EP2765982A1 - Dimethylsulfoxid als lösungsmittel für nukleinsäuren - Google Patents

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzungen umfassend in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation; sowie umfassend mindestens einen pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträglichen Hilfsstoff. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Zusammensetzungen zur Einbringung von Nukleinsäure in beispielsweise humane Zellen oder Gewebe sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen.

Description

Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel für Nukleinsäuren

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzungen umfassend in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation, sowie mindestens einen pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträglichen Hilfsstoff. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Zusammensetzungen zur Einbringung von Nukleinsäure in humane Zellen oder Gewebe sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen.

Stand der Technik

Die Verwendung von Nukleinsäuren wie Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) wird seit langer Zeit von der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie intensiv erforscht.

Ein grundsätzliches Problem bei der Entwicklung von Nukleinsäure-basierten Wirkstoffen besteht darin, dass diese ihre Wirkung in der Regel im Inneren von Zellen entfalten (z.B. im Zytosol oder im Zellkern). Aufgrund der Ladung der Nukleinsäuren findet jedoch eine Diffusion der Nukleinsäure durch die Zellmembran, welche die Zellen nach außen hin begrenzt, nur in äußerst beschränktem Ausmaß statt. Zur Überwindung dieser Barriere wurde eine Vielzahl von verschiedenen Verfahren entwickelt, um Nukleinsäure in Zellen einzubringen. Diese Verfahren umfassen beispielsweise die Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und synthetischen Partikeln oder die direkte Injektion von nackter Nukleinsäure ins Blut zum Zwecke der anschließenden Aufnahme derselben durch die entsprechenden Zielzellen.

Im Stand der Technik sind darüber hinaus zahlreiche Verfahren zur Einbringung von Nukleinsäure in Zellen im Rahmen von gentherapeutischen Ansätzen bekannt, wobei üblicherweise virale Vektorsysteme zum Einsatz kommen. Die in diesen Verfahren eingesetzten Vektorsysteme werden aus natürlich vorkommenden Viren entwickelt, die in der Regel so modifiziert wurden, dass sie nicht länger in der Lage sind, sich in den Zellen zu replizieren. Die viralen Vektoren werden von speziellen Verpackungszelllinien hergestellt und lassen sich aus dem Kulturüberstand entsprechender Zellkulturen reinigen. Bedenken hinsichtlich der Sicherheit solcher Vektorsysteme bestehen u.a. aufgrund der möglichen Rekombination mit natürlich vorkommenden Viren. Es ist nicht ausgeschlossen, dass bei einer solchen Rekombination rekombinante pathogene Viren entstehen könnten, die ein Risiko für den therapeutisch behandelten Organismus darstellen.

Neben den viralen Vektorsystemen sind auch nicht-virale Vektoren in der Gentherapie üblich. Geeignete nicht-virale Vektoren werden mit Hilfe von rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt und entweder in Form von "nackter DNA" oder in komplexierter Form in die jeweilige Zielzelle eingebracht. Dabei werden die Nukleinsäuren für den Transport über die Zellmembran beispielsweise an Polylysin gekoppelt. Diese Systeme sind allerdings hinsichtlich ihrer Effizienz unbefriedigend, da lediglich geringe Mengen an Nukleinsäure von den entsprechenden Zielzellen aufgenommen werden.

Die Möglichkeit der Einbringung von nackter Nukleinsäure wird seit langer Zeit auch intensiv im Zusammenhang mit einer DNA-Vakzinierung erforscht. So konnte gezeigt werden, dass durch direkte intramuskuläre Injektion von RNA- oder DNA-Vektoren, die für verschiedene Enzyme kodierten, eine Gen-Expression im lebenden Organismus erreicht werden kann (Wolff et al. (1 990), Science, 247, 1465-1468).

Trotz der oben dargestellten Entwicklungen besteht weiterhin ein Bedürfnis nach einem einfachen und kostengünstigen Verfahren zur Einbringung von Nukleinsäure in Zellen oder Gewebe von lebenden Organismen. Das Verfahren sollte vorzugsweise mit einem geringen gesundheitlichen Risiko verbunden sein und möglichst auf virale Vektorsysteme und ähnliche Hilfsmittel verzichten. Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, dass Nukleinsäure, die in bestimmter Weise mit organischen Kationen komplexiert sind, hervorragend in Dimethylsulfoxid (DMSO) löslich sind. In DMSO gelöste Nukleinsäuren können direkt beispielsweise durch die Haut eines lebenden Säugetiers in das Zellinnere verabreicht werden. Wie sich mittels Fluoreszenzmarkierung feststellen lässt, können die Nukleinsäuren dabei überraschenderweise bis in die Zellkerne der Hautzellen eindringen. Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt eine pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung umfassend:

a) in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation; und

b) mindestens einen pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträglichen Hilfsstoff.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in der nachfolgenden Beschreibung und den abhängigen Ansprüchen offenbart.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Zusammensetzungen und deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die Dimethylsulfoxid als organisches Lösungsmittel umfassen. Darin gelöst sind eine oder mehrere mit einem oder mehreren organischen Kationen komplexierte Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren sind in der Regel derart komplexiert, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäuren durch positive Ladungen der organischen Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind. „Im Wesentlichen vollständig kompensiert" bedeutet hier insbesondere, dass das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure vorzugsweise größer oder gleich 0,5 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,6 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,7 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,8 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,9 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,91 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,92 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,93 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,94 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,95 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,96 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,97 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,98 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,985 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,99 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,995 ist, oder sogar gleich 1 ist. Das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure kann beispielsweise in dem Bereich 0,5 - 2 liegen, z.B. im Bereich 0,6 - 1 ,8 liegen, im Bereich 0,7 - 1 ,3 liegen, im Bereich 0,8 - 1 ,2 liegen, im Bereich 0,9 - 1 ,1 liegen, im Bereich 0,91 - 1 ,09 liegen, im Bereich 0,92 - 1 ,08 liegen, im Bereich 0,93 - 1 ,07 liegen , im Bereich 0,94 - 1 ,06 liegen, im Bereich 0,95 - 1 ,05 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,97 - 1 ,03 liegen, im Bereich 0,98 - 1 ,02 liegen, im Bereich 0,99 - 1 ,01 liegen, im Bereich 0,995 - 1 ,005 liegen, oder sogar gleich 1 sein. Letzterer Wert wird insbesondere dann erzielt, wenn bei der Herstellung (siehe später) Kationen bei der Fällung der Nukleinsäure im Überschuss vorliegen und das Präzipitat aus organischen Kationen und Nukleinsäure mit Wasser gewaschen wird.

Es wurde festgestellt, dass es durch diese Form der Komplexierung möglich ist, Nukleinsäuren, die ansonsten in organischen Lösungsmitteln nicht löslich sind, in hohen Mengen in DMSO in Lösung zu bringen. Nukleinsäuren, wie z.B. DNA oder RNA, sind unter physiologischen Bedingungen anionische Polymere, die über eine hohe Anzahl von negativ geladenen Phosphat-Gruppen verfügen. Aufgrund der Ladung der Polymere sind diese in wässriger Lösung gut löslich, während die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln äußerst gering ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte zudem gezeigt werden, dass sich die in DMSO gelösten, komplexierten Nukleinsäuren in wirksamer Weise in Zellen und/oder Gewebe z.B. eines Säugetiers einbringen lassen. Insbesondere die dermale oder transdermale Einbringung der erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren (d.h. z.B. die Einbringung über die Haut eines Säugetiers) hat sich als hoch effizient erwiesen. Bereits wenige Stunden nach dem Auftragen auf die Haut konnten entsprechend markierte Nukleinsäuren in verschiedenen Hautzellen und im Bindegewebe darunter nachgewiesen werden. Die erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren eignen sich daher in besonderer Weise als Bestandteil von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen und/oder Gewebe, z.B. in Zellen und/oder Gewebe der Haut.

„Mindestens ein organisches Kation" bedeutet, dass mindestens ein Typ an organischem Kation vorliegt (z.B. CTAB). Es können aber auch Kationengemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen organischen Kationen vorliegen (z.B. CTAB neben DDAB). Üblicherweise ist das mindestens eine organische Kation einfach positiv geladen. Dem Fachmann ist klar, dass der Ausdruck nicht auf die Stoffmenge abstellt.

Die Formulierung„in Dimethylsulfoxid gelöste Komplexe", wie hierin verendet, soll bedeuten, dass die Komplexe in DMSO gelöst vorliegen. Neben der Lösung in DMSO alleine schließt dies auch die Fälle mit ein, in denen Lösungsmittelgemische (d.h. unter Bildung einer homogenen Phase) von DMSO mit einem oder mehr, zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. weiteren organischen Lösungsmitteln vorliegen. Die Nukleinsäuren sind dann entsprechend in diesen DMSO-haltigen Lösungsmittelgemischen gelöst. Bei Vorliegen eines nichthomogenen Gemisches mit mehreren Phasen liegen die Nukleinsäurekomplexe erfindungsgemäß - zumindest vorwiegend - in der DMSO-haltigen Phase vor.

„Mindestens eine Nukleinsäure" bedeutet, dass mindestens eine Nukleinsäure vorliegt. Es können aber auch Nukleinsäuregemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen Nukleinsäuren vorliegen. Der Unterschied kann beispielsweise im Typ der Nukleinsäure (z.B. DNA neben RNA) und/oder der Sequenz der Nukleinsäuren (Länge und/oder Basenabfolge) begründet sein.

Die mindestens eine Nukleinsäure in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung löst sich in DMSO aufgrund der Ladungskompensation in den gebildeten Komplexen. Die Lösung der Nukleinsäure benötigt daher nicht die Bildung von Micellen, Liposomen oder ähnlichen nanopartikulären Strukturen. Üblicherweise liegen daher in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation gelöst vor, wobei die Komplexe sich nicht im Inneren einer Micelle, eines Liposoms oder ähnlichen synthetischen nanopartikulären Strukturen befinden. In einigen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sogar überhaupt keine Micellen, Liposomen oder synthetische Nanopartikel.

Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäß geeigneter Komplexe aus Nukleinsäure und organischem Kation umfasst die Lösung mindestens einer Nukleinsäure in einer wässrigen Flüssigkeit, insbesondere Wasser (z.B. demineralisiertes Wasser), Präzipitation der mindestens einen Nukleinsäure durch Zugabe von mindestens einem organischem Kation, das mit der Nukleinsäure einen in der wässrigen Lösung unlöslichen Komplex bildet, und anschließende Aufnahme des Präzipitats in DMSO oder DMSO-haltigem Lösungsmittelgemisch.

Ein solches Verfahren kann folgende Schritte umfassen:

a) Bereitstellen von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation, b) Lösen der Komplexe in DMSO oder DMSO-haltigem Lösungsmittelgemisch, und c) Zusetzen eines pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoffs zu der DMSO- Lösung oder dem DMSO-haltigen Lösungsmittelgemisch mit den darin gelösten Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation, soweit das DMSO oder das DMSO-haltige Lösungsmittelgemisch aus b) nicht bereits den pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoff enthält.

Insbesondere kann ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfassen:

a) Bereitstellen einer Lösung mit mindestens einer in einer wässrigen ersten Flüssigkeit gelösten Nukleinsäure,

b) Präzipitieren der mindestens einen Nukleinsäure durch Zusatz mindestens eines mit der Nukleinsäure in der ersten Flüssigkeit unlösliche Komplexe bildenden organischen Kations (Komplexbildner) zu der ersten Flüssigkeit,

c) Abtrennen der Komplexe von der ersten Flüssigkeit,

d) Lösen der Komplexe in DMSO oder DMSO-haltigem Lösungsmittelgemisch (zweite Flüssigkeit), und

e) Zusetzen des pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoffs zu der zweiten Flüssigkeit mit den gelösten Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation, soweit das DMSO oder das DMSO-haltige Lösungsmittelgemisch aus d) nicht bereits den pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoff enthält.

Das Zusetzen des pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoffs kann selbstverständlich zu jedem geeigneten Zeitpunkt während des Verfahrens erfolgen.

Geeignete organische Kationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung (bzw. Quellen für die Kationen) sind dabei beispielsweise kationische Detergenzien, Lipide und Stickstoffverbindungen mit quartärem Stickstoff, wie z.B. organische Ammoniumsalze. Insbesondere können als Quelle für organische Kationen eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR₄X verwendet werden, wobei R jeweils unabhängig voneinander ein Kohlenwasserstoff rest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann, ist und X ein Halogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlor, Brom, lod ist, insbesondere Chlor oder Brom, vorzugsweise Brom. Insbesondere enthält der Kohlen wasserstoffrest jedoch vorzugsweise nur C- und H-Atome. Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann die Quelle für das mindestens eine organische Kation eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR¹R²R³R⁴X sein, wobei R¹, R², R³ und R⁴ organische Reste darstellen, insbesondere Kohlen Wasserstoff reste wie vorstehend definiert, und wobei zumindest R¹ ein C1 -Rest ist und R² bis R⁴ längerkettige Reste sind, oder

R¹ und R² jeweils ein C1 -Rest sind und R³ sowie R⁴ längerkettige Reste sind, oder

R¹, R² und R³ jeweils ein C1 -Rest sind und R⁴ ein längerkettiger Rest ist.

Insbesondere sind die Reste R¹, R², R³ und R⁴ jeweils und unabhängig voneinander wie nachstehend für "R" definiert.

R ist in den Verbindungen der Formel NR₄X vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann. Insbesondere können einer oder mehrere, insbesondere zwei oder drei, von R relativ kurzkettige Reste wie C1 bis C3, wie Methyl, Ethyl und Propyl sein, während ein R ein längerer Rest wie C8 oder CI O bis C20, insbesondere C10 bis C16, wie Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Cetyl, Heptadecyl, Icosanyl, Stearyl oder Nonadecyl ist. Eine bevorzugte Kombination von Resten R ist drei Methylreste und ein längerkettiger Rest, insbesondere ein wie vorstehend definierter C10 bis C20-Kohlenwasserstoffrest wie insbesondere ein Cetylrest wie in Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Vorzugsweise umfasst R keine aromatischen und/oder nicht-aromatischen Ringsysteme

Vorzugsweise handelt es sich bei dem mindestens einen organischen Kation (bzw. der Quelle für das Kation) um ein oder mehrere quartäre Amine, wobei CTAB besonders bevorzugt ist. Andere Verbindungen, die sich erfindungsgemäß für die Komplexierung der Nukleinsäuren eignen, umfassen Benzethoniumchlorid, Benzalkonium, Benzalkoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumbromid (DCAB), Dodecyltrimethylammoniumbromid (DCTAB), DOTAP, Lipofectin, Lipofectamin N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium- chloride (DOTMA), Dimethyldioctadecyl-ammoniumbromid (DDAB), dioleyl- dimethylammoniumchloride (DODAC), 2,3-Dioleoyloxy-N-[2-(spermidin carboxy- amido)ethyl]-N-Ndimethyl-1 -propaniniumtrifluoracetat (DOSPA), Diheptadecylamidoglycyl- spermidin (DHGS) und Ähnliche. Vorzugsweise ist das organische Kation nicht Polylysin und/oder TC-Chol.

Vorzugsweise wird der Komplexbildner der ersten Flüssigkeit in Schritt b) in gelöster Form zugesetzt. Dadurch wird eine schnellere Präzipitation ermöglicht als beim Zusatz eines ungelösten Komplexbildners. Die Nukleinsäure wird dabei mit dem mindestens einen organischen Kation vorzugsweise so komplexiert, dass ein Verhältnis von im Wesentlichen 1 :1 (d.h. im Wesentlichen vollständig kompensiert) zwischen den negativen Ladungen (d.h. den anionischen Gruppen) der mindestens einen Nukleinsäure und den Ladungen des mindestens einen organischen Kations vorliegt. Insbesondere organischen Kationen wie die oben erwähnten, z.B. CTAB, sind in der Lage, die positiv geladene Gruppe in einen ausreichend kleinen Abstand an das negativ geladene Sauerstoffatom der Nukleinsäure anzunähern, sodass eine ausreichende (lokale) Abschirmung der Gesamtladung beider Ionen bewirkt wird.

Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist, dass der Komplex aus organischen Kationen und Nukleinsäure insgesamt annähernd ladungsneutral ist, d.h. im Wesentlichen vollständig komplexiert ist. Die komplexierte Nukleinsäure ist daher in einem wässrigen Medium weitestgehend unlöslich und kann bei der Herstellung in wässrigen Medien als unlösliches Präzipitat abgetrennt werden. Diese Eigenschaft erleichtert somit die Herstellung der gewünschten, stöchiometrisch komplexierten Nukleinsäure. Das Abtrennen der Komplexe gemäß Schritt c) erfolgt daher vorzugsweise mittels Zentrifugation oder Filtration. Diese Verfahren stellen eine besonders einfache und effiziente Art der Abtrennung der präzipitierten Komplexe dar. Das Präzipitat kann z.B. durch Zentrifugation zum Beispiel für 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei 10000 bis 20000 x g , vorzugsweise 15000 x g, abgetrennt werden. Gegebenenfalls kann dieser Vorgang nach erneuter Aufnahme des gefällten Niederschlags in Wasser mehrmals durchgeführt werden, dadurch kann beispielsweise ein Überschuss an freien quartären Aminen abgetrennt werden. Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist ferner, dass bei Kontakt der so komplexierten Nukleinsäure mit einer lebenden Zelle oder einem Organ eines Lebewesens keine bzw. nur wenige freie organische Kationen mit den Zellen oder dem Organismus wechselwirken können. Als Folge davon können die organischen Kationen keine cytotoxischen Effekte oder andere Störungen des Metabolismus bei den Zellen auslösen, was ansonsten häufig vorkommen kann. lm Zuge der Komplexierung der mindestes einen Nukleinsäuren können selbstverständlich wie oben erwähnt auch verschiedene organische Kationen Verwendung finden, indem man Mischungen unterschiedlicher organischer Kationen zu der Nukleinsäure-haltigen wässrigen Flüssigkeit gibt, um die Nukleinsäure-Komplexe zu präzipitieren.

Die durch Präzipitation erhaltenen Komplexe werden in DMSO oder DMSO-haltigen Lösungsmittelgemischen gelöst. Die Nuklei nsäurekomplexe können unmittelbar in DMSO gelöst werden, in DMSO gelöst werden und dann mit einem anderen Lösungsmittel gemischt werden, oder auch zunächst in einen anderem Lösungsmittel wie z.B. Ethanol aufgenommen werden und dann mit DMSO gemischt werden. In jedem Fall befinden sich die gelösten Komplexe erfindungsgemäß, zumindest im Wesentlichen, in der DMSO-haltigen Phase. Nach Aufnahme in DMSO oder DMSO-haltigen Lösungsmittelgemischen enthalten diese im Wesentlichen vorzugsweise keine organischen Kationen, die über die zur Kompensation der negativen Ladungen der Nukleinsäure erforderliche Menge hinaus gehen. Dies bedeutet, dass die Anzahl der gesamten positiven Ladungen der organischen Kationen in dem DMSO oder DMSO-haltigen Lösungsmittelgemisch im Wesentlichen mit der Anzahl der negativen Ladungen der Nukleinsäure identisch ist.

