KR20050112498A

KR20050112498A - 세포 내 침투를 촉진하는 지방족 모노아민 또는 양이온성중합체를 포함하는 수화층판상 또는 리포좀, 그것의스크리닝 방법 및 이를 포함하는 화장료 혹은 약제학적조성물

Info

Publication number: KR20050112498A
Application number: KR1020040104333A
Authority: KR
Inventors: 안드레발레리; 본넷이사벨; 페리에르에릭
Original assignee: 꼴레띠까
Priority date: 2004-05-25
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2005-11-30
Also published as: DE102004045186B9; GB0422048D0; FR2870741A1; JP5220546B2; ES2268946B2; US20050266065A1; DE102004045186B4; ES2268946A1; JP2005350445A; DE102004045186A1; JP4950419B2; KR100697361B1; JP2009108056A; FR2870741B1; US9655822B2; GB2415375A; GB2415375B

Abstract

본 발명은 폴리에틸렌이민 또는 다음의 군에서 선택되는 세포 내 침투를 촉진하는 물질 중 어느 하나를 포함하는 신규한 수화층판상 또는 리포좀에 관한 것이다:

i) C10과 C18이 탄소사슬로 연결되어 있는 지방족 모노아민;

ii) 양이온성 중합체,

단, 적어도 하나의 형광물질은 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없어야 하며, 이러한 침투는 가시적으로 볼 수 있어야 함.

이들 리포좀은 물질 또는 활성성분의 세포 내 침투를 촉진하는데 있어 화장품 또는 약학분야에서 매우 유용하다.

Description

세포 내 침투를 촉진하는 지방족 모노아민 또는 양이온성 중합체를 포함하는 수화층판상 또는 리포좀, 그것의 스크리닝 방법 및 이를 포함하는 화장료 혹은 약제학적 조성물{Hydrated lamellar phases or liposomes which contain a fatty monoamine or a cationic polymer which promotes intracellular penetration, and a cosmetic or pharmaceutical composition containing same, as well as a method of screening such a substance}

본 발명은 수화층판상 또는 리포좀에 의해 운반되는 물질 또는 활성성분의 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 물질을 포함하는 수화층판상 또는 리포좀에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 수화층판상 또는 리포좀에 있거나 운반되는 적어도 하나의 활성성분의 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 물질 또는 혼합물을 그들 구조의 일부분에 포함하는 수화층판상 또는 리포좀에 관한 것으로, 상기 물질은 폴리에틸렌이민 또는 본 명세서 및 청구항에 기재된 C10과 C18 사이에 탄소사슬로 연결되어 있는 지방족 모노아민, 또는 본 명세서 및 청구항에 기재된 양이온성 중합체 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택되며, 선택적으로 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없는 형광물질, 예를 들어, 펜타플루오로벤조일아미노 플루오레신(pentafluorobenzoylamino fluorescein)을 포함하며, 이러한 침투는 가시적으로 볼 수 있으며, 주로 세포 내 침투를 촉진하기 위해 활성가능성이 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 관찰될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 화장료 또는 피부화장료 조성물, 또는 약제학적 조성물 또는 피부약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명 화장료 또는 피부화장료 조성물을 대상 피부 또는 모발에 바르는 것을 포함하는 코스메틱 케어방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수화층판상 또는 리포좀에 있거나 운반되는 물질 또는 활성성분의 특성에 따라 주로 주름예방활성, 항산화활성, 슬리밍활성, 미백활성, 피부 또는 모발 염색활성을 위한 화장료 조성물 제조용 화장료 제제로서 수화층판상 또는 리포좀의 이용에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 세포 내 침투를 촉진하는데 활성이 있는 물질을 탐지하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

최근에, 양이온성 리포좀, 즉 CATESOMES™이 미국 특허 제6,071,535(Hayward)에 기술되어 있다. 상기 리포좀은 pH와 주변 배지의 이온력에 매우 민감하며, Nn,N,-디메틸-1,n-디아미노 알킬 타입의 디아민 지방족 알킬 암모늄 지방족 알킬염(Nn,N,-dimethyl-1,n-diamino alkyl type diamine fatty alkyl ammonium fatty acyl salts), DDA로 불리는 디아민, 2번과 8번에 n개의 탄소원자를 갖는 알킬기(5단 37 내지 39줄 참조), 10 내지 30개의 탄소원자를 갖는 지방산으로 이루어진 지방산의 알킬화된 부분(ADDA)으로 구성되어 있다(5단 41 내지 48줄 참조).

상기 ADDA 물질은 미국 뉴저지주 서머빌에 위치한 피닉스 케미칼사에서 CATEMOL 이라는 상품명으로 제조 판매되고 있으며, 제품번호는 CATEMOL 220과 260이다.

CATESOMES은 A-ADDA 염을 형성하기 위해 10 내지 28개의 탄소원자를 갖는 지방산, 예를 들어 비헨산(behenic acid)을 결합시키고, ADDA의 4개의 아민기와 지방산의 카르복실기 간의 염을 형성하기 위해 pH 6∼10에서 같은 농도로 제조된 혼합물을 결합시킴으로써 제조된다(5단 66줄∼6단 4줄 참조).

Hayward의 특허에는 스테롤 헤미석시네이트의 제3염과 같은 스테롤과 유기산염 형태를 포함하는 이중층으로 된 일반적인 리포좀에 관해 기술하고 있는 미국특허 제4,721,612호를 인용하고 있다(5단 13 내지 18줄 참조).

본 발명의 주요 목적은 기대하지 않은 방식으로, 유리하게는 피부 또는 모발세포에서 물질 또는 활성성분의 세포 내 침투를 증가시킬 수 있고 동시에 상기 세포의 세포독성 또는 세포사멸의 유도를 제한할 수 있는 신규한 수화층판상 또는 리포좀을 제공함에 있어 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 기대하지 않은 방식으로, 유리하게는 피부 또는 모발세포에서 물질 또는 활성성분의 세포 내 침투를 촉진할 뿐만 아니라 상기 수화층판상 또는 리포좀에서 유래된 상기 물질 또는 활성성분을 비교적 높은 비율로 캡슐화시킬 수 있는 신규한 수화층판상 또는 리포좀을 제공함에 있어 기술적 문제를 해결하고자 한다.

본 발명의 다른 주 목적은 기대치 않은 방식으로, 유리하게는 피부 또는 모발세포에서 물질 또는 활성성분의 세포 내 우수한 침투력을 갖는 반면, 동시에 상기 세포의 세포독성 또는 세포사멸(또는 apoptosis)의 유도를 제한하는 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 신규한 화장료 또는 피부화장료, 약제학적 또는 피부약제학적 조성물을 제공함에 있어 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.

본 발명의 다른 주 목적은 기대치 않은 방식으로, 유리하게는 피부 또는 모발세포에서 물질 또는 활성성분의 세포 내 침투를 개선하기 위해 활성가능성이 있는 물질을 스크리닝하고, 바람직하게는 상기 세포의 세포독성 또는 세포사멸의 유도를 평가하는 신규한 방법을 제공함에 있어 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.

이들 기술적 문제들은 우선 안전하고 신뢰할 수 있는 방식으로 해결되며, 화장품 또는 약학 및 산업분야에서 이용될 수 있다.

따라서, 일 특징에 따르면, 본 발명은 수화층판상 또는 리포좀을 제공한다. 이들은 상기 수화층판상 또는 리포좀에 있거나 운반되는 적어도 하나의 활성성분의 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 물질 또는 혼합물을 그들의 구조 상에 적어도 한부분에 포함하고 있으며, 다음의 군에서 선택됨을 특징으로 한다:

a) 폴리에틸렌이민,

b) C10과 C18 사이에 탄소사슬을 갖는 1기, 2기, 3기 또는 4기 지방족 모노아민, 유리하게는 한 개의 C10-C18 지방사슬을 포함하는 모노아민, 바람직하게는 한 개의 C10-C18 지방사슬을 포함하는 1기 또는 4기 모노아민,

c) 양이온성 중합체, 특히 양이온성 천연 중합체 또는 선택적으로 양이온을 띠는 중합체 또는 양이온성 합성 중합체,

단, 상기 수화층판상 혹은 리포좀은 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없는 형광물질, 예를 들어 펜타플루오로벤조일아미노 플루오레신(pentafluorobenzoylamino fluorescein)을 선택적으로 적어도 하나 포함하고, 이러한 침투는 가시적으로 볼 수 있음.

구체예에 따르면, 상기 수화층판상 또는 리포좀의 양이온성 천연 중합체는 키토산, 4분자의 벌꿀 중합체, 식물 단백질, 특히 밀 단백질 또는 4분자의 밀 단백질, 벼 단백질 또는 4분자의 벼 단백질, 콩 단백질 또는 4분자의 콩 단백질, 콜라겐 또는 4분자의 콜라겐, 케라틴 또는 4분자의 케라틴, 카제인 또는 4분자의 카제인, 4분자의 셀룰로우즈 또는 4분자의 구아(guar)로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 한다. 이들 4분자 중합체는 일반적으로 상품으로 판매되고 있으며, 4분자화(quaternisation)는 일반적으로 3기 아민을 최초 중합체의 화학기에 융합시켜 얻는다.

다른 유리한 구체예에 따르면, 상기 수화층판상 또는 리포좀의 1기 모노아민은 데실아민, 운데실아민, 도데실아민, 트리데실아민, 테트라데실아민, 펜타데실아민, 옥타데실아민으로 구성된 군에서 선택되거나 또는 C8과 C18 간의 탄화수소 사슬을 갖는 코프라(copra) 아민 혼합물과 같은 1기 모노아민의 혼합물임을 특징으로 한다.

구체예에 따르면, 수화층판상 또는 리포좀은 폴리에틸렌이민을 포함한다.

다른 구체예에 따르면, 수화층판상 또는 리포좀은 지질상에서 리포좀막을 변형하는 적어도 하나의 제제, 예를 들어 트리글리세라이드, 극성 인지질, 또는 극성 스핑고리피드로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택되는 극성지질을 포함한다.

다른 구체예에 따르면, 상기 극성 인지질은 포스파티딜콜린 또는 레시틴, 포스파티딜에탄올아민 또는 세팔린, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤 또는 카디오리핀, 포스파티딜이노시톨로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택한다.

유리하게는, 상기 극성 인지질은 세라마이드, 스핑고포스포리피드, 글리코스핑고리피드로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택한다.

다른 변형예에 따르면, 수화층판상 또는 리포좀은 극성지질 또는 극성 스핑고리피드, 특히 스테롤 헤미석시네이트의 트리스 셀(tris-sel)과 같은 스테롤의 유기산염의 형태를 적어도 하나 포함한다.

본 발명의 다른 유리한 구체예에 따르면, 수화층판상 또는 리포좀은 지질상에 대두, 포도, 해바라기, 루핀, 땅콩, 참깨, 서양호박, 브랜 오일(bran oil), 동백오일, 금잔화, 아마 및 대마로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택되는 천연물질에서 추출한 레시틴을 적어도 하나 포함한다.

