DE102004045186B4

DE102004045186B4 - Liposomen, die die intrazelluläre Penetration von Wirkstofen stimulieren, deren Verwendung zur Herstellung von topischen pharmazeutischen bzw. kosmetischen Zusammensetzungen, die diese Liposomen enthalten sowie ein Screening-Verfahren zum Auffinden von Substanzen zur Stimulierung der intrazellulären Penetration

Info

Publication number: DE102004045186B4
Application number: DE102004045186A
Authority: DE
Inventors: Valérie ANDRE; Isabelle Bonnet; Eric Perrier
Original assignee: Engelhard Lyon SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2004-05-25
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2011-08-18
Anticipated expiration: 2024-09-18
Also published as: JP4950419B2; DE102004045186A1; GB0422048D0; ES2268946B2; KR20050112498A; US20050266065A1; FR2870741B1; JP5220546B2; US9655822B2; JP2005350445A; GB2415375A; ES2268946A1; JP2009108056A; DE102004045186B9; KR100697361B1; GB2415375B; FR2870741A1

Abstract

Verwendung von Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, zu stimulieren, und die ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst; oder b) einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R1R2R3), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R1 und R2 unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R3 ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; als kosmetisches Mittel, das die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff stimuliert, zur Herstellung einer topischen kosmetischen Zusammensetzung; oder zur Herstellung einer topischen pharmazeutischen Zusammensetzung.

Description

Die Erfindung betrifft im Wesentlichen Liposomen, die eine Substanz enthalten, welche die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs begünstigt, der durch die Liposomen befördert wird. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, zu stimulieren, und die ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst; oder b) einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; als kosmetisches Mittel, das die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff stimuliert, zur Herstellung einer topischen kosmetischen Zusammensetzung; oder zur Herstellung einer topischen pharmazeutischen Zusammensetzung.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung Liposomen, welche mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; umfaßt, das die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, stimuliert.
Die Erfindung betrifft ferner kosmetische, dermokosmetische Zusammensetzungen, pharmazeutische oder dermopharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Liposomen gemäß Anspruch 17 in einer Mischung mit einem kosmetisch akzeptablen Träger umfassen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren gemäß Anspruch 27 zum Durchführen des Screenings nach mindestens einer Substanz die potentiell in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs zu stimulieren, die/der durch die Liposomen der vorliegenden Erfindung befördert wird.
Stand der Technik
Kürzlich wurden in dem Dokument US-A-6,071,535 (Hayward) kationische Liposomen, genannt CATESOMES^TM, beschrieben, die sowohl gegenüber dem pH als auch der Ionenstärke des umgebenden Mediums sehr sensitiv sind, und die aus Diaminfettalkylammoniumfettacylsalzen des Typs N_n,N_n-Dimethyl-1,n-diaminoalkyl aufgebaut sind, wobei das Diamin als DDA bezeichnet wird, und wobei der Alkylteil eine Anzahl an Kohlenstoffatomen n von zwischen 2 und 8 besitzt (siehe Spalte 5, Zeilen 37 bis 39), und wobei der Fett-acylierte Teil durch eine Fettsäure bereitgestellt wird, die 10 bis 30 Kohlenstoffatome besitzt, um eine Substanz, die als ADDA bezeichnet wird, zu bilden (Spalte 5, Zeilen 41 bis 48).
Für solche ADDA-Substanzen wird angegeben, dass sie unter dem Handelsnamen CATEMOL von der Fa. Phoenix Chemical, Somerville, New Jersey, USA, Referenz CATEMOL 220 und 260, kommerziell erhältlich sind.
Die CATESOMES werden gebildet, indem eine Fettsäure mit 10 bis 28 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt wird, zum Beispiel Behensäure, um sogenannte A-ADDA-Salze zu bilden, wobei die Mischung in einem äquimolaren Verhältnis und bei einem pH zwischen 6 und 10 hergestellt wird, um ein Salz zwischen der quaternären Amingruppe der ADDA-Substanz und der Carboxylgruppe der Fettsäure zu bilden (siehe Spalte 5, Zeile 66 bis Spalte 6, Zeile 4).
Dieses Hayward-Dokument zitiert weiterhin das Dokument US-A-4,721,612 , das herkömmliche Liposomen betrifft, deren Doppelschichten eine Salzform eines Sterols oder einer organischen Säure umfassen, wie die Tris-Salz-Form eines Sterolhemusuccinats (Spalte 5, Zeilen 13 bis 18).
In der DE 37 13 494 C2 wird ein Verfahren zur Herstellung einer Dispersion von Lipidkügelchen in einer wässrigen Phase beschrieben, wobei die Lipidkügelchen Kohlenwasserstoffketten mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen und eine oder mehrere hydrophile Gruppe(n), ausgewählt aus Hydroxy-, Etheroxid-, Carboxyl-, Phosphat- und Amingruppen, enthalten.
EP 1 304 160 A1 offenbart Liposomen oder Tröpfchen einer o/w-Emulsion mit einer Hüllschicht aus Polymeren.
EP 1 323 415 A1 betrifft ein Verfahren zur Beschichtung feiner Partikel mit einem Lipidfilm.
In der WO 2004/002454 A1 werden kolloidale Nanoaggregate beschrieben, die die Carboxylat-Form eines Camptothecin-Arzneimittels in Verbindung mit einem kationischen Molekül umfassen.
WO 00/53230 offenbart lamellare Partikel, die ein biokompatibles, biologisch abbaubares Polymer umfassen und die eine kationische Ladung auf ihrer Oberfläche tragen.
In der WO 98/46199 werden multilamellare Vesikel beschrieben, die eine Zwiebel-ähnliche Struktur und eingeschlossene kationische Proteinhydrolysate aufweisen. Es wird dabei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass es sich bei diesen multilamellaren Vesikeln nicht um Liposomen handelt.
US 2003/0073619 A1 betrifft ein biologisch abbaubares, nicht-toxisches Lipopolymer, das Polyethylenimin umfasst.
Mit US 2003/0044407 A1 werden kationische Liposomen zur Komplexierung von Antikörpern beschrieben.
US 5,154,854 offenbart die Verwendung von Lipidtröpfchen zur Stabilisierung einer Dispersion, wobei die Lipidtröpfchen eine oder mehrere Kohlenwasserstoffketten oder eine oder mehrere hydrophile Gruppen, wie z. B. Amine, enthalten.
Mit der DE 195 05 005 C2 wird ein Verfahren zur Herstellung kationisierter, pflanzlicher Proteinhydrolysaten und deren Verwendung zur Herstellung von oberflächenaktiven Mitteln beschrieben.
DE 691 16 144 T2 betrifft Liposomen mit an Protein gebundenen Aminresten.
In der DE 41 11 982 A1 werden Liposomenzubereitungen offenbart, die eine Mischung aus einem oder mehreren Lecithinen mit 1–90% fettsäureverestertem Collagenhydrolysat enthalten.
EP 0 437 479 beschreibt Liposomen, die in der Gegenwart von mindestens einem Zucker und wenigstens einem Protein, Polypeptid und/oder Oligopeptid hergestellt werden.
DE 692 07 603 T2 betrifft die Lipid-vermittelte Einführung von Makromolekülen in die Lunge zur Behandlung von zystischer Fibrose, wobei die Lipide kationisierte Proteine enthalten, die spontan mit DNA interagieren können.
Mit der DE 102 43 626 A1 wird ein Wirkstoffkomplex offenbart, der Liposome, einen die Penetration verstärkenden kosmetischen Rohstoff und ein Polymer enthält.
DE 100 63 433 A1 beschreibt die Verwendung von liposomenverkapselter Photolyase und liposomenverkapselter T4 Endonuclease als MMP-1-inhibierende Substanzen in kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitungen zur Vorbeugung gegen die lichtinduzierten Alterung der menschlichen Haut.
Norrie et al., 1982 (Analytical Biochemistry 127, 276–281) offenbart kationische Liposomen, die Stearylamine enthalten.
US 4,897,355 betrifft Liposomen, die mittels positiv geladener Lipide bestimmter Struktur gebildet werden.
Shia et al., 2001 (Biomaterials 22 (2001) 1627–1634) beschreibt eine Studie, in der kleine unilamellare Vesikel (SUV) eingesetzt wurden, die aus Phosphatidylcholin hergestellt und mit Kollagen beschichtet wurden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Hauptziel der Erfindung ist es, auf eine unerwartete Weise, das neue technische Problem zu lösen, das in der Bereitstellung neuer Liposomen besteht, die ein Erhöhen der intrazellulären Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhafterweise in die Zellen der Haut oder des Haares, ermöglichen, während gleichzeitig die Zytotoxizität oder die Induktion des Zelltods dieser Zellen limitiert wird. Ein weiteres Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, auf eine unerwartete Weise, das technische Problem zu lösen, das in der Bereitstellung neuer Liposomen besteht, die nicht nur die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhafterweise in die Zellen der Haut oder des Haares, fördern, sondern die es auch ermöglichen, einen relativ hohen Grad der Einkapselung der Substanz oder des Wirkstoffs in den Liposomen zu erzielen.
Ein weiteres Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, in einer unerwarteten Weise, das technische Problem zu lösen, welches in der Bereitstellung neuer kosmetischer oder dermokosmetischer, pharmazeutischer oder dermopharmazeutischer Zusammensetzungen besteht, die Liposomen enthalten, die eine ausgezeichnete intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhaft in die Zellen der Haut oder des Haares, aufweisen (ermöglichen), während gleichzeitig die Zytotoxizität oder die Induktion des Zelltods (oder Apoptose) dieser Zellen limitiert wird.
Ein weiteres Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, in einer unerwarteten Weise, ein neues technisches Problem zu lösen, welches in der Bereitstellung eines neuen Screeningverfahrens nach einer Substanz besteht, die potentiell wirksam ist, die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhafterweise in die Zellen der Haut oder des Haares zu verbessern, und vorzugsweise ebenfalls die Zytotoxizität oder die Induktion der Apoptose dieser Zellen auszuwerten.
All diese technischen Probleme werden erstmals gleichzeitig gelöst, in einer sicheren und zuverlässigen Weise, die in einem kosmetischen oder pharmazeutischen und in einem industriellen Maßstab genutzt werden kann.
Demnach stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt die Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 bereit, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, zu stimulieren, und die ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmomoamin das eine einzige C10–C13 Fettkette umfasst, vorzugsweise einem primären oder quaternären Monoamin, das eine einzige C10–C13 Fettkette umfasst;
b) einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist;

