ES2441719T3 - Fragmentos de ácidos nucleicos y método de detección específico por identificación molecular de diferentes especies de bacterias del género acinetobacter - Google Patents

Abstract

Gen rpoB completo de una bacteria del género Acinetobacter seleccionada de entre las 23 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genómica 1), especie genómica 3, A. haemolyticus (especie genómica 4), A. junii (especie genómica 5), especie genómica 6, A. johnsonii (especie genómica 7), A. lwoffii (especie genómica 8), especie genómica 9, especie genómica 10, especie genómica 11, A. radioresistens (especie genómica 12), especie genómica 13, especie genómica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 9 y 11 a 32 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, así como sus secuencias complementarias.

Description

Fragmentos de acidos nucleicos y metodo de deteccion especifico por identificacion molecular de diferentes especies de bacterias del genero acinetobacter. La presente invencion se refiere al campo del diagnostico. Mas precisamente, la invencion se refiere a un metodo para la identificacion molecular de las bacterias del genero Acinetobacter mediante las tecnicas de amplificacion y secuenciacion de acidos nucleicos con la ayuda de cebadores oligonucleotidicos. Las bacterias del genero Acinetobacter son unas bacterias que aparecen en forma de cocobacilos Gram negativos, de crecimiento aerobio. Se reconocen actualmente aproximadamente 60 especies y 2 subespecies. Estas bacterias son esencialmente, pero no unicamente, unos agentes de infecciones nosocomiales. Su espectro comprende desde la simple colonizacion hasta infecciones que ponen en juego el pronostico vital, en particular las neumonias, infecciones urinarias, bacteriemias y meningitis (van Dessel et al., 2004). Su excelente capacidad de supervivencia en el entorno exterior del hospital y su capacidad para desarrollar rapidamente resistencias a la mayoria de los antibioticos son los principales factores de su emergencia como agentes de infecciones nosocomiales, en particular en las unidades de cuidado intensivo (Bergogne-Berezin y Towner, 1996; Towner, 1997). Aunque la mayoria de las especies sean responsables de infecciones en el ser humano, solo algunas especies han sido aisladas en el medio ambiente (Nemec et al., 2001, 2003; Carr et al., 2003). Mientras que, en el genero Acinetobacter, se han propuesto 32 especies (van Dessel et al., 2004), son reconocidas 24 especies genomicas (quot;genomic speciesquot; segun la nomenclatura en vigor y abreviados a continuacion quot;geno speciesquot; o quot;g.sp.quot;) y solo 17 especies tienen un nombre validado (Nemec et al., 2003; Carr et al., 2003). Desafortunadamente, los miembros de este genero tienen una variabilidad fenotipica intra-especifica muy amplia, y no son por lo tanto diferenciables en el plano fenotipico. El aumento del numero de infecciones relacionadas con estos agentes ha estimulado la busqueda de metodos de analisis para la identificacion y la taxonomia de estas bacterias. Se ha demostrado tambien que los metodos de identificacion basados en los caracteres fenotipicos y la secuenciacion del gen del ARN 16S ribosomico por comparacion con la hibridacion ADN-ADN no eran validos. Asi, la busqueda de metodos de identificacion rapida de estas bacterias esta aun de actualidad (Gerner-Smidt et al., 1991; Ibrahim et al., 1997; Rainey et al., 1994). En particular, las tecnicas moleculares basadas en la secuenciacion del gen de ARN 16S ribosomico no permiten distinguir las especies mas proximas, en particular debido a una falta de polimorfismo de este gen en este genero, (Yamamoto y Harayama, 1998; Ochman y Wilson, 1987; Stackebrandt y Goebel, 1994). Ademas, debido a esta falta de polimorfismo, existe la necesidad de determinar la secuencia completa del gen 16S ARNr si se desea poder identificar una especie. Esto impone secuenciar la totalidad del gen que es aproximadamente de 1600 pares de bases. La consecuencia practica es que la secuenciacion debe apoyarse en un minimo de 6 reacciones de secuenciacion ademas de la reaccion de amplificacion para obtener un resultado evaluable. Se hicieron unos intentos de filogenias utilizando la comparacion de los genes gyrB (Yamamoto y Harayama, 1996; Yamamoto et al., 1999) y recA (Krawczyk et al., 2002) en alternativa al gen del ARN 16S ribosomico (Ibrahim et al., 1997). Desafortunadamente, las secuencias de estos genes no se determinaron sobre las 10 especies mas recientes (Nemec et al., 2001, 2003; Carr et al., 2003). Por lo tanto existe todavia una demanda de una herramienta de identificacion molecular de las bacterias de las especies del genero Acinetobacter, utilizable rutinariamente en laboratorio de bacteriologia, en particular con un gen suficientemente polimorfico, tal que la determinacion de una secuencia corta (menos de 500 pares de bases) con solo 1 reaccion de amplificacion y dos reacciones de secuencias sea identificable, es decir amplificable y secuenciable por la utilizacion de un solo juego de cebadores. Se ha demostrado descubierto y demostrado segun la presente invencion que

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el gen rpoB y las secuencias no codificantes que lo acotan, a saber

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las secuencias no codificantes en 5' entre las secuencias de los genes rp/L y rpoB (a continuacion

denominadas quot;spacer rplL-rpoBquot; o quot;fragmento intergenico rp/L-rpoBquot;), y

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las secuencias no codificantes en 3' entre las secuencias de los genes rpoC y rpoB (a continuacion

denominadas quot;spacer rpoB-rpoCquot; o quot;fragmento intergenico rpoB-rpoCquot;, constituyen un marcador genetico que permite la deteccion y la identificacion especifica de la bacteria de cada especie del genero Acinetobacter y, en particular, las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1),

A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. jnnii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. Iwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. scbindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus.

Las especies genomicas 1 a 16 (quot;genomic speciesquot;) corresponden a cepas referenciadas en GENEBANK, a algunas (no 3, 6, 9, 10, 13 y 16) no se les han atribuido todavia ningun nombre.

Se han descubierto algunas zonas hipervariables entre las diferentes especies y, por lo tanto, especificas de cada especie, flanqueadas por unas secuencias conservadas entre las diferentes especies, que permiten aplicar un metodo de identificacion molecular de las diferentes especies de bacterias Acinetobacter por amplificacion, con la ayuda de cebadores seleccionados en las secuencias conservadas e hibridacion y/o secuenciacion de las secuencias especificas asi amplificadas.

Mas particularmente, la presente invencion se refiere a secuencias de acidos nucleicos especificas de cada especie del genero Acinetobacter citado anteriormente cuya secuencia nucleotidica es extraida del gen rpoB de dichas bacterias.

Segun Lazcano et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27:365-376], lasARN polimerasas estan divididas en dos grupos segun su origen, uno constituido por las ARN polimerasas virales ARN- o ADN-dependientes, y el otro constituido por las ARN polimerasas ADN-dependientes de origen eucariota o procariota (archaebacterias y eubacterias). Las ARN polimerasas ADN-dependientes eubacterianas estan caracterizadas por una constitucion multimerica simple y conservada denominadas quot;core enzymequot;, representada por aWW', u quot;holoenzimaquot;, representada por aWW'o [Yura e Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13:59-97]. Numerosos trabajos han puesto en evidencia el papel funcional, dentro del complejo enzimatico multimerico, de la sub-unidad W de la ARN polimerasa eubacteriana. Las ARN polimerasas archaebacteriana y eucariota presentan, por su parte, una estructura mas compleja que puede alcanzar una decena, incluso una treintena, de subunidades [Puhlet et al. Proc . Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:4569-4573].

Los genes que codifican las diferentes subunidades aWW'o de la ARN polimerasa ADN-dependiente en las eubacterias, respectivamente los genes rpoA, rpoB, rpoC y rpoD, estan clasificados en diferentes grupos que comprenden los genes que codifican para las proteinas constitutivas de las subunidades ribosomicas o para las enzimas implicadas en la replicacion y la reparacion del genoma [Yura y Yshihma, Ann. Rev. Genet. (1979) 13:5997]. Algunos autores han mostrado que las secuencias de los genes rpoB y rpoC podian ser utilizados a fin de construir unos arboles filogeneticos [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans. (1992) 21:40S] que permiten separar las diferentes ramificaciones y sub-ramificaciones entre los reinos vivientes.

Antes de exponer con mayor detalle la invencion, se definen a continuacion diferentes terminos, utilizados en la descripcion y las reivindicaciones:

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por quot;acido nucleico extraido de bacteriasquot; se entiende en la presente memoria bien el acido nucleico total, o bien elADN genomico, o bien los ARN mensajeros, o bien incluso el ADN obtenido a partir de la transcripcion inversa de losARN mensajeros;

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un quot;fragmento nucleotidicoquot; o un quot;oligonucleotidoquot; son dos terminos sinonimos que designan una cadena de motivos nucleotidicos caracterizada por una secuencia informacional de los acidos nucleicos naturales (o eventualmente modificados) y susceptibles de hibridarse, como los acidos nucleicos naturales, con un fragmento nucleotidico complementario o sustancialmente complementario, en condiciones predeterminadas de astringencia estricta. La cadena puede contener unos motivos nucleotidicos de estructura diferente de la de los acidos nucleicos naturales. Un fragmento nucleotidico (u oligonucleotido) puede contener por ejemplo hasta 100 motivos nucleotidicos. Contiene generalmente por lo menos 10, preferentemente de 18 a 35, motivos nucleotidicos y se puede obtener a partir de una molecula de acido nucleico natural y/o por recombinacion genetica y/o por sintesis quimica,

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una unidad nucleotidica esta derivada de un monomero que puede ser un nucleotido natural de acido nucleico cuyos elementos constitutivos son un azucar, un grupo fosfato y una base nitrogenada seleccionada de entre la adenina (A), la guanina (G), el uracilo (U), la citosina (C), la timina (T); o bien el monomero es un nucleotido modificado en uno por lo menos de los tres elementos constitutivos anteriores; a titulo de ejemplo, la modificacion puede intervenir bien a nivel de las bases, con unas bases modificadas tales como la inosina, que puede hibridarse con cualquier base A, T, U, C o G, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5-desoxiuridina o cualquier otra base modificada capaz de hibridacion, o bien a nivel del azucar, por ejemplo el reemplazo de por lo menos un desoxirribosa por una poliamida [Nielsen PE et al., Science (1991) 254:1497-1500], bien incluso a nivel del grupo fosfato, por ejemplo por reemplazo mediante esteres seleccionados en particular entre los difosfatos, los alquilfosfonatos y los fosforotioatos,

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por quot;hibridacionquot; se entiende el proceso durante el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotidicos que tienen secuencias suficientemente complementarias son susceptibles de asociarse por enlaces hidrogeno estables y especificos, para formar una doble hebra. Las condiciones de hibridacion son determinadas por la quot;astringenciaquot;, es decir el rigor de las condiciones de realizacion. La hibridacion es tanto mas especifica cuanto mayor es la astringencia a la que se efectua. La astringencia es funcion en particular de la composicion en bases de un duplex sonda/diana, asi como por el grado de discordancia entre dos acidos nucleicos. La astringencia puede tambien ser funcion de los parametros de la reaccion de hibridacion, tales como la concentracion y el tipo de especies ionicas presentes en la solucion de hibridacion, la naturaleza y la concentracion de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridacion. La astringencia de las condiciones en las que una reaccion de hibridacion debe ser realizada depende en particular de las sondas utilizadas. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser eventualmente determinadas en cada caso mediante experimentos de rutina. En general, segun la longitud de las sondas utilizadas, la temperatura para la reaccion de hibridacion esta comprendida entre aproximadamente 20 y 65oC, en particular entre 35 y 65oC en una solucion salina con una concentracion de aproximadamente 0,8 a 1 M.

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una quot;sondaquot; es un fragmento nucleotidico que posee una especificidad de hibridacion en unas condiciones determinadas para formar un complejo de hibridacion con un acido nucleico que tiene, en el presente caso, una secuencia nucleotidica comprendida bien en un ARN mensajero, o bien en un ADN obtenido por transcripcion inversa de dicho ARN mensajero, producto de la transcripcion; se puede utilizar una sonda con fines de diagnostico (en particular sondas de captura o de deteccion) o con fines terapeuticos,

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una sonda puede ser inmovilizada o inmovilizable sobre un soporte solido mediante cualquier medio apropiado, por ejemplo por covalencia, por adsorcion, o por sintesis directa sobre un solido. Unos ejemplos de soportes comprenden las placas de microtitulacion y los chips de ADN,

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una quot;sondaquot; esta en general marcada mediante un agente marcador seleccionado por ejemplo entre los isotopos radioactivos, las enzimas, en particular las enzimas susceptibles de actuar sobre un sustrato cromogeno, fluorigeno o luminiscente (en particular una peroxidasa o una fosfatasa alcalina), los compuestos quimicos cromoforos, los compuestos cromogenos, fluorigenos o luminiscentes, los analogos de las bases nucleotidicas. Este marcado puede ser directo entre el ADN y dicho marcador, o indirecto, es decir por medio de ligandos tales como la biotina u otra molecula apta para enlazarse a los agentes de marcado,

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una quot;sonda de especiequot; es una sonda que permite la identificacion especifica de la especie de una bacteria de un genero dado, en este caso acinetobacter,

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una quot;sonda de generoquot; es una sonda que permite la identificacion especifica del genero de la bacteria, cualquiera que sea la especie de la bacteria de dicho genero en ciertas condiciones de hibridacion,

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un quot;cebadorquot; es una sonda que comprende por ejemplo de 10 a 100 motivos nucleotidicos y que posee una especificidad de hibridacion en unas condiciones determinadas para las reacciones de amplificacion enzimatica,

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por quot;cebador de generoquot;, se entiende un juego de cebadores que permite la amplificacion especifica de cualquier bacteria de un mismo genero dado, sin distincion de la especie, en algunas condiciones de hibridacion y de amplificacion (los quot;cebadores de generoquot; son tambien denominados quot;cebadores consensoquot; o quot;cebadores universalesquot; en la presente solicitud)

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por quot;reaccion de amplificacionquot; se entiende una reaccion de polimerizacion enzimatica, por ejemplo en una tecnica de amplificacion tal como la PCR, iniciada por unos oligonucleotidos cebadores y que utiliza un ADN polimerasa,

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por quot;reaccion de secuenciacionquot; se entiende una reaccion que conduce a la determinacion de la secuencia de un fragmento de acido nucleico o de un gen completo mediante un procedimiento de polimerizacion abortiva a partir de cebadores oligonucleotidicos y que utilizan dichos didesoxinucleotidos (Sanger F, Coulson AR (1975), J. Mol. Biol. 94:441) o por hibridaciones multiples con unas sondas multiples fijadas sobre soporte solido tales como las utilizadas en los chipsADN por ejemplo, u otras tecnicas conocidas por el experto en la tecnica.

