KR20200071450A - 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법 - Google Patents

핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200071450A
KR20200071450A KR1020180159198A KR20180159198A KR20200071450A KR 20200071450 A KR20200071450 A KR 20200071450A KR 1020180159198 A KR1020180159198 A KR 1020180159198A KR 20180159198 A KR20180159198 A KR 20180159198A KR 20200071450 A KR20200071450 A KR 20200071450A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
composition
peg
pcr
extraction
Prior art date
Application number
KR1020180159198A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102200041B1 (ko
Inventor
민준홍
백창윤
유현진
김예지
Original Assignee
중앙대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 중앙대학교 산학협력단 filed Critical 중앙대학교 산학협력단
Priority to KR1020180159198A priority Critical patent/KR102200041B1/ko
Publication of KR20200071450A publication Critical patent/KR20200071450A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102200041B1 publication Critical patent/KR102200041B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법에 관한 것으로, 생물학적 시료에 포함된 불순물을 효과적으로 정제할 수 있고, 동시에 생물학적 시료에 포함된 감염균 등의 핵산의 증폭이 가능하므로, 간편하고 단순한 공정으로 생물학적 시료에 존재하는 감염균 등의 핵산의 검출에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법{Composition for Nucleic Acid Purification and Extraction and Nucleic Acid Detection Kit and Method using the same}
본 발명은 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법에 관한 것이다.
현재 감염균 분석에 이용되는 의료 시료는 대부분 전혈(whole blood)과 같은 혈액이다. 혈액은 감염균뿐만 아니라 백여가지의 건강 수치를 제공하는 중요한 시료이기도 하다. 혈액 시료는 혈구, 혈장 단백질 등 많은 요소들로 구성되어 있으며, 그 중에서 감염균은 약 백만분의 일, 혹은 십억분의 일 이하로 존재한다. 그렇기 때문에 미량의 타겟을 정확하게 검출하는 것에 한계가 있다. 핵산을 기반으로 한 분자 진단 방법은 민감도와 정확도면에서 뛰어나지만, 혈액에는 헤모글로빈, 락토페린, 면역글로불린과 같이 분자 진단의 후속 공정 즉 PCR을 방해하는 인자들이 있어 어려움이 있다.
혈액에 존재하는 감염균을 검측하는 방법은 크게 두 가지로 나누어진다. 1) 혈액 내 감염균의 핵산을 추출하는 것, 2) 그 핵산을 증폭하여 확인하는 것이다. 먼저 혈액 내 감염균의 핵산을 추출하는 가장 보편적인 방법은 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 사용하여 세포를 용해시키고, 단백질 및 불순물을 제거하는 것이다. 이 방법은 후속 공정에 영향을 미치지 않도록 정제된 핵산을 제공하나, 사용한 염을 제거하기 위한 워싱(washing) 과정이 필요하기 때문에 공정이 복잡하고 숙련된 전문가가 필요하다. 이후, 추출된 핵산을 중합효소에 의해 증폭하여 정성, 정량 분석을 진행하게 된다.
앞서 설명한 방법은 복잡하고 정교하게 다루어져야 하기 때문에 장소와 시간의 제약을 받는다. 그러나 혈액은 대부분의 의료 정보를 대변하는 가장 중요한 시료이기 때문에, 이를 해결하기 위한 소형화된 장비와 단순해진 공정의 개발로 많은 현장형 장비가 개발되고 있다. 그 중 다이렉트 버퍼(direct buffer)는 화학 물질을 이용하여 혈액 내 감염균의 핵산을 추출하고 불순물을 어느 정도 정제해 주는 시약이다. 다이렉트 버퍼는 보통 계면활성제(detergents)와 이온을 포함하는 시약으로 구성되며, 사용하기에 간단하지만 완벽하게 불순물을 제거하지 못하기 때문에 민감한 증폭 반응 환경을 요구하는 조건에서는(예를 들어, RNA 증폭 반응, 등온 증폭 반응 등) 핵산을 검출하기에 한계가 있다.
이에, 본 발명자는 간편하고 단순한 공정으로 생물학적 시료에서 감염균을 검출할 수 있는 방법을 발굴하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2009-0107927호
본 발명의 하나의 목적은 핵산 정제 및 추출용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 수산화기(-OH)를 포함하는 염기성 화합물을 포함하고, 상기 정제는 가열 조건에서 이루어지는 것인 핵산 정제 및 추출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물을 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물을 생물학적 시료와 혼합하는 단계; 생물학적 시료를 70℃에서 5 내지 10분 동안 가열하는 단계; 및 생물학적 시료에서 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 핵산 정제 및 추출용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 수산화기(-OH)를 포함하는 염기성 화합물을 포함하고, 상기 정제는 가열 조건에서 이루어지는 것인 핵산 정제 및 추출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 시료에 포함된 불순물 제거 및 감염균으로부터 핵산을 추출하는데 사용할 수 있으므로, 시료에 존재하는 감염균의 핵산 증폭 효율이 우수하여 감염균의 검출을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "핵산 정제"는 증폭 대상 핵산 외에 시료(예를 들어, 전혈)에 포함되어 있는 불순물(예를 들어, 적혈구 및 백혈구 등)을 침전 등에 의하여 제거하는 것을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "핵산 추출"은 시료에 포함되어 있는 증폭 대상 핵산을 감염균 등으로부터 증폭이 용이하도록 분리하는 것을 말하며, 이는 세포의 용해, 및 단백질 등 불순물의 제거에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "다이렉트 버퍼(direct buffer)"는 시료(예를 들어, 전혈) 내 증폭 대상 핵산(예를 들어, 감염균의 RNA)을 추출하고 시료에 포함된 불순물을 정제하여, 별도의 워싱 단계 없이 핵산을 증폭하기 위해 사용할 수 있는 시약을 말한다.
