ES2335987T3 - Identificacion molecular de las bacterias del genero streptococcus y generos emparentados. - Google Patents
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Abstract
Fragmento de un gen rpoB de una bacteria del género Streptococcus y de los 4 géneros emparentados Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y Granulicatella, caracterizado porque su secuencia consiste en una de las secuencias SEC ID nº 8 a 35, y las secuencias complementarias.
Description
Identificación molecular de las bacterias del
género Streptococcus y géneros emparentados.
La presente invención se refiere al campo del
diagnóstico. Más precisamente, la invención se refiere a un
procedimiento para la identificación molecular de las bacterias del
género Streptococcus y géneros emparentados,
Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y Granulicatella
mediante unas técnicas de detección y/o de amplificación y de
secuenciación con la ayuda de sondas o de cebadores
oligonucleotídicos aplicados a unas cepas de estos géneros
bacterianos.
Las bacterias del género Streptococcus y
de cuatro géneros emparentados: Enterococcus, Gemella,
Abiotrophia y Granulicatella, son unas bacterias
cocciformes, gram positivo y catalasa negativa de las cuales se
reconocen actualmente más de una cuarentena de especies. Las
bacterias del género Lactococcus, clasificadas anteriormente
entre los estreptococos tal como Streptococcus grupo N, no
están comprendidas en el marco de esta patente debido a su rareza
en patología humana, y porque son fácilmente discriminadas de los
estreptococos por su crecimiento a +10ºC. El género
Streptococcus comprende oficialmente 55 especies. El género
Gemella comprende 6 especies, el género Abiotrophia
comprende 1 especie, el género Granulicatella comprende 3
especies, el género Enterococcus comprende 24 especies
[www.springer-ny-com/bergey-soutline/main.htm].
Estas especies se cultivan fácilmente y con frecuencia a partir de
muestras medioambientales, de extracciones clínicas veterinarias y
de extracciones clínicas humanas [Ruoff KI. (1999) en Manuel of
Clinical Microbiology, p. 283-296, ASM press]. En
el ser humano, diferentes especies del género Streptococcus
son responsables de infecciones comunitarias eventualmente severas
debido al carácter invasivo de los estreptococos considerados o
debido a la producción de toxinas y de manifestaciones clínicas
eventualmente graves a distancia del foco infeccioso. Por ejemplo,
Streptococcus pyogenes (estreptococo grupo A) es responsable
de anginas y de síndromes pos-estreptocócicos que
incluyen el reumatismo articular agudo durante el cual la
destrucción de las válvulas cardiacas mediante un proceso
inflamatorio es responsable de una valvulopatía eventualmente
mortal. Asimismo, varias especies del género Streptococcus,
en particular los estreptococos del grupo A, del grupo C, y del
grupo G, son responsables de infecciones invasivas mortales en
particular de miositis, es decir, de destrucción de los tejidos
cutáneos y sub-cutáneos y del tejido muscular tal
como se ha descrito desde hace algunos años. Asimismo, por ejemplo,
Streptococcus pneumoniae (neumococo) es responsable de
neumonía, de meningitis y de septicemia. Por otro lado, las
bacterias de los géneros Streptococcus, Enterococcus, Gemella,
Abiotrophia y Granulicatella son responsables de
endocarditis, es decir, de infección de las válvulas cardiacas en
el ser humano, las cuales constituyen unas enfermedades infecciosas
mortales [Casalta JP et al. Journal Clinical Microbiology,
2002, 40:1845-1847]. Asimismo, algunas especies de
los géneros considerados son responsables de infecciones
nosocomiales, por ejemplo, las bacterias del género
Streptococcus del grupo A son responsables de bacteriemias
que suceden a unas exploraciones por endoscopia digestiva. Asimismo,
las bacterias del género Enterococcus son responsables de
infecciones urinarias nosocomiales después de la utilización de
antibio-profilaxia por unos antibióticos de la
familia de las cefalosporinas a las que son naturalmente
resistentes. Estas especies bacterianas plantean por otro lado el
problema de su resistencia creciente a los antibióticos,
resistencia a la penicilina G de Streptococcus pneumoniae
[Garav J. Lancet Infect. Dis. 2002, 2: 404-415] y
resistencia a la vancomicina de Enterococcus spp. [Gold H.S.
Clin. Infect. Dis. 2001, 33: 210-219; Bonten M.J.
et al. Lancet Infect. Dis. 2001, 1:
314-325].
Estas diferentes especies bacterianas plantean
el problema de su detección en las muestras patológicas en el ser
humano y su identificación cuando han sido aisladas a partir de
dichas muestras. Los procedimientos convencionales de detección se
basan en efecto en la demostración de bacterias cocciformes gram
positivo, con el examen directo del producto patológico. Sin
embargo, es conocido que esta detección miscroscópica de las
bacterias del género Streptococcus y de géneros emparentados
en las muestras clínicas tiene un umbral de sensibilidad de
10^{4} CFU/ml. Por lo tanto, es muy posible que una muestra
patológica en el ser humano o en el animal contenga una de las
especies consideradas que no sea detectada con el examen
microscópico directo de esta muestra patológica. Por otro lado,
aunque su estructura sea la de bacterias
Gram-positivo, pueden aparecer falsamente
Gram-negativo después de la coloración de Gram de la
muestra patológica y dar lugar a una identificación errónea o a un
punto muerto de identificación. Esto es particularmente frecuente
para las bacterias del género Gemella. En el ser humano, es
en particular el caso durante el examen anatomopatológico y
bacteriológico de las válvulas cardiacas en el caso de una
endocarditis.
Cuando una bacteria de una especie de los
géneros considerados se aísla en laboratorio, los procedimientos
convencionales de identificación fenotípico son los utilizados más
habitualmente para la identificación de las bacterias de las
especies del género Streptococcus y de los géneros
emparentados, y se han desarrollado varios kits de identificación
así como unos autómatas para ayudar a la identificación fenotípica
de las bacterias del género Streptococcus y de los géneros
emparentados. En este aspecto, el grado de identificación en la
práctica corriente es variable. En particular, uno de los ensayos
utilizados para la identificación de estreptococos y de bacterias
de los géneros emparentados es la observación de una reacción
hemolítica, es decir, la destrucción por la bacteria de los
hematíes contenidos en un agar sangre. Sin embargo, esta reacción
de hemólisis puede ser inhibida por la presencia de oxígeno o por la
presencia de peróxido cuando las bacterias estreptococos se
cultivan en presencia de una concentración importante de dióxido de
carbono. Por otro lado, se reconoce que existe un cierto grado de
subjetividad en la apreciación de la hemólisis por las colonias de
estreptococos, y por lo tanto una variabilidad de
inter-operador que perjudica a continuación la
calidad de la identificación de estas bacterias. Para los
estreptococos alfa-hemolíticos, un segundo ensayo es
el de la sensibilidad a la optoquina, que permite reconocer
Streptococcus pneumoniae que es sensible a este compuesto.
Sin embargo, se han relacionado unas cepas de Streptococcus
pneumoniae resistentes a la optoquina [Lund E. Acta Patho.
Microbiol. Immunol. Scand. 1959, 47, 308-315]. Un
último ensayo fenotípico es el serotipado, pudiendo este ensayo ser
falsamente positivo en particular para los estreptococos de
serogrupo D debido a la antigenicidad cruzada entre los
estreptococos del grupo D, Enterococcus y
Pediococcus.
Se han desarrollado varios sistemas moleculares
para la identificación de ciertos serogrupos o de ciertas especies
del género Streptococcus, en particular los estreptococos del
grupo A (Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus,
Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius) y del
grupo B (Streptococcus agalactiae) [Daly J.A. et al.
J Clin Microbiol. 1991, 29: 80-82; Heelan J.S. et
al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 24:
65-69] así como para Streptococcus pneumoniae
[Denys G.A. y Carrey R.B. J. Clin. Microbiol. 1992,30:
2725-2727] mediante la hibridación de sondas
específicas que tienen por diana el gen que codifica el ARN
ribosomal 16S. Asimismo, se han desarrollado diferentes sistemas
basados en la amplificación por PCR de genes que codifican para
unas toxinas o unos factores de virulencia, para la discriminación
de Streptococcus pneumoniae entre los estreptococos
\alpha-hemolíticos [Salo P. et al. J.
Infect. Dis. 1995, 171: 479-482; Morrisson K. et
al. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 434-437;
Kaijalainen T. et al. J. Microbiol. Meth. 2002, 51:
111-118], así como para la detección de
Streptococcus agalactiae [Mawn J.A. et al. J. Clin.
Pathol. 1993, 46: 633-636]. Sin embargo, estos
diferentes sistemas permiten la identificación sólo de una o
algunas especies del género Streptococcus.
Se ha desarrollado un sistema de identificación
de tres especies de estreptococos, basado en la amplificación del
separador 16S-23S [Forsman P. et al.
Microbiology, 1997, 143, 3491-3500], pero la
identificación únicamente se limitó en este trabajo a ciertas
especies de interés animal: Streptococcus agalactiae,
Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus uberis.
Por otro lado, actualmente resulta indispensable disponer en los
laboratorios de 2 dianas moleculares distintas para la detección y
la identificación de los estreptococos, con el fin de paliar los
riesgos de contaminación molecular inherentes a la utilización de
una sola diana.
Por último, no se ha desarrollado ningún sistema
de detección y de identificación de los géneros emparentados con
Streptococcus, y más particularmente para las bacterias del
género Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y
Granulicatella.
Los inventores han demostrado según la presente
invención que el gen rpoB constituye un marcador genético
que permite la detección y la identificación específica de la
bacteria de cada especie del género Streptococcus y de 4
géneros emparentados: Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y
Granulicatella.
