ES2268946A1 - Fases lamelares hidratadas o liposomas que contienen una monoamina grasa o un polimero cationico que promueve la penetracion intracelular, y una composicion cosmetica o farmaceutica que contiene los mismos, asi como un metodo de seleccion de tal sustancia. - Google Patents
Fases lamelares hidratadas o liposomas que contienen una monoamina grasa o un polimero cationico que promueve la penetracion intracelular, y una composicion cosmetica o farmaceutica que contiene los mismos, asi como un metodo de seleccion de tal sustancia. Download PDFInfo
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Abstract
La invención se refiere a fases lamelares hidratadas o liposomas novedosos que contienen polietilenimina o una sustancia que estimule la penetración intracelular seleccionada del grupo que consiste en: i) una monoamina grasa de longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C18; ii) un polímero catiónico, opcionalmente al menos un compuesto fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular, que permite que se visualice esta penetración. Estos liposomas son muy útiles en cosmética o en farmacia para estimular la penetración intracelular de una sustancia o principio activo.
Description
Fases lamelares hidratadas o liposomas que
contienen una monoamina grasa o un polímero catiónico que promueve
la penetración intracelular, y una composición cosmética o
farmacéutica que contiene los mismos, así como un método de
selección de tal sustancia.
La invención se refiere esencialmente a fases
lamelares hidratadas o liposomas que contienen una sustancia que
promueve la penetración intracelular de una sustancia o principio
activo que transporta dicha fase lamelar hidratada o los liposomas.
Más específicamente, la invención se refiere a fases lamelares
hidratadas o liposomas que comprenden, al menos en parte de su
estructura, una sustancia o una mezcla de sustancias que pueda
estimular la penetración intracelular de al menos un principio
activo, que está presente o que transporta dicha fase lamelar
hidratada o liposoma, seleccionada del grupo que consiste en
polietilenimina o en una monoamina grasa de longitud de la cadena
que contiene carbono de entre C10 y C18, definidas en la presente
descripción y en las reivindicaciones, o en un polímero catiónico
también definido en la presente descripción y en las
reivindicaciones, que contiene opcionalmente un compuesto
fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la
penetración intracelular, por ejemplo
pentafluorobenzoilamino-fluorescena, que permite que
se visualice esta penetración, particularmente en el contexto de
un método de selección de una sustancia que sea potencialmente
activa para promover la penetración intracelular.
La invención también se refiere a composiciones
cosméticas o dermocosméticas, o composiciones farmacéuticas o
dermofarmacéuticas que contienen tales fases lamelares hidratadas o
liposomas.
La invención también se refiere a un método de
cuidado cosmético que comprende la aplicación de una composición
cosmética o dermocosmética según la invención sobre las zonas de la
piel o el cabello afectadas. La invención también se refiere al uso
de fases lamelares hidratadas o liposomas como agentes cosméticos,
particularmente para la fabricación de una composición cosmética,
en particular para una actividad antiarrugas, una actividad
antioxidante, una actividad adelgazante, una actividad para
palidecer la piel, una actividad de pigmentación de la piel o el
cabello, según la naturaleza de la sustancia o principio activo que
esté presente o transporte las fases lamelares hidratadas o
liposomas.
La invención también se refiere a un método de
selección para detectar sustancias que sean potencialmente activas
para promover la penetración intracelular.
Recientemente, se han descrito liposomas
catiónicos, denominados CATESOMES^{MR} en el documento
US-A-6.071.535 (Hayward), que son
muy sensibles tanto al pH como a la fuerza iónica del medio
circundante y que están constituidos por sales de acilo graso de
amonio y alquilo graso de diamina de tipo
N_{n},N_{n}-dimetil-1,n-diaminoalquilo,
designándose la diamina como DDA, teniendo la parte alquílica un
número de átomos de carbono n de entre 2 y 8 (véase la columna 5,
líneas 37 a 39), proporcionándose la parte acilada grasa mediante
un ácido graso que tiene de 10 a 30 átomos de carbono, con el fin
de formar una sustancia designada como ADDA (columna 5, líneas 41
a 48).
Tales sustancias de ADDA se dice que están
disponibles comercialmente bajo el nombre comercial de CATEMOL de
la compañía Phoenix Chemical, Somerville, Nueva Jersey, EE.UU.,
referencia CATEMOL 220 y 260.
Los CATESOMES se forman combinando un ácido
graso que tenga de 10 a 28 átomos de carbono, por ejemplo, ácido
behénico, con el fin de formar sales denominadas sales
A-ADDA, preparándose la mezcla en una proporción
equimolar y a un pH de entre 6 y 10, con el fin de formar una sal
entre el grupo de amina cuaternaria de la sustancia de ADDA y el
grupo carboxilo del ácido graso {véase de la columna 5, linea 66 a
la columna 6, línea 4).
Este documento de Hayward también cita el
documento US-A-4.721.612, que se
refiere a liposomas convencionales, cuyas bicapas comprenden una
forma de sal de un esterol y un ácido orgánico, tal como la forma
de tris-sal de un hemisuccinato de esterol (columna
5, líneas 13 a 18).
Un objetivo principal de la presente invención
es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico
novedoso que consiste en proporcionar fases lamelares hidratadas o
liposomas novedosos que permitan un aumento de la penetración
intracelular de una sustancia o principio activo, de manera
ventajosa en las células de la piel o el cabello, mientras que al
mismo tiempo limitan la citotoxicidad o la inducción de la muerte
celular de dichas células.
Otro objetivo principal de la presente invención
es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico de
proporcionar fases lamelares hidratadas o liposomas novedosos que
no sólo promuevan la penetración intracelular de una sustancia o
principio activo, de manera ventajosa en células de la piel o del
cabello, sino que permita una velocidad de encapsulación
relativamente alta de dicha sustancia o principio activo que se va
a obtener en dichas fases lamelares hidratadas o los liposomas.
Otro objetivo principal de la presente invención
es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico
novedoso que consiste en proporcionar composiciones cosméticas o
dermocosméticas, farmacéuticas o dermofarmacéuticas, novedosas que
contienen fases lamelares hidratadas o liposomas que poseen una
excelente penetración intracelular de una sustancia o principio
activo, de manera ventajosa en células de la piel o del cabello,
mientras que al mismo tiempo limitan la citotoxicidad o la inducción
de la muerte celular (apoptosis) de dichas células.
Otro objetivo principal de la presente invención
es solucionar, de una manera inesperada, el problema técnico
novedoso que consiste en proporcionar un método novedoso de
selección de una sustancia que sea potencialmente activa para
mejorar la penetración intracelular de una sustancia o principio
activo, de manera ventajosa en células de la piel o del cabello y
preferiblemente también para evaluar la citotoxicidad o la
inducción de apoptosis de dichas células.
La totalidad de estos problemas técnicos se
soluciona por primera vez de manera simultánea, de una manera
segura y fiable, que puede utilizarse a escala industrial y
farmacéutica o cosmética.
Por tanto, según un primer aspecto, la presente
invención proporciona fases lamelares hidratadas o liposomas,
caracterizados porque comprenden, al menos en parte, en su
estructura una sustancia o una mezcla de sustancias que
puede(n) estimular la penetración intracelular de al menos un
principio activo que está presente o que transportan dichas fases
lamelares hidratadas o liposomas y que se selecciona(n) del
grupo que consiste en:
- a)
- polietilenimina;
- b)
- una monoamina grasa primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C18, de manera ventajosa una monoamina que comprende una cadena grasa C10-C18, preferiblemente una monoamina primaria o cuaternaria que comprende una única cadena grasa C10-C18;
- c)
- un polímero catiónico, particularmente un polímero natural catiónico o que opcionalmente se ha hecho catiónico o un polímero sintético catiónico,
conteniendo opcionalmente dichas fases lamelares
o liposomas al menos un compuesto fluorescente que es esencialmente
inerte con respecto a la penetración intracelular, por ejemplo
pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, que permite
que se visualice esta penetración.
Según una realización particular, dichas fases
lamelares o liposomas se caracterizan porque el polímero natural
opcionalmente catiónico se selecciona del grupo que consiste en
quitosano, polímero de la miel cuaternizado; proteínas vegetales,
particularmente proteínas de trigo o proteínas de trigo
cuaternizadas, proteínas de arroz o proteínas de arroz
cuaternizadas, proteínas de soja o proteínas de soja cuaternizadas;
colageno o colageno cuaternizado, queratina o queratina
cuaternizada, caseína o caseína cuaternizada, celulosa o celulosa
cuaternizada, guar o guar cuaternizado. Estos polímeros
cuaternizados son generalmente productos comerciales y la
cuaternización se obtiene generalmente mediante el injerto de
aminas terciarias en el grupo químico del polímero inicial.
Según otra realización ventajosa, dichas fases
lamelares o liposomas se caracterizan porque la monoamina primaria
se selecciona del grupo que consiste en decilamina, undecilamina,
dodecilamina, tridecilamina, tetradecilamina, pentadecilamina,
octadecilamina o es una mezcla de aminas primarias tal como las
mezclas de aminas de la copra que tienen una cadena hidrocarbonada
de entre C8 y C18.
Según una realización particular, las fases
lamelares o liposomas contienen polietilenimina.
Según otra realización particular, las fases
lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al menos
un agente que modifica la membrana de los liposomas, por ejemplo
un lípido polar seleccionado del grupo que consiste en un
triglicérido, en un fosfolípido polar o en un esfingolípido polar,
solos o en una mezcla.
Según otra realización particular, el
fosfolípido polar mencionado anteriormente se selecciona de
fosfatidilcolina o lecitina, fosfatidiletanolamina o cefalina,
fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol o
cardiolipina, fosfatidilinositol, solos o en una mezcla.
De manera ventajosa, el fosfolípido polar se
selecciona de una ceramida, un esfingofosfolípido, un
glucoesfingolípido solos o en una mezcla.
Según otra variante, las fases lamelares o
liposomas comprenden al menos un lípido polar o un esfingolípido
polar, particularmente en la forma de una sal de un ácido orgánico
de un esterol tal como la tris-sal de un
hemisuccinato de esterol.
Según otra realización ventajosa de la
invención, las fases lamelares o liposomas comprenden al menos una
lecitina, en la fase lipídica, extraída de una fuente natural
seleccionada del grupo que consiste en soja, colza, girasol,
altramuz, cacahuete, sésamo, calabacín, aceite de salvado, camelina
macrocarpa, caléndula, lino, cáñamo, solos o en una
mezcla.
mezcla.
\newpage
Según otra variante, las fases lamelares o los
liposomas también pueden comprender una fase lipídica que contiene
colesterol o un derivado del colesterol, tal como hemisuccinato de
colesterol, como agente que da rigidez a las membranas.
