、これらの方法を利用して菌体中より本発明
のＤＮＡポリメラーゼを抽出することができる。なお、
酵素の抽出は使用する菌体によって最も抽出効果の高い
方法を採用して粗酵素液を調製すればよい。かくして得
られた粗酵素液からＤＮＡポリメラーゼを単離するに当
っては、通常の酵素の精製に用いられる方法を使用でき
る。例えば、硫安塩析処理、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等の方法を組
合せて使用できる。
【０００９】例えば、ピロコッカス フリオサスＤＳＭ
３６３８の培養菌体より調製される粗酵素液のフラク
トゲルＴＭＡＥ（メルク社製）クロマトグラフィー、ホ
スホセルロースＰ−１１（ワットマン社製）クロマトグ
ラフィー、ハイトラップヘパリン（ファルマシア社製）
クロマトグラフィー、セファクリルＳ−３００（ファル
マシア社製）クロマトグラフィー等を行うことにより、
本発明のＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。
３６３８の培養菌体より調製される粗酵素液のフラク
トゲルＴＭＡＥ（メルク社製）クロマトグラフィー、ホ
スホセルロースＰ−１１（ワットマン社製）クロマトグ
ラフィー、ハイトラップヘパリン（ファルマシア社製）
クロマトグラフィー、セファクリルＳ−３００（ファル
マシア社製）クロマトグラフィー等を行うことにより、
本発明のＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。
【００１０】次に本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
理化学的性質について述べる。 （１）作用及び基質特異性 鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にジオキシリボ
ヌクレオシド ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共
有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的な
デオキシヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応
を触媒する。本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオ
シド ５′−３リン酸を必要とする。また、ジデオキシ
チミジン ５′−３リン酸（ｄｄＴＴＰ）に対して感受
性を示し、α型のＤＮＡポリメラーゼではない。
理化学的性質について述べる。 （１）作用及び基質特異性 鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にジオキシリボ
ヌクレオシド ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共
有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的な
デオキシヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応
を触媒する。本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオ
シド ５′−３リン酸を必要とする。また、ジデオキシ
チミジン ５′−３リン酸（ｄｄＴＴＰ）に対して感受
性を示し、α型のＤＮＡポリメラーゼではない。
【００１１】（２）酵素活性測定方法 ２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８、２４℃にて
の値）、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．
１％ トリトンＸ−１００、０．０１％ ＢＳＡ、４０
μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０μＭ 〔 3
Ｈ〕ＴＴＰ上記液に最終濃度が０．２ｍｇになるように
活性化した仔牛胸腺ＤＮＡを加えオートクレーブ水を反
応液の全量が１００μｌになるように加える。この反応
液に酵素液を添加し、ゆるやかに混和後、７５℃で７．
５分間加温する。反応終了後、速やかに氷づけにした
後、ＤＥペーパー（ワットマン社製）にてろ過を行う。
フィルターを５％リン酸水素２ナトリウムにて洗浄し、
液体シンチレーションカウンタにて、フィルター上の〔
3Ｈ〕を測定し、酸不溶性画分への〔 3Ｈ〕ＴＴＰの取
り込み量を計算する。本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼの活性の表示は上記条件下で３０分間に１０ｎｍｏｌ
のＴＴＰの酸不溶画分への取り込みを１単位（Ｕ）とす
る。
の値）、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．
１％ トリトンＸ−１００、０．０１％ ＢＳＡ、４０
μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０μＭ 〔 3
Ｈ〕ＴＴＰ上記液に最終濃度が０．２ｍｇになるように
活性化した仔牛胸腺ＤＮＡを加えオートクレーブ水を反
応液の全量が１００μｌになるように加える。この反応
液に酵素液を添加し、ゆるやかに混和後、７５℃で７．
５分間加温する。反応終了後、速やかに氷づけにした
後、ＤＥペーパー（ワットマン社製）にてろ過を行う。
フィルターを５％リン酸水素２ナトリウムにて洗浄し、
液体シンチレーションカウンタにて、フィルター上の〔
3Ｈ〕を測定し、酸不溶性画分への〔 3Ｈ〕ＴＴＰの取
り込み量を計算する。本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼの活性の表示は上記条件下で３０分間に１０ｎｍｏｌ
のＴＴＰの酸不溶画分への取り込みを１単位（Ｕ）とす
る。
【００１２】（３）至適ｐＨ 本発明のＤＮＡポリメラーゼの反応へのｐＨの影響を求
めた。測定には、１００ｍＵの本酵素標品を用い、２０
ｍＭ トリス塩酸緩衝液をｐＨ６．５〜８．９に調製し
たものをそれぞれ用い（２）に示す条件下で７．５分反
