ES2268946A1

ES2268946A1 - Fases lamelares hidratadas o liposomas que contienen una monoamina grasa o un polimero cationico que promueve la penetracion intracelular, y una composicion cosmetica o farmaceutica que contiene los mismos, asi como un metodo de seleccion de tal sustancia.

Info

Publication number: ES2268946A1
Application number: ES200402941A
Authority: ES
Inventors: Valerie Andre; Isabelle Bonnet; Eric Perrier
Original assignee: Engelhard Lyon SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2004-05-25
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2024-12-10
Also published as: DE102004045186B9; KR20050112498A; GB0422048D0; FR2870741A1; JP5220546B2; ES2268946B2; US20050266065A1; DE102004045186B4; JP2005350445A; DE102004045186A1; JP4950419B2; KR100697361B1; JP2009108056A; FR2870741B1; US9655822B2; GB2415375A; GB2415375B

Abstract

La invención se refiere a fases lamelares hidratadas o liposomas novedosos que contienen polietilenimina o una sustancia que estimule la penetración intracelular seleccionada del grupo que consiste en: i) una monoamina grasa de longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C18; ii) un polímero catiónico, opcionalmente al menos un compuesto fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular, que permite que se visualice esta penetración. Estos liposomas son muy útiles en cosmética o en farmacia para estimular la penetración intracelular de una sustancia o principio activo.

Description

Fases lamelares hidratadas o liposomas que contienen una monoamina grasa o un polímero catiónico que promueve la penetración intracelular, y una composición cosmética o farmacéutica que contiene los mismos, así como un método de selección de tal sustancia.

La invención se refiere esencialmente a fases lamelares hidratadas o liposomas que contienen una sustancia que promueve la penetración intracelular de una sustancia o principio activo que transporta dicha fase lamelar hidratada o los liposomas. Más específicamente, la invención se refiere a fases lamelares hidratadas o liposomas que comprenden, al menos en parte de su estructura, una sustancia o una mezcla de sustancias que pueda estimular la penetración intracelular de al menos un principio activo, que está presente o que transporta dicha fase lamelar hidratada o liposoma, seleccionada del grupo que consiste en polietilenimina o en una monoamina grasa de longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C18, definidas en la presente descripción y en las reivindicaciones, o en un polímero catiónico también definido en la presente descripción y en las reivindicaciones, que contiene opcionalmente un compuesto fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular, por ejemplo pentafluorobenzoilamino-fluorescena, que permite que se visualice esta penetración, particularmente en el contexto de un método de selección de una sustancia que sea potencialmente activa para promover la penetración intracelular.

La invención también se refiere a composiciones cosméticas o dermocosméticas, o composiciones farmacéuticas o dermofarmacéuticas que contienen tales fases lamelares hidratadas o liposomas.

La invención también se refiere a un método de cuidado cosmético que comprende la aplicación de una composición cosmética o dermocosmética según la invención sobre las zonas de la piel o el cabello afectadas. La invención también se refiere al uso de fases lamelares hidratadas o liposomas como agentes cosméticos, particularmente para la fabricación de una composición cosmética, en particular para una actividad antiarrugas, una actividad antioxidante, una actividad adelgazante, una actividad para palidecer la piel, una actividad de pigmentación de la piel o el cabello, según la naturaleza de la sustancia o principio activo que esté presente o transporte las fases lamelares hidratadas o liposomas.

La invención también se refiere a un método de selección para detectar sustancias que sean potencialmente activas para promover la penetración intracelular.

Estado de la técnica

Recientemente, se han descrito liposomas catiónicos, denominados CATESOMES^{MR} en el documento US-A-6.071.535 (Hayward), que son muy sensibles tanto al pH como a la fuerza iónica del medio circundante y que están constituidos por sales de acilo graso de amonio y alquilo graso de diamina de tipo N_{n},N_{n}-dimetil-1,n-diaminoalquilo, designándose la diamina como DDA, teniendo la parte alquílica un número de átomos de carbono n de entre 2 y 8 (véase la columna 5, líneas 37 a 39), proporcionándose la parte acilada grasa mediante un ácido graso que tiene de 10 a 30 átomos de carbono, con el fin de formar una sustancia designada como ADDA (columna 5, líneas 41 a 48).

Tales sustancias de ADDA se dice que están disponibles comercialmente bajo el nombre comercial de CATEMOL de la compañía Phoenix Chemical, Somerville, Nueva Jersey, EE.UU., referencia CATEMOL 220 y 260.

Los CATESOMES se forman combinando un ácido graso que tenga de 10 a 28 átomos de carbono, por ejemplo, ácido behénico, con el fin de formar sales denominadas sales A-ADDA, preparándose la mezcla en una proporción equimolar y a un pH de entre 6 y 10, con el fin de formar una sal entre el grupo de amina cuaternaria de la sustancia de ADDA y el grupo carboxilo del ácido graso {véase de la columna 5, linea 66 a la columna 6, línea 4).

Este documento de Hayward también cita el documento US-A-4.721.612, que se refiere a liposomas convencionales, cuyas bicapas comprenden una forma de sal de un esterol y un ácido orgánico, tal como la forma de tris-sal de un hemisuccinato de esterol (columna 5, líneas 13 a 18).

Sumario de la invención

Un objetivo principal de la presente invención es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico novedoso que consiste en proporcionar fases lamelares hidratadas o liposomas novedosos que permitan un aumento de la penetración intracelular de una sustancia o principio activo, de manera ventajosa en las células de la piel o el cabello, mientras que al mismo tiempo limitan la citotoxicidad o la inducción de la muerte celular de dichas células.

Otro objetivo principal de la presente invención es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico de proporcionar fases lamelares hidratadas o liposomas novedosos que no sólo promuevan la penetración intracelular de una sustancia o principio activo, de manera ventajosa en células de la piel o del cabello, sino que permita una velocidad de encapsulación relativamente alta de dicha sustancia o principio activo que se va a obtener en dichas fases lamelares hidratadas o los liposomas.

Otro objetivo principal de la presente invención es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico novedoso que consiste en proporcionar composiciones cosméticas o dermocosméticas, farmacéuticas o dermofarmacéuticas, novedosas que contienen fases lamelares hidratadas o liposomas que poseen una excelente penetración intracelular de una sustancia o principio activo, de manera ventajosa en células de la piel o del cabello, mientras que al mismo tiempo limitan la citotoxicidad o la inducción de la muerte celular (apoptosis) de dichas células.

Otro objetivo principal de la presente invención es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico novedoso que consiste en proporcionar un método novedoso de selección de una sustancia que sea potencialmente activa para mejorar la penetración intracelular de una sustancia o principio activo, de manera ventajosa en células de la piel o del cabello y preferiblemente también para evaluar la citotoxicidad o la inducción de apoptosis de dichas células.

La totalidad de estos problemas técnicos se soluciona por primera vez de manera simultánea, de una manera segura y fiable, que puede utilizarse a escala industrial y farmacéutica o cosmética.

Por tanto, según un primer aspecto, la presente invención proporciona fases lamelares hidratadas o liposomas, caracterizados porque comprenden, al menos en parte, en su estructura una sustancia o una mezcla de sustancias que puede(n) estimular la penetración intracelular de al menos un principio activo que está presente o que transportan dichas fases lamelares hidratadas o liposomas y que se selecciona(n) del grupo que consiste en:

a): polietilenimina;

b): una monoamina grasa primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C18, de manera ventajosa una monoamina que comprende una cadena grasa C10-C18, preferiblemente una monoamina primaria o cuaternaria que comprende una única cadena grasa C10-C18;

c): un polímero catiónico, particularmente un polímero natural catiónico o que opcionalmente se ha hecho catiónico o un polímero sintético catiónico,

conteniendo opcionalmente dichas fases lamelares o liposomas al menos un compuesto fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular, por ejemplo pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, que permite que se visualice esta penetración.

Según una realización particular, dichas fases lamelares o liposomas se caracterizan porque el polímero natural opcionalmente catiónico se selecciona del grupo que consiste en quitosano, polímero de la miel cuaternizado; proteínas vegetales, particularmente proteínas de trigo o proteínas de trigo cuaternizadas, proteínas de arroz o proteínas de arroz cuaternizadas, proteínas de soja o proteínas de soja cuaternizadas; colageno o colageno cuaternizado, queratina o queratina cuaternizada, caseína o caseína cuaternizada, celulosa o celulosa cuaternizada, guar o guar cuaternizado. Estos polímeros cuaternizados son generalmente productos comerciales y la cuaternización se obtiene generalmente mediante el injerto de aminas terciarias en el grupo químico del polímero inicial.

Según otra realización ventajosa, dichas fases lamelares o liposomas se caracterizan porque la monoamina primaria se selecciona del grupo que consiste en decilamina, undecilamina, dodecilamina, tridecilamina, tetradecilamina, pentadecilamina, octadecilamina o es una mezcla de aminas primarias tal como las mezclas de aminas de la copra que tienen una cadena hidrocarbonada de entre C8 y C18.

Según una realización particular, las fases lamelares o liposomas contienen polietilenimina.

Según otra realización particular, las fases lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al menos un agente que modifica la membrana de los liposomas, por ejemplo un lípido polar seleccionado del grupo que consiste en un triglicérido, en un fosfolípido polar o en un esfingolípido polar, solos o en una mezcla.

Según otra realización particular, el fosfolípido polar mencionado anteriormente se selecciona de fosfatidilcolina o lecitina, fosfatidiletanolamina o cefalina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol o cardiolipina, fosfatidilinositol, solos o en una mezcla.

De manera ventajosa, el fosfolípido polar se selecciona de una ceramida, un esfingofosfolípido, un glucoesfingolípido solos o en una mezcla.

Según otra variante, las fases lamelares o liposomas comprenden al menos un lípido polar o un esfingolípido polar, particularmente en la forma de una sal de un ácido orgánico de un esterol tal como la tris-sal de un hemisuccinato de esterol.

Según otra realización ventajosa de la invención, las fases lamelares o liposomas comprenden al menos una lecitina, en la fase lipídica, extraída de una fuente natural seleccionada del grupo que consiste en soja, colza, girasol, altramuz, cacahuete, sésamo, calabacín, aceite de salvado, camelina macrocarpa, caléndula, lino, cáñamo, solos o en una
mezcla.

\newpage

Según otra variante, las fases lamelares o los liposomas también pueden comprender una fase lipídica que contiene colesterol o un derivado del colesterol, tal como hemisuccinato de colesterol, como agente que da rigidez a las membranas.