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1, sind die Liposomen dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein b) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus, quaternisierten Weizenproteinen, quaternisierten Reisproteinen, quaternisierten Sojaproteinen. Diese quaternisierten Polymere sind im allgemeinen kommerzielle Produkte und die Quaternisierung wird im allgemeinen durch Aufbringen von tertiären Aminen auf die chemischen Gruppen des Startpolymers erzielt.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 sind die Liposomen dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Monoamin a) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Decylamin, Undecylamin, Dodecylamin, Tridecylaminoder einer Mischung aus primären Aminen, wie Mischungen aus Kopraaminen, die eine Kohlenwasserstoffkette von C10 bis C13 besitzen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 enthalten die Liposomen Polyethylenimin.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 umfassen die Liposomen in der Lipidphase mindestens eine Substanz, der die Membran von Liposomen modifiziert, zum Beispiel ein polares Lipid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Triglycerid, einem polaren Phospholipid oder einem polaren Sphingolipid, einzeln oder in einer Mischung.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 ist das oben erwähnte polare Phospholipid ausgewählt aus Phosphatidylcholin oder Lecithin, Phosphatidylethanolamin oder Cephalin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin oder Cardiolipin, Phosphatidylinositol, einzeln oder in einer Mischung.
Vorteilhafterweise ist das polare Phospholipid ausgewählt aus einem Ceramid, einem Sphingophospholipid, einem Glycosphingolipid, einzeln oder in einer Mischung.
Gemäß einer anderen Variante der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 umfassen die Liposomen mindestens ein polares Lipid oder ein polares Sphingolipid, insbesondere in Form eines Salzes einer organischen Säure eines Sterols, wie dem Tris-Salz eines Sterolhemisuccinats.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 umfassen die Liposomen mindestens ein Lecithin in der Lipidphase, extrahiert aus einer natürlichen Quelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Soja, Raps, Sonnenblume, Lupine, Erdnuss, Sesam, Kürbis (”courge”; ”marrow”), Kleieöl, großsamiger Leimdotter (”caméline”; ”bigseed falseflax”), Ringelblume, Leinen (Flachs) und Hanf, einzeln oder in einer Mischung.
Gemäß einer anderen Ausführungsvariante der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 können die Liposomen ebenfalls eine Lipidphase umfassen, welche Cholesterol oder ein Derivat von Cholesterol, wie Cholesterolhemisuccinat, als eine Substanz, die die Membranen versteift, enthält.
Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 können die Liposomen in der Lipidphase mindestens ein Tensid oder eine Oberflächen-aktive Substanz, als eine Substanz, die die Membranen der Liposomen verflüssigt, umfassen.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 enthalten die Liposomen eine fluoreszierende Substanz, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration, insbesondere die intrazelluläre Penetration der Haut oder der Haare, im Wesentlichen inert ist, wobei ein gegenwärtig bevorzugtes Beispiel einer solchen fluoreszierenden Substanz 5-Pentafluorbenzoyl-aminfluorescein umfasst oder aus diesem aufgebaut ist, insbesondere in einem Verhältnis von ungefähr 0,01 Gewichts-% der Zusammensetzung, welche die Liposomen enthält.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 liegt die Konzentration der Substanz(en), welche die intrazelluläre Penetration stimuliert/stimulieren, zwischen 0,05 Gewichts-% und 25 Gewichts-% der Zusammensetzung, welche die Liposomen enthält, vorzugsweise zwischen 0,5 Gewichts-% und 2,5 Gewichts-% der Zusammensetzung.
Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 besitzt das oben erwähnte Fettmonoamin eine Kohlenstoffkette mit einer Länge von C10 bis C13. Vorteilhafterweise ist das oben erwähnte Fettmonoamin ein quaternisiertes primäres Monoamin, das eine einzige Fett-Kohlenstoffkette von von C10 bis C13.
Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 ist das quaternisierte Molekül, welches die intrazelluläre Penetration der Wirkstoffe begünstigt, ausgewählt aus einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen, bevorzugt aus Sojaproteinen, welche quaternisiert sind nach der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert, welches hydrolysiert ist oder nicht, hydroxyalkyliert, insbesondere hydroxypropyliert, ist oder nicht; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe, bevorzugt Methyl oder Ethyl, sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome und bevorzugt vor allem 12 Kohlenstoffatome (Lauryl) besitzt. Besonders bevorzugt ist das quaternisierte Pflanzenprotein der Formel R-N(R₁R₂R₃) Lauryldimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein oder Cocodimonium hydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Verwendung von Liposomen nach Anspruch 1 ist die Substanz oder der Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist, oder von diesen befördert wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-Radikalbildner, wie Vitamin E, einem Flavonoid, einem Carotinoid, Vitamin C; einer depigmentierenden Substanz, wie Catechin, Hydroquinon, Arbutin, Phytinsäure, Ellagsäure, Vitamin C; einer abbauenden (Schlankheits-)Substanz, wie mindestens einem Xanthin, einer Haut- oder Haar-pigmentierenden Substanz, wie Tyrosin, Tryptophan, Phenylanalin, einem Coleus-Extrakt.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung Liposomen nach Anspruch 17 bereit, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, zu stimulieren, und die ausgewählt ist aus einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist, wobei die Liposomen optional mindestens eine fluoreszierende Verbindung enthalten, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, zum Beispiel Pentafluorbenzoylaminofluorescein, die es ermöglicht, die Penetration sichtbar zu machen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 sind die Liposomen dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus quaternisierten Weizenproteinen, quaternisierten Reisproteinen und quaternisierten Sojaproteinen. Diese quaternisierten Polymere sind im allgemeinen kommerzielle Produkte und die Quaternisierung wird im allgemeinen durch Aufbringen von tertiären Aminen auf die chemischen Gruppen des Startpolymers erzielt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 enthalten die Liposomen Polyethylenimin.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 umfassen die Liposomen in der Lipidphase mindestens eine Substanz, der die Membran von Liposomen modifiziert, zum Beispiel ein polares Lipid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Triglycerid, einem polaren Phospholipid oder einem polaren Sphingolipid, einzeln oder in einer Mischung.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 ist das oben erwähnte polare Phospholipid ausgewählt aus Phosphatidylcholin oder Lecithin, Phosphatidylethanolamin oder Cephalin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin oder Cardiolipin, Phosphatidylinositol, einzeln oder in einer Mischung.
Vorteilhafterweise ist das polare Phospholipid ausgewählt aus einem Ceramid, einem Sphingophospholipid, einem Glycosphingolipid, einzeln oder in einer Mischung.
Gemäß einer anderen Variante der Liposomen nach Anspruch 17 umfassen die Liposomen mindestens ein polares Lipid oder ein polares Sphingolipid, insbesondere in Form eines Salzes einer organischen Säure eines Sterols, wie dem Tris-Salz eines Sterolhemisuccinats.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 umfassen die Liposomen mindestens ein Lecithin in der Lipidphase, extrahiert aus einer natürlichen Quelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus. Soja, Raps, Sonnenblume, Lupine, Erdnuss, Sesam, Kürbis (”courge”; ”marrow”), Kleieöl, großsamiger Leimdotter (”caméline”; ”bigseed falseflax”), Ringelblume, Leinen (Flachs) und Hanf, einzeln oder in einer Mischung.
Gemäß einer anderen Ausführungsvariante der Liposomen nach Anspruch 17 können die Liposomen ebenfalls eine Lipidphase umfassen, welche Cholesterol oder ein Derivat von Cholesterol, wie Cholesterolhemisuccinat, als eine Substanz, die die Membranen versteift, enthält.
Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 können die Liposomen in der Lipidphase mindestens ein Tensid oder eine Oberflächen-aktive Substanz, als eine Substanz, die die Membranen der Liposomen verflüssigt, umfassen.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 enthalten die Liposomen eine fluoreszierende Substanz, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration, insbesondere die intrazelluläre Penetration der Haut oder der Haare, im Wesentlichen inert ist, wobei ein gegenwärtig bevorzugtes Beispiel einer solchen fluoreszierenden Substanz 5-Pentafluorbenzoyl-aminfluorescein umfasst oder aus diesem aufgebaut ist, insbesondere in einem Verhältnis von ungefähr 0,01 Gewichts-% der Zusammensetzung, welche die Liposomen enthält.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 liegt die Konzentration der Substanz(en), welche die intrazelluläre Penetration stimuliert/stimulieren, zwischen 0,05 Gewichts-% und 25 Gewichts-% der Zusammensetzung, welche die Liposomen enthält, vorzugsweise zwischen 0,5 Gewichts-% und 2,5 Gewichts-% der Zusammensetzung.
Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 ist das quaternisierte Molekül, welches die intrazelluläre Penetration der Wirkstoffe begünstigt, ausgewählt aus einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen, bevorzugt aus Sojaproteinen, welche quaternisiert sind nach der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert, welches hydrolysiert ist oder nicht, hydroxyalkyliert, insbesondere hydroxypropyliert, ist oder nicht; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe, bevorzugt Methyl oder Ethyl, sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome und bevorzugt vor allem 12 Kohlenstoffatome (Lauryl) besitzt. Besonders bevorzugt ist das quaternisierte Pflanzenprotein der Formel R-N(R₁R₂R₃) Lauryldimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein oder Cocodimonium hydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Liposomen nach Anspruch 17 ist die Substanz oder der Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist, oder von diesen befördert wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-Radikalbildner, wie Vitamin E, einem Flavonoid, einem Carotinoid, Vitamin C oder deren Derivaten; einer depigmentierenden Substanz, wie Catechin, Hydroquinon, Arbutin, Phytinsäure, Ellagsäure, Vitamin C oder deren Derivaten; einer abbauenden (Schlankheits-)Substanz, wie mindestens einem Xanthin, einer Haut- oder Haarpigmentierenden Substanz, wie Tyrosin, Tryptophan, Phenylanalin, einem Coleus-Extrakt oder deren Derivaten.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch kosmetische oder dermokosmetische Zusammensetzungen, pharmazeutische oder dermopharmazeutische Zusammensetzungen, welche solche Liposomen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 der vorliegenden Erfindung umfassen, die mindestens eine Substanz umfassen, welche die intrazelluläre Penetration stimuliert, optional in einem kosmetisch, dermokosmetisch, pharmazeutisch oder dermopharmazeutisch akzeptablen Träger.
Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt und einige von ihnen sind in den zwei Dokumenten aus dem Stand der Technik zitiert, die in der Beschreibung des Standes der Technik angegeben wurden.
Andere Träger ergeben sich aus den Beispielen der kosmetischen, dermokosmetischen, pharmazeutischen oder dermopharmazeutischen Zusammensetzungen der folgenden Beschreibung, welche lediglich eine Illustration darstellt, und welche in keinster Weise den Gegenstand (”scope”) der Erfindung beschränken soll.
Gemäß einem nicht-beanspruchten Aspekt wird ein Verfahren zur kosmetischen Pflege offenbart, welches die topische Applikation einer Zusammensetzung auf die Haut oder das Haar umfasst, die Liposomen enthält, wie oben beschrieben oder wie sich aus der folgenden Beschreibung ergibt, welche unter Bezugnahme auf die Beispiele erfolgt, die einen integralen Teil der Erfindung darstellen.
Gemäß einem nicht-beanspruchten Aspekt wird ebenfalls ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung offenbart, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine topische Applikation einer Zusammenfassung auf die Haut oder das Haar umfasst, welche Liposomen, wie oben beschrieben oder die sich aus den Beispielen ergibt, enthält, wobei sie einen integralen Teil der Erfindung darstellen, in einer Menge, die ausreichend ist, um die nachgesuchte therapeutische Behandlung zu erzielen. Im allgemeinen umfassen die Liposomen mindestens einen Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder durch sie befördert wird, der eine Wirkung besitzt, die mit der nachgesuchten therapeutischen Behandlung in Verbindung steht.
Im Zusammenhang mit einer kosmetischen Pflege wird die Durchführung einer kosmetischen Pflege offenbart, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer anti-Falten-Pflege, einer anti-Oxidans-Pflege, einer abbauenden (Schlankheits-)Pflege (”amincissante”; ”slimming care”), einer Haut-bleichenden Pflege (”blanchissante de la peau”; ”skin paling care”), einer Haut- oder Haarpigmentierenden Pflege.
Im Zusammenhang mit einer therapeutischen Behandlung wird die Durchführung einer geeigneten therapeutischen Behandlung der Haut oder des Haares in Abhängigkeit von der zu behandelnden Pathologie (Symptomatik) offenbart.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung als kosmetische Substanzen, insbesondere zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, insbesondere für eine anti-Falten-Wirkung, eine anti-Oxidans-Wirkung, eine abbauende (Schlankheits-)Wirkung (”activité amincissante”; ”slimming activity”), eine Haut-bleichende Wirkung (”activité blanchissant de la peau”; ”skin paling activity”), eine Haut- oder Haarpigmentierende Wirkung oder zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für jeden dieser Fälle, die bevorzugt auf topischem Weg verabreicht werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Durchführen des Screenings nach mindestens einer Substanz, ausgewählt aus

a) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst; oder
b) einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist;

₁

₂

₃

₁

₂

₃

a) Zubereiten einer hydro-lipidischen Mischung, welche in der Lage ist, die die Liposomen der vorliegenden Erfindung, insbesondere Liposomen, die mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst; oder b) einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist, zu bilden;
b) Hinzugeben einer fluoreszierenden Verbindung, welche vorzugsweise in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, in diese hydro-lipidische Mischung vor dem Dispersionsprozess d);
c) Hinzugeben einer Testsubstanz, die aus der Substanz, die potentiell wirksam und in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration zu stimulieren, ausgewählt ist und einer Referenzsubstanz in die hydro-lipische Mischung, vor oder während des Dispersionsprozesses d);
d) Dispersionsprozess zur Zubereitung der Liposomen gemäß einem beliebigen geeigneten Verfahren aus der hydro-lipidischen Mischung, wie sie entweder oben in Schritt b) oder in Schritt c) erhalten wurde;
e) 2 bis 48 Stunden Inkubation der Zubereitung mit Fibroblasten;
f) Detektieren von mindestens der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung durch Messung der intrazellulären Fluoreszenz.