応させた。本酵素は図１に示すごとく、約ｐＨ８で最大
活性を示した。すなわち、図１は本発明により得られる
酵素の至適ｐＨを示す図であり縦軸は相対活性（％）、
横軸はｐＨを示す。
めた。測定には、１００ｍＵの本酵素標品を用い、２０
ｍＭ トリス塩酸緩衝液をｐＨ６．５〜８．９に調製し
たものをそれぞれ用い（２）に示す条件下で７．５分反
応させた。本酵素は図１に示すごとく、約ｐＨ８で最大
活性を示した。すなわち、図１は本発明により得られる
酵素の至適ｐＨを示す図であり縦軸は相対活性（％）、
横軸はｐＨを示す。
【００１３】（４）至適温度 測定には、１００ｍＵの本酵素標品を用い、（２）に示
す反応条件下で種々の温度で７．５分間反応を行った。
本酵素は図２に示すようにｐＨ７．５において３７℃〜
９０℃の範囲で活性があり、その至適温度は約８０℃で
あった。すなわち図２は本発明により得られる酵素の至
適温度を示す図であり縦軸は相対活性（％）、横軸は温
度（℃）を示す。
す反応条件下で種々の温度で７．５分間反応を行った。
本酵素は図２に示すようにｐＨ７．５において３７℃〜
９０℃の範囲で活性があり、その至適温度は約８０℃で
あった。すなわち図２は本発明により得られる酵素の至
適温度を示す図であり縦軸は相対活性（％）、横軸は温
度（℃）を示す。
【００１４】（５）熱安定性 測定には（２）に示す反応溶液から基質を除いたものに
１００ｍＵの本酵素を加え９０℃で３０分間処理した
後、基質を加えて残存する酵素活性を測定した。図３に
示すとおり、ｐＨ７．５において本酵素は活性の低下を
認めなかった。すなわち、図３は、本発明により得られ
る酵素の熱安定性を示し、縦軸は残存活性（％）、横軸
には熱処理時間（分）を表す。図中白丸印は本発明のＤ
ＮＡポリメラーゼの活性を、図中×印は対照のタックポ
リメラーゼ（アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、パー
キンエルマー社製）の活性を示す。タックポリメラーゼ
の活性は同様の処理により３５％の低下が認められた。
１００ｍＵの本酵素を加え９０℃で３０分間処理した
後、基質を加えて残存する酵素活性を測定した。図３に
示すとおり、ｐＨ７．５において本酵素は活性の低下を
認めなかった。すなわち、図３は、本発明により得られ
る酵素の熱安定性を示し、縦軸は残存活性（％）、横軸
には熱処理時間（分）を表す。図中白丸印は本発明のＤ
ＮＡポリメラーゼの活性を、図中×印は対照のタックポ
リメラーゼ（アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、パー
キンエルマー社製）の活性を示す。タックポリメラーゼ
の活性は同様の処理により３５％の低下が認められた。
【００１５】（６）至適Ｍｇ2+濃度 本酵素はＭｇ2+を要求する。本酵素１００ｍＵを用い
（２）に示す反応条件の内ＭｇＣｌ2 濃度を終濃度２〜
５０ｍＭで変化させそれぞれ７．５分間反応を行った。
本酵素は図４に示すごとく、至適ＭｇＣｌ2 濃度は約１
０ｍＭであった。すなわち、図４は本発明により得られ
る酵素の活性とＭｇＣｌ2 濃度の関係を示し、縦軸は相
対活性（％）を、横軸はＭｇＣｌ2 濃度（ｍＭ）を示
す。
（２）に示す反応条件の内ＭｇＣｌ2 濃度を終濃度２〜
５０ｍＭで変化させそれぞれ７．５分間反応を行った。
本酵素は図４に示すごとく、至適ＭｇＣｌ2 濃度は約１
０ｍＭであった。すなわち、図４は本発明により得られ
る酵素の活性とＭｇＣｌ2 濃度の関係を示し、縦軸は相
対活性（％）を、横軸はＭｇＣｌ2 濃度（ｍＭ）を示
す。
【００１６】（７）至適塩濃度 本酵素１００ｍＵを用いて（２）に示す反応条件に終濃
度５〜１００ｍＭのＮａＣｌを添加し、７．５分間反応
を行った。本酵素は、図５で示す通り０〜１００ｍＭ
ＮａＣｌで活性を有し、中でも５０〜７５ｍＭ ＮａＣ
ｌ付近が最も活性が高かった。すなわち、図５は本発明
により得られる酵素の活性とＮａＣｌ濃度の関係を示す
図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はＮａＣｌ濃度
（ｍＭ）を示す。
度５〜１００ｍＭのＮａＣｌを添加し、７．５分間反応
を行った。本酵素は、図５で示す通り０〜１００ｍＭ
ＮａＣｌで活性を有し、中でも５０〜７５ｍＭ ＮａＣ
ｌ付近が最も活性が高かった。すなわち、図５は本発明
により得られる酵素の活性とＮａＣｌ濃度の関係を示す
図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はＮａＣｌ濃度
（ｍＭ）を示す。
【００１７】（８）アフィジコリン感受性 α型ＤＮＡポリメラーゼの共通の性質としてそのＤＮＡ
合成がアフィジコリン感受性であることが挙げられる。
本酵素は図６で示す様に（２）に示す反応条件下に本酵
素を１００ｍＵ用いてアフィジコリンの終濃度が０．５
〜４ｍＭになるよう添加したところ、アフィジコリン耐
性でありα型ＤＮＡポリメラーゼの特徴を有さない。す
なわち図６は本発明により得られる酵素の活性とアフィ
ジコリン濃度を示し、縦軸は、相対活性（％）を横軸は
アフィジコリン濃度（ｍＭ）を示す。図中、白丸印は本
発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中黒丸印は対照
のピロコッカス フリオサスのα型ＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジーン社製）の活性を示す。α型のＤＮＡポ
リメラーゼ活性はアフィジコリンの添加量に伴い減少す
るが、本発明のＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は影響さ
れない。
合成がアフィジコリン感受性であることが挙げられる。
本酵素は図６で示す様に（２）に示す反応条件下に本酵
素を１００ｍＵ用いてアフィジコリンの終濃度が０．５
〜４ｍＭになるよう添加したところ、アフィジコリン耐
性でありα型ＤＮＡポリメラーゼの特徴を有さない。す
なわち図６は本発明により得られる酵素の活性とアフィ
ジコリン濃度を示し、縦軸は、相対活性（％）を横軸は
アフィジコリン濃度（ｍＭ）を示す。図中、白丸印は本
発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中黒丸印は対照