Según otra realización ventajosa de la
invención, las fases lamelares o los liposomas pueden comprender,
en la fase lipídica, al menos un agente tensioactivo o
tensioactivo, como agente que fluidifica la fase lamelar o las
membranas de los liposomas.
Según otra realización particular de la
invención, las fases lamelares o liposomas contienen un agente
fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la
penetración intracelular, particularmente la penetración
intracelular de la piel o del cabello, del cual un agente preferido
actualmente de tal agente fluorescente comprende o está
constituido por
5-pentafluorobenzoil-aminofluoresceína,
particularmente en una proporción de aproximadamente el 0,01% en
peso de la composición que contiene dicha fase lamelar o
liposomas.
Según una realización ventajosa de la invención,
la concentración de la(s) sustancia(s) que
estimula(n) la penetración intracelular es de entre el 0,05%
y el 25% en peso de la composición que contiene las fases lamelares
hidratadas o los liposomas, preferiblemente de entre el 0,5% y el
2,5% en peso de dicha composición.
Según todavía otra realización ventajosa de la
invención, la monoamina grasa mencionada anteriormente tiene una
longitud de la cadena que contiene carbono de entre C10 y C13. De
manera ventajosa, la monoamina grasa mencionada anteriormente es
una monoamina primaria cuaternizada que comprende una única cadena
grasa que contiene carbono de entre C10 y C18, preferiblemente de
entre C10 y C13.
Según todavía otra realización ventajosa de la
invención, la molécula cuaternizada que promueve la penetración
intracelular de los principios activos se selecciona de una
disolución de proteínas vegetales cuaternizadas, preferiblemente de
proteínas de soja, que están cuaternizadas, de fórmula de tipo
R-N(R_{1}R_{2}R_{3}), en la que R
simboliza la molécula de proteína vegetal, que está hidrolizada o
no, hidroxialquilada, particularmente hidroxipropilada, o no;
siendo R_{1} y R_{2} independientemente un grupo hidrocarbonado
C1-C6, preferiblemente metilo o etilo y siendo
R_{3} un radical alquilo que tiene de 10 a 18 átomos de carbono,
y preferible y principalmente 12 átomos de carbono (laurilo).
Según otra realización de la invención, la
sustancia o principio activo que está presente o que transportan
las fases lamelares o los liposomas se selecciona del grupo que
consiste en un agente antirradicales tal como la vitamina E, un
flavonoide, un carotenoide, vitamina C o sus derivados; un agente
despigmentante tal como catequina, hidroquinona, arbutina, ácido
fítico, ácido elágico, vitamina C o sus derivados; un agente
adelgazante tal como al menos una xantina, un agente pigmentante de
la piel o el cabello tal como tirosina, triptófano, fenilalanina,
un extracto de Coleus o sus derivados.
Según un segundo aspecto, la presente invención
también se refiere a composiciones cosméticas o dermocosméticas;
composiciones farmacéuticas o dermofarmacéuticas, que comprenden
tales fases lamelares hidratadas o liposomas, que comprenden al
menos una sustancia que estimula la penetración intracelular,
opcionalmente en un excipiente, cosmética, dermocosmética,
farmacéutica o dermofarmacéuticamente aceptable.
Tales excipientes son bien conocidos por los
expertos en la técnica y algunos se citan en los dos documentos de
la técnica anterior indicados en la descripción de la técnica
anterior.
Otros excipientes resultan de los ejemplos de
composiciones cosméticas, dermocosméticas, farmacéuticas o
dermofarmac6uticas de la siguiente descripción, que se facilitan
simplemente como una ilustración y que no limitan de ninguna manera
el alcance de la invención.
Según un tercer aspecto, la invención también se
refiere a un método de cuidado cosmético que comprende aplicar
tópicamente, sobre la piel o el cabello, una composición que
comprende fases lamelares hidratadas o liposomas tal como se
describieron anteriormente, o que resultan de la siguiente
descripción, que se hace en relación con los ejemplos que
constituyen una parte integral de la invención.
Según un cuarto aspecto, la presente invención
también cubre un método de tratamiento terapéutico, caracterizado
porque comprende aplicar tópicamente, sobre la piel o el cabello,
una composición que comprende fases lamelares hidratadas o
liposomas tal como se describieron anteriormente, o que resultan de
los ejemplos que constituyen una parte integral de la invención, en
una cantidad que es suficiente para realizar el tratamiento
terapéutico buscado. En general, las fases lamelares hidratadas o
los liposomas comprenden al menos un principio activo que está
presente o que transportan dichas fases lamelares hidratadas o los
liposomas, que tienen una actividad que está relacionada con el
tratamiento terapéutico buscado.
En el contexto del cuidado cosmético, la
presente invención proporciona la realización de un cuidado
cosmético seleccionado del grupo que consiste en un cuidado
antiarrugas, un cuidado antioxidante, un cuidado adelgazante, un
cuidado para palidecer la piel, un cuidado de pigmentación de la
piel o el cabello.
En el contexto de un tratamiento terapéutico, la
invención proporciona la realización de un tratamiento terapéutico
apropiado de la piel o del cabello, como una función de la
patología que se va a tratar.
La invención también se refiere al uso de fases
lamelares hidratadas o liposomas como agentes cosméticos,
particularmente para la fabricación de una composición cosmética,
en particular para una actividad antiarrugas, una actividad
antioxidante, una actividad adelgazante, una actividad para
palidecer la piel, una actividad de pigmentación de la piel o el
cabello, o para la fabricación de una composición farmacéutica, en
cada uno de los casos, preferiblemente a través de la vía
tópica.
Según un quinto aspecto, la presente invención
también se refiere a un método de selección de al menos una
sustancia que pueda estimular potencialmente la penetración
intracelular de una sustancia o principio activo que transportan
las fases lamelares hidratadas o los liposomas, caracterizado
porque comprende:
a) preparar una mezcla hidrolipídica que pueda
formar dichas fases lamelares hidratadas o dichos liposomas;
b) incorporar, antes del proceso de dispersión
en la mezcla hidrolipídica, un compuesto fluorescente, que es
preferible y esencialmente inerte con respecto a la penetración
intracelular;
c) opcionalmente incorporar, antes o durante el
proceso de dispersión en la mezcla hidrolipídica, una sustancia de
prueba seleccionada de dicha sustancia que es potencialmente
activa, que puede estimular la penetración intracelular y una
sustancia de referencia;
d) preparar dichas fases lamelares hidratadas o
dichos liposomas según cualquier método adecuado de formación de
dichas fases lamelares hidratadas o dichos liposomas a partir de la
mezcla hidrolipídica obtenida o bien en la etapa o bien en la etapa
c) anteriores;
e) detectar al menos la penetración intracelular
del compuesto fluorescente mediante la medición de la
fluorescencia intracelular.
Según otra realización, el resultado de la
penetración intracelular del compuesto fluorescente se compara con
la penetración intracelular obtenida con una sustancia de
referencia, particularmente que comprende polietilenimina.
Según todavía otra realización, se mide la
citotoxicidad y/o la inducción de apoptosis de la sustancia que es
potencialmente activa, particularmente en fibroblastos,
preferiblemente fibloblastos humanos normales, en cultivo.
Según todavía otra realización, el compuesto
fluorescente que es esencialmente inerte con respecto a la
penetración intracelular es un compuesto fluorescente que no
penetra de manera espontánea en dicho fibroblasto en cultivo.
Según todavía otra realización, el compuesto
fluorescente comprende, o es,
pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, que se
utiliza a una concentración del 0,01% en peso de la composición
final que contiene las fases lamelares hidratadas o los liposomas,
que se utiliza para evaluar la penetración intracelular.
Según otra realización ventajosa del método, el
compuesto fluorescente se incorpora en presencia de polietilenimina,
estando el compuesto fluorescente y la polietilenimina en una
concentración no citotóxica.
Según todavía otra realización ventajosa de la
invención, la sustancia que potencialmente puede estimular la
penetración intracelular se selecciona de una monoamina grasa
primaria de longitud de la cadena alquílica de entre C10 y C18,
preferiblemente de entre C10 y C13, o un polímero catiónico,
particularmente un polímero natural que opcionalmente se hace
catiónico, o un polímero sintético catiónico que se incorpora a las
fases lamelares o liposomas, según se definieron anteriormente o en
la siguiente descripción con referencia a los ejemplos, que
constituyen una parte integral de la invención.
La invención se refiere además, según un sexto
aspecto, al uso de fases lamelares hidratadas o liposomas, según se
describieron anteriormente, o que resultan de los ejemplos que
constituyen una parte integral de la invención, como un agente
cosmético para la fabricación de una composición cosmética y
particularmente para una actividad antiarrugas, una actividad
antioxidante, una actividad adelgazante, una actividad para
palidecer la piel, una actividad de pigmentación de la piel o el
cabello.
Dentro del contexto de uno cualquiera de los
aspectos precedentes, pueden añadirse de manera ventajosa
tensioactivos a la mezcla hidrolipídica, de modo que se
fluidifiquen las membranas de los liposomas.
La presente invención ha requerido la selección
de un indicador fluorescente que no penetre de manera espontánea en
los fibroblastos en cultivo, por ejemplo, y que induzca muy poca
citotoxicidad por sí mismo o tras su encapsulación en un liposoma,
se incorpore con un buen rendimiento a los liposomas basados en
lecitina de soja, por ejemplo (aproximadamente el 80%) y sea
estable tras la encapsulación (sin liberación ni cambio de la
fluorescencia) y que no induzca una inestabilidad de los liposomas.
El indicador seleccionado es, de manera ventajosa,
5-pentafluorobenzoilamino-fluoresceina
o PFB-F a una concentración del 0,01%, es decir 185
\muM final.
De manera ventajosa, dichos métodos de
dispersión para la preparación de los liposomas se seleccionan
preferiblemente de cizallamiento, ultrasonidos, extrusión,
hidratación/deshidratación (liofilización),
congelación/descongela-
ción, evaporación en fase inversa.
ción, evaporación en fase inversa.
La presencia de liposoma (estructura lamelar) se
atestigua mediante microscopia electrónica de transmisión. El
tamaño de los liposomas se valúa mediante microscopia electrónica
de transmisión y análisis del tamaño de partícula por láser.
De manera ventajosa, la preparación de los
liposomas se realiza a un pH de entre 4 y 8, preferiblemente a pH
6.
De manera ventajosa, la penetración intracelular
de un principio activo se busca en las células de la piel.
De manera ventajosa, la penetración intracelular
de un principio activo en las células de la piel se dirige
principalmente a fibroblastos, queratinocitos y melanocitos.