다른 변형예에 따르면, 수화층판상 또는 리포좀은 또한 막을 견고하게 하기 위한 제제로서 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 헤미석시네이트와 같은 콜레스테롤 유도체를 포함할 수 있다.

본 발명의 다르 유리한 구체예에 따르면, 수화층판상 또는 리포좀은 지질상에 수화층판상 또는 리포좀 막을 유동시킬 수 있는 제제로서 계면활성제제(surfactant agent) 또는 계면활성제(surfactant)를 적어도 하나 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 특정 구체예에 따르면, 라메라상 또는 리포좀은 세포 내 침투 시 특히 피부 또는 모발 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없는 형광물질을 포함한다. 상기 형광물질에 대한 바람직한 실시예에는 5-펜타플루오로벤조일-아민플루오레신을 포함하거나 또는 그것으로 구성되며, 특히 상기 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 조성물의 중량당 약 0.01%의 비율로 포함한다.

본 발명의 유리한 구체예에 따르면, 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 농도는 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 조성물의 중량당 0.05∼25%이며, 바람직하게는 상기 조성물 중량당 0.5∼2.5%이다.

본 발명의 다른 유리한 구체예에 따르면, 상기 지방족 모노아민은 C10과 C13 사이에 탄소사슬을 가지고 있다. 유리하게는, 상기 지방족 모노아민은 C10과 C18, 바람직하게는 C10과 C13 사이에 1개의 지방족 탄소사슬을 포함하고 있다.

본 발명의 다른 유리한 구체예에 따르면, 활성성분의 세포 내 침투를 촉진하는 4분자로된 물질은 4분자의 식물 단백질 용액, 바람직하게는 대두 단백질 용액에서 선택한다. 상기 단백질 용액은 R-N(R₁R₂R₃) 타입의 4분자 형태이며, 단, R은 가수분해되거나 혹은 그렇지 않은, 하이드로알킬화되거나 특히 하이드로프로필화되거나 혹은 그렇지 않은 식물 단백질 분자를 나타내며, R₁과 R₂는 각각 C1-C6 탄화수소이며, 바람직하게는 메틸 또는 에틸기이며, R₃는 10 내지 18개의 탄소 원자를 갖는, 바람직하게는 주로 12개의 탄소 원자(lauryl)를 갖는 알킬 라디칼이다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 수화층판상 또는 리포좀에 있거나 운반되는 물질 또는 활성성분은 비타민 E, 플라보노이드, 카로티노이드, 비타민 C 또는 그들 유도체와 같은 항-라디칼 제제, 카테킨, 하이드로퀴논, 알부틴, 파이트산(phytic acid), 엘라그산(ellagic acid), 비타민 C 혹은 그들의 유도체와 같은 탈색제, 잔틴과 같은 슬리밍제제, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌, 콜레우스 추출물 또는 그들의 유도체와 같은 피부 또는 모발 염색제로 구성된 군에서 선택한다.

두번째 특징에 따르면, 본 발명은 세포 내 침투를 촉진하는 물질을 적어도 하나 포함하는 수화층판상 또는 리포좀과, 선택적으로 화장료, 피부화장료, 약제학, 피부약제학적으로 적합한 부형제를 포함하는 화장료 또는 피부화장료 조성물, 약제학 또는 피부약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 부형제는 당업자에게는 잘 알려져 있으며, 어떤 것은 종래기술에서 언급한 2개의 종래기술 관련 자료에서 인용되어 있다.

다른 종류의 부형제들은 단지 일 예로 설명하고 있을 뿐 본 발명의 범주에 한정하지 않는 방식으로써, 다음에서 설명하는 화장료, 피부화장료, 약제학적 또는 피부약제학적 조성물의 실시예에서 기재하고 있다.

세번째 특징에 따르면, 본 발명은 상기에서 언급하고 또는 본 발명의 필수 구성요소로써 실시예를 통해 다음에서 설명하고 있는 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 조성물을 피부 또는 모발에 국소적으로 투여하는 것을 포함하는 코스메틱 케어방법에 관한 것이다.

네번째 특징에 따르면, 본 발명은 상기에서 언급하고 또는 본 발명의 필수 구성요소로써 실시예를 통해 다음에서 설명하고 있는 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 조성물을 피부 또는 모발에 국소적으로 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법에 관한 것이다. 일반적으로, 수화층판상 또는 리포좀은 치료 대상과 관련된 활성을 갖는 상기 수화층판상 또는 리포좀에 있거나 운반되는 활성성분을 적어도 하나 포함한다.

코스메틱 케어와 관련하여, 본 발명은 주름예방효과, 항산화효과, 슬리밍효과, 미백효과, 피부 또는 모발 염색효과와 같은 코스메틱 케어를 제공한다.

치료와 관련하여, 본 발명은 치료되는 병인의 작용에 따라 피부 또는 모발의 적절한 치료를 제공한다.

본 발명은 각각의 경우 바람직하게는 국소투여를 통해, 주로 주름예방활성, 항산화활성, 슬리밍활성, 미백활성, 피부 또는 모발 염색제용 화장료 조성물의 제조용, 또는 약제학적 조성물의 제조용 화장품으로써, 수화층판상 또는 리포좀의 이용에 관한 것이다.

다섯번째 특징에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함함을 특징으로 하는 수화층판상 또는 리포좀에 의해 운반되는 물질 또는 활성성분의 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 적어도 하나의 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다:

a) 상기 수화층판상 또는 상기 리포좀을 형성할 수 있는 물-지질 혼합물의 제조단계,

b) 상기 물-지질 혼합물에서 분산 과정 전에, 바람직하게는 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없는 형광물질을 결합시키는 단계,

c) 물-지질 혼합물에서 분산 전 또는 분산과정 동안, 세포 내 침투를 촉진할 수 있는, 활성가능성이 있는 상기 물질에서 선택되는 시험 물질과 비교물질을 선택적으로 결합시키는 단계,

d) 상기 b) 또는 c) 단계 중 어느 하나에서 얻은 물-지질 혼합물로부터 수화층판상 또는 리포좀을 형성하는 적절한 방법에 따라 상기 수화층판상 또는 리포좀을 제조하는 단계, 및

e) 세포 내 형광을 측정하여 형광물질의 세포 내 침투를 탐지하는 단계.

다른 구체예에 따르면, 형광물질의 세포 내 침투 결과는 특히 폴리에틸렌이민을 포함하여 비교물질에서 얻은 세포 내 침투와 비교한다.

다른 구체예에 따르면, 활성가능성이 있는 물질의 세포독성 및/또는 세포사멸의 유도는 주로 배양섬유아세포, 바람직하게는 정상 인간의 배양섬유아세포에서 측정한다.

다른 구체예에 따르면, 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없는 형광물질은 상기 배양섬유아세포에 자발적으로는 침투하지 않는 형광물질이다.

다른 구체예에 따르면, 형광물질은 펜타플루오로벤조일아미노플루오레신을 포함하거나 혹은 상기 물질이며, 세포 내 침투를 평가하기 위해 사용되는 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 최종 조성물의 중량당 0.01%의 농도로 이용된다.

본 발명 방법의 다른 유리한 구체예에 따르면, 상기 형광물질은 폴리에틸렌이민을 첨가한 상태에서 결합되며, 이때 형광물질과 폴리에틸렌이민은 세포독성이 없는 농도로 첨가된다.

본 발명의 다른 유리한 구체예에 따르면, 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 물질은 상기에서 설명되거나 혹은 본 발명의 필수 구성요소인 실시예를 참조하여 다음에서 설명하는 바와 같이, 수화층판상 또는 리포좀에 결합되는, C10과 C18 사이에, 바람직하게는 C10과 C13사이에 알킬사슬을 갖는 1기 지방족 모노아민 또는 양이온성 중합체, 특히 선택적으로 양이온을 띠는 천연 중합체, 또는 양이온성 합성 중합체에서 선택된다.

여섯번째 특징에 따르면, 본 발명은 상기에서 설명되거나 혹은 본 발명의 필수 구성요소인 실시예를 참조하여 다음에서 설명하는 바와 같이, 화장품 또는 화장료 조성물의 제조용 및 주로 주름예방활성, 항산화활성, 슬리밍활성, 미백활성, 피부 또는 모발 염색활성용으로서 수화층판상 또는 리포좀의 이용에 관한 것이다.

상기 특징들 중 어느 하나와 관련하여, 계면활성제는 리포좀 막을 유동시키기 위해 유리하게는 물-지질 혼합물에 첨가될 수 있다.

본 발명은 예를 들어 배양섬유아세포에 자발적으로 침투할 수 없고, 그 자체로 또는 리포좀으로 캡슐화한 후 세포독성을 거의 유도하지 않으며, 예를 들어 대두 레시틴으로 제조된 리포좀에 다량 결합되며(80%), 캡슐화 후 안정적이며(형광의 방출과 변화가 없음), 리포좀의 불안정성을 유도하지 않는 형광성 추적물질을 선택하여야 한다. 선택한 추적물질은 0.01% 즉, 최종 185μM의 농도의 5-펜타플루오로벤조일아미노플루오레신 또는 PFB-F 가 유리하다.

유리하게는, 리포좀을 제조하는 동안 분산방법은 바람직하게는 전단(shearing), 초음파(ultrasound), 압출성형(extrusion), 수화/탈수(hydration/dehydration), 동결/건조(freezing/thawing, lyophilisation), 역상 증발(reverse phase evaporation) 중에서 선택한다.

리포좀(층판(lamella) 구조)은 투과전자현미경(trasmission electronic microscopy)으로 확인하였다. 리포좀의 크기는 투과전자현미경과 레이저 입자 크기 분석법(laser particle size analysis)으로 측정하였다.

유리하게는, 리포좀은 pH 4∼8에서, 바람직하게는 pH 6에서 제조하였다.

유리하게는, 활성성분의 세포 내 침투는 피부세포에서 이루어진다.

유리하게는, 활성성분의 피부세포 내 침투는 주로 섬유아세포, 각질형성세포 및 멜라닌형성세포(melanocyte)를 표적(target)으로 한다.

세포 내 침투는 정량화 및 시각화(visualisation) 기술, 그리고 바람직하게는 형광현미경 및 형광광학현미경 하에서 형광 강도의 정량화를 통해 탐지한다.

유리하게는, 물질들은 우선, 양이온성 물질을 전혀 포함하지 않은 음성 대조군보다 10% 이상으로, 유리하게는 양이온성 비교물질인 50μM의 폴리에틸렌이민을 포함하는 양성대조군에 비해 같거나 혹은 더 큰 정도로 형광 추적물질의 세포 내 침투를 촉진하는 데 효과가 있는 것으로 보인다. 두번째로, 선별된 상기 물질들은 세포독성 및/또는 세포사멸 현상을 유도하지 않거나 또는 양이온성 비교물질(50μM의 폴리에틸렌이민을 포함함)과 비교하여 낮은 세포독성 및/또는 세포사멸 현상을 유도해야 한다.

