DE19824317C2 - Methode zur Art-übergreifenden Unterscheidung zwischen mesophilen und psychrotoleranten Stämmen der Bacillus cereus Gruppe - Google Patents

Methode zur Art-übergreifenden Unterscheidung zwischen mesophilen und psychrotoleranten Stämmen der Bacillus cereus Gruppe

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Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Art-übergreifende Unterscheidung zwischen mesophilen und psychrotoleranten Stämmen der Bacillus cereus Gruppe.
Psychrotolerante Stämme der B. cereus Gruppe sind in der Lebensmittelindustrie als ernsthaftes Problem bekannt (Andersson and Granum, 1995). In Form von Endosporen überleben sie die Pasteurisierung und können selbst bei Kühllagerung auskeimen und sich vermehren. Ihre proteolytischen und lipolytischen Enzyme verderben das Lebensmittel (z. B. Geschmacksfehler und Süßgerinnung bei Frischmilch (Mikolajcik, 1978)) und begrenzen dessen Haltbarkeit. Toxinbildende psychrotolerante Stämme der B. cereus Gruppe sind wiederholt an von Durchfall und Erbrechen begleiteten Lebensmittelvergiftungen beteiligt (van Nettten et al., 1990; Cristiansson et al., 1989; Becker et al., 1994). Zwar kann man mit üblichen Verfahren der Qualitätskontrolle in pasteurisierten, kühlgelagerten Lebensmitteln wie Frischmilch B. cereus Gruppen Stämme nachweisen, um jedoch beurteilen zu können, ob der nachgewiesene Stamm psychrotolerant ist und damit eine Gefahr für das Lebensmittel darstellt, bedarf es bislang eines 14-tägigen Wachstumstest bei 7°C. In dieser Zeit hat sich der Stamm bereits im Lebensmittel vermehrt, führt zu fehlerhaften Chargen und gefährdet den Verbraucher. Um präventive Maßnahmen ergreifen zu können, bevor das Lebensmittel weiterverarbeitet wird oder zum Verbraucher gelangt, bedarf es einer schnellen Methode zur Differenzierung zwischen den bedeutungslosen mesophilen und den schädlichen psychrotoleranten Stämmen der B. cereus Gruppe. Die Anwendung dieser Methode in einer größeren Molkerei könnte die Auslieferung von Fehlchargen im Wert von 300000 DM pro Jahr vermeiden helfen und würde zudem Lebensmittelvergiftungen vorbeugen, die durch psychrotolerante Stämme der B. cereus Gruppe bedingt sind.
Stand der Technik
Die B. cereus Gruppe enthält die Arten B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis und B. anthracis. Physiologisch unterscheiden sich diese vier eng verwandten Arten in nur wenigen Merkmalen (Gordon et al., 1973; Priest et al., 1988; Turnball and Kramer, 1991). Die genetische Ähnlichkeit der Arten ist groß, wie DNA-DNA Hybridisierungsstudien (Kaneko et al., 1978; Somerville and Jones, 1972) zeigen. Ähnliche Ergebnisse liefert der Vergleich der 16S-rRNA, 23S-rRNA (Ash et al., 1991; Ash et al., 1992) oder der 16S-23S Spacer Region (Bourque et al., 1995). Vergleicht man die genomische Struktur und Organisation zwischen verschiedenen B. cereus und B. thuringiensis Stämmen, stellt man fest, daß die Diversität zwischen diesen Arten nicht größer ist, als die Diversität innerhalb dieser Arten. Dabei sind einige der B. cereus Stämme ähnlicher zu B. thuringiensis als zu anderen B. cereus Stämmen (Carlson and Kolstø, 1993). Mittels verschiedenen molekularen und chemischen Identifikationsmethoden wie arbitrary PCR (Henderson et al., 1995), Multilocus Enzym Elektrophorese (Carlson and Kolstø, 1993), Ribotyping (Carlson and Kolstø, 1996) und Kohlenhydratverwertung (Wunschel, et al., 1994) ist es möglich B. anthracis von den verbleibenden drei Arten abzugrenzen, die jedoch untereinander nur schwer differenzierbar sind. Ob die Mitglieder der B. cereus Gruppe als eine Art betrachtet werden sollten ist daher immer noch Gegenstand der Debatte.