Se han determinado las secuencias completas de los genes rpoB y de las secuencias no codificantes flanqueantes que los acotan y los separan de los genes rp/L y rpoC (quot;fragmento intergenico rplL-rpoBquot; y quot;fragmento intergenico rpoB-rpoCquot;) de 24 especies del genero Acinetobacter. A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. jobnsonii (especie genomica 7), A. Iwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus.

Para lograr determinar dichas secuencias completas de rpoB y sus secuencias flanqueantes de la totalidad de las especies de bacterias Acinetobacter, se ha tenido que, despues de un gran numero de ensayos infructuosos, determinar en primer lugar 51 cebadores (tabla 2) a partir de la unica secuencia rpoB y de las zonas no codificantes que la acotan de las bacterias del genero Acinetobacter de las secuencias correspondientes de bacterias que son identificadas como proximas disponibles en GENBANK, a saber Acinetobacter sp. ADP1 (GeneBank accession number NC 005966), Pseudomonas syringae pv. tomato str.DC3000 (GeneBank accession number NC 004578) y P. putida KT2440 (GeneBank accession number NC 006347).

La cepa Acinetobacter spADP1 es una cepa que no se habia caracterizado antes de la invencion, y que no corresponde a ninguna de las cepas patogenas descritas en la presente solicitud de patente y listadas a continuacion.

La presente invencion tiene por lo tanto por objeto un gen completo rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 23 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. Iwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende, y mas particularmente consiste en, una secuencia seleccionada de entre las secuencias tal como se han descrito en las secuencias SEC ID no 9 y 11 a 32 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad, asi como sus secuencias complementarias.

La presente invencion tiene igualmente por objeto los fragmentos de acido nucleico que comprenden, y mas particularmente que consiste en, un fragmento no codificante que encuadra el gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. Iwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende, y mas particularmente consiste en, una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se han descrito en las secuencias SEC ID no 121 a 144 respectivamente, y las secuencias SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

Dichas secuencias que presentan unos porcentajes de identidad (tambien denominados porcentajes de similitud) de por lo menos el 98% con dichas secuencias SEC ID 9 a 32, 121 a 144 y 165 a 188 corresponden a las variaciones posibles entre las diferentes cepas de una misma especie que corresponde eventualmente a unas sub-especies. Asi, las secuencias SEC ID no 145 a 164 y 189 a 208 corresponden a diversas cepas de A. baumannii que presentan por lo menos el 98% de homologia con, respectivamente, las secuencias SEC ID no 122 y 166.

Se entiende en la presente memoria por quot;porcentaje de identidad (o porcentaje de similitud)quot; o quot;porcentaje de homologiaquot;, un porcentaje de identidad de las secuencias, es decir un porcentaje de nucleotidos de la secuencia que son identicos a la misma posicion con respecto a otra secuencia,

Las secuencias SEC ID no 121 a 144 corresponden a las secuencias flanqueantes en 5' que representan el fragmento intergenico rplL-rpoB completo que acota el gen rpoB entre los genes rp/L y rpoB, de una longitud comprendida entre 301 y 310 pb, para cada especie de la bacteria de genero Acinetobacter, para las 24 especies mencionadas antes.

Las secuencias SEC ID no 165 a 188 corresponden a las secuencias flanqueantes en 3' que representan el fragmento intergenico rpoB-rpoC completo que acota el gen rpoB entre los genes rpoB y rpoC, de una longitud comprendida entre 86 y 177 pb, para cada especie de la bacteria del genero Acinetobacter, para las 24 especies mencionadas antes.

Los fragmentos intergenicos rpoB-rpoC y rp/L-rpoB que acotan el gen rpoB y la secuencia completa del gen rpoB pueden ser utilizadas para identificar la bacteria, no solo a titulo de sonda y/o por el estudio de su secuencia primaria, sino tambien por el estudio de las estructuras secundaria y terciaria delARN mensajero que proviene de la transcripcion de la secuencia completa deADN.

En estos genes rpoB y las secuencias no codificantes que los acotan (fragmento intergenico rplL-rpoB y fragmento intergenico rpoB-rpoC) de Acinetobacter, los inventores han puesto en evidencia unas secuencias consenso SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8 (tabla 3) que son unas secuencias conservadas entre todas las bacterias del genero Acinetobacter, es decir que pueden ser utilizadas como cebadores que permiten amplificar la misma porcion del gen rpoB y las zonas no codificantes que la acotan (fragmento intergenico rplL-rpoB y fragmento intergenico rpoB-rpoC) de todas dichas bacterias acinetobacter, a saber:

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SEC ID no 1 y 2, para una primera zona del gen rpoB,

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SEC ID no 3 y 4, para una segunda zona del gen rpoB,

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SEC ID no 5 y 6, para el fragmento intergenico rplL-rpoB, y

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SEC ID no 7 y 8, para el fragmento intergenico rpoB-rpoC,

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SEC ID no 1 a 4 y 6-7 estan en el interior del gen rpoB, con:

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SEC ID no 8 y 6 estan cerca de los extremos5' de losgenes rpoB, y respectivamente rpoC.

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SEC ID no 7 y 5 estan cercade los extremos3' de losgenes rp/L y respectivamente rpoB.

La presente invencion proporciona por lo tanto unos oligonucleotidos que presentan unas secuencias conservadas de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre dichas 24 especies que comprenden una secuencia de por lo menos 12, preferentemente por lo menos 18 motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias seleccionada de entre las secuencias tales como las descritas en las secuencias SEC ID no 1 a 8 siguientes, sus secuencias complementarias, preferentemente que consisten en dichas secuencias:

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SEC ID no 1: 5'-TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG-3',

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SEC ID no 2: 5'-CMACACCYTTGTTMCCRTGA-3',

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SEC ID no 3: 5'-GTGATAARATGGCBGGTCGT-3',

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SEC ID no 4: 5'-CGBGCRTGCATYTTGTCRT-3',

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SEC ID no 5 :5'-GAAGARCTTAAGAMDAARCTTG-3'

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SEC ID no 6: 5'-CGTTTCTTTTCGGTATATGAGT-3',

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SEC ID no 7: 5'-GTTCTTTAGGTATCAACATTGAA-3',

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SEC ID no 8: 5'-GACGCAAGACCAATACGRAT-3',

en las que:

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D representa A, G o T,

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Y representa C o T,

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B representa C, G o T,

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R representa A o G, y

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M representa Ao C.

En la posicion que corresponde a un nucleotido D, Y, B, M o R en las secuencias SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5, y 8 se encuentran unos nucleotidos variables en las secuencias dianas complementarias en funcion de la especie de la bacteria considerada, pero todos los demas nucleotidos estan conservados en todas las especies de las bacterias del genero Acinetobacter.

Las secuencias SEC ID no 1, 3, 5 y 7 son utilizadas a titulo de cebadores sobre la hebra directa y las secuencias SEC ID no 2, 4, 6 y 8 son utilizadas a titulo de cebador sobre la hebra indirecta. Las secuencias SEC ID no 2, 4, 6 y 8 corresponden por lo tanto a unas secuencias complementarias de las de la hebra directa.

Para ser utilizados a titulo de cebadores consensuales, se utilizan por lo tanto estos oligonucleotidos de secuencias SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5, y 8, de hecho, en forma de mezclas equimolares de oligonucleotidos de secuencias diferentes, respondiendo dichos oligonucleotidos de secuencias diferentes para cada secuencia SEC ID no 1 a 8 a las diversas definiciones posibles de las secuencias no 1, 2, 3, 4, 5 y 8 respectivamente.

Estas mezclas equimolares de oligonucleotidos son obtenidas utilizando, durante la sintesis oligonucleotidica, unas mezclas equimolares de los diferentes nucleotidos referidos, respectivamente:

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A, G y T para D,

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C y T para Y,

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C, G y T para B,

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A y G para R,

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Ay C para M.

Las mezclas de oligonucleotidos, que responden a los nucleotidos de definicion de las secuencias SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5 y 8, pueden por lo tanto hibridarse con las diferentes secuencias dianas complementarias incluidas en los genes rpoB y en los extremos de los genes rp/L y rpoC que encuadran las zonas no codificantes que los acotan (fragmento intergenico rpoL-rpoB y fragmento intergenico rpoB-rpoC) de todas las especies de bacterias del genero Acinetobacter y, mas particularmente, las 24 especies citadas antes.

La capacidad de estos cebadores para amplificar unos fragmentos de genes rpoB y unas zonas no codificantes que los acotan (fragmento intergenico rplL-rpoB y fragmento intergenico rpoB-rpoC), de todas las especies de Acinetobacter permite considerar que estos cebadores seran eficaces para la identificacion de especies de Acinetobacter adicionales que serian descritas en el futuro.

La presente invencion tiene por lo tanto tambien por objeto una mezcla de oligonucleotidos caracterizada porque comprende una mezcla equimolar de oligonucleotidos de secuencias diferentes que comprenden por lo menos 12, preferentemente por lo menos 18 motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID no 1 a 5 y 8, o los oligonucleotidos de secuencias complementarias.

Mas particularmente, la presente invencion tiene por objeto las mezclas de oligonucleotidos siguientes:

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una mezcla equimolar de 8 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 1, o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

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una mezcla equimolar de 16 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 2 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

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una mezcla equimolar de 6 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 3 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

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una mezcla equimolar de 24 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 4 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

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una mezcla equimolar de 24 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 5 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

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oligonucleotido de secuencia que consiste en la secuencia SEC ID no 6 o secuencia complementaria.

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oligonucleotido de secuencia que consiste en la secuencia SEC ID no 7 o secuencia complementaria.

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una mezcla equimolar de 2 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 8 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

Los oligonucleotidos o mezclas de oligonucleotidos que comprenden una secuencia incluida en una de las secuencias SEC ID no 1 a 8, segun la invencion, pueden ser utilizados como cebadores de genero de las bacterias del genero acinetobacter.

Como se menciono anteriormente, ademas, las secuencias consenso SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5 y 8, asi definidas, encuadran unas secuencias hipervariables cuya secuencia es especifica para cada especie de bacterias del genero Acinetobacter.

Se ha podido asi poner en evidencia unas secuencias especificas de especies para cada una de las 24 especies de bacterias mencionadas anteriormente, que corresponden a las secuencias:

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SEC ID no 33 a 56, encuadradas por las secuencias consensos SEC ID no 1 y 2 (a continuacion quot;zona 1 de rpoBquot;);

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SEC ID no 77 a 100, encuadradas por las secuencias consensos SEC ID no 3 y 4 (a continuacion quot;zona 2 de rpoBquot;);

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SEC ID no 121 a 144, encuadradas por las secuencias consensos SEC ID no 5 y 6 (a continuacion quot;fragmento intergenico rpo/L-rpoBquot;); y

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SEC ID no 165 a 188, encuadradas por las secuencias consensos SEC ID no 7 y 8 (a continuacion quot;fragmento intergenico rpoB-rpoCquot;);

Los oligonucleotidos de secuencias encuadradas por las SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, pueden por lo tanto ser utilizados a titulo de sonda de especie de las bacterias el genero Acinetobacter.

Dichas secuencias hipervariables especificas SEC ID no 33 a 56 encuadradas por las secuencias SEC ID no 1 y 2, representan un fragmento del gen rpoB de una longitud de 350 pb con menos del 96% de identidad entre las diferentes especies (tabla 7) con la excepcion de los pares A. baylii/geno. species 11 y A. grimontii/A. junii, de manera que constituyan una secuencia especifica diana corta, para identificar especificamente cada especie de la bacteria del genero Acinetobacter, mas precisamente para las 24 especies mencionadas antes, con la excepcion de los pares A. baylii/geno. species 11 y A. grimontii/A. junii.

Dichas secuencias hipervariables especificas SEC ID no 77 a 100 encuadradas por las secuencias SEC ID no 3 y 4, representan un fragmento del gen rpoB de una longitud de 450 pb con menos del 96% de identidad entre las diferentes especies (tabla 8) con la excepcion de los pares A. baylii/geno. species 11 y A. grimontii/A. junii, de manera que constituyan una segunda secuencia especifica diana corta, para identificar especificamente cada especie de la bacteria de genero Acinetobacter, mas precisamente para las 24 especies mencionadas antes, con la excepcion de los pares A. baylii/geno. species 11 y A. grimontii/A. junii.

Dichas secuencias hipervariables especificas SEC ID no 121 a 164 encuadradas por las secuencias SEC ID no 5 y 6, representan el fragmento intergenico rplL-rpoB que acota el gen rpoB de una longitud comprendida entre 301 y 310 pb con menos del 97% de identidad entre las diferentes especies (vease la tabla 5 a continuacion) con la excepcion de los pares A. baylii/geno. species 11 y A. grimontii/A. junii, y A. lwoffi/geno. species 9, de manera que constituyan una tercera secuencia especifica diana corta para identificar especificamente cada especie de la bacteria del genero Acinetobacter, mas precisamente para las 24 especies mencionadas antes, con la excepcion de los pares A. baylii/geno. species 11 y A. grimontii/A. junii, y A. lwoffi/geno. species 9.