Gemäß einer anderen Ausführungsform des Verfahrens zum Durchführen des Screenings wird das Ergebnis der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung verglichen mit der intrazellulären Penetration, die mit einer Referenzsubstanz erzielt wird, insbesondere Polyethylenimin umfassend.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform des Verfahrens zum Durchführen des Screenings wird die Zytotoxizität und/oder die Induktion von Apoptose der potentiell aktiven Substanz gemessen, insbesondere auf Fibroblasten, bevorzugt normalen humanen Fibroblasten, in Kultur.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform des Verfahrens zum Durchführen des Screenings ist die fluoreszierende Verbindung, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, eine fluoreszierende Verbindung, die nicht spontan in die Fibroblasten in Kultur penetriert.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform des Verfahrens zum Durchführen des Screenings umfasst die fluoreszierende Verbindung Pentafluorbenzoylaminofluorescein oder ist Pentafluoraminofluorescein, welches bei einer Konzentration von 0,01 Gewichts-% der Endzusammensetzung, welche die Liposomen enthält, welche zur Auswertung der intrazellulären Penetration verwendet werden, verwendet wird.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens zum Durchführen des Screenings wird die fluoreszierende Verbindung in Gegenwart von Polyethylenimin hinzugefügt, wobei die fluoreszierende Verbindung und das Polyethylenimin in einer nicht cytotoxischen Konzentration vorliegen.
Die Erfindung betrifft ferner, gemäß einem weiteren Aspekt, die Verwendung von Liposomen, wie sie oben beschrieben sind oder wie sie sich aus den Beispielen, die einen integralen Teil der Erfindung darstellen, ergeben, als kosmetische Substanz oder zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, und insbesondere für eine anti-Falten-Wirkung, eine anti-Oxidans-Wirkung, eine abbauenden (Schlankheits-)Wirkung (”activité amincissante”; ”slimming activity”), eine Hautbleichende Wirkung (”activité blanchissante de la peau”; ”skin paling activity”), eine Haut- oder Haar-pigmentierende Wirkung.
Im Zusammenhang mit einem beliebigen der vorangehenden Aspekte können vorteilhafterweise Oberflächen-aktive Stoffe zu der hydro-lipidischen Mischung hinzugefügt werden, um die Membranen der Liposomen zu verflüssigen.
Die vorliegende Erfindung machte die Auswahl eines fluoreszierenden Indikators (”traceur”; ”tracer”) erforderlich, der nicht spontan, zum Beispiel in die Fibroblasten in Kultur, penetriert, und der selbst oder nach der Einkapselung in ein Liposom eine sehr geringe Zytotoxizität hervorruft, der mit einer großen Ausbeute in die Liposomen (zum Beispiel auf der Basis von Sojalecithin (ungefähr 80%), eingebaut wird, und der nach der Einkapselung stabil ist (keine Freisetzung und keine Veränderung der Fluoreszenz), und der keine Instabilität der Liposomen induziert. Der ausgewählte Indikator ist vorteilhafterweise 5-Pentafluorbenzoylaminofluorescein oder PFB-F bei einer Konzentration von 0,01%, d. h. 185 μM finaler Konzentration.
Vorteilhafterweise werden die Dispersionsverfahren zum Zubereiten der Liposomen bevorzugt ausgewählt aus Schermethoden, Ultraschall, Extrusion, Hydratation/Dehydratation (Lyophilisation), Einfrieren/Auftauen, reverser Phasen-Evaporation.
Die Gegenwart des Liposoms (lamellare Struktur) wird durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Größe der Liposomen wird durch Transmissionselektronenmikroskopie und Laserpartikel-Größenanalyse (Granulometrie) ausgewertet.
Vorteilhafterweise wird die Zubereitung der Liposomen bei einem pH von 4 bis 8, bevorzugt bei pH 6, vorgenommen.
Vorteilhafterweise erfolgt die beobachtete intrazelluläre Penetration eines Wirkstoffs bei Zellen der Haut.
Vorteilhafterweise hat die Penetration eines Wirkstoffs in die Zellen der Haut hauptsächlich Fibroblasten, Keratinocyten und Melanocyten zum Ziel.
Die Mittel zur Detektion der intrazellulären Penetration werden ausgewählt aus Verfahren zur Quantifizierung und Visualisierung, und sind vorzugsweise die Quantifizierung der Intensität der Fluoreszenz durch Spektrofluorometrie und die Visualisierung mittels optischer Epifluoreszenz-Mikroskopie (”visualisation en microscopie optique à épifluorescence”).
Vorteilhafterweise werden die Moleküle als wirksam angesehen, die erstens eine Stimulierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Indikators erzielen, mehr als 10% größer ist als die der Negativkontrolle seiend, kein kationisches Molekül enthaltend, und vorzugsweise äquivalent oder größer als die Positivkontrolle seiend, die ein kationisches Referenzmolekül, Polyethylenimin, welches bei 50 μM verwendet wird, enthält. Zweitens dürfen die ausgewählten Moleküle vorzugsweise keine zytotoxischen und/oder apoptotischen Phänomene induzieren oder zytotoxische und/oder apoptotische Phänomene induzieren, die geringer sind als solche des kationischen Referenzmoleküls (Polyethylenimin, verwendet bei 50 μM).
Vorteilhafterweise sind die wirksamen Moleküle, die zum Stimulieren der intrazellulären Penetration ausgewählt werden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einem primären oder quaternären Amin variabler Kohlenstoffkettenlänge, und vorteilhafterweise Decylamin, Undecylamin, Dodecylamin, Tridecylamin, o, oder einer Mischung aus primären Aminen, die eine Kohlenwasserstoffkette von C10 bis C13 aufweisen
b) quaternärisierten Pflanzenproteinen, insbesondere quaternärisierten Weizenproteinen, quaternärisierten Reisproteinen, oder quaternärisierten Sojaproteinen

Vorteilhafterweise ist die Stimulierung der intrazellulären Penetration optimal für Kohlenstoffketten mittlerer Länge (C10 bis C13).
Vorteilhafterweise ist die Stimulation der intrazellulären Penetration optimal für ein primäres Amin (zum Beispiel C10-NH₂), im Vergleich zu einem sekundären Amin, welches zum Beispiel die beiden gleichen Kohlenstoffketten umfasst (C10-NH-C10), aufgrund der induzierten sterischen Behinderung.
Vorteilhafterweise ermöglichen es bestimmte quaternisierte Polymere, einen besseren Stimulierungsfaktor der intrazellulären Penetration, zu erreichen, allein durch den Charakter des gewählten Polymers selbst, z. B. ist Lauryldimoniumhydroxypropyl von hydrolysiertem Weizenprotein ungefähr sechsmal weniger effizient als Lauryldimoniumhydroxypropyl von hydrolisiertem Sojaprotein.
Vorteilhafterweise sind die ausgewählten kationischen Moleküle weniger zytotoxisch und/oder induzieren weniger Apoptose als das verwendete Referenzmolekül, Polyethylenimin, verwendet bei 50 μM. Vorteilhafterweise wird die Quantifizierung der Zytotoxizität anhand eines Zell-Lebensfähigkeits-Tests vorgenommen, welcher die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zelle und eine Interleukin 1 alpha-Bestimmung auswertet. Die Apoptose wird durch die Quantifizierung von Caspase-1 ausgewertet.
Vorteilhafterweise werden die Liposomen, die gemäß dem oben beschriebenen erfinderischen Verfahren zubereitet werden, verwendet, um eine Erhöhung der intrazellulären Penetration von kosmetischen, dermokosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zu induzieren, die anstelle des fluoreszierenden Indikators verwendet werden.
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden sich dem Fachmann eindeutig beim Lesen der erklärenden Beschreibung ergeben, die unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erfolgt.
Die Beispiele stellen einen integralen Teil der vorliegenden Erfindung dar und jedes Merkmal, das in Bezug auf den Stand der Technik aus der Beschreibung in ihrer Gesamtheit, einschließlich der Beispiele, neu erscheint, stellt einen integralen Teil der Erfindung in seiner Funktion und in seiner Allgemeingültigkeit dar.
Daher ist jedes Beispiel von allgemeiner Bedeutung („general scope”).
Ferner werden in den Beispielen alle Prozentsätze als Gewichts-% angegeben, sofern nichts anderes angegeben ist, die Temperatur wird in Grad Celsius ausgedrückt, sofern nichts anderes angegeben ist, und der Druck ist Luftdruck, sofern nichts anderes angegeben ist.
Beschreibung der Figuren
Die angehängten 1 bis 4 zeigen die Visualisierung der intrazellulären Penetration von zwei vor-ausgewählten Indikatoren gemäß der Erfindung, PBF-F bzw. TRITC:
1 stellt Fibroblasten dar, die für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01% PBF-F aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 10-fachen Vergrößerung.
2 stellt Fibroblasten dar, die für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01% PBF-F aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 40-fachen Vergrößerung.
3 stellt Fibroblasten dar, die für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01% TRITC aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 100-fachen Vergrößerung.
4 stellt Fibroblasten dar, welche für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01% TRITC und 3% PH aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 100-fachen Vergrößerung.
Beispiel 1: Zubereitung und Aufreinigung eines Liposoms, das einen fluoreszierenden Indikator einkapselt
Fluoreszierende Indikatoren haben nicht nur den Vorteil, sicher zu sein, zum Beispiel in Hinsicht auf Radioaktivität, sondern sind ferner sehr einfach zu verwenden, wenn es darum geht, eine Quantifizierung durchzuführen und einen „visuellen” Aspekt von der intrazellulären Penetration bei Zellkulturmodellen zu demonstrieren.
Die Auswahl des Indikators erfordert die Zubereitung von Liposomen, die 0,01% verschiedener wasserlöslicher oder fettlöslicher Indikatoren enthalten, sowie ihre Aufreinigung, um die nicht eingebauten Indikatoren vor ihrer Applikation auf normale humane Fibroblasten zu entfernen. Eine Liposomen-Kontrolle ohne fluoreszierenden Indikator wird parallel durchgeführt.
a) Auswahl des Liposomen-Zubereitungs-Protokolls
Es wurden Liposomen bei einer Konzentration von 20% Sojalecithin, aufgelöst in Trizma-Verdünnungspuffer (Sigma, Frankreich) 55 mM, zubereitet, – mit 27 mM NaCl auf pH 5 eingestellt. Nach einem magnetischen Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung für 10 Minuten sehr energisch homogenisiert.
Die Liposomen wurden dann in DF-Medium [DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 Glutamax 50/50 Volumen/Volumen, ergänzt mit 10% Kälberserum, mit Penecellin bei einer Endkonzentration von 100 Ul/Milliliter, mit Gentamicin bei einer Endkonzentration von 1 Mikrogramm/Milliliter, mit Amphotericin B bei einer Endkonzentration von 1 Mikrogramm/Milliliter] verdünnt, um verschiedene Sojalecithin-Konzentrationen (0,5–1–2–3–4–5–7,5–10%) zu erzielen.
250 μl der liposomalen Suspension wurden zu Kulturen aus normalen humanen Fibroblasten hinzugefügt, die aus abdominaler Plastik („plastie abdominale”; „abdominal plasy”) extrahiert wurden und in einer 96-Well-Platte kultiviert. Jede Konzentration wurde in vier unterschiedlichen Wells getestet. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch einen Test mit Paranitrophenylphosphat ausgewertet, welches die intrazelluläre alkalische Phosphatase-Aktivität bestimmt, nach dreimaligem Spülen mit Phosphatpuffer pH 7,4. Der Prozentsatz an lebenden Zellen wurden in Bezug auf eine Kontrolle, die ohne die Zugabe von Liposom in das Kulturwelt (n = 6) durchgeführt wurde, berechnet.
Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass eine Zell-Lebensfähigkeit von mehr als 85% bei bis zu 7,5% Lecithin erzielt wurde. Bei 10% Lecithin sank die Lebensfähigkeit unter den akzeptablen Grenzwertes von 75% Lebensfähigkeit.
Die Konzentration von 5%, welche es ermöglichte, eine Zell-Lebensfähigkeit von größer als 90% zu erzielen, wurde ausgewählt.
b) Zubereitung von 5% Sojalecithin-Liposom mit einem eingebauten fluoreszierenden Indikator
0,5 g Sojalecithin, 0,01% fluoreszierender Indikator, welcher gemäß den Empfehlungen des Anbieters vor-gelöst („presolubilisé”; „pre-solubilised”) wurde, wurden in eine Schale gegeben und mit 10 ml Trizma-Puffer verdünnt. Nach einem magnetischen Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung für 10 Minuten energisch homogenisiert, so dass eine liposomale Lösung erzielt wurde, in der die Liposomen eine durchschnittliche Größe aufwiesen, die zwischen 100 und 800 Nanometern variieren konnte, gemäß den exakten Bedingungen der Homogenisierung.
Das Ziel des Aufreinigungsschrittes war es, die nicht eingekapselte Indikator-Fraktion von der Fraktion an Indikatoren, die in die Liposomen eingekapselt waren, zu separieren. Hierzu wurde die liposomale Lösung in einem konischen Röhrchen für 10 Minuten mit 1790 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Ablagerungen (Pellets) wurden wiedergewonnen und dann in 10 ml Kulturmedium gelöst.
Die Liposom-Negativkontrolle wurde gemäß dem oben beschriebenen Protokoll ohne fluoreszierenden Indikator durchgeführt.
Die Proben wurden für 24 Stunden bei 4°C im Dunkeln gelagert. Es wurden 26 Serien von Liposomen hergestellt, mit verschiedenen Typen fluoreszierender Indikatoren, pH-sensitiven, Calcium-sensitiven oder anderen Indikatoren.
Beispiel 2: Auswahl eines fluoreszierenden Indikators, der in ein Liposom eingekapselt werden kann, und der nicht spontan in normale humane Fibroblasten in Kultur penetriert
Die Auswahl des Indikators erforderte die Zubereitung und Aufreinigung von Liposomen gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll, wobei diese Liposomen verschiedene Konzentrationen der verschiedenen wasserlöslichen oder fettlöslichen Indikatoren enthielten (Tabelle 1, Anhang 1). Die Kontrollen – ein freier fluoreszierender Indikator – wurden durch Auflösen eines fluoreszierenden Indikators in dem Verdünnungspuffer bei der gleichen Konzentration durchgeführt, um so seine Zytotoxizität und seine spontane Penetration in die Fibroblasten zu quantifizieren.
Der Vergleich mit einem Liposom, welches keinen fluoreszierenden Indikator enthielt, wurde parallel als Negativkontrolle durchgeführt.
Nach der Extraktion aus einer Biopsie, die aus einer abdominalen plastischen Operation stammte, wurden die Fibroblasten geeigneterweise in DF-Medium, d. h.: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 Glutamax 50/50 Volumen/Volumen, ergänzt mit 10% Kälberserum, mit Penecellin bei einer Endkonzentration von 100 Ul/Milliliter, mit Gentamicin bei einer Endkonzentration von 1 Mikrogramm/Milliliter, mit Amphotericin B bei einer Endkonzentration von 1 μg/Milliliter, amplifiziert.
Nach Zentrifugation wurden die aufgereinigten Liposomen zunächst in DF-Kulturmedium aufgenommen, mit einem Vortex homogenisiert und dann in einer Menge von 1 ml pro Well zu den Fibroblasten, die in 24-Well-Platten (Costar MW24) kultiviert wurden, zugegeben. Die Kontrollen wurden unter den gleichen Bedingungen hergestellt. Eine nicht behandelte Kontrolle wurde ebenfalls durchgeführt.
Die Fibroblasten wurden für 24 Stunden bei 37°C in der Gegenwart der Liposomen inkubiert und dann dreimal in pH 7,4 Phosphatpuffer gespült. Als erstes wurde die Fluoreszenz trocken („évaluée á sec”; „evaluated dry”) durch Spektrofluorometrie mit einem Cytofluor 4000^® (Millipore) ausgewertet. Als zweites wurde die intrazelluläre Fluoreszenz von den Molekülen von Interesse mit einem Olympus^® reversen Mikroskop (IX70) beobachtet unter Verwenden des entsprechenden Anregungsfilters (Objektiv x10, x40 und x100). Schließlich wurde die Zytotoxizität der fluoreszierenden Indikatoren in einer 96-Well-Platte durch Inkubation für 24 Stunden ausgewertet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass von den 25 getesteten Molekülen lediglich Pentafluorbenzoylaminofluorescein PFB-F (P12925 Molecular Probes) und Tetramethylrhodaminisothiocyanat TRITC (T-490 Molecular Probes) nach dem Einbau in ein Liposom, der Applikation auf die Fibroblasten für 24 Stunden und der Quantifikation der Penetration des liposomalen Gehalts, interessante positive Ergebnisse ergaben.