Die klassische Einteilung der B. cereus Gruppe in die vier Arten wird überlagert durch eine weitere Einteilung in mesophile und psychrotolerante Stämme. Es ist bekannt, daß es mesophile und psychrotolerante (= psychrotrophe) Stämme der Arten B. cereus (Mikolajcik, 1978; Grosskopf and Harper, 1969) und B. mycoides (Ronimus et al., 1997) gibt, sowie mesophile B. thuringiensis (Nicholson, 1995). Ferner ist bekannt diese thermalen Typen aufgrund von Wachstumsversuche bei verschiedenen Temperaturen zu unterscheiden (Mikolajcik, 1978; Grosskopf and Harper, 1969). Nach Griffiths and Phillips (1990) können psychrotolerante B. cereus auch noch unter 6°C wachsen, mesophile B. cereus jedoch nicht. Dufrenne et al. (1995) geben 7°C als Grenztemperatur an.
Weiterhin sind PCR Nachweisverfahren für Toxingene von Stämmen der B. cereus Gruppen bekannt (Schraft and Griffiths, 1995; Wang et al., 1997, Granum et al., 1996; Agata et al., 1995; Damgard et al., 1996).
Ferner ist allgemein bekannt, wie man spezifische Sonden gegen Ziel-Nukleotidsequenzen erzeugt, wie man rRNA-Gene amplifiziert und rRNA-Stammbäume erstellt (Lane et al., 1991; Barry et al., 1990). In den Sequenzdatenbanken gibt es bereits einige 16S-rRNA Sequenzen von Stämmen der B. cereus Gruppe.
Bekannt ist ferner, daß zwischen dem G + C Gehalt der "Stems" der ribosomalen RNA und dem optimalen Wachstumsbereich von mesophilen Bakterien eine signifikante Korrelation besteht (Galtier and Lobry, 1997).
Es ist auch bekannt, daß man mit RAPD-PCR Techniken thermophile und mesophile Bacillus Stämmen nachweisen kann (Ronimus et al., 1997).
Mängel der bisher bekannten Ausführungen
Das einzige bislang praktizierte Verfahren zur Unterscheidung zwischen mesophilen und psychrotoleranten Stämmen der B. cereus Gruppe ist bislang der 14-tägige Wachstumstest bei niedrigen Temperaturen, z. B. bei 7°C (Grosskopf and Harper, 1969; Mikolajcik, 1978; Dufrenne et al., 1995). Für die Lebensmittelindustrie hat dieses Verfahren jedoch den gravierenden Nachteil, daß die Qualitätsinformation zum untersuchten Produkt erst nach dessen Weiterverarbeitung bzw. Verkauf vorliegt. Das verursacht hohe Kosten für fehlerhafte Chargen oder/und erhöht auf Verbraucherebene das Risiko von Lebensmittelvergiftungen durch psychrotolerante Stämme der B. cereus Gruppe.
Zwar ist es möglich mit RAPD-PCR Techniken thermophile und mesophile Bacillus Stämme nachzuweisen (Ronimus et al., 1997), und es wäre denkbar diese Methode für den Nachweis mesophiler und psychrotoleranter B. cereus Gruppen Stämme heranzuziehen. Die von Ronimus et al. (1997) beschriebenen RAPD Primer geben allerdings innerhalb der B. cereus Gruppe keine geeignete Auflösung für die Feindifferenzierung. Zudem hat die RAPD- Analyse in Hinblick auf die Aufgabenstellung, sehr schnell zwischen psychrotoleranten und mesophilen Stämmen der B. cereus Gruppe unterscheiden zu wollen, im Vergleich zur erfindungsgemäßen Methode gravierenden Nachteile: sie erfordert einen relativ hohen Zeitaufwand, eine hohe Arbeitsintensität und einen hohen Kapitaleinsatz. Darüber hinaus ist das Vorhandensein einer Referenzdatenbank Voraussetzung.
