DE102004045186A1

DE102004045186A1 - Hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen, enthaltend ein Fettmonoamin oder ein kationisches Polymer, das die intrazelluläre Penetration begünstigt, und kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, diese enthaltend, sowie Screeningverfahren nach einer solchen Substanz

Info

Publication number: DE102004045186A1
Application number: DE102004045186A
Authority: DE
Inventors: Valérie ANDRE; Isabelle Bonnet; Eric Perrier
Original assignee: COLETICA FRENCH Ltd Co LYON; Coletica SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2004-05-25
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2024-09-18
Also published as: DE102004045186B9; KR20050112498A; GB0422048D0; FR2870741A1; JP5220546B2; ES2268946B2; US20050266065A1; DE102004045186B4; ES2268946A1; JP2005350445A; JP4950419B2; KR100697361B1; JP2009108056A; FR2870741B1; US9655822B2; GB2415375A; GB2415375B

Abstract

Die Erfindung betrifft neue hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen, welche entweder Polyethylenimin oder eine Substanz, welche die intrazelluläre Penetration stimuliert, enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: DOLLAR A i) einem Fettmonoamin einer Kohlenstoffkette mit einer Länge von C10 bis C18; DOLLAR A ii) einem kationischen Polymer, DOLLAR A optional mindestens einer fluoreszierenden Verbindung, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, und die es ermöglicht, die Penetration zu visualisieren. DOLLAR A Die Liposomen sind sehr gut verwendbar in Kosmetika oder in Pharmazeutika zum Stimulieren der intrazellulären Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs.

Description

Die Erfindung betrifft im Wesentlichen hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen, die eine Substanz enthalten, welche die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, der durch die hydratisierte lamellare Phase oder die Liposomen befördert wird, begünstigt. Insbesondere betrifft die Erfindung hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen, welche mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in der hydratisierten lamellaren Phase oder dem Liposom vorhanden ist oder durch diese(s) befördert wird, zu stimulieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus entweder Polyethylenimin oder einem Fettmonoamin (Fettsäuremonoamin) einer Kohlenstoff-enthaltenden Kette mit einer Länge von zwischen C10 und C18, das in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen definiert wird, oder einem kationischen Polymer, das ebenfalls in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen definiert wird, wobei diese Substanz oder Mischung aus Substanzen optional eine fluoreszierende Verbindung enthält/enthalten, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, zum Beispiel Pentafluorbenzylaminofluorescein, die es ermöglicht, die Penetration sichtbar zu machen, insbesondere im Zusammenhang mit einem Screeningverfahren nach einer Substanz, die potenziell wirksam ist, die intrazelluläre Penetration zu fördern.
Die Erfindung betrifft ferner kosmetische oder dermokosmetische Zusammensetzungen oder pharmazeutische oder dermopharmazeutische Zusammensetzungen, die solche hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen enthalten.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur kosmetischen Pflege, welches das Applizieren einer kosmetischen oder dermokosmetischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung auf die betreffenden Zonen der Haut oder des Haars umfasst. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen als kosmetische Wirkstoffe, insbesondere zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, insbesondere für eine anti-Falten-Wirkung, eine anti-Oxidans-Wirkung, eine abbauende (Schlankheits-) Wirkung ("activité amincissante"; "slimming activity"), eine Hautbleichungs-Wirkung ("activité blanchissante de la peau"; "skin paling activity"), eine Haut- oder Haarpigmentierende Wirkung, je nach der Natur der Substanz oder des Wirkstoffs, welcher in den hydratisierten lamellaren Phasen oder den Liposomen vorhanden ist oder durch sie befördert wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Screeningverfahren zum Detektieren von Substanzen, die potentiell wirksam sind, die intrazelluläre Penetration zu fördern.

Kürzlich wurden in dem Dokument US-A-6,071,535 (Hayward) kationische Liposomen, genannt CATESOMES^TM, beschrieben, die sowohl gegenüber dem pH als auch der Ionenstärke des umgebenden Mediums sehr sensitiv sind, und die aus Diaminfettalkylammoniumfettacylsalzen des Typs N_n,N_n-Dimethyl-1,n-diaminoalkyl aufgebaut sind, wobei das Diamin als DDA bezeichnet wird, und wobei der Alkylteil eine Anzahl an Kohlenstoffatomen n von zwischen 2 und 8 besitzt (siehe Spalte 5, Zeilen 37 bis 39), und wobei der Fett-acylierte Teil durch eine Fettsäure bereitgestellt wird, die 10 bis 30 Kohlenstoffatome besitzt, um eine Substanz, die als ADDA bezeichnet wird, zu bilden (Spalte 5, Zeilen 41 bis 48).

Für solche ADDA-Substanzen wird angegeben, dass sie unter dem Handelsnamen CATEMOL von der Fa. Phoenix Chemical, Somerville, New Jersey, USA, Referenz CATEMOL 220 und 260, kommerziell erhältlich sind.

Die CATESOMES werden gebildet, indem eine Fettsäure mit 10 bis 28 Kohlenstoffatomen zusammengesetzt wird, zum Beispiel Behensäure, um sogenannte A-ADDA-Salze zu bilden, wobei die Mischung in einem äquimolaren Verhältnis und bei einem pH zwischen 6 und 10 hergestellt wird, um ein Salz zwischen der quaternären Amingruppe der ADDA-Substanz und der Carboxylgruppe der Fettsäure zu bilden (siehe Spalte 5, Zeile 66 bis Spalte 6, Zeile 4).

Dieses Hayward-Dokument zitiert weiterhin das Dokument US-A-4,721,612, das herkömmliche Liposomen betrifft, deren Doppelschichten eine Salzform eines Sterols oder einer organischen Säure umfassen, wie die Tris-Salz-Form eines Sterolhemisuccinats (Spalte 5, Zeilen 13 bis 18).

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Hauptziel der Erfindung ist es, auf eine unerwartete Weise, das neue technische Problem zu lösen, das in der Bereitstellung neuer hydratisierter lamellarer Phasen oder Liposomen besteht, die ein Erhöhen der intrazellulären Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhafterweise in die Zellen der Haut oder des Haares, ermöglichen, während gleichzeitig die Zytotoxizität oder die Induktion des Zelltods dieser Zellen limitiert wird.

Ein weiteres Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, auf eine unerwartete Weise, das technische Problem zu lösen, das in der Bereitstellung neuer hydratisierter lamellarer Phasen oder Liposomen besteht, die nicht nur die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhafterweise in die Zellen der Haut oder des Haares, fördern, sondern die es auch ermöglichen, einen relativ hohen Grad der Einkapselung der Substanz oder des Wirkstoffs in den hydratisierten lamellaren Phasen oder den Liposomen zu erzielen.

Ein weiteres Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, in einer unerwarteten Weise, das technische Problem zu lösen, welches in der Bereitstellung neuer kosmetischer oder dermokosmetischer, pharmazeutischer oder dermopharmazeutischer Zusammensetzungen besteht, die hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen enthalten, die eine ausgezeichnete intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhaft in die Zellen der Haut oder des Haares, aufweisen (ermöglichen), während gleichzeitig die Zytotoxizität oder die Induktion des Zelltods (oder Apoptose) dieser Zellen limitiert wird.

Ein weiteres Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, in einer unerwarteten Weise, ein neues technisches Problem zu lösen, welches in der Bereitstellung eines neuen Screeningverfahrens nach einer Substanz besteht, die potentiell wirksam ist, die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, vorteilhafterweise in die Zellen der Haut oder des Haares zu verbessern, und vorzugsweise ebenfalls die Zytotoxizität oder die Induktion der Apoptose dieser Zellen auszuwerten.

All diese technischen Probleme werden erstmals gleichzeitig gelöst, in einer sicheren und zuverlässigen Weise, die in einem kosmetischen oder pharmazeutischen und in einem industriellen Maßstab genutzt werden kann.

Demnach stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen bereit, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, zu stimulieren, und die ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus:

a) Polyethylenimin;
b) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmomoamin einer Kohlenstoffkette mit einer Länge von C10 bis C18, vorteilhafterweise einem Monoamin, das eine einzige C10 – C18 Fettkette umfasst, vorzugsweise einem primären oder quaternären Monoamin, das eine einzige C10 – C18 Fettkette umfasst;
c) einem kationischen Polymer, insbesondere einem kationischen natürlichen Polymer oder optional einem kationisch gemachten Polymer oder einem kationischen synthetischen Polymer,

wobei die lamellaren Phasen oder Liposomen optional mindestens eine fluoreszierende Verbindung enthalten, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, zum Beispiel Pentafluorbenzoylaminofluorescein, die es ermöglicht, die Penetration sichtbar zu machen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform sind die lamellaren Phasen oder Liposomen dadurch gekennzeichnet, dass das optional kationische natürliche Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chitosan, quaternisiertem Honigpolymer; Pflanzenproteinen, insbesondere Weizenproteinen oder quaternisierten Weizenproteinen, Reisproteinen oder quaternisierten Reisproteinen, Sojaproteinen oder quaternisierten Sojaproteinen; Kollagen oder quaternisiertem Kollagen, Keratin oder quaternisiertem Keratin, Casein oder quaternisiertem Casein, Cellulose oder quaternisierter Cellulose, Guar (Büschelbohne) oder quaternisiertem Guar (Büschelbohne). Diese quaternisierten Polymere sind im allgemeinen kommerzielle Produkte und die Quaternisierung wird im allgemeinen durch Aufbringen von tertiären Aminen auf die chemischen Gruppen des Startpolymers erzielt.

Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform sind die lamellaren Phasen oder Liposomen dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Monoamin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Decylamin, Undecylamin, Dodecylamin, Tridecylamin, Tetradecylamin, Pentadecylamin, Octadecylamin oder einer Mischung aus primären Aminen, wie Mischungen aus Kopraaminen, die eine Kohlenwasserstoffkette von C8 bis C18 besitzen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die lamellaren Phasen oder Liposomen Polyethylenimin.

Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform umfassen die lamellaren Phasen oder die Liposomen in der Lipidphase mindestens eine Substanz, der die Membran von Liposomen modifiziert, zum Beispiel ein polares Lipid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Triglycerid, einem polaren Phospholipid oder einem polaren Sphingolipid, einzeln oder in einer Mischung.

Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform ist das oben erwähnte polare Phospholipid ausgewählt aus Phosphatidylcholin oder Lecithin, Phosphatidylethanolamin oder Cephalin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin oder Cardiolipin, Phosphatidylinositol, einzeln oder in einer Mischung.

Vorteilhafterweise ist das polare Phospholipid ausgewählt aus einem Ceramid, einem Sphingophospholipid, einem Glycosphingolipid, einzeln oder in einer Mischung.

Gemäß einer anderen Variante umfassen die lamellaren Phasen oder Liposomen mindestens ein polares Lipid oder ein polares Sphingolipid, insbesondere in Form eines Salzes einer organischen Säure eines Sterols, wie dem Tris-Salz eines Sterolhemisuccinats.

Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfassen die lamellaren Phasen oder Liposomen mindestens ein Lecithin in der Lipidphase, extrahiert aus einer natürlichen Quelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Soja, Raps, Sonnenblume, Lupine, Erdnuss, Sesam, Kürbis ("courge"; "marrow"), Kleieöl, großsamiger Leimdotter ("caméline"; "bigseed falseflax"), Ringelblume, Leinen (Flachs) und Hanf, einzeln oder in einer Mischung.

Gemäß einer anderen Ausführungsvariante können die lamellaren Phasen oder Liposomen ebenfalls eine Lipidphase umfassen, welche Cholesterol oder ein Derivat von Cholesterol, wie Cholesterolhemisuccinat, als eine Substanz, die die Membranen versteift, enthält.

Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können die lamellaren Phasen und die Liposomen in der Lipidphase mindestens ein Tensid oder eine Oberflächen-aktive Substanz, als eine Substanz, die die lamellare Phase oder die Membranen der Liposomen verflüssigt, umfassen.

Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der Erfindung enthalten die lamellaren Phasen oder Liposomen eine fluoreszierende Substanz, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration, insbesondere die intrazelluläre Penetration der Haut oder der Haare, im Wesentlichen inert ist, wobei ein gegenwärtig bevorzugtes Beispiel einer solchen fluoreszierenden Substanz 5-Pentafluorbenzoylaminfluorescein umfasst oder aus diesem aufgebaut ist, insbesondere in einem Verhältnis von ungefähr 0,01 Gewichts-% der Zusammensetzung, welche die lamellare Phase oder die Liposomen enthält.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung liegt die Konzentration der Substanz(en), welche die intrazelluläre Penetration stimuliert/stimulieren, zwischen 0,05 Gewichts-% und 25 Gewichts% der Zusammensetzung, welche die hydratisierten lamellaren Phasen oder die Liposomen enthält, vorzugsweise zwischen 0,5 Gewichts% und 2,5 Gewichts-% der Zusammensetzung.

Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung besitzt das oben erwähnte Fettmonoamin eine Kohlenstoffkette mit einer Länge von C10 bis C13. Vorteilhafterweise ist das oben erwähnte Fettmonoamin ein quaternisiertes primäres Monoamin, das eine einzige Fett-Kohlenstoffkette von C10 bis C18 umfasst, vorzugsweise von C10 bis C13.

Gemäß noch einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das quaternisierte Molekül, welches die intrazelluläre Penetration der Wirkstoffe begünstigt, ausgewählt aus einer Lösung aus quaternisierten Pflanzenproteinen, bevorzugt aus Sojaproteinen, welche quaternisiert sind nach der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert, welches hydrolysiert ist oder nicht, hydroxyalkyliert, insbesondere hydroxypropyliert, ist oder nicht; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe, bevorzugt Methyl oder Ethyl, sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome und bevorzugt vor allem 12 Kohlenstoffatome (Lauryl) besitzt.

Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz oder der Wirkstoff, der in den hydratisierten lamellaren Phasen oder den Liposomen vorhanden ist, oder von diesen befördert wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-Radikalbildner, wie Vitamin E, einem Flavonoid, einem Carotinoid, Vitamin C oder deren Derivaten; einer depigmentierenden Substanz, wie Catechin, Hydroquinon, Arbutin, Phytinsäure, Ellagsäure, Vitamin C oder deren Derivaten; einer abbauenden (Schlankheits-) Substanz, wie mindestens einem Xanthin, einer Haut- oder Haar-pigmentierenden Substanz, wie Tyrosin, Tryptophan, Phenylanalin, einem Coleus-Extrakt oder deren Derivaten.

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung auch kosmetische oder dermokosmetische Zusammensetzungen; pharmazeutische oder dermopharmazeutische Zusammensetzungen, welche solche hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen umfassen, die mindestens eine Substanz umfassen, welche die intrazelluläre Penetration stimuliert, optional in einem kosmetisch, dermokosmetisch, pharmazeutisch oder dermopharmazeutisch akzeptablen Träger.

Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt und einige von ihnen sind in den zwei Dokumenten aus dem Stand der Technikzitiert, die in der Beschreibung des Standes der Technik angegeben wurden.

Andere Träger ergeben sich aus den Beispielen der kosmetischen, dermokosmetischen, pharmazeutischen oder dermopharmazeutischen Zusammensetzungen der folgenden Beschreibung, welche lediglich eine Illustration darstellt, und welche in keinster Weise den Gegenstand ("scope") der Erfindung beschränken soll.

Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur kosmetischen Pflege, welches die topische Applikation einer Zusammensetzung auf die Haut oder das Haar umfasst, die hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen enthält, wie oben beschrieben oder wie sich aus der folgenden Beschreibung ergibt, welche unter Bezugnahme auf die Beispiele erfolgt, die einen integralen Teil der Erfindung darstellen.

Gemäß einem vierten Aspekt deckt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung ab, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine topische Applikation einer Zusammenfassung auf die Haut oder das Haar umfasst, welche hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen, wie oben beschrieben oder die sich aus den Beispielen ergibt, enthält, wobei sie einen integralen Teil der Erfindung darstellen, in einer Menge, die ausreichend ist, um die nachgesuchte therapeutische Behandlung zu erzielen. Im allgemeinen umfassen die hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen mindestens einen Wirkstoff, der in den hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen vorhanden ist oder durch sie befördert wird, der eine Wirkung besitzt, die mit der nachgesuchten therapeutischen Behandlung in Verbindung steht.

Im Zusammenhang mit einer kosmetischen Pflege stellt die vorliegende Erfindung die Durchführung einer kosmetischen Pflege bereit, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer anti-Falten-Pflege, einer anti-Oxidans-Pflege, einer abbauenden (Schlankheits-) Pflege ("amincissante"; "slimming care"), einer Haut-bleichenden Pflege ("blanchissante de la peau"; "skin paling care"), einer Haut- oder Haar-pigmentierenden Pflege.

Im Zusammenhang mit einer therapeutischen Behandlung stellt die Erfindung die Durchführung einer geeigneten therapeutischen Behandlung der Haut oder des Haares in Abhängigkeit von der zu behandelnden Pathologie (Symptomatik) bereit.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von lamellaren Phasen oder Liposomen als kosmetische Substanzen, insbesondere zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, insbesondere für eine anti-Falten-Wirkung, eine anti-Oxidans-Wirkung, eine abbauende (Schlankheits-) Wirkung ("activite amincissante"; "slimming activity"), eine Haut-bleichende Wirkung ("activite blanchissant de la peau"; "skin paling activity"), eine Haut- oder Haarpigmentierende Wirkung oder zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für jeden dieser Fälle, die bevorzugt auf topischem Weg verabreicht werden.

Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Screeningverfahren nach mindestens einer Substanz, die potentiell in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, die/der durch die hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen befördert wird, zu stimulieren, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

a) Zubereiten einer hydro-lipidischen Mischung, welche in der Lage ist, die hydratisierten lamellaren Phasen oder die Liposomen zu bilden;
b) Hinzugeben einer fluoreszierenden Verbindung, welche vorzugsweise in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, in diese hydro-lipidische Mischung vor dem Dispersionsprozess;
c) optionales Hinzugeben einer Testsubstanz, die aus der Substanz, die potentiell wirksam und in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration zu stimulieren, ausgewählt ist und einer Referenzsubstanz in die hydro-lipische Mischung, vor oder während des Dispersionsprozesses;
d) Zubereiten der hydratisierten lamellaren Phasen oder der Liposomen gemäß einem beliebigen geeigneten Verfahren zur Bildung der hydratisierten lamellaren Phasen oder der Liposomen aus der hydro-lipidischen Mischung, wie sie entweder oben in Schritt b) oder in Schritt c) erhalten wurde;
e) Detektieren von mindestens der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung durch Messung der intrazellulären Fluoreszenz.

Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das Ergebnis der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung verglichen mit der intrazellulären Penetration, die mit einer Referenzsubstanz erzielt wird, insbesondere Polyethylenimin umfassend.

Gemäß noch einer anderen Ausführungsform wird die Zytotoxizität und/oder die Induktion von Apoptose der potentiell aktiven Substanz gemessen, insbesondere auf Fibroblasten, bevorzugt normalen humanen Fibroblasten, in Kultur.

Gemäß noch einer anderen Ausführungsform ist die fluoreszierende Verbindung, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, eine fluoreszierende Verbindung, die nicht spontan in die Fibroblasten in Kultur penetriert.

Gemäß noch einer anderen Ausführungsform umfasst die fluoreszierende Verbindung Pentafluorbenzoylaminofluorescein oder ist Pentafluoraminofluorescein, welches bei einer Konzentration von 0,01 Gewichts-% der Endzusammensetzung, welche die hydratisierten lamellaren Phasen oder die Liposomen enthält, welche zur Auswertung der intrazellulären Penetration verwendet werden, verwendet wird.

Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird die fluoreszierende Verbindung in Gegenwart von Polyethylenimin hinzugefügt, wobei die fluoreszierende Verbindung und das Polyethylenimin in einer nicht cytotoxischen Konzentration vorliegen.

Gemäß noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz, die potentiell in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration zu stimulieren, ausgewählt aus einem primären Fettmonoamin einer Alkyl-Kettenlänge von C10 bis C18, bevorzugt von C10 bis C13, oder einem kationischen Polymer, insbesondere einem natürlichen Polymer, welches optional kationisch gemacht wird, oder einem kationischen synthetischen Polymer, welches in die lamellaren Phasen oder die Liposomen, wie oben oder in der folgenden Beschreibung mit Bezugnahme auf die Beispiele definiert, welche einen integralen Teil der Erfindung darstellen, eingebaut bzw. hinzugefügt wird.

Die Erfindung betrifft ferner, gemäß einem sechsten Aspekt, die Verwendung von hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen, wie sie oben beschrieben sind oder wie sie sich aus den Beispielen, die einen integralen Teil der Erfindung darstellen, ergeben, als kosmetische Substanz oder zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, und insbesondere für eine anti-Falten-Wirkung, eine anti-Oxidans-Wirkung, eine abbauenden (Schlankheits-) Wirkung ("activite amincissante"; "slimming activity"), eine Haut-bleichende Wirkung ("activite blanchissante de la peau"; "skin paling activity"), eine Haut- oder Haar-pigmentierende Wirkung.

Im Zusammenhang mit einem beliebigen der vorangehenden Aspekte können vorteilhafterweise Oberflächen-aktive Stoffe zu der hydro-lipidischen Mischung hinzugefügt werden, um die Membranen der Liposomen zu verflüssigen.

