DE69937679T2

DE69937679T2 - Wasserlösliche zusammensetzung enthaltend aktive inhaltsstoffe zur depigmentierung der haut

Info

Publication number: DE69937679T2
Application number: DE69937679T
Authority: DE
Inventors: Kenneth N. Broomfield JONES; Abeysinghe Boulder PADMAPRIYA; Gabriele Blume; Ernst E. TEICHMÜLLER
Original assignee: ROVI GmbH; Univera Pharmaceuticals Inc Broomfield; Univera Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Unigen Pharmaceuticals Inc Lacey Washingto Us; Evonik Operations GmbH
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2008-11-20
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: JP2002512948A; WO1999055308A1; EP1073418B1; EP1073418A1; KR20010042964A; US6123959A; ES2299243T3; EP1073418A4; DE69937679D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine wässrige Liposomenzusammensetzung enthaltend aktive Wirkstoffe, die Tyrosinase, ein Enzym, das an der Melaninsynthese beteiligt ist, hemmen, und die Verwendung dieser Zusammensetzung zur Depigmentierung (Gleichung) der Haut.
Hintergrund der Erfindung
Weltweit sind Mittel gefragt, die die übermäßige Pigmentierung der Haut hemmen bzw. unterbinden können. Während im europäischen Markt die Präparate eher für Altersflecken, Leberflecken bzw. Sommersprossen eingesetzt werden, sollen im asiatischen Markt die Schönheitsideale einer weißen makellosen Haut erreicht werden.
Melanin ist das natürliche Pigment der Haut, das je nach Hauttyp (genetischer Disposition) und Umwelteinflüssen in unterschiedlichen Konzentrationen in den Melanozyten synthetisiert wird. Melanozyten sind Zellen, die in der Basalmembran der Epidermis vorkommen und 5–10% des zellulären Anteils darstellen (ca 1200–1500 Melanozyten pro cm²). Durch UV-Licht werden die Zellen der Basalschicht angeregt, sich schneller zu teilen. Gleichzeitig werden auch die Melanozyten stimuliert und bilden verstärkt Melanin. Das Melanin wird dann in die Keratinozyten transportiert, wo es als braune Hautfarbe sichtbar wird.
Die Anzahl der Melanozyten in menschlicher Haut ist unabhängig von der Hautfarbe annähernd gleich. Die Hautfärbung hängt stark von der Menge und vom Typ des gebildeten Melanins ab (schwarzes Eumelanin oder gelbes bis rotbraunes Pheomelanin). Asiaten und hellhäutige Menschen haben einen geringeren Anteil an Eumelanin als dunkelhäutige Personen und sind dementsprechend weniger gegen Strahlungseinflüsse geschützt. Rothaarige Menschen zeichnen sich durch eine Pigmentation mit Pheomelanin aus und besitzen keine Photoprotektion. Darüber hinaus variiert die Verteilung des Melanins in der Haut. Bei hellhäutigen Menschen liegt der größte Anteil des Farbstoffs in der Basalschicht während bei dunkelhäutigen Personen das Melanin bis in die Hornschicht verteilt vorliegt.
Ein Enzym dient als Katalysator, um ein Substrat zu einem Produkt umzusetzen. Bei der kompetitiven Hemmung eines Enzyms durch eine niedermolekulare Substanz verdrängt diese das eigentliche Substrat des Enzyms aus der katalytischen Domäne, so dass das Substrat nicht mehr mit Hilfe des Enzyms umgesetzt werden kann. Bei der nichtkompetitiven Hemmung tritt der Inhibitor zwar ebenfalls direkt mit dem Enzym in Wechselwirkung, jedoch an einer anderen Stelle, als der für die Umsetzung des Substrats benötigten. Die Kombination eines kompetitiven Inhibitors mit einem nichtkompetitiven Inhibitor ist deswegen besonders vorteilhaft, da die Wirkmechanismen der kompetitiven und der nichtkompetitiven Hemmung verschieden sind, was bedeutet, dass die Wirkstoffe unabhängig voneinander auf dasselbe Enzym einwirken können. Die Effekte können sich gegenseitig unterstützen, dies ist allerdings nicht notwendigerweise der Fall. Die Unterscheidung zwischen einem kompetivien und einem nichtkompetitiven Inhibitor kann vom Fachmann ohne weiteres mittles gängiger biochemischer Meßmethoden, wie z. B. der Anwendung des Lineweaver-Burk-Diagramms, getroffen werden.
Die Tyrosinase ist das Schlüsselenzym der Melaninsynthese. Es wird aktiviert, wenn es UV-Bestrahlung ausgesetzt wird, und greift induzierend in mehrere Zwischenstufen der Pigmentbildung ein, wie in Schema 1 dargestellt. Es wurde herausgefunden, dass die Tyrosinase für ihre katalytische Aktivität neben dem Substrat zweiwertige Metallionen benötigt. Die zur Zeit gängigen Verfahren, die Melaninsynthese zu inhibieren, um eine Aufhellung der Haut zu erzielen, beruhen auf Substanzen, die direkt mit der Tyrosinase in Wechselwirkung treten oder indirekt deren Aktivität regulieren, z. B. durch Komplexierung der benötigten Metallionen. Schema 1
Der derzeit bekannteste Wirkstoff für die Depigmentierung ist das Hydrochinon. Dieses führt allerdings bei Applikation über längere Zeit zu gravierenden Nebenwirkungen und wurde aus diesem Grund in einigen Ländern bezüglich seiner Einsatzkonzentration limitiert oder vollständig für den Einsatz in kosmetischen Produkten verboten. Außerdem führt das Hydrochinon zu einer permanenten Entfärbung und damit verbunden zu einer steigenden Lichtempfindlichkeit der Haut gegenüber UV-Strahlung.
