KR100220893B1 - 리포좀을 이용한 항생물질의 활성 측정방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세균 막, 진균 막 또는 사람이나 동물 적혈구 막의 인지질을 구성성분으로 하는 리포좀을 제조하여, 리포좀 내부에 포획된 물질의 누출정도를 측정함으로써, 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질이나 일반 항생제의 항균활성과 그들의 부작용인 적혈구 용혈을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 세균, 진균 및 적혈구 함유 혈액을 직접 사용하지 않으므로, 항생물질의 항균활성 및 적혈구 용혈을 신속하고 용이하게 측정 할 수 있고, 멸균과정이나 오염의 염려가 없다. 또한, 본 발명의 방법은 한 번 제조 한 리포좀을 여러 번 사용할 수 있고, 리포좀을 수개월 동안 보관할 수 있으므로 매우 경제적이다.

Description

리포좀을 이용한 항생물질의 활성 측정 방법
본 발명은 리포좀을 이용한 항생물질의 활성 특정방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 세균 막, 진균 막, 사람이나 동물 적혈구 막의 인지질을 구성 성분으로 하는 리포좀을 제조하여, 막의 장벽(barrier) 기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제의 항균활성과 부작용의 하나인 적혈구 용혈을 측정하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 인지질이 물에 분산되어 형성된 페쇄소포체를 리포좀(liposomes)이라 하며, 리포좀은 기초과학과 응용과학 분야에서 널리 이용되고 있다. 리포좀은 생체 막의 기본구조인 인지질의 이 중층(bilayer)으로 구성되어 있는 바, 인지질은 음이온 또는 양쪽성 이온의 극성 분자단 및 탄화수소 16개 내외의 다양한 불포화 도를 갖는 비극성 지용성 사슬 모두를 가지고 있는 양친매성 물질이기 때문에, 물에 분산되면 자발적으로 이중 층을 형성하게 된다.
이러한 리포좀은 단백질과 인지질의 상호작용(참조 : Lee, J.W. and Kim, H., Arch. Biochem. Biophys., 297:354 (1992)), 생체 막의 융합(참조 : Kim, J. and Kim, H., Biochemistry, 25:7867(1986) 및 단백질 전달기작의 모델시스템으로 이용되고 있을 뿐만 아니라, 응용과학 분야에서는 화장품 산업이나, 약물, 유전물질 및 항원을 전달하는 모델시스템으로 이용되고 있다. 그러나, 아직까지 리포좀을 이용하여 항생물질의 항균활성이나 그의 부작용인 적혈구 용혈을 측정하려는 시도는 없었다.
한편, 일반적으로 널리 사용되고 있는 항생물질은 대부분 단일구조 유기화합물인데, 이들 대부분의 유기화합물들은 인체에 작게 또는 크게 부작용을 일으키며, 이들 물질들의 빈번한 사용으로 인하여 많은 세균들이 그들에 대해 저항성을 나타낸다는 문제점이 있었다. 따라서, 최근 들어 인체에 유해하지 않으면서, 세균의 저항성이 나타나지 않거나 혹은 종래의 항생제에 저항성을 가진 세균에 대하여 강력한 항균효과를 나타낼 수 있는 펩타이드 항생물질의 개발에 많은 노력을 기울인 결과, 수많은 펩타이드 항생물질이 발견되었다.
이와 관련하여, 개발된 펩타이드 항생물질의 활성을 측정하고자, 콜로니 계수법(참조:Natori, M., J. Insect Physiol., 23:1169(1977))), 분광계측법(참조: Okada, M. and natori, M., Biochem. J., 211:727(1983)) 및 미생물 성장 지역(zone)의 직경을 측정하는 방법(참조: Matsuzaki, K. et al., Biophys. Bio. Acta, 981:130(1989))등 다양한 방법들이 개발되었다. 이러한 방법들은 배양된 미생물 또는 진균을 필수적으로 요구하므로 배양시 다른 세균의 오염 가능성이 있으며, 많은 시간과 복잡한 측정과정을 거쳐야 한다는 단점이 있었다. 또한, 미생물 또는 진균의 배양조건(배지의 종류)에 따라 펩타이드 항생물질의 활성이 상이하다는 단점도 가지고 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결할 수 있도록, 세균을 사용하지 않고서 펩타이드 항생물질의 활성을 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 세균, 진균 및 사람 적혈구 막의 인지질 구성성분이 다음과 같이 서로 다르다는 사실을 인식하였다. 그람양성균의 세포막에는 음이온을 띤 인지질이 많이 존재하고, 진균이나 사람의 적혈구 막에는 중성을 띤 인지질이 많이 분포하고 있다. 또한, 세균의 막에는 콜레스테롤이 없지만, 진균이나 사람 적혈구의 막에는 콜레스테롤이 많은 양으로 존재하고 있으며, 특히 진균의 경우 콜레스테롤 유도체인 에르고스테롤이 존재하고 이다.(참조: Matsuzaki, K. et al., Biochemistry. 34:3423(1995)).