유리하게는, 세포 내 침투를 촉진하기 위해 선별된 활성물질은 다음으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 한다:

a) 다양한 길이의 탄소사슬을 포함하는 1기 내지 4기 아민, 유리하게는 데실아민, 운데실아민, 도데실아민, 트리데실아민, 테트라데실아민, 펜타데실아민, 옥타데실아민, 벤질디메틸(옥타데실) 암모늄 클로라이드(또는 스테아릴알코니움 클로라이드), 1기 아민의 혼합물(예를 들어 C8 내지 C18의 코프라 아민), 폴리퀀터니움 16(polyquaternium 16),

b) 양이온성 중합체 및 유리하게는 키토산 또는 4분자 벌꿀, 식물 단백질 특히 밀 단백질, 벼 단백질, 대두 단백질 또는 그들의 4분자 유도체, 4분자 셀룰로우즈 또는 구아.

유리하게는, 사용된 양이온성 제제의 농도는 0.05%∼25%, 바람직하게는 0.5∼2.5%, 바람직하게는 1%임을 특징으로 한다.

유리하게는, 세포 내 침투를 촉진하기 위해서는 중간 길이의 탄소사슬(C10∼C13), 평균 C15∼C18의 사슬길이 및 짧은 사슬(C10 미만)이 적당하다.

유리하게는, 세포 내 침투를 촉진하기 위해서는 2개의 같은 탄소사슬, 예를 들어 C10-NH-C10을 포함하는 2기 아민과 비교하여 입체적 장애(steric hindrance)가 유발되기 때문에 1기 아민이 적당하다.

유리하게는, 어떤 종류의 4분자 중합체는 선별된 중합체 소스로부터 얻게 되는 세포 내 침투를 촉진함에 있어 보다 효과적인 인자(factor)일 수 있다. 예를 들어, 로릴디모니움 하이드록시프로필(lauryldimonium hydroxypropyl) 가수분해된 밀 단백질은 로릴디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 대두 단백질보다 약 6배 정도 덜 효과적이다.

유리하게는, 선별된 양이온성 분자들은 비교물질 즉, 50μM의 폴리에틸렌이민보다 세포독성 및/또는 세포사멸을 덜 유도한다.

유리하게는, 세포독성은 세포의 알칼라인 포스파타아제의 활성을 평가하는 세포 생존능 테스트와 인터루킨 1 알파 측정법을 통해 정량화하였다. 세포사멸은 카스파아제-1(caspase-1)을 정량화하여 평가하였다.

유리하게는, 상기의 개선방법을 통해 제조한 리포좀은 화장료, 피부화장료 또는 약제학적 활성성분의 세포 내 침투를 증가시키기 위해 사용되며, 형광 추적물질을 대신하여 이용된다.

본 발명의 다른 목적, 특징들 및 잇점들은 다음 실시예를 들어 설명함으로써 당업자에게는 명백할 것이다.

실시예는 본 발명의 필수 구성부분을 이루고 있으며, 이로부터 나타나는 종래기술과 비교하여 신규한 특징은 기능과 보편성에 있어서 본 발명의 구성요소를 이룬다.

따라서, 모든 실시예는 일반적인 범주 내에 포함된다.

더욱이, 실시예에서, 퍼센트는 별도로 언급하지 않을 경우에는 중량당 퍼센트를, 온도는 섭씨온도를, 압력은 대기압을 뜻한다.

실시예 1: 형광 추적물질로 캡슐화한 리포좀의 제조 및 정제

형광 추적물질은 실험 시 방사능에 안전할 뿐만 아니라 세포배양모델에서 세포 내 침투를 가시적으로 입증하고 정량화함에 있어 매우 간단하므로 종종 이용된다.

0.01%의 수용성 또는 지용성 추적물질을 포함하는 리포좀을 제조하고, 정상인간의 섬유아세포에 투여하기 전에 결합되지 않은 추적물질을 제거하기 위해 그들을 정제하여야한다. 대조군으로 사용될 리포좀은 형광 추적물질을 첨가하지 않고 제조하였다.

a) 리포좀 제조 공정

55mM 트리즈마 희석용 완충액(Trizma dilution buffer, 27mM NaCl로 pH5로 조정함, 프랑스 시그마사 제품)에 녹인 20% 대두 레시틴을 이용하여 리포좀을 제조하였다. 실온에서 30분 동안 마그네틱바를 이용하여 교반한 후, 상기 혼합액을 10분 동안 격렬하게 균질화하였다. 그 후, 농도별(0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10%) 대두 레시틴을 얻기 위해, 리포좀을 DF 배지[DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 Glutamax 50/50 v/v, 10% 우혈청, 최종농도 100UI/mL의 페니실린, 최종농도 1㎍/mL의 젠타마이신, 최종농도 1㎍/mL의 암포테리신 B를 첨가함]로 희석하였다.

250㎕ 리포좀 현탁액을 복부(abdominal plasy) 유래의 정상 인간 배양섬유아세포에 첨가하고, 96웰 플레이트에서 배양하였다. 각 농도는 6개의 다른 웰에서 시험하였다. 세포 생존능은 pH7.4의 인산염 완충액으로 3번 씻은 후 세포 내 알칼라인 포스파타아제 활성을 측정하는 파라니트로페닐포스페이트를 이용한 테스트를 통해 평가하였다. 세포의 생존율은 배양웰에서 리포좀을 첨가하지 않는 대조군과 비교하여 계산하였다(n=6).

그 결과, 0.5∼7.5% 농도의 레시틴에서 85% 이상의 세포 생존능을 볼 수 있었다., 10%의 레시틴 농도에서, 생존능은 75% 이하로 내려갔다.

5%의 농도에서 90% 이상의 세포 생존능을 얻을 수 있었으므로 상기 농도를 선택하였다.

b) 형광 추적물질이 결합된 5% 대두 레시틴 리포좀의 제조

0.5g의 대두 레시틴, 0.01%의 형광 추적물질(구입사의 프로토콜에 따라 미리 녹인 상태)를 디쉬(dish)에 첨가하고 10mL의 트리즈마 완충액으로 희석하였다. 실온에서 마그네틱바를 이용하여 30분간 교반한 후, 혼합액을 10분 동안 격렬하게 균질화시키고, 균질화의 엄격한 조건에 따라 상기로부터 얻은 리포좀 용액 내 리포좀의 평균 크기는 100∼800 nm으로 다양할 수 있다.

리포좀 내에 캡슐화되는 추적물질의 분획으로부터 캡슐화되지 않은 추적물질 분획을 분리하기 위해 정제하였다. 이를 위해, 리포좀 용액을 코니칼 튜브에 넣고 실온에서 1,790 xg, 10분 동안 원심분리하였다. 그 후 플러그(plug)를 수확한 다음 10mL의 배양배지로 녹였다.

음성 대조군으로서 형광 추적물질을 넣지 않고 상기 프로토콜에 따라 제조한 리포좀을 사용하였다.

상기 시료들은 빛이 없는 상태에서 4℃에서 24시간 동안 보존하였다. 형광 추적물질의 타입, pH에 민감한 것, 칼슘에 민감한 것 혹은 그 외의 타입에 따라 26 개의 리포좀 시리즈(series)를 제조하였다.

실시예 2: 정상 인간 배양섬유아세포에서 자발적으로 침투하지 않는 리포좀 내 캡슐화될 수 있는 형광 추적물질의 선별

실시예 1의 프로토콜에 따라, 리포좀을 제조 및 정제하였으며, 이들 리포좀들은 여러 종류의 수용성 또는 지용성 추적물질을 다양한 농도로 포함하고 있다(표 1).

추적자로서 형광 프로브의 선별

프로브 명칭	특징	Exc/Em	농도	캡슐화여부	누수	세포투과	독성	리포좀 내 침투	보유(retained)
#L7545L Lysosensor yellow/blue DND 160	pH에민감함	329/440	10μM	Y	Y	Y	N	N	N
#H-348 hydroxypyrene trisulfonic acid, trisodium salt		403/511	1mM	N	NT	N	NT	N	N
#P-12925 pentafluorobenzoylamino fluorescein		492/516	200μM	Y	N	N		Y	Y
#F-1200 Fura-2.pentapotassium salt	Ca²⁺민감	335/505	10μM	N		N	N	N	Y
#C-369 carboxy dichlorofluorescein	에스터라아제가 있는 경우 형광을 띰		85μM	Y	Y	Y	NT	NT	N
#B-1151 carboxyethyl carboxyfluorescein		482/520	50μM	N	NT	?	NT	NT	N
#T-490 tetramethylrhodamine isothiocyanate TRITC		555/580		Y	?	?	N	Y	PEI의 방해 없음
#C-687 cascade blue hydrazine trisodium salt		399/421	200μM	Y	NT	N	N	Very low	N
#S-1129 sulfo fluorescein diacetate			200μM	NT	NT	N	N	Very low	N
#D-3329 dextran texas red		592/609		NT	NT	N	Y	N	N

Y: yes; N: no; NT: not detected

형광 추적물질을 포함하지 않은 대조군은 희석용 완충액에 형광 추적물질과 같은 농도로 녹여 제조하고, 섬유아세포에서 그것의 세포독성과 자발적 침투를 정량하였다.

동시에, 음성 대조군으로서 어떠한 형광 추적물질도 포함하지 않은 리포좀을 사용하여 서로 비교하였다.

실제로, 복부 성형수술로부터 얻은 생검에서 추출한 후, 섬유아세포는 DF 배지(DMEM 배지, Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham F12 glutamax 50/50 v/v, 10% 우혈청, 최종 농도 100UI/mL의 페니실린, 최종 농도 1㎍/mL의 젠타마이신, 최종 농도 1㎍/mL의 암포테리신 B를 첨가함)에서 증식하였다.

우선, 원심분리 후, 정제된 리포좀을 DF 배양 배지에 첨가하고, 볼텍스(vortex)에서 분쇄하고, 이를 24-웰 플레이트(코스타 MW24)에서 배양된 섬유아세포에 1mL/웰의 농도로 첨가하였다. 같은 조건 하에서 대조군과 무처리 대조군을 실험하였다.

리포좀을 첨가한 섬유아세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하고, pH7.4의 인산염 완충액으로 3회 세척하였다. 첫 번째로, Cytofluor 4000^®(밀리포어 사)이 부착된 형광분광광도계(spectrofluorometry)를 이용하여 형광을 측정하였다. 두 번째로, 여기 필터(대물렌즈 ×10, ×40 및 ×100)를 이용하여 올림푸스 역상 현미경(Olympus^®reverse microscope(I×70)) 하에서 세포 내 형광을 관찰하였다. 마지막으로, 형광 추적물질의 세포독성은 실시예 1의 방법에 따라 24시간 동안 배양하여 96-웰 플레이트에서 측정하였다.