Besser verträgliche hautaufhellende Substanzen, die zur Zeit eingesetzt werden, sind natürlichen Ursprungs wie z. B. Arbutin (aus Bärentraubenblättern, Uvae ursi), Licorice-Extrakt (aus der Süßholzwurzel), Ascorbinsäure (Vitamin C; aus Zitrusfrüchten) und deren Derivate und Kojisäure (aus Kohlenhydratlösungen unter Einwirkung bestimmter Bakterien). Diese sehr gut wasserlöslichen Wirkstoffe wirken als kompetitive Inhibitoren an der Tyrosinase, sind jedoch teilweise in kosmetischen Formulierungen instabil und haben den Nachteil, nur in sehr geringen Mengen in die tieferen Hautschichten zu penetrieren, um so zu den Melanozyten in der Basalmembran zu gelangen. Ein weiterer Nachteil dieser Substanzen ist die geringere Wirksamkeit, die nur mit dem Einsatz höherer Konzentrationen kompensiert werden kann. So muss von Ascorbinsäure das 17-fache und von Arbutin mehr als das 100-fache der Menge von Hydrochinon eingesetzt werden, um einen vergleichbaren Wirkeffekt zu erreichen.
Gombert beschreibt zwei kosmetische Produkte zur Aufhellung der Haut, die beide auf pflanzlicher Basis hergestellt werden (Gombert (1997) Cosmetics and Toiletries Manufacture Worlwide, S. 151–157). Beide Produkte enthalten eine Mischung mehrerer kompetitiver Tyrosinase-Inhihbitoren in wässriger Lösung, emulgiert in Cremes. Hier konnte zwar eine effiziente Hemm-Wirkung der verwendeten Stoffe in einem in vitro-Enyzymtest gezeigt werden, jedoch trat eine nachweisliche Depigmentierung der Haut in vivo-Tests erst bei Verwendung von Creme mit 10% Wirkstoffanteil nach minimal 42 Tagen auf. In einem Test mit 10 Versuchspersonen konnte bei Verwendung einer Creme mit 3% Wirkstoffanteil nur bei 2 Personen überhaupt ein positiver Effekt nachgewiesen werden. Der Autor weist ausdrücklich darauf hin, dass die verwendeten Naturstoffe in der fertigen Formulierung extrem instabil sind, so dass starke Antioxidantien in die Formulierung zugegeben werden müssen. Auch kommt es zur Auskristallisierung der Substanzen bei Lagerung der fertigen Formulierung unter 15°C.
Lee und E. Kim (Cosmetics and Toiletries, 51–56, Vol. 110, Oktober 1995) beschreiben ein Isolat aus Wurzelrinde des Papiermaulbeerbaums Broussonetia papyrifera, das als Fänger freier Radikale wirkt. Da die Bildung von Melanin, bezeichnet als Melanogenese, durch freie Radikale in der Haut verstärkt wird, kann diese mit Hilfe eines solchen Radikalfängers reduziert werden. In diesem Artikel wird nicht auf die Depigmentierung dunkler Flecken der Haut eingegangen, sondern auf das Unterdrücken der Melanogenense mit Hilfe eines freien Radikalfängers. Die beschriebene Wirkung tritt darüber hinaus erst nach mehr als 40 Tagen auf. Auch hier wird auf die Instabilität des Wirkstoffes in der Formulierung ausdrücklich hingewiesen.
Die Aloe ist eine komplizierte Pflanze, die viele biologisch aktive Substanzen enthält (Cohen et al. in Wound Healing/Biochemical and Clinical Aspects, 1. Ausg. WB Saunders, Philadelphia (1992)). Über 300 Arten der Aloe sind bekannt, die meisten sind in Afrika beheimatet. Studien haben gezeigt, dass die biologisch aktiven Substanzen in drei unterschiedlichen Bereichen des Aloeblattes angesiedelt sind – ein Bereich, der klares Gel enthält, im Zentrum des Blattes, der Blattrinde oder dem Herzen des Blattes und eine gelbe Flüssigkeit, die in den pericyclischen Zellen der vaskulären Bündel enthalten ist, die zwischen der Blattrinde und dem inneren Gelbereich sitzen, die als das Latex bezeichnet wird. Historisch wurden Aloe-Produkte in dermatologischen Anwendungen für die Behandlung von Verbrennungen, Entzündungen und andere Wunden verwendet. Diese Nutzungen haben einen großen Aufwand an Forschungen hervorgerufen, um die Inhaltsstoffe der Aloe zu identifizieren, die klinische Aktivität besitzen, insbesondere entzündungshemmende Aktivität. (Siehe z. B. Grindley u. Reynolds (1986) J. of Ethnopharmacology 16: 117–151; Hart et al. (1988), J. of Ethnopharmacology, 23: 61–71). Als ein Ergebnis dieser Untersuchungen gab es viele Berichte über Aloe-Inhaltsstoffe, die diverse biologische Aktivitäten, einschließlich Anti-Tumoraktivität, Anti-Magengeschwür-, anti-diabetische und Anti-Tyrosinase-Aktivität (siehe z. B. Yagi et al. (1977) Z. Naturforsch. 32c: 731–734) und antioxidantische Wirkung (siehe Internationale Anmeldung Nr. PCT/US/95/07404 ) aufweisen.