상기와 같은 사실에 착안하여, 상술한 인지질로 구성된 리포좀을 체조하고, 리포좀 내부에 포획된 물질의 누출정도를 측정함으로써, 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질의 활성뿐만 아니라. 이들의 부작용인 적혈구 용혈 현상을 신속하고 용이하게 측정할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 세균 막, 진균 막 또는 사람이나 동물 적혈구 막의 이지질의 구성성분으로 하는 리포좀을 제조하여, 리포좀 내부에 포획된 물질의 누출정도를 측정함으로써, 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질이나 일반 항생제의 항균활성과 그들의 부작용인 적혈구 용형을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
제1도는 그람양성균 막의 인지질로 구성된 리포좀의 펩타이드 항생물질에 의한 누출 량을 나타내는 그래프이다.
제2도는 진균 막의 인지질로 구성된 리포좀의 펩타이드 항생물질에 의한 누출 량을 나타내는 그래프이다.
제3도는 사람 적혈구 막의 인지질로 구성된 리포좀을 이용하여 펩타이드 항생물질의 부작용인 적혈구 용혈 정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
이화, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질이나 일반 항생제의 항균활성을 세균이나 진균을 직접 사용하지 않고서 측정하고자, 우선 그람양성이나 그람음성의 세균 또는 진균 막의 인지질 조성으로 얇은 막을 형성시키고, 포획시킬 물질 가장 바람직하게는 형광물질을 첨가하여 리포좀을 제조하였다. 이때, 가장 바람직한 세균 막의 인지질 조성은 3:1의 몰 비율로 구성된 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)과 카르디오리핀(cardiolipin)이며, 가장 바람직한 진균 막의 인지질 조성은 3:3:1:1:0.5:2의 몰 비율로 구성된 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 세레마이드(ceremide) 및 콜레스테롤(cholesterol)이다.
상기에서 제조된 리포좀과 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제를 반응시켜, 리포좀 내부에 포획된 물질의 누출정도를 측정함으로써, 전기 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제의 항균활성을 측정하였다. 그 결과, 항생물질의 첨가량이 증가할수록 누출되는 형광물질의 양이 증가하고, 강한 항균활성을 가진 항생물질일수록 리포좀 누출 량이 비례적으로 증가함을 알 수 있었다. 또한, 50누출이 일어나는 펩타이드의 농도(최대포화누출량의 50를 나타내는 펩타이드의 농도)가 실제로 세균 또는 진균의 작용하는 최소억제농도 MIC(minimun inhibition concentration) 값과 거의 일치함을 확인하였다.
따라서, 세균 또는 진균의 막조성으로 이루어진 리포좀은 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제의 활성측정에 이용될 수 있다.
한편, 상기 펩타이드 항생물질이나 일반 항생제의 부작용인 적혈구 용혈(hemolysis)을 사람 또는 동물 적혈구를 직접 사용하지 않고서 측정하고자, 상술한 항균활성 측정방법과 마찬가지로 사람 또는 동물 적혈구 막의 인지질 조성으로 리포좀을 제조하고, 전기 항생물질을 반응시켜 리포좀 내부에 포획된 물질의 누출정도를 측정함으로써 적혈구 용혈을 결정하였다. 이때 사람 적혈구 막의 가장 바람직한 인지질 조성은 2.2:2:1:1.8:2.5의 몰 비율로 구성된 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아림(phosphatidylethanolamine), 포스파티 딜세린(phosphatidylserine). 스핑고미엘린(sphingomyelin) 및 콜레스테롤(cholesterol)이다.