Die anliegenden 1 bis 4 stellen Fotographien dar, welche die intrazelluläre Penetration der zwei vor-ausgewählten („préselectionnés”; „pre-selected”) Indikatoren PFB-F und TRITC bei der Konzentration von 0,01% in den Liposomen nach einer Inkubation mit den Fibroblasten für 24 Stunden visualisieren. Tabelle 2: Ergebnisse des Indikator-Screenings

	Zytotoxizität (% der nicht behandelten Kontrolle)	Penetrations-freie Probe	Penetration (Fluoreszenz nach dem Waschen)
PFB-F (485–530)	110,7%	8 (Ausbeute 45)	65 (Ausbeute 45)
TRITC (530–620)	74,8	295 (Ausbeute 50)	1119 (Ausbeute 50)

Obwohl TRITC eine intensivere Markierung ergab (Tabelle 1 und anliegend 1 bis 4), ist er nichtsdestotrotz leicht zytoxosisch, er penetriert leicht, wenn er dem Kulturmedium frei zugefügt wird. PFB-F scheint daher ein besserer Indikator zu sein.
Beispiel 3: Untersuchung der intrazellulären Penetration in Gegenwart von PFB-F (Pentafluorbenzoylaminofluorescein) oder TRITC (Tetramethylrhodaminisothiocyanat) und in Gegenwart oder nicht in Gegenwart von Polyethylenimin
Die intrazelluläre Penetration von Liposomen, welche 5% Sojalecithin, 0,01% PFB-F oder TRITC enthielten, in Gegenwart oder nicht in Gegenwart von 0,5% 25 kDa Polyethylenimin (PEI), die gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll zubereitet wurden, wurde nach 24 Stunden Inkubation mit humanen Fibroblasten, die in einer 24-Well-Platte kultiviert wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert.
Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von PEI die Penetration von den PFB-F-Liposomen 13,7-fach stimuliert, während die Zugabe von PEI die Penetration von TRITC-Liposomen 16-fach herabsetzt (siehe Fotographien im Anhang, 1 bis 4).
Der weiter verwendete Indikator ist daher PFB-F oder Pentafluorbenzyolaminofluorescein bei 0,01% im Liposom.
Beispiel 4: Untersuchung der Stabilität der Liposomen, die Pentafluorbenzylaminofluorescein (PFB-F) enthalten
Die Stabilität der Liposomen wurde analysiert, indem die Freisetzung des fluoreszierenden Indikators in das DF-Kulturmedium mittels Spektrofluorometrie untersucht wurde; diese Untersuchung wurde als Funktion des pH, der Ionenstärke und der Gegenwart eines Detergenz durchgeführt.

Es wurden geeigneterweise Liposomen, die 5% Sojalecithin, 0,01% PFB-F und 50 μM 25 kDa PEI enthielten, zubereitet. Die liposomalen Lösungen wurden auf pH 6–7–8–9 eingestellt; die Konzentration von Natriumchlorid (NaCl) wurde auf 50–100–150–200 mM eingestellt und die Konzentration von Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100 wurde auf 0,1–0,5–1–3% eingestellt. Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Untersuchung der Freisetzung als Funktion der Gegenwart von Detergenzien, der Ionenstärke und des pH

Moleküle	Konzentrationen	Freisetzung: Mittelwert	Freisetzung: Standardabweichung
Triton X-100	3%	44027	177
	1%	45800	2888
	0,5%	40834	39
	0,1%	19829	103
SDS	3%	62481	180
	1%	71809	1558
	0,5%	76676	200
	0,1%	22990	108
NaCl	200 mM	68527	2040
	150 mM	7622	36
	100 mM	6314	113
	50 mM	5680	62
pH	9	25265	411
	8	18816	226
	7	8781	70
	6	7640	55

Die Ergebnisse scheinen anzuzeigen, dass die Liposomen, die 50 μM 25 kDa PEI enthielten, ab 200 mM NaCl, 0,5% Triton X-100 oder SDS und oberhalb von pH 7 zu destabilisieren begannen.
Beispiel 5: Ausbeute der Einkapselung von dem fluoreszierenden Indikator PFB-B als Funktion der Konzentration von Polyethylenimin
Es wurden Liposomen gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren zubereitet, mit ansteigenden Konzentrationen von 25 kDa PH von 0 bis 100 μM. Nach Zentrifugation bei 1790 g für 10 Minuten wurden die Überstände mittels Spektrofluorometrie quantifiziert. Die Ausbeuten der Einkapselung wurden mit Bezug auf die Anfangskonzentration berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 4: Ausbeute der Einkapselung von PFB-F als Funktion der Konzentration von PEI

Konzentration von PEI (μM) 0 1 10 50 100

Ausbeute (%) 89,0 92,3 91,0 87,5 86,3
Es ist festzustellen, dass der Ausbeute der Einkapselung nicht durch die Erhöhung der Konzentration von PEI beeinträchtigt wird.
Beispiel 6: Entwicklung der Screening-Bedingungen mit fluoreszierenden Liposomen, die verschiedene Konzentrationen von Polyethylenimin enthalten
Es wurden Liposomen gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll zubereitet, mit verschiedenen Konzentrationen von Polyethylenimin (25 kDa PEI, neutralisiert mit 6N Salzsäure), d. h. 0–5–10–50 μM und 0,01% PFB-F.

Die Quantifizierung wurde mittels Spektrofluorometrie nach der Inkubation mit Fibroblasten, kultiviert in einer Einzelschicht in einer 24-Well-Platte für 2–4–6–24 und 48 Stunden, nach drei Waschschritten mit Phosphatpuffer pH 7,4, gegen einen Leerwert nicht behandelter Fibroblasten und nach Normierung gegen freies PFB-F bei der gleichen Konzentration, durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5: Untersuchung der intrazellulären Penetration von PFB-F als Funktion der Zeit und der Konzentration von PEI (n = 4, für jede Bedingung), ausgedrückt in frei wählbaren Fluoreszenzeinheiten

Konzentrationen von PEI	0		5 μM		10 μM		50μM
Zeit	Mittelwert	Standardabweichung	Mittelwert	Standardabweichung	Mittelwert	Standardabweichung	Mittelwert	Standardabweichung
2 Std.	6	0	49	4	67	7	116	6
4 Std.	7	3	63	5	89	9	159	10
6 Std.	6	0	65	10	94	13	203	12
24 Std.	9	3	120	5	129	3	291	17
48 Std.	6	1	160	18	171	13	306	6

Die besten Ergebnisse wurden bei einer Konzentration von 50 μM PEI und einer Mindestinkubationszeit mit den Fibroblasten von 24 Stunden erhalten. Diese Bedingungen werden für das Screening nach Molekülen, welche die intrazelluläre Penetration stimulieren, beibehalten. Die Ergebnisse sind für die freie Kontrollprobe (p < 0,05) für alle Zeiten mit Wirkung ab der Konzentration von 5 μM statistisch signifikant.
Beispiel 7: Analyse der intrazellulären Penetration und der Zytotoxizität von fluoreszierenden Liposomen, die 50 μM Polyethylenimin enthalten, als eine Funktion der Zeit
Das Experiment wurde gemäß Beispiel 6 für PEI-Konzentrationen von 0 bis 100 μM durchgeführt. Die Quantifizierung der Fluoreszenz wurde gemäß Beispiel 6 durchgeführt. Die Stimulierung der intrazellulären Penetration wurde als Stimulierungsfaktor mit Bezug auf Liposom ohne PEI ausgedrückt.