25개의 물질을 실험한 결과, 펜타플루오로벤조일아미노플루오레신 PFB-F(P12925 프로브 분자) 및 테트라메틸로다마인 이소티오시아네이트 TRITC(T-490 프로브 분자) 만이 리포좀과의 결합 후, 섬유아세포에 첨가하여 24시간 동안 배양하고, 리포좀의 침투량을 정량할 경우 뚜렷한 양성 결과를 나타냈다.

도 1 내지 4는 섬유아세포와 함께 24시간 동안 배양한 후 리포좀 내에서 상기에서 선별된 0.01%의 PFB-F 및 TRITC의 세포 내 침투를 보여주는 사진도이다.

추적물질의 스크리닝 결과

	세포독성(무처리 대조군에 대한 %)	침투(프로브 없음)	침투(세척 후 형광)
PFB-F(485-530)	110.7%	8(45 증가)	65(45 증가)
TRITC(530-620)	74.8	295(50 증가)	1,119(50 증가)

그러나, 표 1 및 도 1 내지 4에 나타난 바와 같이, TRITC가 보다 강력하게 표지할 수 있다고는 하지만 다소 세포독성을 나타내고, 배양 배지에 자유롭게 첨가될 경우 약간 침투하는 경향이 있으므로, PFB-F가 추적물질로서 더 나은 것 같다.

실시예 3: 폴리에틸렌이민의 첨가 여부에 따라 PFB-F 또는 TRITC를 첨가한 경우 세포 내 침투 연구

실시예 1의 프로토콜에 따라 제조된 0.5%의 25 kDa의 폴리에틸렌이민(PEI)을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서, 5%의 대두 레시틴, 0.01%의 PFB-F 또는 TRITC를 포함하는 리포좀의 세포 내 침투는 실시예 2에 기재된 대로 24-웰 플레이트에서 배양된 인간 섬유아세포와 24시간 동안 배양한 후 분석하였다.

결과적으로, PEI를 첨가한 경우, PFB-F 리포좀의 침투를 13.7배 촉진시킨 반면, TRITC 리포좀의 침투는 16배 정도 감소하였다(도 1 내지 4 참조).

따라서, 리포좀에서 0.01%의 PFB-F가 추적물질로서 적당하다.

실시예 4: PFB-F을 포함하는 리포좀의 안정성 연구

리포좀의 안정성은 형광분광광도계를 이용하여 형광 추적물질의 DF 배양배지로의 방출을 연구함으로써 분석하였다. 본 연구는 pH, 이온력, 세제(detergent)의 첨가 유무에 따라 실시하였다.

5%의 대두 레시틴, 0.01%의 PFB-F 및 50μM의 25 kDa의 PEI를 포함하는 리포좀을 제조하였다. 리포좀 용액의 pH는 6, 7, 8, 9로 조정하고, NaCl의 농도는 500, 100, 150, 200 mM로 조정하였으며, SDS 또는 Triton X-100의 농도는 0.1, 0.5, 1, 3%로 조정하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.

세제 유무, 이온력 및 pH에 따른 방출 연구

물질	농도	방출: 평균	방출: 표준편차
Triton X-100	3%1%0.5%0.1%	44027458004083419829	177288839103
SDS	3%1%0.5%0.1%	62481718097667622990	1801558200108
NaCl	200mM150mM100mM50mM	68527762263145680	20403611362
pH	9876	252651881687817640	4112267055

상기 결과로부터, 50μM의 25 kDa의 PEI를 포함하는 리포좀은 200mM NaCl, 0.5% Triton X-100 또는 SDS, pH7부터 불안정화되기 시작하는 것 같다.

실시예 5: 폴리에틸렌이민의 농도에 따른 형광 추적물질 PFB-F의 캡슐화 정도

25 kDa PEI의 농도를 0에서 100μM 으로 증가시키면서 실시예 5의 방법에 따라 리포좀을 제조하였다.

1,790g에서 10분 동안 원심분리한 후, 형광분광광도계를 이용하여 상등액을 정량하였다. 캡슐화의 정도는 최초 농도에 의거하여 계산하였고, 표 4에 그 결과를 나타내었다.

PEI의 농도에 따른 PFB-F의 캡슐화 정도

PEI의 농도(μM)	0	1	10	50	100
생산량(%)	89.0	92.3	91.0	87.5	86.3

표 4에 나타난 바와 같이, 캡슐화의 정도는 PEI의 농도와 상관이 없었다.

실시예 6: 폴리에틸렌이민을 농도별로 포함하는 형광 리포좀을 이용한 스크리닝 조건의 개발

실시예 1의 프로토콜에 따라 폴리에틸렌이민(25 kDa PEI-6N HCl로 중화시킴)의 농도를 달리하여, 즉, 0, 5, 10, 50μM과 0.01%의 PFB-F로 리포좀을 제조하였다.

pH7.4의 인산염 완충액으로 3회 세척한 후, 24-웰 플레이트에서 단일층으로 배양된 섬유아세포와 2, 4, 6, 24, 48시간 동안 배양한 후 형광분광광도계를 이용하여 정량하였다. 이때, 무처리 섬유아세포 블랭크(blank)와 PFB-F를 첨가하지 않은 대조군 실험을 병행하였다. 표 5에 그 결과를 나타내었다.

시간별, PEI 농도에 따른 PFB-F의 세포 내 침투 연구(각 조건마다 4회 반복 실험, 형광에 대해서는 임의 단위로 표현)

PEI 농도	0		5μM		10μM		50μM
시간	평균	표준편차	평균	표준편차	평균	표준편차	평균	표준편차
2h	6	0	49	4	67	7	116	6
4h	7	3	63	5	89	9	159	10
6h	6	0	65	10	94	13	203	12
24h	9	3	120	5	129	3	291	17
48h	6	1	160	18	171	13	306	6

최상의 결과는 50μM의 PEI에서 배양 최소 시간은 섬유아세포와 24시간 배양후 얻었다. 상기의 조건은 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 스크리닝에 이용될 것이다. 상기 결과는 5μM의 농도에서 모든 배양 시간 동안 프로브를 첨가하지 않은 대조군(p<0.05)과 비교하여 통계적으로 유의하였다.

실시예 7: 50μM의 폴리에틸렌이민을 포함하는 형광 리포좀의 세포독성 및 세포 내 침투의 시간별 분석

PEI의 농도를 0에서 100μM까지로 하여 실시예 6의 방법에 따라 실험하였다. 세포 내 침투 촉진은 PEI를 첨가하지 않은 리포좀에 대하여 촉진지수(stimulation factor)로서 표현하였다.

세포 생존능은 96-웰 플레이트(웰 당 250㎕의 리포좀 용액)에서 세포 매트 상에서 알칼라인 포스파타아제의 활성을 평가함으로써 실시하였다(파라니트로페닐포스페이트로 실험함, 6회 실시). 세포 생존능은 PEI를 첨가하지 않은 리포좀 대조군에 대해 생존 세포의 비율로 표현하였다. IL1 알파(Quantikine R&D System kit)는 총 단백질을 측정(시그마, 브래포드)함과 동시에 24시간 동안 배양한 후 배양 배지 상에서 측정하였다. 표 6과 7에 그 결과를 나타내었다.

시간별, PEI 농도에 따른 세포독성 및 PFB-F의 세포 내 침투지수(각 조건마다 4번 반복실험)

시간	0	5 μM	10μM	50μM	PEI50 생존능
2h	0.7	5.4	7.4	12.9	93.8%
4h	0.8	7.0	9.9	17.7	92.4%
6h	0.7	7.2	10.4	22.6	83.9%
24h	1.0	13.3	14.3	32.3	72.6%
48h	0.7	17.8	19.0	34.0	48.4%

총 단백질(pg/mg) 내 IL1 알파의 측정

25 kDa PEI	0	10μM	50μM	100μM
총 단백질(㎍/mL)	132.8	136.2	119.5	79.2
IL1(pg/mL)	9.2	12.7	13.1	14.4
단백질 내 IL1(pg/mL)	69.3	93.2	109.6	181.8
촉진지수	1	1.3	1.6	2.6

상기에서 나타난 바와 같이, PEI를 첨가한 경우 형광 추적물질의 침투지수를 34배까지 증가시킬 수 있다. 그러나, 24시간 이후부터, 50μM의 25 kDa PEI에서 무시할 수 없는 정도의 세포독성이 관찰되었고, 48시간째에는 세포의 절반 이상이 사멸하였다. 50μM의 농도에서, IL1 알파의 합성을 고려해 볼 때, 1.6배 촉진하였으며, 100μM에서는 2.6배 정도 촉진하였다. 따라서, 상기 물질은 중대한 염증원으로서의 스트레스를 야기한다.

실시예 8: 리포좀 내 결합되어 있는 형광 추적물질의 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 스크리닝

실시예 5에 기재된 대로 만약 트리즈마 희석용 완충액이 필요하다면, HCl로 pH7로 중화시킨 1, 0.1, 0.01%의 시료, 5%의 대두 레시틴 및 0.01%의 PFB-F로 리포좀을 제조하였다.

우선, 55개의 물질을 50μM의 25 kDa PEI와 비교하여 3회씩 테스트하였다. 실시예 2에 기재된 대로 24-웰 플레이트에서 배양된 정상 인간 섬유아세포와 24시간 동안 배양한 후 세포 내 침투를 정량하였다. 96-웰 플레이트에 200㎕의 리포좀 현탁액을 첨가하여 세포 생존능을 평가하였다. 1% 농도에서 얻은 결과를 표 8에 나타내었다.