Los medios de detección de la penetración
intracelular se seleccionan de los métodos de cuantificación y de
visualización, y son preferiblemente la cuantificaci6n de la
intensidad de fluorescencia mediante espectrofluorometría y
visualización mediante microscopia óptica de epifluorescencia.
De manera ventajosa, se considera que las
moléculas son eficaces si permiten en primer lugar que se obtenga
una estimulación de la penetración de fluorescencia del indicador
fluorescente superior en más del 10% de la del control negativo que
no contiene ninguna molécula catiónica, de manera ventajosa
equivalente o superior a la del control positivo que contiene una
molécula catiónica de referencia, polietilenimina, que se utiliza en
50 \muM. En segundo lugar, las moléculas seleccionadas no deben
inducir preferiblemente fenómenos citotóxicos y/o apoptóticos, o
inducir fenómenos citotóxicos y/o apoptóticos inferiores a los de la
molécula catiónica de referencia (polietilenimina utilizada a 50
\muM).
De manera ventajosa, las moléculas activas
seleccionadas para estimular la penetración intracelular se
seleccionan del grupo que consiste en:
- a)
- una amina primaria a cuaternaria, de longitud variable de la cadena que contiene carbono y, de manera ventajosa, decilamina, undecilamina, dodecilamina, tridecilamina, tetradecilamina, pentadecilamina, octadecilamina, cloruro de bencildimetil(octadecil)amonio (o cloruro de estearalconio), una mezcla de aminas primarias (por ejemplo, aminas de la copra de C8 a C18), Polyquaternium 16;
- b)
- un polímero cuaternizado y preferiblemente quitosano, o de la miel cuaternizado, proteínas vegetales, particularmente proteínas de trigo, proteínas de arroz, proteínas de soja o sus derivados cuaternizados; celulosa o guar cuaternizados.
De manera ventajosa, las concentraciones de los
agentes catiónicos utilizados están entre el 0,05% y el 25%,
preferiblemente entre el 0,5 y el 2,5%, preferiblemente el 1%.
De manera ventajosa, la estimulación de la
penetración intracelular es óptima para cadenas que contienen
carbono de longitud media (de C10 a C13), media para las cadenas de
longitud larga (de C10 a C18) e inferior para cadenas cortas
(inferiores a C10).
De manera ventajosa, la estimulación de la
penetración intracelular es óptima para una amina primaria (por
ejemplo, C10-NH2) en comparación con una amina
secundaria que comprende las dos mismas cadenas que contienen
carbono por ejemplo (C10-NH-C10),
debido al impedimento estérico inducido.
De manera ventajosa, ciertos polímeros
cuaternizados permiten que se obtenga un mejor factor de
estimulación de la penetración intracelular por la misma naturaleza
del polímero seleccionado, por ejemplo, la sal laurildimónica de la
proteína de trigo hidrolizada e hidroxipropilada es aproximadamente
6 veces menos eficaz que la sal laurildimónica de la proteína de
soja hidrolizada e hidroxipropilada.
De manera ventajosa, las moléculas catiónicas
seleccionadas son menos citotóxicas y/o inducen menos apoptosis que
la molécula de referencia utilizada, polietilenimina, utilizada a 50
\muM.
De manera ventajosa, la cuantificación de la
citotoxicidad se realiza con una prueba de viabilidad celular que
evalúa la actividad fosfatasa alcalina de la célula, y una
determinación de la interleucina-1 alfa. La
apoptosis se evalúa mediante la cuantificación de la
caspasa-1.
De manera ventajosa, los liposomas preparados
según el método innovador descrito anteriormente, se utilizan con
el fin de inducir un aumento de la penetración intracelular de los
principios activos cosméticos, dermocosméticos o farmacéuticos, que
se utilizan en sustitución del indicador fluorescente.
Otros objetivos, características y ventajas de
la invención aparecerán claramente para los expertos en la técnica
con la lectura de la descripción explicativa que hace referencia a
los siguientes ejemplos.
Los ejemplos constituyen una parte integral de
la presente invención y cualquier característica que parezca
novedosa con respecto a cualquier estado anterior de la técnica
procedente de la descripción tomada en su totalidad, incluyendo los
ejemplos, constituye una parte integral de la invención en su
función y en su generalidad.
Por tanto, cada ejemplo es de alcance
general.
Además, en los ejemplos, todos los porcentajes
se facilitan en peso, a menos que se indique lo contrario, la
temperatura se expresa en grados Celsius, a menos que se indique lo
contrario, y la presión es la presión atmosférica, a menos que se
indique lo contrario.
Las figuras 1 a 4 adjuntas muestran la
visualización de la penetración intracelular de dos indicadores
preseleccionados según la invención, PFB-F y TRITC,
respectivamente:
- La figura 1 representa fibroblastos que se han
incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de
PFB-F con una ampliación del objetivo multiplicado
por 10.
- La figura 2 representa fibroblastos que se han
incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de
PFE-F con una ampliación del objetivo multiplicado
por 40.
- La figura 3 representa fibroblastos que se han
incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de
TRITC con una ampliación del objetivo multiplicado por 100.
- La figura 4 representa fibroblastos que se han
incubado durante 24 horas con liposomas que tienen un 0,01% de
TRITC y un 3% de PEI, con una ampliación del objetivo multiplicado
por 100.
Los indicadores fluorescentes no sólo tienen la
ventaja de ser seguros con respecto a la radiactividad por ejemplo,
sino que son además muy sencillos de utilizar cuando es cuestión
de hacer una cuantificación o de demostrar un aspecto visual de la
penetración intracelular en modelos de cultivo celular.
La selección del indicador requirió la
preparación de liposomas que contienen un 0,01% de diversos
indicadores hidrosolubles o liposolubles, y su purificación, de
modo que se elimine el indicador no incorporado antes de su
aplicación sobre fibroblastos humanos normales. Se prepara un
liposoma control en paralelo con el indicador fluorescente.
Los liposomas se preparan con una concentración
del 20% de lecitina de soja disuelta en tampón de dilución Trizma
(sigma, Francia) 55 mM - NaCl 27 mM ajustado a pH 5. Tras agitación
magnética durante 30 minutos a temperatura ambiente, la mezcla se
homogeneiza muy vigorosamente durante 10 minutos.
Entonces, se diluyen los liposomas en medio DF
[DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco)/Ham F12 glutamax
50/50 en volumen/volumen, complementado con un 10% de suero bovino,
con penicilina a una concentración final de 100 U.I./mililitro, con
gentamicina a una concentración final de 1 microgramo/mililitro,
con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/mililitro] de modo que se obtengan concentraciones de
lecitina de soja variables (0,5 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 7,5 -
10%).
Se añaden 250 \mul de la suspensión liposomal
a cultivos de fibroblastos humanos normales extraídos de plastia
abdominal y se cultivan en una placa de 96 pocillos. Cada
concentración se prueba en 6 pocillos diferentes. Se evalúa la
viabilidad celular mediante una prueba con fosfato de
paranitrofenilo que determina la actividad fosfatasa alcalina
intracelular después de tres aclarados con tampón fosfato pH 7,4.
Se calcula el porcentaje de células vivas con respecto a un control
preparado sin la adición de liposomas en el pocillo de cultivo (n =
6).
Los resultados obtenidos muestran que se obtiene
una viabilidad celular superior al 85% con hasta el 7,5% de
lecitina. Con un 10% de lecitina, la viabilidad pasa a ser inferior
al umbral aceptable de una viabilidad del 75%.
Se selecciona la concentración del 5%, que
permite que se obtenga una viabilidad celular superior al 90%.
Se introducen 0,5 g de lecitina de soja, un
0,01% de un indicador fluorescente que se solubiliza previamente
según las recomendaciones del proveedor, en una placa y se diluye
con 10 ml de tampón Trizma. Tras agitación magnética durante 30
minutos a temperatura ambiente, la mezcla es homogeneiza
vigorosamente durante 10 minutos, obteniendo así una disolución
liposomal en la que los liposomas tienen un tamaño medio que puede
variar entre 100 y 800 nanómetros según las condiciones exactas de
la homogeneización.
El objetivo de la etapa de purificación es
separar la fracción de indicador no encapsulado de la fracción de
indicador que está encapsulado en los liposomas. Para esto, la
disolución liposomal se centrifuga en un tubo cónico durante 10
minutos a 1.790 g a temperatura ambiente. Entonces, se recuperan
los bloques ("plugs") y se solubilizan luego en 10 ml de medio
de cultivo.
El control negativo de liposomas se prepara
según el protocolo descrito anteriormente, sin indicador
fluorescente.
Las muestras se conservan durante 24 horas a 4ºC
en ausencia de luz. Se preparan 26 series de liposomas con
diversos tipos de indicadores fluorescentes, unos sensibles al pH,
otros sensibles al calcio, u otros.
La selección del indicador requirió la
preparación y la purificación de liposomas, según el protocolo
descrito en el ejemplo 1, conteniendo estos liposomas
concentraciones variables de los diversos indicadores hidrosolubles
o liposolubles (tabla 1, anexo 1). Los controles (un indicador
fluorescente libre) se preparan mediante la disolución a la misma
concentración de indicador fluorescente en el tampón de dilución,
de modo que se cuantifique su citotoxicidad y su penetración
espontánea en los fibroblastos.
La comparación con un liposoma que no contiene
ningún indicador fluorescente como control negativo se realiza en
paralelo.
En la práctica, tras la extracción de una
biopsia que se origina a partir de una cirugía plástica abdominal,
los fibroblastos se amplifican en medio DF, es decir: DMEM (medio
de Eagle modificado por Dulbecco)/Ham F12 glutamax 50/50 en
volumen/volumen, complementado con un 10% de suero bovino, con
penicilina a una concentración final de 100 U.I./mililitro, con
gentamicina a una concentración final de 1 microgramo/mililitro,
con anfotericina B a una concentración final de 1
microgramo/mililitro.
En primer lugar, tras la centrifugación, los
liposomas purificados se llevan a medio de cultivo DF, se
homogeneizan en un vórtex y se depositan a una tasa de 1 ml por
pocillo en los fibroblastos cultivados en placas de 24 pocillos
(Costar MW24). Los controles se preparan en las mismas condiciones.
También se prepara un control no tratado.
Los fibroblastos se incuban durante 24 horas a
37ºC en presencia de los liposomas y luego se aclaran 3 veces en
tampón fosfato pH 7,4. En primer lugar, se evalúa la fluorescencia
en seco mediante espectrofluorimetría con un Cytofluor 4000®
(lector de fluorescencia para placas de múltiples pocillos)
(Millipore). En segundo lugar, se observa la fluorescencia
intracelular para las moléculas de interés con un microscopio
inverso de Olympus® (IX70) utilizando el correspondiente filtro de
excitación (objetivo x10, x40 y x100). Finalmente, se evalúa la
citotoxicidad de los indicadores fluorescentes en una placa de 96
pocillos mediante incubación durante 24 horas tal como se describe
en el ejemplo 1.