상기의 적혈구 용혈 측정결과, 실제로 사람 또는 동물의 적혈구를 파괴시키는 항생물질은 본 발명의 리포좀도 파괴시키고, 전기 적혈구를 파괴시키지 못하는 항생물질은 본 발명의 리포좀도 파괴시키고, 전기 적혈구를 파괴시키지 못하는 항생 물질은 본 발명의 리포좀도 파괴시키지 못함을 확인하였다. 따라서, 사람 또는 동물 적혈구의 막조성으로 이루어진 리포좀은 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제의 부작용인 적혈구 용혈 측정에 이용될 수 있다.
본 발명의 리포즘을 이용하여 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제의 항균활성과 적혈구 막의 용혈을 측정하는 방법은 다음과 같은 장점을 가지고 있다.
①세균, 진균, 및 적혈구 함유 혈액을 직접 사용하지 않고서, 제조가 용이한 리포좀으로 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제의 항균활성 및 적혈구 용혈을 신속하고 용이하게 측정할 수 있다. ②세균이나 진균의 배양이 필요하지 않아 멸균과정이나 오염의 염려가 없으며, 한 번 제조한 리포좀으로 여러 번 사용할 수 있고, 수개월 동안 보관 할 수 있다. ③항균활성을 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 항생물질 또는 일반 항생제의 작용기전을 살펴 볼 수 있고, 그들의 특이성을 결정할 수 있다.
본 발명을 기술하는데 사용된 약어 및 원어는 다음과 같다.
ANTS : 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트리설폰산 이중나트륨염
(8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid disodium salt)
CHO :콜레스테롤(cholesterol)
DPX : p-크실렌 비스(피리디늄) 브로마이드
(p-xylene bis (pyridinium) bromide)
CL : 카르디오리핀(cardiolipin)
MLV : 다층막 리포좀(multilamellar vesicles)
SUV : 단층막 리포좀(small unilamellar vesicles)
FTV : 동결-해동 리포좀(freezing-thawing vesicles)
PC : 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)
PE : 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)
PG : 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)
PS : 포스파티딜세린(phosphatidylserine)
PI : 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)
SM : 스핑고미엘린(sphingomyelin)
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
[펩타이드 합성]
펩타이드 항생물질은 펩타이드 합성기(Applied Biosystem Instrument, Model 431A, USA)를 사용하여 고상법(solid-phase synthesis)으로 합성하였다. 본 실험에서 합성한 펩타이드 항생물질 TED(YCNGKRVCVCR-NH2), TEO(LSVEAKGVKLNDAACAAHCL-NH2), TEDFK(KFYCNGKRVCVCR-NH2), M8(KFY(Aib)KKVCVCK-NH2)의 항균 활성과 적혈구 용혈 정도는 대한민국 특허출헌 제 95-19694호 및 제 96-1909호에 개시되어 있다. 한편, 본 실험에서 합성한 펩타이드 TED-Aib(Y(Aib)NGKRV(Aib)V(Aib)R-NH2)는 항균효과를 나타내지 못하는 펩타이드로서 사용하였다. 상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재하였으며, Aib는 아미노이소부탄산(aminoisobutyric acid)을 나타낸다.
[실시예 2]
리포좀의 제조, 항균활성 및 적혈구 용혈현상의 측정 인지질을 유리병(GLASS VIAL)에 넣어 유기용매에 용해시킨 후 질소 가스를 주입하여 유리병 내에 얇은 막을 형성시키고, 포획시킬 형광물질을 포함하는 완충용액(PH7.4)을 넣은 다음, 인지질을 상전이온도 근처에서 충분히 수화시키고, 강하게 교반하여 중첩된 다층막 리포좀(MLV)을 제조하였다. 이렇게 제조한 MLV를 초음파 분쇄(sonication)하여 소형 단층막 리포즘(SUV)을 제조한 다음, 상온에서 2시간 내지 12시간 방치시켜 액체질소에 급격히 냉동시키고, 다시 상온에서 천천히 해동시키는 과정을 3내지 4회 반복하여 동결-해동 리포좀(FTV)을 제조하였다.