Organische Lösungsmittel, die besonders geeignet zur Mischung mit DMSO sind, umfassen insbesondere ein- oder mehrwertige Alkohole oder teilweise veretherte Alkohole. Bevorzugt enthält das oder die zusätzlichen Lösungsmittel daher mindestens eine Ether-Gruppe und/oder mindestens eine Hydroxyl-Gruppe. Als Lösungsmittel besonders gut geeignete (amphiphile) Verbindungen können durch die Formel HO- 1 -O-R2 beschrieben werden. Dabei ist R1 und R2 jeweils ein Kohlenwasserstoff rest mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen. Insbesondere sind C1 bis C5-Alkohole geeignet, wie z.B. Methanol, Ethanol, 1 -Propanol oder 2-Propanol, Butanol, wie 1 -Butanol, oder Pentadiol, wie 1 -Pentadiol. Ferner sind mehrwertige Alkohole, wie Ethylenglykol oder teilweise veretherte Derivate davon, wie z.B. Ethylenglykol, das mit Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol verethert ist, wie beispielsweise Ethylenglykolether, wie insbesondere Ethylenglykolmonobutylether, -ethylether oder methylether, verwendbar. Alternativ können gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie z.B. auf Benzol basierende aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Styrol, verwendet werden, also insbesondere mit C1 bis C3-Resten substituierte Benzole. Alternativ können halogenhaltige Lösungsmittel wie Chloroform, Dichlormethan oder Tetrachlorkohlenstoff oder andere heteroatomhaltige Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, verwendet werden. Insbesondere für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen ist es jedoch bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung keine halogenierten Kohlenwasserstoffe umfassen. Besonders bevorzugt sind Lösungsmittelmischungen von DMSO mit Ethanol, Glycerin, Ethylenglykol und/oder Propylenglycol.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können im Prinzip jeden beliebigen Anteil an DMSO umfassen. Sie können einen DMSO-Anteil von etwa 1 % (v/v) oder mehr, von etwa 5% (v/v) oder mehr, von etwa 10% (v/v) oder mehr, von etwa 15% (v/v) oder mehr, von etwa 20% (v/v) oder mehr, von etwa 30% (v/v) oder mehr, von etwa 40% (v/v) (v/v) oder mehr, von etwa 50% (v/v) oder mehr, von 60% (v/v) oder mehr, von etwa 70% (v/v) oder mehr, von etwa 80% (v/v) oder mehr, von etwa 90% (v/v) oder mehr, oder auch von etwa 95% (v/v) oder mehr aufweisen. Für die unmittelbare therapeutische, diagnostische oder kosmetische Anwendung am Körper ist eine hohe Konzentration an DMSO ggf. aber unerwünscht, da höhere Konzentration zu Hautirritationen führen können. Insbesondere in solchen Fällen der unmittelbaren therapeutischen, diagnostischen oder kosmetischen Anwendung der Zusammensetzung am Patient, z.B. bei Aufragung auf die Haut, kann es wünschenswert sein, wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen DMSO-Anteil von etwa 60% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 55% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 50% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 45% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 40% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 35% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 30% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 25% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 20% (v/v) (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von etwa 15% (v/v) oder weniger, einen DMSO-Anteil von 10% (v/v) oder weniger, oder auch nur einen DMSO-Anteil von etwa 5% (v/v) oder weniger aufweisen. Bei erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die auf die Haut aufgebracht werden, kann so beispielsweise ein Anteil von 20%-60% DMSO vorliegen.

Weiterhin ist es für z.B. die pharmazeutische oder kosmetische Anwendung vorteilhaft, wenn der Wasseranteil in der Phase, die die Nukleinsäure-Komplexe enthält, geringer als 50% (v/v), bevorzugt geringer als 30% (v/v), besonders bevorzugt geringer als 20% (v/v) ist. Ein höherer Wasseranteil führt zu Bildung größerer Aggregate die keine optimalen Zell und Gewebepenetrationseigenschaften besitzen. Insbesondere für therapeutische, diagnostische und kosmetische Anwendungen ist vorzugsweise der durchschnittliche Durchmesser der Komplexe aus Nukleinsäure und organischem Kation in den erfindungsgemäß zu verwendenden Zusammensetzungen kleiner als 200nm, bevorzugt kleiner als 100nm, besonders bevorzugt kleiner als 50nm, ganz besonders bevorzugt kleiner als 10nm.

Die in DMSO gelösten Nukleinsäure-Komplexe zeichnen sich durch eine außerordentlich hohe Stabilität aus. Dies ist im Wesentlichen darauf zurückzuführen, dass Nukleasen in nicht- wässriger Umgebung inaktiv sind. Dies ist vor allem bei Verwendung von Ribonukleinsäure (RNA) von Bedeutung, da in allen wässrigen Systemen mit einer hohen RNAse-Aktivität gerechnet werden muss. Außerhalb einer RNAse-freien Umgebung, die praktisch nur unter speziellen Laborbedingungen realisiert werden kann, ist grundsätzlich mit einem schnellen Abbau der RNA zu rechnen, was insbesondere den Einsatz von therapeutisch wirksamer RNA als pharmazeutisches Mittel deutlich erschwert. Dieses Problem wird durch die Komplexierung der Nukleinsäure zu den vorliegend beschriebenen Komplexen gelöst.

Ferner ist die Stabilität der erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäuren auch dadurch erhöht, dass in DMSO keine saure oder alkalische Umgebung mehr vorliegt. Dies vermeidet eine etwaige saure oder alkalische Hydrolyse der Nukleinsäuren.

Pharmazeutische/kosmetische Zusammensetzungen

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lassen sich exzellent als kosmetische und oder therapeutische Zusammensetzungen formulieren.

Für eine pharmazeutische Zusammensetzung ist die Nukleinsäure vorzugsweise eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure, d.h. eine Nukleinsäure, die nach Verabreichung an ein Individuum eine biologische Funktion ausübt und dadurch einen therapeutischen Nutzen herbeiführt. Im Stand der Technik sind eine Vielzahl von Nukleinsäuren als therapeutisch wirksam beschrieben worden. Häufig wird die Nukleinsäure in solchen Fällen Sequenzen eines Genoms bzw. Gens aufweisen. Ebenso kann die Nukleinsäure eine diagnostisch nutzbare Nukleinsäure sein z.B. ein sogenannter Molecular Beacon sein. Für eine kosmetische Zusammensetzung ist die Nukleinsäure eine kosmetisch wirksame Nukleinsäure, d.h. eine Nukleinsäure, die nach Verabreichung an ein Individuum zwar in der Regel zu keinem therapeutischen aber zu einem kosmetischen Nutzen führt. Üblicherweise wird die Nukleinsäure hier möglichst nicht Sequenzen eines (humanen) Genoms bzw. (humanen) Gens aufweisen. Nukleinsäuren können beispielsweise als Quelle für Allantoin genutzt werden. Allantoin ist bei verschiedenen Tierarten, vor allem bei Säugetieren, neben der Harnsäure das Endprodukt des Abbaus von Nukleinsäuren, speziell von Purinbasen. Allantoin wird in der Kosmetik in Hautcremes, Sonnenschutzmitteln, Rasierwässern, in Zahncreme und in Mitteln gegen übermäßige Schweißabsonderung (Hyperhidrose) und Hautirritationen eingesetzt. Es bewirkt die Beschleunigung des Zellaufbaus, der Zellbildung oder der Zellregeneration und beruhigt die Haut.

Gemäß einer einfachen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Nukleinsäure- Komplexe, die gelöst in DMSO oder DMSO-haltigem Lösungsmittelgemisch vorliegen, direkt mit den zur kosmetischen und/oder therapeutischen Behandlung vorgesehenen Zellen oder Geweben in Kontakt gebracht, z.B. durch Auftropfen oder Aufstreichen der Nukleinsäure- haltigen DMSO-Lösung. DMSO ist hierfür besonders geeignet, weil DMSO zell- und gewebeverträglich ist.

Es ist natürlich auch möglich, die in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation z.B. mit einem Öl zu einer Emulsion zu verarbeiten und z.B. in dieser Form auf die Haut aufzubringen. Andere übliche Darreichungsformen für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen beispielweise Lotionen, Cremes, Salben, Gele und Pasten. In etlichen Ausführungsformen der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen jedoch keine Emulsion, Lotion, Creme, Salbe, Gel und/oder Paste.

Erfindungsgemäß werden in den pharmazeutischen bzw. kosmetischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die in DMSO gelösten Nukleinsäure-Komplexe mit einem z.B. für die jeweilig geplante Verabreichung geeigneten pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoff vermischt. Vorzugsweise wird der mindestens eine Hilfsstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Füllstoffe, Lösungsmittel, Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Netzmittel, Antischaummittel, Salzbildner, Puffer, Gelbildner, Verdickungsmittel, Filmbildner, Bindemittel, Umhüllungsmittel, Zerfallsbeschleuniger, Adsorptionsmittel, Gleitmittel, Schmiermittel, Formentrennmittel, Fließregulierungsmittel, Antioxidantien, Konservierungsstoffe, Süßungsmittel, Geschmackkorrigientien, Geruchskorrigentien, und Färbemittel.

Beispiele für Füllstoffe sind z.B. Laktose, Cellulose, Stärken (z.B. Maisstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, oder Weizenstärke), Saccharose; Paraffin; Hartfett; Polyethylenglykole (z.B. Macrogole, PEG), Polyethylenoxide (PEO), Lactose, Glucose, Mannit, Glycin, Calciumhydrogenphosphat, Calciumcarbonat etc.

Beispiele für Lösungsmittel als Hilfsstoffe sind z.B. Ethanol, Isopropanol, Glyzerin, Propylenglykol, Aceton, Glyzerintriacetylester, Ölsäureoleylester, und Isopropylmyristat, Macrogole, Polyethylenglycole, Polyethylenoxide, synthetische, pflanzliche oder tierische Öle, synthetische, pflanzliche oder tierische Fette etc.