Los resultados obtenidos muestran que de las 25
moléculas probadas, sólo la
pentafluorobenzoilamino-fluoresceína,
PFB-F (P12925 Molecular Probes) y el isotiocianato
de tetrametil-rodamina TRITC (T-490
Molecular Probes) dan resultados positivos interesantes tras su
incorporación en un liposoma, la aplicación en los fibroblastos
durante 24 horas y la cuantificación de la penetración del
contenido liposomal.
Las figura 1 a 4 adjuntas son fotografías que
visualizan la penetración intracelular de los dos indicadores
preseleccionados, PFB-F y TRITC a la concentración
del 0,01% en liposomas, tras su incubación con los fibroblastos
durante 24 horas.
Citotoxicidad (% del | Penetración de | Penetración (fluorescencia | |
control no tratado) | la sonda libre | tras lavado) | |
PFB-F | 110,7% | 8 (aumenta 45) | 65 (aumenta 45) |
(485-530) | |||
TRITC | 74,8 | 295 (aumenta 50) | 1.119 (aumenta 50) |
(530-620) |
Sin embargo, aunque el TRITC da un marcado más
intenso (tabla 1 y figuras 1 a 4 adjuntas), no obstante es
ligeramente citotóxico, penetra ligeramente cuando se añade libre
al medio de cultivo. Así, PFB-F parece ser un
indicador mejor.
Se analiza la penetración intracelular de
liposomas que contienen un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de
PFB-F o TRITC en presencia o no de un 0,5% de
polietilenimina (PEI) de 25 kDa, que se prepararon según el
protocolo descrito en el ejemplo 1, tras la incubación durante 24
horas sobre fibroblastos humanos cultivados en una placa de 24
pocillos, tal como se describe en el ejemplo 2.
Los resultados obtenidos muestran que la adición
de PEI estimula la penetración de los liposomas con
PFB-F 13,7 veces, mientras que la adición de PEI
disminuye la penetración de los liposomas con TRITC 16 veces
(véanse las fotografías de las figuras 1 a 4 adjuntas).
Por tanto, el indicador retenido es
PFB-F o
pentafluorobenzoilamino-fluoresceina al 0,01% en el
liposoma.
Se analiza la estabilidad de los liposomas
mediante el estudio de la liberación del indicador fluorescente en
el medio de cultivo DF mediante espectrofluorimetría; este estudio
se realiza como una función del pH, de la fuerza iónica y de la
presencia de detergente.
En la práctica, se preparan liposomas que
contienen un 5% de lecitina de soja, un 0,01% de
PFB-F y 50 \muM de PEI de 25 kDa. Las
disoluciones liposomales se ajustan hasta pH 6 - 7- 8 - 9; se
ajusta la concentración de cloruro de sodio (NaCl) hasta 50 - 100 -
150 - 200 mM y se ajusta la concentración de dodecilsulfato de
sodio (SDS) o Triton X-100 hasta 0,1 - 0,5 - 1 - 3%.
Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 3.
Moléculas | Concentraciones | Liberación: | Liberación: |
media | desviación | ||
estándar | |||
Triton X-100 | 3% | 44027 | 177 |
1% | 45800 | 2888 | |
0,5% | 40834 | 39 | |
0,1% | 19829 | 103 | |
SDS | 3% | 62481 | 180 |
1% | 71809 | 1558 | |
0,5% | 76676 | 200 | |
0,1% | 22990 | 108 | |
NaCl | 200 mM | 68527 | 2040 |
150 mM | 7622 | 36 | |
100 mM | 6314 | 113 | |
50 mM | 5680 | 62 | |
pH | 9 | 25265 | 411 |
8 | 18816 | 226 | |
7 | 8781 | 70 | |
6 | 7640 | 55 |
Los resultados parecen indicar que los liposomas
que contienen 50 \muM de PEI de 25 kDa empiezan a
desestabilizarse desde NaCl 200 mM, 0,5% de Triton
X-100 o SDS y por encima de pH 7.
Se preparan liposomas según el método descrito
en el ejemplo 5 con concentraciones crecientes de PEI de 25 kDa
desde 0 \muM hasta 100 \muM. Tras la centrifugación a 1.790 g
durante 10 minutos, se cuantifican los sobrenadantes mediante
espectrofluorimetría. Los rendimientos de encapsulación se calculan
con respecto a la concentración inicial. Los resultados se
facilitan en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Concentración de PEI (\muM) | 0 | 1 | 10 | 50 | 100 |
Rendimiento (%) | 89,0 | 92,3 | 91,0 | 87,5 | 86,3 |
Se indica que el rendimiento de encapsulación no
está afectado por el aumento de la concentración de PEI.
Se preparan liposomas según el protocolo
descrito en el ejemplo 1 con concentraciones variables de
polietilenimina (PEI de 25 kDa, neutralizado con ácido clorhídrico
6 N), es decir, 0 - 5 - 10 - 50 \muM y un 0,01% de
PFB-F.
La cuantificación se lleva a cabo mediante
espectrofluorimetría tras incubación sobre fibroblastos cultivados
en una monocapa en una placa de 24 pocillos durante 2 - 4 - 6 - 24
y 48 horas, tras 3 lavados en tampón fosfato pH 7,4, frente a un
blanco de fibroblastos no tratados y tras normalización frente a
PFB-F libre a la misma concentración. Los
resultados se facilitan en la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Concentración | 0 | 5 \muM | 10 \muM | 50 \muM | ||||
de PEI | ||||||||
Tiempo | Media | Desv. | Media | Desv. | Media | Desv. | Media | Desv. |
Est. | Est. | Est. | Est. | |||||
2 h | 6 | 0 | 49 | 4 | 67 | 7 | 116 | 6 |
4 h | 7 | 3 | 63 | 5 | 89 | 9 | 159 | 10 |
6 h | 6 | 0 | 65 | 10 | 94 | 13 | 203 | 12 |
24 h | 9 | 3 | 120 | 5 | 129 | 3 | 291 | 17 |
48 h | 6 | 1 | 160 | 18 | 171 | 13 | 306 | 6 |
Los mejores resultados se obtienen para una
concentración de 50 \muM de PEI y un tiempo mínimo de incubación
sobre los fibroblastos de 24 horas. Estas condiciones se mantendrán
para la selección de las moléculas que estimulan la penetración
intracelular. Los resultados son estadísticamente significativos en
el control de sonda libre (p < 0,05) para todos los tiempos
desde la concentración de 5 \muM.
La experimentación se realiza según el ejemplo 6
para concentraciones de PEI de 0 a 100 \muM. La cuantificación de
la fluorescencia se realiza según el ejemplo 6. La estimulación de
la penetración intracelular se expresa como un factor de
estimulación con respecto al liposoma sin PEI.
La viabilidad celular se lleva a cabo en una
placa de 96 pocillos (250 \mul de disolución liposomal por
pocillo) mediante una prueba que evalúa la actividad fosfatasa
alcalina en marañas de células (prueba con fosfato de
paranitrofenilo, n = 6). Los resultados de las viabilidades
celulares se expresan como un porcentaje de células vivas con
respecto a un control de liposoma fluorescente libre de PEI. La
determinación de IL1 alfa (kit Quantikine R&D System) se
realiza tomando muestras del medio de cultivo tras 24 horas de
incubación en paralelo a una determinación de las proteínas totales
(Bradford, Sigma). Los resultados se facilitan en las tablas 6 y
7.
\vskip1.000000\baselineskip
Tiempo | 0 | 5 \muM | 10 \muM | 50 \muM | Viabilidad PEI 50 |
2 h | 0,7 | 5,4 | 7,4 | 12,9 | 93,8% |
4 h | 0,8 | 7,0 | 9,9 | 17,7 | 92,4% |
6 h | 0,7 | 7,2 | 10,4 | 22,6 | 83,9% |
24 h | 1,0 | 13,3 | 14,3 | 32,3 | 72,6% |
48 h | 0,7 | 17,8 | 19,0 | 34,0 | 48,4% |
\vskip1.000000\baselineskip
PEI de 25 kDa | 0 | 10 \muM | 50 \muM | 100 \muM |
Proteínas totales en \mug/ml | 132,8 | 136,2 | 119,5 | 79,2 |
IL1 en pg/ml | 9,2 | 12,7 | 13,1 | 14,4 |
IL1 en pg/ml de proteínas | 69,3 | 93,2 | 109,6 | 181,8 |
Factor de estimulación | 1 | 1,3 | 1,6 | 2,6 |
Los resultados muestran que es posible aumentar
hasta 34 veces el factor de penetración del indicador fluorescente
en presencia de PEI en este experimento. Sin embargo, se observa
que a la concentración de 50 \muM de PEI de 25 kDa, a partir de
24 horas, se observa un fenómeno significativo de citotoxicidad, a
las 48 horas, más de la mitad de las células están muertas. Con
respecto a la síntesis de IL1 alfa a la concentración de 50 \muM,
la estimulación es de 1,6 veces y a 100 \muM es de 2,6 veces. Por
tanto, esta molécula genera una tensión de naturaleza inflamatoria
significativa.
Se preparan liposomas con un 5% de lecitina de
soja, un 0,01% de PFB-F y 1 - 0,1 - 0,01% de la
molécula que se va a probar, que se neutraliza hasta pH 7 con ácido
clorhídrico si es necesario, en tampón de dilución Trizma, tal como
se describe en el ejemplo 5.
En primer lugar, se probaron 55 moléculas por
triplicado, en comparación con PEI 50 \muM de 25 kDa. La
penetración intracelular se cuantifica tras 24 horas de incubación
sobre fibroblastos humanos normales cultivados en placas de 24
pocillos, tal como se describe en el ejemplo 2. Se estima la
viabilidad celular en una placa de 96 pocillos con 200 \mul de
suspensión liposomal. Los resultados obtenidos para la
concentración del 1% se facilitan en la tabla 8 (Anexo 2). Una vez
llevada a cabo la selección, se seleccionaron 15 moléculas puesto
que pueden estimular la penetración intracelular del indicador
fluorescente en más del 10%. Las viabilidades celulares son
variadas (desde el 37 hasta el 99%) a una concentración del 1%. La
visualización del indicador fluorescente la penetración para las
moléculas que estimulan la penetración en más del 32%. Estas
moléculas se conservan con prioridad.