Según otra realización ventajosa de la invención, las fases lamelares o los liposomas pueden comprender, en la fase lipídica, al menos un agente tensioactivo o tensioactivo, como agente que fluidifica la fase lamelar o las membranas de los liposomas.

Según otra realización particular de la invención, las fases lamelares o liposomas contienen un agente fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular, particularmente la penetración intracelular de la piel o del cabello, del cual un agente preferido actualmente de tal agente fluorescente comprende o está constituido por 5-pentafluorobenzoil-aminofluoresceína, particularmente en una proporción de aproximadamente el 0,01% en peso de la composición que contiene dicha fase lamelar o liposomas.

Según una realización ventajosa de la invención, la concentración de la(s) sustancia(s) que estimula(n) la penetración intracelular es de entre el 0,05% y el 25% en peso de la composición que contiene las fases lamelares hidratadas o los liposomas, preferiblemente de entre el 0,5% y el 2,5% en peso de dicha composición.

Según todavía otra realización ventajosa de la invención, la monoamina grasa mencionada anteriormente tiene una longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C13. De manera ventajosa, la monoamina grasa mencionada anteriormente es una monoamina primaria cuaternizada que comprende una única cadena grasa que contiene carbono de entre C10 y C18, preferiblemente de entre C10 y C13.

Según todavía otra realización ventajosa de la invención, la molécula cuaternizada que promueve la penetración intracelular de los principios activos se selecciona de una disolución de proteínas vegetales cuaternizadas, preferiblemente de proteínas de soja, que están cuaternizadas, de fórmula de tipo R-N(R_{1}R_{2}R_{3}), en la que R simboliza la molécula de proteína vegetal, que está hidrolizada o no, hidroxialquilada, particularmente hidroxipropilada, o no; siendo R_{1} y R_{2} independientemente un grupo hidrocarbonado C1-C6, preferiblemente metilo o etilo y siendo R_{3} un radical alquilo que tiene de 10 a 18 átomos de carbono, y preferible y principalmente 12 átomos de carbono (laurilo).

Según otra realización de la invención, la sustancia o principio activo que está presente o que transportan las fases lamelares o los liposomas se selecciona del grupo que consiste en un agente antirradicales tal como la vitamina E, un flavonoide, un carotenoide, vitamina C o sus derivados; un agente despigmentante tal como catequina, hidroquinona, arbutina, ácido fítico, ácido elágico, vitamina C o sus derivados; un agente adelgazante tal como al menos una xantina, un agente pigmentante de la piel o el cabello tal como tirosina, triptófano, fenilalanina, un extracto de Coleus o sus derivados.

Según un segundo aspecto, la presente invención también se refiere a composiciones cosméticas o dermocosméticas; composiciones farmacéuticas o dermofarmacéuticas, que comprenden tales fases lamelares hidratadas o liposomas, que comprenden al menos una sustancia que estimula la penetración intracelular, opcionalmente en un excipiente, cosmética, dermocosmética, farmacéutica o dermofarmacéuticamente aceptable.

Tales excipientes son bien conocidos por los expertos en la técnica y algunos se citan en los dos documentos de la técnica anterior indicados en la descripción de la técnica anterior.

Otros excipientes resultan de los ejemplos de composiciones cosméticas, dermocosméticas, farmacéuticas o dermofarmac6uticas de la siguiente descripción, que se facilitan simplemente como una ilustración y que no limitan de ninguna manera el alcance de la invención.

Según un tercer aspecto, la invención también se refiere a un método de cuidado cosmético que comprende aplicar tópicamente, sobre la piel o el cabello, una composición que comprende fases lamelares hidratadas o liposomas tal como se describieron anteriormente, o que resultan de la siguiente descripción, que se hace en relación con los ejemplos que constituyen una parte integral de la invención.

Según un cuarto aspecto, la presente invención también cubre un método de tratamiento terapéutico, caracterizado porque comprende aplicar tópicamente, sobre la piel o el cabello, una composición que comprende fases lamelares hidratadas o liposomas tal como se describieron anteriormente, o que resultan de los ejemplos que constituyen una parte integral de la invención, en una cantidad que es suficiente para realizar el tratamiento terapéutico buscado. En general, las fases lamelares hidratadas o los liposomas comprenden al menos un principio activo que está presente o que transportan dichas fases lamelares hidratadas o los liposomas, que tienen una actividad que está relacionada con el tratamiento terapéutico buscado.

En el contexto del cuidado cosmético, la presente invención proporciona la realización de un cuidado cosmético seleccionado del grupo que consiste en un cuidado antiarrugas, un cuidado antioxidante, un cuidado adelgazante, un cuidado para palidecer la piel, un cuidado de pigmentación de la piel o el cabello.

En el contexto de un tratamiento terapéutico, la invención proporciona la realización de un tratamiento terapéutico apropiado de la piel o del cabello, como una función de la patología que se va a tratar.

La invención también se refiere al uso de fases lamelares hidratadas o liposomas como agentes cosméticos, particularmente para la fabricación de una composición cosmética, en particular para una actividad antiarrugas, una actividad antioxidante, una actividad adelgazante, una actividad para palidecer la piel, una actividad de pigmentación de la piel o el cabello, o para la fabricación de una composición farmacéutica, en cada uno de los casos, preferiblemente a través de la vía tópica.

Según un quinto aspecto, la presente invención también se refiere a un método de selección de al menos una sustancia que pueda estimular potencialmente la penetración intracelular de una sustancia o principio activo que transportan las fases lamelares hidratadas o los liposomas, caracterizado porque comprende:

a) preparar una mezcla hidrolipídica que pueda formar dichas fases lamelares hidratadas o dichos liposomas;

b) incorporar, antes del proceso de dispersión en la mezcla hidrolipídica, un compuesto fluorescente, que es preferible y esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular;

c) opcionalmente incorporar, antes o durante el proceso de dispersión en la mezcla hidrolipídica, una sustancia de prueba seleccionada de dicha sustancia que es potencialmente activa, que puede estimular la penetración intracelular y una sustancia de referencia;

d) preparar dichas fases lamelares hidratadas o dichos liposomas según cualquier método adecuado de formación de dichas fases lamelares hidratadas o dichos liposomas a partir de la mezcla hidrolipídica obtenida o bien en la etapa o bien en la etapa c) anteriores;

e) detectar al menos la penetración intracelular del compuesto fluorescente mediante la medición de la fluorescencia intracelular.

Según otra realización, el resultado de la penetración intracelular del compuesto fluorescente se compara con la penetración intracelular obtenida con una sustancia de referencia, particularmente que comprende polietilenimina.

Según todavía otra realización, se mide la citotoxicidad y/o la inducción de apoptosis de la sustancia que es potencialmente activa, particularmente en fibroblastos, preferiblemente fibloblastos humanos normales, en cultivo.

Según todavía otra realización, el compuesto fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular es un compuesto fluorescente que no penetra de manera espontánea en dicho fibroblasto en cultivo.

Según todavía otra realización, el compuesto fluorescente comprende, o es, pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, que se utiliza a una concentración del 0,01% en peso de la composición final que contiene las fases lamelares hidratadas o los liposomas, que se utiliza para evaluar la penetración intracelular.

Según otra realización ventajosa del método, el compuesto fluorescente se incorpora en presencia de polietilenimina, estando el compuesto fluorescente y la polietilenimina en una concentración no citotóxica.

Según todavía otra realización ventajosa de la invención, la sustancia que potencialmente puede estimular la penetración intracelular se selecciona de una monoamina grasa primaria de longitud de la cadena alquílica de entre C10 y C18, preferiblemente de entre C10 y C13, o un polímero catiónico, particularmente un polímero natural que opcionalmente se hace catiónico, o un polímero sintético catiónico que se incorpora a las fases lamelares o liposomas, según se definieron anteriormente o en la siguiente descripción con referencia a los ejemplos, que constituyen una parte integral de la invención.

La invención se refiere además, según un sexto aspecto, al uso de fases lamelares hidratadas o liposomas, según se describieron anteriormente, o que resultan de los ejemplos que constituyen una parte integral de la invención, como un agente cosmético para la fabricación de una composición cosmética y particularmente para una actividad antiarrugas, una actividad antioxidante, una actividad adelgazante, una actividad para palidecer la piel, una actividad de pigmentación de la piel o el cabello.

Dentro del contexto de uno cualquiera de los aspectos precedentes, pueden añadirse de manera ventajosa tensioactivos a la mezcla hidrolipídica, de modo que se fluidifiquen las membranas de los liposomas.

La presente invención ha requerido la selección de un indicador fluorescente que no penetre de manera espontánea en los fibroblastos en cultivo, por ejemplo, y que induzca muy poca citotoxicidad por sí mismo o tras su encapsulación en un liposoma, se incorpore con un buen rendimiento a los liposomas basados en lecitina de soja, por ejemplo (aproximadamente el 80%) y sea estable tras la encapsulación (sin liberación ni cambio de la fluorescencia) y que no induzca una inestabilidad de los liposomas. El indicador seleccionado es, de manera ventajosa, 5-pentafluorobenzoilamino-fluoresceina o PFB-F a una concentración del 0,01%, es decir 185 \muM final.

De manera ventajosa, dichos métodos de dispersión para la preparación de los liposomas se seleccionan preferiblemente de cizallamiento, ultrasonidos, extrusión, hidratación/deshidratación (liofilización), congelación/descongela-
ción, evaporación en fase inversa.

La presencia de liposoma (estructura lamelar) se atestigua mediante microscopia electrónica de transmisión. El tamaño de los liposomas se valúa mediante microscopia electrónica de transmisión y análisis del tamaño de partícula por láser.

De manera ventajosa, la preparación de los liposomas se realiza a un pH de entre 4 y 8, preferiblemente a pH 6.

De manera ventajosa, la penetración intracelular de un principio activo se busca en las células de la piel.

De manera ventajosa, la penetración intracelular de un principio activo en las células de la piel se dirige principalmente a fibroblastos, queratinocitos y melanocitos.

Los medios de detección de la penetración intracelular se seleccionan de los métodos de cuantificación y de visualización, y son preferiblemente la cuantificaci6n de la intensidad de fluorescencia mediante espectrofluorometría y visualización mediante microscopia óptica de epifluorescencia.