Yagi et al. offenbaren eine Gruppe von Inhibitoren, die aus Aloe isoliert wurden, insbesondere Aloesin und eines seiner Derivatem 2''-O-Feruloylaloesin, die als Inhibitoren der Tyrosinase wirken (Yagi et al. (1987) Plant Medica, 515–517). Durch biochemische Untersuchung der Enzymhemmung mittels des Lineweaver-Burk-Diagramms wird hier gezeigt, dass es sich bei diesem Inhibitor um einen nichtkompetitiven Inhibitor der Tyrosinase handelt. Es wird keine Applikation der Inhibitoren in einem in vivo-Versuch beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine hautverträgliche Zusammensetzung bereitzustellen, die bei äußerlicher Anwendung eine rasche, wirksame und reversible Depigmentierung der Haut zur Folge hat.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet wässrige Zusammensetzungen, enthaltend Liposome aus Phospholipiden und wenigstens einen kompetitiven Inhibitor eines Enzyms der Melaninsynthese in Kombination mit wenigstens einem nichtkompetitiven Inhibitor eines Enzyms der Melaninsynthese, wobei dieser nichtkompetitive Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit den folgenden chemischen Strukturen:
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkoxy, Acyl, Acyloxy, Acylamino und Polyalkoholen oder Derivaten davon, einschließlich Zuckerderivativen, wobei diese Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy-, Acylamino- und Polyalkoholgruppen und Derivate davon gesättigt oder ungesättigt sein können und 1 und 20 Kohlenstoffatome haben. Die Verkapselung der Inhibitoren in ein Liposom verbessert die Bioverfügbarkeit der Inhibitoren und stabilisiert die Verbindungen, die dazu neigen, in wässrigen Lösungen zu hydrolysieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausgewählt um das Enzym Tyrosinase zu hemmen. Die Hemmung der Tyrosinase ist besonders vorteilhaft, da es sich bei der Tyrosinase um eines der Schlüsselenzyme des Melaninstoffwechsels handelt. Somit wird nicht nur der initiative Schritt der Melaninsynthese gehemmt, sondern auch in andere Zwischenstufen des Melaninstoffwechseln regulativ eingegriffen.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist der kompetitive Inhibitor Arbutin und der nichtkompetitive Inhibitor ist Aloesin oder ein Derivat davon. Es wurde herausgefunden, dass sich die hemmenden Effekte addieren, wenn Arbutin in Kombination mit Aloesin oder einem Derivat davon verwendet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die formulierten Inhibitoren pflanzlichen Ursprungs, was die gewünschte angenehme Folge einer besonders hohen Hautverträglichkeit hat.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Depigmentierung der Haut.
Es soll so verstanden werden, dass sowohl die obige allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und erklärend sind und die Erfindung, wie sie beansprucht wird, nicht einschränken sollen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet wässrige Zusammensetzungen enthaltend Liposome aus Phospholipiden und wenigstens einen kompetitiven Inhibitor eines Enzyms der Melaninsynthese in Kombination mit wenigstens einem nichtkompetitiven Inhibitor eines Enzyms der Melaninsynthese, wobei dieser nichtkompetitive Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit den folgenden chemischen Strukturen:
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkoxy, Acyl, Acyloxy, Acylamino und Polyalkoholen oder Derivaten davon, einschließlich Zuckerderivativen, wobei diese Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy-, Acylamino- und Polyalkoholgruppen und Derivate davon gesättigt oder ungesättigt sein können und 1 und 20 Kohlenstoffatome haben. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausgewählt um das Enzym Tyrosinase zu hemmen, da es bei der Tyrosinase um eines der Schlüsselenzyme des Melaninstoffwechsels handelt. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Depigmentierung der Haut.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch eine oder mehrere zusätzliche aktive Substanzen für die Depigmentierung beinhalten, die unabhängig von den anderen aktiven Substanzen, die in der Zusammensetzung enthalten sind, agieren.
Bestimmte Begriffe, die verwendet werden um die Erfindung zu beschreiben, werden wie folgt definiert:
Ein „kompetitiver Inhibitor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Substanz, die die Aktion eines Enzyms, das an der Synthese von Melanin beteiligt ist, verhindert, indem es reversibel mit dem aktiven Zentrum des Enzyms interagiert. Ein kompetitiver Inhibitor vermindert so die Katalyserate, indem er die Anteile an Enzymmolekülen verringert, die an das Substrat gebunden haben. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Enzym Tyrosinase. Die kompetitiven Inhibitoren für Tyrosinase, die in der Zusammensetzung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen alle solche Inhibitoren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Vorzugsweise umfassen die kompetitiven Inhibitoren, die in der Zusammensetzung und dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können, sind aber nicht beschränkt auf, Arbutin, Vitamin C und seine Derivate, Kojisäure, Glutathion, Licorice-Extrakt und Maulbeerbaum-Extrakt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der kompetitive Inhibitor Arbutin, für den, wie unten beschrieben, eine additive Hemmwirkung gezeigt worden ist, wenn er in Kombination mit Aloesin oder einem Derivat davon verwendet wird.