Die Bestimmung des GC Gehaltes der "Stems" der ribosomalen RNA nach Galtier and Lobry (1997) und die Korrelation dieser Daten mit der minimalen Wachstumstemperatur würde die Ermittlung der Sequenz der ribosomalen RNA erfordern und wäre daher besonders Arbeitsintensiv, Kostenintensiv und Zeitaufwendig. Eine schnelle und zugleich kostengünstige Unterscheidung zwischen psychrotoleranten und mesophilen Stämmen der B. cereus Gruppe ist auf diese Weise nicht möglich. Zudem liegen hier bislang keine Daten für die Stämme der B. cereus Gruppe vor.
Die Analyse von bereits sequenzierten Genen von Stämme der B. cereus Gruppe (u. a. Toxingene sowie 16S- und 23S-rRNA Gene) in Hinblick auf die Fragestellung psychrotolerante von mesophilen B. cereus Gruppen Stämmen zu unterscheiden ist bislang unmöglich, da aus den Sequenzdatenbankeinträgen der thermale Wachstumstyp nicht hervorgeht.
Die Aufzählung der Mängel der bisher bekannten Ausführungen macht plausibel, warum der Wachstumstest bei 7°C derzeit das einzige zuverlässige und kostengünstig anwendbare Verfahren ist, mit dem psychrotolerante und mesophile B. cereus Gruppen Stämme unterscheiden werden können. Aufgrund des hohen Zeitaufwandes ist der Wachstumstest jedoch für schnelle Entscheidungen, wie sie im Rahmen der Qualitätssicherung getroffen werden müssen, nicht geeignet.
Technisches Problem
Der im Patentanspruch aufgeführten Erfindung liegt das Problem zugrunde, den extrem hohen Zeitaufwand der bestehenden Methode zur Art-übergreifenden Unterscheidung zwischen psychrotoleranten und mesophilen Stämmen der B. cereus Gruppe signifikant zu verkürzen.
Mittel zur Lösung
Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch aufgeführten Merkmale gelöst.
Strategie zur Entwicklung der erfindungsgemäßen Methode
Es wurden zunächst Bereiche der rDNA, die potentiell zur Unterscheidung von mesophilen und psychrotoleranten Stämmen der B. cereus Gruppe geeignet sind gesucht. Dazu wurden in dieser Arbeit eine Reihe von rDNA Sequenzen von psychrotoleranten und mesophilen Stämme der B. cereus Gruppe ermittelt und mit dem Computerprogramm MacMolly Tetra (SoftGene) verglichen. Es wurden zwei 16S-rDNA Signaturen gefunden, die zur Unterscheidung der beiden thermalen Typen geeignet sind (vgl. Fig. 1). Zum Nachweis dieser Signaturen wurde ein PCR-Primersystem entwickelt, das im Ausführungsbeispiel beschrieben ist (vgl. Fig. 2). Aus diesen Arbeiten resultiert auch die zur Zeit der Patentanmeldung in Vorbereitung befindliche Publikation von Lechner et al. (1998), in der die Einführung der neuen psychrotoleranten Art B. weihenstephanensis vorgeschlagen wird, die alle psychrotoleranten Stämme der Art B. cereus umfassen soll.
Ausführungsbeispiel
Die Detektion der Signaturbasen nach dem Patentanspruch kann auf Grundlage von Hybridisierungstechniken (Ausubel et al., 1987) oder selektiver PCR erfolgen. Es folgt ein Beispiel für die vorteilhafteste Ausführung.
Detektion der rDNA Signaturen mittels selektiver duplex PCR Prinzip
Eine mögliche Vorgehensweise für die PCR zeigt Fig. 2. Mesophile Stämme der B. cereus Gruppe können am Vorhandensein einer mesophilen Signatur 1 nachgewiesen werden (mS1), psychrotolerante am Vorhandensein einer psychrotoleranten Signatur 2 (pS2). Beim Vorhandensein der Mesophiliesignatur mS1 bindet der spezifische Vorwärtsprimer VmS1 an die DNA und amplifiziert mit dem zugehörigen universellen Rückwärtsprimer Ru1 ein 250 bp Fragment. Bei Vorhandensein der Psychrotoleranzsignatur pS2 bindet der spezifische Rückwärtsprimer RpS2 und amplifiziert mit dem zugehörigen universellen Vorwärtsprimer Vu2 ein 130 Bp Fragment. Mittels Agarosegelelektrophorese kann die entstandene Fragmentgröße durch Vergleich mit einem Standard (z. B. 100 Basenpaarleiter) ermittelt werden. Liegt ein 130 bp Fragment vor, ist der Stamm psychrotolerant, liegt ein 250 bp Fragment vor, ist der Stamm mesophil.