A pesar de que este gen haya sido mostrado
anteriormente como una herramienta de identificación bacteriana en
diferentes géneros bacterianos, ninguna publicación menciona su
utilización para la identificación de las bacterias de los géneros
Streptococcus y de los cuatro géneros emparentados, y por lo
tanto no existía ninguna sugerencia en cuanto al interés de la
secuencia de este gen para la identificación de dichas bacterias.
Al contrario, algunas secuencias parciales del gen rpoB en
algunas especies, disponibles en GenBank, mostraba una baja
heterogeneidad, haciendo dudar sobre el interés de este gen como
herramienta de identificación para estas bacterias. Por último, los
inventores han desarrollado una herramienta de identificación de
cuatro géneros bacterianos simultáneamente, obligando a la puesta a
punto de cebadores degenerados que no se podían deducir de ninguna
de las secuencias rpoB determinadas para cada especie.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a unas secuencias de ácidos nucleicos específicos del
género o de cada especie del género Streptococcus y de los
géneros emparentados cuya secuencia nucleotídica está extraída del
gen rpoB de dichas bacterias.
Según Lazcano et al. [J. Mol. Evol.
(1988) 27:365-376], los ARN polimerasas están
divididos en dos grupos según su origen, uno constituido por los
ARN polimerasas virales ARN- o ADN-dependientes, y
el otro constituido por los ARN polimerasas
ADN-dependientes de origen eucariota o procariota
(arcaebacterias y eubacterias). Los ARN polimerasas
ADN-dependientes eubacterianos están caracterizados
por una constitución multimérica simple y conservada denominada
"core enzyme", representada mediante \alpha\beta\beta', o
"holoenzima" representada mediante
\alpha\beta\beta'\sigma [Yura y lshihama, Ann. Rev. Genet.
(1979) 13:59-97].
Numerosos trabajos han demostrado el papel
funcional, en el seno del complejo enzimático multimérico, de la
sub-unidad \beta del ARN polimerasa eubacteriano.
Los ARN polimerasas arcaebacteriano y eucariota presentan, por su
parte, una estructura más compleja que puede alcanzar una decena,
incluso una treintena de sub-unidades [Pühlet et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)
86:4569-4573].
Los genes que codifican las diferentes
sub-unidades \alpha\beta\beta'\sigma del ARN
polimerasa ADN-dependiente en las eubacterias,
respectivamente los genes rpoA, rpoB, rpoC y
rpoD, están clasificados en diferentes grupos que comprenden
los genes que codifican para unas proteínas constitutivas de las
sub-unidades ribosómicas o para unas enzimas
implicadas en la replicación y la reparación del genoma [Yura y
Yshihma, Ann. Rev. Genet. (1979) 13:59-97]. Algunos
autores han mostrado que las secuencias de los genes rpoB y
rpoC se podían utilizar con el fin de construir unos árboles
filogenéticos [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans. (1992)
21:40S] que permiten separar las diferentes ramificaciones y
sub-ramificaciones entre los reinos de los
vivos.
Antes de exponer con mayor detalle la invención,
se definen a continuación diferentes términos, utilizados en la
descripción y en las reivindicaciones:
- -
- Mediante la expresión "ácido nucleico extraído de bacterias" se entiende o bien el ácido nucleico total, o bien el ADN genómico, o bien los ARN mensajeros, o bien también el ADN obtenido a partir de la transcripción inversa de los ARN mensajeros.
- -
- La expresión "fragmento nucleotídico" o el término "oligonucleótido" son dos términos sinónimos que designan un encadenamiento de motivos nucleotídicos caracterizado por una secuencia informacional de los ácidos nucleicos naturales (o eventualmente modificados) y susceptibles de hibridarse, tales como los ácidos nucleicos naturales, con un fragmento nucleotídico complementario o sustancialmente complementario, en unas condiciones predeterminadas de "astringencia" estricta. El encadenamiento puede contener unos motivos nucleotídicos de estructura diferente de la de los ácidos nucleicos naturales. Un fragmento nucleotídico (u oligonucleótido) puede contener por ejemplo hasta 100 motivos nucleotídicos. Contiene generalmente por lo menos 8, y en particular por lo menos 12 motivos nucleotídicos, en particular de 18 a 35, y se puede obtener a partir de una molécula de ácido nucleico natural y/o mediante recombinación genética y/o mediante síntesis química.
- -
- Un motivo nucleotídico se deriva de un monómero que puede ser un nucleótido natural de ácido nucleico cuyos elementos constitutivos son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada seleccionada de entre la adenina (A), la guanina (G), el uracilo (U), la citosina (C), la timina (T); o bien el monómero es un nucleótido modificado en uno por lo menos de los tres elementos constitutivos anteriores; a título de ejemplo, la modificación puede intervenir o bien a nivel de las bases, con unas bases modificadas tales como la inosina, que puede hibridarse con cualquier base A, T, U, C o G, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5-desoxiuridina, o cualquier otra base modificada capaz de hibridación, o bien a nivel del azúcar, por ejemplo el sitio de por lo menos una desoxirribosa por una poliamida [Nielsen PE et al., Science (1991) 254:1497-1500], o bien también a nivel de un grupo fosfato, por ejemplo mediante la sustitución por unos ésteres seleccionados en particular de entre los difosfatos, los alquilfosfonatos y los fosforotioatos.
- -
- Por el término "hibridación" se entiende el proceso durante el cual, en unas condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos que tienen unas secuencias suficientemente complementarias son susceptibles de asociarse mediante unas uniones hidrógeno estables y específicas, para formar una doble hebra. Las condiciones de hibridación son determinadas por la "astringencia", es decir el rigor de las condiciones de funcionamiento. La hibridación es tanto más específica por cuanto que se efectúa con mayor astringencia. La astringencia es función en particular de la composición en bases de un dúplex sonda/diana, así como del grado de desapareamiento entre dos ácidos nucleicos. La astringencia puede asimismo ser función de los parámetros de la reacción de hibridación, tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la disolución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. La astringencia de las condiciones en las que una reacción de hibridación debe ser realizada depende en particular de las sondas utilizadas. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden eventualmente ser determinadas en cada caso por unos experimentos de rutina. En general, según la longitud de las sondas utilizadas, la temperatura para la reacción de hibridación está comprendida entre aproximadamente 20 y 65ºC, en particular entre 35 y 65ºC en una disolución salina a una concentración de aproximadamente 0,8 a 1M.
- -
- Una "sonda" es un fragmento nucleotídico que posee una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para formar un complejo de hibridación con un ácido nucleico que tiene, en el presente caso, una secuencia nucleotídica comprendida en un ARN mensajero, o bien en un ADN obtenido mediante transcripción inversa de dicho ARN mensajero, producto de transcripción; se puede utilizar una sonda con fines de diagnóstico (en particular sondas de captura o de detección) o con fines de terapia.
- -
- Una "sonda de captura" es una sonda inmovilizada o que se puede inmovilizar sobre un soporte sólido mediante cualquier medio apropiado, por ejemplo, mediante covalencia, mediante adsorción, o mediante síntesis directa sobre un sólido. Unos ejemplos de soportes comprenden las placas de microtitulación y los chips de ADN.
- -
- Una "sonda de detección" es una sonda marcada por medio de un agente marcador seleccionado, por ejemplo, de entre los isótopos radioactivos, las enzimas, en particular las enzimas susceptibles de actuar sobre un sustrato cromógeno, fluorígeno o luminiscente (en particular una peroxidasa o una fosfatasa alcalina), los compuestos químicos cromóforos, los compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes, los análogos de las bases nucleotídicas y los ligandos tales como la biotina.
- -
- Una "sonda de especie" es una sonda que permite la identificación específica de la especie de una bacteria.
- -
- Una "sonda de género" es una sonda que permite la identificación específica del género de una bacteria.
- -
- Un "cebador" es una sonda que comprende, por ejemplo, de 10 a 100 motivos nucleotídicos y que posee una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para las reacciones de amplificación enzimática.
- -
- Mediante la expresión "reacción de amplificación" se entiende una reacción de polimerización enzimática, por ejemplo en una técnica de amplificación tal como la PCR, iniciada mediante unos oligonucleótidos cebadores y usando un ADN polimerasa.
- -
- Mediante la expresión "reacción de secuenciación" se entiende la obtención de la secuencia de un fragmento de ácido nucleico o de un gen completo mediante un procedimiento de polimerización abortiva a partir de cebadores oligonucleotídicos y utilizando dichos didesoxinucleótidos (Sanger F, Coulson AR (1975), J. Mol. Biol. 94: 441) o hibridaciones múltiples con unas sondas múltiples fijadas sobre un soporte sólido tales como las utilizadas en los chips de ADN por ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de los genes rpoB de las
bacterias Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus mutans y Streptococcus
agalactiae han sido descritas en la bibliografía.
Los inventores han determinado las secuencias
completas de los genes rpoB de otras especies de bacterias
del género Streptococcus y emparentados: Streptococcus
anginosus y Streptococcus equinus, de Abiotrophia
defectiva, y una amplia porción del gen para Streptococcus
mutans y Enterococcus faecalis. Estas especies han sido
elegidas por los inventores como representantes de los principales
grupos genéticos determinados en base al estudio del gen 16S en las
bacterias del género Streptococcus y géneros emparentados,
enmarcando el conjunto de las especies descritas actualmente en
este género, de manera que la alineación de las secuencias
rpoB obtenidas en estas especies pueda enmarcar aparentemente
el conjunto de las secuencias rpoB de todas las especies de
estos géneros bacterianos más precisamente, se trata por lo tanto de
las especies filogenéticamente más divergentes entre el conjunto de
las especies descritas actualmente en este género, de manera que la
alineación de las secuencias rpob obtenida en estas especies
pueda enmarcar
filogenéticamente de forma aparente el conjunto de las secuencias rpob de todas las especies de este género bacteriano.
filogenéticamente de forma aparente el conjunto de las secuencias rpob de todas las especies de este género bacteriano.