Se llevaron a cabo la preparación de los
liposomas con monoaminas grasas primarias de longitud de la cadena
alquílica de entre 3 y 18 carbonos y la cuantificación de la
penetración intracelular del marcador fluorescente tal como se
describen en el ejemplo anterior. Los resultados se facilitan en la
tabla 9.
Número de carbonos de monoamina primaria | Factor de estimulación |
con una única cadena de alquilo graso | |
Control de PEI de 25 kDa | 34,7 |
C3 | 0,9 |
C4 | 1,4 |
C6 | 0,2 |
C7 | 3,7 |
C10 | 39,6 |
C11 | 95,3 |
C12 | 47,1 |
C13 | 44,5 |
C14 | 11,6 |
C15 | 14,9 |
C18 | 19,6 |
La incorporación, en las membranas de los
liposomas, de aminas grasas que tienen cadenas alifáticas de
diversos tamaños, muestra claramente efecto de la longitud de las
cadenas que contiene carb6no sobre la actividad estimulante de la
penetración intracelular de PFB-F encapsulado en
liposomas que tienen un 5% de lecitina. Existe una clasificación
aproximada de los ácidos grasos como una función de la longitud de
las cadenas. Se distinguen así las cadenas cortas (menos de 8
carbonos), las cadenas medias (desde 10 hasta 18 carbonos) y las
cadenas largas (más de 18 carbonos). Al transponer esta
clasificación a las aminas grasas probadas dentro del contexto de
este estudio, parece que las cadenas medias son las que confieren a
los liposomas su propiedad de estimulación de la penetración
intracelular a los liposomas.
Con vistas a definir mejor las características
de las moléculas que tienen un efecto estimulante sobre la
penetración intracelular de un indicador fluorescente encapsulado
en liposomas que tienen un 5% de lecitina, se ha observado el
efecto del impedimento estérico sobre la actividad estimulante
potencial de estas moléculas. Así, se ha estudiado la penetración
intracelular de PFB-F encapsulado en liposomas, en
presencia de monoaminas grasas primarias, por una parte, y con
monoaminas grasas secundarias, por otra parte. La preparación de
los liposomas con las aminas grasas primarias o secundarias y la
cuantificación de la penetración intracelular de los marcadores
fluorescentes se llevan a cabo tal como se describen en el ejemplo
8. Los resultados se facilitan en la tabla 10. Las diaminas no
permiten una mejor penetración intracelular del marcador.
Número de cadenas de alquilo de la | Factor de estimulación |
amina (longitud de cadena) | |
PEI de 25 kDa | 34,7 |
1(C4) | 1,7 |
2(C4) | 0,7 |
1(C10) | 39,6 |
2 (C10) | 1,2 |
Procediendo como se describió en particular en
el ejemplo 9 ó 10, se demostró, sin embargo, que la longitud de la
cadena que contiene carbono no es el único factor que interviene en
la estimulación de la penetración intracelular del contenido
liposomal.
De hecho, al hacer la comparación de las
estructuras químicas facilitadas en la siguiente figura, se muestra
una especificidad del grupo R que interfiere con la cadena que
contiene carbono C_{12}.
R_{y} representa proteína de soja
hidrolizada e
hidroxipropilada.
R_{A} representa proteína de
trigo hidrolizada e
hidroxipropialada.
Las moléculas cuaternizadas Y y A son productos
que son muy comunes para el experto en la técnica. El impedimento
estérico de la molécula cuaternizada (moléculas comerciales)
incorporada desempeña un papel en la estimulación de la penetración
intracelular de los liposomas que tienen lecitina.
Las moléculas de las clases siguientes (tabla
11) pueden utilizarse, por ejemplo, al 1% para estimular la
penetración intracelular en grados variables de hasta el +39%.
También pueden utilizarse otros hidrolizados
cuaternizados de moléculas extraídas de almendras, guisantes,
patata o algas.
\newpage
Ejemplos de moléculas | Ejemplos de | |
cuaternizadas disponibles | Nombre químico | posibles |
comercialmente | proveedores | |
Trigo | \begin{minipage}[t]{90mm} Sal cocodimónica, estearil-dimetil-amónica, hidroxipropiltrimónica o laurildimónica de la proteína de trigo hidrolizada \end{minipage} | Croda |
Cloruro de amidopropalconio - germen de trigo | ||
Soja | \begin{minipage}[t]{90mm} Sal laurildimónica de la proteína de soja hidrolizada e hidroxipropilada\end{minipage} | Croda |
\begin{minipage}[t]{90mm} Sal cocodimónica de la proteína de soja hidrolizada e hidroxipropilada, cloruro de hidroxipropiltrimetilamonio de la proteína de soja hidrolizada \end{minipage} | RITA corporation | |
Glucósido de dihidroxipropildimonio de soja | ||
Queratina | Sal hidroxipropiltrimónica de la queratina hidrolizada | RITA corporation |
Caseína | Sal hidroxipropiltrimónica de la caseína hidrolizada | RITA corporation |
Colágeno | Sal hidroxipropiltrimónica del colágeno hidrolizado, | RITA corporation |
Sal laurildimónica del colágeno hidrolizado e hidroxipropilado | Cognis | |
Seda | Sal hidroxipropiltrimónica de la seda hidrolizada | RITA corporation |
Arroz | \begin{minipage}[t]{90mm} Sal cocodimónica de la proteína de arroz hidrolizada e hidroxipropilada\end{minipage} | Sochibo |
Guar | Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar, | Meyhall |
Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar, | Rhodia | |
sal hidroxipropiltrimónica de guar | ||
Miel | Sal hidroxipropiltrimónica de miel | ARCH |
Celulosa | Polyquaternium 4 y 10 | Quimasso |
Polyquaternium 39 |
La estimulación de la penetración intracelular
del indicador fluorescente se optimiza probando diversas
concentraciones de la molécula de funcionalización.
En la práctica, se forman liposomas con un 5% de
lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y del 0,5 al
2,5% de la disolución de soja cuaternizada en tampón de dilución
Trizma. Se evalúan la penetración intracelular y la citotoxicidad
tal como se describe en el ejemplo 2. Los resultados obtenidos se
facilitan en la tabla 12.
Soja cuaternizada en % | 0,5 | 1 | 1,5 | 2 | 2,5 |
Factor de estimulación | 0,6 | 1,6 | 38,9 | 97,2 | 99,9 |
Viabilidad celular (%) | 92,4 | 97,9 | 87,9 | 75,4 | 77,3 |
Por tanto, puede ajustarse la penetración
intracelular buscada como una función de la concentración de agente
de funcionalización y de la máxima citotoxicidad tolerada.
Se compara la estimulación de la síntesis de
interleucina-1 alfa entre liposomas que se
funcionalizan con PEI 50 \muM y diversas concentraciones en
disolución de soja cuaternizada.
En la práctica, se forman liposomas con un 5% de
lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y del 0,5 al
2,5% de la disolución de soja cuaternizada o 50 \muM de PEI, en
tampón de dilución Trizma. Se evalúa el contenido de IL1 con un kit
(Quantikine R&D System) según se describe en el ejemplo 7. Se
lleva a cabo una prueba con fosfato de paranitrofenilo (PNPP) en
paralelo, con el fin de evaluar el número de células por pocillo.
Los resultados del contenido de IL1-alfa se comparan
con la densidad óptica del PNPP obtenido, Los resultados obtenidos
se facilitan en la
tabla 13.
tabla 13.
Concentración de | PEI | 0,5% de | 1% de | 1,5% de | 2% de |
molécula de | 50 \muM | soja | soja | soja | soja |
funcionalización | |||||
PNPP | 72,3 | 91,8 | 91,6 | 87,5 | 88,4 |
IL1-alfa | 350 | 137,5 | 137,5 | 212,5 | 187,5 |
ILI-alfa/PNPP | 484,1 | 149,8 | 150,1 | 242,9 | 212,1 |
Los resultados obtenidos muestran que la
disolución de soja cuaternizada seleccionada previamente induce una
citotoxicidad y una tensión inflamatoria que está muy limitada
con respecto a la molécula de referencia de PEI.
Se compara la estimulación de la síntesis de
interleucina-1 alfa entre liposomas que se
funcionalizan con PEI 50 \muM y
diversas-concentraciones en la disolución de soja
cuaternizada.
En la práctica, se forman liposomas con un 5% de
lecitina de soja, un 0,01% de PFB-F y del 0,5 al
2,5% de la disolución de soja cuaternizada o 50 \muM de PEI, en
tampón de dilución Trizma. Se evalúa el contenido de
caspasa-1 con un kit (Caspase-1
Colorimetric Assay R&D System, sistema de I+D para ensayo
colorimétrico de caspasa-1). Se lleva a cabo en
paralelo una prueba con fosfato de paranitrofenilo (PNPP) con el
fin de evaluar el número de células por pocillo. Los resultados del
contenido de caspasa-1 se comparan con la densidad
óptica del PNPP obtenido. Los resultados se facilitan en la tabla
14.
Concentración de | PEI 50 | 0,5% de | 1% de | 1,5% de | 2% de |
molécula de | \muM | soja | soja | soja | soja |
funcionalización | |||||
PNPP | 59,8 | 91,8 | 91,6 | 87,5 | 88,5 |
Caspasa-1 | 642,8 | 76 | 87,7 | 78,3 | 117,5 |
Caspasa-1/PNPP | 1074,9 | 82,8 | 95,7 | 89,5 | 132,8 |
Los resultados obtenidos muestran que la
disolución de soja cuaternizada seleccionada anteriormente induce
una citotoxicidad y una tensión apoptótica que está excesivamente
limitada con respecto a la molécula de PEI de referencia.
Se observaron los liposomas preparados con un 2%
de disolución de soja cuaternizada, sin la adición de principio
activo ni de indicador fluorescente, mediante microscopia
electrónica de transmisión. Se realizó una coloración negativa de
los liposomas utilizando sales de metales pesados que se rompen
entre las bicapas de las vesículas multilamelares. La observación
se realiza con un microscopio electrónico de transmisión Phillips
CM120 y una ampliación de 30 a 60.000.
La observación revela la presencia de capas
lipídicas concéntricas que son características de las estructuras
multilamelares. El tamaño medio de los liposomas observados varía
desde 150 hasta 250 nm.
Se preparan liposomas con un 5% de lecitina de
soja, un 0,2% de vitamina E natural y un 2% de disolución de soja
cuaternizada del ejemplo 11 (molécula Y).
En la practica, se añaden 0,4 g de vitamina E
natural a 10 g de lecitina de soja y 10 ml de etanol al 96%. La
disolución se evapora durante una noche con agitación magnética a
temperatura ambiente y en ausencia de luz. Tras la evaporación del
etanol, se añaden 100 ml de agua desionizada. La mezcla se agita
hasta su disolución completa.
