CN110317890A

CN110317890A - 一种用于粪肠球菌检测的试剂盒

Info

Publication number: CN110317890A
Application number: CN201910550679.4A
Authority: CN
Inventors: 孙泽玮; 陈文静; 郑良荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2019-10-11

Abstract

本发明提供一种用于粪肠球菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向粪肠球菌rpoB基因的向导RNA、扩增引物对、水化TwistAmp基础试剂盒反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针(ssDNA)、RNA酶抑制剂和缓冲液。使用该试剂盒进行粪肠球菌检测，检测的特异性高，可以将粪肠球菌与其他肠球菌，包括屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌区分开来。同时，使用本发明所述RNA序列进行检测，耗时在1小时左右，不需要PCR仪，对设备要求低，显著低于传统的细菌培养法或PCR测序法，临床实用价值大。

Description

一种用于粪肠球菌检测的试剂盒

技术领域

本发明属于致病菌检测领域，涉及一种用于粪肠球菌检测的试剂盒。利用此试剂盒可以进行粪肠球菌快速检测。

背景技术

粪肠球菌是人体感染的革兰阳性菌中常见菌群，给患者及社会带来巨大负担。传统的检测方法是进行细菌培养或PCR联合测序，但细菌培养需要5-7天的时间，而PCR常由于缺乏特异性引物，无法将粪肠球菌与其他肠球菌属细菌区分，故而需要联合一代测序才能鉴定，成本高，需要数天时间才能出结果。在这期间临床医师由于没有获得检测结果，只能凭经验用药，常常导致疾病治疗的延误。因而，如何快速检测粪肠球菌显得尤为重要。近期，张峰等人发现，LbCas12a蛋白可用于致病菌的检测，只需要1小时左右即可完成检测，省时省力，灵敏度高。具体的原理为，该系统包含LbCas12a蛋白、致病菌DNA、向导RNA、两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链DNA(ssDNA)。其中，致病菌DNA序列需要包含TTTN的PAM结构，同时该序列需要具备特异性，即区别于别的致病菌。而向导RNA序列为致病菌特异性靶向序列中TTTN后的一段序列，长度为20-24个碱基。在向导RNA引导下，LbCas12a蛋白可结合到致病菌特异性DNA序列上，随后，LbCas12a蛋白可表现出Dnase活性，从而切割两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链DNA，使得荧光基团和淬灭基团分离，出现荧光，从而指示致病菌的存在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于粪肠球菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向粪肠球菌rpoB基因的向导RNA、RPA扩增引物对、水化TwistAmp基础试剂盒(basic kit)反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针(ssDNA)、RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)和缓冲液。其中特异性靶向粪肠球菌rpoB基因的向导RNA，其核苷酸序列如SEQ No.1所示，能特异性靶向粪肠球菌，而不能靶向屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌，可用于粪肠球菌的检测。其中RPA扩增引物对RPA-F和RPA-R，序列如SEQ No.2和SEQ No.3所示。单链DNA探针的序列如SEQ No.6所示。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒进行粪肠球菌快速检测的方法，通过以下步骤实现：

具体步骤为：取1ml样品，95-98摄氏度加热5min，取1μl作为检测样品，加入14.75μl水化TwistAmp basic kit反应干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列为SEQNo.2)和RPA-R(序列为SEQ No.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μlbuffer2.1(NEB公司)，1000nM向导RNA(序列为SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM单链DNA探针(上海生工，序列为SEQ No.6)，加水补至25μl。37摄氏度反应25-45min，通过荧光显微镜下直接观察检测体系荧光变化，进行粪肠球菌检测；发黄绿色荧光说明有粪肠球菌污染，不发光说明没有粪肠球菌污染。本方法可以将粪肠球菌与其他肠球菌属细菌，包括屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌区分开来。

其中：

所述单链DNA探针ssDNA序列(SEQ No.6)为：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1，由上海生工合成。

使用本发明所述检测试剂盒进行粪肠球菌感染检测的优势在于：(1)与传统细菌培养或PCR联合一代测序法比较，传统方法需要数天时间，本方法只需要1小时即可完成检测。同时，本方法采用RPA法扩增，只要恒温水浴锅即可完成反应，不需要PCR仪，对设备要求低。(2)使用本发明所述检测试剂盒进行检测时，只有粪肠球菌呈阳性反应，而其他种类的肠球菌，包括常见的屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌均呈阴性反应。故而，本发明所述检测试剂盒具有高特异性。

附图说明

图1为粪肠球菌、屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌rpoB基因序列比对图。

图2为样品荧光显微镜下检测结果，从1号-4号管样品加入的是各肠球菌属细菌菌株，分别为粪肠球菌、屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌。其中1号管有黄绿色荧光，呈阳性反应。2-4号管无黄绿色荧光，呈阴性反应。

图3为使用PCR法扩增不同种属肠球菌，得到大小相似的条带，无法区分出粪肠球菌。

图4为使用基于本发明所述向导RNA的检测法与传统PCR联合测序法，实验耗时比较图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：肠球菌属细菌rpoB基因序列比对