DNA-Template
Der zu untersuchende Stamm wurde über Nacht bei 30°C auf Platte oder in Flüssigkultur gezogen. Etwa 0.5 µl Zellmaterial wurden direkt zum PCR-Ansatz gegeben. In manchen Fällen verbesserte eine vorausgehende osmotische Lyse der Zellen die Amplifikation. Dazu wurde eine Bakterienkolonie oder 50 µl Flüssigkultur in 100 µl eiskaltem Reinstwasser (Milli-Q) suspendiert. Die Suspension wurde für mindestens eine Stunde bei 0°C gehalten oder drei mal eingefroren und aufgetaut. Das erhaltene Lysat konnte bei -20°C aufbewahrt werden.
Es ist auch möglich, die Bacillus cereus Gruppen Stämme direkt aus dem Lebensmittel zu isolieren, z. B. durch Abzentrifugieren der Sporen aus Milch. Die Sporen können durch Keimung, mechanisch, chemisch oder enzymatisch geöffnet werden, um die DNA freizusetzen (Reif et al., 1994; Herman et al., 1995). Das hat den Vorteil, daß die Zeit von der Probenahme bis zur PCR auf weniger als eine Stunde reduziert werden kann (beim Abzentrifugieren der Sporen aus Milch erhält man auch Clostridium Sporen, die das beschriebene PCR System aufgrund seiner Spezifität Clostridium rDNA jedoch nicht nachweist).
Ausführung der PCR
Die linke Hälfte von Fig. 2 veranschaulicht die Ausführung der PCR. Die PCR wurde in einem Techne Progene Thermocycler durchgeführt. Das Programm bestand aus den Schritten: Anfangsdenaturierung (94°C; 2'), gefolgt von 27 Zyklen mit Denaturierung (94°C; 15"), Annealing (55°C; 15") und Extension (72°C; 15"), gefolgt von einer abschließenden Extension (72°C; 2'). Ein Zweikomponenten-Mastermix wurde für 1000 Hot-Start-Ansätze hergestellt. Komponente "Kalt" bestand aus 21 ml Reinstwasser (Milli-Q), 3 ml 10-fach Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 9,0; 15 mM MgCl2; 500 mM KCl; 1,0% Gelatine), 2 ml 5 mM dNTP-Mix (Eurogentec) und 25 µmol von jedem Primer. Die Primersequenzen waren VmS1: 5' ATA ACA TTT TGA ACC GCA TG Ru1: 5' CTT CAT CAC TCA CGC GGC; RpS2: 5' GAG AAG CTC TAT CTC TAG A, und Vu2: 5' CAA GGC TGA AAC TCA AAG GA (selektive Signaturbasen unterstrichen). Komponente "Heiß" bestand aus 6 ml Reinstwasser (Milli Q), 1,5 ml 10-fach Puffer (s. o.), 0,4 ml Polymerase Dilution Buffer (Eurogentec) und 0,1 ml Taq-Polymerase (5 Uµl-1, Silverstar, Eurogentec), 5 ml 20% (w/v) Ficoll 400 (Pharmacia Biotech)-Lösung, und 3 ml Kresolrotlösung (1,5 mg/ml). Mix "Heiß" und "Kalt" wurden portioniert bei -20°C aufbewahrt. Pro Reaktion wurden 25 µl Mix "Kalt" und 8 µl Template (s. o.) angesetzt. Nach der Anfangsdenaturierung und Abkühlung auf 80°C wurden 15 µl Mix "Heiß" eingespritzt. Darauf folgten die 27 Zyklen.
Insbesondere in Verbindung mit der DNA-Template Gewinnung durch Zentrifugation direkt aus dem Lebensmittel (z. B. Milch) besteht eine weiterführende Möglichkeit darin, die PCR quantitativ auszugestalten, um eine Aussage über den Sporengehalt des Lebensmittels treffen zu können.