De manera ventajosa, se considera que las moléculas son eficaces si permiten en primer lugar que se obtenga una estimulación de la penetración de fluorescencia del indicador fluorescente superior en más del 10% de la del control negativo que no contiene ninguna molécula catiónica, de manera ventajosa equivalente o superior a la del control positivo que contiene una molécula catiónica de referencia, polietilenimina, que se utiliza en 50 \muM. En segundo lugar, las moléculas seleccionadas no deben inducir preferiblemente fenómenos citotóxicos y/o apoptóticos, o inducir fenómenos citotóxicos y/o apoptóticos inferiores a los de la molécula catiónica de referencia (polietilenimina utilizada a 50 \muM).

De manera ventajosa, las moléculas activas seleccionadas para estimular la penetración intracelular se seleccionan del grupo que consiste en:

a): una amina primaria a cuaternaria, de longitud variable de la cadena que contiene carbono y, de manera ventajosa, decilamina, undecilamina, dodecilamina, tridecilamina, tetradecilamina, pentadecilamina, octadecilamina, cloruro de bencildimetil(octadecil)amonio (o cloruro de estearalconio), una mezcla de aminas primarias (por ejemplo, aminas de la copra de C8 a C18), Polyquaternium 16;

b): un polímero cuaternizado y preferiblemente quitosano, o de la miel cuaternizado, proteínas vegetales, particularmente proteínas de trigo, proteínas de arroz, proteínas de soja o sus derivados cuaternizados; celulosa o guar cuaternizados.

De manera ventajosa, las concentraciones de los agentes catiónicos utilizados están entre el 0,05% y el 25%, preferiblemente entre el 0,5 y el 2,5%, preferiblemente el 1%.

De manera ventajosa, la estimulación de la penetración intracelular es óptima para cadenas que contienen carbono de longitud media (de C10 a C13), media para las cadenas de longitud larga (de C10 a C18) e inferior para cadenas cortas (inferiores a C10).

De manera ventajosa, la estimulación de la penetración intracelular es óptima para una amina primaria (por ejemplo, C10-NH2) en comparación con una amina secundaria que comprende las dos mismas cadenas que contienen carbono por ejemplo (C10-NH-C10), debido al impedimento estérico inducido.

De manera ventajosa, ciertos polímeros cuaternizados permiten que se obtenga un mejor factor de estimulación de la penetración intracelular por la misma naturaleza del polímero seleccionado, por ejemplo, la sal laurildimónica de la proteína de trigo hidrolizada e hidroxipropilada es aproximadamente 6 veces menos eficaz que la sal laurildimónica de la proteína de soja hidrolizada e hidroxipropilada.

De manera ventajosa, las moléculas catiónicas seleccionadas son menos citotóxicas y/o inducen menos apoptosis que la molécula de referencia utilizada, polietilenimina, utilizada a 50 \muM.

De manera ventajosa, la cuantificación de la citotoxicidad se realiza con una prueba de viabilidad celular que evalúa la actividad fosfatasa alcalina de la célula, y una determinación de la interleucina-1 alfa. La apoptosis se evalúa mediante la cuantificación de la caspasa-1.

De manera ventajosa, los liposomas preparados según el método innovador descrito anteriormente, se utilizan con el fin de inducir un aumento de la penetración intracelular de los principios activos cosméticos, dermocosméticos o farmacéuticos, que se utilizan en sustitución del indicador fluorescente.

Otros objetivos, características y ventajas de la invención aparecerán claramente para los expertos en la técnica con la lectura de la descripción explicativa que hace referencia a los siguientes ejemplos.

Los ejemplos constituyen una parte integral de la presente invención y cualquier característica que parezca novedosa con respecto a cualquier estado anterior de la técnica procedente de la descripción tomada en su totalidad, incluyendo los ejemplos, constituye una parte integral de la invención en su función y en su generalidad.

Por tanto, cada ejemplo es de alcance general.

Además, en los ejemplos, todos los porcentajes se facilitan en peso, a menos que se indique lo contrario, la temperatura se expresa en grados Celsius, a menos que se indique lo contrario, y la presión es la presión atmosférica, a menos que se indique lo contrario.

Descripción de las figuras

Las figuras 1 a 4 adjuntas muestran la visualización de la penetración intracelular de dos indicadores preseleccionados según la invención, PFB-F y TRITC, respectivamente:

- La figura 1 representa fibroblastos que se han incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de PFB-F con una ampliación del objetivo multiplicado por 10.

- La figura 2 representa fibroblastos que se han incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de PFE-F con una ampliación del objetivo multiplicado por 40.

- La figura 3 representa fibroblastos que se han incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de TRITC con una ampliación del objetivo multiplicado por 100.

- La figura 4 representa fibroblastos que se han incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de TRITC y un 3% de PEI, con una ampliación del objetivo multiplicado por 100.

Ejemplo 1 Preparación y purificación de liposomas que encapsulan un indicador fluorescente

Los indicadores fluorescentes no sólo tienen la ventaja de ser seguros con respecto a la radiactividad por ejemplo, sino que son además muy sencillos de utilizar cuando es cuestión de hacer una cuantificación o de demostrar un aspecto visual de la penetración intracelular en modelos de cultivo celular.

La selección del indicador requirió la preparación de liposomas que contienen un 0,01% de diversos indicadores hidrosolubles o liposolubles, y su purificación, de modo que se elimine el indicador no incorporado antes de su aplicación sobre fibroblastos humanos normales. Se prepara un liposoma control en paralelo con el indicador fluorescente.

a) Selección del protocolo de preparación de los liposomas

Los liposomas se preparan con una concentración del 20% de lecitina de soja disuelta en tampón de dilución Trizma (sigma, Francia) 55 mM - NaCl 27 mM ajustado a pH 5. Tras agitación magnética durante 30 minutos a temperatura ambiente, la mezcla se homogeneiza muy vigorosamente durante 10 minutos.

Entonces, se diluyen los liposomas en medio DF [DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco)/Ham F12 glutamax 50/50 en volumen/volumen, complementado con un 10% de suero bovino, con penicilina a una concentración final de 100 U.I./mililitro, con gentamicina a una concentración final de 1 microgramo/mililitro, con anfotericina B a una concentración final de 1 microgramo/mililitro] de modo que se obtengan concentraciones de lecitina de soja variables (0,5 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 7,5 - 10%).

Se añaden 250 \mul de la suspensión liposomal a cultivos de fibroblastos humanos normales extraídos de plastia abdominal y se cultivan en una placa de 96 pocillos. Cada concentración se prueba en 6 pocillos diferentes. Se evalúa la viabilidad celular mediante una prueba con fosfato de paranitrofenilo que determina la actividad fosfatasa alcalina intracelular después de tres aclarados con tampón fosfato pH 7,4. Se calcula el porcentaje de células vivas con respecto a un control preparado sin la adición de liposomas en el pocillo de cultivo (n = 6).

Los resultados obtenidos muestran que se obtiene una viabilidad celular superior al 85% con hasta el 7,5% de lecitina. Con un 10% de lecitina, la viabilidad pasa a ser inferior al umbral aceptable de una viabilidad del 75%.

Se selecciona la concentración del 5%, que permite que se obtenga una viabilidad celular superior al 90%.

b) Preparación de liposomas con 5% de lecitina de soja que incorporan un indicador fluorescente

Se introducen 0,5 g de lecitina de soja, un 0,01% de un indicador fluorescente que se solubiliza previamente según las recomendaciones del proveedor, en una placa y se diluye con 10 ml de tampón Trizma. Tras agitación magnética durante 30 minutos a temperatura ambiente, la mezcla es homogeneiza vigorosamente durante 10 minutos, obteniendo así una disolución liposomal en la que los liposomas tienen un tamaño medio que puede variar entre 100 y 800 nanómetros según las condiciones exactas de la homogeneización.

El objetivo de la etapa de purificación es separar la fracción de indicador no encapsulado de la fracción de indicador que está encapsulado en los liposomas. Para esto, la disolución liposomal se centrifuga en un tubo cónico durante 10 minutos a 1.790 g a temperatura ambiente. Entonces, se recuperan los bloques ("plugs") y se solubilizan luego en 10 ml de medio de cultivo.

El control negativo de liposomas se prepara según el protocolo descrito anteriormente, sin indicador fluorescente.

Las muestras se conservan durante 24 horas a 4ºC en ausencia de luz. Se preparan 26 series de liposomas con diversos tipos de indicadores fluorescentes, unos sensibles al pH, otros sensibles al calcio, u otros.

Ejemplo 2 Selección de un indicador fluorescente que puede encapsularse en un liposoma, que no penetra de manera espontánea en fibroblastos humanos normales en cultivo

La selección del indicador requirió la preparación y la purificación de liposomas, según el protocolo descrito en el ejemplo 1, conteniendo estos liposomas concentraciones variables de los diversos indicadores hidrosolubles o liposolubles (tabla 1, anexo 1). Los controles (un indicador fluorescente libre) se preparan mediante la disolución a la misma concentración de indicador fluorescente en el tampón de dilución, de modo que se cuantifique su citotoxicidad y su penetración espontánea en los fibroblastos.

La comparación con un liposoma que no contiene ningún indicador fluorescente como control negativo se realiza en paralelo.

En la práctica, tras la extracción de una biopsia que se origina a partir de una cirugía plástica abdominal, los fibroblastos se amplifican en medio DF, es decir: DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco)/Ham F12 glutamax 50/50 en volumen/volumen, complementado con un 10% de suero bovino, con penicilina a una concentración final de 100 U.I./mililitro, con gentamicina a una concentración final de 1 microgramo/mililitro, con anfotericina B a una concentración final de 1 microgramo/mililitro.

En primer lugar, tras la centrifugación, los liposomas purificados se llevan a medio de cultivo DF, se homogeneizan en un vórtex y se depositan a una tasa de 1 ml por pocillo en los fibroblastos cultivados en placas de 24 pocillos (Costar MW24). Los controles se preparan en las mismas condiciones. También se prepara un control no tratado.

Los fibroblastos se incuban durante 24 horas a 37ºC en presencia de los liposomas y luego se aclaran 3 veces en tampón fosfato pH 7,4. En primer lugar, se evalúa la fluorescencia en seco mediante espectrofluorimetría con un Cytofluor 4000® (lector de fluorescencia para placas de múltiples pocillos) (Millipore). En segundo lugar, se observa la fluorescencia intracelular para las moléculas de interés con un microscopio inverso de Olympus® (IX70) utilizando el correspondiente filtro de excitación (objetivo x10, x40 y x100). Finalmente, se evalúa la citotoxicidad de los indicadores fluorescentes en una placa de 96 pocillos mediante incubación durante 24 horas tal como se describe en el ejemplo 1.