Finalmente, dichas secuencias hipervariables especificas SEC ID no 165 a 188 encuadradas por las secuencias SEC ID no 7 y 8, representan el fragmento intergenico rpoB-rpoC que acotan el gen rpoB de una longitud comprendida entre 86 y 177 pb con menos del 97% de identidad entre las diferentes especies (vease la tabla 6 a continuacion) con la excepcion de los pares A. grimontii/A. junii y de las especies Acb (A. beumannii, A. calcoaceticus y genospecies 3), de manera que constituyen una cuarta secuencia corta especifica diana, para identificar especificamente cada especie de la bacteria del genero Acinetobacter, mas precisamente para las 24 especies mencionadas anteriormente, con la excepcion de los pares A. grimontii/A. junii y de las especies Acb (A. beumannii,

A. calcoaceticus y genospecies 3).

Otro objeto de la presente invencion es por lo tanto un fragmento del gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 24 especies: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. Iwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. scbindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como las descritas en las secuencias SEC ID no 33 a 56 respectivamente, y las secuencias SEC ID no 77 a 100 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

La presente invencion tiene asimismo por objeto un fragmento de gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionado entre las 23 especies: A. calcoaceticus (especie genomica 1), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii,

A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como las descritas en las secuencias SEC ID no 33 y 35 a 56 respectivamente, y las secuencias SEC ID no 77 y 79 a 100 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

Dichas secuencias que presentan unos porcentajes de identidad de por lo menos el 98% con dichas secuencias SEC ID no 33 a 56 y 77 a 100 corresponden a las variaciones posibles entre las diferentes cepas de una misma especie que corresponde eventualmente y mas particularmente a unas sub-especies. Asi, las secuencias SEC ID no 57 a 76 y 101 a 120 corresponden a diversas cepas de A. baumannii que presentan por lo menos el 98% de homologia con, respectivamente, SEC ID no 34 y 78.

La presente invencion tiene por lo tanto tambien por objeto la utilizacion a titulo de sonda de especie de un fragmento de gen rpoB, rp/l o rpoC segun la invencion, o de un oligonucleotido de secuencias especificas de una de dicha especie de bacteria Acinetobacter segun la invencion.

Mas particularmente, la presente invencion proporciona un procedimiento de deteccion por identificacion molecular de una bacteria de una de las especies del genero Acinetobacter caracterizado porque se utiliza:

-

el gen rpoB completo de dicha bacteria segun la invencion, que comprende una dicha secuencia SEC ID no 9 a 32, o preferentemente que consiste en una dicha secuencia SEC ID no 9 a 32, o las secuencias complementarias, o secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad,

-

un fragmento del gen rpoB de dicha bacteria segun la invencion, que comprende una dicha secuencia SEC ID no 33 a 56 o 77 a 100, o que consiste en una dicha secuencia SEC ID no 33 a 56 o 77 a 100, las secuencias complementarias, o secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad,

-

un fragmento del gen rpoB de dicha bacteria segun la invencion, que comprende una dicha secuencia SEC ID no 77 a 100 o, preferentemente, que consiste en una dicha secuencia SEC ID no 77 a 100, o secuencias complementarias, o secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad,

-

un fragmento del gen que comprende un fragmento intergenico rplL-rpoB o rpoB-rpoC completo de dicha bacteria segun la invencion, que comprende una dicha secuencia SEC ID no 121 a 144 o 165 a 188, o preferentemente que consiste en una dicha secuencia SEC ID no 121 a 144 o 165 a 188, las secuencias complementarias o secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad.

-

un oligonucleotido que presenta una secuencia especifica de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies anteriores de por lo menos 18, preferentemente de 18 a 35, motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias seleccionadas de entre las secuencias tales como las descritas en las secuencias:

-

SEC ID no 33 a 56 respectivamente,

-

SEC ID no 77 a 100 respectivamente,

-

SEC ID no 121 a 144 respectivamente,

-

SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y

-

las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad y sus secuencias complementarias; o

-

un oligonucleotido o mezcla equimolar de oligonucleotidos segun la invencion que comprende una secuencia de por lo menos 12, preferentemente 18 nucleotidos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 o las secuencias complementarias, o preferentemente que consiste en una de dicha secuencias SEC ID no 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.

En una primera forma de realizacion de un procedimiento de deteccion de una bacteria segun la invencion, se busca detectar especificamente una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus , procedimiento en el que:

1- se pone en contacto una muestra que contiene o es susceptible de contener unos acidos nucleicos de por lo menos tal bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en un oligonucleotido o un fragmento de gen segun la invencion, preferentemente un fragmento de gen que consiste respectivamente en una de dichas secuencias seleccionada entre:

-

SEC ID no 33 a 56 respectivamente,

-

SEC ID no 77 a 100 respectivamente,

-

SEC ID no 121 a 144 respectivamente,

-

SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y

-

las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad y sus secuencias complementarias, y

2 se determina la formacion o la ausencia de un complejo de hibridacion entre dicha sonda y los acidos nucleicos de la muestra, y se determina asi la presencia de dicha especie de Acinetobacter en la muestra si hay formacion de un complejo de hibridacion.

En una segunda forma de realizacion de un procedimiento de deteccion de una bacteria del genero Acinetobacter de una especie especifica, se realizan las etapas en las que:

1- se ponen en contacto los cebadores de amplificacion que comprenden dichas mezclas de oligonucleotidos segun la invencion, con una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos de por lo menos tal bacteria del genero Acinetobacter, y se realiza una amplificacion de los acidos nucleicos por reaccion de polimerizacion enzimatica que comprende:

-

como cebador 5', por lo menos un oligonucleotido o una mezcla de oligonucleotidos segun la invencion, que comprende una secuencia incluida en una de las secuencias SEC ID no 1, 3, 5 y 7, preferentemente que consiste en dicha secuencia SEC ID no 1, 3, 5 y 7 completa o las secuencias complementarias, y

-

como cebador 3', por lo menos un oligonucleotido o mezcla de oligonucleotidos segun la invencion que comprende unas secuencias incluidas en una de las secuencias SEC ID no 2, 4, 6, y 8 respectivamente, preferentemente que consiste en dicha secuencia SEC ID no 2, 4, 6, y 8 completa o respectivamente una secuencia complementaria.

2- se determina la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion, y se determina asi la presencia o la ausencia de dicha bacteria en la muestra si un producto de amplificacion ha aparecido o no, respectivamente.

Mas particularmente, se busca detectar una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii,

A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus., y, en la etapa 2 siguiente, se determina la presencia o la ausencia de la especie dada de una dicha bacteria efectuando las etapas en las que:

a) se realiza una reaccion de secuenciacion de un fragmento de gen amplificado con dichos cebadores, y

b) se compara la secuencia de dicho fragmento amplificado obtenido con la secuencia de un fragmento de gen de dicha bacteria que comprende respectivamente:

-

dichas secuencias SEC ID no 33 a 56, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 1 y 2 respectivamente

-

dichas secuencias SEC ID no 77 a 100, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 3 y 4 respectivamente, y

-

dichas secuencias SEC ID no 121 a 144, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 5 y 6 respectivamente, y

-

dichas secuencias SEC ID no 165 a 188, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 7 y 8 respectivamente.

En otra variante de dicha segunda forma de realizacion de un procedimiento de deteccion de una bacteria del genero Acinetobacter de una especie especifica, en el que se busca detectar una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, en la etapa 2 anterior, se determina la presencia o la ausencia de la especie dada de una dicha bacteria efectuando las etapas en las que:

a- se pone en contacto una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos amplificado de por lo menos tal bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en un fragmento de gen rpoB o un oligonucleotido especifico segun la invencion, preferentemente un fragmento que consiste respectivamente en una de dichas secuencias seleccionada entre:

-

SEC ID no 33 a 56 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 1 y 2 respectivamente

-

SEC ID no 77 a 100 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 3 y 4 respectivamente, y

-

SEC ID no 121 a 144 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 5 y 6 respectivamente, y

-

SEC ID no 165 a 188 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 7 y 8 respectivamente, y

b- se determina la formacion o la ausencia de un complejo de hibridacion entre dicha sonda y los acidos nucleicos amplificado de la muestra, y se determina asi la presencia o la ausencia de dicha especie de Acinetobacter en la muestra si hay formacion o no de un complejo de hibridacion.

En una forma de realizacion preferida de un procedimiento segun la invencion, se realizan las etapas que comprenden:

1- una primera amplificacion del acido nucleico de dicha muestra con un par de cebadores 5' y 3' seleccionado entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun la invencion, que comprende unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 1 y SEC ID no 2, preferentemente que consiste en dichas secuencias SEC ID no 1 y SEC ID no 2, o las secuencias complementarias, y

2- una primera determinacion de la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion, o llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 1 con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 33 a 56 y 34 a 76 respectivamente, y

-

si en esta etapa 2 se determina la presencia de las especies A. grimontii o A. junii, se realiza ademas:

3a-una secunda reaccion de amplificacion con unos cebadores 5' y 3' seleccionados entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun la invencion, que comprende unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 3 y SEC ID no 4, preferentemente que consisten en dichas secuencias SEC ID no 3 y SEC ID no 4, o las secuencias complementarias, y

4a-una determinacion de la aparicion o de la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 3a con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 77 a 100 respectivamente, o

-

si en la primera etapa 2 se determina la presencia de las especies A. baylii o A. specie genomica 11, se realiza ademas:

3b-una segunda reaccion de amplificacion con unos cebadores 5' y 3' seleccionados entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun la invencion que comprenden unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 7 y SEC ID no 8, preferentemente que consisten en dichas secuencias SEC ID no 7 y SEC ID no 8, o las secuencias complementarias, y

4b-una determinacion de la aparicion o de la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 3b con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 165 a 188 respectivamente.

Las secuencias SEC ID no 1 a 208 pueden ser preparadas por ingenieria genetica y/o por sintesis automatica o sintesis quimica utilizando las tecnicas bien conocidas por el experto en la materia.

Las sondas segun la invencion pueden ser utilizadas, con fines de diagnostico, como se menciono anteriormente, por la determinacion de la formacion o de la ausencia de formacion de un complejo de hibridacion entre la sonda y un acido nucleico diana en una muestra, segun todas las tecnicas de hibridacion conocidas y en particular las tecnicas de deposito puntual sobre un filtro, denominadas quot;DOT-BLOTquot; [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], las tecnicas de transferencia de ADN denominadas quot;SOUTHERN BLOTquot; [Southern E.M., J. Mol. Biol. (1975) 98:503], las tecnicas de transferencia de ARN denominadas quot;NORTHERN BLOTquot;, o las tecnicas denominadas quot;sandwichquot;, en particular con una sonda de captura y/o una sonda de deteccion, siendo dichas sondas capaces de hibridarse con dos regiones diferentes del acido nucleico diana, y siendo una por lo menos de dichas sondas (generalmente la sonda de deteccion), capaz de hibridarse con una region de la diana que es especifica de la especie, entendiendose que la sonda de captura y la sonda de deteccion deben tener unas secuencias nucleotidicas por lo menos parcialmente diferentes.

El acido nucleico que se debe detectar (diana) puede ser el ADN o el ARN (el primero obtenido despues de la amplificacion por PCR). En el caso de la deteccion de una diana de tipo acido nucleico de doble hebra, conviene proceder a la desnaturalizacion de este ultimo antes de la realizacion del procedimiento de deteccion. El acido nucleico diana puede ser obtenido por extraccion segun los metodos conocidos de los acidos nucleicos de una muestra a examinar. La desnaturalizacion de un acido nucleico de doble hebra se puede efectuar mediante los metodos conocidos de desnaturalizacion quimica, fisica o enzimatica, y en particular por calentamiento a una temperatura apropiada, superior a 80oC.

Para aplicar las tecnicas de hibridacion antes citadas, y en particular las tecnicas quot;sandwichquot;, una sonda de la invencion, denominada sonda de captura, es inmovilizada sobre un soporte solido, y otra sonda de la invencion, denominada sonda de deteccion, esta marcada con un agente marcador. Los ejemplos de soporte y de agente marcador son tales como los definidos anteriormente.

De manera ventajosa, una sonda de especie esta inmovilizada sobre un soporte solido, y otra sonda de especie esta marcada por un agente marcador.

Otra aplicacion de dicha mezcla de oligonucleotidos de la invencion es su utilizacion como cebador nucleotidico que comprende un oligonucleotido monocatenario seleccionado entre los oligonucleotidos que tienen una secuencia de por lo menos 12 motivos nucleotidicos incluidos en una de las secuencias SEC ID no 1 a 8, que es utilizable en la sintesis de un acido nucleico en presencia de una polimerisasa por un procedimiento conocido en si, en particular en metodos de amplificacion que utilizan tal sintesis en presencia de una polimerasa (PCR, RT-PCR, etc.). En particular, un cebador de la invencion puede ser utilizado para la transcripcion inversa especifica de una secuencia de ARN mensajero de bacteria de una especie del genero Acinetobacter para obtener una secuencia de ADN complementaria correspondiente. Tal transcripcion inversa puede constituir el primer estado de la tecnica RT-PCR, siendo el estado siguiente la amplificacion por PCR del ADN complementario obtenido.

Segun un caso particular, dicho cebador que comprende un oligonucleotido de la invencion comprende ademas la secuencia sentido o anti-sentido de un promotor reconocido por una ARN polimerasa (promotores T7, T3, SP6 por ejemplo [Studier FW, BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113]: tales cebadores son utilizables en procedimientos de amplificacion de acido nucleico que hace intervenir una etapa de transcripcion, tales como, por ejemplo, las tecnicas NASBA o 3SR [[an Gemen B. et al. Abstract MA 1091, 7thInternational Conference on AIDS (1991) Florencia, Italia].