본 발명의 "수산화기(-OH)를 포함하는 염기성 화합물"은 무기 알칼리 수산화 화합물 또는 암모늄 수산화 화합물일 수 있다. 예를 들어, 칼륨(K), 나트륨(Na) 등의 알칼리 금속, 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca) 등의 알칼리 토금속, 또는 암모늄(NH4+)과 형성된 수산화 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 수산화나트륨(NaOH)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 PEG(polyethylene glycol) 200, PEG 8000, 또는 PEG 200과 PEG 8000의 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물은 PEG 200 및/또는 PEG 8000를 더 포함함으로써, 핵산의 증폭 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 0 내지 1.25부피%의 PEG 200; 0 내지 10부피%의 PEG 8000; 및 10 내지 80mM의 NaOH를 포함하는 것일 수 있다.
0 내지 1.25부피%의 PEG 200; 0 내지 10부피%의 PEG 8000; 및 10 내지 80mM의 NaOH의 조성비를 갖는 다이렉트 버퍼의 핵산 회수율이 우수하며, 특히, 1.25부피%의 PEG 200; 10부피%의 PEG 8000; 및 50mM의 NaOH의 조성비를 갖는 다이렉트 버퍼의 핵산 회수율이 가장 우수하므로, 생물학적 시료로부터 감염균의 신속하고 간단한 검출을 위한 키트에 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 핵산은 생물학적 시료에 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 플라즈마 및 변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 핵산 정제 및 추출용 조성물은 전혈 등 생물학적 시료에 포함된 불순물을 별도의 워싱 과정 없이 제거할 수 있으므로, 본 발명의 핵산 정제 및 추출용 조성물을 사용함으로써, 비전문가도 단순한 공정으로 생물학적 시료로부터 감염균을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 가열은 40 내지 70℃에서 1 내지 10분 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물만을 사용하거나, 본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물을 사용하지 않고 가열만을 한 경우에는 정제가 충분히 이루어지지 않으므로, 핵산의 증폭 효율이 감소할 수 있다. 반면, 생물학적 시료와 본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물를 혼합한 후, 40 내지 70℃에서 1 내지 10분간 가열함으로써, 생물학적 시료에 포함된 불순물의 정제 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 1분 미만으로 가열할 경우, 불순물의 정제가 충분하지 않다. 한편, 10분 초과로 가열하더라도, 증폭 효율에 미치는 영향이 미미하므로 가열에 따른 효율이 낮다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물을 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 핵산 검출용 키트는 본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물 외에, 당업계에서 핵산의 증폭반응에 일반적으로 사용하는 프라이머 세트 및 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 비드-비팅부를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "비드-비팅"은 시료 중의 고체 물질을 물리적인 힘으로 파쇄하는 방법으로써, 비드가 포함된 시료 용액을 손으로 흔들거나 자동진동기를 이용하여 수행될 수 있으나, 자동진동기를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다. 상기 "비드"의 소재는 제한이 없으나, 바람직하게는 마이크로 유리 비드일 수 있다.
본 발명의 키트는 미세유체 칩의 형태로 제작될 수 있으며, 구체적으로, 미세유체 챔버 부분, 시료 준비 챔버 부분, 및 증폭 및 검출 챔버 부분의 세 부분으로 구성될 수 있다. 한편, 미세유체 챔버 부분은 시료가 채워지는 시료 입력 부분 및 처리된 시료와 다이렉트 버퍼가 시료 준비 챔버에서 증폭 및 검출 챔버로 옮겨지는 미세유체 채널로 구성될 수 있다. 시료 준비 챔버는 본 발명의 다이렉트 버퍼와 비드 및 마그네틱바를 포함하며, 비드-비팅이 수행되는 비드-비팅부에 해당한다. 증폭 및 검출 챔버 부분은 핵산 증폭에 사용되는 시약을 포함한다.
또한, 본 발명의 키트에 생물학적 시료를 넣어주면 기기의 모터부분이 작동해 비드의 회전이 이루어지고 이로 인해 핵산 추출공정이 진행될 수 있다, 이때, 다이렉트 버퍼와 시료가 혼합된 후, 키트의 히터가 작동하여 불순물 정제가 이루어지고, 증폭 및 검출 챔버 부분으로 시료가 이동된 후, 핵산의 증폭이 이루어질 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산은 형광기기 등을 이용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 핵산 정제 및 추출용 조성물을 생물학적 시료와 혼합하는 단계; 생물학적 시료를 40 내지 70℃에서 1 내지 10분 동안 가열하는 단계; 및 생물학적 시료에서 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 생물학적 시료의 전처리부터 감염균의 핵산 증폭까지 한번에 수행할 수 있으므로, 생물학적 시료에 존재하는 감염균을 신속하고 간단하게 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 핵산은 감염균 유래 핵산일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 감염균은 박테리아 또는 바이러스일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 뎅기바이러스 또는 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)일 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 102pfu/100㎕ 수준의 아데노바이러스, 103pfu/㎖ 수준의 뎅기바이러스 및 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)의 간편하고 신속한 검출이 가능하므로, 현장에서도 고민감도로 감염균의 검출이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 살모넬라균(Salmonella typhimurium)일 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 103pfu/㎖ 수준의 대장균 및 105cfu/ml 수준의 살모넬라균의 간편하고 신속한 검출이 가능하므로, 현장에서도 고민감도로 감염균의 검출이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 뎅기바이러스는 뎅기바이러스 혈청형 1, 뎅기바이러스 혈청형 2, 뎅기바이러스 혈청형 3 및 뎅기바이러스 혈청형 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뎅기바이러스 혈청형일 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 뎅기바이러스의 혈청형 1, 2, 3 및 4의 구별이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 검출은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR) 또는 고리매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification: LAMP)일 수 있다.
본 발명의 핵산을 검출하는 단계는 PCR 방법으로 수행될 수 있다. 이 경우, 핵산의 검출을 위하여 프라이머 세트, 및 당업계에서 PCR 반응에 일반적으로 사용하는 시약, 예를 들어, dNTP 및 Taq, Q5 등의 중합효소 등을 사용하여 핵산 증폭 반응이 수행될 수 있다.