Beispiele für Befeuchtungsmittel sind z.B. Wasser, Ethanol, Isopropanol, Glyzerin, Propylenglykol, Aceton, Glyzerintriacetylester, Ölsäureoleylester, Isopropylmyristat, Sorbit, etc.

Beispiele für Emulgatoren sind z.B. Cetylalcohol, Stearylalkohol, Cetylstearylalkohol, Gylcerolmonostearat, Lecithine, Fettsäureester des Sorbitans (z.B. Sorbitanmonooleat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Sorbitantrioleat, Sorbitantristearat, Sorbitanmonolaureat), des Polyoxyethylensorbitans (Polysorbate, z.B. Polysorbat 20, 40, 60 oder 80), oder des Polyoxyethylens (z.B. Macrogolstearat 400, Polyoxyl-40-stearat, Polyoxyl- 50-stearat), Polyoxyethylenfettalkoholether (z.B. Polyoxyl-23-laurylether, Polyoxyl-20- cetostearylether, Polyoxyl-10-oleylether), Natriumdodecylsulfat, Natriumcetylstearylsulfat, Natriumdioctylsulfosuccinat (und Kalium- bzw. Calciumsalze davon), Cholesterin, Polyoxyethylen-Fettsäureglyceride (z.B. Macrogol-1 500-glyceroltriricinoleat, Macrogol- Glycerolhydroxystearat), Macrogol-1000 glycerolmonofettsäureester, Macrogol-1000- glycerolmonolaurat, Macrogol-1000-glycerolmonostearat, Macrogol-1000-glycerolmonooleat), Poloxamer etc.

Beispiele für Lösungsvermittler sind z.B. Polyethylenglykole (PEG, Macrogole), Polyethylenoxide (PEO), Polysorbate, Natriumdioctylsulfosuccinat (und Kalium- bzw. Calciumsalze davon) etc. Beispiele für Netzmittel sind z.B. Polyethylenglykole (PEG, Macrogole), Polyethylenoxide (PEO), Polysorbate, Natriumdodecylsulfat, Natriumcetylstearylsulfat, etc.

Beispiele für Antischaummittel sind z.B. Dimethylpolysiloxane, etc.

Beispiele für Salzbildner sind z.B. Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Tris(hydroxyethyl)amin, etc.

Beispiele für Puffer sind z.B. Natriumdihydrogenphosphat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Zitronensäure, Weinsäure, Glycin, Natriumhydrogencarbonat, etc.

Beispiele für Gelbildner sind z.B. Pektin, Tragant, Polyacrylsäuren, Polyvinylpyrrolidon, (hochdisperses) Siliciumdioxid, Carboxymethylcellulose , etc.

Beispiele für Verdickungsmittel sind z.B. Pektin, Tragant, Polyacrylsäuren, Polyvinylpyrrolidon, hochdisperses Siliciumdioxid, Carboxymethylcellulose, Gelatine, Methylcellulose, Hydroxypropyl-Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Polyvinylalkohol, Bentonit, etc.

Beispiele für Filmbildner sind z.B. Ethylcellulose, Hydroxypropyl-methylcellulosephtalat, Celluloseacetatphtalat, Polyacrylate, etc.

Beispiele für Bindemittel sind z.B. Stärken (z.B. Maisstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, oder Weizenstärke), Tragant, Cellulose, Celluloseether (Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose), Polyvinylpyrrolidon, Sacharose, Mannit, Gelatine, Calci umhydrogenphosphat, Gummi arabicum, Polyethylenglycol, etc.

Beispiele für Umhüllungsmittel sind z.B. Saccharose (z.B. zur Zuckerdragierung); Gelatine ( z.B. bei Kapseln); Gelatinepolysuccinat (z.B. bei„Weichkapseln"), Polyacrylate, Ethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropyl-Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose,

Carboxymethylcellulose-Natrium, Hydroxypropyl-methylcellulosephtalat, Macrogole, Polyethylenglycole, Polyethylenoxide, etc. Beispiele für Zerfallsbeschleuniger (Sprengmittel) sind z.B. Stärken (z.B. Maisstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, oder Weizenstärke); Croscarmellose; Natriumhydrogencarbonat z.B. in Kombination mit Citronensäure, etc.

Beispiele für Adsorptionsmittel sind z.B. Bolus alba (Kaolin), (hochdisperses) Siliciumdioxid, etc.

Beispiele für Gleitmittel sind z.B. Polyethylenglykole (PEG, Macrogole), Polyethylenoxide (PEO), Talkum, Stearinsäure (z.B. als Magnesiumstearat), etc.

Beispiele für Schmiermittel sind z.B. Polyethylenglykole (PEG, Macrogole), Polyethylenoxide (PEO), Talkum, Stearinsäure (z.B. als Magnesiumstearat), Dimethylpolysiloxane, etc.

Beispiele für Formentrennmittel sind z.B. Polyethylenglykole (PEG, Macrogole), Polyethylenoxide (PEO), Talkum, Stearinsäure (z.B. als Magnesiumstearat), Dimethylpolysiloxane, etc.

Beispiele für Fließregulierungsmittel sind z.B. (hochdisperses) Siliciumdioxid, etc.

Beispiele für Antioxidantien sind z.B. Butylhydroxytoluol, all-rac-a-Tocopherol, etc.

Beispiele für Konservierungsstoffe sind z.B. PHB-Ester, Benzalkoniumchlorid, Benzylalkohol, Thiomersal, Benzoesäure, Methyl-4-hydroxybenzoat, Propyl-4-hydroxybenzoat, Zitronensäure, lineare aliphatische 1 ,3-Diole, Phenoxyethanol und Chlorphenesin etc.

Beispiele für Süßungsmittel sind z.B. Saccharose, Sorbit, Süßstoffe wie etwa Saccharin-Natrium und Cyclamat; Aromen, Aspartame, Fructose, Laktose, Glucose, Mannit, Xylitol, etc.

Beispiele für Geschmackkorrigientien sind z.B. Saccharose, Sorbit, Süßstoffe wie etwa Saccharin-Natrium und Cyclamat; Aromen, etc.

Beispiele für Geruchskorrigentien sind in der Regel Duftstoffe.

Ein Beispiel für Färbemittel ist z.B. Titandioxid. Ein weiterer denkbarer Hilfsstoff für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist Harnstoff.

Vorzugsweise ist der Hilfsstoff nicht Wasser, auch wenn die Zusammensetzung neben dem Hilfsstoff natürlich auch noch Wasser umfassen kann.

Bei dem Hilfsstoff kann es sich beispielsweise um eine beliebige mit Wasser nicht mischbare lipophile Verbindung handeln, die mit DMSO gemischt werden kann oder auch mit DMSO ein 2 Phasensystem bildet. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Hilfsstoff um ein Öl; ein Wachs; und/oder ein Fett. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung liegen neben dem Öl, Wachs oder Fett mindestens ein weiterer Hilfsstoff vor.

Geeignete Öle, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, umfassen synthetische, tierische und pflanzliche Öle. Ebenso umfassen geeignete Wachse bzw. Fette synthetische, tierische und/oder pflanzliche Wachse bzw. synthetische, tierische und/oder pflanzliche Fette.

Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die Öle keine synthetischen Öle sind, sondern z.B. tierische und/oder pflanzliche Öle. Geeignete pflanzliche Öle sind z.B. Nussöle und Samenöle. Geeignete pflanzliche Öle umfassen insbesondere Erdnussöl, Walnussöl, Mandelöl, Haselnussöl, Sojabohnenöl, Olivenöl, Mohnöl, Hanföl, Kürbiskernöl, Sonnenblumensamenöl, Sesamsamenöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Leinöl, Rapsöl, Ricinusöl und Ähnliche. Auch aus Getreide gewonnene Keimöle können vorliegend als Träger verwendet werden. Bevorzugte Keimöle umfassen z.B. solche, die aus Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Reis und Triticale gewonnen werden. Als geeignete pflanzliche Fette können beispielsweise Kokosfett oder Kakaobutter verwendet werden. Mögliche pflanzliche Wachse umfassen bspw. Zuckerrohrwachs, Carnaubawachs, Jojobaöl, Candeli Ilawachs und Japanwachs.

Neben pflanzlichen Ölen, Wachsen und Fetten können auch tierische Fette, Wachse und Öle, wie z.B. Fischöle oder aus Nerzen oder Hirschen gewonnene Öle und Fette, eingesetzt werden. Lebertran und Walöl (wie beispielsweise aus Spermaceti) sind Beispiele für Fischöle, die vorliegend verwendet werden können. Mögliche Quellen für tierische Wachse sind beispielsweise Walrat, Wollwachs und Bienenwachs. Geeignete Verfahren zur Gewinnung reiner Öle tierischen Ursprungs sind im Stand der Technik bekannt.

Ggf. können auch pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträgliche synthetische Öle, Fette und Wachse eingesetzt werden. Geeignete synthetische Öle und Fette basieren zum Beispiel auf Silikon- oder Paraffinverbindungen. Ein Beispiel ist Vaseline. Sojawachs kann durch Hydrierung aus Soja gewonnen werden und ist ein Beispiel für ein synthetisches Wachs.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können beispielsweise einen Öl- oder Fettanteil aufweisen, der größer ist als 25% (v/v), beispielsweise größer oder gleich etwa 30%(v/v), größer oder gleich etwa 40% (v/v), größer oder gleich etwa 50%(v/v), größer oder gleich etwa 60% (v/v), größer oder gleich etwa 70% (v/v), größer oder gleich etwa 80%(v/v) etc..

Vorzugsweise umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kein Erdöl, Mineralöl, Mineralöldestillat, Leichtöl, Schweröl, Toluol, Benzol, oder Treibstoffe, wie Dieselkraftstoff, und/oder Benzin.