이때, 본 발명에서 사용한 그람양성균의 인지질 조성은 PG/치(3:1. 몰 비율), 진균의 막 인지질 조서은 PC/PE/PS/PI/세레마이드/CHO(3:3:1:1:0.5:2), 사람 적혈구 막의 인지질 조성은 PC/PE/PS/SM/CHO(2:2:2:1:1.8:2.5)로 하여 리포좀을 각각 제조하였으며, 리포좀내의 인지질 농도는 바스코브스키(Vaskovsky)방법으로 측정하였다. (참조 : Vaskovsky, V.E. et al,. J. Chromatogr., 114:129(1975)). 또한, 리포좀에 포획된 용액은 12.5mM ANTS, 45mM DPX 및 68mM Nac1를 포함한 10mM HEPES 완충용액(pH 7.4)이며, 포획되지 않은 ANTS와 DPX는 세파덱스 G-50 칼럼(1 x 20cm)을 통과시켜 제거하고, 리포좀 용액만을 모아서 펩타이드 항생물질 또는 일반 항생제의 항균활성과 적혈구 용혈현상을 후술하는 바와 같이 측정하였다.
항균활성 및 적혈구 용혈현상은 리포좀의 누출 량으로 다음과 같이 측정하였다: 실시예 1에서 합성한 펩타이드 항생물질의 양을 달리하면서 상기에서 제조된 리포좀과 37에서 1시간 반응시킨 다음, 분과형광계(spectrofluorometer, JASCOFP-777, JAPAN)를 이용하여 여기파장(excitation waverength) 360nm, 발산파장(emission wavelength)535nm에서 ANTS의 형광세기를 측정하고 누출 량을 계산하였다. (참조: 제1도 제2도 및 제3도). 이때, 상기에서 세파덱스 G-50 칼럼을 통과한 리포좀 용액의 형광 세기를 0누출이라 하고, X-100(Triton X-100)으로 리포좀을 파괴시켜 측정한 형광세기를 100누출이라 하였으며, 항진균제 앰포테리신B(amphotericin B)를 항진균 활성과 적혈구 용혈측정의 양성 대조구(positive control)로 사용하였다. 상기에서, 항균활성 측정에 사용된 리포좀은 그람양성균 또는 진균의 막 인지질로 구성된 리포좀이며, 적혈구 용혈현상 측정에 사용된 리포좀은 그람양성균 또는 진균의 막 인지질로 구성된 리포좀이며, 적혈구 용혈현상 측정에 사용된 리포좀은 사람 적혈구 막의 인지질로 구성된 리포좀이다.
[실시예 3]
[그람양성균의 막 조성으로 이루어진 리포좀의 누출 량 분석]
제1도는 그람양성균의 막 인지질 조성으로 이루어진 리포좀의 펩타이드 항생물질에 의한 누출 량을 나타내는 그래프이다. 제1도에서 보듯이, 펩타이드 항생물질의 양이 증가할수록 누출되는 형광물질의 양이 증가함을 알 수 있었고, 강한 항균활성을 가진 펩타이드 항생물질일수록 리포좀 누출 량이 비례적으로 증가함을 알 수 있었다. 또한, 항균효과가 없는 펩타이드(TED-Aib)의 경우, 펩타이드 농도를 증가시켜도 리포좀 누출이 일어나지 않음을 알 수 있었다.
아울러, TEDFK 펩타이드 항생물질의 경우 40농도에서 90이상이 누출됨을 알 수 있었고, 50누출이 일어나는 펩타이드의 농도(최대포화누출량의 50를 나타내는 펩타이드의 농도)가 실제로 그람양성균인 Streptococcus aureus에 작용하는 최소 억제농도 MIC 값과 거의 일치함을 확인하였다. 즉, TEDFK의 경우 50누출이 일어나는 펩타이드의 농도는 10이고, 실제 Streptococcus aureus에서 측정한 MIC 값은 6.25이었다.
따라서, 그람양성균의 막조성으로 이루어진 리포좀은 그람양성균 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질의 활성 측정에 효과적으로 이용 될 수 있다.
[실시예 4]
[진균의 막 조성으로 이루어진 리포좀의 누출 량 분석]
제2도는 진균의 막 인지질 조성으로 이루어진 리포좀의 펩타이드 항생물질에 의한 누출 량을 나타내는 그래프이다. 제2도에서 보듯이 , 펩타이드 항생물질의 양이 증가할수록 누출되는 형광물질의 양이 증가함을 알 수 있었고, 강한 항균활성을 가진 펩타이드 항생물질일수록 리포좀 누출 량이 비례적으로 증가함을 알 수 있었다. 또한, 항균효과가 없는 펩타이드(TED-Aib)의 경우, 펩타이드 농도를 증가시켜도 리포좀 누출이 일어나지 않음을 알 수 있었다.