본 발명의 핵산을 검출하는 단계는 LAMP 방법으로 수행될 수 있다. 이 경우, 핵산의 검출을 위하여 고리매개등온 증폭 프라이머 세트, 및 당업계에서 LAMP 반응에 일반적으로 사용하는 시약, 예를 들어, Isothermal Amplification Buffer II, MgSO4, dNTP Mix, Bst 중합효소 및 AMV Reverse Transcriptase 등을 사용하여 핵산 증폭 반응이 수행될 수 있다.
핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법에 따르면, 생물학적 시료에 포함된 불순물을 효과적으로 정제할 수 있고, 동시에 생물학적 시료에 포함된 감염균 등의 핵산의 증폭이 가능하므로, 간편하고 단순한 공정으로 생물학적 시료에 존재하는 감염균 등의 핵산의 검출에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 전혈로부터 뎅기바이러스의 검출을 위한 미세유체 칩을 나타낸 도면이다.
도 2는 전혈로부터 바이러스 RNA의 검출 공정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 미세유체 칩을 사용하여 뎅기바이러스를 검출하는 공정을 나타낸 사진이다.
도 4는 다이렉트 버퍼 구성 물질의 농도에 따른 PCR 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 PCR 효율에 대한 다이렉트 버퍼 구성 물질의 주요 효과를 직접 샘플 PCR(a) 및 희석 샘플 PCR(b)에서 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 PCR 효율에 대한 다이렉트 버퍼 구성 물질 중 두 물질간의 조합 효과를 직접 샘플 PCR에서 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 PCR 효율에 대한 다이렉트 버퍼 구성 물질 중 두 물질간의 조합 효과를 희석 샘플 PCR에서 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 전혈 샘플에서 PCR에 사용할 수 있는 DNA에 대한 PEG 8000의 농도별 효과를 나타낸 그래프(a) 및 사진(b)이다.
도 9는 상용 제품인 Qiagen 및 다이렉트 버퍼(Nex) 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 다이렉트 버퍼의 아데노바이러스 검출 성능을 비교한 그래프이다.
도 10은 비드 크기(a), 비드 양(b) 및 비드-비팅 시간(c)에 따른 뎅기 바이러스 용해 효율 및 RNA 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 전혈 및/또는 다이렉트 버퍼의 가열 시간에 따른 뎅기바이러스 RNA의 증폭 효율을 나타낸 그래프이다.
도 12는 뎅기바이러스 혈청형 1(a), 뎅기바이러스 혈청형 4(b), 및 뎅기바이러스 혈청형 3 및 4(c)의 LAMP 산물에 대한 젤 전기영동 사진 및 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 13은 상용 제품인 Qiagen 및 다이렉트 버퍼(Nex) 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 미세유체 칩의 뎅기바이러스 혈청형 3의 검출 성능을 비교한 그래프이다.
도 14는 전혈에 포함된 살모넬라균(a), 아데노바이러스(b) 및 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)(c)에 대한 증폭곡선이다.
도 15는 변에 포함된 대장균(a), 아데노바이러스(b) 및 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)(c)에 대한 증폭곡선이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다이렉트 버퍼 최적 조성비 및 바이러스 검출 효율 분석 방법
1-1. 바이러스 배양 및 전혈 샘플
설대우 교수(College of Pharmacy, Chung-Ang University, Korea)님으로부터 제공받은 인간 아데노바이러스(human adenovirus) 5 및 HEK 293 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 사용하여 배양하였다. HEK 293 세포에 2일 동안 바이러스를 감염시킨 후, 동결-해동 순환(freeze-thaw cycling)에 의해 바이러스를 수득하였다. 뎅기바이러스는 고려대학교 구로 병원에서 제공받았으며, 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)는 BioNano Health-Guard Research Center에서 구입하였다. RNA의 안정성을 확인하기 위해 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 스파이크(spike)된 RNA를 추출하였다.
전혈(whole blood)은 건강한 지원자 5명(남자 3명 및 여자 2명)으로부터 채취하였다. 수집된 혈액을 튜브(Vacutainer tube k2 EDTA, Becton Dickinson and Company, NJ, USA)에 담아 4℃에서 보관하고 일주일 이내에 사용하였다.
1-2. 직접 샘플 PCR 및 희석 샘플 PCR
37℃ 및 150rpm의 진탕 배양기(Biofree, Seoul, Korea)에서 3% TBS(Tryptic soy broth)(Becton, France)로 배양한 Salmonella typhimurium(ATCC 14028)의 게놈 DNA를 전혈에 스파이크하였다. 전혈 및 다이렉트 버퍼(direct buffer)를 1:2의 부피비로 혼합하였다. 다이렉트 버퍼는 계면활성제(SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 Triton X-100), PEG(polyethylene glycol) 200, PEG 8000, 카오트로픽 염(chaotropic salt)인 구아니디움 티오시아네이드(guanidium thiocyanate: GuSCN), 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)인 황산나트륨(Na2SO4), NaOH 및/또는 MgCl2를 다양한 조성비로 혼합하여 구성하였다.
직접 샘플 PCR은 스파이크된 전혈 및 다이렉트 버퍼 혼합물을 샘플로 직접 사용하였다. 희석 샘플 PCR은 전혈 샘플을 TE 버퍼로 1000배 희석하여 사용하였다. 사용한 프라이머는 표 1과 같다. 혈액 상층액에서 DNA의 회수율 및 정제율을 정량하기 위하여 LightCycler® 480 System(Roche, Basel, Switzerland)을 사용하여 실시간(real time) PCR을 수행하였다.