のピロコッカス フリオサスのα型ＤＮＡポリメラーゼ
（ストラタジーン社製）の活性を示す。α型のＤＮＡポ
リメラーゼ活性はアフィジコリンの添加量に伴い減少す
るが、本発明のＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は影響さ
れない。
【００１８】（９）Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）感
受性 測定には（２）に示す反応条件下に１００ｍＵの本酵素
を用い、終濃度０．５〜４ｍＭになるようにＮＥＭを加
え、７．５分間反応させた。本酵素は図７で示す通り、
ＳＨ基修飾試薬であるＮＥＭに対して強い感受性を示し
た。すなわち、図７は本発明により得られる酵素の活性
とＮＥＭ濃度の関係を示す図であり、縦軸は相対活性
（％）、横軸はＮＥＭ濃度（ｍＭ）を示す。図中、白丸
印は本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中黒丸印
は対照のピロコッカス フリオサスのα型ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ストラタジーン社製）の活性を示す。本発明の
酵素は、α型ＤＮＡポリメラーゼほど強く阻害されない
が、ＮＥＭによって酵素活性が阻害される。
受性 測定には（２）に示す反応条件下に１００ｍＵの本酵素
を用い、終濃度０．５〜４ｍＭになるようにＮＥＭを加
え、７．５分間反応させた。本酵素は図７で示す通り、
ＳＨ基修飾試薬であるＮＥＭに対して強い感受性を示し
た。すなわち、図７は本発明により得られる酵素の活性
とＮＥＭ濃度の関係を示す図であり、縦軸は相対活性
（％）、横軸はＮＥＭ濃度（ｍＭ）を示す。図中、白丸
印は本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性を、図中黒丸印
は対照のピロコッカス フリオサスのα型ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ストラタジーン社製）の活性を示す。本発明の
酵素は、α型ＤＮＡポリメラーゼほど強く阻害されない
が、ＮＥＭによって酵素活性が阻害される。
【００１９】（１０）ｄｄＴＴＰ感受性 測定には、（２）に示す反応条件下に１００ｍＵの本酵
素を用い、終濃度１０〜４００μＭになるように添加し
て７．５分間反応させた。本酵素は図８に示す通り、ｄ
ｄＴＴＰに高感受性を示す。すなわち、図８は本発明の
ＤＮＡポリメラーゼの活性とｄｄＴＴＰ濃度の関係を示
す図であり、縦軸は相対活性（％）を横軸はｄｄＴＴＰ
濃度（μＭ）を示す。図中、白丸印は本発明のＤＮＡポ
リメラーゼの活性を、図中×印は前出のアンプリタック
ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す。タックポリメラーゼ
活性のｄｄＴＴＰによる影響は明らかに本酵素が受ける
影響より弱く、本発明の酵素はｄｄＴＴＰにより感受性
が高い。
素を用い、終濃度１０〜４００μＭになるように添加し
て７．５分間反応させた。本酵素は図８に示す通り、ｄ
ｄＴＴＰに高感受性を示す。すなわち、図８は本発明の
ＤＮＡポリメラーゼの活性とｄｄＴＴＰ濃度の関係を示
す図であり、縦軸は相対活性（％）を横軸はｄｄＴＴＰ
濃度（μＭ）を示す。図中、白丸印は本発明のＤＮＡポ
リメラーゼの活性を、図中×印は前出のアンプリタック
ＤＮＡポリメラーゼの活性を示す。タックポリメラーゼ
活性のｄｄＴＴＰによる影響は明らかに本酵素が受ける
影響より弱く、本発明の酵素はｄｄＴＴＰにより感受性
が高い。
【００２０】以上、詳細に説明したように本発明により
新規ＤＮＡポリメラーゼ及びその製造方法が提供され
る。本発明のＤＮＡポリメラーゼは耐熱性が高く、かつ
ｄｄＴＴＰ高感受性であり、種々の遺伝子操作実験、特
に高温下におけるジデオキシ法による遺伝子解析に好適
である。
新規ＤＮＡポリメラーゼ及びその製造方法が提供され
る。本発明のＤＮＡポリメラーゼは耐熱性が高く、かつ
ｄｄＴＴＰ高感受性であり、種々の遺伝子操作実験、特
に高温下におけるジデオキシ法による遺伝子解析に好適
である。
【００２１】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す
が本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
が本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２２】実施例１ ピロコッカス フリオサス ＤＳＭ ３６３８の培養は
以下の通りに行った。トリプトン１．０％、酵母エキス
０．５％、可溶性でんぷん１．０％、ジャマリンＳ・ソ
リッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャ
マリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）
０．５％、ＭｇＳＯ4 ０．００３％、ＮａＣｌの０．
００１％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、Ｃ
ｏＳＯ4０．０００１％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．
０００１％、ＺｎＳＯ4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4
・５Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．
１ｐｐｍ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．１ｐｐｍ、Ｎａ2 ＭｏＳＯ
4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ
０．２５ｐｐｍの組成の培地１０リットルを５本の２リ
ットル容のメディウム瓶に分注し、１２１℃、１５分間
殺菌した後、窒素ガスを吹込み、溶存酸素を除去した
後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静置培