Ein „nichtkompetitiver Inhibitor" bezieht sich auf eine Substanz, die an eine andere Stelle als dem aktiven Zentruf des Enzyms bindet. So können ein Enzym und ein nichtkompetitiver Inhibitor gleichzeitig an ein Substrat binden. Ein nichtkompetitiver Inhibitor wirkt, indem er die Umsatzrate eines Enzyms herabsetzt.
Die nichtkompetitiven Inhibitoren der vorliegenden Erfindung umfassen Aloesin, das durch folgende chemische Formel veranschaulicht wird,
und Derivate davon, ausgewählt aus Verbindungen, die die folgenden chemischen Strukturen haben:
worin R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkoxy, Acyl, Acyloxy, Acylamino und Polyalkoholen oder Derivaten davon, einschließlich, nicht jedoch beschränkt auf, Zuckerderivative, wobei diese Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy-, Acylamino- und Polyalkoholgruppen und Derivate davon gesättigt oder ungesättigt sein können und 1 und 20 Kohlenstoffatome haben;
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkoxy, Acyl, Acyloxy, Acylamino und Polyalkoholen oder Derivaten davon, einschließlich, nicht jedoch beschränkt auf, Zuckerderivative, wobei diese Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy-, Acylamino- und Polyalkoholgruppen und Derivate davon gesättigt oder ungesättigt sein können und 1 und 20 Kohlenstoffatome haben;
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkoxy, Acyl, Acyloxy, Acylamino und Polyalkoholen oder Derivaten davon, einschließlich, nicht jedoch beschränkt auf, Zuckerderivative, wobei diese Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy-, Acylamino- und Polyalkoholgruppen und Derivate davon gesättigt oder ungesättigt sein können und 1 und 20 Kohlenstoffatome haben; und
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkoxy, Acyl, Acyloxy, Acylamino und Polyalkoholen oder Derivaten davon, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zuckerderivative, wobei diese Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy-, Acylamino- und Polyalkoholgruppen und Derivate davon gesättigt oder ungesättigt sein können und 1 und 20 Kohlenstoffatome haben.
Die R-Substituenten haben die Aufgabe, die Verbindung in der Formulierung zu stabilisieren, die Effizienz des Inhibitors zu vergrößern und die Penetration der Verbindung in die Haut zu verbessern.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Aloesin-Derivat ausgewählt aus der Gruppe der Verbindungen, die die folgende chemische Struktur haben:
worin R₁, R₂ und R₃ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff-; Hydroxyl-, Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Acylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Acylogruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Acylaminogruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Polyalkoholgruppen, wobei jede der genannten Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy- und Acylaminogruppen gesättigt, ungesättigt und substituiert sein kann; und
R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aromatischen substituierten Carbonsäuren, die an den verbrückenden Sauerstoff über den Carboxylkohlenstoff gebunden ist wodurch der Ester gebildet wird, wobei diese Carbonsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus, aber nicht beschränkt auf, Phenylessigsäure, DOPA, Tyrosin und Zimtsäure und deren Derivate, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Ferulasäure. R₄ kann auch der Rest der Kojisäure sein, obwohl es sich hierbei nicht um eine Carbonsäure im eigentlichen Sinne handelt (Kojisäure weist keine Carboxylgruppe auf).
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die genannten Acylgruppen hydroxysubstituiert und die genannten Acyloxygruppen werden von Fettsäuren und Dicarbonsäuren erhalten.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der nichtkompetitive Inhibitor Octylaloesin, das die folgende chemische Struktur hat:
oder das 2''-O-Feruloylaloesin (R₁ = OH, R₂ und R₃ = CH₃, R₄ = Rest der Ferulasäure in obiger Formel V). Insbesondere das Octylaloesin hat gegenüber dem unsubstituierten Aloesin eine deutlich erhöhte inhibierende Wirkung auf die Tyrosinase, so dass es in wesentlich geringeren Konzentrationen eingesetzt werden kann.
Andere nichtkompetitive Inhibitoren des Tyrosins, die dem Fachmann bekannt sind, können in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet werden.
„Liposomen" sind kugelförmige Gebilde (Vesikel), die im Wesentlichen Phospholipidmoleküle umfassen, die zwei hydrophobe Schwänze enthalten, welche aus Fettsäureketten bestehen. Wenn sie mit Wasser in Verbindung kommen, reihen sich diese Moleküle spontan auf, um kugelförmige Doppelschichtmembranen zu bilden, wobei sich die lipophilen Enden der Moleküle in jeder Schicht im Zentrum der Membran aneinander anlagern und die gegenüberliegenden polaren Enden die innere bzw. äußere Oberfläche der Doppelschichtmembran(en) bilden. Dadurch weist jede Seite der Membran ein hydrophile Oberfläche auf, während das Innere der Membran ein lipophiles Medium umfasst. Diese Membranen können um einen inneren wässrigen Hohlraum in einer Reihe von konzentrischen, kugelförmigen Hüllen, getrennt durch dünne Wasserfilme, angeordnet sein, in einer Weise, die den Schichten einer Zwiebel nicht unähnlich ist.