Otro objeto de la invencion es un cebador nucleotidico que comprende una mezcla de oligonucleotidos monocatenarios seleccionados entre los oligonucleotidos que tienen unas secuencias que comprenden una de las secuencias SEC ID no 1 a 8 o, preferentemente, que consisten en una de las secuencias SEC ID no 1 a 8 que es utilizable para la secuenciacion total o parcial del gen rpoB o del fragmento intergenico rplL-rpoB o del fragmento intergenico rplB-rpoC de cualquier especie del genero Acinetobacter.

La secuenciacion del gen rpoB parcial o completa o del fragmento intergenico rplL-rpoB o del fragmento intergenico rplB-rpoC en toda bacteria del genero Acinetobacter permite la identificacion de cualquier bacteria Acinetobacter por analisis bioinformatico de esta secuencia y el reconocimiento de nuevas especies de bacterias Acinetobacter desconocidas.

Preferentemente, en una utilizacion como cebador o para la secuenciacion de los genes rpoB o del fragmento intergenico rplL-rpoB o del fragmento intergenico rpoB-rpoC se utilizan dichas mezclas de oligonucleotidos de secuencia SEC ID no 1 y 2.

La presente invencion tiene asimismo por objeto un kit de diagnostico util en un procedimiento segun la invencion, que comprende por lo menos un dicho fragmento de gen rpoB o del fragmento intergenico rplL-rpoB o del fragmento intergenico rpoB-rpoC segun la invencion, que comprende o que consiste en una de las secuencias SEC ID no 9 a 188, o un oligonucleotido o dicha mezcla de oligonucleotidos equimolares segun la invencion, que comprende unas secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 1 a 8, y los oligonucleotidos y fragmentos de genes rpoB o del fragmento intergenico rplL-rpoB o del fragmento intergenico rpoB-rpoC de secuencias complementarias, tales como las definidas anteriormente, asi como, preferentemente, unos agentes reactivos utiles en las reacciones de hibridaciones o reacciones de amplificacion o secuenciacion, llegado el caso.

Como se ha mencionado en las definiciones, un oligonucleotido o fragmento de acido nucleico segun la invencion puede estar en forma de un acido desoxirribonucleico (ADN) o de un acido ribonucleico (ARN) para los cuales en este caso T esta sustituido por U.

Finalmente, un ultimo objeto de la invencion es una sonda de terapia genica para tratar las infecciones provocadas por una cepa que pertenece a una especie del genero Acinetobacter, comprendiendo dicha sonda un oligonucleotido tal como el definido anteriormente. Esta sonda de terapia genica, capaz de hibridarse sobre el ARN mensajero y/o sobre el ADN genomico de dichas bacterias, puede bloquear los fenomenos de traduccion y/o de transcripcion y/o de replicacion.

El principio de los metodos de terapia genica se conoce y se basa en particular en la utilizacion de una sonda que corresponde a una hebra anti-sentido: la formacion de un hibrido entre la sonda y la hebra sentido es capaz de perturbar por lo menos una de las etapas de descifrado de la informacion genetica. Las sondas de terapia genica son por lo tanto utilizables como medicamentos antibacterianos, que permiten luchar contra las infecciones causadas por las bacterias de las especies del genero Acinetobacter.

Otras caracteristicas y ventajas de la presente invencion apareceran y la invencion se entendera mejor con la ayuda de la descripcion siguiente, que se refiere a los experimentos efectuados y a los resultados obtenidos con el objetivo de realizar la invencion, y que son dados a titulo puramente ilustrativo.

La tabla 1 siguiente recoge la lista de las especies de Acinetobacter para las cuales se han determinado unas secuencias rpoB y el fragmento intergenico rplL-rpoB y el fragmento intergenico rpoB-rpoC, las cepas mencionadas provienen de la Collection del Institut Pasteur (CIP), las secuencias SEC ID no 1 a 208 son descritas en el listado de secuencias anexo a la descripcion.

En la tabla 2, se presentan los diferentes cebadores utilizados para la amplificacion y la secuenciacion de los genes rpoB.

En la tabla 2, cuando se presentan unas secuencias que comprenden unos nucleotidos W, H, Y, [, R, B, M, K, S o D, estos tienen los significados conocidos por el experto en la materia y, de manera tambien convencional, estos cebadores son utilizados en realidad en forma de mezcla equimolar de oligonucleotidos de secuencias diferentes en el sitio de dichos nucleotidos, como se explica anteriormente.

La tabla 3 presenta unas comparaciones de similitudes de las secuencias de los genes 16S ARNr y rpoB entre las dos subespecies C. affermentans y entre los 11 pares de especies consideradas como proximas, para las cuales las similitudes entre secuencias de genes 16S ARNr son superiores o iguales al 98,5%, con comparacion estadistica de las medias de similitud obtenidas.

La figura 1 es una representacion grafica del porcentaje de variabilidad (range site variability: RS[ (eje de las Y)) de las secuencias de los genes rpoB y secuencias flanqueantes de las diferentes especies del genero Acinetobacter estudiadas por ventanas de 50 nucleotidos (eje de las X). se encuadran las regiones hipervariables, bordeadas por regiones conservadas, utilizada para la identificacion de la especie con la ayuda de los cebadores consenso.

La figura 2 es un dendograma que representa las relaciones filogenicas de las diferentes especies de A. cinetobacter mediante el metodo del quot;neighbour-joiningquot;. El arbol se ha construido por la alineacion de las secuencias del gen rpoB. Los valores de muestreo de quot;bootstrapquot; (probabilidad de exactitud de los nudos en porcentaje) calculados en base a una muestra de 1000 arboles, son indicados en cada nudo, solo se han indicado los valores superiores o iguales al 75%.

La figura 3 es un dendograma que representa las relaciones filogenicas de las diferentes especies de A. cinetobacter mediante el metodo quot;neighbour-joiningquot;. El arbol se ha construido por la alineacion de las secuencias hipervariable (zona 1 y zona 2) del gen rpoB. Los valores de quot;bootstrapquot; (probabilidad de exactitud de los nudos en porcentaje) calculados en base a una muestra de 1000 arboles, son indicados en cada nudo.

La figura 4 es un dendograma que representa las relaciones filogenicas de las diferentes especies de A. cinetobacter mediante el metodo del quot;neighbour-joiningquot;. Los 4 arboles se han construido por la alineacion de las secuencias de los genes rpoB, 16SRNA, rpoB, gyrB, recA. Los valores de muestreo de quot;bootstrapquot; (probabilidad de exactitud de los nudos en porcentaje) calculados en base a una muestra de 1000 arboles, son indicados en cada nudo, solo se indican los valores superiores o iguales al 75%.

1- Materiales y metodos.

1.1- Cepas bacterianas.

Las cepas bacterianas utilizadas son listadas en la tabla 1. Todas las cepas se han cultivado sobre gelosas Columbia al 5% de sangre de oveja y han sido incubadas durante 48h a 37oC en condicion de aerobia.

1.2-amplificacion y secuenciacion del gen rpoB y de los fragmentos intergenicos rplL-rpoB y rpoB-rpoC.

La secuencia del gen rpoB y de los fragmentos intergenicos que lo bordean de las especies mas proximas, se han alineados a fin de producir una secuencia consenso. Las secuencias seleccionadas eran las de Acinetobacter sp ADP1 (GeneBank accession number NC 005966), Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000 (GeneBank accession number NC 004578) y P. putida KT2440 (GeneBank accession number NC 006347). La secuencia consenso ha permitido determinar los cebadores utilizados despues para las PCR, la tecnica de marcha sobre el genoma (quot;genome walkingquot;) y para la secuenciacion. Ciertos cebadores han sido determinados ulteriormente al analisis de los resultados obtenidos. Los cebadores son presentados en la tabla 2 siguiente.

El ADN bacteriano se ha extraido de suspensiones de las cepas por QIAamp blood kit (Qiagen, Hilden, Germany) segun las recomendaciones del fabricante. Todas las mezclas de reaccion de PCR comprendian 2,5 X 10-2 U de polimerasa Taq por 1l, 1X de tampon Taq, 1,8 mM MgCl2 (Gibco BRL, Life Technologies, Cergy Pontoise, France), 200 1M de dATP, dCTP, dTTP y dGTP (Boehringer Manheim GmbH, Hilden, Germany), y 0,2 1M de cada cebador (Eurogentec, Seraing, Belgica). Las mezclas de reaccion de PCR se sometieron a 35 ciclos de desnaturalizacion a 94oC durante 30 s, una hibridacion de los cebadores durante 30s, y una extension a 72oC durante 2 min. Cada programa de amplificacion empezaba por una etapa de desnaturalizacion a 95oC durante 2 minutos, y terminaba por una etapa de elongacion a 72oC durante 10 minutos. La determinacion de la secuencia de los extremos de los genes se ha realizado mediante la utilizacion del Universal GenomeWalker Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Brevemente, el ADN genomico era digerido por Eco R[, Ora I, Pvu II, Stu I y Sca I. Los fragmentos de ADN se unen con el GenomeWalker adaptor. La PCR se ha realizado incorporando el cebador quot;adaptor primerquot; proporcionado por el fabricante y los cebadores especificos. Para la amplificacion, se utilizan 1,5 U de enzima ELONGASE (Boehringer Manheim) con 10 pmol de cada cebador, 20 mM de cada dNTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,6 mM MgCl2 y 5 1l de ADN digerido para un volumen final de 50 1l. Los amplicones se purificaron con la ayuda del quot;QIAquick spin PCR purification kit quot; (Qiagen). Las reacciones de secuencia se realizaron con la ayuda de los reactivos del secuenciador ABI Prism 3100 ADN sequencer (dRhod.Terminator RR Mix, Perkin Elmer Applied Biosystems).

Estas condiciones de extraccion del ADN y amplificacion PCR y secuenciacion se describen en Khamis et al. 2003.

1.3- Determinacion de las secuencias parciales discriminantes en el gen rpoB.

A fin de detectar las porciones de secuencia con una alta variabilidad rodeadas de regiones conservadas, se ha utilizado el programa S[ARAP (para Sequence [ARiability Analysis Program, Hypertext link quot;descargaquot; en la pagina URL: http://ifr48.free.fr/recherche/jeu cadre/jeu rickettsie.html). Una vez realizado este analisis, las zonas mas polimorficas del gen rpoR se determinan y se designan unos cebadores universales, seleccionados en las zonas bordeantes conservadas, despues de diferentes ensayos infructuosos. Las condiciones de PCR que incorporaban los cebadores universales son las mismas que las mencionadas anteriormente. Estos cebadores se utilizan para la amplificacion y la secuenciacion de las 4 zonas hipervariables para todas las cepas estudiadas.

Estos cebadores son presentados en la tabla 3 siguiente y en la figura 1.

1.4- Analisis de las secuencias rpoB y unos fragmentos intergenicos que lo bordean.

Los fragmentos de secuencias de los genes rpoB y de los fragmentos intergenicos que lo bordean obtenidos en este estudio, se analizaron con la ayuda de quot;Sequence Analysis Softwarequot; (Applied Biosystems), y las secuencias parciales se combinaron en una sola secuencia consenso con la ayuda del quot;Sequence Assembler Softwarequot; (Applied Biosystems). Todas las referencias de deposito de las cepas a la Coleccion del Instituto Pasteur (lt;CIP») (Francia, Paris) estan listadas en la tabla 1. Las alineaciones multiples y los porcentajes de similitud entre los genes de diferentes especies se realizaron mediante CLUSTAL W en el servidor EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) (Thompson et al.1994). Unos arboles filogenicos se realizaron a partir de las secuencias mediante el metodo de quot;neighbor-joiningquot;(Felsenstein et al.1989). Los quot;bootstrapsquot; se realizaron para evaluar la solidez de los nudos utilizando SEQBOOT en el programa PHYLIP.

2- Resultados

a. Secuencias completas de los genes rpoB de las diferentes especies de Acinetobacter

Los cebadores designados han permitido amplificar las regiones ensayos de todas las cepas del trabajo; el tamafo del gen completo es de 4089 pb para todas las especies. Los porcentajes de similitud entre las cepas varian del 83 al 94%, salvo 2 pares de especies (tabla 4). En efecto, 2 pares de especies, A. junii/A. grimontii y A. baylyi/especie genomica 11 tienen unas similitudes del 99%. Las otras especies tienen menos del 95% de similitud entre si.

b. Identificacion de las diferentes especies de Acinetobacter basadas en las secuencias parciales del gen rpoB.

El programa S[ARAP ha permitido la identificacion de 2 zonas variables bordeadas por unas zonas conservadas que han permitido generar unos cebadores universales:

-

zona 1: entre las posiciones 2900 y 3250, y

-

zona 2: entre las posiciones 3250 y 3700 pb (figura 1).

Estas zonas son amplificadas con la ayuda de los cebadores suscitados en todas las especies de Acinetobacter y todas las cepas de A. baumannii. El tamafo de la zona 1 es de 350 pb y la zona 2 es de 450 pb. El porcentaje de similitud entre las diferentes especies de la zona 1 varia del 78,6 al 95,4% para todas las especies excepto 2 pares. En efecto, como para la secuencia completa, A. baylyi/ especie genomica 11 y A. junii/A. grimontii tienen los valores de similitud mas elevados, respectivamente el 98 y el 99,1%, mientras que las otras especies tienen menos del 96%. El porcentaje de similitud de la zona 2 es entre el 75,8 y el 95,3% para todas las especies salvo, ahi tambien, las especies A. junii/A. grimontii y A. baylyi/especie genomica 11 que tienen similitudes mas altas, respectivamente el 98,8 y el 99,6%, mientras que las otras especies tienen menos del 96% entre si.