A partir de estas secuencias completas o casi
completas y tras numerosas tentativas infructuosas tal como se
muestran en los ejemplos 1 y 2 a continuación, los inventores han
demostrado las secuencias de consenso y específicas SEC ID nº 6 y 7
siguientes:
- -
- SEC ID nº 6: 5'-AARYTNGGMCCTGAAGAAAT-3', y
- -
- SEC ID nº 7: 5'-TGNARTTTRTCATCAACCATGTG-3',
en las que:
- -
- N representa la inosina o uno de los 4 nucleótidos A, T, C o G,
- -
- R representa A o G,
- -
- M representa A o C, y
- -
- Y representa C o T,
y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores han determinado dichas secuencias
SEC ID nº 6 y 7 como no sólo consensuales entre todas las bacterias
del género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados
sino además específicas de la familia de las bacterias del género
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados.
En la posición que corresponde a un nucleótido
N, Y, M o R en las secuencias SEC ID nº 6 y 7 se encuentran unos
nucleótidos variables en las secuencias dianas complementarias en
función de la especie de la bacteria considerada, pero todos los
demás nucleótidos están conservados en todas las especies de las
bacterias del género Streptococcus y de dichos 4 géneros
emparentados.
Unas secuencias SEC ID nº 6 y 7 así definidas
están presentes en los genes rpoB de cualquier bacteria del
género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados y
específicos de las bacterias del género Streptococcus y de
dichos 4 géneros emparentados, y pueden por lo tanto proporcionar
unas sondas de género o unos cebadores de amplificación para
detectar cualquier bacteria del género Streptococcus y de
dichos 4 géneros emparentados.
Con este fin, la presente invención tiene por lo
tanto por objeto un oligonucleótido que comprende una secuencia de
por lo menos 8, preferentemente por lo menos 12, más preferentemente
de 18 a 35, motivos nucleotídicos, de los cuales por lo menos una
secuencia de 8, preferentemente 12, más preferentemente 18 motivos
consecutivos están incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 6 y
7 siguientes:
- -
- SEC ID nº 6: 5'-AARYTNGGMCCTGAAGAAAT-3', y
- -
- SEC ID nº 7: 5'-TGNARTTTRTCATCAACCATGTG-3',
en las que:
- -
- N representa la inosina o uno de los 4 nucleótidos A, T, C o G,
- -
- R representa A o G,
- -
- M representa A o C, y
- -
- Y representa C o T, y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene asimismo por objeto
una mezcla de oligonucleótidos, caracterizada porque está
constituida por una mezcla equimolar de oligonucleótidos según la
invención, que tienen todos una secuencia diferente y que
comprenden todos una secuencia incluida en la SEC ID nº 6, o todos
una secuencia incluida en la SEC ID nº 7.
Más particularmente, la presente invención tiene
asimismo por objeto una mezcla de dichos oligonucleótidos,
constituida por una mezcla equimolar de 32 oligonucleótidos de
secuencias diferentes que comprenden cada una por lo menos 15,
preferentemente por lo menos 18 motivos nucleotídicos consecutivos
incluidos en la secuencia siguiente:
- -
- SEC ID nº 6: 5'-AARYTNGGMCCTGAAGAAAT-3',
en la que:
- -
- R representa A o G,
- -
- Y representa C o T,
- -
- M representa A o C, y
- -
- N representa A, T, C o G,
y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene asimismo por objeto
una mezcla de dichos oligonucleótidos, constituida por una mezcla
equimolar de 8 oligonucleótidos de secuencias diferentes que
comprenden cada una por lo menos 15, preferentemente por lo menos
18 motivos nucleotídicos consecutivos incluidos en la siguiente
secuencia:
- -
- SEC ID nº 6: 5'-AARYTNGGMCCTGAAGAAAT-3',
en la que:
- -
- R representa A o G,
- -
- Y representa C o T,
- -
- M representa A o C, y
- -
- N representa la inosina,
y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene asimismo por objeto
una mezcla de dichos oligonucleótidos, constituida por una mezcla
equimolar de 16 oligonucleótidos de secuencias diferentes que
comprenden cada una por lo menos 15, preferentemente por lo menos
21 motivos nucleotídicos consecutivos incluidos en la siguiente
secuencia:
- -
- SEC ID nº 7: 5'-TGNARTTTRTCATCAACCATGTG-3',
en la que:
- -
- R representa A o G, y
- -
- N representa A, T, C o G, y las secuencias complementarias.
La presente invención tiene asimismo por objeto
una mezcla de dichos oligonucleótidos, constituida por una mezcla
equimolar de 4 oligonucleótidos de secuencias diferentes que
comprenden cada una por lo menos 15, preferentemente por lo menos
21 motivos nucleotídicos consecutivos incluidos en la siguiente
secuencia:
- -
- SEC ID nº 7: 5'-TGNARTTTRTCATCAACCATGTG-3',
en la que:
- -
- R representa A o G, y
- -
- N representa la inosina,
y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
Dichas mezclas de oligonucleótidos pueden
hibridarse con una secuencia complementaria incluida en el gen
rpoB de todas las bacterias del género Streptococcus
y de dichos 4 géneros emparentados, y pueden por lo tanto ser
utilizadas a título de sonda de género o cebadores de amplificación
para la detección o respectivamente la amplificación de un
fragmento de gen rpoB de dicha bacteria.
Para preparar dicha mezcla equimolar de
oligonucleótidos según las síntesis de oligonucleótidos conocidas
por el experto en la materia, basta con utilizar una mezcla
equimolar de 4 ó 2 nucleótidos para los nucleótidos que
corresponden a N o respectivamente K, N, R o Y, a saber:
- -
- una mezcla equimolar de los 4 nucleótidos, A, T, C y G para los nucleótidos que corresponden a N en el que N representa A, T, C o G, y
- -
- una mezcla equimolar de los 2 nucleótidos T y G para los nucleótidos que corresponden a K,
- -
- una mezcla equimolar de los 2 nucleótidos A y C para los nucleótidos que corresponden a N,
- -
- una mezcla equimolar de los 2 nucleótidos A y G para los nucleótidos que corresponden a R, y
- -
- una mezcla equimolar de los 2 nucleótidos C y T para los nucleótidos que corresponden a Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtiene así una mezcla equimolar de 32
(2^{3}x4) y de 16 (2^{2}x4) nucleótidos de secuencias diferentes
para respectivamente las 2 secuencias SEC ID nº 6 y 7.
En dichas mezclas equimolares de
oligonucleótidos según la invención, debido a que "N"
representa la inosina que puede hibridarse con cualquier base o una
mezcla equimolar de las 4 bases A, T, C, G, las secuencias SEC ID
nº 6 y 7 pueden hibridarse con la secuencia complementaria incluida
en el gen rpoB de todas las bacterias del género
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados.
Además, estas secuencias de consenso SEC ID nº 6
y SEC ID nº 7, enmarcan unas secuencias hipervariables cuya
secuencia es específica para cada especie de bacteria del género
Streptococcus. Estas secuencias enmarcadas por las SEC ID nº
6 y 7, pueden ser, por lo tanto, utilizadas a título de sonda de
especie de las bacterias del género Streptococcus y de
dichos 4 géneros emparentados.
Además, las secuencias SEC ID nº 6 y 7 han sido
determinadas como que enmarcan un fragmento del gen rpob que
comprende una zona cuya longitud variable es de aproximadamente 720
pb y como que comprenden las secuencias específicas más cortas para
cada especie de la bacteria del género Streptococcus y de
dichos 4 géneros empa-
rentados.
rentados.
Los inventores han podido así demostrar unas
sondas de especie para cada una de las 28 especies de bacteria del
género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados
estudiados que corresponden a las secuencias SEC ID nº 8 a 35
descritas en el ejemplo 2 a continuación, enmarcadas por las
secuencias de consenso SEC ID nº 6 y 7.
En las secuencias SEC ID nº 1 a 3 y 5, descritas
en el listado de secuencias al final de la descripción:
- -
- el nucleótido M representa A o C,
- -
- el nucleótido K representa T o G,
- -
- el nucleótido R representa A o G,
- -
- el nucleótido W representa A o T,
- -
- el nucleótido Y representa C o T,
- -
- el nucleótido N representa A, T, C, G o I,
- -
- el nucleótido S representa C o G,
- -
- el nucleótido V representa A, C o G.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de consenso extraídas de las SEC
ID nº 6 y 7 demostradas según la presente invención, se pueden
utilizar a título de sonda de género, de cebador de amplificación o
de reacción de secuenciación en unos procedimientos de detección de
bacteria de género Streptococcus y de dichos 4 géneros
emparentados mediante identificación molecular.
Las secuencias extraídas de las secuencias SEC
ID nº 6 y 7 permiten por lo tanto no sólo preparar unas sondas de
género de las bacterias del género Streptococcus y de dichos
4 géneros emparentados sino también detectar e identificar la
especie de dicha bacteria mediante amplificación y secuenciación
utilizando dichas secuencias como cebadores.
La secuencia completa del gen rpoB se
puede utilizar para identificar la bacteria no sólo mediante el
estudio de su secuencia primaria, sino también mediante el estudio
de las estructuras secundaria y terciaria del ARN mensajero que
procede de la transcripción de la secuencia completa de ADN.