프라이머 프라이머 염기서열
(5'→3')		 서열번호
Salmonella typhimurium forward CTCACGGGACGCGAAAAGACGA 서열번호 1
reverse CGACGCCGGATTCCCCTACCAG 서열번호 2
1-3. PCR 효율 분석 및 비교
QIAamp DNA mini kit를 사용하여 추출된 실시예 1-1의 아데노바이러스 DNA 양을 양성 대조군(positive control: PC)과 비교하여 용해 효율을 확인하였다. 또한, 대조군으로써 상용화된 다이렉트 버퍼인 NexampTM Direct PCR Buffer Kit(Genes Laboratories, Gyeongido, Korea)를 사용하였다. 마이크로 비드(직경 50 내지 70㎛, DAIHAN Scientific, Kangwon-do, Korea)를 35% 과산화수소와 98% 황산으로 구성된 피라나 용액(piranha solution)으로 30분 동안 세척하였다. 0.4g의 마이크로 비드와 다이렉트 버퍼를 샘플에 넣어 아데노바이러스를 용해시켰다. 아데노바이러스를 스파이크한 전혈(200㎕)을 2배 용량의 다이렉트 버퍼(400㎕) 및 마이크로 비드와 혼합한 후 비드-비팅(bead-beating)하였다. 1분 동안 30Hz의 진동수로 비드-비팅한 후, 실온에서 4분 동안 방치하였으며, 직접 샘플을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
1-4. 다이렉트 버퍼 구성 물질의 주요 효과 및 조합 효과 분석
MinitabTM 프로그램을 사용하여 다이렉트 버퍼의 구성 물질에 대한 최적 비율을 분석하였다. PEG 200, PEG 8000, GuSCN, Na2SO4 및 MgCl2는 Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였고, NaOH는 Junsei-Chemical(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. One-half factorial experiment는 2 반복 및 4 블록으로 설계되었다. 실험은 DOE(design of experiment)의 실행 순서에 의해 순차적으로 수행되었다.
1-5. 역전사-PCR 및 LAMP
one step RT-PCR set(Bioassay, South Korea) 및 SuperScript® II Reverse Transcriptase(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, MA, USA)/TB Green Premix Ex Taq II(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)을 각각 사용하여 One-step 및 two-step 역전사(Reverse Transcription: RT)-PCR(LightCycler®480 II, Roche, Basel, Switzerland)을 수행하였다.
고리매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification: LAMP)은 Mmiso®Dengue Detection Kit(Real-Time)(Mmonitor, South Korea)의 각 유형 마스터 혼합물 23㎕와 58℃에서 준비된 RNA 샘플 2㎕의 혼합물로 40분 동안 수행한 후, FAM 채널로부터 형광을 판독하여 수행하였다.
1-6. 바이러스 용해 효율 및 RNA 안정성 분석
다이렉트 버퍼(1.25%(v/v) PEG 200, 10%(v/v) PEG 8000 및 50mM NaOH) 내 비드-비팅(bead-beating) 조건에 따른 바이러스 용해 효율을 조사하기 위하여, 전혈 대신에 뎅기바이러스가 첨가된 물을 사용하고 RT-PCR로 측정하였다. H1N1에서 추출한 순수한 RNA는 또한 용해 준비 과정에서 RNA 안정성을 조사하기 위해 다이렉트 버퍼에 첨가되었다. 그 후, 순수한 뎅기바이러스 RNA를 함유한 전혈 샘플에 대한 정량적 PCR 결과를 순수한 뎅기바이러스 RNA를 함유한 물에 대한 정량적 PCR 결과와 비교하였다.
1-7. 미세유체 칩 구성 및 뎅기바이러스 검출
미세유체 칩은 미세유체 챔버 부분, 시료 준비 챔버 부분 및 LAMP 챔버 부분의 세 부분으로 구성된다(도 1). 미세유체 챔버 부분은 전혈 시료가 채워지는 시료 입력 부분과 처리된 시료와 다이렉트 버퍼가 시료 준비 챔버에서 LAMP 챔버로 옮겨지는 미세유체 채널로 구성된다. 시료 준비 챔버는 0.4㎖의 다이렉트 버퍼에 0.8g의 유리 마이크로 비드(50 내지 70㎛)와 마그네틱바(8mm 및 3mm)를 포함한다. LAMP 챔버 부분에는 마스터 혼합물 23㎕이 포함된 6개의 상업용 표준 마이크로튜브가 존재한다. 마이크로유체 칩에서 뎅기바이러스를 용해시키기 위한 마이크로 비드-비팅 공정을 수행하기 위하여, 시료 준비 챔버에 4개의 배플(baffle)을 사용하여, 난류 효과를 개선하여 비드-비팅 효율을 증가시켰다.
미세유체 칩의 검출 공정은 교반(용해), 가열(블로킹 및 LAMP) 및 형광 검출로 수행된다(도 2).
구체적으로, 칩에 전혈을 넣어주면 기기의 모터부분이 작동해 비드의 회전이 이루어지고 이로 인해 핵산 추출공정이 진행된다. 교반 공정은 전혈을 시료 준비 챔버에 넣고 다이렉트 버퍼와 혼합시킨 후, 전혈 중의 바이러스를 90초 동안 비드-비팅을 유도하는 마그네트 바의 교반에 의한 바이러스의 용해로 이루어진다. 가열 공정은 히터가 작동하여 70℃에서 5 내지 10분간 가열됨에 따라 불순물이 정제된 후 실온으로 냉각하여 이루어진다.
그 후, 전처리된 전혈 샘플은 5개의 마이크로 튜브 챔버(1, 2, 3 및 4번 챔버의 뎅기바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4, 및 5번 챔버의 양성 대조군, 6번 챔버의 음성 대조군(negative control: NC)로 이동하여 LAMP 시약과 만나 RNA의 증폭이 이루어지며, 증폭된 RNA는 형광에 의해 검출된다(도 3).
실시예 2. PCR 효율에 미치는 다이렉트 버퍼 구성 물질의 주요 효과 확인
다이렉트 버퍼 구성 물질이 PCR 효율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1-3을 수행하여 Triton X-100, SDS, PEG 200, PEG 8000, Na2SO4, GuSCN, NaOH 및 MgCl2의 각 농도에 따른 PCR 효율을 분석하였다.