아울러, TEDFK와 M8 펩타이드 항생물질의 경우, 40농도에서 각각82및 92이상이 누출됨을 알 수 있었고, 50누출이 일어나는 펩타이드의 농도가 실제로 진균인 Candida albicans 에 작용하는 최소억제농도 MIC 값과 거의 일치함을 확인하였다. 즉, TEDFX 펩타이드의 경우, 50누출이 일어나는 펩타이드의 농도는 10이고, 실제 Candida albicans에서 얻은 MIC 값은 6.25이었다. 또한, M8 펩타이드의 경우, 50누출이 일어나는 펩타이드의 농도는 5이고, 실제 Candida albicans에서 측정한 MIC 값은 3.67이었다. 참고로, 현재 시판되고 있는 항진균제 앰포테리신 B의 경우, 50누출이 일어나는 펩타이드의 농도는 0.5이고, 실제 Candida albicans에서 측정한 MIC 값은 0.5이었다.
따라서, 진균의 막조성으로 이루어진 리포좀은 진균 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질의 활성 측정에 효과적으로 이용 될 수 있다.
[실시예 5]
[사람 적혈구 막의 조성으로 이루어진 리포좀의 누출 량 분석]
제3도는 사람 적혈구 막의 인지질 조성으로 이루어진 리포좀의 펩타이드 항생물질에 의한 누출 량을 나타내는 그래프이다. 제3도에서 보듯이, 본 발명에서 사용한 펩타이드 항생물질은 적혈구 막을 파괴시키지 못하는 반면, 앰포테리신 B는 리조좀을 파괴시킴을 알 수 있는 바, 이는 실제로 사람 및 동물의 적혈구로 실험한 결과와 일치함을 확인하였다.
따라서, 사람 적혈구의 막조성으로 이루어진 리포좀은 펩타이드 항생물질의 부작용인 적혈구 용혈 측정에 효과적으로 이용될 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 세균 막, 진균 막 또는 사람이나 동물 적혈구 막의 인지질을 구성성분으로 하는 리포좀을 제조하여, 리포좀 내부에 포획된 물질의 누출정도를 측정함으로써, 막의 장벽기능을 저해시키는 기작으로 항균효과를 나타내는 펩타이드 항생물질이나 일반 항생제의 항균활성과 그들의 부작용인 적혈구 용혈을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하면, 세균, 진균 및 적혈구 함유 혈액을 직접 사용하지 않으므로, 항생물질의 항균활성과 적혈구 용혈의 신속하고 용이하게 측정할 수 있고, 멸균과정이나 오염의 염려가 없다. 또한, 본 발명의 한번 제조한 리포좀을 여러 번 사용할 수 있고, 리포좀을 수개월 동안 보관할 수 있으므로 매우 경제적이다.

Claims (5)

  1. 다음의 각 단계를 포함하는 항균활성 측정방법: (i) 세균 또는 진균 막의 인지질을 구성성분으로 하여, 분광형광계로 측정 가능한 형광물질을 내부에 포획시킨 리포즘을 수득하는 단계 (ii) 수득된 리포좀과 항균활성을 측정할 항생물질을 혼합하여 37에서 1시간동안 반응시키는 단계; 및 (iii) 리포좀 내부에 포획된 형광물질의 누출정도를 분광형광계로 측정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 세균 막의 인지질 조성은 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol)과 카르디오리핀(carddiolipin)이 3 : 1의 몰 비율로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 항균활성 측정방법.
  3. 제1항에 있어서, 진균 막의 인지질 조성은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 세레마이드(ceremide) 및 콜레스테롤(cholesterol)이 3:3:1:1:0.5:2의 몰 비율로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 항균활성 측정방법.
  4. 다음의 각 단계를 포함하는 적혈구 용혈의 측정 방법: (i) 사람 또는 동물 적혈구 막의 인지질을 구성성분으로 하며, 분광형 광계로 측정 가능한 형광물질을 내부에 포획시킨 리포즘을 수득하는 단계; (ii) 수득된 리포좀과 항균활성을 측정할 항생물질을 혼합하여 37에서 1시간동안 반응시키는 단계; 및, (iii)리포좀 내부에 포획된 물질의 누출정도를 분광형광계로 측정하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 사람 적혈구 막의 인지질 조성은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 스핑고미엘린(sphingomyelin) 및 콜레스테롤(cholesterol)이 2.2:2:1:1.8:2.5의 몰 비율로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 적혈구 용혈의 측정방법.
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