Die Phospholipide, die in der Zusammensetzung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen alle Phospholipide, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, die verwendet werden können, um Liposome herzustellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Phosphoglyceride. Phosphoglyceride bestehen aus einem Glyceridgrundgerüst, ein oder zwei Fettsäureketten und einem Phosphat oder phosphorylisiertem Alkohol. Die Haupt-Phophoglyceride sind Derivate von Phosphatidat. Beispiele für Phosphatidylgruppen, die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phosphatidylcholin, Lyso-Phosphatidylcholin, Phosphatidylsäure, Phosphatidylethanolamin und verschiedene Kombinationen davon. Beispiele für Fettsäurereste, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Linolsäure, Ölsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure. Hydrierte Phopholipide können in den Zusammensetzungen dieser Erfindung auch verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Liposomen, die aus Sojaphospholipiden hergestellt werden, verwendet.
Liposomen werden verwendet, um Arzneimittel bereitzustellen, die in ihrer freien Form giftig sind, und um Arzneimittel über einen verlängerten Zeitraum freizusetzen, um die Häufigkeit der Gabe zu verringern. Darüber hinaus können Liposomen verwendet werden, um wässrige Dispersionen von hydrophoben oder amphiphilen Arzneimitteln zu bilden. Da die Vesikel einen amphiphilen Charakter haben, können die verkapselten Substanzen ihre favorisierte Umgebung auswählen. In der vorliegenden Erfindung sind sowohl der kompetitive als auch der nichtkompetitive Inhibitor in Liposomen verkapselt. Die Liposomen dienen sowohl dazu die Bioverfügbarkeit der Inhibitoren in Bezug auf die Melanocyten in der Basalschicht der Haut zu verbessern als auch dazu die Inhibitoren, die dazu neigen in wässrigen Lösungen zu hydrolysieren, zu stabilisieren. Insbesondere die Stabilität der pflanzlichen hautbleichungsaktiven Substanzen wird durch die Verkapselung in den Lipidvesikeln bis um das Vierfache erhöht. Darüber hinaus hemmen einige der Fettsäuren, die in den Liposomen vorliegen, z. B, die Linolensäure, auch die Melaninsynthese und unterstützen so die Depigmentierung. (Maeda und Fukuda (1991) J. Soc. Cosmet. Chem. 42: 361–368). Die Vesikelgröße der Liposome gemäß dieser Erfindung liegt zwischen 80 bis 400 nm im Durchmesser.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Inhibitoren in einer Konzentration von 0,05 bis 7,5 Gew.-% des kompetitiven Inhibitors und 0,05 bis 1,5 Gew.-% des nichtkompetititven Inhibitors eingesetzt, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die Inhibitoren eingesetzt in einer Konzentration von 3,5 bis 5,5 Gew.-% für den kompetitiven und 0,75 bis 1,25 Gew.-% für den nichtkompetititven Inhibitor, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. Werden Arbutin in Kombination mit Aloesin oder einem Derivat davon als Inhibitoren eingesetzt, so sind die bevorzugten Konzentrationen 3,5 bis 5,5 Gew.-% Arbutin und 0,75 bis 1,25 Gew.-% Aloesin oder Aloesinderivat. Insbesondere bevorzugt ist eine wässrige Zusammensetzung, die ca. 4 Gew.-% Arbutin und ca. 1 Gew.-% Aloesin oder Aloesinderivat enthält, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Der Phospholipidanteil der wässrigen Zusammensetzung beträgt vorzugsweise 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Phospholipidanteil von 8 bis 12 Gew.-%. Es kommen vorzugsweise Liposomen aus Phospholipiden aus Soja mit einem Phosphatidylcholinanteil von mindestens 73 Gew.-% zum Einsatz; besonders bevorzugt ist ein Phosphatidylcholinanteil von 73 bis 79 Gew.-%. Beispiele von Phospholipidfraktionen, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, a) 73 bis 79 Gew.-% Phosphatidylcholin, 0 bis 6 Gew.-% Lyso-Phosphatidylcholin, etwa 8 Gew.-% Phosphatidsäure, etwa 4 Gew.-% Phosphatidylethanolamin und etwa 9 Gew.-% andere Lipide; b) 90 bis 96 Gew.-% Phosphatidylcholin und 0 bis 6 Gew.-% Lyso-Phosphatidylcholin; oder c) mindestens 95 Gew.-% Phosphatidylcholin und höchstens 2 Gew.-% Lyso-Phosphatidylcholin.
Die Fettsäurereste der Sojaphospholipide stammen größtenteils von ungesättigten Fettsäuren, wobei Linolsäure den Hauptanteil ausmacht. Die folgende ist eine typische Fettsäurezusammensetzung: 61 bis 71% Linolsäure, 3 bis 7% Linolensäure, 6 bis 13% Ölsäure, 10 bis 15% Palmitinsäure und 1,5 bis 4% Stearinsäure.
Es können auch hydrierte Phospholipide mit einem Phosphatidylcholinanteil von mindestens 73 Gew.-%, vorzugsweise 75 bis 95 Gew.-% verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann neben den bereits genannten Bestandteilen einen oder mehrere Alkohole in Konzentrationen von insgesamt bis zu 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthalten. Die Alkohole, die verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Ethanol und Isopropanol. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der verwendete Alkohol Ethanol.