침투 촉진 물질의 스크리닝 결과

INCI 명칭	촉진지수	생존능	관찰여부
폴리에틸렌이민 25kDa	34.7	74.1	+
코코디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질	4.3	86	-
코코디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 벼 단백질	18	85	-
스테아디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질	4.6	86.4	-
로릴디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질	6.2	87.5	-
하이드록시프로필트리모니움 가수분해된 밀 단백질	1.3	91.7	-
하이드록시프로필트리모니움 벌꿀(honey)	15	92	-
소듐 라우로일 귀리 아미노산	0.8	76.6	-
소듐 라우로일 밀 아미노산	1.1	46.1	-
코코아민	32.7	79.7	+
라우릴디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 대두 단백질	38.8	87.9	+
키토산	10.3	99	-
하이드록시프로필 구아 하이드록시프로필트리모니움 클로라이드	1.1	74.8	-
하이드록시프로필 구아	-0.2	91.1	-
하이드록시프로필 구아	-0.4	97.5	-
하이드록시프로필 구아 하이드록시프로필트리모니움 클로라이드	1.4	71.2	-
구아 하이드록시프로필트리모니움	0.6	53.3	-
메이프로	1	91.6	-
폴리쿼터니움 7	0.3	80.1	-
폴리비닐피롤리돈(1)	1.4	85.1	-
폴리비닐카프로락탐	4.1	0	-
폴리비닐피롤리돈(2)	0.7	26.6	-
폴리비닐피롤리돈(3)	0.7	71	-
폴리쿼터니움 16(1)	4.6	83.5	-
폴리쿼터니움 11(1)	1.5	49.7	-
코코트리모니움 메토설페이트	0.1	55	-
폴리쿼터니움 16(2)	8.4	33.8	-
폴리쿼터니움 16(3)	1	38.8	-
폴리쿼터니움 16(4)	12.5	67.1	-
폴리쿼터니움 16(5)	0.2	85.3	-
폴리쿼터니움 44	0.8	59.7	-
코코알코니움 클로라이드	5.6	36.3	-
코코트리모니움 클로라이드	-0.2	65.6	-
테트라하이드록시프로필 에틸렌디아민	1.9	95.3	-
스테라미도프로필 세테아릴 디모니움 토실레이트 및 PG	13.1	93.2	-
쿼터니움 70 및 PG	-0.2	63.9	-
쿼터니움 26	30.9	59.2	-
쿼터니움 22	2	98.9	-
폴리코터니움 28	0.6	79.3	-
폴리쿼터니움 11(2)	2.9	50.7	-
폴리쿼터니움 11(3)	2.9	77.1	-
폴리쿼터니움 2	4.2	23.6	-
스테랄코니움 클로라이드	17.6	37.4	-
프로필아민 C3	0.9	103.3	-
n-부틸아민 C4	1.4	106.2	-
디부틸아민 2 C4	0.7	75.7	-
헥실아민 C6	0.2	82.1	-
헵틸아민 C7	3.7	39.4	-
디옥틸아민 2 C8	1	34.7	-

-계속-

INCI 명칭	촉진지수	생존능	관찰
데실아민 C10	39.6	68.5	+
디데실아민 2 C10	1.2	28.3	-
운데실아민 C11	95.3	84	+
도데실아민 C12	47.1	57	+
트리데실아민 C13	44.5	62.6	+
테트라데실아민 C14	11.6	54.8	-
펜타데실아민 C15	14.9	73	-
옥타데실아민 C18	19.6	61.2	-
올레일아민 C18:1	1.9	87.1	-

스크리닝 후, 형광 추적물질의 세포 내 침투를 10% 이상 촉진할 수 있는 15개의 물질을 선별하였다. 세포 생존능은 1%의 농도에서 37 내지 99%으로 다양하였다. 32% 이상 침투를 촉진하는 물질의 침투는 형광 추적물질을 관찰함으로써 확인하였다. 이들 물질은 우선순위로 유지하였다.

실시예 9: 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 구조에 따른 영향

C3과 C18 사이에 알킬 사슬을 갖는 1기 지방족 모노아민으로 된 리포좀의 제조 및 형광 표지를 이용한 세포 내 침투의 정량화는 상기 실시예들에서 기재된 대로 실시하였다. 그 결과는 표 9에 나타내었다.

탄소사슬의 길이에 따른 세포 내 침투의 촉진

1개의 알킬 지방사슬을 포함하는 1기 모노아민의 탄소 수	촉진지수
25 kDa PEI 대조군	34.7
C3	0.9
C4	1.4
C6	0.2
C7	3.7
C10	39.6
C11	95.3
C12	47.1
C13	44.5
C14	11.6
C15	14.9
C18	19.6

표 9에 나타난 바와 같이, 리포좀 막에 다양한 길이의 지방족 사슬을 갖고 있는 지방족 아민이 결합함으로써 5%의 레시틴을 포함하는 리포좀에 캡슐화되는 PFB-F의 세포 내 침투를 촉진하는 데 있어 탄소사슬의 길이는 명백하게 영향을 미침을 알 수 있었다. 지방산은 사슬 길이별로 대략적으로 분류하였다. 따라서, 짧은 사슬(8개 미만의 탄소), 중간 사슬(10 내지 18개의 탄소) 및 긴 사슬(18개 이상의 탄소)로 구별하였다. 본 실험의 전후에서 실험되는 1기 지방족 아민의 이러한 분류를 통해 볼 때, 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 리포좀의 특징을 부여하는데 있어 중간 사슬이 적당한 것으로 보인다.

실시예 10: 세포 내 침투에 대한 입체적 장애의 영향

5%의 레시틴을 포함하는 리포좀 내에 캡슐화되는 형광 추적물질의 세포 내 침투에 대해 촉진 효과를 갖는 물질의 특징을 규정하고자, 본 발명자들은 이들 물질의 잠재적 촉진 능에 대한 입체적 장애의 영향을 관찰하였다. 이를 위해, 한편으로는 1기 지방족 모노아민을 첨가한 리포좀으로, 다른 한편으로는 2기 지방족 모노아민을 첨가한 리포좀을 이용하여 리포좀 내 캡슐화된 PFB-F의 세포 내 침투를 연구하였다. 1기 또는 2기 지방족 아민을 첨가한 리포좀의 제조 및 형광 추적물질의 세포 내 침투의 정량화는 실시예 8에 기재된 대로 실시하였다. 그 결과는 표 10에 나타내었다. 디아민(diamine)은 표지자의 세포 내 침투를 더 향상시킬 수 없었다.

탄소사슬 수에 따른 세포 내 침투의 촉진

아민의 알킬 사슬의 수(사슬 길이)	촉진지수
25 kDa PEI	34.7
1(C4)	1.7
2(C4)	0.7
1(C10)	39.6
2(C10)	1.2

실시예 11: 세포 내 침투에 대한 입체적 장애의 영향

실시예 9 또는 10에서 주로 기재된 대로, 탄소사슬 수가 리포좀의 세포 내 침투를 방해하는 유일한 요인은 아니다.

사실상, 리포좀 내 캡슐화되는 물질의 다음 도면에서 나타나는 화학 구조를 비교할 경우, R기의 특이성이 C₁₂ 탄소사슬을 방해함을 볼 수 있다.

Ry: 가수분해되고 하이드록시프로필화된 대두 단백질을 나타냄

RA: 가수분해되고 하이드록시프로필화된 밀 단백질을 나타냄

4분자 물질 Y 및 A는 당업자에게는 잘 알려진 물질이다. 4분자 물질(상품화된 물질)의 입체적 장애는 레시틴을 포함하는 리포좀의 세포 내 침투를 촉진하는 데 중요한 역할을 담당한다.

예를 들어, 표 11에 분류된 여러 종류의 물질들은 1%의 농도에서 39%까지 다양한 정도로 세포 내 침투를 촉진할 수 있다. 또한, 아몬드, 완두콩, 감자 또는 해조류에서 추출한 물질의 4분자 가수분해물이 사용될 수 있다.

상품화된 4분자 물질	화학명	회사명
밀	코코디모니움, 스테아디모니움, 하이드록시프로필트리모니움 또는 로릴디모니움 가수분해된 밀 단백질, 밀 배아-아미도프로팔코니움 클로라이드	Croda
대두	로릴디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 대두 단백질, 코코디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 대두 단백질, 하이드록시프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드 가수분해된 대두 단백질, 대두 디하이드록시프로필디모니움 글루코시드	CrodaRITA corporation
케라틴	하이드록시프로필트리모니움 가수분해된 케라틴	RITA corporation
카제인	하이드록시프로필트리모니움 가수분해된 카제인	RITA corporation
콜라겐	하이드록시프로필트리모니움 가수분해된 콜라겐, 로릴디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 콜라겐	RITA corporationCognis
실크	하이드록시프로필트리모니움 가수분해된 실크	RITA corporation
벼	코코디모니움 하이드록시프로필 가수분해된 벼 단백질	Sochibo
구아	하이드록시프로필 구아 하이드록시프로필트리모니움 클로라이드, 하이드록시프로필 구아 하이드록시프로필트리모니움 클로라이드, 구아 하이드록시프로필트리모니움	MeyhallRhodia
벌꿀	하이드록시프로필트리모니움 벌꿀(honey)	ARCH
셀룰로우즈	폴리쿼터니움 4 및 10폴리쿼터니움 39	Quimasso

실시예 12: 세포 내 침투를 촉진하는 기능성 물질의 최적 농도

형광 추적물질의 세포 내 침투를 촉진하는 최적 농도를 알아보기 위해 기능성 물질을 농도별로 테스트하였다.

리포좀은 5%의 대두 레시틴, 0.01% PFB-F 및 트리즈마 희석용 완충액에 녹인 0.5∼2.5%의 4분자 대두 용액으로 제조하였다. 실시예 2에 따라 세포 내 침투 및 세폭독성을 평가하였다. 그 결과는 표 12에 나타내었다.

세포 생존능뿐만 아니라 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 농도 및 촉진지수 연구

4분자 대두(%)	0.5	1	1.5	2	2.5
촉진지수	0.6	1.6	38.9	97.2	99.9
세포 생존능(%)	92.4	97.9	87.9	75.4	77.3

따라서, 세포 내 침투는 기능성 물질의 농도 및 세포 생존능에 따라 조정될 수 있다.

실시예 13: 폴리에틸렌이민과 선별된 4분자 대두 간의 염증효과의 비교

50μM PEI를 포함하는 리포좀과 농도별 4분자 대두 용액간의 인터루킨 1 알파의 합성 촉진을 비교하였다.

5%의 대두 레시틴, 0.01%의 PFB-F 및 트리즈마 희석용 완충액에 녹인 0.5∼2.5%의 4분자 대두 용액 또는 50μM PEI로 리포좀을 제조하였다. IL1 알파의 함량은 실시예 7의 키트로 평가하였다(Quantikine R&D System). 웰 당 세포수를 평가하기 위해 파라니트로페닐포스페이트(PNPP)를 이용한 테스트를 병행하였다. IL1 알파 함량은 상기로부터 얻은 PNPP의 흡광도와 비교하여 그 결과를 표 13에 나타내었다.

인터루킨 1 알파의 합성에 대한 기능성 물질(PEI 및 4분자 대두)의 효과

기능성 물질의 농도	50μM PEI	0.5% 대두	1% 대두	1.5% 대두	2% 대두
PNPP	72.3	91.8	91.6	87.5	88.4
IL1 알파	350	137.5	137.5	212.5	187.5
IL1 알파/PNPP	484.1	149.8	150.1	242.9	212.1

표 13에 나타난 바와 같이, 미리 선별된 4분자 대두 용액은 비교물질 PEI와 비교하여 세포독성과 매우 제한된 염증 스트레스를 유도하였다.

실시예 14: 폴리에틸렌이민과 선별된 4분자 대두 간의 세포사멸 효과 비교

50μM PEI를 포함하는 리포좀과 선별된 4분자 대두의 농도별 비교를 통해 인터루킨 1 알파의 합성 촉진을 비교하였다.