그 결과, 계면활성제에 있어서, Triton X-100은 1% 농도까지 PCR 반응을 억제하지 않는 반면, SDS는 0.01% 이상의 농도에서 PCR 반응의 강력한 억제제로 작용함을 확인하였다. 이는 SDS가 강한 음이온성을 나타내기 때문에, PCR에 사용된 중합 효소의 표면에 흡착되어 효소 반응을 억제하기 때문이다(도 4a).
또한, PEG는 길이에 따라 매우 다른 특성을 갖는 것으로 알려져 있으며, PCR 억제 결과 역시 길이에 따라 다름을 확인하였다. 짧은 길이의 PEG 200은 긴 길이의 PEG 8000 대비 PCR 반응을 강하게 억제하였으며, 비록 고농도에서 반응이 억제되기는 하였으나, PEG 8000의 경우 100% PEG 8000 샘플에서도 10%의 PCR 효율을 나타냄을 확인하였다(도 4b).
일반적으로, 단백질의 3차원 구조를 변화시켜 단백질의 용해도를 증가시키는 카오트로픽 염(chaotropic salt)은 PCR의 강력한 억제제로 알려져 있으며, 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)은 단백질의 응집을 촉진시켜 용해도를 낮추는 것으로 알려져 있다. 그러나, 코스모트로픽 염인 황산나트륨(Na2SO4)이 카오트로픽 염인 GuSCN보다 높은 PCR 억제능을 나타내는 것으로 확인되었다(도 4c).
한편, NaOH는 pH와 밀접한 관련이 있다. 50mM NaOH는 pH가 약 13이고, PCR 버퍼에 포함되면, pH가 9 내지 10이기 때문에 PCR 완충액 농도를 증가시킴으로써, PCR 반응의 억제 효과를 해소할 수 있다. MgCl2의 경우, 중합 효소 반응의 억제는 Mg2+의 특성에 의한 것이다. 다만, Mg2+에 의한 PCR 저해 효과 역시 PCR 버퍼의 조성을 변화시킴으로써 해소할 수 있다(도 4d).
상기 결과를 통하여, 전혈에 대한 DNA 회수율 및 PCR 효율에 대한 주요 효과 및 조합 효과를 확인하기 위한 각 화학물질의 적절한 농도 범위는 표 2와 같음을 확인하였다.
구분 허용 농도 범위
Triton X-100 0 내지 1.0%
SDS 0 내지 0.01%
PEG 200 0 내지 1.25%
PEG 8000 0 내지 20%
GuSCN 0 내지 100mM
Na2SO4 0 내지 50mM
NaOH 0 내지 50mM
MgCl2 0 내지 10mM
실시예 3. PCR 효율에 대한 다이렉트 버퍼 구성 물질의 주요 효과 확인
다이렉트 버퍼를 개발할 때 가장 중요한 목표는 유리 핵산을 얻는 것이다. 유리 핵산의 존재는 두 가지 측정 방법으로 확인할 수 있다. 하나는 직접 샘플 PCR의 효율을 측정하는 것이고, 다른 하나는 저해제의 영향을 제거하고 PCR 효율을 측정(희석 샘플 PCR)하는 것이다. PCR 샘플에 포함된 핵산의 양과 불순물의 양은 직접 샘플 PCR 결과(핵산 양 및 불순물 양 모두에 의존)와 희석 샘플 PCR 결과(핵산 양에 의존)를 비교함으로써 도출할 수 있다.
따라서, PCR 효능에 대한 구성 물질의 주요 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-2의 직접 샘플 PCR(도 5a) 및 희석 샘플 PCR(도 5b)에 대하여 실시예 1-4에 따라 ANOVA 기반 DOE(Design of Experiment)를 수행하였다.
그 결과, PEG 200는 직접 샘플 PCR 효율(Ct의 감소)을 증가시키는 반면, 희석 샘플 PCR 효율에 대해서는 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통하여, PEG 200은 PCR에 관여하는 핵산에 영향을 주지 않고 전혈의 PCR 억제의 감소 효과를 확인하였으며, 이는 핵산에 대한 PEG 200의 다양한 이온(헴 등) 및 단백질(면역 글로블린 등) 흡착 방지 효과 때문임을 확인하였다.
또한, PEG 8000이 버퍼에 존재하면 PCR 효율이 증가하나, 핵산의 양이 감소하면 PCR 효율이 감소하였다. 희석 샘플 PCR 결과에 따르면, 용액 중의 핵산의 양이 감소하였으나, 전혈의 불순물이 더 많이 감소되거나 전혈의 PCR 억제가 감소됨을 확인하였다.
한편, Mg2+는 PCR 효율에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 이는 불순물을 제거하거나 핵산을 농축하는데 사용된 Mg2+의 농도가 너무 낮기 때문임을 확인하였다. 마찬가지로, 카오트로픽 염인 GuSCN 및 코스모트로픽 염인 Na2SO4의 농도가 낮기 때문에 PCR 효율에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 다만, GuSCN의 경우, PCR에 영향을 미치지 않는 농도(50mM)의 사용에도 불구하고, GuSCN이 존재할 때 PCR 효율이 감소한다는 것을 확인하였다. 이는 카오트로픽 염인 GuSCN이 전혈의 PCR 저해 능력을 증가시킨다는 것을 시사한다(희석 샘플 PCR 결과에서는 PCR에 관여하는 핵산의 양이 감소하지 않음).
PCR 효율은 계면활성제인 SDS 또는 Triton-X의 첨가에 따라 감소하였는데, 이는 핵산의 양이 감소하기 때문이 아니라 GuSCN의 경우와 같이 전혈의 계면활성제 및 모든 물질이 반응 또는 결합하기 때문임을 확인하였다.
pH 관련, NaOH는 PCR 효율에 긍정적인 역할을 하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 직접 샘플 PCR 결과에 따르면, NaOH의 PCR 효율 증가 효과는 거의 나타나지 않았으나, 희석 샘플 PCR 결과에 따르면, PCR 효율이 크게 증가하였다. 이와 같은 결과를 통하여, NaOH가 전혈의 불순물을 제거하지는 않지만, PCR 반응에 참여할 수 있는 핵산의 양을 증가시키며, 이는 NaOH가 버퍼에 첨가됨으로써, 시료의 pH가 상승하고, 핵산이나 단백질 등의 각종 생물학적 물질이 높은 음전하를 나타내어 각종 생체 물질 간의 흡착을 방해하기 때문임을 확인하였다. 또한, 헴 또는 면역글로블린과 같은 억제제의 존재뿐만 아니라 핵산과의 결합에 의하여 전혈의 PCR 반응이 억제됨을 확인하였다. 따라서, NaOH는 다이렉트 버퍼 조성에 필수적인 구성임을 확인하였다.