Als besonders geeignet hat es sich in diesem Zusammenhang erwiesen, zusätzlich ein Öl oder Fett in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einzubringen. Dabei werden zunächst wie oben beschrieben die komplexierten Nukleinsäuren zunächst in DMSO gelöst. Anschließend wird das Nukleinsäure-haltige DMSO-Lösung mit einem oder mehreren Ölen gemischt, so dass eine Flüssigkeit entsteht, die komplexierten Nukleinsäuren, DMSO und Öl umfasst. Dabei kann das Nukleinsäure-haltige DMSO - je nach Öl - in dem Öl gelöst vorliegen oder mit dem Öl ein Emulsion ausbilden.

Umfassen die Zusammensetzungen als Hilfsstoff einen Emulgator oder Tenside, so sind diese funktionell zu unterscheiden von den erfindungsgemäß obligatorisch erforderlichen organischen Kationen, die ggf. auch als Tensid/Emulgator betrachtet werden können. Diese Hilfsstoffe liegen also zusätzlich zu den obligatorisch erforderlichen Kationen vor und dienen nicht der Komplexbildung mit der Nukleinsäure sondern erfüllen ein andere Funktion, z.B. die Emulgierung zweier Flüssigkeiten. Ein nicht-beschränkendes Beispiel für so einen Fall ist eine Emulsion aus Wasser und einem Gemisch aus Öl und DMSO, wobei in der ÖI-DMSO-Phase die Nukleinsäurekomplexe enthalten sind. Auch in allen anderen Fällen, wo organische Kationen auch theoretisch als Hilfsstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden werden können ist zu unterscheiden, ob der entsprechende Stoff nun im Komplex mit der Nukleinsäure vorliegt, oder ob er die Funktion als Hilfsstoff wahrnimmt und nicht im Komplex mit der Nukleinsäure vorliegt. Benzalkoniumchlorid ist beispielsweise ein quartäre Ammoniumverbindung, die häufig auch als Konservierungsstoff eingesetzt wird. Für die Komplexbildung mit Nukleinsäuren sind andere quartäre Ammoniumverbindungen wir CTAB aber gelegentlich besser geeignet. Vorzugsweise sind daher in der vorliegenden Erfindung die organischen Kationen im Komplex mit der Nukleinsäure nicht identisch mit dem pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoff.

Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen keine Kunststoffe, insbesondere keine synthetischen artifiziellen (d.h. in der Natur nicht vorkommende) organischen Polymere, wie man sie z.B. aus der Werkstofftechnik kennt. Biologische Polymere wie Nukleinsäuren sind selbstverständlich hiervon nicht erfasst.

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorzugsweise nicht parallel Triglyzeride, Phospholipide und Cholesterin (oder alternativ Cholesterinester) oder gar kein Triglyzerid, Phospholipid, Cholesterin und/oder Cholesterinester.

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorzugsweise kein Sonnenblumenöl, Rapsöl, Weizenkeimöl, Olivenöl und/oder Kokosfett.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ricinusöl als mit DMSO mischbares Öl verwendet.

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung befinden sich vorzugsweise die in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation nicht im Inneren einer Micelle, eines Liposoms oder eines Nanopartikels.

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen die in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation vorzugsweise nicht an der Oberfläche einer Micelle, eines Liposoms und/oder eines Nanopartikels adsorbiert. Die Nukleinsäure

Die erfindungsgemäß in die Zellen oder Gewebe einzubringende Nukleinsäure ist eine geladene Nukleinsäure. Der Begriff „Nukleinsäure" ist erfindungsgemäß eine Nukleinsäure zu verstehen, deren Nukleoside durch Phosphatgruppen miteinander verknüpft sind, wobei die beteiligten Phosphatreste üblicherweise eine negative Ladung tragen, wie es bei natürlich vorkommender DNA oder RNA der Fall ist. Mit anderen Worten handelt es sich bei den geladenen Nukleinsäuren um polyanionische Säuren (Polyelektrolyte), in denen die anionischen Gruppen durch die negativ geladenen Sauerstoffreste der Phosphatgruppen, die die Phosphordiesterbindungen bilden, gebildet werden. Grundsätzlich kann es sich bei den die negativen Ladungen tragenden Resten der Nukleinsäuren auch um die negativen Reste von Phosphorthioaten oder Phosphordithioaten oder auch um andere negativ geladene Gruppen von Nukleinsäuren handeln.

Üblicherweise lösen sich Nukleinsäuren auf Grund ihrer Ladung gut in Wasser, nicht jedoch in mit Wasser nicht mischbaren organischen Flüssigkeiten, wie Kohlenwasserstoffen oder anderen organischen Lösungsmitteln, wie Ethanol, etc. Eine Nukleinsäure wird im Sinne der Erfindung als gelöst erachtet, wenn sie sich durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 15000 x g nicht abzentrifugieren lässt.

Bei den Nukleinsäuren in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuren handeln, wie z.B. um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA. Eine doppelsträngige Nukleinsäure kann beispielsweise in Form zweier separater Einzelstränge oder als Haarnadelschleifenstruktur vorliegen. Die Größe der einzubringenden Nukleinsäure ist erfindungsgemäß unkritisch.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Nukleinsäure um ein Oligonukleotid, d.h. um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA (oderDNA/RNA Hybride) mit einer Kettenlänge von etwa 2 bis etwa 1 50 Nukleotiden, bevorzugt von etwa 5 bis etwa 100 Nukleotiden, bevorzugt etwa 10 bis etwa 80 Nukleotiden, besonders bevorzugt etwa 20 bis etwa 60 Nukleotiden. Das Oligonukleotid ist vorzugsweise ein synthetisch hergestelltes Oligonukleotid mit bekannter Sequenz. Bei den Nukleinsäuren kann es sich beispielsweise um DNA, cDNA, mRNA, sRNA, Ribozyme, Antisense-DNA, RNA, Antisense RNA, siRNA, Decoys, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, oder miRNA handeln. In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure keine siRNA. Für eine therapeutische Anwendung ist es besonders vorteilhaft, wenn die Nukleinsäuren zumindest einen Teil einer Sequenz eines (humanen) Genoms oder auch Gens enthalten. Für die kosmetische Anwendung ist es wiederum vorteilhaft, wenn die Nukleinsäuren keine Sequenz eines (humanen) Genoms oder auch Gens enthalten.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der einzubringenden Nukleinsäure um einen Vektor oder um ein Plasmid mit einer Größe von mehr als 1 kb (1000 Nukleotide). Die Größe des Vektors oder des Plasmids wird in der Regel mehr als 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 1 1 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb oder sogar mehr als 20 kb betragen. Es kann sich bei der Nukleinsäure, die in die Zellen eingebracht werden soll, z.B. um einen Gentherapie-Vektor handeln, der für die Expression in einem Säugetier verabreicht wird. Beispiele für Gentherapie-Vektoren, die sich für die erfindungsgemäße Einschleusung in Gewebe eines lebenden Säugetiers eignen, umfassen beispielsweise virale und nicht-virale Vektoren. Virale Vektoren leiten sich von verschiedenen Viren ab, z.B. von Retroviren, Herpesviren, Adenoviren oder von Adeno-assoziierten Viren (AAV), siehe Lundstrom, Trends Biotechnol. (2003), 21 (3):1 1 7-22. Vorzugsweise handelt es sich bei den viralen Vektoren um solche, die nicht mehr in der Lage sind, sich in den damit transfizierten Zellen zu replizieren. Neben den viralen Vektoren können auch nicht-virale Vektoren, z.B. eukaryontische Expressionsvektoren, in die Zellen oder Gewebe eingebracht werden. Die Vektoren oder Plasmide umfassen vorzugsweise einen eukaryotischen Promotor, der in dem Säugetier aktiv ist.

Anwendungen

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich erfindungsgemäß in vorteilhafter Weise zum Beispiel zur Verwendung in der Medizin, z.B. zur Therapie oder Diagnostik oder in der Kosmetik, insbesondere wenn bei den Verfahren Nukleinsäuren in Zellen oder Gewebe eingebracht werden müssen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zellen oder Geweben, die durch die Einbringung der Nuklei nsäure-Komplexe behandelt werden sollen, um Zellen und/oder Gewebe eines Säugetiers, z.B. um Zellen und/oder Gewebe von Mensch, Ratte, Hamster, Meerschweinchen, Hund, Katze, Pferd, Rind, Schwein, Schaf, Ziege und anderen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dient die Zusammensetzung der Einbringung von Nukleinsäure in menschliche Zellen und/oder Gewebe.

Gewebe, in die Nukleinsäuren erfindungsgemäß eingebracht werden können, umfassen z.B. Epithelgewebe, Bindegewebe und Muskelgewebe. Für die Einbringung ist die Einbringung in die Haut, insbesondere in die Epidermis, Dermis und/oder Subkutis bevorzugt. Auch die Einbringung über andere Epitheltypen (z.B. Darmepithel) ist bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die Einbringung der Nukleinsäuren in Zellen, die an der Ausbildung von Haaren beteiligt sind. Soweit es sich um menschliche Zellen handelt, sind diese vorzugsweise keine embryonalen Stammzellen.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische bzw. kosmetische Zusammensetzung wird dazu mit den zu behandelnden Zellen und/oder Geweben in Kontakt gebracht. Dabei erfolgt der Kontakt mit den komplexierten Nukleinsäuren vorzugsweise ohne Verletzung der jeweiligen Gewebe- Oberfläche, wie z.B. der Haut des Säugetiers. In einer einfachen Ausführungsform der Erfindung wird die Zusammensetzung auf die Zellen und/oder Gewebe aufgetragen, z.B. durch Auftropfen oder Aufstreichen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Gewebe, das für die Aufnahme der erfindungsgemäß komplexierten Nukleinsäure vorgesehen ist, um Epithelgewebe eines Säugetiers, beispielsweise die Haut eines Säugetiers.