Los resultados obtenidos muestran que de las 25 moléculas probadas, sólo la pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, PFB-F (P12925 Molecular Probes) y el isotiocianato de tetrametil-rodamina TRITC (T-490 Molecular Probes) dan resultados positivos interesantes tras su incorporación en un liposoma, la aplicación en los fibroblastos durante 24 horas y la cuantificación de la penetración del contenido liposomal.

Las figura 1 a 4 adjuntas son fotografías que visualizan la penetración intracelular de los dos indicadores preseleccionados, PFB-F y TRITC a la concentración del 0,01% en liposomas, tras su incubación con los fibroblastos durante 24 horas.

TABLA 2 Resultados de la selección de indicador

	Citotoxicidad (% del	Penetración de	Penetración (fluorescencia
	control no tratado)	la sonda libre	tras lavado)
PFB-F	110,7%	8 (aumenta 45)	65 (aumenta 45)
(485-530)
TRITC	74,8	295 (aumenta 50)	1.119 (aumenta 50)
(530-620)

Sin embargo, aunque el TRITC da un marcado más intenso (tabla 1 y figuras 1 a 4 adjuntas), no obstante es ligeramente citotóxico, penetra ligeramente cuando se añade libre al medio de cultivo. Así, PFB-F parece ser un indicador mejor.

Ejemplo 3 Estudio de la penetración intracelular en presencia de PFB F (pentafluorobenzoilamino-fluoresceina) o TRITC (isotiocianato de tetrametil-rodamina) en presencia o no de polietilenimina

Se analiza la penetración intracelular de liposomas que contienen un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F o TRITC en presencia o no de un 0,5% de polietilenimina (PEI) de 25 kDa, que se prepararon según el protocolo descrito en el ejemplo 1, tras la incubación durante 24 horas sobre fibroblastos humanos cultivados en una placa de 24 pocillos, tal como se describe en el ejemplo 2.

Los resultados obtenidos muestran que la adición de PEI estimula la penetración de los liposomas con PFB-F 13,7 veces, mientras que la adición de PEI disminuye la penetración de los liposomas con TRITC 16 veces (véanse las fotografías de las figuras 1 a 4 adjuntas).

Por tanto, el indicador retenido es PFB-F o pentafluorobenzoilamino-fluoresceina al 0,01% en el liposoma.

Ejemplo 4 Estudio la estabilidad de los liposomas que contienen pentafluorobenzoilamino-fluoresceína (PFB-F)

Se analiza la estabilidad de los liposomas mediante el estudio de la liberación del indicador fluorescente en el medio de cultivo DF mediante espectrofluorimetría; este estudio se realiza como una función del pH, de la fuerza iónica y de la presencia de detergente.

En la práctica, se preparan liposomas que contienen un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y 50 \muM de PEI de 25 kDa. Las disoluciones liposomales se ajustan hasta pH 6 - 7- 8 - 9; se ajusta la concentración de cloruro de sodio (NaCl) hasta 50 - 100 - 150 - 200 mM y se ajusta la concentración de dodecilsulfato de sodio (SDS) o Triton X-100 hasta 0,1 - 0,5 - 1 - 3%. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 3.

TABLA 3 Estudio de la liberación como una función de la presencia de detergentes, de la fuerza fónica y del pH

Moléculas	Concentraciones	Liberación:	Liberación:
		media	desviación
			estándar
Triton X-100	3%	44027	177
	1%	45800	2888
	0,5%	40834	39
	0,1%	19829	103
SDS	3%	62481	180
	1%	71809	1558
	0,5%	76676	200
	0,1%	22990	108
NaCl	200 mM	68527	2040
	150 mM	7622	36
	100 mM	6314	113
	50 mM	5680	62
pH	9	25265	411
	8	18816	226
	7	8781	70
	6	7640	55

Los resultados parecen indicar que los liposomas que contienen 50 \muM de PEI de 25 kDa empiezan a desestabilizarse desde NaCl 200 mM, 0,5% de Triton X-100 o SDS y por encima de pH 7.

Ejemplo 5 Rendimiento de encapsulación del indicador fluorescente PFB-B como una función de la concentración de polietilenmina

Se preparan liposomas según el método descrito en el ejemplo 5 con concentraciones crecientes de PEI de 25 kDa desde 0 \muM hasta 100 \muM. Tras la centrifugación a 1.790 g durante 10 minutos, se cuantifican los sobrenadantes mediante espectrofluorimetría. Los rendimientos de encapsulación se calculan con respecto a la concentración inicial. Los resultados se facilitan en la tabla 4.

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TABLA 4 Rendimiento de encapsulación de PFB-F como una función de la concentración de PEI

Concentración de PEI (\muM)	0	1	10	50	100
Rendimiento (%)	89,0	92,3	91,0	87,5	86,3

Se indica que el rendimiento de encapsulación no está afectado por el aumento de la concentración de PEI.

Ejemplo 6 Desarrollo de las condiciones de selección con liposomas fluorescentes que contienen concentraciones variables de polietilenimina

Se preparan liposomas según el protocolo descrito en el ejemplo 1 con concentraciones variables de polietilenimina (PEI de 25 kDa, neutralizado con ácido clorhídrico 6 N), es decir, 0 - 5 - 10 - 50 \muM y un 0,01% de PFB-F.

La cuantificación se lleva a cabo mediante espectrofluorimetría tras incubación sobre fibroblastos cultivados en una monocapa en una placa de 24 pocillos durante 2 - 4 - 6 - 24 y 48 horas, tras 3 lavados en tampón fosfato pH 7,4, frente a un blanco de fibroblastos no tratados y tras normalización frente a PFB-F libre a la misma concentración. Los resultados se facilitan en la tabla 5.

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TABLA 5 Estudio de la penetración intracelular de PFB-F como función del tiempo y la concentración de PEI (n = 4 para cada condición), expresado en unidades arbitrarias de fluorescencia

Concentración	0	5 \muM	10 \muM	50 \muM
de PEI
Tiempo	Media	Desv.	Media	Desv.	Media	Desv.	Media	Desv.
		Est.		Est.		Est.		Est.
2 h	6	0	49	4	67	7	116	6
4 h	7	3	63	5	89	9	159	10
6 h	6	0	65	10	94	13	203	12
24 h	9	3	120	5	129	3	291	17
48 h	6	1	160	18	171	13	306	6

Los mejores resultados se obtienen para una concentración de 50 \muM de PEI y un tiempo mínimo de incubación sobre los fibroblastos de 24 horas. Estas condiciones se mantendrán para la selección de las moléculas que estimulan la penetración intracelular. Los resultados son estadísticamente significativos en el control de sonda libre (p < 0,05) para todos los tiempos desde la concentración de 5 \muM.

Ejemplo 7 Análisis de la penetración intracelular y de la citotoxicidad de liposomas fluorescentes que contienen polietilenimina 50 \muM como función del tiempo

La experimentación se realiza según el ejemplo 6 para concentraciones de PEI de 0 a 100 \muM. La cuantificación de la fluorescencia se realiza según el ejemplo 6. La estimulación de la penetración intracelular se expresa como un factor de estimulación con respecto al liposoma sin PEI.

La viabilidad celular se lleva a cabo en una placa de 96 pocillos (250 \mul de disolución liposomal por pocillo) mediante una prueba que evalúa la actividad fosfatasa alcalina en marañas de células (prueba con fosfato de paranitrofenilo, n = 6). Los resultados de las viabilidades celulares se expresan como un porcentaje de células vivas con respecto a un control de liposoma fluorescente libre de PEI. La determinación de IL1 alfa (kit Quantikine R&D System) se realiza tomando muestras del medio de cultivo tras 24 horas de incubación en paralelo a una determinación de las proteínas totales (Bradford, Sigma). Los resultados se facilitan en las tablas 6 y 7.

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TABLA 6 Factor de penetración intracelular de PFB-F y citotoxicidad como una función del tiempo y de la concentración de PEI (n = 4 para cada condición)

Tiempo	0	5 \muM	10 \muM	50 \muM	Viabilidad PEI 50
2 h	0,7	5,4	7,4	12,9	93,8%
4 h	0,8	7,0	9,9	17,7	92,4%
6 h	0,7	7,2	10,4	22,6	83,9%
24 h	1,0	13,3	14,3	32,3	72,6%
48 h	0,7	17,8	19,0	34,0	48,4%

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TABLA 7 Determinación de IL1 alfa en pg/mg de proteínas totales

PEI de 25 kDa	0	10 \muM	50 \muM	100 \muM
Proteínas totales en \mug/ml	132,8	136,2	119,5	79,2
IL1 en pg/ml	9,2	12,7	13,1	14,4
IL1 en pg/ml de proteínas	69,3	93,2	109,6	181,8
Factor de estimulación	1	1,3	1,6	2,6

Los resultados muestran que es posible aumentar hasta 34 veces el factor de penetración del indicador fluorescente en presencia de PEI en este experimento. Sin embargo, se observa que a la concentración de 50 \muM de PEI de 25 kDa, a partir de 24 horas, se observa un fenómeno significativo de citotoxicidad, a las 48 horas, más de la mitad de las células están muertas. Con respecto a la síntesis de IL1 alfa a la concentración de 50 \muM, la estimulación es de 1,6 veces y a 100 \muM es de 2,6 veces. Por tanto, esta molécula genera una tensión de naturaleza inflamatoria significativa.

Ejemplo 8 Selección de moléculas que estimulan la penetración intracelular de un indicador fluorescente incorporado en un liposoma

Se preparan liposomas con un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y 1 - 0,1 - 0,01% de la molécula que se va a probar, que se neutraliza hasta pH 7 con ácido clorhídrico si es necesario, en tampón de dilución Trizma, tal como se describe en el ejemplo 5.

En primer lugar, se probaron 55 moléculas por triplicado, en comparación con PEI 50 \muM de 25 kDa. La penetración intracelular se cuantifica tras 24 horas de incubación sobre fibroblastos humanos normales cultivados en placas de 24 pocillos, tal como se describe en el ejemplo 2. Se estima la viabilidad celular en una placa de 96 pocillos con 200 \mul de suspensión liposomal. Los resultados obtenidos para la concentración del 1% se facilitan en la tabla 8 (Anexo 2). Una vez llevada a cabo la selección, se seleccionaron 15 moléculas puesto que pueden estimular la penetración intracelular del indicador fluorescente en más del 10%. Las viabilidades celulares son variadas (desde el 37 hasta el 99%) a una concentración del 1%. La visualización del indicador fluorescente la penetración para las moléculas que estimulan la penetración en más del 32%. Estas moléculas se conservan con prioridad.