실시예 4. PCR 효율에 대한 다이렉트 버퍼 구성 물질의 조합 효과 확인
다이렉트 버퍼 구성 물질 중 두 물질간의 상호 작용을 확인하기 위하여, 실시예 1-2의 직접 샘플 PCR(도 6) 및 희석 샘플 PCR(도 7)에 대하여, 실시예 1-4에 따라 ANOVA 기반 DOE(Design of Experiment)를 수행하였다.
그 결과, 대부분의 경우 주요 효과와 차이가 없으나, PEG 8000, 계면활성제 및 GuSCN과 같은 일부 물질은 결합되는 물질에 따라 특성이 변하는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 직접 샘플 PCR에서 PEG 200이 없는 경우 NaOH의 영향은 무시할 수 있으나, 희석 샘플 PCR의 결과에 따르면, PEG 200의 존재에 관계없이 NaOH의 효과가 매우 높은 것으로 확인되었다. 이는 PEG 200에 불순물 정제 효과가 있음을 시사한다. PCR에 관여할 수 있는 핵산의 양은 NaOH에 의해 증가되지만(희석 샘플 PCR 결과), PEG 200이 없는 경우 효과는 매우 낮다(직접 샘플 PCR 결과). 즉, PEG 200은 NaOH와 같은 다이렉트 버퍼의 핵심 물질 중 하나임을 의미한다.
또한, PEG 8000는 직접 샘플 PCR에 긍정적인 영향을 미친 것으로 나타났다. 그러나, PEG 8000 특성의 pH 변화는 직접 샘플 PCR 및 희석 샘플 PCR의 결과와는 정반대이다. 구체적으로, PEG 8000과 NaOH로 희석된 샘플 PCR 결과에 따르면, NaOH에 의한 희석 샘플 PCR 효율은 PEG 8000에 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 직접 샘플 PCR 결과에 따르면, PEG 8000이 존재할 경우, NaOH가 PCR에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났고, 또한, PEG 8000의 존재 하에서 희석 샘플 PCR의 효율은 낮아지는 것으로 나타났다. 따라서, PEG 8000은 불순물의 정화 효과를 나타내나, 용액 중의 핵산의 농도를 감소시키는 효과(핵산 침전) 역시 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 표준화된 PCR 결과에서 PEG 8000의 농도 및 반응 시간이 증가함에 따라 용액에 남아있는 핵산의 양이 감소하는 것으로 나타났다는 점에서, PEG 8000은 PCR에 영향을 미치는 핵산 및 불순물을 함께 침전 또는 응고시키며, PEG 8000의 농도가 10%일 때, 최적의 효과가 나타남을 확인하였다(도 8).
이와 같은 결과를 통하여, 1.25%(v/v) PEG 200, 10%(v/v) PEG 8000 및 50mM NaOH의 조성비를 갖는 다이렉트 버퍼의 핵산 회수율이 가장 우수함을 확인하였다.
실시예 5. 전혈에서의 바이러스 핵산 검출
전혈에서 바이러스의 핵산 검출이 가능한지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 4에서 확인한 최적의 조성비를 갖는 다이렉트 버퍼(1.25%(v/v) PEG 200, 10%(v/v) PEG 8000 및 50mM NaOH)를 아데노바이러스를 스파이크한 전혈에 사용하여, 실시예 1-3에 따라 아데노바이러스를 검출하였다.
그 결과, Qiagen 키트를 기반으로한 PCR 효율 및 선형 범위는 본 발명의 다이렉트 버퍼보다 우수한 것으로 나타났으나, 이와 같은 결과는 Qiagen 키트의 불순물 제거 공정에 기인한 것으로 확인되었다. 한편, 본 발명의 다이렉트 버퍼는 전혈 102pfu/100㎕ 농도의 바이러스의 검출이 가능한 것으로 나타나, 상용화된 NexampTM Direct PCR Buffer보다 PCR 효율 및 선형 범위가 뛰어난 것으로 확인되었다(도 9).
실시예 6. 비드-비팅 조건에 따른 RNA 추출 효율 및 안정성 확인
RNA 추출 효율 및 안정성에 대한 마이크로 유리 비드의 크기, 양 및 교반 시간에 대한 최적 조건을 확인하기 위하여, 뎅기바이러스 혈청형 3에 대한 RNA 추출 효율 및 안정성을 비드의 크기(20, 30, 50㎛), 양(0.4, 0.6, 0.8g) 및 비드-비팅 시간(30, 60, 90초)에 따라 분석하였다. 용해 효율은 QIAamp viral RNA mini Kit를 사용한 순수(pure water) 방법 대비 비드-비팅을 사용한 다이렉트 버퍼 방법(실시예 1-6)에 따른 뎅기바이러스 혈청형 3으로부터 추출한 RNA의 양(%)로 정의하였다. RNA 안정성은 비드-비팅 전 대비 비드-비팅 후 RT-PCR에 의해 증폭된 RNA 양(%)으로 정의하였다.
비드-비팅 공정에 따른 물리적 스트레스 하에서 RNA 안정성을 확인한 결과, 더 큰 비드는 더 효과적으로 뎅기바이러스를 용해시키는 것으로 나타났다(도 10a). 또한, 비드 양(도 10b) 및 교반 시간(도 10c)이 증가할수록 용해 효율이 높아지는 것으로 나타났다. RNA 추출 효율은 0.8g의 50㎛ 유리 비드를 사용하고 1,500rpm에서 90초 동안 교반(25Hz)할 때, 90% 이상인 것으로 확인되었다. 또한, 80% 이상의 RNA는 심각한 물리적 스트레스 하에서도 안정적인 것으로 나타났다.