Abhängig von den Zellen oder Geweben, in die die komplexierten Nukleinsäuren eingebracht werden sollen, sowie von der Größe und Menge der Nukleinsäuren wird die Verweildauer der (pharmazeutischen oder kosmetischen) Zusammensetzung auf den Zellen oder Geweben in der Regel im Bereich von Minuten oder Stunden liegen. Bei einigen Anwendungen kann es allerdings auch vorteilhaft sein, eine Verweildauer von mehreren Tagen vorzusehen, insbesondere wenn das Einbringen einer großen Menge Nukleinsäure in die Zellen oder Gewebe erwünscht ist. Anwendungen, bei denen eine längere Verweildauer eingestellt werden kann, betreffen insbesondere die Einbringung von Nukleinsäuren in tiefere Hautschichten, wie z.B. in die Dermis oder Subcutis.

Bei der Einbringung der komplexierten Nukleinsäure in die Zellen und/oder Gewebe, insbesondere in die Haut, kann es erforderlich oder zweckmäßig sein, die Auftragung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung einmal oder sogar mehrfach zu wiederholen. Vorzugsweise wird die Auftragung mindestens 2, 3, 4, 5, oder mindestens 7 Mal, z.B. im Verlaufe einer Woche wiederholt, bis die intrazelluläre Konzentration der Nukleinsäure in den Zellen bzw. in den Zellkernen ausreichend hoch ist. Ein einmaliges Auftragen kann jedoch ebenso ausreichend sein.

Eine besonders geeignete Aufbringungsform der in DMSO gelösten komplexierten Nukleinsäure sind dermale oder transdermale Pflaster. Durch die Verwendung von Pflastern, die ein Depot für die in DMSO gelösten komplexierten Nukleinsäure verfügen, lässt sich über einen größeren Zeitraum ein Kontakt mit der behandelten Haut erreichen und somit eine kontinuierliche Aufnahme der Nukleinsäuren bewirken.

Erfindungsgemäß komplexierte Nukleinsäure können durch Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung beispielsweise in Gewebezellen der Epidermis, Dermis und Subcutis eingeschleust werden.

Im Zuge der guten Aufnahme der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in verschiedene Zell- und Gewebetypen, können die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung im Prinzip auf jede dem Fachmann bekannte Art und Weise verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können beispielsweise parenteral, enteral, und/oder topisch verabreicht werden. Verabreichungswege umfassen daher zum Beispiel die intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intradermale oder transdermale Verabreichung, orale oder rektale Verabreichung, epikutane, dermale, inhalative, nasale, oder intranasale Verabreichung. Besonders bevorzugt sind die topische, dermale, und/oder transdermale Verabreichung.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind hinsichtlich der Zusammensetzungen eine oder mehrere oder alle der folgenden Bedingungen erfüllt:

a) die Zusammensetzung umfasst kein Erdöl, Mineralöl, Mineralöldestillat, Leichtöl, Schweröl, Toluol, Benzol, mineralisches Fett, Treibstoffe, Dieselkraftstoff, und/oder Benzin,

b) sind die organischen Kationen im Komplex mit der Nukleinsäure nicht identisch mit dem pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoff, c) umfasst die Zusammensetzung keine synthetischen artifiziellen organischen Polymere,

d) umfasst die Zusammensetzung nicht parallel ein Triglyzerid, Phospholipid, Cholesterin und/oder Cholesterinester, e) befinden sich die in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation nicht im Inneren einer Micelle, eines Liposoms oder eines Nanopartikels, und/oder f) sind die in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation nicht an der Oberfläche einer Micelle, eines Liposoms und/oder eines Nanopartikels adsorbiert sind.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein pharmazeutisches oder kosmetisches Behandlungsverfahren an einem Patienten bzw. ein Verfahren zur Einbringung mindestens einer Nukleinsäure in Zellen und/oder Gewebe einen Patienten, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:

a) In-Kontakt-Bringen einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit Zellen und/oder Cewebe(n) eines Patienten.

Der Patient kann ein Mensch oder ein Tier sein. Insbesondere kann das Tier ein Säugetier sein.

Figuren

Fig. 1 zeigt die Löslichkeit von CTAB-DNA in DMSO/Wasser-Gemischen unterschiedlicher Verhältnisse.

Fig. 2 EtBr-CTAB-DNA in DMSO ist in jeden getesteten Mischungsverhältnis (9-67%) mit Ethylen- und Propylenglykol vollständig in einer Phasen löslich. Linke Seite: Propylenglycol; Rechte Seite: Ethylenglycol. Oben: Raumlichtaufnahme; Unten UV- Lichtaufnahme. Der DMSO Anteil nimmt von links nach rechts jeweils zu (9%, 1 7%, 33%, 50% und 67% (v/v)).

Fig. 3 Dünnschicht der Maushaut nach Behandlung mit FAM-Oligo in DMSO-Propylenglykol.

Drei Tage nach Auftragung von 10μ1 der Zusammensetzung. Oben grüner Kanal (FAM- Oligo-Fluoreszenz). Oben, links Übersicht die grüne Färbung (helle Punkte) zeigt das eingedrungene FAM-Oligo an. Oben, rechts Detail der quergeschnittenen Haarwurzel mit Zellkernen, die das FAM-Oligo aufgenommen haben. Unten blauer Kanal (Bisbenz- Fluoreszenz - Zellkernfärbung). Unten, links Übersicht die blaue Färbung (helle Punkte) zeigt die Zellkerne an. Unten, rechts Detail der quergeschnittenen Haarwurzel mit Zellkernen.

Fig. 4 Dünnschicht der Maushaut nach Behandlung mit FAM-Oligo in DMSO. Drei Tage nach Auftragung von 10μΙ der Zusammensetzung. Grüner Kanal (FAM-Oligo- Fluoreszenz).Oben, links Übersicht: die grüne Färbung zeigt das eingedrungene FAM- Oligo an. Detail mehrerer längs angschnittener Haare. Im unteren Bereich des Haarschaftes (helle Stäbchen) zeigen konzentrisch angeordnete helle Punkte. Dies sind die Zellkerne des Haarwurzelzellen, in denen das grün-fluoeszierende Oligonukleotid eingedrungen ist.

Fig. 5 Fotografie einer Maus vier Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Propylenglycol-Formulierung.

Fig. 6 Fotografie einer Maus vier Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Propylenglycol-Formulierung.

Fig. 7 Fotografie einer Maus drei Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Ethanol-Rizinus-Formulierung.

Fig. 8 Fotografie einer Maus drei Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Ethanol-Rizinus-Formulierung.

Fig. 9 Fotografie einer Maus fünf Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (Tyrosinase) (SEQ ID NO: 2) in DMSO-Ethanol-Rizinus-Formulierung.

Fig. 10 Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen eines Dünnschnitts eines Hautbereichs fünf Wochen nach Behandlung mit siRNA-1 (SEQ ID NO: 2) in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol. Es ist ein Hautbereich präpariert, der den Übergang zwischen der haarlosen und dem behaarten Bereich zeigt. Flg. 10A: Darstellung der Zellkerne mit Bisbenzimid. Fig. 10B: Darstellung von Tyrosinase mittels anti-Tyrosinase- Antikörpern. Die folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulichen weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf diese spezifischen Ausführungsbeispiele beschränkt ist.

Beispiel 1

Vergleich der Löslichkeit von CTAB-DNA in verschiedenen organischen Lösungsmitteln

In 1 ,7ml Kunststoffröhrchen wurde je 250μΙ einer 1 % (w/v) Lachssperma-DNA - entsprechend 2,5mg - in Wasser eingefüllt. Die DNA wurde mit einem gleichem Volumen 1 00mM CTAB ausgefällt und der Niederschlag durch Zentrifugation (5min, 10.000 x g) präzipitiert. Das Pellet wurde in 500μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde über Nacht im Speedvac getrocknet. In jedes Röhrchen wurde ein Volumen von 1 ml unterschiedlicher Lösungsmittel eingefüllt und das CTAB-DNA-Pellet über Nacht geschüttelt (800 Upm). Die Röhrchen wurden erneut zentrifugiert und die Abwesenheit eines Niederschlags wurde als Nachweis sehr guter Löslichkeit der CTAB-DNA in dem entsprechenden Lösungsmittel gewertet.

Löslichkeit von CTAB-DNA in verschiedenen Lösungsmitteln

Beispiel 2

Vergleich der Löslichkeit von CTAB-DNA in DMSO/Wasser Mischungen

In elf 1 ,7ml Kunststoffröhrchen wurde je 250μΙ einer 1 % (w/v) Lachssperma-DNA - entsprechend 2,5mg - in Wasser eingefüllt. Die DNA wurde mit einem gleichem Volumen 100mM CTAB ausgefällt und der Niederschlag durch Zentrifugation (5min, 10.000 x g) präzipitiert. Das Pellet wurde in 500μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde über Nacht im Speedvac getrocknet. In jedes Röhrchen wurde ein Volumen von 1 ml unterschiedliche Mischung von DMSO mit Wasser eingefüllt und das CTAB- DNA-Pellet über Nacht geschüttelt (800 Upm). Die Röhrchen wurden erneut zentrifugiert und die DNA im Überstand durch Messung der Absorption bei 260nm bestimmt. Es zeigte sich, dass die Löslichkeit der in Wasser gering ist und ab einer DMSO-Konzentration von 80% (v/v) stark zunimmt. % DMSO 0 10 20 30 50 60 70 80 90 95 100

260nm 0,218 0,235 0,222 0,227 0,145 0,128 0,144 0,655 2,862 3,003 2,896

% von max 7,5 8,1 7,7 7,9 5,0 4,4 5,0 22,6 98,8 103,7 100,0

Beispiel 3

Bestimmung der CTAB-DNA-Partikelgröße in DMSO-Wasser Mischungen

Für die Einbringung der Nukleinsäuren in Säugerzellen über die Haut ist die Partikelgröße der CTAB-DNA-Partikel von Bedeutung. Kleinere Partikel können leichte die Haut durchdringen und von der Zellmembran aufgenommen werden. Daher wurde die CTAB-DNA-Partikelgröße mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt.