Die vorliegende Erfindung machte die Auswahl eines fluoreszierenden Indikators ("traceur"; "tracer") erforderlich, der nicht spontan, zum Beispiel in die Fibroblasten in Kultur, penetriert, und der selbst oder nach der Einkapselung in ein Liposom eine sehr geringe Zytotoxizität hervorruft, der mit einer großen Ausbeute in die Liposomen (zum Beispiel auf der Basis von Sojalecithin (ungefähr 80 %), eingebaut wird, und der nach der Einkapselung stabil ist (keine Freisetzung und keine Veränderung der Fluoreszenz), und der keine Instabilität der Liposomen induziert. Der ausgewählte Indikator ist vorteilhafterweise 5-Pentafluorbenzoylaminofluorescein oder PFB-F bei einer Konzentration von 0,01 %, d.h. 185 μM finaler Konzentration.

Vorteilhafterweise werden die Dispersionsverfahren zum Zubereiten der Liposomen bevorzugt ausgewählt aus Schermethoden, Ultraschall, Extrusion, Hydratation/Dehydratation (Lyophilisation), Einfrieren/Auftauen, reverser Phasen-Evaporation.

Die Gegenwart des Liposoms (lamellare Struktur) wird durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Größe der Liposomen wird durch Transmissionselektronenmikroskopie und Laserpartikel-Größenanalyse (Granulometrie) ausgewertet.

Vorteilhafterweise wird die Zubereitung der Liposomen bei einem pH von 4 bis 8, bevorzugt bei pH 6, vorgenommen.

Vorteilhafterweise erfolgt die beobachtete intrazelluläre Penetration eines Wirkstoffs bei Zellen der Haut.

Vorteilhafterweise hat die Penetration eines Wirkstoffs in die Zellen der Haut hauptsächlich Fibroblasten, Keratinocyten und Melanocyten zum Ziel.

Die Mittel zur Detektion der intrazellulären Penetration werden ausgewählt aus Verfahren zur Quantifizierung und Visualisierung, und sind vorzugsweise die Quantifizierung der Intensität der Fluoreszenz durch Spektrofluorometrie und die Visualisierung mittels optischer Epifluoreszenz-Mikroskopie ("visualisation en microscopie optique à épifluorescence").

Vorteilhafterweise werden die Moleküle als wirksam angesehen, die erstens eine Stimulierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Indikators erzielen, mehr als 10 % größer ist als die der Negativkontrolle seiend, kein kationisches Molekül enthaltend, und vorzugsweise äquivalent oder größer als die Positivkontrolle seiend, die ein kationisches Referenzmolekül, Polyethylenimin, welches bei 50 μM verwendet wird, enthält. Zweitens dürfen die ausgewählten Moleküle vorzugsweise keine zytotoxischen und/oder apoptotischen Phänomene induzieren oder zytotoxische und/oder apoptotische Phänomene induzieren, die geringer sind als solche des kationischen Referenzmoleküls (Polyethylenimin, verwendet bei 50 μM).

Vorteilhafterweise sind die wirksamen Moleküle, die zum Stimulieren der intrazellulären Penetration ausgewählt werden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einem primären oder quaternären Amin variabler Kohlenstoffkettenlänge, und vorteilhafterweise Decylamin, Undecylamin, Dodecylamin, Tridecylamin, Tetradecylamin, Pentadecylamin, Octadecylamin, Benzyldimethyl (Octadecyl)ammoniumchlorid (oder Stearylalkoniumchlorid), einer Mischung aus primären Aminen (zum Beispiel C8 bis C18-Copraaminen), Polyquaternium 16;
b) einem kationischen Polymer, und vorteilhafterweise Chitosan, oder quaternärisiertem Honig, Pflanzenproteinen, insbesondere Weizenproteinen, Reisproteinen, Sojaproteinen oder ihren quaternärisierten Derivaten; quaternärisierter/m Cellulose oder Guar (Büschelbohne).

Vorteilhafterweise liegen die Konzentrationen der verwendeten kationischen Substanzen von 0,05 % bis 25 %, bevorzugt von 0,5 bis 2,5 %, bevorzugt bei 1 %.

Vorteilhafterweise ist die Stimulierung der intrazellulären Penetration optimal für Kohlenstoffketten mittlerer Länge (C10 bis C13), durchschnittlich für Ketten großer Länge (C15 bis C18) und geringer für kurze Ketten (weniger als C10).

Vorteilhafterweise ist die Stimulation der intrazellulären Penetration optimal für ein primäres Amin (zum Beispiel C10-NH₂), im Vergleich zu einem sekundären Amin, welches zum Beispiel die beiden gleichen Kohlenstoffketten umfasst (C10-NH-C10), aufgrund der induzierten sterischen Behinderung.

Vorteilhafterweise ermöglichen es bestimmte quaternisierte Polymere, einen besseren Stimulierungsfaktor der intrazellulären Penetration, zu erreichen, allein durch den Charakter des gewählten Polymers selbst, z.B. ist Lauryldimoniumhydroxypropyl von hydrolysiertem Weizenprotein ungefähr sechsmal weniger effizient als Lauryldimoniumhydroxypropyl von hydrolisiertem Sojaprotein.

Vorteilhafterweise sind die ausgewählten kationischen Moleküle weniger zytotoxisch und/oder induzieren weniger Apoptose als das verwendete Referenzmolekül, Polyethylenimin, verwendet bei 50 μM.

Vorteilhafterweise wird die Quantifizierung der Zytotoxizität anhand eines Zell-Lebensfähigkeits-Tests vorgenommen, welcher die alkalische Phosphatase-Aktivität der Zelle und eine Interleukin 1 alpha-Bestimmung auswertet. Die Apoptose wird durch die Quantifizierung von Caspase-1 ausgewertet.

Vorteilhafterweise werden die Liposomen, die gemäß dem oben beschriebenen erfinderischen Verfahren zubereitet werden, verwendet, um eine Erhöhung der intrazellulären Penetration von kosmetischen, dermokosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zu induzieren, die anstelle des fluoreszierenden Indikators verwendet werden.

Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden sich dem Fachmann eindeutig beim Lesen der erklärenden Beschreibung ergeben, die unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erfolgt.

Die Beispiele stellen einen integralen Teil der vorliegenden Erfindung dar und jedes Merkmal, das in Bezug auf den Stand der Technik aus der Beschreibung in ihrer Gesamtheit, einschließlich der Beispiele, neu erscheint, stellt einen integralen Teil der Erfindung in seiner Funktion und in seiner Allgemeingültigkeit dar.

Daher ist jedes Beispiel von allgemeiner Bedeutung („general scope").

Ferner werden in den Beispielen alle Prozentsätze als Gewichts% angegeben, sofern nichts anderes angegeben ist, die Temperatur wird in Grad Celsius ausgedrückt, sofern nichts anderes angegeben ist, und der Druck ist Luftdruck, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beschreibung der Figuren

Die angehängten 1 bis 4 zeigen die Visualisierung der intrazellulären Penetration von zwei vor-ausgewählten Indikatoren gemäß der Erfindung, PBF-F bzw. TRITC:

1 stellt Fibroblasten dar, die für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01 % PBF-F aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 10-fachen Vergrößerung.

2 stellt Fibroblasten dar, die für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01 % PBF-F aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 40-fachen Vergrößerung.

3 stellt Fibroblasten dar, die für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01 % TRITC aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 100-fachen Vergrößerung.

4 stellt Fibroblasten dar, welche für 24 Stunden mit Liposomen inkubiert wurden, die 0,01 % TRITC und 3 % PEI aufwiesen, mit einer durch das Objektiv erzielten 100-fachen Vergrößerung.