La similitud intraespecifica de las diferentes cepas de A. baumannii para la zona 1 varia del 98,3 al 100% con la excepcion de la cepa CIP 103655. En efecto, esta cepa posee solo entre el 94,9 y el 95,7% con las otras cepas. De la misma manera, la zona 2 varia del 98,7 al 100% para todas las cepas de A. Baumanii con la excepcion de la cepa CIP 103655. Esta cepa tiene unas similitudes comprendidas entre el 93,6 y el 94,4% con las otras cepas de la especie. Las especies mas proximas de A. baumannii son especie genomica 3 para la zona 1 y A. calcoaceticus para la zona 2 con similitudes respectivas del 95,1% y del 93,6%. Son valores claramente inferiores a la variabilidad intraespecifica con la excepcion de la cepa CIP 103655, para la cual la cepa de A. baumannii mas alejada posee el 94,9% y el 93,6% de similitud, respectivamente en las zonas 1 y 2.

En total, la variabilidad de secuencia es del 0,4 al 24,2% para las secuencias parciales contra el 0,8 al 16,9% para las secuencias completas de rpoB. Las 2 secuencias parciales permiten por lo tanto una identificacion no ambigua de las 24 especies.

c. Analisis de las zonas flanqueantes del gen rpoB (fragmento intergenico rplL-rpoB y fragmento intergenico rpoBrpoC).

El tamafo de los 2 fragmentos intergenicos es variable en funcion de las especies. El tamafo del fragmento intergenico entre rplL y rpoB varia de 301 a 310 pb (tabla 1). Entre las especies, el porcentaje de similitud de este fragmento intergenico rplL-rpoB varia del 80,8 al 96,9%, salvo que el fragmento intergenico es identico entre A. junnii y A. grimontii, y los pares de especies como A. baylyi-especie genomica 11 y A. lowffii-especie genomica 9 tienen unos porcentaje de similitud comprendidos entre el 98,4 y el 99,7%.

El tamafo del fragmento intergenico entre rpoB y rpoC varia de 86 a 177 pb (tabla 19 con unos porcentaje de similitud entre las especies comprendidos entre el 70,2 y el 96,5%, salvo para A. junnii/A. grimontii que tienen una similitud elevada del 99,5%, y dentro del complejo Acb (.A. calcoaceticus, A. baumannii y especie genomica 3) cuyos porcentajes de similitud estan comprendidos entre el 98,5 y el 99,0% para el fragmento intergenico rpoB-rpoC. Sin embargo, con respecto al fragmento intergenico rplL-rpoB, A. baylyi-especie genomica 11 y A. lwoffii-especie genomica 9 solo tienen el 83,8 y el 87,9% respectivamente de porcentaje de similitud para el fragmento intergenico rpoB-rpoC.

Dentro de la especie A. baumannii, el tamafo del fragmento intergenico rplL-rpoB es de 305 pb para todas las cepas con la excepcion de la cepa CIP 103655 para la cual el tamafo es de 304 pb. El fragmento intergenico rpoB-rpoC tiene un tamafo de 86 pb para todas las cepas. Todavia en esta especie, el porcentaje de similitud en el fragmento intergenico rplL-rpoB varia del 99 al 100% para todas las cepas con la excepcion de la cepa CIP 103655. Esta cepa posee entre el 96,1 y el 96,4% de similitud con las otras cepas. El otro fragmento intergenico rpoB-rpoC es 100% similar para todas las cepas, con la excepcion de la cepa CIP 103655, que es del 97,7 al 98,8% similar a las otras cepas. La especie mas proxima de A. baumannii es especie genomica 3 para el fragmento intergenico rplL-rpoUB y

A. calcoaceticus para el fragmento intergenico rpoB-rpoC con similitudes respectivas del 95,9% y el 98,5%. Son valores claramente superiores a la similitud intra-especifica, con la excepcion de la cepa CIP 103655 para la cual las especies de A. baumannii tienen similitudes del 96,1% y del 97,7% respectivamente para los fragmentos intergenicos rplL-rpoH y rpoB-rpoQ.

De hecho, como se destaca de las posiciones de los cebadores de las secuencias SEC ID no 5, 6, 7 y 8, los fragmentos que corresponden a los amplificados obtenidos con la ayuda de estos cebadores tienen unas secuencias que superan las de los fragmentos intergenicos propiamente dichos en los extremos 5' y 3', pero las secuencias SEC ID no 121 a 144 y 165 a 188 dadas en el listado de secuencias anexo a la presente descripcion, corresponden a los fragmentos intergenicos completos y no desbordan en los genes rplL, rpoB y rpoC respectivamente.

d. Analisis filogenico de las especies de Acinetobacter.

El arbol filogenico construido con las secuencias completas del gen rpoB construido mediante la tecnica del quot;neighbour-joiningquot; esta soportado por valores muy altos de bootstrap (figura 2). El numero de valores de bootstratp

� 75% es de 17/22 utilizando el gen rpoB completo mientras que es de solo 7/22 por la utilizacion del gen 16S rRNA (plt;0,01). Todas las especies estan bien separadas en diferentes grupos. El arbol basado en el gen rpoB parcial (zona 1 y zona 2 concatenadas) muestra un grupo homogeneo de las cepas de A. baumannii. La cepa CIP 103655 aparece en el mismo grupo pero esta claramente separada de los otros aislados de A. baumannii. Este agrupamiento esta soportado por un valor de bootstrap del 85%.

2.4- Discusion

Con la excepcion del gen 16S rRNA, no existe actualmente ninguna secuencia de gen de mantenimiento realizado sobre todas las especies de Acinetobacter. Las secuencias de los genes gyrB y recA no estan disponibles para las 10 especies descritas mas recientemente. En efecto, Yamamoto et al. (1996, 1999) y Krawczyk et al. (2002) han secuenciado los genes gyrB y recA de 14 especies y han comparado esta tecnica con la hibridacion ADN-ADN (Bouvet y Jeanjean, 1989; Bouvet y Grimont, 1986; Tjernberg y Ursing, 1989). Mediante la construccion de un arbol basado en el gen rpoB que incorpora 14 especies, no se observa ninguna congruencia entre las diferentes especies. Sin embargo, el arbol basado en el gen rpoB tiene de manera significativa mas valores de bootstrap � 75% (11/12) que el basado en el gen 16S rRNA (4/12), gyrB (5/12) y recA (6/12) (p lt; 0,01, p � 0,01 y p � 0,02 respectivamente) (figura 4). Esto demuestra la solidez del arbol basado en el gen rpoB. A. lwoffi y Acinetobacter especie genomica 9 son 100% identicos en el gen gyrB, pero estan separados en la secuencia de gyrD y recA (Yamamoto et al., 1999; Krawczyk et al. (2002). Las especies mal delimitadas por el gen rpoB son los pares A. grimontii/A. junii y A. baylii/especie genomica 9. Desafortunadamente, es imposible compararlos en gyrB y recA, no estando disponibles las secuencias de A. grimontii y A. baylii.

Para la identificacion molecular rutinaria de Acinetobacter, puede ser utilizada cada una de las secuencias parciales del gen rpoB y de los 2 fragmentos intergenicos que la bordean, debido a su poder discriminante y a su longitud. El inconveniente de la utilizacion de una sola de estas secuencias es la ausencia de buena discriminacion entre los pares A. grimontii/A. junii y A. baylii/especie genomica 9 (Tabla 4 a 11). Sin embargo, este inconveniente puede ser reducido combinando la secuencia de por lo menos 2 de estas secuencias hipervariables. Debido a su tamafo, se

cree que es preferible empezar por la secuencia de la zona 1, ya que permite identificar perfectamente 20 especies sobre 24. Si las secuencias obtenidas son las de A. grimontii/A. junii, es mejor realizar a continuacion la secuencia de la zona 2 que diferencia mejor estas 2 especies. Si la secuencia obtenida es mas proxima de A. baylii/especie genomica 9, sera preferible determinar la secuencia del fragmento intergenico rpoB-rpoC que discrimina mejor estas 5 2 especies.

La variabilidad intraespecifica de los fragmentos cortos observados dentro de la especie A. baumannii muestra que, a excepcion de la cepa CIP 103655, todos los aislados tienen similitudes claramente inferiores a las que se pueden observar entre A. baumannii y las especies que le son mas proximas. Sin embargo, las similitudes debiles

10 observadas entre la cepa de A. baumannii CIP 103655 y los otros aislados de la especie muestran que la identificacion de ciertos aislados de esta especie puede quedar ambigua. La especie A. baumannii es la especie la mas frecuente en afeccion en el ser humano. Los resultados muestran que la cepa CIP 103655 es una cepa diferente de las 24 especies catalogadas y no es probablemente una cepa de especie A. baumannii.

15 En conclusion, los resultados obtenidos por la utilizacion de las secuencias parciales del gen rpoB y los fragmentos intergenicos rplL-rpoB y rpoB-rpoC muestran que estas herramientas son eficaces para la identificacion molecular rutinaria de las cepas de Acinetobacter. Sin embargo, debido a la fuerte similitud entre ciertas especies, seran necesarios unos trabajos complementarios que estudian las similitudes intraespecificas en varias especies. Asimismo, el estatuto de ciertas cepas como la cepa de A. baumannii CIP 103655 y de ciertas especies como A.

20 grimontii y A. baylii, debera ser estudiado por hibridacion ADN-ADN y secuencias de otros genes de mantenimiento (recA y gyrB).

Tabla 1. Cepas de Acinetobacter estudiadas. Tabla 2: Cebadores utilizadas para amplificar el gen rpoB y sus zonas flanqueantes Tabla 3: Cebadores utilizados para amplificar y secuenciar la zona 1 y la zona 2 del gen rpoB asi como los fragmentos intergenicos que la flanquean de las especies de A. cinetobacter del presente estudio.

Especie

Cepa SEC ID rpoB completada SEC ID rpoB zona 1 SEC ID rpoB zona 2 fragmentos intergenicos completos

rplL -rpoB

rpoB -rpoC

SEC ID no

Tamafo SEC ID no Tamafo

especie genomica 1, A. calcoaceticus

CIP 81.8T 9 33 77 121 305 165 86

especie genomica 2, baumannii

CIP 70.34T 10 34 78 122 305 166 86

1072.1 (ref)

57 101 144 305 189 86

CIP 53.77

58 102 145 305 190 86

CIP 53.79

59 103 146 305 191 86

CIP 54.97

60 104 147 305 192 86

CIP 54.147

61 105 148 305 193 86

CIP 64.1

62 106 149 305 194 86

CIP 68.38

63 107 150 305 195 86

CIP 70.8

64 108 151 305 196 86

CIP 70.9

65 109 152 305 197 86

CIP 70.10

66 110 153 305 198 86

CIP 70.21

67 111 154 305 199 86

CIP 70.22

68 112 155 305 200 86

CIP 70.24

69 113 156 305 201 86

CIP 70.28

70 114 157 305 202 86

CIP 70.32

71 115 158 305 203 86

CIP 70.33

72 116 159 305 204 86

CIP 70.35

73 117 160 305 205 86

CIP 103572

74 118 161 305 206 86

CIP 103655

75 119 162 304 207 86

CIP 105742

76 120 163 304 208 86

especie genomica 3

CIP 70.15 11 35 79 123 305 167 86

especie genomica 4, A. haemolyticus

CIP 64.3T 12 36 80 124 308 168 172

especie genomica 5, A. junii

CIP 64.5T 13 37 81 125 308 169 149

especie genomica 6

CIP Al65 14 38 82 126 308 170 170

especie genomica 7, A. johnsonii

CIP 64.6T 15 39 83 127 301 171 141

especie genomica 8, A. lwoffii

CIP 64.KF 16 40 84 128 308 172 177

especie genomica

CIP 64.7 17 41 85 129 306 173 150

Especie

Cepa SEC ID rpoB completada SEC ID rpoB zona 1 SEC ID rpoB zona 2 fragmentos intergenicos completos

rplL -rpoB

rpoB -rpoC

SEC ID no

Tamafo SEC ID no Tamafo

9

especie genomica 10

CIP 70.12 18 42 86 130 307 174 144

especie genomica 11

CIP 63.46 19 43 87 131 304 175 154

especie genomica 12, A. radioresistens

CIP 103788T 20 44 88 132 304 176 89

especie genomica 13

CIP 70.18 21 45 89 133 309 177 154

especie genomica 16

CIP 64.2 22 46 90 134, 309 178 153

A schindleri

CIP 107287T 23 47 91 135 310 179 159

A. ursingii

CIP 107286T 24 48 92 136 308 180 136

A. baylyi

CIP 107474T 25 49 93 137 304 181 88

A. bouvetii

CIP 107468T 26 50 94 138 305 182 156

A. gerneri

CIP 107464T 27 51 95 139 309 183 170

A. gimontii

CIP 107470T 28 52 96 140 308 184 150

A. tandoii

CIP 107469T 29 53 97 141 306 185 156

A. tjernbergiae

CIP 107465T 30 54 98 142 307 186 143

A. towneri

CIP 107472T 31 55 99 143 307 187 157

A. parvus

CIP 108168T 32 56 100 144 308 188 143

no

Cebador secuencia (5'-3') Posicion Tm (oC)

1.

AcintFa GGTAAAGTDACRCCTAAAGGT 60oC

2.

AcintRa GTATGAACGTGGGDCAGATT 58oC

3.

Ac28Fa GTDGGTAC[GGYATGGAA 52oC

4.

Ac1754Ra GAACGYGCRTGCATYTTGTCA 60oC

5.

Ac822F CGYAAAGAYTTGAAAGAAGA 54oC

6.

Ac840R CTTCTTTCAARTCTTTRCGRT 60oC

7.

Ac660F GAYGTDAAAGAYTCATCTTTA 54oC

8.

Ac1720R GAACGYGCRTGCATYTTGT 60oC

9.

Ac660R CGTAAAGATGARTCTTTHAC 54oC

10.

Ac1700F GACAARATGCAYGCRCGTT 60oC

11.

Ac696F� TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG 60oC

12.

Ac1093R� CMACACCYTTGTTMCCRTGA 60oC

13.