Neben einem Alkohol kann die wässrige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch ein Konservierungsmittel enthalten. Geeignete Konservierungsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Formaldehyd, Paraben und Euxyl^® K400. Ist das Konservierungsmittel zusammen mit dem Alkohol vorhanden, so beträgt der Alkoholanteil üblicherweise 1 bis 4 Gew.-%.
Der pH-Wert der erfindungsgemäßen Zusammensetzung liegt im Allgemeinen in einem Bereich von 5 bis 7,5. Der physiologisch ideale pH-Wert für die Haut wird durch die jeweilige Anwendung bestimmt. Zur Einstellung des pH-Werts kann die wässrige Zusammensetzung auch ein Puffersystem, wie beispielsweise einen Phosphatpuffer (KH₂PO₄/Na₂HPO₄) enthalten.
Die Zusammensetzung kann neben den genannten Stoffen weitere Hilfsstoffe enthalten, die bei der Formulierung kosmetischer Produkte üblich sind. Diese Substanzen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
In der besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als kompetitiven Inhibitor Arbutin in einer Menge von ca. 4 Gew.-%, und als nichtkompetitiven Inhibitor Aloesin oder ein Derivat davon in einer Menge von ca. 1 Gew.-%, einen Alkohol in einer Menge von ca. 16 Gew.-% und Phospholipide in einer Menge von ca. 10 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können nach jedem dem Fachmann bekannten Verfahren zur Herstellung von Liposomendispersionen hergestellt werden. (Siehe z. B. "Liposomes – A Practical Approach", herausgegeben von R. C. New (Oxford University Press 1990). Alkoholhaltige wässrige Zusammensetzungen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können beispielsweise hergestellt werden, indem man zunächst die wasserlöslichen Inhibitoren in destilliertem Wasser und die Phospholipide und gegebenenfalls wasserunlösliche Inhibitoren in einem Teil des Alkohols löst. Die entstandene Lipidlösung wird langsam zu der wässrigen Lösung gegeben, während die Mischung gerührt wird. Die spontan entstandenen Liposomen, in welchen die Wirkstoffe eingeschlossen sind, werden dann unter Energiezufuhr zerkleinert, z. B. durch Rühren bei hohen Umdrehungszahlen, durch Hochdruckfiltration, Ultraschallbehandlung, Extrudieren oder Homogenisieren. Der Rest des Alkohols und gegebenenfalls weiteres Wasser, das z. B. ein Puffersystem enthält, werden dann zugegeben, und die Mischung wird nochmals gerührt, bis die gewünschte Teilchengröße und Größenverteilung der Liposomen (Polydispersität vorzugsweise < 1,0) erreicht ist.
Je nach Verwendungszweck kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung vor einer Anwendung mit Wasser weiter verdünnt werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden zur Depigmentierung der Haut verwendet, indem die Formulierung gleichmäßig auf die zu bleichende Hautoberfläche aufgetragen (topische Verwendung). Auf diese Weise kann die Zusammensetzung sowohl zur großflächigen Aufhellung der Haut als auch zur gezielten Gleichung von Bereichen mit starker Pigmentierung wie etwa Sommersprossen, Alters- und Leberflecken eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Formulierung in Cremes oder Lotionen verwendet.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann eine sehr viel raschere Depigmentierung der Haut (sichtbar innerhalb von 10 bis 14 Tagen) erreicht werden als es mit bisher beschriebenen Formulierungen möglich war. Dies ist ein Ergebnis aus dem additiven Effekt der Kombination des kompetitiven und der nichtkompetitiven Inhibitioren und der erhöhten Bioverfügbarkeit und der Stabilität der aktiven Substanzen, resultierend aus der Verkapselung in einem Liposom. Außerdem ist die Depigmentierung darüber hinaus aufgrund der Wirkmechanismen der verwendeten Inhibitoren reversibel, ohne dass eine Fleckenbildung der Haut zu verzeichnen ist.
Der additive Effekt der Inhibitoren und die gesteigerte Bioverfügbarkeit der aktiven Substanzen senkt auch die Dosis des Inhibitors, die nötig ist, um die Haut zu depigmentieren, auf ein Level, das keinerlei dosisabhängige Nebeneffekte herbeiführt. Wenn sie alleine verwendet werden, ist es für die hydrophilen Wirkstoffe schwierig in die Hautschicht zu penetrieren, was der Grund dafür ist, dass sie in bisher beschriebenen Formulierungen in relativ hohen Dosen vorliegen mussten.
Beispiel 1 beschreibt die Herstellung einer wässrigen Liposomendispersion, die Arbutin und Aloesin enthält.
Beispiel 2 beschreibt eine in vivo Untersuchung, in der die Zusammensetzung gemäß Beispiel 1 verwendet wird. Diese in vivo Untersuchung zeigt, dass ein deutlich höheres Level der Depigmentierung der Haut nach UV-Bestrahlung nach Anwendung von in Liposomen verkapselten aktiven Inhaltsstoffen erreicht werden kann als mit den gleichen nicht-verkapselten Substanzen in wässrigen Lösungen.