5%의 대두 레시틴, 0.01%의 PFB-F 및 트리즈마 희석용 완충액에 녹인 0.5∼2.5%의 4분자 대두 용액 또는 50μM PEI로 리포좀을 제조하였다. 카스파아제 1의 함량은 키트로 측정하였다(Caspase-1 Colorimeric Assay R&D System). 웰 당 세포 수를 측정하기 위해 파라니트로페닐포스페이트(PNPP)를 이용한 테스트를 병행하였다. 카스파아제-1 함량은 PNPP의 흡광도와 비교하여 얻었으며, 표 14에 그 결과를 나타내었다.

카스파아제-1의 함량에 대한 기능성 물질의 효과

기능성 물질의 농도	50μM PEI	0.5% 대두	1% 대두	1.5% 대두	2% 대두
PNPP	59.8	91.8	91.6	87.5	88.5
카스파아제-1	642.8	76	87.7	78.3	117.5
카스파아제-1/PNPP	1074.9	82.8	95.7	89.5	132.8

표 14에 나타난 바와 같이, 미리 선별된 4분자 대두 용액은 비교물질 PEI와 비교하여 세포독성 및 극도로 제한된 세포사멸 스트레스를 유도하였다.

실시예 15: 투과전자현미경을 이용한 실시예 14의 리포좀 조성물의 구조 관찰

활성성분과 형광 추적물질을 첨가하지 않고, 2%의 4분자 대두 용액으로 제조된 리포좀을 투과전자현미경 하에서 관찰하였다. 다층 낭의 이중층(bilayers of the multilamellar vesicles)을 파열시키는 중금속염을 이용하여 리포좀의 네거티브 색을 만들었다. Philips CM120 투과전자현미경 하에서 30∼60,000 배로 확대하여 관찰하였다.

관찰 결과, 다층 구조의 특징을 나타내는 동심성 지질층(concentric lipid layers)을 관찰하였다. 리포좀의 평균 크기는 150∼250 nm로 다양하게 관찰되었다.

실시예 16: 실시예 11의 4분자 대두 용액을 이용한 항-라디칼 보호 촉진

5%의 대두 레시틴, 0.2%의 천연 비타민 E 및 실시예 11의 2%의 4분자 대두 용액(Y 물질)로 리포좀을 제조하였다.

0.4g의 천연 비타민 E를 10g의 대두 레시틴과 10mL의 96% 에탄올에 첨가하였다. 상기 용액을 빛을 차단한 상태에서 실온 하에서 마그네틱 바로 교반하면서 밤새도록 증발시켰다. 에탄올을 증발시킨 후, 100mL의 탈이온수를 첨가하고, 이 혼합물이 완전히 녹을때까지 교반하였다.

그 후, 5mL의 레시틴-비타민 E 용액, 190㎕(즉, 2%)의 4분자 대두 용액 및 4.80mL의 55mM의 트리즈마 희석용 완충액(27mM NaCl를 첨가하여 pH를 5로 조정함)을 첨가하고 마그네틱 바로 교반하면서 빛을 차단한 상태에서 30분 동안 혼합하여 리포좀을 제조하였다. 최대 속도에서 10분 동안 상기 용액을 분쇄하여 변형된 리포좀을 제조하였다. 분쇄하지 않은 상기 용액을 비타민 E가 없는 대조군으로 사용하였다.

천연 비타민 E에 기반을 둔 리포좀은 세포독성을 억제하고 기능성 제제를 포함하지 않도록 10μM 25 kDa PEI를 첨가한 상태에서 제조하였다.

정상 인간 섬유아세포는 24-웰 플레이트에 파종하고 컨플루언스(confluence) 상태까지 배양하였다. pH7.4의 칼슘-마그네슘-인산염 완충액(인비트로젠, In vitrogen)으로 3회 세척한 후, 여러 종류의 용액을 배양 배지로 반쯤 희석하여(즉, 비타민 E의 최종 농도는 0.1%가 됨) 최소 2시간 동안 배양하였다. 배양 배지만을 넣은 채 배양한 후 프로브 대조군으로 사용하였다. pH7.4의 칼슘-마그네슘-인산염 완충액으로 3회 세척하여 리포좀과 결합하지 않은 비타민 E(free vitamin E)를 제거하였다. 그 후, 15mL의 HBSS에 녹인 1mM 용액 150㎕에 디하이드로로다민 123(프로브 물질)을 200㎕/웰의 비율로 첨가하여 세포 매트를 배양하였다. 상기 플레이트는 490∼530 nm에서 흡광도를 읽고, UVB를 912nm에서 0.8 J/cm²로 조사하고, 같은 파장에서 다시 형광을 읽었다. 그 결과는 비율로 표시하였다:

A=조사/비조사(irradiated/non-irradiated, I/NI)

B=(I/NI 리포좀)/(I/NI 프로브 대조군)

C=리포좀화된 비타민 E/자유형 비타민 E

세포막을 통해 수동적으로 확산하기 때문에 사용된 형광 프로브는 세포 내 활성산소의 중간매개물의 존재를 평가할 수 있다. 이때, 양이온성 로다민에 산화될 수 있다. 예를 들어, 형광 프로브는 과산화수소(hydrogen peroxide)와 페록시나이트라이트(peroxynitrites)와 적극적으로 반응할 수 있다. 이 결과는 표 15에 나타내었다.

변형 리포좀을 이용한 항-라디칼 보호

	I	NI	A=I/NI	B=리포좀/대조군	C=리포좀/자유형
본 발명 물질	118990	58786	2.01	79.3%	+23%
비기능성 리포좀	114907	52306	2.31	91.1%	+11%
리포좀 PEI	105257	40148	2.82	111.4%	-9%

상기 결과로부터, 4분자 대두 단백질을 포함하는 리포좀은 이를 포함하지 않은 리포좀과 비교하여 라디칼 스트레스에 대해 20% 이상의 보호 효과를 얻을 수 있는 반면, 비교물질 PEI를 포함하는 리포좀은 상기의 보호 효과를 나타내지 않으며, 심지어 부수적인 스트레스를 유발시키기도 하였다.

실시예 17: 본 발명 물질의 탈색(depigmentation) 촉진

다음의 프로토콜에 따라 리포좀을 제조하였다: 2%의 4분자 대두 용액 또는 10μM PEI를 첨가하거나 그렇지 않은 5%의 대두 레시틴.

또한, 활성물질을 함께 캡슐화하였다: 0.05%의 방부제(식물 활성물질로된 혼합액)를 넣지 않은 Phytolight^®(프랑스 리용, 꼴레띠카), 0.05% 알부틴 및 1mM의 카테킨(시그마 사). 상기 물질들은 24-웰 플레이트에서 컨플루언스 전 상태까지 배양된 정상 인간 멜라닌형성세포에 5% 레시틴 리포좀, 10μM PEI를 포함한 리포좀 또는 2%의 4분자 대두와 함께 처리하였다. 리포좀화되거나 그렇지 않은 활성물질은 5% CO₂ 하에서 37℃에서 66시간 동안 MMK2 배지(시그마 사)에서 배양하였다. 칼슘-마그네슘-인산염 완충액(인비트로젠)으로 3회 세척한 후, 0.5% Triton X-100을 포함하는 인산염 완충액으로 추출하고, L-DOPA 및 MBTH(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone)을 첨가한 상태에서 티로시나아제의 활성을 측정하여 정량화하였다. MBTH-o-퀴논 물질의 형성은 490nm에서 흡광도를 측정하여 반응 속도에 따라 정량화하였다. 티로시나아제 활성은 효소 반응의 기울기로 표현하고, 그 결과는 표 16에 나타내었다.

리포좀 또는 리포좀화되지 않은 활성물질의 탈색 효과(효소 반응 속도로 표현)

	자유형	리포좀	PEI 리포좀	대두 리포좀
알부틴	0.004	0.001	0	0
Phytolight^®	0.01	0.008	0.003	0.0016
카테킨	0.007	0.007	0	0.003

상기 결과로부터, 함께 캡슐화된 활성물질에 따라, 정상 인간 멜라닌형성세포의 시험관 내 실험에서 티로시나아제 활성의 억제는 증가하였다. 4분자 대두 리포좀은 식물 추출물 혼합물에 PEI를 첨가하여 얻은 것보다 더 효과적이었고, 알부틴에 대해서는 비슷하였고, 카테킨의 경우 약간 낮았다. 모든 경우에서, 활성은 활성물질을 포함하지 않은 리포좀과 비교하여 최소 2.3배 더 컸다.

실시예 18: 본 발명 물질의 크기를 감소시키는 방법

리포좀의 크기는 고압 분쇄기를 사용하여 줄일 수 있다(1,000 bars보다 더 큰 압력을 줌, 바람직하게는 2,000 bars, 보다 바람직하게는 3,000 bars 이상의 압력을 줌). 3,000 bars에서, 상기 기기는 리포좀을 약 50nm까지 줄일 수 있다.

리포좀의 크기는 실시예 15에 기재된 대로, 레이저 입자 크기 분석기(Beckman Coulter, N4 plus, Submicron Particle Size Analyser)와 투과전자현미경을 이용하여 분석하였다.

실시예 19: 경피성 투과 후 본 발명 물질의 침투 입증: 형광 추적물질, 비타민 E 또는 유전물질

실시예 12에 기재된 리포좀에 결합되어 있거나 또는 자유형, 실시예 11에서 선별된 2%의 4분자 대두 용액을 포함하거나 그렇지 않은 형광물질(0.01% PFB-F)의 침투는 인간 피부로의 경피성 투과를 통해 정량화하였다. 확산 속도는 3 내지 24시간 동안 형광분광광도계를 이용하여 정량하였다. 또한, 방출여부는 이후 24시간 뒤에 정량하였다. 또한, 저장여부는 마지막에 평가하였다. 시료의 수는 실험 조건 당 5개로 하였다. 표 17에 나타난 바와 같이, 4분자 대두를 첨가하여 제조한 리포좀을 이용할 경우, 4분자 제제를 첨가하지 않은 벡터형 또는 비벡터형의 경우와 비교하여 형광 추적물질의 확산, 방출 및 저장을 약간 촉진하였다.

	자유형	리포좀	4분자 리포좀
확산	0.57±0.03	1.17±0.05	1.76±0.13
방출 24h	0.691±0.06	1.398±0.07	1.77±0.21
저장	0.81±0.1	1.27±0.17	2.61±0.33

실시예 12에 기재된 대로 리포좀에 결합되어 있거나 또는 자유형, 실시예 11에서 선별된 2%의 4분자 대두 용액을 포함하거나 또는 그렇지 않은 비타민 E(0.5%)의 침투는 인간 피부로의 경피성 투과로 정량하였다. 확산 속도는 5 내지 24시간 까지 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정량하였다. 방출은 이후 24시간 후에 정량하였다. 저장은 마지막에 평가하였다. 그 결과, 4분자 대두를 첨가하여 제조한 리포좀을 이용할 경우, 4분자 제제를 첨가하지 않은 벡터형 또는 비벡터형의 경우와 비교하여 비타민 E의 확산, 방출 및 저장을 약간 촉진하였다.