Ac1055F� GTGATAARATGGCBGGTCGT 60oC

14.

Ac1598R� CGB GCRTGCATYTTGTCRT 58oC

15.

AcintlFb AAGAAGCWGGYGCTAMAG - 55oC

16.

Acint2Fb CTKGGYCTKAAAGAAGCYAA - 58oC

17.

Acint3Fb CTGCTGCYGYTGTTGAAGA - 58oC

18.

AcintlRb GGTAGTTRATGGTTTCMGG � 56oC

19.

Acint2Rb GTTRATGGTITCMGGCTTYTT � 59oC

20.

Acint3Rb GGTTTCMGGCTTYTTAACTT � 56oC

21.

Ac1Fa ATGGCWTACTCAYATACYGA 1 57oC

22.

Ac4Fa GCWTACTCATAYACYGARAA 4 56oC

23.

Ac8Fa ACTCATAYACYGARAARAAAC 8 56oC

24.

Ac361F GARCAAGAAGTMTACATGGG 361 58oC

25.

Ac1215F GTTCAACCGYCGTWTSGGT 1215 59oC

26.

Acl503F GATCAACGCCAAGCCDGT 1503 57oC

27.

Ac2071F GGYTCRAACATGCAGCGT 2071 56oC

28.

Ac2267F GYGT[GAYATCTACAACCT 2267 55oC

29.

Ac3684F TGAYGGHCGTACDGGYG 3684 56oC

30.

Ac3753F CCAYTTRGTDGAYGACAAAAT 3753 56oC

31.

Ac3850F TTCGGTGGTCAGCGYTTC 3850 57oC

32.

Ac28R GTTTYTTYTCRGTRTATGAGT 28 56oC

33.

Ac55R GCAAYTTRCYAAARTYCTT 55 59oC

34.

Ac211R CAGCATTGCCRGARTARCT 211 57oC

no

Cebador secuencia (5'-3') Posicion Tm (oC)

35.

Ac380R CCCATGTAKACTTCTTGYTC 380 58oC

36.

Ac1221R GTTGAACTTCAT[CGDCCWA 1221 55oC

37.

Ac1523R GCHACHGGCTTGGCGTT 1523 56oC

38.

Ac2093R GCCTGACGCTGCATGTT 2093 55oC

39.

Ac2314Ra TGTTCTGGTTBGAACG[GT 2314 56oC

40.

Ac2928Ra GHGCHGCTTCTTCRAAGA 2928 55oC

41.

Ac2936Ra CGYTCACGHGCHGCTTCT 2936 55oC

42.

Ac1170F GCTTCCATYTGGCGHACRT 1170 58oC

43.

Ac1705F GTACGTCACGBACYTCRAA 1705 58oC

44.

Ac1804F TCCATRAACTGDGAYAAYTG 1804 56oC

45.

Ac2231F GTATCACGYGCDACACAHGA 2231 60oC

46.

Ac2348F GTCATGAAYGCDACRCGCA 2348 58oC

47.

Ac1379R CGGTTACCYAARTGRTCRAT 1379 58oC

48.

Ac1391R GAACGNACRCG[CGGTTA 1391 58oC

49.

Ac2325R GTTRATACADGTRTTYTGGTT 2325 56oC

50.

Ac2439R GAACGCRACRCGCATGTT 2439 56oC

51.

Ac2442R CATGAACGCRACRCGCAT 2442 56oC

cebadores

SEC ID no secuencia (5'-3') Posicion� Tm (oC) Diana

Ac696F

1 TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG �2916 60oC rpoB zona 1

Ac1093R

2 CMACACCYTTGTTMCCRTGA �3267 60oC rpoB zona 1

Ac1055F

3 GTGATAARATGGCBGGTCGT �3263 60oC rpoB zona 2

Ac1598R

4 CGBGCRTGCATYTTGTCRT �3773 58oC rpoB zona 2

AcintLBF

5 GAAGARCTTAAGAMDAARCTTG -361 60oC Espaciador rplL-rpoB

AcintLBR

6 CGTTTCTTTTCGGTATATGAGT �29 60oC Espaciador rplL-rpoB

AcintBCF

7 GTTCTTTAGGTATCAACATTGAA �4048 60oC Espaciador rpoB- rpoC

AcintBCR

8 GACGCAAGACCAATACGRAT �4207 59oC Espaciador rpoB- rpoC

� se trata de la composicion del primer nucleotido de la secuencia cebador con respecto al gen rpoB

Tabla 4: Comparacion del porcentaje de similitud (%) del gen rpoB (4089 pb) entre las diferentes especies de Acinetobacter

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223 A. calcoaceticus [1]

A. genospecies 3 [2]

[3]

A. baumannii

A. genospecies 16

[4]

[5]

A. parvus

A. genospecies 13

[6]

[7] A. tjerubergiae

[8] A. grimonti

[9] A. junii

[10]

A. baemolyticus

A. genospecies 6

[11]

[12] A. bouvetii

[13]

A. johnsonii

A. genospecies 9

[14]

[15] A. Iwoffi [16[ A. schindleri

[17] A. towneri

[18] A. tandoii

[19] A. baylyi

93,992,093,8 88,688,789,4 87,988,389,093,9 89,489,590,094,493,7 89,489,089,491,991,693,3 87,787,988,691,891,792190,1 87,587,888,691,691,892,090,099,2 88,088,389,192,591,892,190,491,791,9 87,887,887,590,189,590,489,890,190,190,6 84,885,285,685,885,486,185,484,384,485,384,8 86,686,887,287,887,788,487,686,886,787,386,688,6 85,586,386,286,586,186,285,285,185,085,985,187,688,4 85,786,485,986,885,986,985,785,285,086,185,486,988,493,3 86,086,786,987,286,887,486,485,985,786,385,788,488,790,790,5 85,185,285,786,286,086,585,586,486,586,586,086,088,087,386,787,0 86,487,086,787,587,488,087,287,387,487,987,186,487,986,486,887,487,1 86,586,687,287,486,787,686,686,686,787,286,386,287,086,986,986,786,086,7

A. genospecies 11 [20]86,686,987,387,687,087,986,986,886,987,486,586,387,387,187,286,986,186,899,2

A. genospecies 10 [21]86,686,987,387,487,788,287,687,287,287,586,986,487,486,686,787,485,587,492,392,5

[22] A. gerneri 86,586,787,686,986,987,787,487,387,387,586,986,887,786,386,486,787,087,688,788,989,0

[23] A. ursingii 85,786,085,685,485,785,986,385,385,386,286,584,385,585,184,985,285,386,585,385,585,386,1

[24] A. radioresistense 84,284,584,984,684,484,484,184,484,284,484,283,183,284,684,384,984,683,984,184,083,784,385,2

Tabla 5: Comparacion de los porcentaje de similitud (%) de las secuencias (301-310 pb) fragmentos intergenicos rplL-rpoB de las diferentes especies Acinetobacter.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223

A. calcoaceticus [1]

especie genomica 3

[2]

A. baumanii

[3]

especie genomica 13

[4]

especie genomica 16

[5]

A. parvus

[6]

A. tjernbergiae

[7]

A. junii

[8]

A. grimontii

[9]

A. haemolyticus

[10]

especie genomica 6

[11]

especie genomica 9

[12]

A. lwoffii

[13]

A. schindleri

[14]

A. bouvetii

[15]

A. johnsonii

[16]

A. towneri

[17]

A. tandoii

[18]

A. baylyi

[19]

92,890,6 95,9 84,0 86,8 86,5 86,5 87,4 86,8 93,4 83,0 86,2 86,5 96,9 93,4 85,5 87,1 86,5 95,0 93,7 94,0 87,7 88,4 88,4 91,5 93,4 91,2 93,1 87,7 88,4 88,4 91,5 93,4 91,2 93,1 100,0 85,8 87,1 86,5 93,4 93,7 92,1 93,1 93,4 93,4 87,1 87,4 86,2 91,2 93,1 90,6 92,1 93,1 93,1 91,2 87,7 86,8 86,8 84,0 85,8 83,0 85,2 86,5 86,5 85,5 85,8 86,8 86,5 86,5 83,0 84,6 82,7 85,2 85,5 85,5 84,6 85,5 98,4 87,4 87,7 88,1 83,6 85,5 83,6 85,8 87,4 87,4 85,5 85,8 96,2 95,9 87,7 86,5 86,5 84,6 85,2 84,3 86,2 86,5 86,5 86,2 85,5 91,8 91,2 91,5 84,3 84,6 84,9 81,1 82,4 80,8 82,7 821 82,1 82,4 82,1 88,1 87,7 87,4 86,5 84,9 85,8 87,1 87,1 85,5 86,5 87,4 84,6 84,6 85,8 84,9 89,0 88,4 89,3 91,2 87,4 86,2 85,8 85,8 84,0 84,3 83,6 85,2 84,9 84,9 84,3 84,3 89,0 88,4 89,3 93,1 84,9 90,3 82,7 82,4 83,0 81,4 83,6 82,4 82,7 83,6 83,6 81,8 82,7 86,2 85,2 85,8 85,5 89,3 87,1 84,9

especie genomica 11

[20]83,0 82,7 83,3 81,8 84,0 817 83,0 84,0 84,0 82,1 82,7 86,5 85,5 86,2 85,8 89,6 87,4 85,2 99,7

especie genomica 10

[21]84,9 84,6 84,9 84,3 85,5 84,9 85,5 86,2 86,2 83,6 84,9 88,1 87,1 87,7 90,3 86,8 89,3 89,6 92,5 92,8

A. gerneri

[22] 86,8 85,5 85,8 83,0 84,6 83,6 84,9 85,2 85,2 83,6 84,0 88,4 88,4 87,7 88,7 85,5 88,4 88,1 91,5 91,8 92,8

A. radioresistense

[23]86,2 87,1 88,4 86,8 87,4 86,2 86,8 87,7 87,7 86,8 85,2 86,8 86,2 85,8 86,2 84,9 86,5 84,9 83,0 83,3 86,5 86,5

A. ursingii

[24]85,8 84,9 85,5 85,2 86,5 84,9 86,8 85,5 85,5 84,9 85,2 85,5 85,5 84,9 87,7 85,5 85,8 86,2 85,2 85,5 86,8 87,7 90,3

Tabla 6: Porcentaje de similitud (%) de las secuencias (301-310 pb) fragmentos intergenico rpoB-rpoC (86-177 pb) de las diferentes especies de Acinetobacter.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223

especie genomica 6

[1]

A. haemolyticus

[2]

A. junii

[3]

A. grimontii

[4]

A. calcoaceticus

[5]

especie genomica 3

[6]

A. baumaniii

[7]

especie genomica 13

[8]

especie genomica 16

[9]

A. parvus

[10]

A. tjerubergiae

[11]

A. tandoii

[12]

A. towneri

[13]

A. baylyi

[14]

especie genomica 11

[15]

especie genomica 10

[16]

A. gerueri

[17]

A. bouvetii

[18]

A. schindleri

[19]

A. johnsonii

[20]

especie genomica 9

[21]

A. lwoffii

[22]

A. radioresistense

[23]

A. ursingii

[24]

92,490,4 89,4 90,9 89,9 99,5 90,4 89,9 91,4 91,4 90,9 89,9 91,9 91,9 99,0 90,4 89,9 91,4 91,4 98,5 98,5 76,3 75,3 78,8 79,3 92,9 93,4 92,9 75,3 75,3 77,8 78,3 91,9 92,4 91,9 96,5 79,3 79,3 79,8 80,3 91,4 91,4 91,4 86,4 85,9 80,3 80,8 81,3 81,8 93,4 93,4 93,4 86,4 86,9 91,4 74,2 77,8 75,8 76,3 90,4 91,4 90,4 79,8 80,3 77,3 79,8 74,2 77,3 78,8 79,3 88,4 89,4 88,9 76,8 76,8 76,3 78,8 85,4 82,8 81,8 80,3 80,8 88,4 87,9 87,9 84,8 86,4 87,4 87,4 85,9 82,8 78,3 79,8 77,3 77,8 88,9 89,9 89,4 77,3 77,8 79,3 81,3 84,3 84,3 83,8 75,3 77,3 77,3 76,8 88,4 88,4 88,9 79,3 79,8 81,8 84,8 72,7 75,3 82,8 80,8 78,3 78,8 80,3 80,8 89,4 90,4 89,4 74,7 75,3 74,2 75,3 76,8 71,7 82,3 70,7 74,7 70,7 73,7 74,7 75,3 89,9 90,9 89,9 89,4 91,4 84,3 85,4 81,8 79,8 83,3 75,3 76,3 74,2 70,2 73,7 72,7 73,2 90,9 91,9 90,9 88,9 90,4 84,3 85,9 80,8 78,3 84,3 75,3 77,8 71,7 92,9 75,3 77,8 74,2 73,7 89,4 89,4 89,4 73,2 73,7 75,8 76,8 76,3 74,2 81,8 72,2 75,8 77,3 76,3 77,8 76,8 79,8 80,8 81,3 90,4 91,4 90,4 80,3 82,3 79,3 81,3 81,8 82,8 82,3 78,8 77,3 76,3 84,8 84,8 80,8 74,7 77,3 78,8 79,3 90,4 91,4 90,4 82,3 83,8 81,3 82,8 83,8 82,3 85,9 78,3 76,8 74,2 83,8 81,8 73,2 87,9 86,4 86,4 85,4 85,4 94,9 94,9 94,9 88,4 87,9 91,9 93,4 87,9 86,4 90,9 85,9 89,9 84,3 86,9 85,4 86,4 86,9 87,4 77,3 75,3 79,8 79,3 90,9 91,4 91,9 81,3 82,8 85,4 88,4 77,8 77,8 85,4 79,3 81,3 72,2 77,8 77,8 76,8 77,8 78,3 88,4 Tabla 7: Comparacion de los porcentajes de similitud (%) de las secuencias (350 pb) de las secuencias parciales de la zona 1 de rpoB de las diferentes especies deAcinetobacter.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223