Beispiel 1: Zubereitung und Aufreinigung eines Liposoms, das einen fluoreszierenden Indikator einkapselt
Fluoreszierende Indikatoren haben nicht nur den Vorteil, sicher zu sein, zum Beispiel in Hinsicht auf Radioaktivität, sondern sind ferner sehr einfach zu verwenden, wenn es darum geht, eine Quantifizierung durchzuführen und einen „visuellen" Aspekt von der intrazellulären Penetration bei Zellkulturmodellen zu demonstrieren.
Die Auswahl des Indikators erfordert die Zubereitung von Liposomen, die 0,01 verschiedener wasserlöslicher oder fettlöslicher Indikatoren enthalten, sowie ihre Aufreinigung, um die nicht eingebauten Indikatoren vor ihrer Applikation auf normale humane Fibroblasten zu entfernen. Eine Liposomen-Kontrolle ohne fluoreszierenden Indikator wird parallel durchgeführt.
a) Auswahl des Liposomen-Zubereitungs-Protokolls
Es wurden Liposomen bei einer Konzentration von 20 % Sojalecithin, aufgelöst in Trizma-Verdünnungspuffer (Sigma, Frankreich) 55 mM, zubereitet, – mit 27 mM NaCl auf pH 5 eingestellt. Nach einem magnetischen Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung für 10 Minuten sehr energisch homogenisiert.
Die Liposomen wurden dann in DF-Medium [DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 Glutamax 50/50 Volumen/Volumen, ergänzt mit 10 Kälberserum, mit Penecellin bei einer Endkonzentration von 100 UI/Milliliter, mit Gentamicin bei einer Endkonzentration von 1 Mikrogramm/Milliliter, mit Amphotericin B bei einer Endkonzentration von 1 Mikrogramm/Milliliter] verdünnt, um verschiedene Sojalecithin-Konzentrationen (0,5–1–2–3–4–5–7,5–10 %) zu erzielen.
250 μl der liposomalen Suspension wurden zu Kulturen aus normalen humanen Fibroblasten hinzugefügt, die aus abdominaler Plastik („plastie abdominale"; „abdominal plasy") extrahiert wurden und in einer 96-Well-Platte kultiviert. Jede Konzentration wurde in vier unterschiedlichen Wells getestet. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch einen Test mit Paranitrophenylphosphat ausgewertet, welches die intrazelluläre alkalische Phosphatase-Aktivität bestimmt, nach dreimaligem Spülen mit Phosphatpuffer pH 7,4. Der Prozentsatz an lebenden Zellen wurden in Bezug auf eine Kontrolle, die ohne die Zugabe von Liposom in das Kulturwell (n=6) durchgeführt wurde, berechnet.
Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass eine Zell-Lebensfähigkeit von mehr als 85 bei bis zu 7,5 % Lecithin erzielt wurde. Bei 10 % Lecithin sank die Lebensfähigkeit unter den akzeptablen Grenzwertes von 75 % Lebensfähigkeit.
Die Konzentration von 5 %, welche es ermöglichte, eine Zell-Lebensfähigkeit von größer als 90 % zu erzielen, wurde ausgewählt.
b) Zubereitung von 5 % Sojalecithin-Liposom mit einem eingebauten fluoreszierenden Indikator
0,5 g Sojalecithin, 0,01 % fluoreszierender Indikator, welcher gemäß den Empfehlungen des Anbieters vor-gelöst („présolubilisé"; „pre-solubilised") wurde, wurden in eine Schale gegeben und mit 10 ml Trizma-Puffer verdünnt. Nach einem magnetischen Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung für 10 Minuten energisch homogenisiert, so dass eine liposomale Lösung erzielt wurde, in der die Liposomen eine durchschnittliche Größe aufwiesen, die zwischen 100 und 800 Nanometern variieren konnte, gemäß den exakten Bedingungen der Homogenisierung.
Das Ziel des Aufreinigungsschrittes war es, die nicht eingekapselte Indikator-Fraktion von der Fraktion an Indikatoren, die in die Liposomen eingekapselt waren, zu separieren. Hierzu wurde die liposomale Lösung in einem konischen Röhrchen für 10 Minuten mit 1790 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Ablagerungen (Pellets) wurden wiedergewonnen und dann in 10 ml Kulturmedium gelöst.
Die Liposom-Negativkontrolle wurde gemäß dem oben beschriebenen Protokoll ohne fluoreszierenden Indikator durchgeführt.
Die Proben wurden für 24 Stunden bei 4°C im Dunkeln gelagert. Es wurden 26 Serien von Liposomen hergestellt, mit verschiedenen Typen fluoreszierender Indikatoren, pH-sensitiven, Calcium-sensitiven oder anderen Indikatoren.
Beispiel 2: Auswahl eines fluoreszierenden Indikators, der in ein Liposom eingekapselt werden kann, und der nicht spontan in normale humane Fibroblasten in Kultur penetriert
Die Auswahl des Indikators erforderte die Zubereitung und Aufreinigung von Liposomen gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll, wobei diese Liposomen verschiedene Konzentrationen der verschiedenen wasserlöslichen oder fettlöslichen Indikatoren enthielten (Tabelle 1, Anhang 1). Die Kontrollen – ein freier fluoreszierender Indikator – wurden durch Auflösen eines fluoreszierenden Indikators in dem Verdünnungspuffer bei der gleichen Konzentration durchgeführt, um so seine Zytotoxizität und seine spontane Penetration in die Fibroblasten zu quantifizieren.
Der Vergleich mit einem Liposom, welches keinen fluoreszierenden Indikator enthielt, wurde parallel als Negativkontrolle durchgeführt.
Nach der Extraktion aus einer Biopsie, die aus einer abdominalen plastischen Operation stammte, wurden die Fibroblasten geeigneterweise in DF-Medium, d.h.: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/Ham F12 Glutamax 50/50 Volumen/Volumen, ergänzt mit 10 % Kälberserum, mit Penecellin bei einer Endkonzentration von 100 UI/Milliliter, mit Gentamicin bei einer Endkonzentration von 1 Mikrogramm/Milliliter, mit Amphotericin B bei einer Endkonzentration von 1 μg/Milliliter, amplifiziert.
Nach Zentrifugation wurden die aufgereinigten Liposomen zunächst in DF-Kulturmedium aufgenommen, mit einem Vortex homogenisiert und dann in einer Menge von 1 ml pro Well zu den Fibroblasten, die in 24-Well-Platten (Costar MW24) kultiviert wurden, zugegeben. Die Kontrollen wurden unter den gleichen Bedingungen hergestellt. Eine nicht behandelte Kontrolle wurde ebenfalls durchgeführt.
Die Fibroblasten wurden für 24 Stunden bei 37°C in der Gegenwart der Liposomen inkubiert und dann dreimal in pH 7,4 Phosphatpuffer gespült. Als erstes wurde die Fluoreszenz trocken („évaluée à sec"; „evaluated dry") durch Spektrofluorometrie mit einem Cytofluor 4000^® (Millipore) ausgewertet. Als zweites wurde die intrazelluläre Fluoreszenz von den Molekülen von Interesse mit einem Olympus^® reversen Mikroskop (IX70) beobachtet unter Verwenden des entsprechenden Anregungsfilters (Objektiv x10, x40 und x100). Schließlich wurde die Zytotoxizität der fluoreszierenden Indikatoren in einer 96-Well-Platte durch Inkubation für 24 Stunden ausgewertet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass von den 25 getesteten Molekülen lediglich Pentafluorbenzoylaminofluorescein PFB-F (P12925 Molecular Probes) und Tetramethylrhodaminisothiocyanat TRITC (T-490 Molecular Probes) nach dem Einbau in ein Liposom, der Applikation auf die Fibroblasten für 24 Stunden und der Quantifikation der Penetration des liposomalen Gehalts, interessante positive Ergebnisse ergaben.
Die anliegenden 1 bis 4 stellen Fotographien dar, welche die intrazelluläre Penetration der zwei vor-ausgewählten („préselectionnés"; „pre-selected") Indikatoren PFB-F und TRITC bei der Konzentration von 0,01 % in den Liposomen nach einer Inkubation mit den Fibroblasten für 24 Stunden visualisieren. Tabelle 2: Ergebnisse des Indikator-Screenings
Obwohl TRITC eine intensivere Markierung ergab (Tabelle 1 und anliegend 1 bis 4), ist er nichtsdestotrotz leicht zytoxosisch, er penetriert leicht, wenn er dem Kulturmedium frei zugefügt wird. PFB-F scheint daher ein besserer Indikator zu sein.
Beispiel 3: Untersuchung der intrazellulären Penetration in Gegenwart von PFB-F (Pentafluorbenzoylaminofluorescein) oder TRITC (Tetramethylrhodaminisothiocyanat) und in Gegenwart oder nicht in Gegenwart von Polyethylenimin
Die intrazelluläre Penetration von Liposomen, welche 5 % Sojalecithin, 0,01 PFB-F oder TRITC enthielten, in Gegenwart oder nicht in Gegenwart von 0,5 % 25 kDa Polyethylenimin (PEI), die gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll zubereitet wurden, wurde nach 24 Stunden Inkubation mit humanen Fibroblasten, die in einer 24-Well-Platte kultiviert wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert.
Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von PEI die Penetration von den PFB-F-Liposomen 13,7-fach stimuliert, während die Zugabe von PEI die Penetration von TRITC-Liposomen 16-fach herabsetzt (siehe Fotographien im Anhang, 1 bis 4).
Der weiter verwendete Indikator ist daher PFB-F oder Pentafluorbenzyolaminofluorescein bei 0,01 % im Liposom.
Beispiel 4: Untersuchung der Stabilität der Liposomen, die Pentafluorbenzylaminofluorescein (PFB-F) enthalten
Die Stabilität der Liposomen wurde analysiert, indem die Freisetzung des fluoreszierenden Indikators in das DF-Kulturmedium mittels Spektrofluorometrie untersucht wurde; diese Untersuchung wurde als Funktion des pH, der Ionenstärke und der Gegenwart eines Detergenz durchgeführt.
Es wurden geeigneterweise Liposomen, die 5 % Sojalecithin, 0,01 % PFB-F und 50 μM 25 kDa PEI enthielten, zubereitet. Die liposomalen Lösungen wurden auf pH 6–7–8–9 eingestellt; die Konzentration von Natriumchlorid (NaCl) wurde auf 50–100–150-200 mM eingestellt und die Konzentration von Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100 wurde auf 0,1–0,5–1-3 % eingestellt. Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Untersuchung der Freisetzung als Funktion der Gegenwart von Detergenzien, der Ionenstärke und des pH
Die Ergebnisse scheinen anzuzeigen, dass die Liposomen, die 50 μM 25 kDa PEI enthielten, ab 200 mM NaCl, 0,5 % Triton X-100 oder SDS und oberhalb von pH 7 zu destabilisieren begannen.
Beispiel 5: Ausbeute der Einkapselung von dem fluoreszierenden Indikator PFB-B als Funktion der Konzentration von Polyethylenimin
Es wurden Liposomen gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren zubereitet, mit ansteigenden Konzentrationen von 25 kDa PEI von 0 bis 100 μM. Nach Zentrifugation bei 1790 g für 10 Minuten wurden die Überstände mittels Spektrofluorometrie quantifiziert. Die Ausbeuten der Einkapselung wurden mit Bezug auf die Anfangskonzentration berechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 4: Ausbeute der Einkapselung von PFB-F als Funktion der Konzentration von PEI
Es ist festzustellen, dass der Ausbeute der Einkapselung nicht durch die Erhöhung der Konzentration von PEI beeinträchtigt wird.
Beispiel 6: Entwicklung der Screening-Bedingungen mit fluoreszierenden Liposomen, die verschiedene Konzentrationen von Polyethylenimin enthalten
Es wurden Liposomen gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll zubereitet, mit verschiedenen Konzentrationen von Polyethylenimin (25 kDa PEI, neutralisiert mit 6N Salzsäure), d.h. 0–5–10–50 μM und 0,01 % PFB-F.
Die Quantifizierung wurde mittels Spektrofluorometrie nach der Inkubation mit Fibroblasten, kultiviert in einer Einzelschicht in einer 24-Well-Platte für 2–4–6–24 und 48 Stunden, nach drei Waschschritten mit Phosphatpuffer pH 7,4, gegen einen Leerwert nicht behandelter Fibroblasten und nach Normierung gegen freies PFB-F bei der gleichen Konzentration, durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5: Untersuchung der intrazellulären Penetration von PFB-F als Funktion der Zeit und der Konzentration von PEI (n = 4, für jede Bedingung), ausgedrückt in frei wählbaren Fluoreszenzeinheiten
Die besten Ergebnisse wurden bei einer Konzentration von 50 μM PEI und einer Mindestinkubationszeit mit den Fibroblasten von 24 Stunden erhalten. Diese Bedingungen werden für das Screening nach Molekülen, welche die intrazelluläre Penetration stimulieren, beibehalten. Die Ergebnisse sind für die freie Kontrollprobe (p < 0,05) für alle Zeiten mit Wirkung ab der Konzentration von 5 μM statistisch signifikant.
Beispiel 7: Analyse der intrazellulären Penetration und der Zytotoxizität von fluoreszierenden Liposomen, die 50 μM Polyethylenimin enthalten, als eine Funktion der Zeit
Das Experiment wurde gemäß Beispiel 6 für PEI-Konzentrationen von 0 bis 100 μM durchgeführt. Die Quantifizierung der Fluoreszenz wurde gemäß Beispiel 6 durchgeführt. Die Stimulierung der intrazellulären Penetration wurde als Stimulierungsfaktor mit Bezug auf Liposom ohne PEI ausgedrückt.
Die Zell-Lebensfähigkeit wurde in einer 96-Well-Platte (250 μl liposomale Lösung pro Well) durch einen Test durchgeführt, welcher die alkalische Phosphatase-Aktivität auf Zellmatten („tapis cellulaire"; „cell mats") auswertet (Test mit Paranitrophenylphosphat, n = 6). Die Ergebnisse der Zell-Lebensfähigkeiten wurden als Prozentsatz der lebenden Zellen in Bezug auf eine PEI-freie fluoreszierende Liposom-Kontrolle ausgedrückt. Die Bestimmung von IL1 alpha (Kit Quantikine R & D System) wurde in dem Kulturmedium, das 24 Stunden nach der Inkubation gesammelt wurde, durchgeführt, parallel zu einer Bestimmung der Gesamtproteine (Bradford, Sigma). Die Ergebnisse werden in den Tabellen 6 und 7 wiedergegeben. Tabelle 6: Faktor der intrazellulären Penetration von PFB-F und der Zytotoxizität als Funktion der Zeit und der Konzentration von PEI (n = 4, für jede Bedingung)