경피성 투과 실험은 실시예 12에 기재된 리포좀에 2%의 대두 용액을 첨가하여 형광유전물질(200mM)을 결합시키거나 그렇지 않은 조건에서 실시하였다. 형광광학현미경(epifluorescence optical microscopy) 하에서 피부의 횡단면을 관찰한 결과, 4분자 대두를 첨가한 리포좀을 이용할 경우 유전물질을 진피로 확산시킬 수 있었다.

이중 엘라스틴 19-20의 형광 프로브의 염기서열은 다음과 같다:

센스: 5'-(FITC)AGCUGCUAAGGCUGGCGCUTT-3'

안티센스: 5'-AGCGCCAGCCUUAGCAGCUTT-3'

실시예 20: 수중유형(oil-in-water) 에멀젼 타입의 화장료 또는 약제학적 제형에서의 본 발명 물질의 이용

제법 20a:

A 물 총 100

부틸렌 글리콜 2

글리세린 3

소듐 디하이드록시세틸 2

포스페이트,

이소프로필 하이드록시세틸 에테르

B 글리콜 스테아레이트 SE 14

트리이소노나오인 5

옥틸 코코에이트 6

C 부틸렌 글리콜, 2

메틸파라벤,

에틸파라벤, 프로필파라벤,

pH 5.5로 조정함.

D 본 발명 물질 0.01∼10%

제법 20b:

A 물 총 100

부틸렌 글리콜 2

글리세린 3

폴리아크릴아마이드, 이소파라핀, 2.8

로레쓰-7

B 부틸렌 글리콜, 2

메틸파라벤,

에틸파라벤, 프로필파라벤;

2

페녹시에탄올,

메틸파라벤,

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤 0.5

부틸렌 글리콜

C 본 발명 물질 0.01∼10%

제법 20c:

A 카보머 0.50

프로필렌 글리콜 3

글리세롤 5

물 총 100

B 옥틸 코코에이트 5

비스아보롤 0.30

디메티콘 0.30

C 소듐 하이드록사이드 1.60

D 페녹시에탄올, 0.50

메틸파라벤,

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

E 퍼퓸 0.30

F 본 발명 물질 0.01∼10%

실시예 21: 유중수형(water-in-oil) 제형에서의 본 발명 물질의 이용

A PEG30 3

디폴리하이드록시스테아레이트

카프릭 트리글리세라이드 3

세테아릴 옥타노에이트 4

디부틸 아디페이트 3

포도씨 유 1.5

호호바 오일 1.5

페녹시에탄올, 0.5

메틸파라벤,

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

B 글리세린 3

부틸렌 글리콜 3

마그네슘 설페이트 0.5

EDTA 0.05

물 총 100

C 사이클로메티콘 1

디메티콘 1

D 퍼퓸 0.3

E 본 발명 물질 0.01∼10%

실시예 22: 3중 에멀젼(triple emulsion) 제형에서의 본 발명 물질의 이용

1차 에멀젼 W1/O

A PEG30 4

디폴리하이드록시스테아레이트

카프릭 트리글리세라이드 7.5

이소헥사데칸 15

PPG-15 스테아릴 에테르 7.5

B 물 65.3

C 페녹시에탄올, 0.7

메틸파라벤,

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

2차 에멀젼 W1/O/W2

A 1차 에멀젼 60

B 폴록사머 407 2

페녹시에탄올, 0.3

메틸파라벤,

프로필파라벤, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3 디올

물 총 100

C 카보머 15

D 트리에탄올아민 pH6.0∼6.5

E 본 발명 물질 0.01∼10%

실시예 23: 립스틱용 제형 및 그외 무수물에서의 본 발명 물질의 이용

A 미네랄 왁스 17.0

이소스테아릴 이소스테아레이트 31.5

프로필렌 글리콜 디펠라고네이트 2.6

프로필렌 글리콜 이소스테아레이트 1.7

PEG 8 비즈왁스 3.0

수소화된 팜핵유 3.4

글리세라이드,

수소화된 팜 글리세라이드

라놀린 오일 3.4

참기름 1.7

세틸 락테이트 1.7

미네랄 오일, 라놀린 알콜 3.0

B 피마자유 총 100

티타늄 디옥사이드 3.9

CI 15850:1 0.616

CI 45410:1 0.256

CI 19140:1 0.048

CI 77491 2.048

C 본 발명 물질 0.01∼5%

실시예 24: 수용성 젤 제형(아이라이너, 슬리머, 등)에서의 본 발명 물질의 이용

A 물 총 100

카보머 0.5

부틸렌 글리콜 15

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.5

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

B 본 발명 물질 0.01∼10%

실시예 25: 본 발명 물질을 포함하는 약제학적 제형의 제조

제법 25a: 정제 제조

A 부형제 정제 당 1g

락토우즈 0.359

슈크로우즈 0.240

B 본 발명 물질 0.001∼0.1

제법 25b: 연고 제조

A 부형제

저밀도 폴리에틸렌 5.5

액체 파라핀 총 100

B 본 발명 물질 0.001∼0.1

제법 25c: 주사약 제조

A 부형제

식염 등장액 5mL

B 본 발명 물질 0.001∼0.1g

A 및 B는 각각 앰플로 포장하여 사용 전에 혼합한다.

실시예 26: 본 발명 물질의 화장료 적합 평가

토끼의 피부 및 눈을 평가하고, 흰쥐에 단일 구강투여를 통해 비정상적 독성이 없는지 그리고 기니아 피그에서 민감도를 연구하여 실시예 15(활성성분이 첨가되지 않음)의 화합물의 독성 테스트를 실시하였다.

토끼에서 피부의 1차 자극 평가:

"피부에 대한 급성 자극/부식에 대한 효과" 연구와 관련하여 OECD에서 규정한 방법에 따라 3마리의 토끼의 피부에 0.5mL씩 희석없이 상기에서 제조된 제형을 투여하였다.

1982년 2월 21일자로 프랑스 공화국 관보에 공포된 1982년 2월 1일자 규정에서 정하는 기준에 따라 상기 제형들을 분류하였다.

이들 테스트 결과, 실시예 12에서 얻은 물질을 포함하는 제형은 피부에 대해 자극이 없는 것으로 결론내릴 수 있었다.

토끼에서 눈 자극 평가:

"눈에 대한 급성 자극/부식에 대한 효과" 연구와 관련하여 1987년 2월 24일자 OECD 제 405호 지시에서 규정한 방법에 따라 3마리 토끼의 눈에 0.1mL씩 한번 희석하지 않은 상기 제형들을 투여하였다.

그 결과, 제형들은 눈에 대해 자극이 없는 것으로 결론내렸다.

쥐에서 단일 구강투여를 통한 비정상적 독성 유무 테스트:

1987년 2월 24일자 OECD 제 405호 지시에서 규정한 프로토콜에 따라 5마리 수컷과 5마리 암컷 쥐에 상기 제형들을 체중 1kg당 5g씩 한번 구강투여하였다.

LD0 및 LD50은 5,000mg/kg보다 더 컸다. 따라서, 시험한 제형들은 섭식에 따른 위험이 없는 제형으로 분류되었다.

기니아 피그에서 피부 민감도 평가:

상기 제형들에 대해 OECD 제 405호 지시에서 규정한 프로토콜에 따른 Magnusson and Kligmann의 극대화 실험(maximization test)을 실시하였다. 그 결과, 제형들은 피부 접촉 시 민감하지 않는 것으로 분류되었다.

돌연변이 가능성 평가:

본 프로토콜은 OECD 제 471호의 지시를 따른다(Directive 92/69/EEC).

돌연변이 테스트는 Ames et al.(Mutation Research, 1975, 31, 347-364)의 방법에 따라 <<살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)>>과 <<에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)>>에서 실시하였다. 프로뮤타젠(pro-mutagen)과 뮤타젠을 직접 구별하기 위해, 최소 배지에서 외재성 대사활성화 시스템을 첨가하거나 그렇지 않은 상태에서 5개의 균주에 본 발명 물질을 처리하였다. 배양 후, 돌연변이를 일으킨 콜로니 수를 세고 대조군 내 자발적으로 돌연변이를 일으킨 콜로니 수를 비교하였다.

본 발명 물질은 Directive 92/69 EEC로 볼 때 어떠한 돌연변이 활성도 갖고 있지 않았다.

건강한 실험자들에 대한 감작능 평가:

본 발명 물질의 알레르기 가능성을 건강한 실험자들에서 평가하였다. 상기 프로토콜은 유도시기와 자극 테스트를 포함하는 Marzulli and Maibach(Contact Dermatitis, 1975, 2, 1-17)의 방법에 따른 것이다. 이 테스트는 18세와 65세 사이이고 어떤 종류의 피부 타입을 가지고 있고, 여성 및/또는 남성으로 구성된 100명의 건강한 실험자에서 실시되었다.

20% 희석한 본 발명 물질을 포함하는 교합 패취(occlusive patch)를 각 실험자들의 견갑 부위(scapular zone)에 처리하였다. 상기 패취들은 24시간 동안 피부와 직접 접촉시키고 3주 동안 이틀마다 반복 처리하여 총 9회 처리하였다. 각 패취를 제거한 후, 자극과 피부 감작의 임상적 표시를 평가하였다=유도기.

2주 후, 20% 희석한 본 발명 물질을 포함하는 다른 패취들을 실험자들의 피부에 처리하고 24시간 동안 피부 표면에 직접 접촉시켰다. 자극과 피부 감작의 임상적 표시는 각 패취를 제거한 후 24, 48 및 72 시간째에 평가하였다="공격(challenge)" 기.

유도기나 공격기 동안 어느 시기에도 상관없이, 100명의 실험자들 중 어느 누구에서도 자극 또는 피부 감작의 임상적 표시를 나타내지 않았다.

실험 조건 하에서, 20% 희석한 본 발명 물질은 알레르기 가능성이 없었다.

상기 실시예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 폴리에틸렌이민 또는 다음의 군에서 선택되는 세포 내 침투를 촉진하는 물질 중 어느 하나를 포함하는 신규한 수화층판상 또는 리포좀을 제공하는 효과가 있다:

i) C10과 C18이 탄소사슬로 연결되어 있는 지방족 모노아민;

ii) 양이온성 중합체,

이들 리포좀은 물질 또는 활성성분의 세포 내 침투를 촉진하는데 있어 화장품 또는 약학분야에서 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1 내지 4는 본 발명의 추적물질 즉 PBF-F 및 TRITC의 세포 내 침투를 관찰한 것으로,

도 1은 0.01%의 PBF-F을 포함하는 리포좀과 섬유아세포를 24시간 동안 배양한 결과를 나타낸 10배 확대한 사진도이다.