Entonces, los liposomas se preparan añadiendo 5
ml de disolución de lecitina - vitamina E, 190 \mul (es decir, el
2%) de disolución de soja cuaternizada y 4,80 ml de tampón de
dilución Trizma 55 mM - NaCl 27 mM ajustado a pH 5 y se mezclan con
agitación magnética en ausencia de luz durante 30 minutos. Después,
se homogeneiza la disolución a velocidad máxima durante 10 minutos,
con el fin de formar los liposomas modificados. Se prepara la misma
disolución sin pasar a la homogeneización y servirá como un control
libre de vitamina E.
Los liposomas basados en vitamina E natural se
preparan en presencia de PEI 10 \muM de 25 kDa, de modo que se
evite la citotoxicidad y también sin agente de
funcionalización.
Se siembran fibroblastos humanos normales en
placas de 24 pocillos y se cultivan hasta confluencia. Tras tres
aclarados con tampón fosfato pH 7,4 con calcio y magnesio (In
vitrogen), se incubaron las diversas disoluciones diluidas a la
mitad (es decir, una concentración de vitamina E final del 0,1%)
con medio de cultivo durante al menos dos horas. Los pocillos se
incubaron con medio de cultivo solo y servirán como control de
sonda a continuación. Tras tres aclarados con tampón fosfato pH 7,4
con calcio y magnesio, de modo que se eliminaran los liposomas y la
vitamina E libre, las marañas de células se incuban en presencia de
dihidro-rodamina 123 (Molecular Probes) a la tasa de
200 \mul/pocillo de una disolución preparada tal como sigue: 150
\mul de una disolución 1 mM disuelta en 15 ml de tampón HBSS
(solución salina equilibrada de Hank). Se lee la placa para
determinar la fluorescencia a 490 - 530 nm y luego se irradia a 0,8
J/cm^{2} con [NB a 912 nm y después se lee de nuevo para
determinar la fluorescencia a las mismas longitudes de onda. Los
resultados se expresan como razones:
A = irradiado/no irradiado (I/NI)
B = (liposoma I/NI)/(control de sonda I/NI)
C = liposomas con vitamina E/libres de vitamina
E
La sonda fluorescente utilizada permite que se
evalúe la presencia de productos intermedios de oxígeno reactivo
intracelulares, puesto que difunde de manera pasiva a través de las
membranas celulares, en las que puede oxidarse entonces hasta
rodamina catiónica. La sonda fluorescente reacciona positivamente,
por ejemplo, con peróxido de hidrógeno y peroxinitritos. Los
resultados obtenidos se facilitan en la tabla 15.
I | NI | A = I/NI | B = liposoma/control | C = liposoma/libre | |
Producto de la invención | 118990 | 58786 | 2,01 | 79,3% | +23% |
Liposoma no funcionalizado | 114907 | 52306 | 2,31 | 91,1% | +11% |
Liposoma con PEI | 105257 | 40148 | 2,82 | 111,4% | -9% |
Estos resultados indican que los liposomas
funcionalizados mediante la proteína de soja cuaternizada permiten
la obtención de más del 20% de efecto protector contra la tensión
por radicales con respecto a los liposomas no funcionalizados,
mientras que los liposomas funcionalizados con la molécula de PEI
de referencia no permiten que se observe un efecto protector, por
un lado, e incluso generan una tensión adicional.
Se prepararon liposomas según el siguiente
protocolo: 5% de lecitina de soja a la que se añade o no un 2% de
solución de soja cuaternizada o PEI 10 \muM. También se
coencapsulan los principios activos: Phytolight® (Coletica, Lyons,
Francia) sin un 0,05% de conservante (cóctel de principios activos
vegetales), un 0,05% de arbutina y catequina 1 mM (Sigma). Las
moléculas se aplicaron libres, en un liposoma con el 5% de lecitina,
en liposomas funcionalizados con PEI 10 \muM o un 2% de soja
cuaternizada, sobre melanocitos humanos normales cultivados en
placas de 24 pocillos y preconfluyentes. Los principios activos que
se encapsulan en los liposomas o no, se incuban durante 66 horas a
37ºC bajo CO2 al 5% en medio MMK2 (Sigma). Tras 3 aclarados con
tampón fosfato con calcio y magnesio (Invitrogen), extracción en
tampón fosfato que contiene un 0,5% de Triton
X-100, se cuantifica la actividad tirosinasa
mediante una determinación en presencia de L-DOPA
(L-3,4-dihidroxifenilalanina) y MBTH
(3-metil-2-benzotiazolinona-hidrazona).
La formación de un compuesto de
MBTH-o-quinona se caracteriza por un
valor de absorbancia a 490 nm cuantificado cinéticamente. La
actividad tirosinasa se expresa mediante la pendiente (velocidad)
de la reacción enzimática. Los resultados se facilitan en la tabla
16.
Libre | Liposoma | Liposoma | Liposoma | |
con PEI | con soja | |||
Arbutina | 0,004 | 0,001 | 0 | 0 |
Phytolight® | 0,01 | 0,008 | 0,003 | 0,0016 |
Catequina | 0,007 | 0,007 | 0 | 0,003 |
Estos resultados muestran que la
funcionalización, como una función de los principios activos
coencapsulados, permite un aumento de la inhibición de la actividad
tirosinasa in vitro con melanocitos humanos normales. La
funcionalización mediante soja cuaternizada es más eficaz que la
obtenida mediante la adición de PEI para el complejo de extractos
vegetales, equivalente para la arbutina y ligeramente inferior para
la catequina. En cada caso, la actividad es de al menos 2,3 veces
mayor que con un liposoma no funcionalizado.
El tamaño de los liposomas puede disminuirse
mediante el uso de un homogeneizador de alta presión (presión de
trabajo superior a 1.000 bares, preferiblemente superior a 2.000
bares, más preferiblemente superior a 3.000 bares). A 3.000 bares,
este instrumento permite que se obtengan liposomas de
aproximadamente 50 nm.
Se analizó el tamaño de los liposomas con la
ayuda de un analizador láser del tamaño de partícula (Beckman
Coulter, N4 plus, Submicron Particle Size Analyser) y mediante
microscopia electrónica de transmisión, tal como se describe en el
ejemplo 15.
La penetración de la molécula fluorescente
(0,01% de PFB-F), libre o incorporada en un
liposoma tal como se describe en el ejemplo 12, que comprende o no
un 2% de la disolución de soja cuaternizada seleccionada en el
ejemplo 11, se cuantificó mediante permeación transcutánea en la
piel humana. Se cuantificó la cinética de difusión mediante
espectrofluorimetría desde 3 hasta 24 horas. Se cuantificó la
liberación tras 24 horas adicionales. También se evaluó al final el
almacenamiento. El número de muestras probadas es de 5 por
condición. Los resultados obtenidos facilitados en la tabla 17
muestran que el uso de los liposomas preparados en presencia de
soja cuaternizada estimula significativamente la difusión, la
liberación y el almacenamiento del indicador fluorescente con
respecto a la forma no vectorizada o la forma vectorizada sin
agente cuaternizado.
Libre | Liposoma | Liposoma | |
cuaternizado | |||
Difusión | 0,57 \pm 0,03 | 1,17 \pm 0,05 | 1,76 \pm 0,13 |
Liberación a 24 h | 0,691 \pm 0,06 | 1,398 \pm 0,07 | 1,77 \pm 0,21 |
Almacenamiento | 0,81 \pm 0,1 | 1,27 \pm 0,17 | 2,61 \pm 0,33 |
La penetración de la molécula de vitamina E
(0,5%), libre o incorporada en un liposoma tal como se describe en
el ejemplo 12, que comprende o no un 2% de la disolución de soja
cuaternizada seleccionada en el ejemplo 11, se cuantificó mediante
permeación transcutánea en la piel humana. Se cuantificó la
cinética de difusión mediante cromatografía líquida de alta
resolución desde 5 hasta 24 horas. Se cuantificó la liberación tras
24 horas adicionales. También se evaluó al final el almacenamiento.
El número de muestras probadas es de 5 por condición. Los
resultados obtenidos también muestran que el uso de los liposomas
preparados en presencia de soja cuaternizada estimula
significativamente la difusión, la liberación y el almacenamiento
de la vitamina E con respecto a la forma no vectorizada o la forma
vectorizada sin agente cuaternizado.
Se llevó a cabo el mismo experimento de
penetración transcutánea con la incorporación o no de material
genético fluorescente (200 mM) en un liposoma tal como se describe
en el ejemplo 12 en presencia de un 2% de disolución de soja. Lo
obtenido por observación mediante microscopia óptica de
epifluorescencia de las secciones transversales de la piel muestra
que el uso de los liposomas preparados en presencia de soja
cuaternizada permite la difusión del material genético a la dermis
profunda.