Agarosegelelektrophorese
Acht µl des PCR-Produktes wurden direkt in die Geltaschen eines 2% Agarosegels transferiert. Aufgrund des Ficoll 400 Zusatzes war kein Gelladepuffer notwendig. Nach der anschließenden Elektrophorese wurden die DNA-Fragmente Ethidiumbromid gefärbt und mit einem Pharmcia Image Master (Pharmacia Biotech) fotografiert. Die rechte Hälfte von Fig. 2 zeigt ein Agarosegel mit PCR-Produkten von einem psychrotoleranten (links) und einem mesophilen Stamm (rechts). Fig. 3 zeigt ein Beispielgel, nach dem B. cereus Gruppen Isolate verschiedener Herkunft in mesophile und psychrotolerante Stämme unterteilt werden können.
Bestätigende Wachstumsversuche
Zur Ermittlung der Zuverlässigkeit des PCR-Nachweises dienten Wachstumsversuche bei 7°C und 30°C. Das Kulturmedium war PC-Bouillon, bestehend aus 5,0 gl-1 Caseinpepton, 2,5 gl-1 Hefeextrakt und 1,0 gl-1 Glucose, gelöst in entionisiertem Wasser, pH 7,0. Fünf ml PC-Bouillon wurden mit 10 µl Übernachtkultur inokuliert und mit 120 upm bei der entsprechenden Temperatur geschüttelt. Wuchs ein Stamm nur bei 30°C, wurde er als mesophil eingestuft, wuchs er zusätzlich auch bei 7°C wurde er als psychrotolerant eingestuft.
Zuverlässigkeit des PCR-Nachweises
196 Stämme der B. cereus Gruppe wurden aus Lebensmitteln und Bodenproben unterschiedlicher Herkunft isoliert (einen Überblick gibt Tabelle 1) und sowohl einem Wachstumstest bei 7°C unterzogen als auch mit dem beschriebenen PCR-Nachweis untersucht. Die Ergebnisse von PCR-Nachweisen und Wachstumsversuchen stimmten zu 100% überein.
Zeitaufwand
Der Zeitaufwand für die PCR und die Analyse der PCR-Produkte beträgt je nach Ast der Ausführung von 15 Minuten (z. B. bei Einsatz eines LightCyclers von Roche) bis zu 1,5 Stunden. (hier beschriebe Ausführung). Hinzu kommt der Zeitaufwand für die Bereitstellung des DNA-Templates, der je nach Art der Ausführung zwischen 45 Minuten (Zentrifugation und mechanischer Sporenaufbruch) bis zu 12 Stunden (hier beschriebene Ausführung) liegt.
Der Gesamtzeitaufwand von der Probenahme bis zum Analyseergebnis liegt somit je nach Art der Ausführung zwischen einer Stunde und 14 Stunden.
Erreichte Vorteile
Die erfindungsgemäße Methode zur Art-übergreifenden Unterscheidung zwischen mesophilen und psychrotoleranten Stämmen der B. cereus Gruppe bringt im Vergleich zum bisherigen 14-tägigen Wachstumstest bei 7°C eine Reihe wesentliche Verbesserungen, die infolge erläutert werden.
Bei der erfindungsgemäßen Methode liegt die Zeitspanne zwischen der Probenahme vom Lebensmittel und dem Analyseergebnis im Bereich von in der Lebensmittelindustrie üblichen Prozeßzeiten. Somit liegt die Qualitätsinformation zum untersuchten Lebensmittel bereits vor oder während dessen Weiterverarbeitung vor. Dadurch ist es möglich hohe Kosten, die durch die Produktion fehlerhafter Chargen entstehen, zu vermeiden. Die Kosten einer Charge eines Lebensmittels können in der Größenordnung von 30000 DM liegen.
Eine besonders vorteilhafte Anwendung des Ausführungsbeispieles wäre, die Qualität der Anlieferungsmilch bereits auf Stufe der Tanksammelwagen zu untersuchen, um die Verwertungsrichtung der Milch auf Grundlage ihres Gehaltes an psychrotoleranten Stämmen der B. cereus Gruppe bestimmen zu können. Befindet sich beispielsweise in einem der Tanksammelwagen Milch mit einem hohen Gehalt an psychrotoleranten B. cereus, so kann man sie der Verwertungsrichtung UHT-Milch zuführen, da bei der Ultrahocherhitzung die Sporen abgetötet werden. Milch mit besonders wenig psychrotoleranten B. cereus würde der Verwertungsrichtung Frischmilch zugeführt, bei der die Sporen nicht abgetötet werden.