Die Zell-Lebensfähigkeit wurde in einer 96-Well-Platte (250 μl liposomale Lösung pro Well) durch einen Test durchgeführt, welcher die alkalische Phosphatase-Aktivität auf Zellmatten („tapis cellulaire”; „cell mats”) auswertet (Test mit Paranitrophenylphosphat, n = 6). Die Ergebnisse der Zell-Lebensfähigkeiten wurden als Prozentsatz der lebenden Zellen in Bezug auf eine PEI-freie fluoreszierende Liposom-Kontrolle ausgedrückt. Die Bestimmung von IL1 alpha (Kit Quantikine R & D System) wurde in dem Kulturmedium, das 24 Stunden nach der Inkubation gesammelt wurde, durchgeführt, parallel zu einer Bestimmung der Gesamtproteine (Bradford, Sigma). Die Ergebnisse werden in den Tabellen 6 und 7 wiedergegeben. Tabelle 6: Faktor der intrazellulären Penetration von PFB-F und der Zytotoxizität als Funktion der Zeit und der Konzentration von PEI (n = 4, für jede Bedingung)

Zeit	0	5 μM	10 μM	50 μM	Lebensfähigkeit PEI 50
2 Std.	0,7	5,4	7,4	12,9	93,8%
4 Std.	0,8	7,0	9,9	17,7	92,4%
6 Std.	0,7	7,2	10,4	22,6	83,9%
24 Std.	1,0	13,3	14,3	32,3	72,6%
48 Std.	0,7	17,8	19,0	34,0	48,4%

Tabelle 7: Bestimmung von IL1-alpha in pg/mg vom Gesamtprotein

25 kDa PEI	0	10 μM	50 μM	100 μM
Gesamtproteine in μg/ml	132,8	136,2	119,5	79,2
IL1 in pg/ml	9,2	12,7	13,1	14,4
IL1 in pg/mg der Proteine	69,3	93,2	109,6	181,8
Stimulierungsfaktor	1	1,3	1,6	2,6

Die Ergebnisse zeigen, dass es in diesem Experiment möglich ist, den Penetrationsfaktor des fluoreszierenden Indikators in Gegenwart von PEI bis zu 34-fach zu erhöhen. Jedoch wurde beobachtet, dass bei der Konzentration von 50 μM von 25 kDa PH mit Wirkung ab 24 Stunden, ein nicht unerhebliches Auftreten an Zytotoxizität beobachtet wurde, wobei bei 48 Stunden mehr als die Hälfte der Zellen tot waren. Was die Synthese von IL1-alpha bei der Konzentration von 50 μM betrifft, liegt die Stimulierung bei 1,6-fach, und bei der Konzentration von 100 μM bei 2,6-fach. Dieses Molekül erzeugt einen signifikanten inflammatorischen Stress.
Beispiel 8: Screening nach Molekülen, welche die intrazelluläre Penetration eines fluoreszierenden Indikators, der in ein Liposom eingebaut ist, stimulieren
Es wurden Liposomen mit 5% Sojalecithin, 0,01% PFB-F und 1–0,1–0,01% des zu testenden Moleküls, das mit Salzsäure auf pH 7 neutralisiert wurde, wenn erforderlich in Trizma-Verdünnungspuffer, wie in Bespiel 5 beschrieben, zubereitet.
55 Moleküle wurden zunächst 3-fach getestet, im Vergleich zu den 50 μM 25 kDa PEI. Die intrazelluläre Penetration wurde 24 Stunden nach Inkubation mit normalen humanen Fibroblasten, die in 24-Well-Platten kultiviert wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde in einer 96-Well-Platte mit 200 μl liposomaler Suspension bestimmt. Die erzielten Ergebnisse für die Konzentration von 1% werden in Tabelle 8 (Anhang 2) wiedergegeben. Aus dem durchgeführten Screening wurden 15 Moleküle ausgewählt, da sie in der Lage waren, die intrazelluläre Penetration des fluoreszierenden Indikators mit mehr als 10% zu stimulieren.
Die Zell-Lebensfähigkeiten waren unterschiedlich (von 37 bis 99%) bei einer Konzentration von 1%. Die Visualisierung des fluoreszierenden Indikators bestätigte die Penetration für die Moleküle, welche die Penetration mit mehr als 32% stimulierten. Diese Moleküle wurden bevorzugt weiterverwendet.
Beispiel 9: Einfluss der Struktur der Moleküle auf die Stimulierung der intrazellulären Penetration

Die Zubereitung der Liposomen mit primären Fettmonoaminen mit einer Alkylkettenlänge von 3 bis 18 Kohlenstoffen (Kohlenstoffatomen) und die Quantifizierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Markers wurden, wie in dem vorangehend beschriebenen Beispiel, durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gegeben. Tabelle 9: Stimulierung der intrazellulären Penetration als Funktion der Kohlenstoffkettenlnge

Anzahl der Kohlenstoffe (Kohlenstoffatome) Primäres Monoamin mit einer einzigen Alkylfettkette	Stimulierungsfaktor
25 kDa PEI-Kontrolle	34,7
C3	0,9
C4	1,4
C6	0,2
C7	3,7
C10	39,6
C11	95,3
C12	47,1
C13	44,5
C14	11,6
C15	14,9
C18	19,6

Der Einbau von Fettaminen mit alipathischen Ketten verschiedener Größen in die Membranen der Liposomen, zeigt eindeutig den Einfluss der Länge der Kohlenstoffketten auf die stimulierende Aktivität der intrazellulären Penetration von PFB-F, eingekapselt in Liposomen mit 5% Lecithin. Es existiert eine grobe Einteilung der Fettsäuren als eine Funktion der Kettenlänge. Danach werden kurze Ketten (weniger als 8 Kohlenstoffe (Kohlenstoffatome)), mittlere Ketten (von 10 bis 18 Kohlenstoffe (Kohlenstoffatome)) und lange Ketten (mehr als 18 Kohlenstoffe (Kohlenstoffatome)) unterschieden. Beim ÜbAusbeuteen dieser Einteilung auf die primären Fettamine, die im Zusammenhang mit dieser Untersuchung getestet wurden, erscheint es, dass die mittleren Ketten solche sind, die ihre Eigenschaft, die intrazelluläre Penetration der Liposomen zu stimulieren, auf die Liposomen übAusbeuteen.
Beispiel 10: Einfluss der sterischen Behinderung auf die intrazelluläre Penetration
Um die Eigenschaften der Moleküle mit einem stimulierenden Effekt auf die intrazelluläre Penetration eines fluoreszierenden Indikators, der in Liposomen mit 5% Lecithin eingekapselt ist, am besten zu bestimmen, haben wir den Einfluss der sterischen Behinderung auf die potentiell stimulierende Aktivität dieser Moleküle beobachtet. Wir haben dafür die intrazelluläre Penetration von PFB-F, eingekapselt in Liposomen, in Gegenwart von zum einen primären Fettmonoaminen und zum anderen sekundären Fettmonoaminen untersucht. Die Zubereitung der Liposomen mit primären oder sekundären Fettaminen und die Quantifizierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Markers wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle 10 wiedergegeben. Die Diamine ermöglichten keine bessere intrazelluläre Penetration des Markers. Tabelle 10: Stimulierung der intrazellulären Penetration als Funktion der Anzahl an Kohlenstoffketten

Anzahl an Alkylketten des Amins (Kettenlänge) Stimulierungsfaktor

25 kDa PEI 34,7

1(C4) 1,7

2(C4) 0,7

1(C10) 39,6

2(C10) 1,2
Beispiel 11: Einfluss der sterischen Behinderung auf die intrazelluläre Penetration
Indem so vorgegangen wurde, wie insbesondere in Beispiel 9 oder 10 beschrieben wurde, wurde gezeigt, dass die Länge der Kohlenstoffkette nicht der einzige Faktor ist, der die Stimulierung der intrazellulären Penetration des liposomalen Gehalts beeinträchtigt.
Tatsächlich wurde in einem Vergleich der chemischen Strukturen, die in der folgenden Figur dargestellt sind, und die in Liposomen eingekapselt sind, eine Spezifität der Gruppe R gezeigt, die mit der C₁₂-Kohlenstoffkette interferiert.
R_Y stellt das hydrolysierte und hydroxypropylierte Sojaprotein dar
R_A stellt das hydrolysierte und hydroxypropylierte Weizenprotein dar
Die quaternisierten Moleküle A oder Y sind Produkte, die dem Fachmann gut geläufig sind. Die sterische Behinderung der eingebauten quaternisierten Moleküle (herkömmliche Moleküle) spielt eine Rolle bei der Stimulierung der intrazellulären Penetration der Liposomen mit Lecithin.

Die Moleküle der folgenden Klassen (Tabelle 11) können beispielsweise bei 1% zum Stimulieren der intrazellulären Penetration in unterschiedlichem Maß bis zu +39% verwendet werden. Andere quaternisierte Hydrolysate von Molekülen, die aus Mandeln, Erbsen, Kartoffeln oder Algen extrahiert werden, können ebenfalls verwendet werden.

Beispiele von herkömmlich erhältlichen quaternisierten Molekülen	Chemischer Name	Beispiele von potentiellen Anbietern
Weizen	Cocodimonium-, Steardimonium-, Hydroxypropyltriomonium- oder Lauryldimonium-hydrolysiertes Weizenprotein. Weizenkeim-Amidopropalkoniumchlorid	Croda
Soja	Lauryldimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein, Cocodimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein, Hydroxypropyltrimethylamoniumchloridhydrolysiertes Sojaprotein Sojadihydroxypropyldimoniumglucosid	Croda RITA Corporation
Keratin (nicht-erfindungsgemäß)	Hydroxypropyltrimonium-hydrolysiertes Keratin	RITA Corporation
Casein (nicht-erfindungsgemäß)	Hydroxypropyltrimonium-hydrolysiertes Casein	RITA Corporation
Collagen (nicht-erfindungsgemäß)	Hydroxypropyltrimonium-hydrolysiertes Collagen, Lauryldimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Collagen	RITA Corporation Cognis
Seide (nicht-erfindungsgemäß)	Hydroxypropyltrimonium-hydrolysierte Seide	RITA Corporation
Reis	Cocodimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Reisprotein	Sochibo
Guar (Büschelbohne) (nicht-erfindungsgemäß)	Hydroxypropylguarhydroxypropyl-trimoniumchlorid Hydroxypropylguar Hydroxypropyltrimoniumchlorid, Guarhydroxypropyltrimonium	Meyhall Rhodia
Honig (nicht-erfindungsgemäß)	Hydroxypropyltrimoniumhonig	ARCH
Cellulose (nicht-erfindungsgemäß)	Polyquaternium 4 und 10 Polyquaternium 39	Quimasso

Beispiel 12: Optimierung der Konzentration von funktionalisierenden Molekülen (die die intrazelluläre Penetration stimulieren)
Die Stimulierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Indikators wurde optimiert, indem verschiedene Konzentrationen funktionalisierender Moleküle getestet wurden.
Geeigneterweise wurden Liposomen mit 5% Sojalecithin, 0,01% PFB-F und 0,5 bis 2,5% der quaternisierten Sojalösung in Trizma-Verbindungspuffer gebildet. Die intrazelluläre Penetration und die Zytotoxizität wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgewertet. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 12 wiedergegeben. Tabelle 12: Untersuchung der Konzentration eines Moleküls, das sowohl die intrazelluläre Penetration und den Stimulierungsfaktor als auch die Zell-Lebensfähigkeit stimuliert

Quaternisiertes Soja in % 0,5 1 1,5 2 2,5

Stimulierungsfaktor 0,6 1,6 38,9 97,2 99,9

Zell-Lebensfähigkeit (%) 92,4 97,9 87,9 75,4 77,3
Die nachgesuchte intrazelluläre Penetration kann demnach als eine Funktion der Konzentration des funktionalisierenden Wirkstoffs und des Maximums der tolerierten Zytotoxizität eingestellt werden.
Beispiel 13: Inflammatorischer Effekt, verglichen zwischen Polyethylenimin und dem ausgewählten quaternisierten Soja
Die Stimulierung der Synthese von Interleukin 1 alpha wird zwischen Liposomen verglichen, die durch 50 μM PEI und durch verschiedene Konzentrationen in Lösung von quaternisiertem Soja funktionalisiert wurden.