Beispiel 3 beschreibt einen in vitro Tyrosininhibierungsassay, in dem die Inhibitoren Arbutin und Aloesin, sowohl allein als auch in Kombination verwendet werden. In diesem Beispiel wurde der Umsatz von L-DOPA, einem Substrat der Tyrosinase, zu Dopachrom durch Absorptionsmessung von Licht bei 475 nm verfolgt. Dieses Bespiel zeigt, dass die Kombination von Aloesin und Arbutin einen additiven Effekt hat, und diese somit kombiniert eine größere Hemmung der Tyrosinase bewirken als jeder Inhibitor einzeln. Dies ist keineswegs ein erwartetes Ergebnis, da die Kombination der beiden Wirkungsprinzipien der kompetitiven und der nichtkompetitiven Hemmung aufeinander nicht notwendigerweise additiv wirkt.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren, indem sie die hohe Wirksamkeit der Zusammensetzung veranschaulichen. Sie werden nur zu Beschreibungszwecken bereitgestellt und sollen den Bereich der Erfindung nicht einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung einer arbutin- und aloesinhaltigen wässrigen Liposomendispersion

Tabelle 1 fasst die Materialien und Mengen zusammen, die für jeden Schritt der Herstellung einer wässrigen Liposomendispersion verwendet wurden, die Arbutin und Aloesein enthält. Kurz zusammengefasst wurden Aloesin und Arbutin in Wasser gelöst (Schritt A). Die Phospholipide wurden in Alkohol (33 g) gelöst (Schritt B). Die alkoholische Lipidlösung aus Schritt B wurde innerhalb von 17 min bei 9°C unter Rühren (2700 U/min) zu der wässrigen Lösung aus Schritt A getropft. Es wurden weitere 20 min unter den gleichen Bedingungen weiter gerührt. Dann wurde zusätzlicher Alkohol zugegeben (Schritt C) und die Mischung weitere 10 min gerührt. wurde Eine Pufferlösung (KH₂PO₄ und NaOH) wurde wie in Schritt D beschrieben hergestellt und zu der Dispersion hinzugegeben und die Mischung wurde für weitere 10 min gerührt. Der pH-Wert der so hergestellten Liposomendispersion betrug 6,83, der mittlere Durchmesser der Liposomen 158,6 nm und die Polydispersität war 0,226. Tabelle 1 Zusammenfassung der Herstellung einer Liposomendispersion, enthaltend Arbutin und Aloesin

Schritt	Menge	Rohstoff
A	648,20 g	destilliertes Wasser
	10,00 g	Aloesin
	40,00 g	Arbutin
B	100,00 g	Phospholipide*
	33,30 g	Ethanol (rein)
C	132,00 g	Ethanol (rein)
D	30,00 g	destilliertes Wasser
	5,00 g	KH₂PO₄
	1,50g	wässrige NaOH-Lösung (30%ig)
	1.000,00 g
* Phospholipidfraktion (erhältlich von Fa. Nattermann, Deutschland)
	Phosphatidylcholin	(73–76 Gew.-%)
	Lyso-Phosphatidylcholin	(0–6 Gew.-%)
	Phosphatidsäure	(< 8 Gew.-%)
	Phosphatidylethanolamin	(< 4 Gew.-%)
	andere Lipide	(ca. 9 Gew.-%)
	(Gehaltsangaben bez. auf Trockensubstanz)

Beispiel 2: In vivo-Untersuchung der Depigmentierung der Haut durch die Zusammensetzung gemäß Beispiel 1
Die Zusammensetzung aus Beispiel 1 wurde in zwei unterschiedlichen Konzentrationen getestet: unverdünnt (100%) und mit Wasser im Verhältnis 1:1 (50%) verdünnt. Als Vergleichsformulierungen wurden drei wässrige Lösungen hergestellt: Kontrolllösung 1, die aus einer wässrigen Lösung mit den gleichen Wirkstoffgehalten (Arbutin und Aloesin) in der gleichen Konzentration wie die Zusammensetzung aus Beispiel 1 aber ohne Phospholipide, oder formuliert als Liposome, als Kontrolllösung 2, welches ansonsten dieselbe war wie Kontrolllösung 1, und Kontrolllösung 3, welche aus einer Liposomendispersion analog zu Beispiel 1 aber ohne die Wirkstoffe (Arbutin und Aloesin) hergestellt wurde. Die insgesamt 5 Formulierungen wurden auf den Unterarmen von 4 hellhäutigen Probanden (Hauttyp II) in definierten Mengen (20 μl) 2 × täglich, morgens und abends, aufgetragen. Die Formulierungen wurden 30 Minuten auf der Haut belassen, dann wurden die Auftragsstellen mit einem Philips UV-Bräunungsstrahler HB311 (UV-A Strahlung mit geringem Anteil an UV-B) für jeweils 25 Minuten bestrahlt. Innerhalb von 10–14 Tagen Versuchsdauer war an den Stellen, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen behandelt wurden, ein Depigmentierungseffekt mit bloßem Auge zu erkennen. Dieser Effekt konnte bei beiden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung deutlich beobachtet werden. An den mit den Vergleichslösungen behandelten Stellen konnte innerhalb der Versuchsdauer kein mit bloßem Auge sichtbarer Effekt beobachtet werden. Die Depigmentierung bei den mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen behandelten Probanden war über 14 Tage nach Absetzen der Applikation der Wirkstoffe mit bloßem Auge sichtbar und schwächte dann ab. Eine Fleckenbildung konnte nicht ausgemacht werden.