養した。培養後、遠心分離により集菌した。次に、集菌
体を１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２−Ｍ
Ｅ）、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル
（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁した。超音波破砕機にて３０秒間、５回
処理し、遠心分離してその上清液を得た。上清液を硫安
塩析後、５ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％
グリセロール、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭ
ＳＦを含む２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
０）（以下、緩衝液Ａとする）に対して透析した。この
透析液を緩衝液Ａにて平衡化したフラクトゲルＴＭＡＥ
（メルク社製）カラムクロマトグラフィーに供し、１０
〜５００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ溶出画分にＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を得た。活性画分を１０ｍＭ ２−
ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、緩衝液Ｂ
とする）に対して透析した。この透析液を緩衝液Ｂにて
平衡化したホスホセルロースＰ−１１（ワットマン社
製）カラムクロマトグラフィーに供し、１０〜５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂにて平衡化したハイトラッ
プヘパリン（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフ
ィーに供し、１０〜５００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液
Ｂ溶出画分中のポリメラーゼ活性画分を濃縮した。その
活性画分を１０ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
０％グリセロール、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．０）にて平衡化したセファクリルＳ−３００（ファ
ルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにてゲルろ過
を行い、約１０ＵのＤＮＡポリメラーゼを得た。
以下の通りに行った。トリプトン１．０％、酵母エキス
０．５％、可溶性でんぷん１．０％、ジャマリンＳ・ソ
リッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャ
マリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）
０．５％、ＭｇＳＯ4 ０．００３％、ＮａＣｌの０．
００１％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、Ｃ
ｏＳＯ4０．０００１％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．
０００１％、ＺｎＳＯ4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4
・５Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．
１ｐｐｍ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．１ｐｐｍ、Ｎａ2 ＭｏＳＯ
4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ
０．２５ｐｐｍの組成の培地１０リットルを５本の２リ
ットル容のメディウム瓶に分注し、１２１℃、１５分間
殺菌した後、窒素ガスを吹込み、溶存酸素を除去した
後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静置培
養した。培養後、遠心分離により集菌した。次に、集菌
体を１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２−Ｍ
Ｅ）、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル
（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁した。超音波破砕機にて３０秒間、５回
処理し、遠心分離してその上清液を得た。上清液を硫安
塩析後、５ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％
グリセロール、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭ
ＳＦを含む２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
０）（以下、緩衝液Ａとする）に対して透析した。この
透析液を緩衝液Ａにて平衡化したフラクトゲルＴＭＡＥ
（メルク社製）カラムクロマトグラフィーに供し、１０
〜５００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ溶出画分にＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を得た。活性画分を１０ｍＭ ２−
ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）（以下、緩衝液Ｂ
とする）に対して透析した。この透析液を緩衝液Ｂにて
平衡化したホスホセルロースＰ−１１（ワットマン社
製）カラムクロマトグラフィーに供し、１０〜５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂにて平衡化したハイトラッ