Secuencia de la sonda fluorescente de elastina
19-20 duplicada:
- Sentido: 5'-(FITC)AGCUGCUAAGGCUGGCGCUTT-3'
- Antisentido: 5'-AGCGCCAGCCUUAGOAGCUTT-3'
Formulación
20a
A | Agua | csp 100 |
Butilenglicol | 2 | |
Glicerina | 3 | |
Dihidroxicetilfosfato de sodio | 2 | |
Isopropil hidroxicetil éter | ||
B | Estearato de glicol SE | 14 |
Triisononanoína (3,5,5-trimetilhexanoato de propano-1,2,3-triilo) | 5 | |
Cocoato de octilo | 6 | |
C | Butilenglicol, | 2 |
Metilparabeno, | ||
etilparabeno, propilparabeno, | ||
pH ajustado a 5,5 | ||
D | Productos de la invención | 0,01 - 10% |
Formulación
20b
A | Agua | csp 100 |
Butilenglicol | 2 | |
Glicerina | 3 | |
Poliacrilamida, isoparafina, | 2,8 | |
Laureth-7 | ||
B | Butilenglicol, | 2 |
metilparabeno, | ||
etilparabeno, propilparabeno; | ||
2 | ||
Fenoxietanol, | ||
metilparabeno, | ||
propilparabeno, butilparabeno | ||
etilparabeno | 0,5 | |
Butilenglicol | ||
D | Productos de la invención | 0,01 - 10% |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación
20c
A | Carbómero | 0,50 |
Propilenglicol | 3 | |
Glicerol | 5 | |
Agua | csp 100 | |
B | Cocoato de octilo | 5 |
Bisabolol | 0,30 | |
Dimeticona | 0,30 | |
C | Hidróxido de sodio | 1,60 |
D | Fenoxietanol, | 0,50 |
metilparabeno, | ||
propilparabeno, butilparabeno | ||
etilparabeno | ||
E | Perfume | 0,30 |
F | Productos de la invención | 0,01 - 10% |
A | Dipolihidroxiestearato de PEG 30 | 3 |
Triglicéridos cápricos | 3 | |
Octanoato de cetearilo | 4 | |
Adipato de dibutilo | 3 | |
Aceite de pepitas de uva | 1,5 | |
Aceite de jojoba | 1,5 | |
Fenoxietanol, | 0,5 | |
metilparabeno, | ||
propilparabeno, butilparabeno, | ||
etilparabeno | ||
B | Glicerina | 3 |
Butilenglicol | 3 | |
Sulfato de magnesio | 0,5 | |
EDTA | 0,05 | |
Agua | csp 100 | |
C | Ciclometicona | 1 |
Dimeticona | 1 | |
D | Perfume | 0,3 |
E | Productos de la invención | 0,01 - 10% |
\vskip1.000000\baselineskip
A | Dipolihidroxiestearato de PEG 30 | 4 |
Triglicéridos cápricos | 7,5 | |
Isohexadecano | 15 | |
Estearil éter de PPG-15 | 7,5 | |
B | Agua | 65,3 |
C | Fenoxietanol, | 0,7 |
metilparabeno, | ||
propilparabeno, butilparabeno | ||
etilparabeno |
A | Emulsión primaria | 60 |
B | Poloxámeru 407 | 2 |
Fenoxietanol, | 0,3 | |
metilparabeno, | ||
propilparabeno, | ||
2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol | ||
Agua | csp 100 | |
C | Carbómero | 15 |
D | Trietanolamina | pH 6,0 - 6,5 |
E | Productos de la invención | 0,01 - 10% |
\vskip1.000000\baselineskip
A | Cera mineral | 17,0 |
Isoestearato de isoestearilo | 31,5 | |
Diperlagonato de propilenglicol | 2,6 | |
Isoestearato de propilenglicol | 1,7 | |
Cera de abeja de PEG 8 | 3,0 | |
Glicéridos hidrogenados de aceite de semilla de palma, | 3,4 | |
glicéridos hidrogenados de palma | ||
Aceite de lanolina | 3,4 | |
Aceite de sésamo | 1,7 | |
Lactato de cetilo | 1,7 | |
Aceite vegetal, alcohol de lanolina | 3,0 | |
B | Aceite de ricino | csp 100 |
Dióxido de titanio | 3,9 | |
\begin{minipage}[t]{100mm} CI 15850: 1 (3-hidroxi-4-[(4-metil-2-sulfonatofenil)azo]-2-naftoato de calcio) \end{minipage} | 0,616 | |
\begin{minipage}[t]{100mm} CI 45410: 1 (ácido 3,4,5,6-tetracloro-2-(1,4,5,8-tetrabromo-6-hidroxi-3-oxoxanten-9-il)benzoico) \end{minipage} | 0,256 | |
\begin{minipage}[t]{100mm} CI 19140: 1 (complejos de 4,5-dihidro-5-oxo-1-(4-sulfofenil)-4-[(4-sulfofenil)azo]-1H-pirazol-3-carboxilato de zirconio) \end{minipage} | 0,048 | |
CI 77491 (trióxido de dihierro) | 2,048 | |
C | Productos de la invención | 0,01 - 5% |
A | Agua | csp 100 |
Carbómero | 0,5 | |
Butilenglicol | 15 | |
Fenoxietanol, metilparabeno, | 0,5 | |
propilparabeno, butilparabeno, | ||
etilparabeno | ||
B | Productos de la invención | 0,01 - 10% |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación
25a
A | Excipientes | En g por comprimido |
Lactosa | 0,359 | |
Sacarosa | 0,240 | |
B | Producto de la invención | 0,001 - 0,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación
25b
A | Excipientes | |
Polietileno de baja densidad | 5,5 | |
Parafina líquida csp | 100 | |
B | Producto de la invención | 0,001 - 0,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
A | Excipientes | |
Solución salina isotónica | 5 ml | |
B | Producto de la invención | 0,001 - 0,1 g |
La fase A y la fase B se envasan en ampollas
separadas y se mezclan antes de su uso.
\newpage
Se llevaron a cabo pruebas toxicológicas con los
compuestos obtenidos según el ejemplo 15 (sin la incorporación de
principio activo), mediante una evaluación ocular y cutánea en el
conejo, mediante el estudio de la ausencia de toxicidad anómala por
la administración oral única en la rata y mediante el estudio del
poder de sensibilización en el cobaya.
Se aplicaron las preparaciones descritas
anteriormente sin dilución a una dosis de 0,5 ml sobre la piel de 3
conejos, según el método recomendado por la OECD (Organización para
la Cooperación y el Desarrollo Económico) en relación con el
estudio del "efecto irritante/corrosivo agudo sobre la
piel".
Los productos se clasifican según los criterios
definidos en la Decisión de 1/2/1982 publicada en el Diario Oficial
de la República Francesa (el "JORF") de 21/02/82.
Los resultados de estas pruebas han permitido
concluir que la preparación que contiene el compuesto obtenido
según el ejemplo 12 no fue irritante para la piel.
Las preparaciones descritas anteriormente se
instilaron puras y en una cantidad a la tasa de 1 ml en el ojo de
tres conejos según el método recomendado por la directiva de la
OECD nº 405 del 24 de febrero de 1987, en relación con el estudio
del "efecto irritante/corrosivo agudo sobre los ojos".
Los resultados de esta prueba permiten concluir
que las preparaciones pueden considerarse como no irritantes para
los ojos.
Se administraron las preparaciones descritas en
una cantidad por vía oral a la dosis de 5 g/kg de peso corporal, a
5, ratas macho y 5 ratas hembra según un protocolo inspirado por la
Directiva de la OECD nº 401 del 24 de febrero de 1987 y adaptada a
productos cosméticos.
Se encontró que las DLO y DL50 son superiores a
5.000 mg/kg. Por tanto, las preparaciones probadas no se clasifican
entre las preparaciones que son peligrosas por ingestión.
Las preparaciones descritas se sometieron a la
prueba de maximización descrita por Magnusson y Klingmann, un
protocolo que está de acuerdo con la linea directiva nº 406 de la
OECD. Las preparaciones se clasifican como no sensibilizantes por
contacto con la piel.
El protocolo está de acuerdo con la línea
directiva de la OECD nº 471 (Directiva 92/69/EEC).
Se llevaron a cabo las pruebas de mutagénesis en
"Salmonella typhimurium" y en "Escherichia
coli" según el método de Ames et al. (Mutation
Research, 1975, 31, 347-364). Se expusieron
cinco cepas al producto de la invención en medio mínimo, con o sin
sistemas exógenos de activación del metabolismo (de modo que se
distingan promutágenos y mutágenos directamente). Tras la
incubación, se contaron las colonias mutadas y se compararon con el
número de colonias mutadas espontáneamente entre los controles.
El producto de la invención no tiene ninguna
actividad mutagénica en el sentido de la Directiva 92/69/EEC.
Evaluación en un panel de voluntarios del
potencial alergénico del producto de la invención. El protocolo
está de acuerdo con el método de Marzulli y Maibach (Contact
Dermatitis, 1976, 2, 1-17) que comprende una
fase de inducción y una prueba de estimulación, esta prueba se
realiza en un panel de 100 voluntarios sanos de sexo femenino y/o
masculino, con edades comprendidas entre 18 y 65 arios y que tienen
cualquier tipo de piel.
Se aplicó un parche oclusivo que contenía el
producto de la invención diluido al 20% sobre la zona escapular de
cada uno de los voluntarios. Los parches se dejaron en contacto
directo con la piel durante 24 horas y se volvieron a aplicar cada
dos días durante 3 semanas para un total de 9 aplicaciones. Tras la
retirada de cada parche, se evaluaron los signos clínicos de
irritación y sensibilización de la piel = Fase de inducción.
Tras un periodo de 2 semanas, se aplicaron otros
parches que contenían el producto de la invención diluido al 20%
sobre la piel de los voluntarios y se dejaron en contacto directo
con le superficie cutánea durante 24 horas. Se evaluaron los signos
clínicos de irritación y sensibilización de la piel 24, 48 y 72
horas después de la retirada del parche = Fase de
"exposición".
Ninguno de los 100 voluntarios participantes en
el estudio presentó signos clínicos de irritación o de
sensibilización de la piel, ya fuese en la fase de inducción o en
la fase de "exposición".