Tabelle 7: Bestimmung von IL1-alpha in pg/mg vom Gesamtprotein
Die Ergebnisse zeigen, dass es in diesem Experiment möglich ist, den Penetrationsfaktor des fluoreszierenden Indikators in Gegenwart von PEI bis zu 34-fach zu erhöhen. Jedoch wurde beobachtet, dass bei der Konzentration von 50 μM von 25 kDa PEI mit Wirkung ab 24 Stunden, ein nicht unerhebliches Auftreten an Zytotoxizität beobachtet wurde, wobei bei 48 Stunden mehr als die Hälfte der Zellen tot waren. Was die Synthese von IL1-alpha bei der Konzentration von 50 μM betrifft, liegt die Stimulierung bei 1,6-fach, und bei der Konzentration von 100 μM bei 2,6-fach. Dieses Molekül erzeugt einen signifikanten inflammatorischen Stress.
Beispiel 8: Screening nach Molekülen, welche die intrazelluläre Penetration eines fluoreszierenden Indikators, der in ein Liposom eingebaut ist, stimulieren
Es wurden Liposomen mit 5 % Sojalecithin, 0,01 % PFB-F und 1 – 0,1 – 0,01 % des zu testenden Moleküls, das mit Salzsäure auf pH 7 neutralisiert wurde, wenn erforderlich in Trizma-Verdünnungspuffer, wie in Bespiel 5 beschrieben, zubereitet.
55 Moleküle wurden zunächst 3-fach getestet, im Vergleich zu den 50 μM 25 kDa PEI. Die intrazelluläre Penetration wurde 24 Stunden nach Inkubation mit normalen humanen Fibroblasten, die in 24-Well-Platten kultiviert wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, quantifiziert. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde in einer 96-Well-Platte mit 200 μl liposomaler Suspension bestimmt. Die erzielten Ergebnisse für die Konzentration von 1 % werden in Tabelle 8 (Anhang 2) wiedergegeben. Aus dem durchgeführten Screening wurden 15 Moleküle ausgewählt, da sie in der Lage waren, die intrazelluläre Penetration des fluoreszierenden Indikators mit mehr als 10 % zu stimulieren.
Die Zell-Lebensfähigkeiten waren unterschiedlich (von 37 bis 99 %) bei einer Konzentration von 1 %. Die Visualisierung des fluoreszierenden Indikators bestätigte die Penetration für die Moleküle, welche die Penetration mit mehr als 32 stimulierten. Diese Moleküle wurden bevorzugt weiterverwendet.
Beispiel 9: Einfluss der Struktur der Moleküle auf die Stimulierung der intrazellulären Penetration
Die Zubereitung der Liposomen mit primären Fettmonoaminen mit einer Alkylkettenlänge von 3 bis 18 Kohlenstoffen (Kohlenstoffatomen) und die Quantifizierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Markers wurden, wie in dem vorangehend beschriebenen Beispiel, durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gegeben. Tabelle 9: Stimulierung der intrazellulären Penetration als Funktion der Kohlenstoffkettenlänge
Der Einbau von Fettaminen mit alipathischen Ketten verschiedener Größen in die Membranen der Liposomen, zeigt eindeutig den Einfluss der Länge der Kohlenstoffketten auf die stimulierende Aktivität der intrazellulären Penetration von PFB-F, eingekapselt in Liposomen mit 5 % Lecithin. Es existiert eine grobe Einteilung der Fettsäuren als eine Funktion der Kettenlänge. Danach werden kurze Ketten (weniger als 8 Kohlenstoffe (Kohlenstoffatome)), mittlere Ketten (von 10 bis 18 Kohlenstoffe (Kohlenstoffatome)) und lange Ketten (mehr als 18 Kohlenstoffe (Kohlenstoffatome)) unterschieden. Beim ÜbAusbeuteen dieser Einteilung auf die primären Fettamine, die im Zusammenhang mit dieser Untersuchung getestet wurden, erscheint es, dass die mittleren Ketten solche sind, die ihre Eigenschaft, die intrazelluläre Penetration der Liposomen zu stimulieren, auf die Liposomen übAusbeuteen.
Beispiel 10: Einfluss der sterischen Behinderung auf die intrazelluläre Penetration
Um die Eigenschaften der Moleküle mit einem stimulierenden Effekt auf die intrazelluläre Penetration eines fluoreszierenden Indikators, der in Liposomen mit 5 % Lecithin eingekapselt ist, am besten zu bestimmen, haben wir den Einfluss der sterischen Behinderung auf die potentiell stimulierende Aktivität dieser Moleküle beobachtet. Wir haben dafür die intrazelluläre Penetration von PFB-F, eingekapselt in Liposomen, in Gegenwart von zum einen primären Fettmonoaminen und zum anderen sekundären Fettmonoaminen untersucht. Die Zubereitung der Liposomen mit primären oder sekundären Fettaminen und die Quantifizierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Markers wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle 10 wiedergegeben. Die Diamine ermöglichten keine bessere intrazelluläre Penetration des Markers. Tabelle 10: Stimulierung der intrazellulären Penetration als Funktion der Anzahl an Kohlenstoffketten
Beispiel 11: Einfluss der sterischen Behinderung auf die intrazelluläre Penetration
Indem so vorgegangen wurde, wie insbesondere in Beispiel 9 oder 10 beschrieben wurde, wurde gezeigt, dass die Länge der Kohlenstoffkette nicht der einzige Faktor ist, der die Stimulierung der intrazellulären Penetration des liposomalen Gehalts beeinträchtigt.
Tatsächlich wurde in einem Vergleich der chemischen Strukturen, die in der folgenden Figur dargestellt sind, und die in Liposomen eingekapselt sind, eine Spezifität der Gruppe R gezeigt, die mit der C₁₂-Kohlenstoffkette interferiert.
R_y stellt das hydrolysierte und hydroxypropylierte Sojaprotein dar
R_A stellt das hydrolysierte und hydroxypropylierte Weizenprotein dar
Die quaternisierten Moleküle A oder Y sind Produkte, die dem Fachmann gut geläufig sind. Die sterische Behinderung der eingebauten quaternisierten Moleküle (herkömmliche Moleküle) spielt eine Rolle bei der Stimulierung der intrazellulären Penetration der Liposomen mit Lecithin.
Die Moleküle der folgenden Klassen (Tabelle 11) können beispielsweise bei 1 zum Stimulieren der intrazellulären Penetration in unterschiedlichem Maß bis zu +39 % verwendet werden. Andere quaternisierte Hydrolysate von Molekülen, die aus Mandeln, Erbsen, Kartoffeln oder Algen extrahiert werden, können ebenfalls verwendet werden.
Beispiel 12: Optimierung der Konzentration von funktionalisierenden Molekülen (die die intrazelluläre Penetration stimulieren)
Die Stimulierung der intrazellulären Penetration des fluoreszierenden Indikators wurde optimiert, indem verschiedene Konzentrationen funktionalisierender Moleküle getestet wurden.
Geeigneterweise wurden Liposomen mit 5 % Sojalecithin, 0,01 % PFB-F und 0,5 bis 2,5 % der quaternisierten Sojalösung in Trizma-Verbindungspuffer gebildet. Die intrazelluläre Penetration und die Zytotoxizität wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgewertet. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 12 wiedergegeben. Tabelle 12: Untersuchung der Konzentration eines Moleküls, das sowohl die intrazelluläre Penetration und den Stimulierungsfaktor als auch die Zell-Lebensfähigkeit stimuliert
Die nachgesuchte intrazelluläre Penetration kann demnach als eine Funktion der Konzentration des funktionalisierenden Wirkstoffs und des Maximums der tolerierten Zytotoxizität eingestellt werden.
Beispiel 13: Inflammatorischer Effekt. verglichen zwischen Polyethylenimin und dem ausgewählten quaternisierten Soja
Die Stimulierung der Synthese von Interleukin 1 alpha wird zwischen Liposomen verglichen, die durch 50 μM PEI und durch verschiedene Konzentrationen in Lösung von quaternisiertem Soja funktionalisiert wurden.
Geeigneterweise wurden Liposomen mit 5 % Sojalecithin, 0,01 % PFB-F und 0,5 bis 2,5 % der Lösung aus quaternisiertem Soja oder 50 μM PEI in Trizma-Verdünnungspuffer, gebildet. Der IL-1 alpha-Gehalt wurde mit einem Kit (Quantikine R&D System) ausgewertet, wie in Beispiel 7 beschrieben. Ein Test mit Paranitrophenylphosphat (PNPP) wurde parallel durchgeführt, um die Anzahl der Zellen pro Well auszuwerten. Die Ergebnisse des IL1 alpha-Gehalts wurden mit der erzielten optischen Dichte von PNPP verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 13 wiedergegeben. Tabelle 13: Effekt der funktionalisierenden Moleküle (PEI und quaternisiertes Soja) auf die Synthese von Interleukin 1 alpha
Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Lösung aus quaternisiertem Soja, die vorher ausgewählt wurde, eine Zytotoxizität und einen inflammatorischen Stress induziert, der im Vergleich zu dem Referenzmolekül PEI sehr eingeschränkt ist.
Beispiel 14: Apoptotischer Effekt, verglichen zwischen dem Polyethylenimin und, dem ausgewählten quaternisiertem Soja
Die Stimulierung der Synthese von Interleukin 1 alpha wurde verglichen zwischen Liposomen, die durch 50 μM PEI und durch verschiedene Konzentrationen in Lösung von quaternisiertem Soja funktionalisiert wurden.
Geeigneterweise wurden Liposome mit 5 % Sojalecithin, 0,01 % PFB-F und 0,5 bis 2,5 % der Lösung aus quaternisiertem Soja oder 50 μM PEI, in Trizma-Verdünnungspuffer, gebildet. Der Gehalt an Caspase 1 wurde mit einem Kit (Caspase-1 Colorimetric Assay R&D System) ausgewertet. Es wurde ein Test mit Paranitrophenylphosphat (PNPP) parallel durchgeführt, um die Anzahl der Zellen pro Well auszuwerten. Die Ergebnisse des Caspase 1-Gehalts wurden mit der erzielten optischen Dichte von PNPP verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 14 wiedergegeben. Tabelle 14: Effekt der funktionalisierenden Moleküle auf den Gehalt an Caspase-1
Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Lösung aus dem vorher ausgewählten quaternisierten Soja eine Zytotoxizität und einen apoptotischen Stress induzierte, die/der im Vergleich mit dem Referenzmolekül PEI übermäßig eingeschränkt ist.
Beispiel 15: Beobachtung der Struktur der liposomalen Zusammensetzung aus Beispiel 14 durch Transmissionselektronenmikroskopie
Die Liposomen, die mit 2 % quaternisierter Sojalösung ohne Zugabe eines Wirkstoffs und eines fluoreszierenden Indikators zubereitet wurden, wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet. Eine Negativ-Anfärbung der Liposomen wurde unter Verwenden von Schwermetallsalzen durchgeführt, welche die Doppelschichten der multilamellaren Vesikel aufbrechen. Die Beobachtung wurde mit einem Philips CM120 Transmissionselektronenmikroskop und einer Vergrößerung von 30 bis 60.000 durchgeführt.
Die Beobachtungen ließen die Gegenwart von konzentrischen Lipidschichten, die charakteristisch für multilamellare Strukturen sind, erkennen. Die durchschnittliche Größe der beobachteten Liposomen variierte von 150 bis 250 nm.
Beispiel 16: Stimulierung des Anti-Radikal-Schutzes durch die Verwendung einer Lösung aus quaternisiertem Soja aus Beispiel 11
Es wurden Liposomen mit 5 % Sojalecithin, 0,2 % natürlichem Vitamin E und 2 % quaternisierter Sojalösung aus Beispiel 11 (Molekül Y) zubereitet.
Geeigneterweise wurden 0,4 g natürliches Vitamin E zu 10 g Sojalecithin und 10 ml 96 % Ethanol hinzugefügt. Die Lösung wurde für eine Nacht unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur und im Dunkeln evaporiert. Nach der Evaporation des Ethanols wurden 100 ml deionisiertes Wasser hinzugefügt. Die Mischung wurde bis zur vollständigen Auflösung gerührt.
Die Liposomen wurden dann durch Zugeben von 5 ml der Lecithin-Vitamin E-Lösung, 190 μl (d.h. 2 %) quaternisierte Sojalösung und 4,80 ml 55 mM Trizma-Verdünnungspuffer – 27 ml NaCl, eingestellt auf pH 5, zubereitet und unter magnetischem Rühren im Dunkeln für 30 Minuten gemischt. Die Lösung wurde dann bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten homogenisiert, um die modifizierten Liposomen zu bilden. Die gleiche Lösung wurde ohne die Homogenisierung zubereitet und stellte eine freie Vitamin E-Kontrolle dar.
Die auf natürlichem Vitamin E basierten Liposomen wurden in Gegenwart von 10 μM 25 kDa PEI, um einer Zytotoxizität vorzubeugen, und ebenfalls ohne funktionalisierenden Wirkstoff zubereitet.
Normale humane Fibroblasten wurden in 24-Well-Platten ausgesät und bis zum Zusammenfluss kultiviert. Nach dreimaligem Spülen mit Phosphatpuffer mit Calcium und Magnesium, pH 7,4, (In vitrogen) wurden die verschiedenen Lösungen, auf die Hälfte (d.h. Endkonzentration von Vitamin E von 0,1 %) verdünnt, in Kulturmedium für mindestens 2 Stunden inkubiert. Es wurden Wells mit Kulturmedium allein inkubiert, die als Kontroll-Probe in der folgenden Durchführung dienten. Nach dreimaligem Spülen in Phosphatpuffer mit Calcium und Magnesium, pH 7,4, zum Entfernen der Liposomen und des freien Vitamin E, wurden die Zellmatten in Gegenwart von Dihydrorhodamin 123 (Molecular Probes) in einer Menge von 200 μl/Well einer Lösung, die wie folgt zubereitet wurde: 150 μl einer 1 mM Lösung, aufgelöst in 15 ml HBSS-Puffer, inkubiert. Die Platte wurde bei 490 bis 530 nm auf ihre Fluoreszenz hin gelesen und dann bei 0,8 J/cm² mit UVB bei 912 nm bestrahlt und dann erneut bei derselben Wellenlänge auf die Fluoreszenz hin gelesen. Die Ergebnisse werden in Verhältnissen ausgedrückt:

A: = bestrahlt/nicht bestrahlt (I/NI)
B: = (I/NI Liposom) (I/NI Kontrollprobe)
C: = liposomiertes Vitamin E/freies Vitamin E

Die verwendete fluoreszierende Probe ermöglichte die Auswertung der Gegenwart von intrazellulär reaktiven Sauerstoffintermediaten, da sie passiv durch die Zellmembranen diffundiert, wo sie dann zu kationischem Rhodamin oxidiert werden kann. Die fluoreszierende Probe reagierte zum Beispiel positiv mit Wasserstoffperoxid und Peroxynitriten. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 15 gegeben. Tabelle 15: anti-Radikal-Schutz durch die auf diese Weise modifizierten Liposomen
Die Ergebnisse zeigen an, dass die durch das quaternisierte Sojaprotein funktionalisierten Liposomen es ermöglichen, einen mehr als 20 % höheren protektiven Effekt gegen radikalen Stress zu erzielen, im Vergleich zu nicht funktionalisierten Liposomen, während die mit dem Referenzmolekül PEI funktionalisierten Liposomen keinen protektiven Effekt zeigten, sondern noch zusätzlichen Stress erzeugen.
Beispiel 17: Stimulierung der Depigmentierung durch die Produkte der Erfindung
Es wurden Liposomen gemäß dem folgenden Protokoll zubereitet: 5 % Sojalecithin, zu dem 2 % quaternisierte Sojalösung oder 10 μM PEI hinzugefügt wurde oder nicht hinzugefügt wurde. Die Wirkstoffe wurden ebenfalls co-eingekapselt: Phytolight^® (Coletica, Lyons, Frankreich) ohne Konservierungsstoff bei 0,05 % (Cocktail aus Pflanzenwirkstoffen), 0,05 % Arbutin und 1 mM Catechin (Sigma). Die Moleküle wurden frei appliziert, in 5 % Lecithin-Liposom, in 10 μM PEI funktionalisierten Liposomen oder 2 % quaternisiertem Soja, auf normale humane Melanocyten, die in 24-Well-Platten kultiviert wurden und prä-konfluent (vor der Zusammenlagerung) waren. Die Wirkstoffe, die liposomiert waren oder nicht liposomiert waren, wurden für 66 Stunden bei 37°C unter 5 % CO₂ in MMK2-Medium (Sigma) inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit Phosphatpuffer mit Calcium und Magnesium (Invitrogen) und Extraktion in Phosphatpuffer, der 0,5 % Triton X-100 enthielt, wurde die Tyrosinase-Aktivität durch Bestimmung in Gegenwart von L-DOPA und MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon) quantifiziert. Die Bildung einer MBTH-oquinon-Verbindung wurde durch einen Absorbanzwert bei 490 nm kinetisch quantifiziert. Die Tyrosinase-Aktivität wurde durch den Anstieg (Geschwindigkeit) der Enzymreaktion ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 wiedergegeben. Tabelle 16: Depigmentierungs-Effekt von liposomierten oder nicht liposomierten Wirkstoffen (ausgedrückt in der Geschwindigkeit der Enzymreaktion)
Die Ergebnisse zeigen, dass als Funktion der co-eingekapselten Wirkstoffe, die Funktionalisierung eine Erhöhung der Inhibition der Tyrosinase-Aktivität in vitro auf normale humane Melanocyten ermöglicht. Die Funktionalisierung durch das quaternisierte Soja ist effektiver als die Funktionalisierung durch die Zugabe von PEI für den Komplex aus Pflanzenextrakten, ist äquivalent für Arbutin und ist leicht geringer für Catechin. In jedem Fall liegt die Aktivität mindestens 2,3-fach höher als mit einem nicht funktionalisierten Liposom.
Beispiel 18: Verfahren zum Herabsetzen der Größe der Produkte der Erfindung
Die Größe der Liposomen kann durch die Verwendung eines Hochdruck-Homogenisators (mit einem Arbeitsdruck von mehr als 1.000 bar, bevorzugt mehr als 2.000 bar, stärker bevorzugt mehr als 3.000 bar) herabgesetzt werden. Bei 3.000 bar können mit diesem Gerät Liposomen von ungefähr 50 nm erhalten werden.
Die Größe der Liposomen wurde mit Hilfe eines Laserpartikel-Größenanalysators (Granulometers) (Beckman Coulter, N4 plus, Submicron Particle Size Analyser) und durch Transmissionselektronenmikroskopie, wie in Beispiel 15 beschrieben, analysiert.
Beispiel 19: Darstellung der Penetration von Material welches durch die Produkte der Erfindung befördert wird, nach transkutaner Permeation: Beispiele mit einem fluoreszierenden Indikator, Vitamin E oder genetischem Material
Die Penetration eines fluoreszierenden Moleküls (0,01 % PFP-F), frei oder eingebaut in ein Liposom, wie in Beispiel 12 beschrieben, das 2 % quaternisierte Sojalösung, ausgewählt aus Beispiel 11, umfasste oder nicht umfasste, wurde durch transkutane Permeation auf humaner Haut quantifiziert. Die Diffusionskinetik wurde spektrofluorometrisch von 3 bis 24 Stunden quantifiziert. Die Freisetzung wurde nach 24 weiteren Stunden quantifiziert. Die Einlagerung wurde zuletzt ebenfalls ausgewertet. Die Anzahl der getesteten Proben betrug 5 pro Testbedingung. Die in Tabelle 17 wiedergegebenen erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von Liposomen, die in der Gegenwart von quaternisiertem Soja hergestellt wurden, die Diffusion, die Freisetzung und die Einlagerung des fluoreszierenden Indikators signifikant stimuliert – im Vergleich zu der nicht vektorisierten Form oder der Form, die ohne quaternisierte Substanz vektorisiert wurde. Tabelle 17:
Die Penetration des Vitamin-E-Moleküls (0,5 %), das frei oder in ein Liposom eingebaut war, wie in Beispiel 12 beschrieben, und das 2 % quaternisierte Sojalösung, ausgewählt aus Beispiel 11, umfaßte oder nicht umfaßte, wurde durch transkutane Permeation auf humaner Haut quantifiziert. Die Diffusionskinetik wurde mittels Hochleistungsflüssigchromatographie für die Dauer von 5 bis 24 Stunden quantifiziert. Die Freisetzung wurde nach weiteren 24 Stunden quantifiziert. Die Einlagerung wurde zuletzt ebenfalls ausgewertet. Die erzielten Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die Verwendung von Liposomen, die in der Gegenwart von quaternisiertem Soja hergestellt wurden, die Diffusion, die Freisetzung und die Einlagerung von Vitamin E signifikant stimuliert, im Vergleich zu der nicht vektorisierten Form oder der Form, die ohne quaternisierte Substanz vektorisiert wurde.
Das gleiche Experiment der transkutanen Penetration wurde mit Einbau (oder nicht) von fluoreszierendem genetischem Material (200 mM) in ein Liposom, wie in Beispiel 12 beschrieben, in der Gegenwart einer 2 % Sojalösung durchgeführt. Die Ergebnisse, die durch eine Beobachtung von transversalen Schnitten der Haut durch optische Epifluoreszenzmikroskopie erzielt wurden, zeigen, dass die Verwendung der Liposomen, die in der Gegenwart von quaternisiertem Soja hergestellt wurden, die Diffusion des genetischen Materials bis in die tiefe Dermis ermöglicht.
Sequenz der fluoreszierenden Probe von Duplex- („duplexée"; „duplexed") Elastin 19–20:
Sense: 5'-(FITC) AGCUGCUAAGGCUGGCGCUTT-3'
Antisense: 5'-AGCGCCAGCCU UAGCAGCUTT-3'
Beispiel 20: Verwendung der Produkte der Erfindung in kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen des Öl-in-Wasser-Emulsionstyps
Formulierung 20a:

A Wasser qsp 100

Butylenglycol 2

Glycerin 3

Natriumdihydroxycetylphosphat, Isopropylhydroxycetylether	2
B Glycolstearat SE	14
Triisononaoin	5
Octylcocoat	6
C Butylenglycol, Methylenparaben, Ethylparaben, Propylparaben, pH eingestellt auf 5,5	2
D Produkte der Erfindung	0,01–10 %

Formulierung 20b:

A Wasser qsp 100

Butylenglycol 2

Glycerin 3

Polyacrylamid, Isoparaffin, Laureth-7 2,8

B Butylenglycol, Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben; 2

Phenoxyethanol, 2

Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,5
Butylenglycol
D Produkte der Erfindung	0,01–10%

Formulierung 20c:

A Carbomer	0,50
Propylenglycol	3
Glycerin	5
Wasser	qsp 100
B Octylcocoat	5
Bisabolol	0,30
Dimethicon	0,30
C Natriumhydroxid	1,60
D Phenoxyethanol Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,50
E Duftstoffe	0,30
F Produkte der Erfindung	0,01–10%

Beispiel 21: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Wasser-in-Öl-Typs

APEG 30-dipolyhydroxystearat	3
Caprintriglyceride	3
Cetearyloctanoat	4
Dibutyladipat	3
Traubenkernöl	1,5
Jojobaöl	1,5
Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,5
B Glycerin	3
Butylenglycol	3
Magnesiumsulfat	0,5
EDTA	0,05
Wasser	qsp 100
C Cyclomethicon	1
Dimethicon	1
D Duftstoffe	0,3
E Produkte der Erfindung	0,01–10 %

Beispiel 22: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung eines Dreifach-Emulsionstyps (Tripel-Emulsionstyps)

Erste Emulsion W1/O

A PEG 30-dipolyhydroxystearat	4
Caprintriglyceride	7,5
Isohexadecan	15
PPG-15 Stearylether ("PPG-15 stearul ether")	7,5
B Wasser	65,3
C Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,7

Zweite Emulsion W1/O/W2

A Erste Emulsion 60

B Poloxamer 407 2

Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, 2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol 0,3

Wasser qsp 100

C Carbomer	15
D Triethanolamin	pH 6,0–6,5
E Produkte der Erfindung	0,01–10 %

Beispiel 23: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Lippenstift-Typs und anderen wasserfreien Produkten

A Mineralwachs	17,0
Isostearylisostearat	31,5
Propylenglycoldipelargonat	2,6
Propylenglycolisostearat	1,7
PEG 8 Bienenwachs	3,0
Hydrogeniertes Palmenkernöl Glyceride, hydrogenierte Palmenglyceride	3,4
Lanolinöl	3,4
Sesamöl	1,7
Cetyllactat	1, 7
Mineralöl, Lanolinalkohol	3,0
B Castoröl	qsp 100
Titandioxid	3,9
CI 15850 : 1	0,616
CI 45410 : 1	0,256
CI 19140 : 1	0,048
CI 77491	2,048
C Produkte der Erfindung	0,01–5 %

Beispiel 24: Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung von wässrigen Gelen (Eyeliner, "Amincissants" ("slimmer") usw.)

A Wasser	qsp 100
Carbomer	0,5
Butylenglycol	15
Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,5
B Produkte der Erfindung	0,01–10 %

Beispiel 25: Zubereitung pharmazeutischer Formulierungen, welche das Produkt der Erfindung enthalten
Formulierung 25a: Zubereitung von Tabletten

A Träger in g pro Tablette

Lactose 0,359

Saccharose 0,240

B Produkt der Erfindung 0,001–0,1
Formulierung 25b: Zubereitung einer Salbe

A Träger

Polyethylen geringer Dichte 5,5

Flüssiges Paraffin qsp 100

B Produkt der Erfindung 0,001–0,1
Formulierung 25c: Zubereitung einer injizierbaren Formulierung

A Träger

Isotonische Kochsalzlösung 5 ml

B Produkt der Erfindung 0,001–0,1 g
Phase A und Phase B werden in separate Ampullen verpackt und vor der Verwendung gemischt.
Beispiel 26: Auswertung der kosmetischen Akzeptanz der Produkte der Erfindung
Es wurden toxikologische Tests mit den Verbindungen, die gemäß Beispiel 15 erzielt wurden (ohne Einbau eines Wirkstoffs), durchgeführt, durch eine Haut-Auswertung und eine Okulare Auswertung beim Kaninchen, durch die Untersuchung der Abwesenheit anormaler Toxizität bei oraler Einzelverabreichung an die Ratte und durch die Untersuchung des Sensibilisierungsvermögens beim Meerschweinchen.
Auswertung der Anfangsreizung der Haut beim Kaninchen
Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden ohne Verdünnung mit einer Dosis von 0,5 ml auf die Haut von drei Kaninchen appliziert, gemäß dem Verfahren, das von der Richtlinie der OECD in Bezug auf die Untersuchung "der akute reizende/ätzende Effekt auf der Haut" empfohlen wird.
Die Produkte wurden gemäß den Kriterien eingeteilt, die in der Entscheidung von 1/2/1982, veröffentlicht im Amtsblatt der französischen Republik (das "JORF") vom 21/02/82 definiert sind.
Die Ergebnisse dieser Tests ließen die Schlussfolgerung zu, dass die Zubereitung, welche die Verbindung, die gemäß Beispiel 12 erhalten wurde, enthält, als nicht reizend für die Haut klassifiziert wurde.
Auswertung der Okularen Reizung beim Kaninchen
Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden rein und in einer Einzelverabreichung von 0,1 ml in die Augen von drei Kaninchen eingeträufelt, gemäß dem Verfahren, das durch die Richtlinie der OECD Nr. 405 vom 24. Februar 1987 in Bezug auf die Untersuchung "der akute reizende/ätzende Effekts auf die Augen" vorgeschlagen wurde.
Die Ergebnisse dieses Tests lassen die Schlussfolgerung zu, dass die Zubereitungen als nicht reizend für die Augen angesehen werden können.
Test bezüglich der Abwesenheit anormaler Toxizität durch orale Einzelverabreichung an die Ratte:
Die beschriebenen Zubereitungen wurden in einer oralen Einzelverabreichung mit der Dosis von 5 g/kg Körpergewicht an 5 männliche Ratten und an 5 weibliche Ratten verabreicht, gemäß einem Protokolls, das an die Richtlinie der OECD Nr. 401 vom 24. Februar 1987 angelehnt wurde und an kosmetische Produkte angepasst wurde.
Es wurde festgestellt, dass LD0 und LD50 größer als 5000 mg/kg sind. Die getesteten Zubereitungen werden daher nicht unter den Zubereitungen eingeteilt, die bei Nahrungsaufnahme gefährlich sind.
Auswertung des Haut-Sensibilisierungspotentials beim Meerschweinchen
Die beschriebenen Zubereitungen wurden einem Maximierungs-Test unterworfen, der von Magnusson und Kligmann beschrieben wurde, einem Protokoll, welches in Übereinstimmung mit der Richtlinie Nr. 406 der OECD ist. Die Zubereitungen werden als nicht sensibilisierend bei Kontakt mit der Haut eingeteilt.
Auswertung des Mutagenitätspotentials:
Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit der Richtlinie der OECD Nr. 471 (Richtlinie 92/69/EG).
Die Mutagenese-Tests wurden mit "Salmonella typhimurium" und mit "Escherichia coli" durchgeführt, gemäß dem Verfahrens von Ames et al. (Mutation Research, 1975, 31, 347–364. Fünf Stämme wurden dem Produkt der Erfindung in Minimalmedium, mit oder ohne exogene Systeme der Metabolismus-Aktivierung (um Pro-Mutagene und Direkt-Mutagene zu unterscheiden), ausgesetzt. Nach Inkubation wurden die mutierten Kolonien gezählt und wurden mit der Anzahl an Kolonien verglichen, die unter den Kontrollen spontan mutierten.
Das Produkt der Erfindung weist keinerlei mutagene Aktivität im Sinn der Richtlinie 92/69/EG) auf.
Auswertung des Sensibilisierungspotentials bei gesunden Freiwilligen (Probanden)
Auswertung des allergenisierenden Potentials des Produktes der Erfindung auf ein Panel (eine Gruppe) Freiwilliger (Probanden). Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Marzulli und Maibach (Contact Dermatitis, 1976, 2, 1–17), welches eine Induktionsphase und einen Auslösungstest („épreuve déclenchante"; „triggering test") umfasst. Dieser Test wurde mit einem Panel (einer Gruppe) von 100 gesunden Freiwilligen (Probanden) weiblichen und/oder männlichen Geschlechts, in einem Alter von 18 bis 65 Jahren, mit einem beliebigen Hauttyp, durchgeführt.
Es wurde ein abdeckendes Pflaster ("patch occlusive"; "occlusif patch"), das das Produkt der Erfindung, verdünnt auf 20 %, enthielt, auf das Schultergebiet eines jeden der Freiwilligen (Probanden) appliziert. Die Pflaster wurden für 24 Stunden in direktem Kontakt mit der Haut gelassen und wurden alle zwei Tage für 3 Wochen für insgesamt 9 Applikationen immer wieder appliziert. Nach dem Entfernen eines jeden Pflasters wurden die klinischen Anzeichen einer Reizung und einer Hautsensibilisierung ausgewertet = Induktionsphase.
Nach einem Zeitraum von 2 Wochen wurden andere Pflaster, die das Produkt der Erfindung, verdünnt auf 20 %, enthielten, auf die Haut der Freiwilligen (Probanden) appliziert und für 24 Stunden in direktem Kontakt mit der Hautoberfläche gelassen. Die klinischen Anzeichen einer Reizung und einer Hautsensibilisierung wurden 24, 48 und 72 Stunden nach dem Entfernen des Pflasters ausgewertet = "Anregungs"-Phase ("phase challenge"; "Challenge Phase").
Keiner der 100 Freiwilligen (Probanden), die in diese Untersuchung involviert waren, zeigte klinische Anzeichen einer Reizung oder einer Hautsensibilisierung, weder während der Induktionsphase noch während der Anregungs-Phase.
Unter den eingehaltenen experimentellen Bedingungen, besitzt das Produkt der Erfindung, verdünnt auf 20 %, kein allergenisierendes Potential.