실시예 7. 전혈 및 다이렉트 버퍼의 가열에 따른 RNA 증폭 효율 증가 효과 확인
뎅기바이러스로부터 RNA를 추출한 후, 샘플 내의 RNA를 실시예 1-5의 방법에 의해 증폭시켰다. 전혈은 전혈 단독 또는 전혈과 다이렉트 버퍼 혼합물을 70℃로 가열하여 사용하였다. 증폭 효율(%)은 (전혈에 존재하는 특정 RNA의 Ct - 음성 대조군의 Ct(NC))/(물에 존재하는 특정 RNA의 Ct - NC의 Ct)로 정의하였고, Ct(임계주기: threshold cycle)는 RT-PCR 결과에 따라 나타내었다.
그 결과, 전혈만을 가열할 경우, RT-PCR 효율은 50% 미만으로 확인되었다. 그러나, 전혈과 다이렉트 버퍼 혼합물을 가열할 경우, RT-PCR 증폭 효율이 80%까지 향상되는 것으로 나타났다(도 11). 이는 높은 pH를 제공하는 PEG 200 및 NaOH가 폴리머라제 등의 효소와 단백질 등의 증폭 억제제 간의 비특이적 결합을 방지하기 때문임을 확인하였다. PEG 200과 NaOH는 고농도에서 증폭 반응을 억제하기 때문에, RNA 증폭에 있어서 불순물 정제 효율을 증가시키기 위하여, PEG 200 또는 NaOH의 농도를 증가시키는 것 보다는 70℃에서 5 내지 10분간 가열하는 것이 더욱 바람직함을 확인하였다.
실시예 8. 미세유체 칩의 뎅기바이러스 혈청형 구별 성능 확인
뎅기바이러스의 혈청형을 구별할 수 있는지 확인하기 위하여, 다양한 혈청형의 뎅기바이러스(104pfu)가 첨가된 전혈시료 200㎕를 실시예 1-7의 미세유체 칩을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 12a 내지 12c와 같이, 뎅기바이러스 혈청형 1 내지 4가 효과적으로 구별됨을 확인하였다.
실시예 9. 미세유체 칩의 우수한 뎅기바이러스 검출 민감도 확인
실시예 1-7의 미세유체 칩이 상업용 다이렉트 버퍼(NEXampTM direct buffer kit, South Korea) 및 정상 guanidine 기반 column kit(QIAamp DNA mini Kit with whole blood protocol, Hilden, Germany) 대비 우수한 검출 효율을 나타내는지 확인하기 위하여, 103, 104 및 105pfu/㎖의 농도에서의 뎅기바이러스 혈청형 3의 검출율을 비교하였다.
그 결과, 실시예 1-7의 미세유체 칩을 사용할 경우 뎅기바이러스가 모두 검출되었다. 반면, 각각 103, 104 및 105pfu/㎖ 샘플에 대해서 NEXamp 키트는 각각 0, 20 및 60%의 성공률을 보이는 것으로 나타났고, Qiagen 키트는 60, 80 및 100%의 성공률을 보이는 것으로 나타났다(도 13). 즉, 실시예 1-7의 미세유체 칩은 상업용 다이렉트 버퍼 키트(NEXamp) 및 정상 DNA 정제 키트(Qiagen) 대비 뎅기바이러스 검출 민감도가 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 10. 생물학적 시료에 포함된 감염균 다중 검출 효과 확인
10-1. 전혈에 포함된 감염균 다중 검출 효과 확인
전혈 200㎕에 살모넬라균(Salmonella typhimurium) 105cfu/㎖, DNA 바이러스인 아데노바이러스 105pfu/㎖ 및 RNA 바이러스인 인플루엔자 A 바이러스(H1N1) 103pfu/㎖를 스파이크한 후 증류수 200㎕와 혼합하고, 실시예 4에서 확인한 최적의 조성비를 갖는 다이렉트 버퍼(1.25%(v/v) PEG 200, 10%(v/v) PEG 8000 및 50mM NaOH) 400㎕를 혼합 및 비드-비팅을 진행한 다음, 70℃에서 5분간 가열한 후, PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, 살모넬라균(도 14a), 아데노바이러스(도 14b) 및 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)(도 14c) 각각에 대한 증폭곡선을 확인하여, 본 발명의 다이렉트 버퍼의 핵산 추출 및 정제공정이 정상적으로 작동함을 확인하였다.
10-2. 변에 포함된 감염균 다중 검출 효과 확인
변 6mg에 대장균(Escherichia coli) 103cfu/㎖, DNA 바이러스인 아데노바이러스 105pfu/㎖ 및 RNA 바이러스인 인플루엔자 A 바이러스(H1N1) 104pfu/㎖를 스파이크한 후 증류수 200㎕와 혼합하고, 실시예 4에서 확인한 최적의 조성비를 갖는 다이렉트 버퍼(1.25%(v/v) PEG 200, 10%(v/v) PEG 8000 및 50mM NaOH) 400㎕를 혼합 및 비드-비팅을 진행한 다음, 70℃에서 5분간 가열한 후, PCR 반응을 수행하였다.