如图1所示，在粪肠球菌rpoB基因序列中，本发明所述向导RNA序列(选中部分)的5’端为TTTN的PAM结构。该向导RNA序列在屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌中没有完全一致的序列，均有数个碱基的差异。且在屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌中的同源序列5’端均无TTTN的PAM结构，故而，使用本向导RNA，Cas12a蛋白无法靶向至屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌，因而，在检测时，只有粪肠球菌可呈现阳性反应，其余肠球菌属细菌呈阴性反应，可用于粪肠球菌的特异性检测。

实施例2：本发明所述向导RNA特异性判定，步骤如下：

(1)准备粪肠球菌、屎肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌标准菌株；

(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；

(3)准备反应体系，反应体系为25μl，包括1μl检测样品，14.75μl水化TwistAmp basickit反应干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列为SEQ No.2)和RPA-R(序列为SEQNo.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μl buffer2.1(NEB公司)，1000nM向导RNA(序列为SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM单链DNA探针(上海生工)，加水补至25μl；

(4)37摄氏度恒温反应30min；

(5)反应结束后，将PCR管置于荧光显微镜下直接观察，有荧光证明样品中存在粪肠球菌，没有荧光则表示无粪肠球菌污染。

检测结果如图2所示，样本1为粪肠球菌，观察到荧光，呈阳性反应。其余样本非粪肠球菌，无荧光，呈阴性反应。

实施例3:基于本发明所述向导RNA的检测法与传统PCR法特异性及实验耗时比较

1.基于本发明所述向导RNA的检测法，步骤如下：

(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；

(4)37摄氏度恒温反应30min；

(5)反应结束后，将PCR管置于荧光显微镜下直接观察，有荧光证明样品中存在粪肠球菌，没有荧光则表示无粪肠球菌污染；

(6)检测结果如图2所示，样本1为粪肠球菌，观察到荧光，呈阳性反应。其余样本非粪肠球菌，无荧光，呈阴性反应。

2.传统PCR法实验步骤如下：

(1)设计引物，PCR引物序列为RPA引物5’端起始的20个碱基，使获得的PCR产物与RPA产物序列相同，引物对序列见SEQ No.4和SEQ No.5；

(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；

(3)配置反应体系，包含12.5μl DNA聚合酶预混液(上海生工)，1μl正向引物，1μl反向引物，1μl待测样品，9.5μl水；

(4)PCR反应；

(5)琼脂糖凝胶电泳；

(6)实验结果如图3所示，所有的样本均扩增出195bp大小片段，无法区别粪肠球菌与其他种类肠球菌。

如上所述，PCR法无法区分肠球菌种类，故需要进行测序比对，实验成本高，用时长，可能延误病情。

如图4所示，使用基于本发明所述检测试剂盒的检测方法特异性高，耗时短，仅为1小时左右，而使用PCR法，由于不同种肠球菌序列高度同源，在一段序列中差异常常仅为数个碱基，设计的引物常常所有菌株都能扩增，所得产物大小接近，无法通过琼脂糖凝胶区分，故而需要进行测序，实验耗时在2天左右。本发明所述方法耗时显著低于PCR组。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于粪肠球菌检测的试剂盒

<130> 1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

gcaaacguug gucgcuacaa agu 23

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

cagaagaagg cttgaaagac atttatgaac g 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

gcgtttccgc taaggttaag tttaatagac g 31

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

cagaagaagg cttgaaagac at 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

gcgtttccgc taaggttaag t 21

<210> 6

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

ttatt 5

Claims

1.一种用于粪肠球菌检测的试剂盒，其特征在于，由特异性靶向粪肠球菌rpoB基因的向导RNA、扩增引物对、水化TwistAmp基础试剂盒反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针、RNA酶抑制剂和缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种用于粪肠球菌检测的试剂盒，其特征在于，其中特异性靶向粪肠球菌rpoB基因的向导RNA的核苷酸序列如SEQ No.1所示，RPA扩增引物对的序列如SEQ No.2和SEQ No.3所示。单链DNA探针的序列如SEQ No.6所示。

3.根据权利要求1所述的粪肠球菌检测的试剂盒进行粪肠球菌快速检测的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：取1ml样品，95-98摄氏度加热5min，取1μl作为检测样品，加入14.75μl水化TwistAmp基础试剂盒反应干燥球，0.9μl 10mM RPA-F和RPA-R，0.375μl RNA酶抑制剂，3.5μl buffer2.1，1000nM向导RNA，250nM LbCas12a，200nM单链DNA探针，加水补至25μl，37摄氏度反应25-45min，通过荧光显微镜下直接观察检测体系荧光变化，进行粪肠球菌检测，发黄绿色荧光说明有粪肠球菌污染，不发光说明没有粪肠球菌污染。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中RPA-F的序列如SEQ No.2所示，RPA-R序列如SEQ No.3所示，向导RNA序列如SEQ No.1所示。