200μΙ einer 1 % (w/v) Lachssperma-DNA - entsprechend 2mg - in Wasser wurden in ein 2ml Röhrchen eingefüllt. Die DNA wurde mit einem gleichem Volumen 100mM CTAB ausgefällt und der Niederschlag durch Zentrifugation (5min, 10.000 x g) präzipitiert. Das Pellet wurde in 500μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde über Nacht im Speedvac getrocknet. In das Röhrchen wurde ein Volumen von 2ml DMSO eingefüllt und das CTAB-DNA-Pellet über Nacht geschüttelt (800 Upm). Es entstand eine klare Lösung. Die CTAB- DNA-Lösung in DMSO wurde 1 :10 mit DMSO und Wasser verdünnt, so dass verschiedene DMSO-Wasser-Mischungen im Konzentrationsbereich mit einem DMSO-Gehalt (v/v) zwischen 10 - 100% entstanden. Je 0,5 ml der verschiedenen CTAB-DNA Lösungen in den DMSO- Wasser Mischungen wurde in Kunststoffküvetten überführ und die die Partikelgröße mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung mit einem Zetasizer (Malvern Instruments GmbH, 71083 Herrenberg) gemessen.

Es ergab sich bei hohen DMSO-Konzentrationen größer als 80% (v/v) DMSO ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 10nm, der sich bei zunehmendem Wassergehalt auf mehr als das 10fache erhöhte. DMSO H20

Konzentration mittlerer Konzentration

Vol. Konz. Partikeldurchmesser Vol. Konz.

% (v/v) Nm (SD) % (v/V)

10 227 (6,7) 90

20 139 (7,1 ) 80

33 154 (5,5) 66

40 183 (6,2) 60

50 168 (4,0) 50

60 8 (3) 40

60 10 (3,1 ) 40

70 60 (4,5) 30

80 7 (1 ,5) 20

90 13 (2,1 ) 10

100 10 (1 ,2) 0

Beispiel 4

Bestimmung der Löslichkeit von CTAB-DNA in DMSO-Glycol Mischungen

20mg Lachssperm-DNA wurde in einem 50ml Röhrchen in 10ml Wasser gelöst. Die entstandene DNA-Lösung wurde mit dem gleichen Volumen 100mM CTAB versetzt, das 2mg Ethidiumbromid (EtBr) enthielt. Es entstand ein roter Niederschlag, der durch 15min Zentrifugation mit 5000 xg abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag durch Suspension in 10ml Wasser und erneute Zentifugation gewaschen. Der Niederschlag (EtBr-CTAB-DNA) über Nacht im Speedvac getrocknet und in 10ml DMSO gelöst. Zur Bestimmung der Mischbarkeit von CTAB-DNA in DMSO mit Glycolen wurde in fünf 1 ,7ml Röhrchen je 500μΙ Ethylenglycol bzw. Propylenglycol vorgelegt und mit unterschiedlichen Volumina EtBr-CTAB-DNA in DMSO versetzt, gemischt und 5min bei 10000 xg zentrifugiert. Die Proben wurden bei Raumlicht und UV-Licht fotografiert. Es zeigte sich, dass die DMSO- gelöste EtBr-CTAB-DNA in allen getesteten Mischungsverhältnissen mit Ethylenglycol und Propylenglycol mischbar war. Weder eine Phasentrennung noch ein Niederschlag war zu beobachten.

Beispiel 5

Herstellung von CTAB-Oligonukleotiden

Folgende Oligonukleotide wurden für die transdermale Verabreichung an menschliche Haut bzw. Mäusehaut vorgesehen.

Ein Oligonukleotid (3'-GAT CCT GCA TAT GGT AGT G -5', SEQ ID NO: 1 ) Molekulargewicht 5938,82g/Mol ) wurde mit dem fluoreszenten Farbstoff Fluorescein (6FAM) (Oligonukleotid 1 ) bzw. TAMRA (Oligonukleotid 2) markiert, um einen Nachweis des Oligonukleotids in den Hautzellen zu ermöglichen. Die Oligonukleotide wurden von der Firma Biolegio (Nijmegen, Niederlande) bezogen.

Zur Herstellung von CTAB-Oligonukleotid-Komplexen wurde 1 mg der Oligonukleotide in 200μΙ Wasser gelöst und mit 400μΙ 10mM CTAB versetzt. Die Probe wurde 30min auf Eis inkubiert und der entstandene Niederschlag 5min bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgezogen und der Niederschlag mit 200μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wurde über Nacht im Speedvac getrocknet und danach in 200μΙ DMSO aufgenommen. Unter der Annahme einer 100% Fällungseffizienz enthält die DMSO-CTAB- Oligonukleotid-Lösung 5 §/μΙ Oligonukleotid.

Für die Aufbringung der CTAB-Oligonukleotide wurden folgende Verdünnungen hergestellt: Mischung l : 1 μβ μΙ CTAB-Oligonukleotid in 10% DMSO mit 20% Ethanol, 70% Ethylenglycol

Mischung 2 1 g μΙ CTAB-Oligonukleotid in 50% DMSO mit 50% Propylenglykol

Mischung 3 1 g μΙ CTAB-Oligonukleotid in 33% DMSO mit 67% Rizinusöl

Mischung 4 1 μ^μΐ CTAB-Oligonukleotid in 50% DMSO mit 50% Ethanol

Mischung 5 1 pg/pl CTAB-Oligonukleotid in 5% DMSO mit 15% Ethanol, 80% Riz

Die Prozentangaben sind jeweils in (v/v) angegeben.

Bemerkung: Der Hilfsstoff kann im Zusammenhang mit dieser Erfindung zwei besondere Eigenschaften vermitteln: A) Er verdünnt das DMSO, das in hohen Konzentration zu Hautreizungen führen kann und B) er verstärkt die Aufnahme der CTAB-Komplexe in die Haut und die Hautzellen. Öle, Glykole und Ethanol erfüllen diese Merkmale.

Beispiel 6

Einbringen von DNA in murine Hautzellen

Mäuse wurden für die dermale Applikation der Zusammensetzungen durch Rasur eines Fellbereichs im Nacken vorbereitet. Es wurden jeweils 10 μΙ der Zusammensetzung auf eine Fläche von ca. 1 cm² aufgetragen. In einigen Fällen wurde die Auftragung nach zwei Tagen wiederholt.

Die Präparation des behandelten Hautbereichs erfolgte nach 2 Tagen nach der letzten Auftragung. . Die Präparate wurden in flüssigen Stickstoff eingefroren, und es wurden Dünnschnitte mit einer Dicke von etwa 8 pm für die Fluoreszenzmikroskopie hergestellt. In einigen Fällen erfolgte eine Kernfärbung mit Bisbenzimid (5min, 1 pg/ml in PBS). Die Auswertung der Fluoreszenzmikroskopie zeigte nach 2 Tagen Zellkerne von Epidermiszellen und von Zellen der Haarfollikel und Bulge-Region, die durch das Fluoreszein-markierte Oligonukleotid grün erschienen. Bereits nach einer einmaligen Auftragung war das markierte Nukleotid in den im Hautgewebe und den Hautzellen nachweisbar.

In folgenden Zelltypen konnte die Fluoreszenz-markierte Oligonukleotid-DNA nachgewiesen werden: Haarbulge- und Haarwurzelzellen, Bindegewebszellen der Haut, Kapillarzellen, Muskelzellen, Epidermiszellen. Beispiel 7

Herstellung von Oligonukleotiden zur Beeinflussung des Haarwachstums und Pigmentbildung der Haut

siRNAs wurden als doppelsträngige Produkte mit 3' Desoxythymidinüberhängen (dTdT) von Eurofins MWG Operon (85560 Ebersberg, Deutschland) bezogen. siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) (5'-CUA UCU GAA UCA GAU UCU A dTdT-3'; SEQ ID NO:

2) , mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende und entsprechend komplementären RNA- Gegenstrang ebenfalls mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende. siRNA-2 (unspezifische Kontrolle) (5'-GCU GAC CCU GAA GUU CAU C dTdT-3'; SEQ ID NO:

3) , mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende und entsprechend komplementären RNA- Gegenstrang ebenfalls mit zwei Desoxythymidinen am 3'-Ende.

Beispiel 8

Herstellung von komplexierter siRNA in Ethanol/Rizinusöl

2mg der siRNA-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 2) (Tyrosinase-spezifisch) und 2 (unspezifische Kontrolle; SEQ ID NO: 3) wurden jeweils in 200μΙ Wasser gelöst und mit 600μΙ 10mM Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung gemischt. Es entstanden eine weiße Trübungen, die durch 5min Zentrifugation bei 10.000 xg niedergeschlagen wurden. Die Überstände wurden verworfen und die Niederschläge in je 200μΙ Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Niederschläge unter Vakuum getrocknet. Zu den Niederschlägen wurde zunächst 200μΙ Ethanol gegeben und die Suspension gevortext. Die Suspension blieb trübe. In 200μΙ Schritten wurde weiterer Ethanol zugefügt und gemischt. Bei der Zugabe von insgesamt 1200μΙ Ethanol war die komplexierte siRNA komplett gelöst. 50μΙ, 10ΟμΙ, 200μΙ der komplexierten siRNA in Ethanol wurden mit 950μΙ, 900μΙ und 800μΙ Rizinusöl (Gesamtvolumen jeweils 1 ml) durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Es entstanden klare Lösungen mit siRNAs.