Otro objeto de la presente invención es un
oligonucleótido o un fragmento de gen rpoB que tiene una
secuencia que consiste en las secuencias SEC ID nº 8 a 35,
incluyendo por lo tanto las secuencias SEC ID nº 11, 12, 14 y 22 de
las bacterias Streptococcus pyogenes, Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus mutans y respectivamente
Streptococcus agalactiae, y entre los oligonucleótidos o
fragmentos de secuencias complementarias tales como se han definido
anteriormente.
Los inventores, después del análisis de las
diferentes secuencias, han determinado mediante comparación de dos
en dos de todas las secuencias SEC ID nº 8 a 35 que el índice de
homología entre dos secuencias diferentes de entre dichas
secuencias SEC ID nº 8 a 35 es como máximo de 98,7%. Por debajo de
98,7% de homología entre las secuencias, éstas identifican unas
bacterias de especies diferentes.
Los oligonucleótidos, fragmentos de gen y genes
objetos de la presente invención, han sido descritos como teniendo
unas secuencias de ADN, es decir, con unos oligonucleótidos A, T, C
y G. Sin embargo, la presente invención tiene asimismo por objeto
unos oligonucleótidos que comprenden unas secuencias de ARN
correspondientes, es decir, en las que T está sustituido con U.
En la presente descripción, mediante la
expresión "secuencias inversas y secuencias complementarias" se
entienden las secuencias siguientes:
- -
- la secuencia inversa de dicha secuencia,
- -
- la secuencia complementaria de dicha secuencia, y
- -
- la secuencia complementaria de la secuencia inversa de dicha secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias SEC ID nº 1 a 35 se pueden
preparar mediante ingeniería genética y/o mediante síntesis química,
en particular mediante síntesis automática, utilizando las técnicas
bien conocidas por el experto en la materia.
Una primera aplicación de un oligonucleótido
según la invención es su utilización como sonda para la detección,
en una muestra biológica, de bacterias de una de las especies del
género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados que
comprende una secuencia nucleotídica en una de las secuencias SEC ID
nº 6 a 35, y sus secuencias complementarias.
Un oligonucleótido que comprende las secuencias
SEC ID nº 6 y 7 se utilizará a título de sonda de género y un
oligonucleótido que comprende una secuencia comprendida en o que
comprende una de las secuencias SEC ID nº 8 a 35, se utilizará a
título de sonda de especie.
Más particularmente, la presente invención tiene
por objeto un oligonucleótido que consiste en una secuencia
específica de una especie de una bacteria del género
Streptococcus y dichos géneros emparentados, de 20 a 100
nucleótidos consecutivos, preferentemente por lo menos 30
nucleótidos consecutivos incluidos en una de dichas secuencias SEC
ID nº 8 a 35 o, llegado el caso, una mezcla equimolar de dichos
oligonucleótidos de secuencias diferentes.
Preferentemente, dichas secuencias comprendidas
en una de las secuencias SEC ID nº 8 a 35, que tienen
preferentemente por lo menos 20 nucleótidos, más preferentemente
por lo menos 30 nucleótidos consecutivos incluidos en una de las
secuencias SEC ID nº 8 a 35, constituyen las secuencias específicas
de las diferentes especies respectivas más cortas, que se pueden
utilizar como sonda de especies de las bacterias
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados en
cuestión.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las sondas según la invención se pueden utilizar
con fines de diagnóstico, tal como se ha mencionado anteriormente,
mediante la determinación de la formación o de la ausencia de
formación de un complejo de hibridación entre la sonda y un ácido
nucleico diana en una muestra, según todas las técnicas de
hibridación conocidas y en particular las técnicas de depósito
puntual sobre filtro, denominadas "DOT-BLOT"
[Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor], las técnicas de transferencia de ADN denominadas
"SOUTHERN BLOT" [Southern E.M., J. Mol. Biol. (1975) 98:503],
las técnicas de transferencia de ARN denominadas "NOTHERN
BLOT", o las técnicas denominadas "sándwich", en particular
con una sonda de captura y/o una sonda de detección, siendo dichas
sondas capaces de hibridarse con dos regiones diferentes del ácido
nucleico diana, y siendo una por lo menos de dichas sondas
(generalmente la sonda de detección) capaz de hibridarse con una
región de la diana que es específica de la especie, entendiéndose
que la sonda de captura y la sonda de detección deben tener unas
secuencias nucleotídicas por lo menos parcialmente diferentes.
El ácido nucleico a detectar (diana) puede ser
ADN o ARN (el primero obtenido después de la amplificación por
PCR). En el caso de la detección de una diana de tipo ácido nucleico
de doble hebra, conviene proceder a la desnaturalización de este
último antes de la realización del procedimiento de detección. El
ácido nucleico diana se puede obtener mediante extracción según los
procedimientos conocidos de los ácidos nucleicos de una muestra a
examinar. La desnaturalización de un ácido nucleico de doble hebra
se puede realizar mediante los procedimientos conocidos de
desnaturalización química, física o enzimática, y en particular
mediante calentamiento a una temperatura apropiada, superior a
80ºC.
Para realizar las técnicas de hibridación
citadas anteriormente, y en particular las técnicas "sándwich",
una sonda de la invención, denominada sonda de captura, se
inmoviliza sobre un soporte sólido, y otra sonda de la invención,
denominada sonda de detección, se marca con un agente marcador. Los
ejemplos de soporte y de agente marcador son tal como se han
definido anteriormente.
De manera ventajosa, una sonda de especie se
inmoviliza sobre un soporte sólido, y otra sonda de especie se
marca mediante un agente marcador.
Otra aplicación de un oligonucleótido de la
invención es su utilización como cebador nucleotídico que comprende
un oligonucleótido monocuaternario seleccionado de entre los
oligonucleótidos que tienen una secuencia de por lo menos 12
motivos nucleotídicos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 6
a 36, que se puede utilizar en la síntesis de un ácido nucleico en
presencia de una polimerasa mediante un procedimiento conocido en
sí, en particular en unos procedimientos de amplificación que
utilizan dicha síntesis en presencia de una polimerasa (PCR,
RT-PCR, etc.). En particular, se puede utilizar un
cebador de la invención para la transcripción inversa específica de
una secuencia de ARN mensajero de una bacteria de una especie del
género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados para
obtener una secuencia de ADN complementaria correspondiente. Dicha
transcripción inversa puede constituir la primera etapa de la
técnica RT-PCR, siendo la etapa siguiente la
amplificación por PCR del ADN complementario obtenido. Se pueden
utilizar asimismo los cebadores de la invención para la
amplificación específica por reacción de polimerización en cadena de
la secuencia total del ADN del gen rpoB de una especie del
género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados.
Según un caso particular, dicho cebador que
comprende un oligonucleótido de la invención comprende además la
secuencia sentido o anti-sentido de un promotor
reconocido por un ARN polimerasa (promotores T7, T3, SP6, por
ejemplo) [Studier FW, BA Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113]:
dichos cebadores se pueden utilizar en unos procedimientos de
amplificación de ácido nucleico que hacen intervenir una etapa de
transcripción, tales como, por ejemplo, las técnicas NASBA o 3SR
[Van Gemen B. et al. Abstract MA 1091, 7th International
Conference on AIDS (1991) Florence, Italia].
Un cebador nucleotídico que comprende un
oligonucleótido seleccionado de entre los oligonucleótidos que
tienen una secuencia que comprende una de las secuencias SEC ID nº
6 a 35 o una secuencia incluida en las SEC ID nº 6 a 35, se puede
utilizar para la secuenciación total o parcial del gen rpoB
de una cepa cualquiera de una especie del género
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados.
La secuenciación del gen rpoB parcial o
total en cualquier bacteria del género Streptococcus y
géneros emparentados permite la identificación de cualquier
bacteria Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados
mediante análisis bioinformático de esta secuencia, y el
reconocimiento de nuevas especies de bacterias Streptococcus
y de dichos 4 géneros emparentados desconocidas.
Preferentemente, en una utilización como cebador
o para la secuenciación de los genes rpoB, se utiliza dicha
mezcla de oligonucleótidos según la invención, y más preferentemente
dichas mezclas de oligonucleótidos que consisten en las secuencias
SEC ID nº 6 y SEC ID nº 7.
Más precisamente, la presente invención
proporciona un procedimiento de detección mediante identificación
de una bacteria de una de las especies del género
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados,
caracterizado porque se utiliza:
- -
- dicho fragmento de dicho gen rpoB de dicha bacteria según la presente invención, que consiste en una secuencia nucleotídica seleccionada de entre una de las secuencias SEC ID nº 8 a 35, las secuencias complementarias, útil en particular como sonda de especies, y/o
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
- dicho oligonucleótido según la presente invención que consiste en dicha secuencia específica incluida en una de las secuencias SEC ID nº 8 a 35, las secuencias complementarias, útil en particular como sonda de especies, y/o
- -
- un oligonucleótido o dicha mezcla de oligonucleótidos según la presente invención que comprende una secuencia constituida por motivos nucleotídicos consecutivos, incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 6 y 7, útil en particular como sonda de género o cebador de amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, en dicho procedimiento de
detección según la invención, se utiliza por lo menos dicha mezcla
de oligonucleótidos según la presente invención, cuyas secuencias
consisten en las secuencias SEC ID nº 6 y 7, y sus secuencias
inversas y secuencias complementarias en las que más preferentemente
N representa la inosina.