Ejemplo 9 Influencia de las moléculas sobre la estimulación de la penetración intracelular

Se llevaron a cabo la preparación de los liposomas con monoaminas grasas primarias de longitud de la cadena alquílica de entre 3 y 18 carbonos y la cuantificación de la penetración intracelular del marcador fluorescente tal como se describen en el ejemplo anterior. Los resultados se facilitan en la tabla 9.

TABLA 9 Estimulación de la penetración intracelular como función de la longitud de la cadena que contiene carbono

Número de carbonos de monoamina primaria	Factor de estimulación
con una única cadena de alquilo graso
Control de PEI de 25 kDa	34,7
C3	0,9
C4	1,4
C6	0,2
C7	3,7
C10	39,6
C11	95,3
C12	47,1
C13	44,5
C14	11,6
C15	14,9
C18	19,6

La incorporación, en las membranas de los liposomas, de aminas grasas que tienen cadenas alifáticas de diversos tamaños, muestra claramente efecto de la longitud de las cadenas que contiene carb6no sobre la actividad estimulante de la penetración intracelular de PFB-F encapsulado en liposomas que tienen un 5% de lecitina. Existe una clasificación aproximada de los ácidos grasos como una función de la longitud de las cadenas. Se distinguen así las cadenas cortas (menos de 8 carbonos), las cadenas medias (desde 10 hasta 18 carbonos) y las cadenas largas (más de 18 carbonos). Al transponer esta clasificación a las aminas grasas probadas dentro del contexto de este estudio, parece que las cadenas medias son las que confieren a los liposomas su propiedad de estimulación de la penetración intracelular a los liposomas.

Ejemplo 10 Influencia del impedimento estérico sobre la penetración intracelular

Con vistas a definir mejor las características de las moléculas que tienen un efecto estimulante sobre la penetración intracelular de un indicador fluorescente encapsulado en liposomas que tienen un 5% de lecitina, se ha observado el efecto del impedimento estérico sobre la actividad estimulante potencial de estas moléculas. Así, se ha estudiado la penetración intracelular de PFB-F encapsulado en liposomas, en presencia de monoaminas grasas primarias, por una parte, y con monoaminas grasas secundarias, por otra parte. La preparación de los liposomas con las aminas grasas primarias o secundarias y la cuantificación de la penetración intracelular de los marcadores fluorescentes se llevan a cabo tal como se describen en el ejemplo 8. Los resultados se facilitan en la tabla 10. Las diaminas no permiten una mejor penetración intracelular del marcador.

TABLA 10 Estimulación de la penetración intracelular como una función del número de cadenas que contiene carbono

Número de cadenas de alquilo de la	Factor de estimulación
amina (longitud de cadena)
PEI de 25 kDa	34,7
1(C4)	1,7
2(C4)	0,7
1(C10)	39,6
2 (C10)	1,2

Ejemplo 11 Influencia del impedimento estérico sobre la penetración intracelular

Procediendo como se describió en particular en el ejemplo 9 ó 10, se demostró, sin embargo, que la longitud de la cadena que contiene carbono no es el único factor que interviene en la estimulación de la penetración intracelular del contenido liposomal.

De hecho, al hacer la comparación de las estructuras químicas facilitadas en la siguiente figura, se muestra una especificidad del grupo R que interfiere con la cadena que contiene carbono C_{12}.

1

R_{y} representa proteína de soja hidrolizada e hidroxipropilada.

R_{A} representa proteína de trigo hidrolizada e hidroxipropialada.

Las moléculas cuaternizadas Y y A son productos que son muy comunes para el experto en la técnica. El impedimento estérico de la molécula cuaternizada (moléculas comerciales) incorporada desempeña un papel en la estimulación de la penetración intracelular de los liposomas que tienen lecitina.

Las moléculas de las clases siguientes (tabla 11) pueden utilizarse, por ejemplo, al 1% para estimular la penetración intracelular en grados variables de hasta el +39%.

También pueden utilizarse otros hidrolizados cuaternizados de moléculas extraídas de almendras, guisantes, patata o algas.

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Ejemplos de moléculas		Ejemplos de
cuaternizadas disponibles	Nombre químico	posibles
comercialmente		proveedores
Trigo	\begin{minipage}[t]{90mm} Sal cocodimónica, estearil-dimetil-amónica, hidroxipropiltrimónica o laurildimónica de la proteína de trigo hidrolizada \end{minipage}	Croda
	Cloruro de amidopropalconio - germen de trigo
Soja	\begin{minipage}[t]{90mm} Sal laurildimónica de la proteína de soja hidrolizada e hidroxipropilada\end{minipage}	Croda
	\begin{minipage}[t]{90mm} Sal cocodimónica de la proteína de soja hidrolizada e hidroxipropilada, cloruro de hidroxipropiltrimetilamonio de la proteína de soja hidrolizada \end{minipage}	RITA corporation
	Glucósido de dihidroxipropildimonio de soja
Queratina	Sal hidroxipropiltrimónica de la queratina hidrolizada	RITA corporation
Caseína	Sal hidroxipropiltrimónica de la caseína hidrolizada	RITA corporation
Colágeno	Sal hidroxipropiltrimónica del colágeno hidrolizado,	RITA corporation
	Sal laurildimónica del colágeno hidrolizado e hidroxipropilado	Cognis
Seda	Sal hidroxipropiltrimónica de la seda hidrolizada	RITA corporation
Arroz	\begin{minipage}[t]{90mm} Sal cocodimónica de la proteína de arroz hidrolizada e hidroxipropilada\end{minipage}	Sochibo
Guar	Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar,	Meyhall
	Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar,	Rhodia
	sal hidroxipropiltrimónica de guar
Miel	Sal hidroxipropiltrimónica de miel	ARCH
Celulosa	Polyquaternium 4 y 10	Quimasso
	Polyquaternium 39

Ejemplo 12 Optimización de la concentración de una molécula de funcionalización (que estimula la penetración intracelular)

La estimulación de la penetración intracelular del indicador fluorescente se optimiza probando diversas concentraciones de la molécula de funcionalización.

En la práctica, se forman liposomas con un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y del 0,5 al 2,5% de la disolución de soja cuaternizada en tampón de dilución Trizma. Se evalúan la penetración intracelular y la citotoxicidad tal como se describe en el ejemplo 2. Los resultados obtenidos se facilitan en la tabla 12.

TABLA 12 Estudio de la concentración de molécula que estimula la penetración intracelular y el factor de estimulación, así como la viabilidad celular

Soja cuaternizada en %	0,5	1	1,5	2	2,5
Factor de estimulación	0,6	1,6	38,9	97,2	99,9
Viabilidad celular (%)	92,4	97,9	87,9	75,4	77,3

Por tanto, puede ajustarse la penetración intracelular buscada como una función de la concentración de agente de funcionalización y de la máxima citotoxicidad tolerada.

Ejemplo 13 Efecto inflamatorio comparado entre la polietienimina y la soja cuaternizada seleccionada

Se compara la estimulación de la síntesis de interleucina-1 alfa entre liposomas que se funcionalizan con PEI 50 \muM y diversas concentraciones en disolución de soja cuaternizada.

En la práctica, se forman liposomas con un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y del 0,5 al 2,5% de la disolución de soja cuaternizada o 50 \muM de PEI, en tampón de dilución Trizma. Se evalúa el contenido de IL1 con un kit (Quantikine R&D System) según se describe en el ejemplo 7. Se lleva a cabo una prueba con fosfato de paranitrofenilo (PNPP) en paralelo, con el fin de evaluar el número de células por pocillo. Los resultados del contenido de IL1-alfa se comparan con la densidad óptica del PNPP obtenido, Los resultados obtenidos se facilitan en la
tabla 13.

TABLA 13 Efecto de las moléculas de funcionalización (PEI y soja cuaternizada) sobre la síntesis de interleucina-1 alfa

Concentración de	PEI	0,5% de	1% de	1,5% de	2% de
molécula de	50 \muM	soja	soja	soja	soja
funcionalización
PNPP	72,3	91,8	91,6	87,5	88,4
IL1-alfa	350	137,5	137,5	212,5	187,5
ILI-alfa/PNPP	484,1	149,8	150,1	242,9	212,1

Los resultados obtenidos muestran que la disolución de soja cuaternizada seleccionada previamente induce una citotoxicidad y una tensión inflamatoria que está muy limitada con respecto a la molécula de referencia de PEI.

Ejemplo 14 Efecto apoptótico comparado entre la polietilenimina y la soja cuaternizada seleccionada

Se compara la estimulación de la síntesis de interleucina-1 alfa entre liposomas que se funcionalizan con PEI 50 \muM y diversas-concentraciones en la disolución de soja cuaternizada.

En la práctica, se forman liposomas con un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y del 0,5 al 2,5% de la disolución de soja cuaternizada o 50 \muM de PEI, en tampón de dilución Trizma. Se evalúa el contenido de caspasa-1 con un kit (Caspase-1 Colorimetric Assay R&D System, sistema de I+D para ensayo colorimétrico de caspasa-1). Se lleva a cabo en paralelo una prueba con fosfato de paranitrofenilo (PNPP) con el fin de evaluar el número de células por pocillo. Los resultados del contenido de caspasa-1 se comparan con la densidad óptica del PNPP obtenido. Los resultados se facilitan en la tabla 14.

TABLA 14 Efecto de las moléculas de funcionalización sobre el contenido de caspasa-1

Concentración de	PEI 50	0,5% de	1% de	1,5% de	2% de
molécula de	\muM	soja	soja	soja	soja
funcionalización
PNPP	59,8	91,8	91,6	87,5	88,5
Caspasa-1	642,8	76	87,7	78,3	117,5
Caspasa-1/PNPP	1074,9	82,8	95,7	89,5	132,8

Los resultados obtenidos muestran que la disolución de soja cuaternizada seleccionada anteriormente induce una citotoxicidad y una tensión apoptótica que está excesivamente limitada con respecto a la molécula de PEI de referencia.

Ejemplo 15 Observación de la estructura de la composición liposomal del ejemplo 14 mediante microscopia electrónica de transmisión

Se observaron los liposomas preparados con un 2% de disolución de soja cuaternizada, sin la adición de principio activo ni de indicador fluorescente, mediante microscopia electrónica de transmisión. Se realizó una coloración negativa de los liposomas utilizando sales de metales pesados que se rompen entre las bicapas de las vesículas multilamelares. La observación se realiza con un microscopio electrónico de transmisión Phillips CM120 y una ampliación de 30 a 60.000.