[1] A. baumannii

especie genomica 3 [2]

[3] A. calcoaceticus

[4] A. griwonti

[5] A. junii

especie genomica 16 [6]

[7] A. parvus

especie genomica 13 [8]

[9] A. johnsonii

[10] A. tjernbergiae

especie genomica 6 [11]

[12] A. baemolyticus

[13] A. schindleri

[14] A. baylyi

especie genomica 11 [15]

[16] A. bouvetii

especie genomica 10 [17]

�18] A. gerueri

especie genomica 9 [19]

[20] A. lwoffii

[21] A. towneri

[22] A. ursingii

[23] A. tandoii

[24] A. radioresistense

95,188,3 90,6 87,1 86,6 88,0 86,9 86,3 87,1 99,1 86,0 84,3 84,6 90,3 89,4 87,1 85,7 84,0 91,4 90,6 95,4 87,4 86,9 85,7 90,6 89,7 93,4 93,1 85,1 84,3 84,6 90,0 89,4 89,4 91,1 91,7 87,1 86,3 85,4 90,6 89,7 92,3 92,9 93,1 93,1 83,7 82,9 82,9 87,4 87,1 89,4 88,3 87,1 87,7 87,7 87,7 85,4 85,1 87,7 87,4 92,0 89,7 91,1 89,1 90,0 90,3 84,6 84,0 82,9 89,1 88,6 87,7 88,0 88,3 86,0 87,1 85,4 86,3 85,1 84,0 82,6 85,1 84,9 86,0 85,4 84,6 86,0 85,1 85,7 85,7 84,9 85,1 84,3 82,9 85,1 84,9 85,7 85,1 84,9 85,7 85,4 85,7 85,7 85,7 98,0 84,6 84,6 81,1 85,4 85,7 84,9 85,4 85,4 86,0 84,9 83,7 84,9 86,3 90,0 89,4 82,9 82,6 80,6 84,6 83,7 84,9 84,9 85,1 84,3 84,9 816 84,9 85,1 88,6 88,0 85,1 84,9 85,7 82,3 89,1 88,9 85,4 86,9 85,7 87,4 86,9 85,4 85,1 85,7 87,1 87,1 89,1 86,0 85,4 84,3 82,3 83,7 84,0 86,0 85,1 85,7 86,0 84,9 84,6 86,0 86,9 86,0 86,9 86,3 85,1 86,6 83,7 85,1 83,1 83,4 83,7 85,7 84,6 87,1 85,1 84,6 84,0 85,7 86,0 85,4 86,6 85,4 84,3 86,3 93,7 81,7 80,9 81,4 85,1 85,4 84,9 84,0 83,7 87,1 83,4 83,4 84,0 82,0 83,7 83,1 83,4 80,9 86,3 86,3 84,0 82,6 82,0 82,0 84,9 84,6 82,9 84,0 83,7 83,7 85,1 84,6 82,9 83,4 82,0 82,6 84,0 81,7 85,4 80,6 81,7 82,0 83,4 82,6 82,0 88,6 88,3 89,4 90,0 86,9 88,0 88,3 86,9 88,0 85,7 83,4 83,7 85,4 82,3 87,4 85,1 85,7 84,9 83,7 79,7 78,9 78,6 82,0 81,1 82,0 82,0 80,0 79,4 81,7 80,6 79,4 82,0 78,6 79,4 80,3 79,7 83,1 80,0 80,0 78,6 80,0 83,4 Tabla 8: Comparacion de los porcentajes de similitud (%) de las secuencias (450 pb) de las secuencias parciales de la zona 2 de rpoB de las diferentes especies deAcinetobacter.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223

[1] A. calcoaceticus

especie genomica 3 [2]

[3] A. baumannii

especie genomica 13 [4]

[5] A. tjernbergiae

especie genomica 16 [6]

[7] A. parvus

[8] A baylyi

especie genomica 11

[9]

especie genomica 10

[10]

[11] A. bouvetii

[12] A. schindleri

[13] A. johnsonii

especie genomica 9 [14]

[15] A. lwoffii

[16] A. gerneri

[17] A. tandoii

[18] A. towneri

[19] A. haemolyticus

especie genomica 6 [20]

[21] A. ursingii

[22] A. grimonti

[23] A. junii

[24] A. radioresistense

94,293,6 91,8 89,3 90,0 88,4 90,0 90,7 89,1 93,8 88,2 88,7 89,1 93,3 93,1 88,4 88,7 89,6 93,6 93,1 94,9 84,7 84,9 84,4 86,9 85,6 86,2 86,2 84,2 84,9 84,4 86,4 85,6 86,2 86,2 99,6 84,0 84,2 84,9 84,4 83,8 87,3 86,9 94,9 95,3 86,2 85,8 85,1 83,8 86,0 85,6 84,9 87,3 87,3 88,0 82,9 85,1 84,2 83,6 83,3 85,3 84,7 87,1 87,1 87,3 90,9 84,7 85,3 85,8 85,8 86,0 86,7 86,2 87,1 87,1 86,4 89,8 88,7 83,6 85,1 83,8 83,6 83,8 85,1 86,0 86,0 86,0 85,8 86,4 88,0 86,0 83,6 85,6 83,3 84,4 84,0 85,8 84,2 86,4 86,4 85,8 86,4 88,0 86,7 95,1 81,8 80,0 82,0 81,6 80,9 82,4 81,6 87,3 87,3 86,7 84,0 83,3 83,6 82,2 82,4 82,2 82,7 83,1 83,3 83,3 83,1 83,1 82,9 82,9 82,2 83,1 81,8 82,4 80,9 80,7 83,1 83,6 83,6 83,6 83,1 82,4 82,9 83,3 83,3 83,3 83,8 84,0 84,9 83,8 85,1 85,1 85,3 88,7 83,3 83,1 84,4 81,3 82,4 82,7 82,0 84,7 84,7 83,8 81,8 81,8 82,4 83,8 82,2 85,1 84,7 86,7 82,0 82,0 82,0 82,0 82,0 83,8 82,2 81,8 81,8 81,8 81,3 80,7 81,8 81,3 81,8 84,7 83,8 84,7 87,3 81,8 81,3 80,7 81,6 82,2 79,6 79,8 80,0 79,6 78,2 79,1 81,1 79,8 78,9 79,3 81,1 83,1 84,0 81,6 85,8 80,9 81,6 81,6 82,2 82,2 83,6 83,1 80,2 80,2 81,6 78,2 80,7 80,9 82,7 83,3 80,9 83,1 84,7 84,9 85,8 81,6 80,4 80,9 81,6 81,6 81,1 82,4 82,9 80,4 80,4 81,3 78,4 79,6 80,7 80,9 81,8 81,3 83,6 84,2 85,6 86,0 80,9 98,0 75,8 76,0 77,1 77,1 76,9 78,0 77,8 78,7 78,2 78,7 77,1 78,2 76,0 80,7 79,6 80,4 79,1 80,2 80,4 81,8 81,6 83,6 82,4

Tabla 9: Comparacion de los porcentaje de similitud (%) de las secuencias (350 pb) de las secuencias parciales de la zona 1 de rpoB de las diferentes cepas de A. baumannii

cepas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

64.1[1]

70.9 [2]100,0

70.33 [3]100,0 100,0

105742 [4]100,0 100,0 100,0

53.79 [5]100,0 100,0 100,0 100,0

70.8 [6]99,4 99,4 99,4 99,4 99,4

54.97 [7]99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 100,0

70.32 [8]98,3 98,3 98,3 98,3 98,3 98,9 98,9

70.34 [9]98,3 98,3 98,3 98,3 98,3 98,9 98,9 100,0

68.38 [10]98,3 98,3 98,3 98,3 98,3 98,9 98,9 99,4 99,4

70.24 [11]98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 99,1 99,1 99,7 99,7 99,7

53.77

[12]99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,7 99,7 99,1 99,1 99,1 99,4

54.147

[13]99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,7 99,7 99,1 99,1 99,1 99,4 100,0

70.10 [14]99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,7 99,7 98,6 98,6 98,6 98,9 99,4 99,4

1072.1 [15]98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 99,4 99,4 98,3 98,3 98,3 98,6 99,1 99,1 99,7

70.21 [16]99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,7 99,7 ' 98,6 98,6 98,6 98,9 99,4 99,4 100,0 99,7

70.28 [17]98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 99,4 99,4 98,3 98,3 98,3 98,6 99,1 99,1 99,7 99,4 99,7

70.35 [18]98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 99,4 99,4 98,3 98,3 98,3 98,6 99,1 99,1 99,7 99,4 99,7 100,0

70.22 [19]99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,7 99,7 98,6 98,6 98,6 98,9 99,4 99,4 99,4 99,1 99,4 99,7 99,7

103572

[20]98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 99,4 99,4 98,3 98,3 98,3 98,6 99,1 99,1 99,1 98,9 99,1 99,4 99,4 99,7

103655

[21]95,4 95,4 95,4 95,4 95,4 95,4 95,4 94,9 94,9 94,9 95,1 95,1 95,1 95,1 94,9 95,1 95,4 95,4 95,7 95,4

Tabla 10: Comparacion de los porcentajes de similitud (%) de las secuencias (450 pb) de las secuencias parciales de la zona 2 de rpoB de diferentes cepas de A. baumannii

cepas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819

70.10 [1]

70.21 [2]100,0

1072.1 [3]99,8 99,8

103572 [4]99,8 99,8 100,0

53.77 [5]99,1 99,1 99,3 99,3

70.22 [6]99,1 99,1 99,3 99,3 99,6

70.32 [7]99,3 99,3 99,6 99,6 99,3 99,3

70.34 [8]99,3 99,3 99,6 99,6 99,3 99,3 100,0

(38.38 [9]99,3 99,3 99,6 99,6 99,3 99,3 100,0 100,0

54.147 [10]99,3 99,3 99,6 99,6 99,3 99,3 100,0 100,0 100,0

53.79 [11]99,1 99,1 99,3 99,3 99,1 99,6 99,8 99,8 99,8 99,8

70.9 [12]98,9 98,9 99,1 99,1 98,9 99,3 99,6 99,6 99,6 99,6 99,8

64.1 [13]99,1 99,1 99,3 99,3 99,1 99,6 99,8 99,8 99,8 99,8 100,0 99,8

70.33 [14]99,1 99,1 99,3 99,3 99,1 99,6 99,8 99,8 99,8 99,8 100,0 99,8 100,0

105742 [15]99,1 99,1 99,3 99,3 99,1 99,6 99,8 99,8 99,8 99,8 100,0 99,8 100,0 100,0

54.97 [16]99,1 99,1 99,3 99,3 99,1 99,1 99,8 99,8 99,8 99,8 99,6 99,3 99,6 99,6 99,6

70.8 [17]99,1 99,1 99,3 99,3 98,7 98,7 99,3 99,3 99,3 99,3 99,1 98,9 99,1 99,1 99,1 99,6

70.24 [18]99,6 99,6 99,8 99,8 99,1 99,1 99,8 99,8 99,8 99,8 99,6 99,3 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6

70.35 [19]99,6 99,6 99,8 99,8 99,6 99,6 99,8 99,8 99,8 99,8 99,6 99,3 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6

70.28 [20]99,6 99,6 99,8 99,8 99,1 99,1 99,3 99,3 99,3 99,3 99,1 98,9 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,6 99,6

103655 [21]94,0 94,0 94,2 94,2 94,2 94,2 93,8 93,8 93,8 93,8 93,8 93,6 93,8 93,8 93,8 93,6 93,6 94,0 94,0 94,4

Tabla 11: Comparacion de los porcentajes de similitud (%) de las secuencias del fragmento intergenico rplL-rpoB de diferentes cepas de A. baumannii

cepas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920 70.8[1]

70.33 [2]99,7

68.38 [3]100,0

105742 [4]100,0

64.1 [5]100,0

103572 [6]100,0

54.147 [7]100,0

70.35 [8]100,0

70.32 [9]100,0

70.28 [10]100,0

70.24 [11]100,0

70.22 [12]100,0

70.21 [13]100,0

70.10 [14]100,0

54.97 [15]100,0 116] 53.79 100,0

53.77 [17]100,0

70.9 [18]100,0

70.34 [19]100,0

1072.1 [20]99,3

103655 [21]96,7 99,799,7 100,0 99,7 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 99,0 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 96,4 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 100,0

99,3 99,3

96,7 96,7 96,4

Tabla 12. Comparacion de los porcentajes de similitud (%) de las secuencias (301-310 pb) del fragmento intergenico rpoB-rpoC de diferentes cepas de A. baumannii

cepas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920 54.97 [1]

103655 [2]98,8

70.10 [3]100,0

70.24 [4]100,0

70.33 [5]100,0

70.34 [6]100,0

70.35 [7]100,0

1072.1 [8]100,0

103572

[9]100,0

105742

[10]100,0

70.32 [11]100,0

70.28 [12]100,0

70.22 [13]100,0

70.21 [14]100,0

70.9 [15]100,0

70.8 [16]100,0

68.38 [17]100,0

64.1 [18]100,0

54.147 [19]100,0

53.79 [20]100,0

53.77 [21]98,8

98,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,898,897,7 100,0

100,0 100,0

100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98

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Lbstado de�secuencbas

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lt;160gt; 208

lt;170gt; PatentIn version 3.1

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acinetobacter

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gaagarctta agamdaarct tg 22

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acinetobacter

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acinetobacter

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acinetobacter

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15

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15

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20 lt;400gt; 97

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lt;400gt; 99

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20

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25

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30

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25 lt;400gt; 135

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lt;212gt; ADN

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10

lt;210gt; 141

lt;211gt; 306

lt;212gt; ADN

lt;213gt; acinetobacter tandoii

15

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lt;210gt; 142 20 lt;211gt; 307

lt;212gt; ADN

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lt;211gt; 307

lt;212gt; ADN

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25

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30

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10

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15

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149 20 lt;211gt; 305

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152 20 lt;211gt; 305

lt;212gt; ADN

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lt;213gt; Acinetobacter baumannii