En un primer modo de realización de un
procedimiento de detección según la invención, se busca demostrar la
presencia de una bacteria del género Streptococcus y de
dichos 4 géneros emparentados, y se realizan las etapas en las
que:
- 1.
- se pone en contacto por lo menos una sonda de género que comprende dicha mezcla de oligonucleótidos de secuencias que comprenden o que están comprendidas en una de las secuencias SEC ID nº 6 y 7, las secuencias complementarias según la invención, con una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de por lo menos dicha bacteria del género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados, y
- 2.
- se determina la formación o la ausencia de formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda de género y los ácidos nucleicos de la muestra, y se determina la presencia de dicha bacteria del género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados, si existe una formación de un complejo de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo modo de realización de un
procedimiento de detección de una bacteria del género
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados, se
realizan las etapas en las que:
- 1.
- Se ponen en contacto unos cebadores de amplificación que comprenden dichas mezclas de oligonucleótidos que comprenden una secuencia incluida en dichas secuencias SEC ID nº 6 y 7, y secuencias complementarias según la invención, con una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de por lo menos dicha bacteria del género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados con:
- -
- como cebador 5': dicha mezcla de oligonucleótidos que comprende una secuencia incluida en la secuencia SEC ID nº 6, o preferentemente que consiste en dicha secuencia SEC ID nº 6 completa, o una secuencia complementaria según la invención;
- -
- como cebador 3': dicha mezcla de oligonucleótidos que comprende una secuencia incluida en la secuencia SEC ID nº 7 o preferentemente que consiste en dicha secuencia SEC ID nº 7 completa, o respectivamente una secuencia complementaria según la invención.
- 2.
- Se realiza una amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción de polimerización enzimática y se determina la aparición o la ausencia de un producto de amplificación, y se determina así la presencia de dicha bacteria en la muestra si ha aparecido un producto de amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Este segundo modo de realización se puede
utilizar para detectar específicamente el género de una bacteria
del género Streptococcus y dichos 4 géneros emparentados.
Pero, en la etapa 2 de este segundo modo de
realización, se puede intentar detectar específicamente una especie
determinada de una bacteria del género Streptococcus
seleccionada de entre las especies Streptococcus mutans,
Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis,
Streptococcus suis, Streptococcus acidominimus, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus,
Streptococcus difficilis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus
equi, Streptococcus equinus, Streptococcus intermedius,
Streptococcus mitis, Streptococcus bovis, Granulicatella adjacens,
Abiotrophia defectiva, Enterococcus avium, Enterococcus
casselliflavus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium,
Enterococcus gallinarum, Enterococcus sacharolyticus, Gemella
haemolysans y Gemella morbillorum, como se describe en
la variante de realización de un procedimiento de detección
específica de una especie de dichas bacterias, descrita
anteriormente.
Tal como se ha expuesto anteriormente en la
introducción, los géneros Streptococcus, Enterococcus,
Granulicatella, Abiotrophia, y Gemella
comprenden más especies bacterianas que las que han sido
efectivamente secuenciadas en este trabajo. Sin embargo, las
especies secuenciadas han sido elegidas tales que enmarcan todas
las especies conocidas en estos géneros bacterianos y están en
número suficiente para demostrar la aplicación de la secuencia
rpoB en la identificación de las especies de estos
géneros.
En una variante de realización de un
procedimiento de detección específica de una especie de dichas
bacterias según la invención, se realizan las etapas en las
que:
- 1.
- se pone en contacto una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de por lo menos dicha bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en dicho fragmento de gen o dicho oligonucleótido que comprende una secuencia incluida en una de las secuencias SEC ID nº 8 a 35, preferentemente un oligonucleótido que consiste en una de dichas secuencias SEC ID nº 8 a 35, las secuencias complementarias según la invención, y
- 2.
- se determina la formación o la ausencia de un complejo de hibridación entre dicha sonda y los ácidos nucleicos de la muestra, y se determina así la presencia de dicha bacteria en la muestra si existe una formación de un complejo de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra variante de realización del
procedimiento según la invención, en la que se intenta detectar
específicamente una especie determinada de una bacteria del género
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados
seleccionados de entre las 28 especies citadas anteriormente, el
procedimiento comprende las etapas en las que, en una muestra que
contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de
por lo menos dicha bacteria:
- a)
- se realiza una reacción de secuenciación de un fragmento del gen rpoB amplificado de dicha bacteria determinada con la ayuda de los cebadores nucleotídicos que consisten en dichas mezclas de oligonucleótidos que comprenden unas secuencias incluidas en la secuencia SEC ID nº 6 como cebador 5', y SEC ID nº 7 como cebador 3', preferentemente las secuencias que consisten en dichas secuencias SEC ID nº 6 y 7, y sus secuencias complementarias, y
- b)
- se determina la presencia o la ausencia de la especie determinada de dicha bacteria comparando la secuencia de dicho fragmento obtenido con la secuencia del gen completo rpoB de dicha bacteria o la secuencia de un fragmento del gen rpoB de dicha bacteria que comprende dichas secuencias nº 8 a 35, y secuencias complementarias según la invención, y se determina así la presencia de dicha bacteria en la muestra si la secuencia del fragmento obtenida es idéntica a la secuencia conocida del género o del fragmento de gen rpoB de dicha bacteria.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene asimismo por objeto
un kit de diagnóstico útil en un procedimiento según la invención
que comprende por lo menos dicho fragmento de gen o dicho
oligonucleótido de secuencia comprendida o que consiste en las
secuencias SEC ID nº 8 a 35 o dicho oligonucleótido o mezcla de
oligonucleótidos que comprenden una secuencia incluida en una de
las secuencias SEC ID nº 6 y 7, y/o por lo menos dicho fragmento de
gen rpoB de dicha bacteria que comprende las secuencias SEC
ID nº 8 a 35, y las secuencias complementarias según la
invención.
Ventajosamente, un kit según la presente
invención comprende dichos oligonucleótidos en forma de
"biochips", es decir, fijados sobre unos soportes sólidos, en
particular en vidrio, según el procedimiento descrito en la patente
US nº 5.744.305 (Affymetrix, Fodor et al.) utilizando la
estrategia de resecuenciación descrita en la solicitud WO 95/11995
(Affymax, Chee et al.) o según el procedimiento descrito por
A Troesch et al. en J. Clin. Microbiol., vol. 37(1),
p. 49-55, 1999. Los oligonucleótidos sintetizados
sobre el "biochip" realizan la resecuenciación de la región
hipervariable del gen rpoB. Este procedimiento presenta una
ventaja considerable en términos de coste de producción y sin
compromiso en la calidad de la identificación de las diferentes
especies debido a la elección de estas secuencias de identificación.
Preferentemente, estos oligonucleótidos fijados sobre el soporte
sólido del "biochip" comprenden de 10 a 30 bases, por ejemplo
20 bases, con una posición de interrogación situada en la región
central como, por ejemplo, en la 12ª posición con relación al
extremo 3' de la secuencia para unos oligonucleótidos de 20 bases.
Otro ejemplo consiste en utilizar unos oligonucleótidos de 17
bases, con 2 posiciones de interrogación: una en la 10ª y una en la
8ª posición. Otros oligonucleótidos tienen unas longitudes
comprendidas entre 10 y 25 nucleótidos. Las posiciones de
interrogación varían entonces en función de la longitud del
oligonucleótido.
El análisis se efectúa sobre el sistema completo
GeneChip® (referencia 900228, Affymetrix, Santa Clara, CA) que
comprende el lector GeneArray®, el horno de hibridación GeneChip®,
la estación fluídica GeneChip® y el programa de análisis
GeneChip®.
Un oligonucleótido según la invención puede ser
utilizado asimismo a título de sonda de terapia génica para tratar
las infecciones provocadas por una cepa que pertenece a una especie
del género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados,
comprendiendo dicha sonda un oligonucleótido tal como se ha definido
anteriormente. Esta sonda de terapia génica, capaz de hibridarse
sobre el ARN mensajero y/o sobre el ADN genómico de dichas
bacterias, puede bloquear los fenómenos de traducción y/o de
transcripción y/o de replicación.
El principio de los procedimientos de terapia
génica es conocido y se basa en particular en la utilización de una
sonda que corresponde a una hebra anti-sentido: la
formación de un híbrido entre la sonda y la hebra sentido es capaz
de perturbar por lo menos una de las etapas del descifrado de la
información genética. Las sondas de terapia génica por lo tanto se
pueden utilizar como medicamentos antibacterianos, permitiendo
luchar contra las infecciones causadas por las bacterias de las
especies del género Streptococcus y de dichos 4 géneros
emparentados.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de la descripción siguiente, dividida en
ejemplos, que se refieren a unos experimentos efectuados con el
objetivo de realizar la invención y que se proporcionan a título
totalmente ilustrativo.
La figura 1 representa la visualización de los
productos de amplificación por coloración con bromuro de etidio
después de la electroforesis sobre un gel de agarosa obtenido en el
ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha determinado la secuencia completa del gen
rpoB de las bacterias de las especies Abiotrophia
defectiva, Streptococcus anginosus y Streptococcus
equinus mediante amplificación enzimática y secuenciación
automática disponible en los estreptococos. La elección de estas
especies se basó en el análisis del árbol 16S que muestra una
divergencia genética que cubre el conjunto del árbol filogenético de
los estreptococos.