La observación revela la presencia de capas lipídicas concéntricas que son características de las estructuras multilamelares. El tamaño medio de los liposomas observados varía desde 150 hasta 250 nm.

Ejemplo 16 Estimulación de la protección antirradicales mediante el uso de una disolución de soja cuaternizada del ejemplo 11

Se preparan liposomas con un 5% de lecitina de soja, un 0,2% de vitamina E natural y un 2% de disolución de soja cuaternizada del ejemplo 11 (molécula Y).

En la practica, se añaden 0,4 g de vitamina E natural a 10 g de lecitina de soja y 10 ml de etanol al 96%. La disolución se evapora durante una noche con agitación magnética a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Tras la evaporación del etanol, se añaden 100 ml de agua desionizada. La mezcla se agita hasta su disolución completa.

Entonces, los liposomas se preparan añadiendo 5 ml de disolución de lecitina - vitamina E, 190 \mul (es decir, el 2%) de disolución de soja cuaternizada y 4,80 ml de tampón de dilución Trizma 55 mM - NaCl 27 mM ajustado a pH 5 y se mezclan con agitación magnética en ausencia de luz durante 30 minutos. Después, se homogeneiza la disolución a velocidad máxima durante 10 minutos, con el fin de formar los liposomas modificados. Se prepara la misma disolución sin pasar a la homogeneización y servirá como un control libre de vitamina E.

Los liposomas basados en vitamina E natural se preparan en presencia de PEI 10 \muM de 25 kDa, de modo que se evite la citotoxicidad y también sin agente de funcionalización.

Se siembran fibroblastos humanos normales en placas de 24 pocillos y se cultivan hasta confluencia. Tras tres aclarados con tampón fosfato pH 7,4 con calcio y magnesio (In vitrogen), se incubaron las diversas disoluciones diluidas a la mitad (es decir, una concentración de vitamina E final del 0,1%) con medio de cultivo durante al menos dos horas. Los pocillos se incubaron con medio de cultivo solo y servirán como control de sonda a continuación. Tras tres aclarados con tampón fosfato pH 7,4 con calcio y magnesio, de modo que se eliminaran los liposomas y la vitamina E libre, las marañas de células se incuban en presencia de dihidro-rodamina 123 (Molecular Probes) a la tasa de 200 \mul/pocillo de una disolución preparada tal como sigue: 150 \mul de una disolución 1 mM disuelta en 15 ml de tampón HBSS (solución salina equilibrada de Hank). Se lee la placa para determinar la fluorescencia a 490 - 530 nm y luego se irradia a 0,8 J/cm^{2} con [NB a 912 nm y después se lee de nuevo para determinar la fluorescencia a las mismas longitudes de onda. Los resultados se expresan como razones:

A = irradiado/no irradiado (I/NI)

B = (liposoma I/NI)/(control de sonda I/NI)

C = liposomas con vitamina E/libres de vitamina E

La sonda fluorescente utilizada permite que se evalúe la presencia de productos intermedios de oxígeno reactivo intracelulares, puesto que difunde de manera pasiva a través de las membranas celulares, en las que puede oxidarse entonces hasta rodamina catiónica. La sonda fluorescente reacciona positivamente, por ejemplo, con peróxido de hidrógeno y peroxinitritos. Los resultados obtenidos se facilitan en la tabla 15.

TABLA 15 Protección antirradicales mediante los liposomas así modificados

	I	NI	A = I/NI	B = liposoma/control	C = liposoma/libre
Producto de la invención	118990	58786	2,01	79,3%	+23%
Liposoma no funcionalizado	114907	52306	2,31	91,1%	+11%
Liposoma con PEI	105257	40148	2,82	111,4%	-9%

Estos resultados indican que los liposomas funcionalizados mediante la proteína de soja cuaternizada permiten la obtención de más del 20% de efecto protector contra la tensión por radicales con respecto a los liposomas no funcionalizados, mientras que los liposomas funcionalizados con la molécula de PEI de referencia no permiten que se observe un efecto protector, por un lado, e incluso generan una tensión adicional.

Ejemplo 17 Estimulación de la despigmentación mediante los productos de la invención

Se prepararon liposomas según el siguiente protocolo: 5% de lecitina de soja a la que se añade o no un 2% de solución de soja cuaternizada o PEI 10 \muM. También se coencapsulan los principios activos: Phytolight® (Coletica, Lyons, Francia) sin un 0,05% de conservante (cóctel de principios activos vegetales), un 0,05% de arbutina y catequina 1 mM (Sigma). Las moléculas se aplicaron libres, en un liposoma con el 5% de lecitina, en liposomas funcionalizados con PEI 10 \muM o un 2% de soja cuaternizada, sobre melanocitos humanos normales cultivados en placas de 24 pocillos y preconfluyentes. Los principios activos que se encapsulan en los liposomas o no, se incuban durante 66 horas a 37ºC bajo CO2 al 5% en medio MMK2 (Sigma). Tras 3 aclarados con tampón fosfato con calcio y magnesio (Invitrogen), extracción en tampón fosfato que contiene un 0,5% de Triton X-100, se cuantifica la actividad tirosinasa mediante una determinación en presencia de L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) y MBTH (3-metil-2-benzotiazolinona-hidrazona). La formación de un compuesto de MBTH-o-quinona se caracteriza por un valor de absorbancia a 490 nm cuantificado cinéticamente. La actividad tirosinasa se expresa mediante la pendiente (velocidad) de la reacción enzimática. Los resultados se facilitan en la tabla 16.

TABLA 16 Efecto de despigmentación de principios activos encapsulados en liposomas o no (expresado como velocidad de la reacción enzimática)

	Libre	Liposoma	Liposoma	Liposoma
			con PEI	con soja
Arbutina	0,004	0,001	0	0
Phytolight®	0,01	0,008	0,003	0,0016
Catequina	0,007	0,007	0	0,003

Estos resultados muestran que la funcionalización, como una función de los principios activos coencapsulados, permite un aumento de la inhibición de la actividad tirosinasa in vitro con melanocitos humanos normales. La funcionalización mediante soja cuaternizada es más eficaz que la obtenida mediante la adición de PEI para el complejo de extractos vegetales, equivalente para la arbutina y ligeramente inferior para la catequina. En cada caso, la actividad es de al menos 2,3 veces mayor que con un liposoma no funcionalizado.

Ejemplo 18 Método de disminución del tamaño de los productos de la invención

El tamaño de los liposomas puede disminuirse mediante el uso de un homogeneizador de alta presión (presión de trabajo superior a 1.000 bares, preferiblemente superior a 2.000 bares, más preferiblemente superior a 3.000 bares). A 3.000 bares, este instrumento permite que se obtengan liposomas de aproximadamente 50 nm.

Se analizó el tamaño de los liposomas con la ayuda de un analizador láser del tamaño de partícula (Beckman Coulter, N4 plus, Submicron Particle Size Analyser) y mediante microscopia electrónica de transmisión, tal como se describe en el ejemplo 15.

Ejemplo 19 Demostración de la penetración del material que transporta los productos de la invención tras la permeación transcutánea Ejemplos con un indicador fluorescente, vitamina E o material genético

La penetración de la molécula fluorescente (0,01% de PFB-F), libre o incorporada en un liposoma tal como se describe en el ejemplo 12, que comprende o no un 2% de la disolución de soja cuaternizada seleccionada en el ejemplo 11, se cuantificó mediante permeación transcutánea en la piel humana. Se cuantificó la cinética de difusión mediante espectrofluorimetría desde 3 hasta 24 horas. Se cuantificó la liberación tras 24 horas adicionales. También se evaluó al final el almacenamiento. El número de muestras probadas es de 5 por condición. Los resultados obtenidos facilitados en la tabla 17 muestran que el uso de los liposomas preparados en presencia de soja cuaternizada estimula significativamente la difusión, la liberación y el almacenamiento del indicador fluorescente con respecto a la forma no vectorizada o la forma vectorizada sin agente cuaternizado.

TABLA 17

	Libre	Liposoma	Liposoma
			cuaternizado
Difusión	0,57 \pm 0,03	1,17 \pm 0,05	1,76 \pm 0,13
Liberación a 24 h	0,691 \pm 0,06	1,398 \pm 0,07	1,77 \pm 0,21
Almacenamiento	0,81 \pm 0,1	1,27 \pm 0,17	2,61 \pm 0,33

La penetración de la molécula de vitamina E (0,5%), libre o incorporada en un liposoma tal como se describe en el ejemplo 12, que comprende o no un 2% de la disolución de soja cuaternizada seleccionada en el ejemplo 11, se cuantificó mediante permeación transcutánea en la piel humana. Se cuantificó la cinética de difusión mediante cromatografía líquida de alta resolución desde 5 hasta 24 horas. Se cuantificó la liberación tras 24 horas adicionales. También se evaluó al final el almacenamiento. El número de muestras probadas es de 5 por condición. Los resultados obtenidos también muestran que el uso de los liposomas preparados en presencia de soja cuaternizada estimula significativamente la difusión, la liberación y el almacenamiento de la vitamina E con respecto a la forma no vectorizada o la forma vectorizada sin agente cuaternizado.

Se llevó a cabo el mismo experimento de penetración transcutánea con la incorporación o no de material genético fluorescente (200 mM) en un liposoma tal como se describe en el ejemplo 12 en presencia de un 2% de disolución de soja. Lo obtenido por observación mediante microscopia óptica de epifluorescencia de las secciones transversales de la piel muestra que el uso de los liposomas preparados en presencia de soja cuaternizada permite la difusión del material genético a la dermis profunda.