Claims

Hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zum Teil in ihrer Struktur eine Substanz oder eine Mischung aus Substanzen umfassen, die in der Lage ist/sind, die intrazelluläre Penetration von mindestens einem Wirkstoff, der in den hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, zu stimulieren, und die ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polyethylenemin; b) einem primären, sekundären, tertiären oder quaternären Fettmonoamin einer Kohlenstoffkette mit einer Länge von C10 bis C18, vorteilhafterweise einem Monoamin, das eine einzige C10–C18 Fettkette umfasst, vorzugsweise einem primären oder quaternären Monoamin, das eine einzige C10–C18 Fettkette umfasst; c) einem kationischen Polymer, insbesondere einem kationischen natürlichen Polymer oder optional einem kationisch gemachten Polymer oder einem kationischen synthetischen Polymer, wobei die lamellaren Phasen oder Liposomen optional mindestens eine fluoreszierende Verbindung enthalten, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, zum Beispiel Pentafluorbenzoylaminofluorescein, die es ermöglicht, die Penetration zu visualisieren.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das optional kationische natürliche Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chitosan, quaternisiertem Honigpolymer, Weizenproteinen oder quaternisierten Weizenproteinen, Reisprotein oder quaternisiertem Reisprotein, Sojaprotein oder quaternisiertem Sojaprotein, Kollagen oder quaternisiertem Kollagen, Keratin oder quaternisiertem Keratin, Casein oder quaternisiertem Casein, quaternisierter Cellulose oder quaternisiertem Guar.
Lamellare Phasen der Liposomen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Monoamin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Decylamin, Undecylamin, Dodecylamin, Tridecylamin, Tetradecylamin, Pentadecylamin, Octadecylamin oder einer Mischung aus primären Aminen, wie Mischungen aus Kopraaminen, die eine Kohlenwasserstoffkette von C8 bis C18 aufweisen.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie Polyethylenimin enthalten.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lamellaren Phasen oder die Liposomen in der Lipidphase mindestens eine Substanz, die die Membran von Liposomen modifiziert, zum Beispiel ein polares Lipid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Triglycerid, einem polaren Phospholipid oder einem polaren Sphingolipid, einzeln oder in einer Mischung, umfassen.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das oben erwähnte polare Phospholipid ausgewählt ist aus Phosphatidylcholin oder Lecithin, Phosphatidylethanolamin oder Cephalin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin oder Cardiolipin, Phosphatidylinositol, einzeln oder in einer Mischung.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das polare Sphingolipid ausgewählt ist aus einem Ceramid, einem Sphingophospolipid, einem Glycosphingolipid, einzeln oder in einer Mischung.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lamellaren Phasen oder die Liposomen mindestens ein Lecithin in der Lipidphase, extrahiert aus einer natürlichen Quelle, umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Soja, Raps, Sonnenblume, Lupine, Erdnuss, Sesam, Kürbis, Kleieöl, großsamiger Leimdotter, Ringelblume, Leinen (Flachs) und Hanf, einzeln oder in einer Mischung.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lamellenphasen oder die Liposomen in der Lipidphase Cholesterol oder Cholesterylhemisuccinat als eine Substanz umfassen, die die Membranen versteift.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lamellaren Phasen oder Liposomen in der Lipidphase mindestens ein Tensid („surfactant agent") oder einen Oberflächenaktiven Stoff („surfactant") als Substanz umfassen, der die lamellaren Phasen oder die Membran der Liposomen verflüssigt.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine fluoreszierende Substanz oder eine fluoreszierende Komponente enthalten, der/die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, umfassend ungefähr 0,01 Gewichts-% 5-Pentafluorbenzoylaminfluorescein, von der Zusammensetzung, welche die lamellaren Phasen oder Liposomen enthält.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Substanz(en), welche die intrazelluläre Penetration stimuliert/stimulieren, von 0,05 Gewichts-% bis 25 Gewichts% einer Zusammensetzung, welche die hydratisierten lamellaren Phasen oder die Liposomen enthält, liegt.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Substanz(en), welche die intrazelluläre Penetration stimuliert/stimulieren, von 0,5 Gewichts-% bis 2,5 Gewichts% einer Zusammensetzung, welche die hydratisierten lamellaren Phasen oder die Liposomen enthält, liegt.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oben erwähnte Fettmonoamin eine Kohlenstoffkette mit einer Länge von C10 bis C13 aufweist.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oben erwähnte Fettmonoamin ein quaternisiertes primäres Monoamin ist, das eine einzige Fett-Kohlenstoffkette von C10 bis C18 umfasst, bevorzugt von C10 bis C13.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Monoamin quaternisiert ist und ausgewählt ist aus einer Lösung aus Pflanzenprotein, bevorzugt aus Sojaprotein, welches quaternisiert wird nach der Formel des Typs R-N(R₁R₂R₃), wobei R das Pflanzenproteinmolekül symbolisiert, welches hydrolysiert ist oder nicht, hydroxyalkyliert, insbesondere hydroxypropyliert ist oder nicht; R₁ und R₂ unabhängig voneinander eine C1-C6-Kohlenwasserstoffgruppe, bevorzugt Methyl oder Ethyl, sind und R₃ ein Alkylradikal ist, das 10 bis 18 Kohlenstoffatome, und bevorzugt vor allem 12 Kohlenstoffatome (Lauryl), aufweist.
Lamellare Phasen oder Liposomen gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz oder der Wirkstoff, der in den hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen vorhanden ist oder von diesen befördert wird, ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer antiradikalbildenden Substanz, wie Vitamin E, einem Flavonoid, einem Carotinoid, Vitamin C oder deren Derivaten; einer depigmentierenden Substanz, wie Catechin, Hydroquinon, Arbutin, Phytinsäure, Ellagsäue, Vitamin C oder deren Derivaten; einer abbauenden (Schlankheits-) Substanz, wie mindestens einem Xanthin, einer Haut- oder Haar-pigmentierenden Substanz, wie Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, einem Coleus-Extrakt oder deren Derivaten.
Kosmetische oder dermokosmetische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie lamellare Phasen oder Liposomen umfasst, welche mindestens eine Substanz umfassen, die die intrazelluläre Penetration stimuliert, wobei die lamellaren Phasen oder Liposomen und die Substanz, welche die intrazelluläre Penetration stimuliert, wie in einem vorangehenden Ansprüche definiert, in einer Mischung mit einem kosmetisch akzeptablen Träger vorliegen.
Pharmazeutische oder dermopharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie lamellare Phasen oder Liposomen umfasst, die mindestens eine Substanz umfassen, die die intrazelluläre Penetration stimuliert, wobei die lamellaren Phasen oder Liposomen und die Substanz, welche die intrazelluläre Penetration stimuliert, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 17 definiert, in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger vorliegen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Substanz, welche die intrazelluläre Penetration stimuliert, von 0,05 Gewichts% bis 25 Gewichts-% der Endzusammensetzung, bevorzugt von 0,5 Gewichts-% bis 2,5 Gewichts% der Endzusammensetzung, liegt.
Kosmetische oder dermokosmetische Zusammensetzung mit einer anti-Falten-Wirkung, einer anti-Oxidans-Wirkung, einer abbauenden (Schlankeits-) Wirkung, einer Haut-bleichenden Wirkung, einer Haut- oder Haar-pigmentierenden Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass sie hydratisierte lamellare Phasen oder Liposomen umfasst, welche eine Substanz umfassen, die die intrazelluläre Penetration stimuliert, wobei die Substanz und die hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert, sind.
Verfahren zur kosmetischen Pflege, dadurch gekennzeichnet, dass es das Applizieren einer kosmetischen oder dermokosmetischen Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 18, 20 und 21 definiert, auf die betreffenden Zonen der Haut oder des Haares umfasst.
Verfahren zur kosmetischen Pflege nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die kosmetische Pflege ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer anti-Falten-Pflege, einer anti-Oxidans-Pflege, einer abbauenden (Schlankheits-) Pflege, einer Haut-bleichenden Pflege, einer Haut- oder Haar-pigmentierenden Pflege.
Verwendung von hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 17 als kosmetische Substanz, insbesondere zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, insbesondere für eine anti-Falten-Wirkung, eine anti-Oxidans-Wirkung, eine abbauende (Schlankheits-) Wirkung, eine Haut-bleichende Wirkung, eine Haut- oder Haar-pigmentierende Wirkung.
Verfahren zum Durchführen des Screenings nach mindestens einer Substanz, die potentiell in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration einer Substanz oder eines Wirkstoffs, die/der durch die hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen befördert wird, zu stimulieren, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) Zubereiten einer hydro-lipidischen Mischung, welche in der Lage ist, die hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen zu bilden; b) Hinzufügen bzw. Einbauen einer fluoreszierenden Verbindung, welche vorzugsweise in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, vor dem Dispersionsprozess in/zu diese(r) hydrolipidischen Mischung; c) optionales Hinzufügen bzw. Einbauen einer Testsubstanz, ausgewählt aus der Substanz, die potentiell aktiv und die in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration zu stimulieren, und einer Referenzsubstanz in die hydro-lipidische Mischung vor oder während des Dispersionsprozesses; d) Zubereiten der hydratisierten lamellaren Phasen oder der Liposome nach einem beliebigen geeigneten Verfahren zum Bilden der hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen aus der hydro-lipischen Mischung, wie sie entweder in Schritt b) oder in Schritt c) oben erhalten wurde; e) Detektieren von mindestens der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung durch Messung der intrazellulären Fluoreszenz.
Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Ergebnis der intrazellulären Penetration der fluoreszierenden Verbindung verglichen wird mit der intrazellulären Penetration, die mit einer Referenzsubstanz, die insbesondere Polyethylenimin umfasst, erzielt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zytotoxizität und/oder die Induktion von Apoptose der Substanz, die potentiell aktiv ist, bestimmt wird, insbesondere auf Fibroblasten, bevorzugt normalen humanen Fibroblasten, in Kultur.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Verbindung, die in Bezug auf die intrazelluläre Penetration im Wesentlichen inert ist, eine fluoreszierende Verbindung ist, die nicht spontan in Fibroblasten in Kultur penetriert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Verbindung Pentafluorbenzoylaminofluorescein ist oder umfasst, welches bei einer Konzentration von 0,01 Gewichts % der Endzusammensetzung, welche die hydratisierten lamellaren Phasen oder Liposomen enthält, verwendet wird, welche zur Auswertung der intrazellulären Penetration verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Verbindung in Gegenwart von Polyethylenimin eingebaut wird, wobei die fluoreszierende Verbindung und das Polyethylenimin in einer nicht cytotoxischen Konzentration vorliegen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz, die potentiell in der Lage ist, die intrazelluläre Penetration zu stimulieren, ausgewählt ist aus einem primären Fettmonoamin einer Alkyl-Kettenlänge von C10 bis C18, bevorzugt von C10 bis C13, oder einem kationischen Polymer, insbesondere einem natürlichen Polymer, welches optional kationisch gemacht wird, oder einem kationischen synthetischen Polymer, welches in die lamellaren Phasen oder die Liposomen, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 17 definiert, eingebaut bzw. hinzugefügt wird.