Geeigneterweise wurden Liposomen mit 5% Sojalecithin, 0,01% PFB-F und 0,5 bis 2,5% der Lösung aus quaternisiertem Soja oder 50 μM PEI in Trizma-Verdünnungspuffer, gebildet. Der IL-1 alpha-Gehalt wurde mit einem Kit (Quantikine R&D System) ausgewertet, wie in Beispiel 7 beschrieben. Ein Test mit Paranitrophenylphosphat (PNPP) wurde parallel durchgeführt, um die Anzahl der Zellen pro Well auszuwerten. Die Ergebnisse des IL1 alpha-Gehalts wurden mit der erzielten optischen Dichte von PNPP verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 13 wiedergegeben. Tabelle 13: Effekt der funktionalisierenden Moleküle (PEI und quaternisiertes Soja) auf die Synthese von Interleukin 1 alpha

Konzentration des funktionalisierenden Moleküls	50 μM PEI	0,5% Soja	1% Soja	1,5% Soja	2% Soja
PNPP	72,3	91,8	91,6	87,5	88,4
IL1 alpha	350	137,5	137,5	212,5	187,5
IL1 alpha/PNPP	484,1	149,8	150,1	242,9	212,1

Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Lösung aus quaternisiertem Soja, die vorher ausgewählt wurde, eine Zytotoxizität und einen inflammatorischen Stress induziert, der im Vergleich zu dem Referenzmolekül PEI sehr eingeschränkt ist.
Beispiel 14: Apoptotischer Effekt, verglichen zwischen dem Polyethylenimin und dem ausgewählten quaternisiertem Soja
Die Stimulierung der Synthese von Interleukin 1 alpha wurde verglichen zwischen Liposomen, die durch 50 μM PEI und durch verschiedene Konzentrationen in Lösung von quaternisiertem Soja funktionalisiert wurden.

Geeigneterweise wurden Liposome mit 5% Sojalecithin, 0,01% PFB-F und 0,5 bis 2,5% der Lösung aus quaternisiertem Soja oder 50 μM PEI, in Trizma-Verdünnungspuffer, gebildet. Der Gehalt an Caspase 1 wurde mit einem Kit (Caspase-1 Colorimetric Assay R&D System) ausgewertet. Es wurde ein Test mit Paranitrophenylphosphat (PNPP) parallel durchgeführt, um die Anzahl der Zellen pro Well auszuwerten. Die Ergebnisse des Caspase 1-Gehalts wurden mit der erzielten optischen Dichte von PNPP verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 14 wiedergegeben. Tabelle 14: Effekt der funktionalisierenden Moleküle auf den Gehalt an Caspase-1

Konzentration des funktionalisierenden Moleküls	50 μM PEI	0,5% Soja	1% Soja	1,5% Soja	2% Soja
PNPP	59,8	91,8	91,6	87,5	88,5
Caspase-1	642,8	76	87,7	78,3	117,5
Caspase-1/PNPP	1074,9	82,8	95,7	89,5	132,8

Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Lösung aus dem vorher ausgewählten quaternisierten Soja eine Zytotoxizität und einen apoptotischen Stress induzierte, die/der im Vergleich mit dem Referenzmolekül PEI übermäßig eingeschränkt ist.
Beispiel 15: Beobachtung der Struktur der liposomalen Zusammensetzung aus Beispiel 14 durch Transmissioriselektronenmikroskopie
Die Liposomen, die mit 2% quaternisierter Sojalösung ohne Zugabe eines Wirkstoffs und eines fluoreszierenden Indikators zubereitet wurden, wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet. Eine Negativ-Anfärbung der Liposomen wurde unter Verwenden von Schwermetallsalzen durchgeführt, welche die Doppelschichten der multilamellaren Vesikel aufbrechen. Die Beobachtung wurde mit einem Philips CM120 Transmissionselektronenmikroskop und einer Vergrößerung von 30 bis 60.000 durchgeführt.
Die Beobachtungen ließen die Gegenwart von konzentrischen Lipidschichten, die charakteristisch für multilamellare Strukturen sind, erkennen. Die durchschnittliche Größe der beobachteten Liposomen variierte von 150 bis 250 nm.
Beispiel 16: Stimulierung des Anti-Radikal-Schutzes durch die Verwendung einer Lösung aus quaternisiertem Soja aus Beispiel 11.
Es wurden Liposomen mit 5% Sojalecithin, 0,2% natürlichem Vitamin E und 2% quaternisierter Sojalösung aus Beispiel 11 (Molekül Y) zubereitet.
Geeigneterweise wurden 0,4 g natürliches Vitamin E zu 10 g Sojalecithin und 10 ml 96% Ethanol hinzugefügt. Die Lösung wurde für eine Nacht unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur und im Dunkeln evaporiert. Nach der Evaporation des Ethanols wurden 100 ml deionisiertes Wasser hinzugefügt. Die Mischung wurde bis zur vollständigen Auflösung gerührt.
Die Liposomen wurden dann durch Zugeben von 5 ml der Lecithin-Vitamin E-Lösung, 190 μl (d. h. 2%) quaternisierte Sojalösung und 4,80 ml 55 mM Trizma-Verdünnungspuffer – 27 ml. NaCl, eingestellt auf pH 5, zubereitet und unter magnetischem Rühren im Dunkeln für 30 Minuten gemischt. Die Lösung wurde dann bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten homogenisiert, um die modifizierten Liposomen zu bilden. Die gleiche Lösung wurde ohne die Homogenisierung zubereitet und stellte eine freie Vitamin E-Kontrolle dar.
Die auf natürlichem Vitamin E basierten Liposomen wurden in Gegenwart von 10 μM 25 kDa PEI, um einer Zytotoxizität vorzubeugen, und ebenfalls ohne funktionalisierenden Wirkstoff zubereitet.
Normale humane Fibroblasten wurden in 24-Well-Platten ausgesät und bis zum Zusammenfluss kultiviert. Nach dreimaligem Spülen mit Phosphatpuffer mit Calcium und Magnesium, pH 7,4, (In vitrogen) wurden die verschiedenen Lösungen, auf die Hälfte (d. h. Endkonzentration von Vitamin E von 0,1%) verdünnt, in Kulturmedium für mindestens 2 Stunden inkubiert. Es wurden Wells mit Kulturmedium allein inkubiert, die als Kontroll-Probe in der folgenden Durchführung dienten. Nach dreimaligem Spülen in Phosphatpuffer mit Calcium und Magnesium, pH 7,4, zum Entfernen der Liposomen und des freien Vitamin E, wurden die Zellmatten in Gegenwart von Dihydrorhodamin 123 (Molecular Probes) in einer Menge von 200 μl/Well einer Lösung, die wie folgt zubereitet wurde: 150 μl einer 1 mM Lösung, aufgelöst in 15 ml HBSS-Puffer, inkubiert. Die Platte wurde bei 490 bis 530 nm auf ihre Fluoreszenz hin gelesen und dann bei 0,8 J/cm² mit UVB bei 912 nm bestrahlt und dann erneut bei derselben Wellenlänge auf die Fluoreszenz hin gelesen. Die Ergebnisse werden in Verhältnissen ausgedrückt:

A: = bestrahlt/nicht bestrahlt (1/NI)
B: = (I/NI Liposom) (I/NI Kontrollprobe)
C: = liposomiertes Vitamin E/freies Vitamin E

Die verwendete fluoreszierende Probe ermöglichte die Auswertung der Gegenwart von intrazellulär reaktiven Sauerstoffintermediaten, da sie passiv durch die Zellmembranen diffundiert, wo sie dann zu kationischem Rhodamin oxidiert werden kann. Die fluoreszierende Probe reagierte zum Beispiel positiv mit Wasserstoffperoxid und Peroxynitriten. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 15 gegeben. Tabelle 15: anti-Radikal-Schutz durch die auf diese Weise modifizierten Liposomen

	I	NI	A = 1/NI	B = Liposom/Kontrolle	C = Liposom/frei
Produkt der Erfindung	118990	58786	2,01	79,3%	+23%
Nicht funktionalisiertes Liposom	114907	52306	2,31	91,1%	+11%
Liposom PEI	105257	40148	2,82	111,4%	–9%

Die Ergebnisse zeigen an, dass die durch das quaternisierte Sojaprotein funktionalisierten Liposomen es ermöglichen, einen mehr als 20% höheren protektiven Effekt gegen radikalen Stress zu erzielen, im Vergleich zu nicht funktionalisierten Liposomen, während die mit dem Referenzmolekül PEI funktionalisierten Liposomen keinen protektiven Effekt zeigten, sondern noch zusätzlichen Stress erzeugen.
Beispiel 17: Stimulierung der Depigmentierung durch die Produkte der Erfindung
Es wurden Liposomen gemäß dem folgenden Protokoll zubereitet: 5% Sojalecithin, zu dem 2% quaternisierte Sojalösung oder 10 μM PEI (Referenzliposom) hinzugefügt wurde oder nicht hinzugefügt (Referenzliposom) wurde. Die Wirkstoffe wurden ebenfalls co-eingekapselt: Phytolight^® (Coletica, Lyons, Frankreich) ohne Konservierungsstoff bei 0,05% (Cocktail aus Pflanzenwirkstoffen), 0,05% Arbutin und 1 mM Catechin (Sigma). Die Moleküle wurden frei appliziert, in 5% Lecithin-Liposom, in 10 μM PH funktionalisierten Liposomen oder 2% quaternisiertem Soja, auf normale humane Melanocyten, die in 24-Well-Platten kultiviert wurden und prä-konfluent (vor der Zusammenlagerung) waren. Die Wirkstoffe, die liposomiert waren oder nicht liposomiert waren, wurden für 66 Stunden bei 37°C unter 5 CO₂ in MMK2-Medium (Sigma) inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit. Phosphatpuffer mit Calcium und Magnesium (Invitrogen) und Extraktion in Phosphatpuffer, der 0,5% Triton X-100 enthielt, wurde die Tyrosinase-Aktivität durch Bestimmung in Gegenwart von L-DOPA und MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon) quantifiziert. Die Bildung einer MBTH-o-quinon-Verbindung wurde durch einen Absorbanzwert bei 490 nm kinetisch quantifiziert. Die Tyrosinase-Aktivität wurde durch den Anstieg (Geschwindigkeit) der Enzymreaktion ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 wiedergegeben. Tabelle 16: Depigmentierungs-Effekt von liposomierten oder nicht liposomierten Wirkstoffen (ausgedrückt in der Geschwindigkeit der Enzymreaktion)

Frei Liposom (Referenzliposom) PEI-Liposom (Referenzliposom) Soja-Liposom

Arbutin 0,004 0,001 0 0

Phytolight^® 0,01 0,008 0,003 0,0016

Catechin 0,007 0,007 0 0,003
Die Ergebnisse zeigen, dass als Funktion der co-eingekapselten Wirkstoffe, die Funktionalisierung eine Erhöhung der Inhibition der Tyrosinase-Aktivität in vitro auf normale humane Melanocyten ermöglicht. Die Funktionalisierung durch das quaternisierte Soja ist effektiver als die Funktionalisierung durch die Zugabe von PEI für den Komplex aus Pflanzenextrakten, ist äquivalent für Arbutin und ist leicht geringer für Catechin. In jedem Fall liegt die Aktivität mindestens 2,3-fach höher als mit einem nicht funktionalisierten Liposom.
Beispiel 18: Verfahren zum Herabsetzen der Größe der Produkte der Erfindung
Die Größe der Liposomen kann durch die Verwendung eines Hochdruck-Homogenisators (mit einem Arbeitsdruck von mehr als 1.000 bar, bevorzugt mehr als 2.000 bar, stärker bevorzugt mehr als 3.000 bar) herabgesetzt werden. Bei 3.000 bar können mit diesem Gerät Liposomen von ungefähr 50 nm erhalten werden.
Die Größe der Liposomen wurde mit Hilfe eines Laserpartikel-Größenanalysators (Granulometers) (Beckman Coulter, N4 plus, Submicron Particle Size Analyser) und durch Transmissionselektronenmikroskopie, wie in Beispiel 15 beschrieben, analysiert.
Beispiel 19: Darstellung der Penetration von Material, welches durch die Produkte der Erfindung befördert wird, nach transkutaner Permeation: Beispiele mit einem fluoreszierenden Indikator, Vitamin E oder genetischem Material