도 2는 0.01%의 PBF-F을 포함하는 리포좀과 섬유아세포를 24시간 동안 배양한 결과를 나타낸 40배 확대한 사진도이다.

도 3은 0.01%의 TRITC을 포함하는 리포좀과 섬유아세포를 24시간 동안 배양한 결과를 나타낸 100배 확대한 사진도이다.

도 4는 0.01%의 TRITC와 3%의 PEI를 포함하는 리포좀과 섬유아세포를 24시간 동안 배양한 결과를 나타낸 100배 확대한 사진도이다.

Claims

수화층판상 혹은 리포좀 내에 내재하거나 운반되는 적어도 하나의 활성성분의 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 물질 혹은 그것들의 혼합물을 자체 구조 내에 포함하고 있으며, 상기 물질은 다음의 군에서 선택됨을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀:

a) 폴리에틸렌이민,

b) C10과 C18 사이에 탄소사슬을 갖는 1기, 2기, 3기 또는 4기 지방족 모노아민, 유리하게는 한 개의 C10-C18 지방사슬을 포함하는 모노아민, 바람직하게는 한 개의 C10-C18 지방사슬을 포함하는 1기 또는 4기 모노아민,

c) 양이온성 중합체, 특히 양이온성 천연 중합체 또는 선택적으로 양이온을 띠는 중합체 또는 양이온성 합성 중합체,

단, 상기 수화층판상 혹은 리포좀은 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없는 형광물질, 예를 들어 펜타플루오로벤조일아미노 플루오레신(pentafluorobenzoylamino fluorescein)을 선택적으로 적어도 하나 포함하고, 이러한 침투는 가시적으로 볼 수 있음.
제 1항에 있어서, 선택적으로 양이온성 천연 중합체는 키토산, 4분자의 벌꿀 중합체, 밀 단백질 또는 4분자의 밀 단백질, 벼 단백질 또는 4분자의 벼 단백질, 콩 단백질 또는 4분자의 콩 단백질, 콜라겐 또는 4분자의 콜라겐, 케라틴 또는 4분자의 케라틴, 카제인 또는 4분자의 카제인, 4분자의 셀룰로우즈 또는 4분자의 구아(guar)로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
제 1항에 있어서, 1기 모노아민은 데실아민, 운데실아민, 도데실아민, 트리데실아민, 테트라데실아민, 펜타데실아민, 옥타데실아민으로 구성된 군에서 선택되거나 또는 C8과 C18 사이에 탄화수소 사슬을 갖는 코프라(copra) 아민 혼합물과 같은 1기 모노아민의 혼합물임을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌이민을 포함함을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 수화층판상 혹은 리포좀은 지질상에서 리포좀막을 변형시키는 제제, 예를 들어 트리글리세라이드, 극성 인지질 또는 극성 스핑고리피드로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택되는 극성지질을 적어도 하나 포함함을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
제 5항에 있어서, 상기 극성 인지질은 포스파티딜콜린 또는 레시틴, 포스파티딜에타놀아민 또는 세팔린, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤 또는 카디오리핀, 포스파티딜이노시톨로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택됨을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 극성 스핑고리피드는 세라마이드, 스핑고포스포리피드, 글리코스핑고리피드로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택됨을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 수화층판상 혹은 리포좀은 지질상에 천연소재에서 추출된 레시틴을 적어도 하나 포함하며, 상기 천연소재는 대두, 포도, 해바라기, 루핀, 땅콩, 참깨, 서양호박, 브랜 오일(bran oil), 동백오일, 금잔화, 아마 및 대마로 구성된 군에서 단독 또는 그것의 혼합물로서 선택됨을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 수화층판상 혹은 리포좀은 지질상에 막을 견고하게 하는 제제로서 콜레스테롤 또는 콜레스테릴헤미석시네이트를 포함함을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 수화층판상 혹은 리포좀은 지질상에 수화층판상 혹은 리포좀의 막을 유동화하는 제제로서 계면활성제를 적어도 하나 포함함을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수화층판상 혹은 리포좀을 포함하는 조성물 중량당 0.01%의 5-펜타플루오벤조일아민을 포함하며, 세포 내 침투 시 반드시 활성이 없는 형광물질 또는 형광성분을 포함함을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 농도는 수화층판상 혹은 리포좀을 포함하는 조성물의 중량당 0.05∼25%임을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 농도는 수화층판상 혹은 리포좀을 포함하는 조성물의 중량당 0.5∼2.5%임을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방족 모노아민은 C10과 C13 사이에 탄소사슬로 연결됨을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방족 모노아민은 C10과 C18, 바람직하게는, C10과 C13 사이에 지방족 탄소사슬을 한 개 포함하는 1기 모노아민의 4분자 형태임을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 1기 모노아민은 4분자 형태이며, R-N(R₁R₂R₃) 이 4개가 연결되어 있으며, 식물 단백질 용액, 바람직하게는 대두 단백질에서 선택되며, 단, R은 가수분해되거나 혹은 그렇지 않은, 하이드록시알킬화된, 특히 하이드록시프로필화되거나 혹은 그렇지 않은 식물 단백질을 나타내며, R₁ 및 R₂는 각각 C1-C6 탄화수소군, 바람직하게는 메틸 혹은 에틸을, R₃는 10∼18 탄소를 갖는 알킬 레디칼, 주로 12개의 탄소(lauryl)를 갖는 알킬 레디칼을 나타냄을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
상기 전항들 중 어느 한 항에 있어서, 수화층판상 혹은 리포좀에 내재하거나 또는 운반되는 물질 혹은 활성성분은 비타민 E, 플라보노이드, 카로티노이드, 비타민 C, 혹은 그들의 유도체와 같은 항-라디칼 제제, 카테킨, 하이드로퀴논, 아부틴, 파이트산(phytic acid), 엘라그산(ellagic acid), 비타민 C, 혹은 그들의 유도체와 같은 탈색소제, 잔틴과 같은 슬리밍제, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌, 콜레우스 추출물 혹은 그들의 유도체와 같은 피부 혹은 모발 염색제로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀.
세포 내 침투를 촉진하는 물질을 적어도 하나 포함하는 수화층판상 혹은 리포좀을 포함하며, 상기 전항들 중 어느 한 항에서 정의되는 상기 수화층판상 혹은 리포좀 및 세포 내 침투를 촉진하는 상기 물질은 화장료에 적합한 부형제와 혼합됨을 특징으로 하는 화장료 혹은 피부용 화장료 조성물.
세포 내 침투를 촉진하는 물질을 적어도 하나 포함하는 수화층판상 혹은 리포좀을 포함하며, 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에서 정의되는 상기 수화층판상 혹은 리포좀 및 세포 내 침투를 촉진하는 상기 물질은 약제학적으로 적합한 부형제와 혼합됨을 특징으로 하는 약제학적 혹은 피부용 약제학적 조성물.
제 19항에 있어서, 세포 내 침투를 촉진하는 물질의 농도는 최종 조성물의 중량당 0.05∼25%이며, 바람직하게는 0.5∼2.5%임을 특징으로 하는 약제학적 혹은 피부용 약제학적 조성물.
세포 내 침투를 촉진하는 물질을 포함하는 수화층판상 혹은 리포좀을 포함하고, 상기 물질과 수화층판상 혹은 리포좀은 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에서 정의됨을 특징으로 하는 주름예방효과, 항산화효과, 슬리밍효과, 미백효과, 피부 혹은 모발 염색효과가 있는 화장료 혹은 피부용 화장료 조성물.
제 18항, 20항 및 21항 중 어느 한 항에 기재된 화장료 혹은 피부화장료 조성물을 대상 피부 혹은 모발 부분에 처리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 코스메틱 케어방법.
제 22항에 있어서, 코스메틱 케어는 주름예방효과, 항산화효과, 슬리밍관리, 미백효과, 피부 혹은 모발 염색관리 중 어느 하나임을 특징으로 하는 코스메틱 케어방법.
화장품 주로 화장료 조성물의 제조, 주로 주름예방활성, 항산화활성, 슬리밍활성, 미백활성, 피부 혹은 모발 염색활성용 화장품으로서 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 수화층판상 혹은 리포좀의 이용.
다음을 포함함을 특징으로 하는 수화층판상 혹은 리포좀에 의해 운반되는 물질 혹은 활성성분의 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 물질의 스크리닝 방법:

a) 상기 수화층판상 혹은 상기 리포좀을 형성할 수 있는 물-지질 혼합물의 제조 단계;

b) 상기 물-지질 혼합물에서 분산과정 전에, 세포 내 침투 시 바람직하게는 반드시 활성이 없는 형광물질을 결합시키는 단계;

c) 상기 물-지질 혼합물에서 분산 전 또는 과정 중에, 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 활성가능성이 있는 상기 물질로부터 선택되는 시험물질과 비교물질을 결합시키는 단계;

d) 상기 b) 또는 c) 단계에서 얻은 물-지질 혼합물로부터 수화층판상 또는 리포좀을 형성하는 적당한 방법에 따라 상기 수화층판상 또는 상기 리포좀을 제조하는 단계; 및,

e) 세포 내 형광을 측정하여 형광물질의 세포 내 침투를 측정하는 단계.
제 25항에 있어서, 형광물질의 세포 내 침투 결과는 비교물질 특히 폴리에틸렌이민에서 얻은 세포 내 침투와 비교함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 25항 또는 제 26항에 있어서, 주로 배양 섬유아세포, 바람직하게는 정상인간 섬유아세포에서 활성가능성이 있는 물질의 세포독성 및/또는 세포사멸(apoptosis)의 유도를 측정함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 침투에 있어 반드시 활성이 없는 형광물질은 상기 배양 섬유아세포에 자발적으로 침투하지 않는 형광물질임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광물질은 펜타플루오로벤조일아미노 플루오레신(pentafluorobenzoylamino fluorescein)을 포함하거나 또는 상기 물질이며, 세포 내 침투를 평가하는 데 이용되는 수화층판상 또는 리포좀을 포함하는 최종 조성물의 중량당 0.01% 의 농도로 이용됨을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 25항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광물질은 폴리에틸렌이민을 첨가한 상태에서 결합되며, 이때 형광물질과 폴리에틸렌이민은 세포독성이 없는 농도로 첨가됨을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 25항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 침투를 촉진할 수 있는 물질은 C10과 C18 사이에, 바람직하게는 C10에서 C13 사이에 알킬 사슬을 포함하는 1기 지방족 모노아민 또는 양이온성 중합체, 특히 선택적으로 양이온을 띠는 천연 중합체, 또는 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 수화층판상 또는 리포좀에 결합되는 양이온성 합성 중합체 중에서 선택됨을 특징으로 하는 스크리닝 방법.