Beispiel 3: In vitro-Enzymaktivitätsmessung der Tyrosinase in Gegenwart von Arbutin und Aloesin
Es wurde ein in vitro-Tyrosinase-Inhibierungsassay (modifiziert nach der Methode von Pomerantz, J. Biol. Chem., 238, 2351–2357, 1963) durchgeführt. Gemäß dieser Methode wurde der Umsatz von L-DOPA, einem Substrat von Tyrosinase, zu Dopachinon und anschließend zu Dopachrom durch Absorptionsmessung bei 475 nm in einem Spektralphotometer verfolgt. Da die farbige Substanz Dopachrom Licht der Wellenlänge 475 nm absorbiert, kann eine quantitive Messung des zeitabhängigen Umsatzes, und somit die Aktivität der Tyrosinase, erfolgen.
Alle Proben hatten ein Endvolumen von 1,5 ml. Jede Probe wurde in einem auf pH 6,8 eingestellten 50 mM Kaliumphosphat-Puffer angesetzt und durch Zusatz von 10% DMSO stabilisiert. Je Ansatz wurden 48 u (= "units", stellt die Aktivitätseinheit eines Enzyms dar, gemessen in mM Substratumsatz pro Minute) Tyrosinase eingesetzt. Für jeden Inhibitor wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt, wobei zwei unterschiedliche Ausgangskonzentrationen von L-DOPA verwendet wurden, einmal 0,4 mM und einmal 0,2 mM. Es wurden auch Kontrollen durchgeführt, indem dieselben Konzentrationen an ungehemmter Tyrosinase verwendet wurden. In den Kontrollproben wurde das Zugabevolumen des Inhibitors durch 50 mM Kaliumphosphat-Puffer ersetzt. Die zeitabhängige Absorptionsänderung und somit der Umsatz des L-DOPA wurde jeweils über 2 min verfolgt.

Die Umsatzkinetik der Tyrosinase wurde bei Zugabe folgender Inhibitor-Konzentrationen gemessen: Arbutin 0,9 mM; Aloesin 0,0192 mM, 0,0385 mM und 0,0769 mM, und bei der jeweiligen Kombination beider Inhibitoren. Die Inhibierung des Enzyms wurde aus der Differenz der gehemmten zur ungehemmten Kinetik bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Es muss nicht weiter ausgeführt werden, dass die hier untersuchte Zusammensetzung keine Liposomen enthielt, da die Penetrationsfähigkeit und Bioverfügbarkeit bei einem in vitro-Test bedeutungslos sind. Der Zweck dieser in vitro Tests war es die Wirksamkeit der Inhibitoren (Arbutin und Aloesin) einzeln und in Kombination zu bestimmen. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, kann ein mehr oder weniger additiver Enzyminhibierungseffekt bei allen gemessenen Konzentrationen erreicht werden.

Tabelle 2. Zusammenfassung dertion des Inhibitors und Konzentra % Hemmung der Tyrosinase
Inhibitor	Konzentration (mM)	% Hemmung Tyrosinase
Arbutin	0,9	29%
Aloesin	0,0192	20
Aloesin	0,0385	32%
Aloesin	0,0769	46%
Arbutin Aloesin	0,9 0,0192	53%
Arbutin Aloesin	0,9 0,0385	61%
Arbutin Aloesin	0,9 0,0769	73%

Claims

Eine wässrige Zusammensetzung enthaltend Liposome aus Phospholipiden und wenigstens einen kompetitiven Inhibitor eines Enzyms der Melaninsynthese in Kombination mit wenigstens einem nichtkompetitiven Inhibitor eines Enzyms der Melaninsynthese, wobei dieser nichtkompetitive Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit den folgenden chemischen Strukturen:
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkoxy, Acyl, Acyloxy, Acylamino und Polyalkoholen oder Derivaten davon, einschließlich Zuckerderivativen, wobei diese Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy-, Acylamino- und Polyalkoholgruppen und Derivate davon gesättigt oder ungesättigt sein können und 1 und 20 Kohlenstoffatome haben.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Enzym Tyrosinase ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei diese kompetitiven und nichtkompetitiven Inhibitoren pflanzlichen Ursprungs sind.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der nichtkompetitive Inhibitor Aleosin oder ein Aleosinderivativ ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der folgenden chemischen Struktur:
worin R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, OH, Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Acylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Acyloxygruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Acylaminogruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und Polyalkoholgruppen, wobei jede der Alkyl-, Alkoxy-, Acyl-, Acyloxy- und Acylaminogruppen gesättigt, ungesättigt und substituiert sein kann, und R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aromatischen substituierten Carbonsäuren, die an den verbrückenden Sauerstoff über den Carboxylkohlenstoff gebunden sind, wodurch der Ester gebildet wird, wobei diese Carbonsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Phenylessigsäure, DOPA, Tyrosin und Zimtsäure und deren Derivate, Ferulasäure und Kojisäure.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der nichtkompetitive Inhibitor Aleosin oder Octylaloesin ist.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der kompetitive Inhibitor Arbutin ist.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, außerdem enthaltend einen oder mehrere Alkohole in einer Menge von bis zu 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, außerdem enthaltend eine oder mehrere zusätzliche aktive Substanzen zur Depigmentierung.
Verwendung der wässrigen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur reversiblen Depigmentierung der Haut.