プヘパリン（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフ
ィーに供し、１０〜５００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液
Ｂ溶出画分中のポリメラーゼ活性画分を濃縮した。その
活性画分を１０ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１
０％グリセロール、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ
ＰＭＳＦを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．０）にて平衡化したセファクリルＳ−３００（ファ
ルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにてゲルろ過
を行い、約１０ＵのＤＮＡポリメラーゼを得た。
【００２３】
【発明の効果】本発明では、よりジデオキシヌクレオシ
ド ５′−３リン酸に高感受性を示す新規耐熱性ポリメ
ラーゼが得られた。本酵素は遺伝子塩基配列の解析、そ
の他遺伝子操作実験において有効に利用し得る。
ド ５′−３リン酸に高感受性を示す新規耐熱性ポリメ
ラーゼが得られた。本酵素は遺伝子塩基配列の解析、そ
の他遺伝子操作実験において有効に利用し得る。
【図１】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨ
を示す図である。
を示す図である。
【図２】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適温度
を示す図である。
を示す図である。
【図３】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性
を示す図である。
を示す図である。
【図４】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適Ｍｇ
Ｃｌ2 濃度を示す図である。
Ｃｌ2 濃度を示す図である。
【図５】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適Ｎａ
Ｃｌ濃度を示す図である。
Ｃｌ濃度を示す図である。
【図６】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアフィジ
コリン感受性を示す図である。
コリン感受性を示す図である。
【図７】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＮ−エチ
ルマレイミド感受性を示す図である。
ルマレイミド感受性を示す図である。
【図８】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのｄｄＴＴ
Ｐを示す図である。
Ｐを示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を示す耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ。 （１）作用及び基質特異性 鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にデオキシリボ
ヌクレオシド ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共
有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的な
デオキシヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応
を触媒する。本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオ
シド ５′−３リン酸を必要とする。ジデオキシチミジ
ン ５′−３リン酸に対して感受性を示す。 （２）熱安定性 ｐＨ７．５において、９０℃、３０分の処理では活性の
低下は認められない。 （３）至適温度 ｐＨ７．５において、３７℃〜９０℃の測定範囲で活性
を有し、至適温度は約８０℃である。 （４）至適ｐＨ ７５℃でトリス塩酸緩衝液の緩衝能の範囲であるｐＨ
６．５から８．９において活性を有し、その至適ｐＨは
約８である。 - 【請求項２】 ピロコッカス属に属する菌体を培養し、
培養物より請求項１に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21481993A JP3543341B2 (ja) | 1993-08-09 | 1993-08-09 | 耐熱性ｄｎａポリメラーゼ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21481993A JP3543341B2 (ja) | 1993-08-09 | 1993-08-09 | 耐熱性ｄｎａポリメラーゼ及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0751061A true JPH0751061A (ja) | 1995-02-28 |
| JP3543341B2 JP3543341B2 (ja) | 2004-07-14 |
Family
ID=16662053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21481993A Expired - Fee Related JP3543341B2 (ja) | 1993-08-09 | 1993-08-09 | 耐熱性ｄｎａポリメラーゼ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3543341B2 (ja) |
-
1993
- 1993-08-09 JP JP21481993A patent/JP3543341B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3543341B2 (ja) | 2004-07-14 |
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