Estrategia y secuenciación:
Varias secuencias parciales de 510 pb de genes
rpoB están disponibles en GenBank para las 10 especies de
estreptococos siguientes: Streptococcus intermedius,
Streptococcus sanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
parasanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis,
Streptococcus cristalus, Streptococcus constallatus, Streptococcus
anginosus y Granulicatella adjacens. [Majewski,J.,
Zawadzki,P., Pickerill, P., Cohan, F.M. y Dowson,C.G. Barriers to
genetic exchange between bacterial species: Streptococcus pneumoniae
transformation. J. Bacteriol. 182, 1016-1023
(2000)], pero los cebadores utilizados por estos autor es amplifican
sólo una fracción de las especies del género Streptococcus y
por lo tanto no ha sido posible llevar a cabo bien el trabajo en
base a estos únicos datos. Por lo tanto, fue necesario determinar
unos cebadores capaces de amplificar el conjunto de las cepas de
estreptococos, enterococos, Abiotrophia, Gemella, y
Granulicatella. Estos cebadores debían además enmarcar una
región que presenta una diversidad genética suficiente para permitir
distinguir dos especies entre sí. Sin embargo, la alineación de
estas secuencias parciales publicadas ha permitido determinar los
cebadores comunes siguientes: (la numeración se refiere a la
secuencia completa del Streptococcus pyogenes)
- -
- SEC ID nº 36: 5'-AGACGGACCTTCTATGGAAAA-3' (cebador 748F),
- -
- SEC ID nº 37: 5'-GGACACATACGACCATAGTG-3' (cebador 116R), y
- -
- SEC ID nº 38: 5'-GTTGTAACCTTCCCAWGTCAT-3' (cebador 830R).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebadores han permitido secuenciar la
parte central del gen rpoB de 714 pb para las cinco especies
seleccionadas (Streptococcus equinus, Streptococcus
mutans, Streptococcus anginosus, Enterococcus
faecalis, y Abiotrophia defectiva). A partir de este
fragmento central, la secuenciación ha continuado mediante la
técnica denominada del genoma Walker.
Aparte de esta zona publicada [Majewski, J.,
et al. J. Bacteriol. 2002, 182, 1016-1023],
la alineación de las dos secuencias completas disponibles en
GenBank Streptococcus pneumoniae [GenBank número de acceso
AE008542] y Streptococcus pyogenes [GenBank número de acceso
AE006480] han permitido elegir los cebadores siguientes:
- -
- SEC ID nº 39: 5'-GTCTTCWTGGGYGATTTCCC-3' (cebador 2215R),
- -
- SEC ID nº 40: 5'-ACCGTGGIGCWTGGTTRGAAT-3' (cebador 2057R),
- -
- SEC ID nº 41: 5'-AACCAATTCCGYATYGGTYT-3' (cebador 1252R),
- -
- SEC ID nº 42: 5'-AGIGGGTTTAACATGATGTC-3' (cebador 371F),
- -
- SEC ID nº 43: 5'-AGIGCCCAAACCTCCATCTC-3' (cebador 730F), y
- -
- SEC ID nº 44: 5'-CTCCAAGTGAACAGATGTGTA-3'(cebador 585R).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebadores han permitido extender la región
secuenciada para algunas de las cinco cepas elegidas. De manera
completamente inesperada, E. faecalis no está amplificado por
estos cebadores; pero se ha observado que la zona parcial
secuenciada presentaba una homología con el gen rpoB de
Listeria monocytogenes, es decir, con una bacteria que
pertenece a un género bacteriano diferente, lo que no se podía
absolutamente deducir de los datos existentes, por lo tanto, se han
elegido unos cebadores en el gen rpoB de Listeria
para amplificar el gen rpoB de Enterococcus
faecalis.
- -
- SEC ID nº 45: 5'-TTACCAAACTTAATTGAGATTCAAAC-3' (cebador 180F)
- -
- SEC ID nº 46: 5'-AGTATTTATGGGTGATTTCCCA-3' (cebador 410F)
- -
- SEC ID nº 47: 5'-GGACGTTATAAAATCAACAAAAAATT-3' (cebador 910F)
- -
- SEC ID nº 48: 5'-AGTTATAACCATCCCAAGTCATG-3' (cebador 2430R)
- -
- SEC ID nº 49: 5'-TGAAGTTTATCATCAACCATGTG-3' (cebador 3280R)
- -
- SEC ID nº 50: 5'-CCCAAAACGTTGTCCACC-3' (cebador 3360R).
Las secuencias parciales así obtenidas para las
cinco cepas elegidas (Streptococcus equinus, Streptococcus
mutans, Streptococcus anginosus, Enterococcus
faecalis, Abiotrophia defectiva) han permitido elegir
los cebadores siguientes:
- -
- SEC ID nº 51: 5'-AACCAAGCYCGGTTAGGRAT-3' (cebador 520R)
- -
- SEC ID nº 52: 5'-ATGTTGAACCCACTIGGGGTGCCAT-3' (cebador 2881 F) para la secuenciación de las zonas C- y N-terminales mediante genoma Walker.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación es entonces completa, tal como
lo demuestra la determinación de la región codificante, y la
alineación de las proteínas traducidas de las secuencias
nucleotídicas con las dos proteínas rpoB publicadas de
Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.
Varios cebadores de consenso potenciales fueron
objeto de investigaciones para obtener un fragmento susceptible de
conducir a la secuencia completa de los genes rpoB por
elongaciones sucesivas a partir de una serie de cebadores
específicos.
En cada una de las etapas anteriores, un gran
número de tentativas con unos cebadores teórica o potencialmente
apropiados han fracasado antes de determinar los cebadores
mencionados anteriormente para permitir amplificar y secuenciar por
etapas sucesivas la totalidad de los genes rpoB descrita a
continuación.
Las reacciones de secuenciación han sido
realizadas utilizando los agentes reactivos del kit ABI Prism
dRhodamine Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
(Perkin Elmer Applied Biosystems) según las recomendaciones del
fabricante siguiendo el siguiente programa: 30 ciclos que comprenden
una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 10 s, una etapa de
hibridación del cebador a 50ºC durante 10 s y una etapa de extensión
a 60ºC durante 2 minutos. Los productos de secuenciación han sido
separados mediante electroforesis sobre un gel de poliacrilamida en
un secuenciador 377 DNA Sequencer (Perkin), y analizados para formar
unas secuencias de consenso mediante el programa Sequencer
Assembler (Applied Biosystems).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\newpage
Este enfoque ha permitido determinar la
secuencia completa del gen rpoB en dos especies del género
Streptococcus y en Abiotrophia defectiva:
SEC ID nº 1: Secuencia del gen rpoB de
Streptococcus anginosus. Esta secuencia mide 4.523 pares de
bases, posee un contenido en citosina más guanosina de 41% y está
depositada en GenBank con el número de acceso AF 535183:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 2: Secuencia del gen rpoB de
Streptococcus equinus. Esta secuencia mide 4.118 pares de
bases, posee un contenido en citosina más guanosina de 41% y está
depositada en GenBank con el número de acceso AF 535187:
\newpage
SEC ID nº 3: Secuencia del gen rpoB de
Abiotrophia defectiva. Esta secuencia mide 4.325 pares de
bases, posee un contenido en citosina más guanosina de 47% y está
depositada en GenBank con el número de acceso AF 535173:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 4: Secuencia parcial del gen
rpoB de Streptococcus mutans. Esta secuencia mide
3.198 pares de bases, posee un contenido en citosina más guanosina
de 42% y está depositada en GenBank con el número de acceso AF
535167:
\newpage
SEC ID nº 5: Secuencia parcial del gen
rpoB de Enterococcus faecalis. Esta secuencia mide
3.096 pares de bases, posee un contenido en citosina más guanosina
de 42% y está depositada en GenBank con el número de acceso AF
535175:
En las secuencias anteriores, el nucleótido K
designa T o G, el nucleótido M designa A o C, el nucleótido R
designa A o G, el nucleótido W designa A o T, el nucleótido Y
designa C o T y el nucleótido N designa A, T, C o G.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la alineación de las secuencias
completas del gen rpoB en Streptococcus spp. y
Abiotrophia defectiva del ejemplo 1, y las conocidas en
GenBank (Streptococcus pneumonia AE008542 y Streptococcus
pyogenes AE006480) se ha elegido un juego de cebadores para la
amplificación y la secuenciación de un fragmento de 709 a 740 pb de
este gen en 28 cepas tipo de estos géneros bacterianos. Estos
cebadores tienen por secuencia:
- -
- SEQ ID nº 6: 5'-AARYTIGMCCTGAAGAAAT-3'
- -
- SEQ ID nº 7: 5'-TGIARTTTRTCATCAACCATGTG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia SEC ID nº 7 se utiliza a título de
cebador 3' y representa por lo tanto la secuencia inversa
complementaria de la hebra directa representada en las secuencias
SEC ID nº 1 a 5 anteriores.
Estos cebadores están incorporados con el ADN
extraído de las bacterias en una PCR según las siguientes
condiciones: desnaturalización a 95ºC durante 1 min. seguida de 35
ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 94ºC durante
10 s, una etapa de hibridación a 52ºC durante 10 s y una etapa de
elongación a 72ºC durante 30 s.
Los productos amplificados son secuenciados por
los mismos cebadores SEC ID nº 6 y SEC ID nº 7 según las condiciones
siguientes: desnaturalización a 95ºC durante 1 min. seguida de 30
ciclos que comprenden una etapa de desnaturalización a 95ºC durante
30 s, una etapa de hibridación a 52ºC durante 30 s y una etapa de
hibridación a 62ºC durante 1 min. Los productos de secuenciación se
analizan mediante un secuenciador ABI PRISM 3100.