Ein Vorteil bei der Herstellung von pasteurisierten Milch wäre, daß die bisher üblichen Rückstellproben zur ex-post Überprüfung der Mindesthaltbarkeit von einer prozeßbegleitenden Analyse abgelöst werden könnten, deren Ergebnis zur ex-ante Prognose des Mindesthaltbarkeitsdatums herangezogen werden kann. Bei Rohmilchargen hoher Qualität kann somit eine wesentlich höhere Mindesthaltbarkeit angegeben werden, was dem Hersteller Wettbewerbsvorteile liefert. Andererseits können auch qualitativ minderwertige Chargen erkannt werden, und mit einer kürzeren Mindesthaltbarkeit gekennzeichnet werden.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Methode ist, die Anlieferungsmilch bereits auf Erzeugerebene rasch und kostengünstig auf den Gehalt an psychrotoleranten Stämmen der B. cereus Gruppe untersuchen zu können. Dieser wichtige Qualitätsparameter könnte dann bei der Milchgeldauszahlung berücksichtigt werden.
Tabelle 1
Herkunft und Anzahl der überprüften Bacillus cereus Gruppen Stämme
A American Type Culture Collection, Rockville, USA;
B Bundesanstalt für Milchforschung, Institut für Hygiene, Kiel, FRG;
D Damgaard et al., 1996;
F Felix d'Hérelle, Reference Centre for Bacterial Viruses, Univ. LAVAL, Québec, Canada;
G German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, FRG;
H Wiebe und Hammer, Deutsche Bundesanstalt für Milchforschung, Kiel, 1997;
I von Stetten, diese Studie;
L Lonc 1997;
M Mayr, diese Studie;
N National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK;
V Granum, P., Norwegian College of Veterinary Medicine, Oslo, Norway.
W Weihenstephan Bacillus Collection of the Institut für Mikrobiologie, Forschungszentrum für Milch und Lebensmittel, Tech. Univers. Munich, Freising-Weihenstephan, FRG.
Zitierte Literatur
Agata, N., Mori, M., Ohta, M., Suwan, S., Ohtani I. and Isobe, M. (1994) A novel dodecadepsipeptide, cereulide, isolated from Bacillus cereus causes vacuole formation in Hep-2 cells. FEMS Microbiol Lett 121: 31-34.
Andersson, A., Rönner, U. and Granum, P. E. (1995) What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? Int J Food Microbiol 28: 145-155.
Ash, C. and Collins, M. D. (1992) Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus anthracis and emetic Bacillus cereus determined by PCR-direct sequencing. FEMS Microbiol Lett 94: 75-80.
Ash, C., Farrow, J. A. E., Dorsch, M., Stackebrandt, E. and Collins, M. D. (1991) Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rDNA. Int J Syst Bacteriol 41: 343-346.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidmann, J. G., Smith, J. A. and Struhls, K. (Eds.) (1987) Current protocols in Molecular Biology. Wiley, New York.
Barry, T. G. et al. (1990) EP 0395292.
Becker, H., Schaller, G., von Wiese, W. and Terplan, G. (1994). Bacillus cereus in infant foods and dried milk products. Int J Food Microbiol 23: 1-15.
Bourque, S. N., Valero, J. R., Lavoie, M. C. and Levesque, R. C. (1995) Comparative analysis of the 16S to 23S ribosomal intergenic spacer sequences of Bacillus thuringiensis strains and subspecies and of closely related species. Appl Environ Microbiol 61: 1623-1626.
Carlson, C. R., Cougant, D. A. and Kolstø, A.-B. (1994) Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains. Appl Environ Microbiol 60: 1719-1725.
Carlson, C. R., Johansen, R. and Kolstø, A.-B. (1996) The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMS Microbiol Lett 141: 163-167.
Cristiansson, A., Satyanarayan, N., Nilsson, I., Wadström, T. and Pettersson, H.-E. (1989) Toxin production by Bacillus cereus dairy isolates in milk at low temperatures. Appl Environ Microbiol 55: 2595-2600.