그 결과, 대장균(도 15a), 아데노바이러스(도 15b) 및 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)(도 15c) 각각에 대한 증폭곡선을 확인하여, 본 발명의 다이렉트 버퍼의 핵산 추출 및 정제공정이 정상적으로 작동함을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Composition for Nucleic Acid Purification and Extraction and Nucleic Acid Detection Kit and Method using the same <130> PN180416 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Salmonella typhimurium_forward <400> 1 ctcacgggac gcgaaaagac ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Salmonella typhimurium_reverse <400> 2 cgacgccgga ttcccctacc ag 22

Claims (15)

  1. 핵산 정제 및 추출용 조성물에 있어서,
    상기 조성물은 수산화기(-OH)를 포함하는 염기성 화합물을 포함하고,
    상기 정제는 가열 조건에서 이루어지는 것인
    핵산 정제 및 추출용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 PEG(polyethylene glycol) 200, PEG 8000, 또는 PEG 200과 PEG 8000의 혼합물을 더 포함하는 것인 핵산 정제 및 추출용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은
    0 내지 1.25부피%의 PEG 200;
    0 내지 10부피%의 PEG 8000; 및
    10 내지 80mM의 NaOH
    를 포함하는 것인 핵산 정제 및 추출용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산은 생물학적 시료에 포함된 것인 핵산 정제 및 추출용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 플라즈마 및 변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 핵산 정제 및 추출용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 가열은
    40 내지 70℃에서 1 내지 10분 동안 이루어지는 것인 핵산 정제 및 추출용 조성물.
  7. 제 1 항의 조성물을 포함하는 핵산 검출용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 키트는 비드-비팅부를 포함하는 것인 핵산 검출용 키트.
  9. 제 1 항의 조성물을 생물학적 시료와 혼합하는 단계;
    생물학적 시료를 40 내지 70℃에서 1 내지 10분 동안 가열하는 단계; 및
    생물학적 시료에서 핵산을 검출하는 단계
    를 포함하는 핵산 검출 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산은 감염균 유래 핵산인 것인 핵산 검출 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 감염균은 박테리아 또는 바이러스인 것인 핵산 검출 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 뎅기바이러스 또는 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)인 것인 핵산 검출 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 살모넬라균(Salmonella typhimurium)인 것인 핵산 검출 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 뎅기바이러스는 뎅기바이러스 혈청형 1, 뎅기바이러스 혈청형 2, 뎅기바이러스 혈청형 3 및 뎅기바이러스 혈청형 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뎅기바이러스 혈청형인 것인 핵산 검출 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 검출은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR) 또는 고리매개 등온 증폭(Loop-mediated isothermal amplification: LAMP)인 것인 핵산 검출 방법.
KR1020180159198A 2018-12-11 2018-12-11 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법 KR102200041B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180159198A KR102200041B1 (ko) 2018-12-11 2018-12-11 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180159198A KR102200041B1 (ko) 2018-12-11 2018-12-11 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200071450A true KR20200071450A (ko) 2020-06-19
KR102200041B1 KR102200041B1 (ko) 2021-01-08

Family

ID=71137321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180159198A KR102200041B1 (ko) 2018-12-11 2018-12-11 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102200041B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220157148A (ko) * 2021-05-20 2022-11-29 건국대학교 산학협력단 광범위성 항균 활성을 가지는 항균펩티드를 이용하여 용해가 어려운 박테리아로부터 고품질의 핵산을 추출하는 방법
CN117867179A (zh) * 2024-02-29 2024-04-12 中国人民解放军海军军医大学 一种检测登革病毒的lamp引物组、微流控芯片及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080066727A (ko) * 2005-11-02 2008-07-16 가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼 Ｒｎａ의 추출방법 및 ｒｎａ의 검출방법
KR20090107927A (ko) 2008-04-09 2009-10-14 (주)바이오니아 자동정제장치, 멀티 웰 플레이트 키트 및 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080066727A (ko) * 2005-11-02 2008-07-16 가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼 Ｒｎａ의 추출방법 및 ｒｎａ의 검출방법
KR20090107927A (ko) 2008-04-09 2009-10-14 (주)바이오니아 자동정제장치, 멀티 웰 플레이트 키트 및 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220157148A (ko) * 2021-05-20 2022-11-29 건국대학교 산학협력단 광범위성 항균 활성을 가지는 항균펩티드를 이용하여 용해가 어려운 박테리아로부터 고품질의 핵산을 추출하는 방법
CN117867179A (zh) * 2024-02-29 2024-04-12 中国人民解放军海军军医大学 一种检测登革病毒的lamp引物组、微流控芯片及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR102200041B1 (ko) 2021-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3636769B1 (en) Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof
Hedman et al. Overcoming inhibition in real-time diagnostic PCR
JP5546977B2 (ja) パルボウイルスｂ１９の検出のための新規なプライマーおよびプローブ
US5871975A (en) Method for suppressing inhibition of enzyme-mediated nucleic acid amplification reactions by ionic detergents
JP5290987B2 (ja) 核酸増幅用サンプルの調製方法及び調製キット
EP1407051A2 (en) Universal method and composition for the rapid lysis of cells for the release of nucleic acids and their detection
AU2002354838A1 (en) Universal method and composition for the rapid lysis of cells for the release of nucleic acids and their detection
JPH03133379A (ja) タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法
JP2021121809A (ja) 溶血試薬
KR102200041B1 (ko) 핵산 정제 및 추출용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출 키트 및 방법
JP2024026545A (ja) 改良された核酸検出方法
JP2022191442A (ja) 非特異的な核酸増幅を抑制する方法
EP3303623A1 (en) Molecular detection of rna
KR20230005897A (ko) Rna 바이러스의 검출 방법
JP2023024808A (ja) Ｒｎａウイルス検出方法
JP2018166410A (ja) 生体試料中の核酸の長期保存方法
JP2024502387A (ja) 核酸を検出するための方法
JP7385471B2 (ja) Ｐｈｉ６内部対照組成物、装置、および方法
WO2023286535A1 (ja) 核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法
CN118166168B (zh) 同时检测虫媒传染性疾病多种病原体的引物池及pcr快速检测试剂盒
US20210054444A1 (en) Rapid cellular lysis by reduction/oxidation reaction
US20220195541A1 (en) Detecting a target nucleic acid in a biological sample
WO2023057422A1 (en) Universal buffer in methods for safe and rapid detection of pathogen infection
US20230287525A1 (en) Method for the concentration of microscopic substances derived from living organisms, environments, or foods
JP2024095485A (ja) 核酸検出用ｐｃｒ溶液

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
G170 Publication of correction