Secuencia de la sonda fluorescente de elastina 19-20 duplicada:

: Sentido: 5'-(FITC)AGCUGCUAAGGCUGGCGCUTT-3'

: Antisentido: 5'-AGCGCCAGCCUUAGOAGCUTT-3'

Ejemplo 20 Uso de los productos de la invención en formulaciones cosméticas o farmacéuticas de tipo emulsión aceite en agua

Formulación 20a

A	Agua	csp 100
	Butilenglicol	2
	Glicerina	3
	Dihidroxicetilfosfato de sodio	2
	Isopropil hidroxicetil éter


B	Estearato de glicol SE	14
	Triisononanoína (3,5,5-trimetilhexanoato de propano-1,2,3-triilo)	5
	Cocoato de octilo	6


C	Butilenglicol,	2
	Metilparabeno,
	etilparabeno, propilparabeno,
	pH ajustado a 5,5


D	Productos de la invención	0,01 - 10%

Formulación 20b

A	Agua	csp 100
	Butilenglicol	2
	Glicerina	3
	Poliacrilamida, isoparafina,	2,8
	Laureth-7


B	Butilenglicol,	2
	metilparabeno,
	etilparabeno, propilparabeno;
		2
	Fenoxietanol,
	metilparabeno,
	propilparabeno, butilparabeno
	etilparabeno	0,5

	Butilenglicol


D	Productos de la invención	0,01 - 10%

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Formulación 20c

A	Carbómero	0,50
	Propilenglicol	3
	Glicerol	5
	Agua	csp 100


B	Cocoato de octilo	5
	Bisabolol	0,30
	Dimeticona	0,30


C	Hidróxido de sodio	1,60


D	Fenoxietanol,	0,50
	metilparabeno,
	propilparabeno, butilparabeno
	etilparabeno
E	Perfume	0,30


F	Productos de la invención	0,01 - 10%

Ejemplo 21 Uso de los productos de la invención en una formulación de tipo agua en aceite

A	Dipolihidroxiestearato de PEG 30	3
	Triglicéridos cápricos	3
	Octanoato de cetearilo	4
	Adipato de dibutilo	3
	Aceite de pepitas de uva	1,5
	Aceite de jojoba	1,5
	Fenoxietanol,	0,5
	metilparabeno,
	propilparabeno, butilparabeno,
	etilparabeno


B	Glicerina	3
	Butilenglicol	3
	Sulfato de magnesio	0,5
	EDTA	0,05
	Agua	csp 100


C	Ciclometicona	1
	Dimeticona	1


D	Perfume	0,3


E	Productos de la invención	0,01 - 10%

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Ejemplo 22 Uso de los productos de la invención en una formulación de tipo agua en aceite Emulsión primaria W1/O

A	Dipolihidroxiestearato de PEG 30	4
	Triglicéridos cápricos	7,5
	Isohexadecano	15
	Estearil éter de PPG-15	7,5


B	Agua	65,3


C	Fenoxietanol,	0,7
	metilparabeno,
	propilparabeno, butilparabeno
	etilparabeno

Emulsión secundaria W1/O/W2

A	Emulsión primaria	60


B	Poloxámeru 407	2
	Fenoxietanol,	0,3
	metilparabeno,
	propilparabeno,
	2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol
	Agua	csp 100


C	Carbómero	15


D	Trietanolamina	pH 6,0 - 6,5


E	Productos de la invención	0,01 - 10%

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Ejemplo 23 Uso de los productos de la invención en una formulación de tipo barra de labio y otros productos anhidros

A	Cera mineral	17,0
	Isoestearato de isoestearilo	31,5
	Diperlagonato de propilenglicol	2,6
	Isoestearato de propilenglicol	1,7
	Cera de abeja de PEG 8	3,0
	Glicéridos hidrogenados de aceite de semilla de palma,	3,4
	glicéridos hidrogenados de palma
	Aceite de lanolina	3,4
	Aceite de sésamo	1,7
	Lactato de cetilo	1,7
	Aceite vegetal, alcohol de lanolina	3,0


B	Aceite de ricino	csp 100
	Dióxido de titanio	3,9
	\begin{minipage}[t]{100mm} CI 15850: 1 (3-hidroxi-4-[(4-metil-2-sulfonatofenil)azo]-2-naftoato de calcio) \end{minipage}	0,616
	\begin{minipage}[t]{100mm} CI 45410: 1 (ácido 3,4,5,6-tetracloro-2-(1,4,5,8-tetrabromo-6-hidroxi-3-oxoxanten-9-il)benzoico) \end{minipage}	0,256
	\begin{minipage}[t]{100mm} CI 19140: 1 (complejos de 4,5-dihidro-5-oxo-1-(4-sulfofenil)-4-[(4-sulfofenil)azo]-1H-pirazol-3-carboxilato de zirconio) \end{minipage}	0,048
	CI 77491 (trióxido de dihierro)	2,048


C	Productos de la invención	0,01 - 5%

Ejemplo 24 Uso de los productos de la invención en una formulación de geles acuosos (lápices de ojos, adelgazantes, etc.)

A	Agua	csp 100
	Carbómero	0,5
	Butilenglicol	15
	Fenoxietanol, metilparabeno,	0,5
	propilparabeno, butilparabeno,
	etilparabeno


B	Productos de la invención	0,01 - 10%

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Ejemplo 25 Preparación de formulaciones farmacéuticas que contienen el producto de la invención

Formulación 25a

Preparación de comprimidos

A	Excipientes	En g por comprimido
	Lactosa	0,359
	Sacarosa	0,240


B	Producto de la invención	0,001 - 0,1

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Formulación 25b

Preparación de una pomada

A	Excipientes
	Polietileno de baja densidad	5,5
	Parafina líquida csp	100


B	Producto de la invención	0,001 - 0,1

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Formulación 25c Preparación de una fórmula inyectable

A	Excipientes
	Solución salina isotónica	5 ml


B	Producto de la invención	0,001 - 0,1 g

La fase A y la fase B se envasan en ampollas separadas y se mezclan antes de su uso.

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Ejemplo 26 Evaluación de la aceptación cosmética de los productos de la invención

Se llevaron a cabo pruebas toxicológicas con los compuestos obtenidos según el ejemplo 15 (sin la incorporación de principio activo), mediante una evaluación ocular y cutánea en el conejo, mediante el estudio de la ausencia de toxicidad anómala por la administración oral única en la rata y mediante el estudio del poder de sensibilización en el cobaya.

Evaluación de la irritación primaria de la piel en el conejo

Se aplicaron las preparaciones descritas anteriormente sin dilución a una dosis de 0,5 ml sobre la piel de 3 conejos, según el método recomendado por la OECD (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico) en relación con el estudio del "efecto irritante/corrosivo agudo sobre la piel".

Los productos se clasifican según los criterios definidos en la Decisión de 1/2/1982 publicada en el Diario Oficial de la República Francesa (el "JORF") de 21/02/82.

Los resultados de estas pruebas han permitido concluir que la preparación que contiene el compuesto obtenido según el ejemplo 12 no fue irritante para la piel.

Evaluación de la irritación ocular en el conejo

Las preparaciones descritas anteriormente se instilaron puras y en una cantidad a la tasa de 1 ml en el ojo de tres conejos según el método recomendado por la directiva de la OECD nº 405 del 24 de febrero de 1987, en relación con el estudio del "efecto irritante/corrosivo agudo sobre los ojos".

Los resultados de esta prueba permiten concluir que las preparaciones pueden considerarse como no irritantes para los ojos.

Prueba sobre la ausencia de toxicidad anómala por la administración oral única en la rata

Se administraron las preparaciones descritas en una cantidad por vía oral a la dosis de 5 g/kg de peso corporal, a 5, ratas macho y 5 ratas hembra según un protocolo inspirado por la Directiva de la OECD nº 401 del 24 de febrero de 1987 y adaptada a productos cosméticos.

Se encontró que las DLO y DL50 son superiores a 5.000 mg/kg. Por tanto, las preparaciones probadas no se clasifican entre las preparaciones que son peligrosas por ingestión.

Evaluación del potencial de sensibilización de la piel en el cobaya

Las preparaciones descritas se sometieron a la prueba de maximización descrita por Magnusson y Klingmann, un protocolo que está de acuerdo con la linea directiva nº 406 de la OECD. Las preparaciones se clasifican como no sensibilizantes por contacto con la piel.

Evaluación del potencial de mutagenicidad

El protocolo está de acuerdo con la línea directiva de la OECD nº 471 (Directiva 92/69/EEC).

Se llevaron a cabo las pruebas de mutagénesis en "Salmonella typhimurium" y en "Escherichia coli" según el método de Ames et al. (Mutation Research, 1975, 31, 347-364). Se expusieron cinco cepas al producto de la invención en medio mínimo, con o sin sistemas exógenos de activación del metabolismo (de modo que se distingan promutágenos y mutágenos directamente). Tras la incubación, se contaron las colonias mutadas y se compararon con el número de colonias mutadas espontáneamente entre los controles.

El producto de la invención no tiene ninguna actividad mutagénica en el sentido de la Directiva 92/69/EEC.

Evaluación del potencial de sensibilización en voluntarios sanos

Evaluación en un panel de voluntarios del potencial alergénico del producto de la invención. El protocolo está de acuerdo con el método de Marzulli y Maibach (Contact Dermatitis, 1976, 2, 1-17) que comprende una fase de inducción y una prueba de estimulación, esta prueba se realiza en un panel de 100 voluntarios sanos de sexo femenino y/o masculino, con edades comprendidas entre 18 y 65 arios y que tienen cualquier tipo de piel.

Se aplicó un parche oclusivo que contenía el producto de la invención diluido al 20% sobre la zona escapular de cada uno de los voluntarios. Los parches se dejaron en contacto directo con la piel durante 24 horas y se volvieron a aplicar cada dos días durante 3 semanas para un total de 9 aplicaciones. Tras la retirada de cada parche, se evaluaron los signos clínicos de irritación y sensibilización de la piel = Fase de inducción.

Tras un periodo de 2 semanas, se aplicaron otros parches que contenían el producto de la invención diluido al 20% sobre la piel de los voluntarios y se dejaron en contacto directo con le superficie cutánea durante 24 horas. Se evaluaron los signos clínicos de irritación y sensibilización de la piel 24, 48 y 72 horas después de la retirada del parche = Fase de "exposición".

Ninguno de los 100 voluntarios participantes en el estudio presentó signos clínicos de irritación o de sensibilización de la piel, ya fuese en la fase de inducción o en la fase de "exposición".

En las condiciones experimentales conservadas, el producto de la invención diluido al 20% carece de potencial alergénico.