Damgaard, P. H., Jacobsen, C. S. and Soerensen, J. (1996) Development and application of a primer set for specific detection of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in soil using magnetic capture hybridization and PCR amplification. System Appl Microbiol 19: 436-441.
Dufrenne, J., Bijwaard, M., te Giffel, M., Beumer, R., Notermans, S. (1995) Characteristics of some psychrotrophic Bacillus cereus isolates. Int J Food Microbiol 27: 175-183.
Foegeding, P. M. and Berry, E. D. (1997) Cold Temperature Growth of Clinical and Food Isolates of B. cereus. J Food Protect 60: 1256-1258.
Galtier, N., Lobry, J. R. (1997) Relationships between genomic G + C content, RNA secondary structures, and optimal growth temperature in prokaryotes. J Mol Evol 44: 632-­ 636.
Gordon, R. E., Haynes, W. C., and Pankg, C. H. N. (1973) The genus Bacillus. U.S. Department of Agriculture, Washington, D.C.
Granum, P. E., Andersson, A., Gayther, C., te Giffel, M., Larsen, H., Lund, T. and O'Sullivan, K. (1996) Evidence for a further enterotoxin complex produced by Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett 141: 145-149.
Griffiths, M. W. and Phillips, D. J. (1990) Incidence, source and some properties of psychrotrophic Bacillus spp found in raw and pasteurized milk. J Soc Dairy Technol 43: 62-­ 66.
Grosskopf, J. C. and Harper, W. (1969) Role of psychrotrophic sporeformers in long life milk. J Dairy Sci 52: 897.
Henderson, I., Duggleby, C. J. and Turnbull, P. C. B (1994) Differentiation of Bacillus anthracis from other Bacillus cereus group bacteria with the PCR. Int J Syst Bacteriol 44: 99-­ 105.
Herman, L., de Block, J. H. G. E. and Waes, G. M. A. V. J. (1995) A direct PCR detection method for Clostridium tyrobutyricum in up to 100 milliliters of raw milk. Appl Environ Microbiol 61: 4141.4146.
Kaneko, T., Nozaki, R. and Aizawa, K. (1978). Deoxyribonucleic acid relatedness between Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis. Microbiol Immunol 22: 639-­ 641.
Lane, D. et al. (1991) EP 0431149.
Lechner, S., Mayr, R., Francis, K. P., Prüß, B. M., Kaplan, T., Wiesner-Gunkel, E., Stewart, G. S. A. B. and Scherer, S. (1998) Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Int J Syst Bacteriol 48: 1373-1382.
Lonc, E., Lecadet, M.-M., Lachowicz, T. M. and Panek. E. (1997) Description of Bacillus thuringiensis wratislaviensis (H-47), a new serotype originating from Wroclaw (Poland), and other Bt soil isolates from the same area. Lett Appl Microbiol 24: 467-473.
Stewart, G. S. A. B. and Scherer, S. (1998) Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Int J Syst Bacteriol 48: 1373-1382.
Mikolajcik, E. M. (1978) Psychrotrophic sporeformers - A possible keeping-quality problem in market milk. American Dairy Rev 40: 34A-34D.
Nicholson, W. L. (1995) Photoreactivation in the genus Bacillus. Curr Microbiol 31: 361-­ 364.
Priest, F. G., Goodfellow, M. and Todd, C. (1988) A numerical classification of the genus Bacillus. J Gen Microbiol. 134: 1847-1882.
Reif, T. C., Malcolm, J., Pillai, S. D. and Mitchell, C. (1994) Identification of capsule- forming Bacillus anthracis spores with the PCR and a novel dual-probe hybridization format. Appl Environ Microbiol 60: 1622-1625.
Ronimus, R. S., Parker L. E., Morgan, H. W. (1997) The utilization of RAPD-PCR for identifying thermophilic and mesophilic Bacillus species. FEMS Microbiol Lett 147: 75-79.
Ronimus, R. S., Parker, L. E. and Morgan, H. W. (1997) The utilization of RAPD-PCR for identifying thermophilic and mesophilic Bacillus species. FEMS Microbiol Lett 147: 75-79.