Los inventores han determinado la posición de
estos dos cebadores SEC ID nº 6 y SEC ID nº 7, de manera que se
respetan los siguientes criterios:
- 1-
- Secuencia enmarcada por estos dos cebadores específicos de la especie de la bacteria. Esta condición se verifica después de la alineación de los fragmentos de aproximadamente 720 pb con el conjunto de las secuencias de los genes bacterianos rpoB disponibles en los bancos de datos informáticos.
- 2-
- Búsqueda de una región de identificación la más corta posible con el fin de aumentar lo máximo posible la sensibilidad de la detección molecular.
- 3-
- La longitud de los cebadores de 18 a 22 pb.
- 4-
- Secuencia de los cebadores que presentan una temperatura de fusión próxima.
- 5-
- Secuencia de los cebadores que no permiten ninguna auto-hibridación ni complementariedad.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\newpage
Los fragmentos obtenidos del gen rpoB de
las bacterias de las especies del género Streptococus y
dichos géneros emparentados tienen aproximadamente 720 (709 a 732)
pares de bases, y su secuencia es específica de cada especie de
este género y permitiendo por lo tanto la identificación molecular
de las bacterias de las 28 especies ensayadas:
SEC ID nº 8: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus suis CIP 1032 17^{T} que mide
709 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 9: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus sanguinis CIP 55.128^{T} que
mide 725 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 10: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus salivarius CIP 102503^{T} que
mide 728 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 11: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus pyogenes CIP 56.41^{T} que
mide 725 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 12: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus pneumoniae CIP 102911^{T} que
mide 724 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 13: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus oralis CIP 102922^{T} que mide
694 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 14: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus mutans CIP 103220^{T} que mide
728 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 15: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus mitis CIP 103335^{T} que mide
730 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 16: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus equinus CIP 102504^{T} que
mide 697 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 17: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus constellatus CIP 103247^{T}
que mide 731 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 18: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus anginosus CIP 102921^{T} que
mide 697 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 19: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus dysgalactiae CIP 102914^{T}
que mide 728 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 20: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus bovis CIP 102302^{T} que mide
728 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 21: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus acidominimus CIP 82.4^{T} que
mide 728 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 22: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus agalactiae CIP 103227^{T} que
mide 733 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 23: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus difficilis CIP 103768^{T} que
mide 714 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 24: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus intermedius CIP 103248^{T} que
mide 728 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 25: secuencia parcial del gen
rpoB en Streptococcus equi CIP 102910^{T} que mide
728 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 26: secuencia parcial del gen
rpoB en Enteroccocus gallinarum CIP 103013^{T} que
mide 694 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 27: secuencia parcial del gen
rpoB en Enterococcus casseliflavus CIP 103018^{T}
que mide 727 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 28: secuencia parcial del gen
rpoB en Enterococcus saccharolyticus CIP 103246^{T}
que mide 721 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 29: secuencia parcial del gen
rpoB en Enterococcus faecium CIP 103014^{T} que mide
727 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 30: secuencia parcial del gen
rpoB en Enterococcus faecalis CIP 103015^{T} que
mide 724 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 31: secuencia parcial del gen
rpoB en Enterococcus avium CIP 103019^{T} que mide
570 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 32: secuencia parcial del gen
rpoB en Abiotrophia defectiva CIP 103242^{T} que mide 732
pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 33: secuencia parcial del gen
rpoB en Gemella morbilorum CIP 81.10^{T} que mide
727 pares de bases:
\newpage
SEC ID nº 34: secuencia parcial del gen
rpoB en Gemella haemolysans CIP 101126^{T} que mide
726 pares de bases:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 35: secuencia parcial del gen
rpoB en Granulicatella adjacens CIP 103243^{T} que
mide 719 pares de bases:
En las secuencias anteriores, el nucleótido M
designa A o C, el nucleótido R designa A o G, el nucleótido W
designa A o T, el nucleótido Y designa C o T y el nucleótido N
designa A, T, C o G.
En las secuencias anteriores, las referencias
CIP se refieren a unos depósitos a la Colección Nacional de Cultivo
de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur en Paris
(Francia).
\vskip1.000000\baselineskip
Una colección de veinte cepas que pertenecen a
las siguiente especies bacterianas: Steptococcus pyogenes,
Streptococcus sanguis, Granulicatella adjacens, Abiotrophia
defectiva, Enterococcus avium, Enterococcus faecalis, Gemella
haemolysans, Gemella morbillorum, Streptococcus equi, Streptococcus
anginosus, Staphylococcus aureus, Pseudomohas oleovorans,
Mycobacterium avium, Bacillus cereus, Acinetobacter anitratus,
Corynebacterium amycolatum, Klebsiella terrigena, Pasteurella,
Lactobacillus rhamnosus, Staphylococcus, ha sido codificada de
manera que se realiza una identificación molecular a ciegas (el
experimentador no conocía a priori la identidad de las
cepas) de las cepas según el procedimiento descrito en la presente
solicitud de patente. La extracción de los ácidos nucleicos así
como la amplificación del fragmento del gen rpoB se han
realizado tal como se describe en el ejemplo nº 2 incorporando unos
cebadores que consisten en unas mezclas de 4 oligonucleótidos que
tienen unas secuencias que consisten en las secuencias SEC ID nº 6
(como cebador 5') y SEC ID nº 7 (como cebador 3'), representando N
la inosina, en una amplificación PCR (figura 1). La secuenciación de
estos 10 amplificados se ha realizado incorporando en la reacción
de secuenciación los cebadores SEC ID nº 6 y SEC ID nº 7, como se
describe en el ejemplo nº 2, y la comparación de las secuencias
obtenidas con las secuencias SEC ID nº 1 a 5 y 8 a 35 ha permitido
identificar las diez cepas amplificadas como Streptococcus
pyogenes, Streptococcus sanguis, Granulicatella adjacens,
Abiotrophia defectiva, Enterococcus avium, Enterococcus faecalis,
Gemella haemolysans, Gemella morbillorum, Streptococcus equi,
Streptococcus anginosus. La descodificación de estas 10 cepas
ha mostrado 100% de concordancia entre la identificación molecular
según el procedimiento que constituye el objeto de la presente
invención y la identificación establecida anteriormente mediante los
procedimientos fenotípicos estándares. Este resultado ilustra la
especificidad del juego de cebadores SEC ID nº 6/SEC ID nº 7.
Las demás bacterias elegidas porque están
frecuentemente aisladas en las muestras clínicas humanas o animales
susceptibles de contener asimismo unas bacterias del género
Streptococcus, no han sido amplificadas, demostrando así la
especificidad de los cebadores utilizados para el género
Streptococcus y dichos 4 géneros emparentados en las
condiciones de utilización para la detección de las bacterias del
género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados
según la invención con relación a las bacterias de otro género.
En la figura 1 se representan los productos de
amplificación PCR obtenidos a partir de diez cepas bacterianas
codificadas, que comprenden 7 cepas que pertenecen al género
Streptococcus y dichos 4 géneros emparentados (columnas 2,
3, 4, 7-11) y 3 cepas bacterianas de géneros
bacterianos distintos de Streptococcus y de dichos 4 géneros
emparentados (columnas 5, 6 y 12). Las columnas 1 y 13 representan
el marcador de peso molecular. Los productos de amplificación se
obtienen después de la incorporación de los cebadores SEC ID nº 6 y
SEC ID nº 7 descritos anteriormente, y son visualizados mediante
coloración con bromuro de etidio después de la electroforesis sobre
un gel de agarosa.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> UNIVERSIDAD DE LA MEDITERRANEE
(Aix-Marseille II) y CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE - CNRS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Identificación molecular de las
bacteris del género Strepetococcus
\vskip0.400000\baselineskip
<130> H52 437 caso 10 PCT MD
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus anginosus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (266)..(2087)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, c, g o i
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (266)..(4430)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, c, g o i
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4430)..(4503)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, c, g o i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus equinus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Abiotrophia defectiva
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus mutans
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (619)..(3193)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, c, g o i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3096
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, c o g o i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaarytnggmc ctgaagaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa i
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa a, t, c o g o i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgnartttrt catcaaccat gtg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 709
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus suis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 725
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus sanguinis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus salivarius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 725
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 694
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus oralis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus mutans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 730
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus mitis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 697
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus equinus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 731
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
constellatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 697
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus anginosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
dysgalactiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus bovis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
acidominimus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 733
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus agalactiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 714
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus difficilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus intermedius
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptotoccus equi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 697
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus gallinarum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 727
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus
casseliflavus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 721
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus
saccharolyticus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 727
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 725
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 570
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 732
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Abiotrophia defectiva
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 727
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gemella morbilorum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 726
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gemella haemolysins
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 719
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Granulicatella adjacens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagacggacct tctatggaaa a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacacatac gaccatagtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgtaacct tcccawgtca t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcttcwtgg gygatttccc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccgtggngc wtggttrgaa t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccaattcc gyatyggtyt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagngggttta acatgatgtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagngcccaaa cctccatctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccaagtga acagatgtgt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaccaaact taattgagat tcaaac
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtatttatg ggtgatttcc ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacgttata aaatcaacaa aaaatt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttataacc atcccaagtc atg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaagtttat catcaaccat gtg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaaaacgt tgtccacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccaagcyc ggttaggrat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211>25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgttgaacc cactnggggt gccat
\hfill25
Claims (20)
1. Fragmento de un gen rpoB de una
bacteria del género Streptococcus y de los 4 géneros
emparentados Enterococcus, Gemella,
Abiotrophia y Granulicatella, caracterizado
porque su secuencia consiste en una de las secuencias SEC ID nº 8 a
35, y las secuencias complementarias.