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155 20 lt;211gt; 305

10

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15

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10

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lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

15

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lt;213gt; Acinetobacter baumannii

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lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 158

25

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lt;211gt; 305

lt;212gt; ADN

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30

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lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

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10

lt;210gt; 161

lt;211gt; 305

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

15

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lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

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lt;211gt; 304

lt;212gt; ADN

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lt;211gt; 305

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25

lt;210gt; 166

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30

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lt;212gt; ADN

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lt;213gt; Acinetobacter junii 15

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lt;212gt; ADN

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lt;400gt; 170

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lt;400gt; 171

35 lt;210gt; 172

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lt;212gt; ADN

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40 lt;400gt; 172

lt;210gt; 173

lt;211gt; 150

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter sp.

lt;210gt; 174

lt;211gt; 144

lt;212gt; ADN 15 lt;213gt; Acinetobacter sp.

lt;400gt; 174

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lt;211gt; 154

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter sp. 40

lt;400gt; 177

lt;210gt; 178

lt;211gt; 153

lt;212gt; ADN

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lt;400gt; 178

10

lt;210gt; 179

lt;211gt; 159

lt;212gt; ADN

lt;213gt; acinetobacter schindleri

15

lt;400gt; 179

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lt;212gt; ADN

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lt;211gt; 88

lt;212gt; ADN 30 lt;213gt; acinetobacter baylyi

lt;400gt; 181

35 lt;210gt; 182

lt;211gt; 156

lt;212gt; ADN

lt;213gt; acinetobacter bouvetii

40 lt;400gt; 182

lt;210gt; 183

lt;211gt; 170

lt;212gt; ADN

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lt;400gt; 183

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lt;212gt; ADN

lt;213gt; acinetobacter grimontii

lt;400gt; 184

lt;210gt; 185

lt;211gt; 156

lt;212gt; ADN 20 lt;213gt; acinetobacter tandoii

lt;400gt; 185

25 lt;210gt; 186

lt;211gt; 143

lt;212gt; ADN

lt;213gt; acinetobacter tjernbergiae

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lt;211gt; 157 35 lt;212gt; ADN

lt;213gt; acinetobacter towneri

lt;400gt; 187

lt;210gt; 188

lt;211gt; 143

lt;212gt; ADN

lt;213gt; acinetobacter parvus

lt;400gt; 188

lt;210gt; 189

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 189

lt;210gt; 190

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 190

lt;210gt; 191

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 191

lt;210gt; 192

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 192

lt;210gt; 193

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 193

lt;210gt; 194

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 194

lt;210gt; 195

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 195

lt;210gt; 196

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

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lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 197

lt;210gt; 198

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 198

lt;210gt; 199

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 199

lt;210gt; 200

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

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lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 201

lt;210gt; 202

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 202

lt;210gt; 203

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 203

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lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 204

lt;210gt; 205

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 205

lt;210gt; 206

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 206

lt;210gt; 207

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

lt;400gt; 207

10

lt;210gt; 208

lt;211gt; 86

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Acinetobacter baumannii

15

lt;400gt; 208

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1. Gen rpoB completo de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 23 especies siguientes:

   A. calcoaceticus (especie genomica 1), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

   A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 9 y 11 a 32 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, asi como sus secuencias complementarias.

2. 2.

   Gen rpoB completo de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre dichas 23 especies segun la reivindicacion 1, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID no 9 y 11 a 32, las secuencias inversas y las secuencias complementarias, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad con dichas secuencias.

3. 3.

   Fragmento de gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 23 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

   A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 33 y 35 a 56 respectivamente, y las secuencias SEC ID no 77 y 79 a 100 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

4. 4.

   Fragmento del gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID no 33 a 56 respectivamente y las secuencias SEC ID no 77 a 100 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, y sus secuencias complementarias.

5. 5.

   Fragmento intergenico que comprende una secuencia no codificante que bordea el gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

   A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvu, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 121 a 144 respectivamente, y las secuencias SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

6. 6.

   Fragmento intergenico que comprende una secuencia no codificante que bordea el gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter segun la reivindicacion 5, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID no 121 a 144 respectivamente y las secuencias SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, y sus secuencias complementarias.

7. 7.

   Fragmento segun una de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque consiste en un oligonucleotido que presenta una secuencia especifica de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes:

   A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii,

   A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia de por lo menos 18, preferentemente de 18 a 35, motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias seleccionadas de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias:

   -

   SEC ID no 33 a 56 respectivamente,

   -

   SEC ID no 77 a 100 respectivamente,

   -

   SEC ID no 121 a 144 respectivamente,

   -

   SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y

   -

   las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

8. 8.

   Utilizacion in vitro como sonda de especie de un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 6 o un oligonucleotido segun la reivindicacion 7.

9. 9.

   Oligonucleotido caracterizado porque presenta una secuencia conservada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes:

   A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii,

   A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvu, que comprende una secuencia de por lo menos 12, preferentemente de por lo menos 18 motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias seleccionadas de entre las secuencias tales como se han descrito en las secuencias SEC ID no 1 a 8 siguientes, sus secuencias complementarias:

   -

   SEC ID no 1: 5'-TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG-3',

   -

   SEC ID no 2: 5'-CMACACCYTTGTTMCCRTGA-3',

   -

   SEC ID no 3: 5'-GTGATAARATGGCBGGTCGT-3',

   -

   SEC ID no 4: 5'-CGBGCRTGCATYTTGTCRT-3',

   -

   SEC ID no 5 :5'-GAAGARCTTAAGAMDAARCTTG-3'

   -

   SEC ID no 6: 5'-CGTTTCTTTTCGGTATATGAGT-3',

   -

   SEC ID no 7: 5'-GTTCTTTAGGTATCAACATTGAA-3',

   -

   SEC ID no 8: 5'-GACGCAAGACCAATACGRAT-3',

   en las que:

   -

   D representa A, G o T,

   -

   Y representa C o T,

   -

   B representa C, G o T,

   -

   R representa A o G, y

   -

   M representa A o C.

10. 10.Mezcla de oligonucleotidos, caracterizada porque comprende una mezcla equimolar de oligonucleotidos tales como se definen en la reivindicacion 9, de secuencias diferentes que comprende por lo menos 12, preferentemente por lo menos 18 motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID no 1 a 5 y 8 o los oligonucleotidos de secuencias complementarias.
11. 11.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 8 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 1, o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.
12. 12.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizadaporque consisteen una mezcla equimolar de 16 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 2 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.
13. 13.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 6 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 3 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.
14. 14.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 24 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 4 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.
15. 15.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 24 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 5 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.
16. 16.Oligonucleotido segun la reivindicacion 9, caracterizado porque su secuencia consiste en la secuencia SEC ID no 6 o secuencia complementaria.
17. 17.Oligonucleotido segun la reivindicacion 9, caracterizado porque su secuencia consiste en la secuencia SEC ID no 7 o una secuencia complementaria.
18. 18.Mezcla deoligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 2 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 8 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.
19. 19.Utilizacioncomocebadordeamplificaciony/o dereacciondesecuenciaciondeunoligonucleotido ouna mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 9 a 18, para la deteccion por identificacion molecular de una bacteria de una de dichas especies del genero Acitenobacter.
20. 20.Procedimiento de deteccion por identificacion molecular de una bacteria de una de las especies del genero Acitenobacter, caracterizado porque se utiliza:

    -

    el gen rpoB completo de dicha bacteria segun la reivindicacion 1 o 2, o

    -

    un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 6, y/o

    -

    un oligonucleotido segun una de las reivindicaciones 7, 9, 16 o 17 o una mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10 a 15 o 18.

21. 21.Procedimiento segun la reivindicacion 20, caracterizado porque se intenta detectar especificamente una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. Iwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

    A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, procedimiento en el que:

    1- se pone en contacto una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos de por lo menos tal bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en un oligonucleotido segun la reivindicacion 7 o un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 7, preferentemente un fragmento del gen que consiste respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre:

    -

    SEC ID no 33 a 56 respectivamente,

    -

    SEC ID no 77 a 100 respectivamente,

    -

    SEC ID no 121 a 144 respectivamente,

    -

    SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y

    -

    las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad y sus secuencias inversas y secuencias complementarias, y

    2- se determina la formacion o la ausencia de un complejo de hibridacion entre dicha sonda y los acidos nucleicos de la muestra, y se determina asi la presencia de dicha especie de Acinetobacter en la muestra si existe la formacion de un complejo de hibridacion.
22. 22.Procedimiento segun la reivindicacion 20, caracterizado porque comprende las etapas en las que:

    1- se ponen en contacto unos cebadores de amplificacion que comprenden dichas mezclas de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10 a 15 o 18, con una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos de por lo menos una de dicha bacteria del genero Acinetobacter, y se realiza una amplificacion de acidos nucleicos por reaccion de polimerizacion enzimatica que comprende:

    -

    como cebador 5', por lo menos un oligonucleotido o una mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10, 11, 13, 15 y 17 que comprende una secuencia incluida en una de las secuencias SEC ID no 1, 3, 5, y 7, que consiste preferentemente en dicha secuencia SEC ID no 1, 3, 5, y 7 completa o las secuencias complementarias, y

    -

    como cebador 3', por lo menos un oligonucleotido o mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10, 12, 14, 16, y 18 que comprende las secuencias incluidas en una de las secuencias SEC ID no 2, 4 6, y 8 respectivamente, que consiste preferentemente en dicha secuencia SED ID no 2, 4, 6, y 8 completa o respectivamente une secuencia complementaria.

    2- y se determina la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion, y se determina asi la presencia o la ausencia de dicha bacteria en la muestra si un producto de amplificacion ha aparecido o no ha aparecido respectivamente.
23. 23.Procedimiento segun la reivindicacion 22, caracterizado porque se intenta detectar una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

    A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, y, en la etapa 2, se determina la presencia o la ausencia de la especie dada de una dicha bacteria efectuando las etapas en las que:

    a) se realiza una reaccion de secuenciacion de un fragmento del gen amplificado con dichos cebadores, y

    b) se compara la secuencia de dicho fragmento amplificado obtenido con la secuencia de un fragmento del gen de dicha bacteria que comprende respectivamente:

    -

    dichas secuencias SEC ID no 33 a 56, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 1 y 2 respectivamente

    -

    dichas secuencias SEC ID no 77 a 100, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 3 y 4 respectivamente, y

    -

    dichas secuencias SEC ID no 121 a 144, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 5 y 6 respectivamente, y

    -

    dichas secuencias SEC ID no 165 a 188, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 7 y 8 respectivamente.

24. 24.Procedimiento segun la reivindicacion 22, caracterizado porque se intenta detectar una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1), A. baumannii (especie genomica 2), especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4), A. junii (especie genomica 5), especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7), A. lwoffii (especie genomica 8), especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12), especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

    A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, y, en la etapa 2, se determina la presencia o la ausencia de la especie dada de una dicha bacteria efectuando las etapas en las que:

    a- se pone en contacto una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos amplificados de por lo menos una de dicha bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en un fragmento del gen rpoB segun una de las reivindicaciones 3 a 6, o un oligonucleotido segun la reivindicacion 7, preferentemente un fragmento que consiste respectivamente en una de dicha secuencias seleccionadas de entre:

    -

    SEC ID no 33 a 56 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEQ. ID. no 1 y 2 respectivamente

    -

    SEC ID no 77 a 100 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 3 y 4 respectivamente, y

    -

    SEC ID no 121 a 144 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 5 y 6 respectivamente, y

    -

    SEC ID no 165 a 188 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 7 y 8 respectivamente, y

    b- se determina la formacion o la ausencia de un complejo de hibridacion entre dicha sonda y los acidos nucleicos amplificados de la muestra, y se determina asi la presencia o la ausencia de dicha especie Acinetobacter en la muestra si existe la formacion o no de un complejo de hibridacion.
25. 25.Procedimiento segun una de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque se realizan las etapas que comprenden:

    1- una primera amplificacion del acido nucleico de dicha muestra con un par de cebadores 5' y 3' seleccionados de entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun las reivindicaciones 11 y 12, que comprende unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 1 y SEC ID no 2, que consiste preferentemente en dichas secuencias SEC ID no 1 y 2, o las secuencias complementarias, y

    2- una primera determinacion de la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 1 con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 33 a 56 respectivamente, y

    -

    si en esta etapa 2 se determina la presencia de las especies A. grimontii o A. junii, se realiza ademas:

    3a-una segunda reaccion de amplificacion con unos cebadores 5' y 3' seleccionados de entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun la reivindicacion 10 o las reivindicaciones 13 y 14, que comprenden unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 3 y SEC ID no 4, que consisten preferentemente en dichas secuencias SEC ID no 3 y 4, o las secuencias complementarias, y

    4a-una determinacion de la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 3a con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 77 a 100 respectivamente, o

    -

    si en esta etapa 2 se determina la presencia de las especies A. baylii o especie genomica 11, se realiza ademas:

    3b-una segunda reaccion de amplificacion con unos cebadores 5' y 3' seleccionados de entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun las reivindicaciones 17 y 18, que comprenden unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 7 y SEC ID no 8, que consisten preferentemente en dichas secuencias SEC ID no 7 y 8, o las secuencias complementarias, y

    4b-una determinacion de la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 3b con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 165 a 188 respectivamente.
26. 26.Kit de diagnostico util en un procedimiento segun una de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizado porque comprende por lo menos uno de dicho oligonucleotido segun una de las reivindicaciones 7, 9, 16 o 17 o un mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10 a 15 o 18 o un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 6, asi como, preferentemente, unos reactivos utiles en las reacciones de hibridaciones o reacciones de amplificacion o secuenciacion llegado el caso.