Beispiel 9

Herstellung von komplexierter siRNA in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol

2mg der siRNA-Oligonukleotid 1 (SEQ ID NO: 2) und 2 (SEQ ID NO: 3) wurden jeweils in 200μΙ Wasser gelöst und mit 600μΙ 10mM Cetylammoniumbromid-Lösung gemischt. Es entstand eine weisse Trübung, die durch 5min Zentrifugation bei 10.000 xg niedergeschlagen wurde. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag in 200μΙ Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Niederschlag unter Vakuum getrocknet. Der Niederschlag (Cetylammonium-siRNA) wurde in 200μΙ Dimethylsulfoxid aufgenommen. 10μΙ, 20μΙ und 50μΙ der komplexierten siRNA in Dimethylsulfoxid wurde mit 90μΙ, 80μΙ und 50μΙ Propylenglykol (Gesamtvolumen jeweils 100μΙ) gemischt. Es entstanden klare Lösungen mit gelösten siRNAs .

Beispiel 10

Effekt von dermaler Applikation lipophilen siRNA-1 (Tyrosinase-spezifischen)-Komplexen in Mäusen

14 Mäuse wurden zur Untersuchung des Effekts von lipophilen siRNA-Tyr-Komplexen verwendet. 3 Mäusen wurden auf die unrasierte Kopf- bzw. Rückenhaut je 20μΙ der in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol gelösten siRNA-1 (Proben 1 d, 1 f und 1 g aus Beispiel 12) aufgetragen. 3 weiteren Mäusen wurden auf die unrasierte Kopf- bzw. Rückenhaut je 20μΙ der in Ethanol/Rizinusöl gelösten siRNA-1 (Proben 1 a, 1 b und 1 c des Beispiel 1 1 ) aufgetragen. 3 weiteren Mäusen wurden auf die gleichen Stellen je 20μΙ der in Ethanol/Rizinusöl gelösten siRNA 2 (unspezifische Kontrollen, Proben 2a, 2b und 2c des Beispiel 1 1 ) und 3 weiteren Mäusen die in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol gelöste siRNA 2 (unspezifische Kontrolle, Proben 2d, 2f und 2g des Beispiel 12) aufgetragen. Als weitere Kontrollen wurde unkomplexierte siRNA-1 unmittelbar in sterilem TE (10mM TrisCI, pH8, 2mM EDTA) bzw. TE mit 20% (v/v) Dimethylsulfoxid zu einer Endkonzentration an siRNA-1 von 2 g l gelöst und je 20μΙ dieser Lösung ebenfalls auf jeweils eine Maus aufgebracht. Danach wurden die Mäuse mit Wasser und Trockenfutter ad libitum gehalten. Nach ca. 2 Wochen färbten sich die Haare der Mäuse, die mit siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) behandelt waren, weiß und fielen aus. Die Haare der zur Kontrolle mit siRNA-2 wie auch die mit unkomplexierter siRNA-1 behandelten Mäuse blieben unverändert dicht und schwarz. Nach weiteren 3 Wochen wuchsen die Haare, der mit siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) wieder nach, so dass der Effekt nach ca. 7 Wochen nach Applikation vollkommen aufgehoben war. Abgesehen von der Haarveränderung war keine Abweichung der mit siRNA-1 (Tyrosinase-spezifisch) behandelten Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtbar. Über den gesamten Zeitraum waren die Mäuse vital und zeigten keinerlei pathologische Veränderungen.

Beispiel 1

Nachweis der Reduktion der Tyrosinase in Dünnschnitten siRNA-1 behandelter Hautbereiche Zum Nachweis der spezifischen Reaktion der Tyrosinase-spezifischen siRNA-1 wurde das Tyrosinase-Protein in der Haut der behandelten Mäuse in Dünnschnitten mittels Anti- Tyrosinase-Antikörpern untersucht. Dazu wurde eine Maus, die mit komplexierter siRNA-1 in Dimethylsulfoxid/Propylenglycol (20%:80%) behandelt worden war, nach 5 Wochen getötet und ein Hautbereich heraus geschnitten, der sowohl einen Teil eines haarlosen wie auch einen Teil behaarten Hautbereich einschloss. Als Kontrolle wurde ein Hautbereich verwendet, der nicht mit komplexierter siRNA-1 behandelt worden war. Die Hautfragmente wurden über Nacht bei 4°C in PBS mit 10% Formaldehyd fixiert, in Flüssigstickstoff eingefroren und in 8 pm Dünnschnitte geschnitten. Die Schnitte wurden in 1 zu 200 in PBS verdünnten Kaninchen anti- Tyrosinase-Antikörpern (Antibody-online.com, Atlanta, GA 30346, USA) 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden in PBS gespült und mit Rhodamin-gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörpern 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf wurden die Schnitte mit PBS gespült und zur Kernfärbung mit 2pg/ml Bisbenzimid in PBS inkubiert. Darauf wurden die Schnitte wieder mit PBS gespült und mit einem Tropfen Fluoromount eingedeckelt. Die Dünnschnitte wurden mittels Fluorezenzmikroskop ausgewertet. Es zeigte sich in den Kontrollen, die nicht mit komplexierter siRNA-1 behandelt worden waren eine deutliche rote Fluoreszenz in Bereich der Haarzellen und Epithelzellen. Die rote Fluoreszenz zeigt das Vorhandensein von Tyrosinase in den Dünnschnitten an. Hautbereiche, die mit komplexierter siRNA-1 behandelt waren, zeigten keine bzw. stark reduzierte rote Fluoreszenz.

Claims

Patentansprüche

1 . Pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung umfassend:

a) in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation; und

b) mindestens einen pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträglichen Hilfsstoff.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 , wobei die Nukleinsäure derart komplexiert ist, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäure durch organische Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind, insbesondere wobei das Molverhältnis zwischen den anionischen Ladungen der mindestens einen Nukleinsäure und den Ladungen der organischen Kationen im Wesentlichen 1 :1 beträgt.

3. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung eine Nukleinsäurekonzentration von mehr als 1 pg/ml, vorzugsweise mehr als 10 g/ml, besonders bevorzugt mehr als 100 pg/ml aufweist.

4. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die organischen Kationen quartäre Amine umfassen, insbesondere wobei die organischen Kationen Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) umfassen.

5. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der mindestens eine Hilfsstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Füllstoffe, Lösungsmittel, Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Netzmittel, Antischaummittel, Salzbildner, Puffer, Gelbildner, Verdickungsmittel, Filmbildner, Bindemittel, Umhüllungsmittel, Zerfallsbeschleuniger, Adsorptionsmittel, Gleitmittel, Schmiermittel, Formentrennmittel, Fließregulierungsmittel, Antioxidantien, Konservierungsstoffe, Süßungsmittel, Geschmackskorrigientien, Geruchskorrigentien, und Färbemittel.

6. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Hilfsstoff aus einem primärer Alkohol, insbesondere Ethanol besteht.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Hilfsstoff aus einem mehrwertigen Alkohol, insbesondere Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder einem Polyethylenglycol besteht.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Hilfsstoff aus einem Öl, Wachs oder Fett besteht, insbesondere wobei der Hilfsstoff Rizinusöl ist.

9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung einen Öl-, Wachs oder Fettanteil von mehr als 30%, vorzugsweise mehr als 50%, besonders bevorzugt mehr als 80% (v/v) besitzt.

10. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der DMSO-Gehalt der Zusammensetzung zwischen 2% bis 95%, bevorzugt zwischen 5% bis 90% (v/v), besonders bevorzugt zwischen 10% und 60% (v/v) liegt.

1 1 . Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei:

a) die Zusammensetzung kein Erdöl, Mineralöl, Mineralöldestillat, Leichtöl, Schweröl, Toluol, Benzol, mineralisches Fett, Treibstoffe, Dieselkraftstoff, und/oder Benzin umfasst,

b) die organischen Kationen im Komplex mit der Nukleinsäure nicht identisch mit dem pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoff sind, c) die Zusammensetzung keine synthetischen artifiziellen organischen Polymere umfasst,

d) die Zusammensetzung kein Triglyzerid, Phospholipid, Cholesterin und/oder Cholesterinester umfasst,

e) sich die in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation nicht im Inneren einer Micelle, eines Liposoms oder eines Nanopartikels befinden, und/oder f) die in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation nicht an der Oberfläche einer Micelle, eines Liposoms und/oder eines Nanopartikels adsorbiert sind.

12. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung einen Wasser-Anteil von etwa 50% (v/v) oder weniger, vorzugweise von etwa 40% (v/v) oder weniger, vorzugweise von etwa 30% (v/v) oder weniger, vorzugweise von etwa 20% (v/v) oder weniger, vorzugweise von etwa 15% (v/v) oder weniger, vorzugweise von etwa 10% (v/v) oder weniger, vorzugweise von etwa 5% (v/v) oder weniger, oder besonders bevorzugt von etwa 0% umfasst.

13. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Komplexe einen mittleren Durchmesser von weniger als 200nm, bevorzugt weniger als 100nm, besonders bevorzugt weniger als 50nm besitzen.

14. Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen oder Gewebe, insbesondere zur Verwendung bei der Einbringung von Nukleinsäure in Zellen der Epidermis, Dermis und/oder Subcutis.

15. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung umfassend in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation, und mindestens einen pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträglichen Hilfsstoff, insbesondere zur Herstellung einer der Zusammensetzungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Bereitstellen von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation,

b) Lösen der Komplexe in DMSO oder DMSO-haltigem Lösungsmittelgemisch, und c) Zusetzen eines pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoffs zu der DMSO-Lösung oder dem DMSO-haltigen Lösungsmittelgemisch mit den darin gelösten Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation, soweit das DMSO-haltige Lösungsmittelgemisch nach b) nicht bereits den pharmazeutisch oder kosmetisch verträglichen Hilfsstoff enthält.