2. Oligonucleótido caracterizado porque
consiste en una secuencia específica de una especie de una bacteria
del género Streptococcus y de los 4 géneros emparentados
Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y
Granulicatella, de 20 a 100 nucleótidos consecutivos,
preferentemente por lo menos 30 nucleótidos consecutivos, incluidos
en una de dichas secuencias SEC ID nº 8 a 35, y las secuencias
complementarias.
3. Utilización de un fragmento de gen o de un
oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, a título
de sonda de especie de una bacteria del género Streptococcus
y de dichos géneros emparentados.
4. Oligonucleótido caracterizado porque
comprende una secuencia de por lo menos 8, preferentemente por lo
menos 12, más preferentemente 18 a 35 motivos nucleotídicos, de los
cuales por lo menos una secuencia de 8 motivos nucleotídicos
consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 6 y 7
siguientes:
- -
- SEC ID nº 6: 5'-AARYTNGGMCCTGAAGAAAT-3', y
- -
- SEC ID nº 7: 5'-TGNARTTTRTCATCAACCATGTG-3',
en las que:
- -
- N representa la inosina o uno de los 4 nucleótidos A, T, C o G,
- -
- R representa A o G,
- -
- M representa A o C, y
- -
- Y representa C o T,
y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Mezcla de oligonucleótidos,
caracterizada porque está constituida por una mezcla
equimolar de oligonucleótidos según la reivindicación 4, que tienen
todos una secuencia diferente y que comprenden todos una secuencia
incluida en la SEC ID nº 6 o todos una secuencia incluida en la SEC
ID nº 7.
6. Mezcla de oligonucleótidos,
caracterizada porque está constituida por una mezcla
equimolar de 32 oligonucleótidos según la reivindicación 4, de
secuencias diferentes que comprenden cada una por lo menos 15,
preferentemente por lo menos 18 motivos nucleotídicos consecutivos,
incluidos en la secuencia siguiente:
- -
- SEC ID nº 6: 5'-AARYTNGGMCCTGAAGAAAT-3', y
en la que:
- -
- R representa A o G,
- -
- Y representa C o T,
- -
- M representa A o C, y
- -
- N representa A, T, C o G, y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Mezcla de oligonucleótidos,
caracterizada porque está constituida por una mezcla
equimolar de 8 oligonucleótidos según la reivindicación 4 de
secuencias diferentes que comprenden cada una por lo menos 15,
preferentemente por lo menos 18 motivos nucleotídicos consecutivos,
incluidos en la secuencia siguiente:
- -
- SEC ID nº 6: 5'-AARYTNGGMCCTGAAGAAAT-3',
en la que:
- -
- R representa A o G,
- -
- Y representa C o T,
- -
- M representa A o C, y
- -
- N representa la inosina, y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Mezcla de oligonucleótidos,
caracterizada porque está constituida por una mezcla
equimolar de 16 oligonucleótidos según la reivindicación 4, de
secuencias diferentes que comprenden cada una por lo menos 15,
preferentemente por lo menos 21 motivos nucleotídicos consecutivos,
incluidos en la secuencia siguiente:
- -
- SEC ID nº 7: 5'-TGNARTTTRTCATCAACCATGTG-3',
en la que:
- -
- R representa A o G, y
- -
- N representa A, T, C o G, y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Mezcla de oligonucleótidos,
caracterizada porque está constituida por una mezcla
equimolar de 4 oligonucleótidos según la reivindicación 4, de
secuencias diferentes que comprenden cada una por lo menos 15,
preferentemente por lo menos 21 motivos nucleotídicos consecutivos,
incluidos en la secuencia siguiente:
- -
- SEC ID nº 7: 5'-TGNARTTTRTCATCAACCATGTG-3',
en la que:
- -
- R representa A o G, y
- -
- N representa la inosina,
y las secuencias complementarias.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Mezcla de oligonucleótidos según la
reivindicación 5, caracterizada porque dichas secuencias
consisten en las secuencias SEC ID nº 6 y 7 en las que,
preferentemente, N representa la inosina, y las secuencias
complemen-
tarias.
tarias.
11. Utilización de un oligonucleótido o de una
mezcla de oligonucleótidos según una de las reivindicaciones 4 a
10, a título de cebador de amplificación o sonda de género de una
bacteria del género Streptococcus y de los 4 géneros
emparentados Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y
Granulicatella.
12. Procedimiento de detección mediante
identificación molecular de una bacteria de una de las especies del
género Streptococcus y de los 4 géneros emparentados
Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y Granulicatella,
caracterizado porque se utiliza:
- -
- un fragmento de gen rpoB o un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, y/o
- -
- por lo menos un oligonucleótido o una mezcla de oligonucleótidos según una de las reivindicaciones 4 a 10.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que se busca detectar la presencia de una bacteria del género
Streptococcus o de dichos 4 géneros emparentados,
caracterizado porque comprende las etapas en las que:
- 1.
- se pone en contacto por lo menos una sonda de género que comprende dicha mezcla de oligonucleótidos según una de las reivindicaciones 5 a 10, con una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de por lo menos dicha bacteria del género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados, y
- 2.
- se determina la formación o la ausencia de formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda de género y los ácidos nucleicos de la muestra, y se determina así la presencia de dicha bacteria en la muestra si existe una formación de un complejo de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque comprende las etapas en las que:
- 1.
- se ponen en contacto los cebadores de amplificación que comprenden dichas mezclas de oligonucleótidos según una de las reivindicaciones 5 a 10, con una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de por lo menos dicha bacteria del género Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados, con:
- -
- como cebador 5', dicha mezcla de oligonucleótidos que comprende una secuencia incluida en la secuencia SEC ID nº 6, o preferentemente que consiste en dicha secuencia SEC ID nº 6 completa, o una secuencia complementaria según una de las reivindicaciones 5, 6, 7 ó 10, y
- -
- como cebador 3', dicha mezcla de oligonucleótidos que comprende una secuencia incluida en la secuencia SEC ID nº 7 o preferentemente que consiste en dicha secuencia SEC ID nº 7 completa o una secuencia complementaria según una de las reivindicaciones 5, 8, 9 ó 10.
- 2.
- Se realiza una amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción de polimerización enzimática y se determina la aparición o la ausencia de un producto de amplificación, y se determina así la presencia de dicha bacteria en la muestra si ha aparecido un producto de amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
14, caracterizado porque se busca detectar específicamente
una especie determinada de una bacteria del género
Streptococcus y de dichos 4 géneros emparentados seleccionada
de entre las especies: Streptococcus mutans, Streptococcus
oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus
suis, Streptococcus acidominimus, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus
difficilis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equi,
Streptococcus equinus, Streptococcus intermedius, Streptococcus
mitis, Streptococcus bovis, Streptococcus alactolyticus,
Streptococcus gallolyticus, Streptococcus macedonicus, Streptococcus
infantarius, Streptococcus hominis, Granulicatella adjacens,
Abiotrophia defectiva, Enterococcus avium, Enterococcus
casselliflavus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium,
Enterococcus gallinarum, Enterococcus sacharolyticus, Gemella
haemolysans y Gemella morbillorum,
procedimiento en el que:
- 1.
- se pone en contacto una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de por lo menos dicha bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en un fragmento de gen o un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, y
- 2.
- se determina la formación o la ausencia de un complejo de hibridación entre dicha sonda y los ácidos nucleicos de la muestra, y se determina así la presencia de dicha bacteria en la muestra si existe una formación de un complejo de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque se busca detectar una especie
determinada de una bacteria del género Streptococcus y de
dichos 4 géneros emparentados seleccionada de entre las especies:
Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius,
Streptococcus sanguinis, Streptococcus suis, Streptococcus
acidominimus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus,
Streptococcus constellatus, Streptococcus difficilis, Streptococcus
dysgalactiae, Streptococcus equi, Streptococcus equinus,
Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus bovis,
Streptococcus alactolyticus, Streptococcus gallolyticus,
Streptococcus macedonicus, Streptococcus infantarius, Streptococcus
hominis, Granulicatella adjacens, Abiotrophia defectiva,
Enterococcus avium, Enterococcus casselliflavus, Enterococcus
faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum,
Enterococcus sacharolyticus, Gemella haemolysans y Gemella
morbillorum, procedimiento en el que, en una muestra que
contiene o que es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de
por lo menos dicha bacteria del género Streptococcus y de
dichos 4 géneros emparentados, se efectúan las etapas en las
que:
- a)
- se realiza una reacción de secuenciación de un fragmento del gen rpoB amplificado de dicha bacteria determinada con la ayuda de unos cebadores nucleotídicos que consisten en dichas mezclas de oligonucleótidos según una de las reivindicaciones 5 a 10, que comprenden unas secuencias incluidas en la secuencia SEC ID nº 6, como cebador 5', y SEC ID nº 7, como cebador 3', preferentemente unas secuencias que consisten en dichas secuencias SEC ID nº 6 y 7, y dichas secuencias complementarias, y
- b)
- se determina la presencia o la ausencia de la especie determinada de dicha bacteria comparando la secuencia de dicho fragmento obtenido con la secuencia de un fragmento del gen completo rpoB de dicha bacteria que comprende dichas secuencias nº 8 a 35 según una de las reivindicaciones 1 ó 2, y secuencias complementarias, y se determina así la presencia de dicha bacteria en la muestra si la secuencia del fragmento obtenida es idéntica a la secuencia conocida del género o del fragmento de gen rpoB de dicha bacteria.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Kit de diagnóstico útil en un procedimiento
según una de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado
porque comprende por lo menos dicho oligonucleótido, una mezcla de
oligonucleótidos, o un fragmento de gen según una de las
reivindicaciones 1 ó 2 y 4 a 10.
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