Schraft, H. and Griffiths, M. W. (1995) Special oligonucleotide primers for the detection of lecithinase positive Bacillus spp. by PCR. Appl Environ Microbiol 61: 98-102.
Somerville, H. J. and Jones, M. L. (1972). DNA competition experiments within the Bacillus cereus group of bacilli. J Gen Microbiol 73: 257-261.
Turnball, P. C. B. and Kramer, J. M. (1991) Bacillus. In: Manual of Clinical Microbiology, 5th
edn, pp. 296-303. Balows, A., Hausler, Jr, W. J., Herrmann, K. L., Isenberg, H. D. and Shadomy, H. J. (Eds.) Washington, DC: American Society for Microbiology.
von Netten, P., von de Moosdijk, A., von Hoensel, P., Mossel, D. A. A. and Perales. I. (1990) Psychrotolerant strains of Bacillus cereus producing enterotoxin. J Appl Bacteriol 69: 73-79.
Wang, R.-F., Cao, W.-W. and Cerniglia, C. E. (1997) A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods. J Appl Microbiol 83: 727-736.
Wunschel, D., Fox, K. F., Black, G. E. and Fox, A. (1994) Discrimination among the Bacillus cereus group; in comparison to B. subtilis, by structural carbohydrate profiles and ribosomal RNA spacer region PCR. Syst Appl Microbiol 17: 625-635.
3. Eingabe Sequenzprotokoll.ST25.txt
SEQUENCE LISTING

Claims (1)

  1. Methode zur Art-übergreifenden Unterscheidung zwischen mesophilen und psychrotoleranten Stämmen der Arten B. cereus, B. weihenstephanensis, B. thuringiensis und B. mycoides (Bacillus cereus Gruppe),
    dadurch gekennzeichnet,
    daß mindestens einer der folgenden 16S-rDNA oder 16S-rRNA Signaturen oder Teile davon nachgewiesen werden (die Signaturen sind durch die nach E. coli nummerierten, unterstrichen dargestellten Signaturbasen gekennzeichnet).
    • a) Signaturen bei einem mesophilen Stamm (Wachstum von über 7°C bis 46°C):
      Signatur mS1 in Sequenz 1 des Sequenzprotokolls
      Signatur mS2 in Sequenz 2 des Sequenzprotokolls
    • b) Signatur bei einem psychrotoleranten Stamm (Wachstum von unter 7°C bis 38°C):
      Signatur pS2 in Sequenz 3 des Sequenzprotokolls
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69022180T2 (de) * 1989-05-31 1996-02-01 Amoco Corp Universelle nukleinsäuresonden für eubakterien sowie methoden.
DE69030131T2 (de) * 1989-04-20 1997-07-17 Thomas Gerard Barry Erzeugung von spezifischen Sonden gegen Ziel-Nukleotidsequenzen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69030131T2 (de) * 1989-04-20 1997-07-17 Thomas Gerard Barry Erzeugung von spezifischen Sonden gegen Ziel-Nukleotidsequenzen
DE69022180T2 (de) * 1989-05-31 1996-02-01 Amoco Corp Universelle nukleinsäuresonden für eubakterien sowie methoden.

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Datenbank BIOSIS bei STN, AN 1984: 169595 BIOSIS zu Aerobic mesophilic and psychrotrophic spore forming bacteria in buffaloe milk. Shehata A.E. et al., J. DAIRY SCI, (1983) 66(6), 1228-1231 *
Datenbank CA bei STN, AN 130: 165238 CA zu: Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Lechner, S. et al., Int. J.Syst. Bacteriol.(1998) 48(4), 1373-1382 *
Datenbank CAPLUS bei STN, AN 1995: 349656 CAPLUS zu: Effect of pH on Bacillus thermoamylovorans growth and glucose fermentation. Combet-Blanc, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. (1995), 61(2), 656-9 *
Datenbank CAPLUS bei STN, AN 1996: 580428 CAPLUS zu: Rapid and precise Characterization of PCR products from Bacilli using electrospray ionization FTICR mass spectrometry. Muddiman, D.C. *
Datenbank GenBank bei STN, LOCUS (LOC): LAKRRNA GenBank (R) zu: GenBank ACC. NO. (GBN): L27478 *

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