Die Penetration eines fluoreszierenden Moleküls (0,01% PFP-F), frei oder eingebaut in ein Liposom, wie in Beispiel 12 beschrieben, das 2% quaternisierte Sojalösung, ausgewählt aus Beispiel 11, umfasste oder nicht umfasste, wurde durch transkutane Permeation auf humaner Haut quantifiziert. Die Diffusionskinetik wurde spektrofluorometrisch von 3 bis 24 Stunden quantifiziert. Die Freisetzung wurde nach 24 weiteren Stunden quantifiziert. Die Einlagerung wurde zuletzt ebenfalls ausgewertet. Die Anzahl der getesteten Proben betrug 5 pro Testbedingung. Die in Tabelle 17 wiedergegebenen erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von Liposomen, die in der Gegenwart von quaternisiertem Soja hergestellt wurden, die Diffusion, die Freisetzung und die Einlagerung des fluoreszierenden Indikators signifikant stimuliert – im Vergleich zu der nicht vektorisierten Form oder der Form, die ohne quaternisierte Substanz vektorisiert wurde. Tabelle 17:

	Frei	Liposom	Quaternisiertes Liposom
Diffusion	0,57 ± 0,03	1,17 ± 0,05	1,76 ± 0,13
Freisetzung 24 Std.	0,691 ± 0,06	1,398 ± 0,07	1,77 ± 0,21
Einlagerung	0,81 ± 0,1	1,27 ± 0,17	2,61 ± 0,33

Die Penetration des Vitamin-E-Moleküls (0,5%), das frei oder in ein Liposom eingebaut war, wie in Beispiel 12 beschrieben, und das 2% quaternisierte Sojalösung, ausgewählt aus Beispiel 11, umfaßte oder nicht umfaßte, wurde durch transkutane Permeation auf humaner Haut quantifiziert. Die Diffusionskinetik wurde mittels Hochleistungsflüssigchromatographie für die Dauer von 5 bis 24 Stunden quantifiziert. Die Freisetzung wurde nach weiteren 24 Stunden quantifiziert. Die Einlagerung wurde zuletzt ebenfalls ausgewertet. Die erzielten Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die Verwendung von Liposomen, die in der Gegenwart von quaternisiertem Soja hergestellt wurden, die Diffusion, die Freisetzung und die Einlagerung von Vitamin E signifikant stimuliert, im Vergleich zu der nicht vektorisierten Form oder der Form, die ohne quaternisierte Substanz vektorisiert wurde.
Das gleiche Experiment der transkutanen Penetration wurde mit Einbau (oder nicht) von fluoreszierendem genetischem Material (200 mM) in ein Liposom, wie in Beispiel 12 beschrieben, in der Gegenwart einer 2% Sojalösung durchgeführt. Die Ergebnisse, die durch eine Beobachtung von transversalen Schnitten der Haut durch optische Epifluoreszenzmikroskopie erzielt wurden, zeigen, dass die Verwendung der Liposomen, die in der Gegenwart von quaternisiertem Soja hergestellt wurden, die Diffusion des genetischen Materials bis in die tiefe Dermis ermöglicht.
Sequenz der fluoreszierenden Probe von Duplex-(„duplexée”; „duplexed”) Elastin 19–20:
Sense: 5'-(FITC)AGCUGCUAAGGCUGGCGCUTT-3'
Antisense: 5'-AGCGCCAGCCUUAGCAGCUTT-3'
Beispiel 20: Verwendung der Produkte der Erfindung in kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen des Öl-in-Wasser-Emulsionstyps

Formulierung 20a:

A	Wasser	qsp 100
	Butylenglycol	2
	Glycerin	3
	Natriumdihydroxycetylphosphat,	2
	Isopropylhydroxycetylether

B	Glycolstearat SE	14
	Triisononaoin	5
	Octylcocoat	6

C	Butylenglycol, Methylenparaben,	2
	Ethylparaben,
	Propylparaben, pH eingestellt
	auf 5,5

D	Produkte der Erfindung	0,01–10%

Formulierung 20b:

A	Wasser	qsp 100
	Butylenglycol	2
	Glycerin	3
	Polyacrylamid, Isoparaffin,	2,8
	Laureth-7

B	Butylenglycol,	2
	Methylparaben,
	Ethylparaben, Propylparaben;
		2
	Phenoxyethanol,
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,5

	Butylenglycol

D	Produkte der Erfindung	0,01–10%

Formulierung 20c:

A	Carbomer	0,50
	Propylenglycol	3
	Glycerin	5
	Wasser	qsp 100

B	Octylcocoat	5
	Bisabolol	0,30
	Dimethicon	0,30

C	Natriumhydroxid	1,60

D	Phenoxyethanol,	0,50
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben

E	Duftstoffe	0,30

F	Produkte der Erfindung	0,01–10%

Beispiel 21: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Wasser-in-Öl-Typs

A	PEG 30-dipolyhydroxystearat	3
	Caprintriglyceride	3
	Cetearyloctanoat	4
	Dibutyladipat	3
	Traubenkernöl	1,5
	Jojobaöl	1,5
	Phenoxyethanol,	0,5
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben

B	Glycerin	3
	Butylenglycol	3
	Magnesiumsulfat	0,5
	EDTA	0,05
	Wasser	qsp 100

C	Cyclomethicon	1
	Dimethicon	1

D	Duftstoffe	0,3

E	Produkte der Erfindung	0,01–10%

Beispiel 22: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung eines Dreifach-Emulsionstyps (Tripel-Emulsionstyps)

Erste Emulsion W1/O

A	PEG 30-dipolyhydroxystearat	4
	Caprintriglyceride	7,5
	Isohexadecan	15
	PPG-15 Stearylether	7,5
	(”PPG-15 stearul ether”)

B	Wasser	65,3

C	Phenoxyethanol,	0,7
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben

Zweite Emulsion W1/O/W2

A	Erste Emulsion	60

B	Poloxamer 407	2
	Phenoxyethanol,	0,3
	Methylparaben,
	Propylparaben, 2-Brom-2-nitro
	propan-1,3-diol
	Wasser	qsp 100

C	Carbomer	15

D	Triethanolamin	pH 6,0–6,5

E	Produkte der Erfindung	0,01–10%

Beispiel 23: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Lippenstift-Typs und anderen wasserfreien Produkten

A	Mineralwachs	17,0
	Isostearylisostearat	31,5
	Propylenglycoldipelargonat	2,6
	Propylenglycolisostearat	1,7
	PEG 8 Bienenwachs	3,0
	Hydrogeniertes Palmenkernöl	3,4
	Glyceride,
	hydrogenierte Palmenglyceride
	Lanolinöl	3,4
	Sesamöl	1,7
	Cetyllactat	1,7
	Mineralöl, Lanolinalkohol	3,0

B	Castoröl	qsp 100
	Titandioxid	3,9
	Cl 15850:1	0,616
	Cl 45410:1	0,256
	Cl 19140:1	0,048
	Cl 77491	2,048

C	Produkte der Erfindung	0,01–5%

Beispiel 24: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung von wässrigen Gelen (Eyeliner, ”Amincissants” (”slimmer”) usw.)

A	Wasser	qsp 100
	Carbomer	0,5
	Butylenglycol	15
	Phenoxyethanol, Methylparaben,	0,5
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben

B	Produkte der Erfindung	0,01–10%

Beispiel 25: Zubereitung pharmazeutischer Formulierungen, welche das Produkt der Erfindung enthalten
Formulierung 25a: Zubereitung von Tabletten

A Träger in g pro Tablette

Lactose 0,359

Saccharose 0,240

B Produkt der Erfindung 0,001–0,1

Formulierung 25b: Zubereitung einer Salbe

A Träger

Polyethylen geringer Dichte 5,5

Flüssiges Paraffin qsp 100

B Produkt der Erfindung 0,001–0,1

Formulierung 25c: Zubereitung einer injizierbaren Formulierung

A Träger

Isotonische Kochsalzlösung 5 ml

B Produkt der Erfindung 0,001–0,1 g
Phase A und Phase B werden in separate Ampullen verpackt und vor der Verwendung gemischt.
Beispiel 26: Auswertung der kosmetischen Akzeptanz der Produkte der Erfindung
Es wurden toxikologische Tests mit den Verbindungen, die gemäß Beispiel 15 erzielt wurden (ohne Einbau eines Wirkstoffs), durchgeführt, durch eine Haut-Auswertung und eine okulare Auswertung beim Kaninchen, durch die Untersuchung der Abwesenheit anormaler Toxizität bei oraler Einzelverabreichung an die Ratte und durch die Untersuchung des Sensibilisierungsvermögens beim Meerschweinchen.
Auswertung der Anfangsreizung der Haut beim Kaninchen:
Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden ohne Verdünnung mit einer Dosis von 0,5 ml auf die Haut von drei Kaninchen appliziert, gemäß dem Verfahren, das von der Richtlinie der OECD in Bezug auf die Untersuchung ”der akute reizende/ätzende Effekt auf der Haut” empfohlen wird.
Die Produkte wurden gemäß den Kriterien eingeteilt, die in der Entscheidung von 1/2/1982, veröffentlicht im Amtsblatt der französischen Republik (das ”JORF”) vom 21/02/82 definiert sind.
Die Ergebnisse dieser Tests ließen die Schlussfolgerung zu, dass die Zubereitung, welche die Verbindung, die gemäß Beispiel 12 erhalten wurde, enthält, als nicht reizend für die Haut klassifiziert wurde.
Auswertung der okularen Reizung beim Kaninchen:
Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden rein und in einer Einzelverabreichung von 0,1 ml in die Augen von drei Kaninchen eingeträufelt, gemäß dem Verfahren, das durch die Richtlinie der OECD Nr. 405 vom 24. Februar 1987 in Bezug auf die Untersuchung ”der akute reizende/ätzende Effekts auf die Augen” vorgeschlagen wurde.
Die Ergebnisse dieses Tests lassen die Schlussfolgerung zu, dass die Zubereitungen als nicht reizend für die Augen angesehen werden können.
Test bezüglich der Abwesenheit anormaler Toxizität durch orale Einzelverabreichung an die Ratte:
Die beschriebenen Zubereitungen wurden in einer oralen Einzelverabreichung mit der Dosis von 5 g/kg Körpergewicht an 5 männliche Ratten und an 5 weibliche Ratten verabreicht, gemäß einem Protokolls, das an die Richtlinie der OECD Nr. 401 vom 24. Februar 1987 angelehnt wurde und an kosmetische Produkte angepasst wurde.
Es wurde festgestellt, dass LD0 und LD50 größer als 5000 mg/kg sind. Die getesteten Zubereitungen werden daher nicht unter den Zubereitungen eingeteilt, die bei Nahrungsaufnahme gefährlich sind.
Auswertung des Haut-Sensibilisierungspotentials beim Meerschweinchen:
Die beschriebenen Zubereitungen wurden einem Maximierungs-Test unterworfen, der von Magnusson und Kligmann beschrieben wurde, einem Protokoll, welches in Übereinstimmung mit der Richtlinie Nr. 406 der OECD ist. Die Zubereitungen werden als nicht sensibilisierend bei Kontakt mit der Haut eingeteilt.
Auswertung des Mutagenitätspotentials:
Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit der Richtlinie der OECD Nr. 471 (Richtlinie 92/69/EG).
Die Mutagenese-Tests wurden mit ”Salmonella typhimurium” und mit ”Escherichia coli” durchgeführt, gemäß dem Verfahrens von Ames et al. (Mutation Research, 1975, 31, 347–364). Fünf Stämme wurden dem Produkt der Erfindung in Minimalmedium, mit oder ohne exogene Systeme der Metabolismus-Aktivierung (um Pro-Mutagene und Direkt-Mutagene zu unterscheiden), ausgesetzt. Nach Inkubation wurden die mutierten Kolonien gezählt und wurden mit der Anzahl an Kolonien verglichen, die unter den Kontrollen spontan mutierten.
Das Produkt der Erfindung weist keinerlei mutagene Aktivität im Sinn der Richtlinie 92/69/EG) auf.
Auswertung des Sensibilisierungspotentials bei gesunden Freiwilligen (Probanden):
Auswertung des allergenisierenden Potentials des Produktes der Erfindung auf ein Panel (eine Gruppe) Freiwilliger (Probanden). Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Marzulli und Maibach (Contact Dermatitis, 1976, 2, 1–17), welches eine Induktionsphase und einen Auslösungstest („épreuve déclenchante”; „triggering test”) umfasst. Dieser Test wurde mit einem Panel (einer Gruppe) von 100 gesunden Freiwilligen (Probanden) weiblichen und/oder männlichen Geschlechts, in einem Alter von 18 bis 65 Jahren, mit einem beliebigen Hauttyp, durchgeführt.
Es wurde ein abdeckendes Pflaster (”patch occlusive”; ”occlusif patch”), das das Produkt der Erfindung, verdünnt auf 20%, enthielt, auf das Schultergebiet eines jeden der Freiwilligen (Probanden) appliziert. Die Pflaster wurden für 24 Stunden in direktem Kontakt mit der Haut gelassen und wurden alle zwei Tage für 3 Wochen für insgesamt 9 Applikationen immer wieder appliziert. Nach dem Entfernen eines jeden Pflasters wurden die klinischen Anzeichen einer Reizung und einer Hautsensibilisierung ausgewertet = Induktionsphase.
Nach einem Zeitraum von 2 Wochen wurden andere Pflaster, die das Produkt der Erfindung, verdünnt auf 20%, enthielten, auf die Haut der Freiwilligen (Probanden) appliziert und für 24 Stunden in direktem Kontakt mit der Hautoberfläche gelassen. Die klinischen Anzeichen einer Reizung und einer Hautsensibilisierung wurden 24, 48 und 72 Stunden nach dem Entfernen des Pflasters ausgewertet = ”Anregungs”-Phase (”phase challenge”; ”Challenge Phase”).
Keiner der 100 Freiwilligen (Probanden), die in diese Untersuchung involviert waren, zeigte klinische Anzeichen einer Reizung oder einer Hautsensibilisierung, weder während der Induktionsphase noch während der Anregungs-Phase.