En las condiciones experimentales conservadas,
el producto de la invención diluido al 20% carece de potencial
alergénico.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
ANEXO 2: TABLA
8
Resultados de la selección de
moléculas que estimulan la
penetración
Nombre INCI | Factor de estimulación | Viabilidad | Visualización |
Polietiienimina de 25 kDa | 34,7 | 74,1 | + |
Sal cocodimónica de proteína de trigo hidrolizada | 4,3 | 86 | - |
e hidroxipropilada | |||
Sal cocodimónica de proteína de arroz hidrolizada | 18 | 85 | - |
e hidroxipropilada | |||
Sal estearil-dimetilamónica de proteína de trigo | 4,6 | 86,4 | - |
hidrolizada e hidroxipropilada | |||
Sal laurildimónica de proteína de trigo hidrolizada | 6,2 | 87,5 | - |
e hidroxipropilada | |||
Sal hidroxipropiltrimónica de proteína de trigo hidrolizada | 1,3 | 91,7 | - |
Sal hidroxipropiltrimónica de miel | 15 | 92 | - |
Lauroil-aminoácidos de avena sódicos | 0,8 | 76,6 | - |
Lauroil-aminoácidos de trigo sódicos | 1,1 | 46,1 | - |
Cocoamina | 32,7 | 79,7 | + |
Sal laurildimónica de proteína de soja hidrolizada | 38,8 | 87,9 | + |
e hidroxipropilada | |||
Quitosano | 10,3 | 99 | - |
Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar | 1,1 | 74,8 | - |
Hidroxipropilguar | -0,2 | 91,1 | - |
Hidroxipropilguar | -0,4 | 97,5 | - |
Cloruro de hidroxipropiltrimonio de hidroxipropilguar | 1,4 | 71,2 | - |
Hidroxipropiltrimonio-guar | 0,6 | 53,3 | - |
Meypro | 1 | 91,6 | - |
Polyquaternium 7 | 0,3 | 80,1 | - |
Polivirilpirrolidona (1) | 1,4 | 85,1 | - |
Polivinilcaprolactama | 4,1 | 0 | - |
Polivinilpirrolidona (2) | 0,7 | 26,6 | - |
Polivinilpirrolidona (3) | 0,7 | 71 | - |
Polyquaternium 16 (1) | 4,6 | 83,5 | - |
Polyquaternium 11 (1) | 1,5 | 49,7 | - |
Metosulfato de cocotrimonio | 0,1 | 55 | - |
Polyquaternium 16 (2) | 8,4 | 33,8 | - |
\newpage
ANEXO 2: TABLA 8
(continuación)
Nombre INCI | Factor de estimulación | Viabilidad | Visualización |
Polyquaternium 16 (3) | 1 | 38,8 | - |
Polyquaternium 16 (4) | 12,5 | 67,1 | - |
Polyquaternium 16 (5) | 0,2 | 85,3 | - |
Polyquaternium 44 | 0,8 | 59,7 | - |
Cloruro de cocoalconio | 5,6 | 36,3 | - |
Cloruro de cocotrimonio | -0,2 | 65,6 | - |
Tetrahidroxipropil-etilendiamina | 1,9 | 95,3 | - |
Tosilato de estearamidopropil-cetearildimonio y PG | 13,1 | 93,2 | - |
Quaternium 70 y PG | -0,2 | 63,9 | - |
Quaternium 26 | 30,9 | 59,2 | - |
Quaternium 22 | 2 | 98,9 | - |
Polyquaternium 28 | 0,6 | 79,3 | - |
Polyquaternium 11 (2) | 2,9 | 50,7 | - |
Polyquaternium 11 (3) | 2,9 | 77,1 | - |
Polyquaternium 2 | 4,2 | 23,6 | - |
Cloruro de estearalconio | 17,6 | 37,4 | - |
Propilamina C3 | 0,9 | 103,3 | - |
n-butilamina C4 | 1,4 | 106,2 | - |
Dibutilanna 2 C4 | 0,7 | 75,7 | - |
Hexilamina C6 | 0,2 | 82,1 | - |
Heptilamina C7 | 3,7 | 39,4 | - |
Dioctilamina 2 C8 | 1 | 34,7 | - |
Decilamina C10 | 39,6 | 68,5 | + |
Didecilamina 2 C10 | 1,2 | 28,3 | - |
Undecilamina C11 | 95,3 | 84 | + |
Dodecilamina C12 | 47,1 | 57 | + |
Tridecilamina C13 | 44,5 | 62,6 | + |
Tetradecilamina C14 | 11,6 | 54,8 | - |
Pentadecilamina C15 | 14,9 | 73 | - |
Octadecilamina C18 | 19,6 | 61,2 | - |
Oleilamina C18:1 | 1,9 | 87,1 | - |
Claims (24)
1. Fases lamelares hidratadas o liposomas,
caracterizados porque comprenden, al menos en parte de su
estructura, una sustancia o una mezcla de sustancias que
pueda(n) estimular la penetración intracelular de al menos
un principio activo, que está presente o lo transportan dichas
fases lamelares hidratadas o liposomas, y que se
selecciona(n) del grupo que consiste en:
a) Polietilenimina;
b) una monoamina grasa primaria, secundaria,
terciaria o cuaternaria de longitud de la cadena que contiene
carbono de entre C10 y C18, de manera ventajosa una monoamina que
comprende una única cadena grasa C10-C18,
preferiblemente una monoamina primaria o cuaternaria que comprende
una única cadena grasa C10-C18;
c) un polímero catiónico, particularmente un
polímero natural catiónico o que opcionalmente se hace catiónico, o
un polímero sintético catiónico,
conteniendo dichas fases lamelares hidratadas o
liposomas al menos un compuesto fluorescente que es esencialmente
inerte con respecto a la penetración intracelular, por ejemplo
pentafluorobenzoilamino-fluoresceína, que permite
que se visualice esta penetración.
2. Fases lamelares o liposomas según la
reivindicación 1, caracterizados porque el polímero natural
catiónico opcional se selecciona del grupo que consiste en
quitosano, polímero de la miel cuaternizado, proteínas de trigo o
proteínas de trigo cuaternizadas, proteínas de arroz o proteínas de
arroz cuaternizadas, proteínas de soja o proteínas de soja
cuaternizadas, colágeno o colágeno cuaternizado, queratina o
queratina cuaternizada, caseína o caseína cuaternizada, celulosa
cuaternizada o guar cuaternizado.
3. Fases lamelares o liposomas según la
reivindicación 1, caracterizados porque la monoamina
primaria se selecciona del grupo que consiste en decilamina,
undecilamina, dodecilamina, tridecilamina, tetradecilamina,
pentadecilamina, octadecilamina o es una mezcla de aminas primarias
tales como mezcla de aminas de la copra que tienen una cadena
hidrocarbonada de entre C8 y C18.
4. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque contienen
polietilenimina.
5. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases
lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al menos
un agente que modifica la membrana de los liposomas, por ejemplo,
un lípido polar seleccionado del grupo que consiste en un
triglicérido, en un fosfolípido polar o en un esfingolípido polar,
solos o en una mezcla.
6. Fases lamelares o liposomas según la
reivindicación 5, caracterizados porque el fosfolípido polar
mencionado anteriormente se selecciona de fosfatidilcolina o
lecitina, fosfatidiletanolamina o cefalina, fosfatidilserina,
fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol o cardiolipina,
fosfatidilinositol, solos o en una mezcla.
7. Fases lamelares o liposomas según la
reivindicación 5 ó 6, caracterizados porque el esfingolípido
polar se selecciona de una ceramida, un esfingofosfolípido, un
glucoesfingolípido, solos o en una mezcla.
8. Fases lamelares o liposomas -según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases
lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al
menos una lecitina extraída de una fuente natural seleccionada del
grupo que consiste en soja, colza, girasol, altramuz, cacahuete,
sésamo, calabacín, aceite de salvado, camelina macrocarpa,
caléndula, lino y cáñamo, solos o en una mezcla.
9. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases
lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica,
colesterol o hemisuccinato de colesterilo como agente que da
rigidez a las membranas.
10. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque las fases
lamelares o los liposomas comprenden, en la fase lipídica, al
menos un tensioactivo o agente tensioactivo como agente que
fluidifica la fase lamelar o las membranas de los liposomas.
11. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque contienen
un agente fluorescente o componente fluorescente que es
esencialmente inerte con respecto a la penetración intracelular,
que comprende aproximadamente un 0,01% en peso, de
5-pentafluorobenzoilamino-fluoresceína,
de la composición que contiene dichas fases lamelares o
liposomas.
12. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la
concentración de sustancia(s) que estimula(n) la
penetración intracelular oscila entre el 0,05% y el 25% en peso de
una composición que contiene las fases lamelares hidratadas o los
liposomas.
13. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la
concentración de sustancia(s) que estimula(n) la
penetración intracelular oscila entre el 0,5% y el 2,5% en peso de
una composición que contiene las fases lamelares hidratadas o los
liposomas.
14. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la
monoamina grasa mencionada anteriormente tiene una longitud de la
cadena que contiene carbono de entre C10 y C13.
15. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la
monoamina grasa mencionada anteriormente es una monoamina primaria
cuaternizada que comprende una única cadena grasa que contiene
carbono de entre C10 y C18, que oscila entre C10 y C13.
16. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la
monoamina primaria se cuaterniza y se selecciona de una disolución
de proteína vegetal, preferiblemente de proteína de soja, que está
cuaternizadas, de fórmula de tipo
R-N(R_{1}R_{2}R_{3}), en la que R
simboliza la molécula de proteína vegetal, que está hidrolizada o
no, hidroxialquilada, particularmente hidroxipropilada, o no;
siendo R_{1} y R_{2} independientemente un grupo hidrocarbonado
C1-C6, preferiblemente metilo o etilo y siendo
R_{3} un radical alquilo que tiene de 10 a 18 átomos de carbono,
y preferible y principalmente 12 átomos de carbono (laurilo).
17. Fases lamelares o liposomas según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizados porque la
sustancia o principio activo que está presente o que transportan
las fases lamelares hidratadas o los liposomas se selecciona del
grupo que consiste en un agente antirradical tal como la vitamina
E, un flavonoide, un carotenoide, vitamina C o sus derivados; un
agente despigmentante tal como catequina, hidroquinona, arbutina,
ácido fítico, ácido elágico****, vitamina C o sus derivados; un
agente adelgazante tal como al menos una xantina, un agente
pigmentante de la piel o el cabello tal como tirosina, triptófano,
fenilalanina, un extracto de Coleus o sus derivados.
18. Composición cosmética o dermocosmética,
caracterizada porque comprende fases lamelares o liposomas
que comprenden al menos una sustancia que estimula la penetración
intracelular, siendo dichas fases lamelares o liposomas y dicha
sustancia que estimula la penetración intracelular tal como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en una
mezcla con un, excipiente cosméticamente aceptable.
19. Composición cosmética o dermocosmética,
caracterizada porque comprende fases lamelares o liposomas
que comprenden al menos una sustancia que estimula la penetración
intracelular, siendo dichas fases lamelares o liposomas y dicha
sustancia que estimula la penetración intracelular tal como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en una
mezcla con un excipiente cosméticamente aceptable.
20. Composición según la reivindicación 19,
caracterizada porque la concentración de la sustancia que
estimula la penetración intracelular es de entre el 0,05% y el 25%
en peso de la composición final, preferiblemente de entre el 0,5% y
el 2,5% en peso de la composición final.
21. Composición cosmética o dermocosmética, que
tiene un efecto antiarrugas, un efecto antioxidante, un efecto
adelgazante, un efecto para palidecer la piel, un efecto de
pigmentación de la piel o el cabello, caracterizada porque
comprende fases lamelares hidratadas o liposomas que comprenden una
sustancia que estimula la penetración intracelular, siendo dicha
sustancia y dichas fases lamelares hidratadas o liposomas tal como
se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
22. Método de cuidado cosmético,
caracterizado porque comprende aplicar una composición
cosmética o dermocosmética según se define en una de las
reivindicaciones 18, 20 ó 21, sobre las zonas de la piel o el
cabello afectadas.
23. Método de cuidado cosmético según la
reivindicación 22, caracterizado porque el cuidado cosmético
se selecciona del grupo que consiste en un cuidado antiarrugas, un
cuidado antioxidante, un cuidado adelgazante, un cuidado para
palidecer la piel, un cuidado de pigmentación de la piel o el
cabello.
24. Uso de fases lamelares hidratadas o
liposomas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, como
un agente cosmético, particularmente para la fabricación de una
composición cosmética, en particular para una actividad
antiarrugas, una actividad antioxidante, una actividad adelgazante,
una actividad para palidecer la piel, una actividad de pigmentación
de la piel o el cabello.
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