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(Tabla pasa a página siguiente)

100

ANEXO 2: TABLA 8

Resultados de la selección de moléculas que estimulan la penetración

Nombre INCI	Factor de estimulación	Viabilidad	Visualización
Polietiienimina de 25 kDa	34,7	74,1	+
Sal cocodimónica de proteína de trigo hidrolizada	4,3	86	-
e hidroxipropilada
Sal cocodimónica de proteína de arroz hidrolizada	18	85	-
e hidroxipropilada
Sal estearil-dimetilamónica de proteína de trigo	4,6	86,4	-
hidrolizada e hidroxipropilada
Sal laurildimónica de proteína de trigo hidrolizada	6,2	87,5	-
e hidroxipropilada
Sal hidroxipropiltrimónica de proteína de trigo hidrolizada	1,3	91,7	-
Sal hidroxipropiltrimónica de miel	15	92	-
Lauroil-aminoácidos de avena sódicos	0,8	76,6	-
Lauroil-aminoácidos de trigo sódicos	1,1	46,1	-
Cocoamina	32,7	79,7	+
Sal laurildimónica de proteína de soja hidrolizada	38,8	87,9	+
e hidroxipropilada
Quitosano	10,3	99	-
Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar	1,1	74,8	-
Hidroxipropilguar	-0,2	91,1	-
Hidroxipropilguar	-0,4	97,5	-
Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar	1,4	71,2	-
Hidroxipropiltrimonio-guar	0,6	53,3	-
Meypro	1	91,6	-
Polyquaternium 7	0,3	80,1	-
Polivirilpirrolidona (1)	1,4	85,1	-
Polivinilcaprolactama	4,1	0	-
Polivinilpirrolidona (2)	0,7	26,6	-
Polivinilpirrolidona (3)	0,7	71	-
Polyquaternium 16 (1)	4,6	83,5	-
Polyquaternium 11 (1)	1,5	49,7	-
Metosulfato de cocotrimonio	0,1	55	-
Polyquaternium 16 (2)	8,4	33,8	-

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ANEXO 2: TABLA 8 (continuación)

Nombre INCI	Factor de estimulación	Viabilidad	Visualización
Polyquaternium 16 (3)	1	38,8	-
Polyquaternium 16 (4)	12,5	67,1	-
Polyquaternium 16 (5)	0,2	85,3	-
Polyquaternium 44	0,8	59,7	-
Cloruro de cocoalconio	5,6	36,3	-
Cloruro de cocotrimonio	-0,2	65,6	-
Tetrahidroxipropil-etilendiamina	1,9	95,3	-
Tosilato de estearamidopropil-cetearildimonio y PG	13,1	93,2	-
Quaternium 70 y PG	-0,2	63,9	-
Quaternium 26	30,9	59,2	-
Quaternium 22	2	98,9	-
Polyquaternium 28	0,6	79,3	-
Polyquaternium 11 (2)	2,9	50,7	-
Polyquaternium 11 (3)	2,9	77,1	-
Polyquaternium 2	4,2	23,6	-
Cloruro de estearalconio	17,6	37,4	-
Propilamina C3	0,9	103,3	-
n-butilamina C4	1,4	106,2	-
Dibutilanna 2 C4	0,7	75,7	-
Hexilamina C6	0,2	82,1	-
Heptilamina C7	3,7	39,4	-
Dioctilamina 2 C8	1	34,7	-
Decilamina C10	39,6	68,5	+
Didecilamina 2 C10	1,2	28,3	-
Undecilamina C11	95,3	84	+
Dodecilamina C12	47,1	57	+
Tridecilamina C13	44,5	62,6	+
Tetradecilamina C14	11,6	54,8	-
Pentadecilamina C15	14,9	73	-
Octadecilamina C18	19,6	61,2	-
Oleilamina C18:1	1,9	87,1	-

Claims

1. Fases lamelares hidratadas o liposomas, caracterizados porque comprenden, al menos en parte de su estructura, una sustancia o una mezcla de sustancias que pueda(n) estimular la penetración intracelular de al menos un principio activo, que está presente o lo transportan dichas fases lamelares hidratadas o liposomas, y que se selecciona(n) del grupo que consiste en:

a) Polietilenimina;

b) una monoamina grasa primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C18, de manera ventajosa una monoamina que comprende una única cadena grasa C10-C18, preferiblemente una monoamina primaria o cuaternaria que comprende una única cadena grasa C10-C18;

c) un polímero catiónico, particularmente un polímero natural catiónico o que opcionalmente se hace catiónico, o un polímero sintético catiónico,

conteniendo dichas fases lamelares hidratadas o liposomas al menos un compuesto fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular, por ejemplo pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, que permite que se visualice esta penetración.

2. Fases lamelares o liposomas según la reivindicación 1, caracterizados porque el polímero natural catiónico opcional se selecciona del grupo que consiste en quitosano, polímero de la miel cuaternizado, proteínas de trigo o proteínas de trigo cuaternizadas, proteínas de arroz o proteínas de arroz cuaternizadas, proteínas de soja o proteínas de soja cuaternizadas, colágeno o colágeno cuaternizado, queratina o queratina cuaternizada, caseína o caseína cuaternizada, celulosa cuaternizada o guar cuaternizado.

3. Fases lamelares o liposomas según la reivindicación 1, caracterizados porque la monoamina primaria se selecciona del grupo que consiste en decilamina, undecilamina, dodecilamina, tridecilamina, tetradecilamina, pentadecilamina, octadecilamina o es una mezcla de aminas primarias tales como mezcla de aminas de la copra que tienen una cadena hidrocarbonada de entre C8 y C18.

4. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque contienen polietilenimina.

5. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al menos un agente que modifica la membrana de los liposomas, por ejemplo, un lípido polar seleccionado del grupo que consiste en un triglicérido, en un fosfolípido polar o en un esfingolípido polar, solos o en una mezcla.

6. Fases lamelares o liposomas según la reivindicación 5, caracterizados porque el fosfolípido polar mencionado anteriormente se selecciona de fosfatidilcolina o lecitina, fosfatidiletanolamina o cefalina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol o cardiolipina, fosfatidilinositol, solos o en una mezcla.

7. Fases lamelares o liposomas según la reivindicación 5 ó 6, caracterizados porque el esfingolípido polar se selecciona de una ceramida, un esfingofosfolípido, un glucoesfingolípido, solos o en una mezcla.

8. Fases lamelares o liposomas -según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al menos una lecitina extraída de una fuente natural seleccionada del grupo que consiste en soja, colza, girasol, altramuz, cacahuete, sésamo, calabacín, aceite de salvado, camelina macrocarpa, caléndula, lino y cáñamo, solos o en una mezcla.

9. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, colesterol o hemisuccinato de colesterilo como agente que da rigidez a las membranas.

10. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al menos un tensioactivo o agente tensioactivo como agente que fluidifica la fase lamelar o las membranas de los liposomas.

11. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque contienen un agente fluorescente o componente fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular, que comprende aproximadamente un 0,01% en peso, de 5-pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, de la composición que contiene dichas fases lamelares o liposomas.

12. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la concentración de sustancia(s) que estimula(n) la penetración intracelular oscila entre el 0,05% y el 25% en peso de una composición que contiene las fases lamelares hidratadas o los liposomas.

13. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la concentración de sustancia(s) que estimula(n) la penetración intracelular oscila entre el 0,5% y el 2,5% en peso de una composición que contiene las fases lamelares hidratadas o los liposomas.

14. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la monoamina grasa mencionada anteriormente tiene una longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C13.

15. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la monoamina grasa mencionada anteriormente es una monoamina primaria cuaternizada que comprende una única cadena grasa que contiene carbono de entre C10 y C18, que oscila entre C10 y C13.

16. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la monoamina primaria se cuaterniza y se selecciona de una disolución de proteína vegetal, preferiblemente de proteína de soja, que está cuaternizadas, de fórmula de tipo R-N(R_{1}R_{2}R_{3}), en la que R simboliza la molécula de proteína vegetal, que está hidrolizada o no, hidroxialquilada, particularmente hidroxipropilada, o no; siendo R_{1} y R_{2} independientemente un grupo hidrocarbonado C1-C6, preferiblemente metilo o etilo y siendo R_{3} un radical alquilo que tiene de 10 a 18 átomos de carbono, y preferible y principalmente 12 átomos de carbono (laurilo).

17. Fases lamelares o liposomas según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la sustancia o principio activo que está presente o que transportan las fases lamelares hidratadas o los liposomas se selecciona del grupo que consiste en un agente antirradical tal como la vitamina E, un flavonoide, un carotenoide, vitamina C o sus derivados; un agente despigmentante tal como catequina, hidroquinona, arbutina, ácido fítico, ácido elágico****, vitamina C o sus derivados; un agente adelgazante tal como al menos una xantina, un agente pigmentante de la piel o el cabello tal como tirosina, triptófano, fenilalanina, un extracto de Coleus o sus derivados.

18. Composición cosmética o dermocosmética, caracterizada porque comprende fases lamelares o liposomas que comprenden al menos una sustancia que estimula la penetración intracelular, siendo dichas fases lamelares o liposomas y dicha sustancia que estimula la penetración intracelular tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en una mezcla con un, excipiente cosméticamente aceptable.

19. Composición cosmética o dermocosmética, caracterizada porque comprende fases lamelares o liposomas que comprenden al menos una sustancia que estimula la penetración intracelular, siendo dichas fases lamelares o liposomas y dicha sustancia que estimula la penetración intracelular tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en una mezcla con un excipiente cosméticamente aceptable.

20. Composición según la reivindicación 19, caracterizada porque la concentración de la sustancia que estimula la penetración intracelular es de entre el 0,05% y el 25% en peso de la composición final, preferiblemente de entre el 0,5% y el 2,5% en peso de la composición final.

21. Composición cosmética o dermocosmética, que tiene un efecto antiarrugas, un efecto antioxidante, un efecto adelgazante, un efecto para palidecer la piel, un efecto de pigmentación de la piel o el cabello, caracterizada porque comprende fases lamelares hidratadas o liposomas que comprenden una sustancia que estimula la penetración intracelular, siendo dicha sustancia y dichas fases lamelares hidratadas o liposomas tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

22. Método de cuidado cosmético, caracterizado porque comprende aplicar una composición cosmética o dermocosmética según se define en una de las reivindicaciones 18, 20 ó 21, sobre las zonas de la piel o el cabello afectadas.

23. Método de cuidado cosmético según la reivindicación 22, caracterizado porque el cuidado cosmético se selecciona del grupo que consiste en un cuidado antiarrugas, un cuidado antioxidante, un cuidado adelgazante, un cuidado para palidecer la piel, un cuidado de pigmentación de la piel o el cabello.

24. Uso de fases lamelares hidratadas o liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, como un agente cosmético, particularmente para la fabricación de una composición cosmética, en particular para una actividad antiarrugas, una actividad antioxidante, una actividad adelgazante, una actividad para palidecer la piel, una actividad de pigmentación de la piel o el cabello.