Unter den eingehaltenen experimentellen Bedingungen, besitzt das Produkt der Erfindung, verdünnt auf 20%, kein allergenisierendes Potential.

Anhang 2: Ergebnisse des Screenings nach Molekülen, welche die Penetration stimulieren (Tabelle 8).

INCI-Name	Stimulierungsfaktor	Lebensfähigkeit	Visualisierung
Polyethylenimin 25 kDa	34,7	74,1	+
Cocodimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Weizenprotein	4,3	86	-
Cocodimoniumhydroxypropyl-hydrolisiertes Reisprotein	18	85	-
Steadimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Weizenprotein	4,6	86,4	-
Lauryldimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Weizenprotein	6,2	87,5	-
Hydroxypropyltrimonium-hydrolysiertes Weizenprotein	1,3	91,7	-
Hydroxypropyltrimoniumhonig	15	92	-
Natriumlauroylhafer-Aminosäuren	0,8	76,6	-
Natriumlauroylweizen-Aminosauren	1,1	46,1	-
Cocoamin	32,7	79,7	+
Lauryldimoniumhydroxypropyl hydrolysiertes Sojaprotein	38,8	87,9	+
Chitosan	10,3	99	-
Hydroxypropylguarhydroxy-propyltrimoniumchlorid	1,1	74,8	-
Hydroxypropylguar	–0,2	91,1	-
Hydroxypropylguar	–0,4	97,5	-
Hydroxypropylguar-hydroxypropyltrimoniumchlorid	1,4	71,2	-
Guarhydroxypropyltrimonium	0,6	53,3	-
Meypro	1	91,6	-
Polyquaternium 7	0,3	80,1	-
Polyvinylpyrrolidon (1)	1,4	85,1	-
Polyvinylcaprolactam	4,1	0	-
Polyvinylpyrrolidon (2)	0,7	26,6	-
Polyvinylpyrrolidon (3)	0,7	71	-
Polyquaternium 16 (1)	4,6	83,5	-
Polyquaternium 11(1)	1,5	49,7	-
Cocotrimoniummethosulfat	0,1	55	-
Polyquaternium 16 (2)	8,4	33,8	-
Polyquaternium 16 (3)	1	38,8	-
Polyquaternium 16 (4)	12,5	67,1	-
Polyquaternium 16 (5)	0,2	85,3	-
Polyquaternium 44	0,8	59,7	-
Cocoalkoniumchlorid	5,6	36,3	-
Cocotrimoniumchlorid	–0,2	65,6	-
Tetrahydroxypropylethylendiamin	1,9	95,3	-
Stearamidopropylcetearyldimoniumtosylat und PG	13,1	93,2	-
Quaternium 70 und PG	–0,2	63,9	-
Quaternium 26	30,9	59,2	-
Quaternium 22	2	98,9	-
Polyquaternium 28	0,6	79,3	-
Polyquaternium 11 (2)	2,9	50,7	-
Polyquaternium 11 (3)	2,9	77,1	-
Polyquaternium 2	4,2	23,6	-
Stearalkoniumchlorid	17,6	37,4	-
Propylamin C3	0,9	103,3	-
n-Butylamin C4	1,4	106,2	-
Dibutylamin 2 C4	0,7	75,7	-
Hexylamin C6	0,2	82,1	-
Heptylamin C7	3,7	39,4	-
Dioctylamin 2 C8	1	34,7	-
Decylamin C10	39,6	68,5	+
Didecylamin 2 C10	1,2	28,3	-
Undecylamin C11	95,3	84	+
Dodecylamin C12	47,1	57	+
Tridecylamin C13	44,5	62,6	+
Tetradecylamin C14	11,6	54,8	-
Pentadecylamin C15	14,9	73	-
Octadecylamin C18	19,6	61,2	-
Oleylamin C18:1	1,9	87,1	-

↑ Anhang 2, Tabelle 8 (Fortsetzung)

Claims

Verwendung von Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, zu stimulieren, und die ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst; oder b) einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; als kosmetisches Mittel, das die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff stimuliert, zur Herstellung einer topischen kosmetischen Zusammensetzung; oder zur Herstellung einer topischen pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein b) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus quaternisierten Weizenproteinen, quaternisiertem Reisprotein, quaternisiertem Sojaprotein.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Monoamin a) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Decylamin, Undecylamin, Dodecylamin, Tridecylamin, oder einer Mischung aus primären Aminen, die eine Kohlenwasserstoffkette von C10 bis C13 aufweisen.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen mindestens ein Lecithin in der Lipidphase, extrahiert aus einer natürlichen Quelle, umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Soja, Raps, Sonnenblume, Lupine, Erdnuss, Sesam, Kürbis, Kleieöl, großsamiger Leimdotter, Ringelblume, Leinen (Flachs) und Hanf, einzeln oder in einer Mischung.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen in der Lipidphase Cholesterol oder Cholesterylhemisuccinat als eine Substanz umfassen, die die Membranen versteift.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen in der Lipidphase mindestens ein Tensid („surfactant agent”) oder einen Oberflächen-aktiven Stoff („surfactant”) als Substanz umfassen, der die Membran der Liposomen verflüssigt.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine fluoreszierende Substanz oder eine fluoreszierende Komponente enthalten, der/die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, umfassend ungefähr 0,01 Gewichts-% 5-Pentafluorbenzoylaminfluorescein, von der Zusammensetzung, welche Liposomen enthält.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Substanz(en), welche die intrazelluläre Penetration stimuliert/stimulieren, von 0,05 Gewichts-% bis 25 Gewichts-% einer Zusammensetzung, welche die Liposomen enthält, liegt.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Substanz(en), welche die intrazelluläre Penetration stimuliert/stimulieren, von 0,5 Gewichts-% bis 2,5 Gewichts-% einer Zusammensetzung, welche die Liposomen enthält, liegt.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fettmonoamin ein quaternisiertes primäres Monoamin ist, das eine einzige Fett-Kohlenstoffkette von C10 bis C13 umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein hydrolysiert ist oder nicht, hydroxyalkyliert ist oder nicht.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein hydroxypropyliert ist oder nicht.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ und R₂ des quaternisierten Pflanzenproteins Methyl oder Ethyl sind.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R₃ des quaternisierten Pflanzenproteins 12 Kohlenstoffatome (Lauryl) aufweist.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein der Formel R-N(R₁R₂R₃) Lauryldimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein oder Cocodimonium hydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein ist.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer antiradikalbildenden Substanz wie Vitamin E, einem Flavonoid, einem Carotinoid, Vitamin C; einer depigmentierenden Substanz wie Catechin, Hydroquinon, Arbutin, Phytinsäure, Ellagsäure, Vitamin C; einer abbauenden (Schlankheits-)Substanz wie mindestens einem Xanthin; einer Haut- oder Haar-pigmentierenden Substanz wie Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, einem Coleus-Extrakt.
Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; umfaßt, das die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, stimuliert.
Liposomen gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus quaternisierten Weizenproteinen, quaternisiertem Reisprotein und quaternisiertem Sojaprotein.
Liposomen gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein hydrolysiert ist oder nicht, hydroxyalkyliert ist oder nicht.
Liposomen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein hydroxypropyliert ist oder nicht.
Liposomen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ und R₂ des quaternisierten Pflanzenproteins Methyl oder Ethyl sind.
Liposomen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass R₃ des quaternisierten Pflanzenproteins 12 Kohlenstoffatome (Lauryl) aufweist.
Liposomen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternisierte Pflanzenprotein der Formel R-N(R₁R₂R₃) Lauryldimoniumhydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein oder Cocodimonium hydroxypropyl-hydrolysiertes Sojaprotein ist.
Kosmetische oder dermokosmetische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie Liposomen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 in einer Mischung mit einem kosmetisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische oder dermopharmazeutische Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass sie Liposomen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23 in einer Mischung mit einem kosmetisch akzeptablen Träger umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Substanz, welche die intrazelluläre Penetration stimuliert, von 0,05 Gewichts-% bis 25 Gewichts-% der Endzusammensetzung, bevorzugt von 0,5 Gewichts-% bis 2,5 Gewichts-% der Endzusammensetzung, liegt.
Verfahren zum Durchführen des Screenings nach mindestens einer Substanz, ausgewählt aus a) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst; oder b) einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; die potentiell in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs zu stimulieren, die/der durch die Liposomen gemäß den Ansprüchen 17–23 und Liposomen, die mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst, befördert wird; dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) Zubereiten einer hydro-lipidischen Mischung, welche in der Lage ist, die Liposomen gemäß den Ansprüchen 17–23 und Liposomen, die mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin, das eine einzige C10 bis C13-Fettkette umfasst, zu bilden; b) Hinzufügen einer fluoreszierenden Verbindung, welche vorzugsweise in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, vor dem Dispersionsprozess d) in/zu diese(r) hydrolipidischen Mischung; c) Hinzufügen einer Testsubstanz, ausgewählt aus der Substanz, die potentiell aktiv und die in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration zu stimulieren, und einer Referenzsubstanz in die hydro-lipidische Mischung vor oder während des Dispersionsprozesses d); d) Dispersionsprozess zur Zubereitung der Liposome aus der hydro-lipischen Mischung, wie sie entweder in Schritt b) oder in Schritt c) erhalten wurde; e) 2 bis 48 Stunden Inkubation der Zubereitung mit Fibroblasten; f) Detektieren von mindestens der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung durch Messung der intrazellulären Fluoreszenz.
Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Ergebnis der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung verglichen wird mit der intrazellulären Penetration, die mit einer Referenzsubstanz erzielt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zytotoxizität und/oder die Induktion von Apoptose der Substanz, die potentiell aktiv ist, bestimmt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Verbindung, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, eine fluoreszierende Verbindung ist, die nicht spontan in Fibroblasten in Kultur penetriert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Verbindung Pentafluorbenzoylaminofluorescein ist oder umfasst, welches bei einer Konzentration von 0,01 Gewichts-% der Endzusammensetzung, welche die Liposomen enthält, verwendet wird, welche zur Auswertung der intrazellulären Penetration verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Verbindung in Gegenwart von Polyethylenimin eingebaut wird, wobei die fluoreszierende Verbindung und das Polyethylenimin in einer nicht cytotoxischen Konzentration vorliegen.