FI111014B - Kationisten lipidien ja kationisten polymeerien synergiaan perustuva geenitransfektion menetelmä - Google Patents

Description

-1 - 111014

Katumisten lipidien ja kationisten polymeerien synergiaan perustuva t geenitransfektion menetelmä ·· 5

Keksinnön alue

Kuvattu keksintö on geenisiirtoon, mukaan lukien humaanien sairauksien geeniterapia, tarkoitettu synergistinen menetelmä. Keksintö koskee kationisten lipidien (esim. 10 Dosper) ja kationisten polymeerien (esim. PEI tai polyetyleeni-imiinit) kombinaatioiden käyttöä ja valmistamista DNA:n tai RNA:n tai synteettisten nukleiinihappojen (mukaan lukien paljaat nukleiinihapot, genominen tai ei-genominen DNA, nonviraaliset ekspressioplasmidit ja viraaliset vektorit) siirtämiseksi isäntäsoluihin in vitro ja in vivo. Tämä keksintö koskee myös kaikkien kuvattujen 15 kombinaatioiden käyttöä geenien siirtoon, ekspressioon, korjaamiseen, aktivointiin, inhibiitioon ja säätelyyn, kun tarkoitukseen käytetään kationisten liposomien ja kationisten polymeerien spesifistä yhdistelmää. Lisäksi kuvattu keksintö käsittää muiden molekyylien ja yhdisteiden siirtämisen soluihin, erityisesti negatiivisesti ‘ varautuneiden, kun tarkoitukseen käytetään kationisten liposomien ja kationisten 20 polymeerien kombinaatiota, ja erityisesti terapeuttisessa tarkoituksessa.

I r t

Keksinnön taustaa 25 Geeniterapia on potentiaalinen tekniikka geneettisten ja hankittujen sairauksien hoitamiseksi. Tämän terapian tavoitteena on koijata patofysiologinen häiriö viemällä potilaan kohdesoluihin terapeuttisia geenejä1. Geeniterapia voi olla spesifisempää ja • * * selektiivisempää, ja pitkäkestoisempaa hoidollisesti kuin perinteinen lääkehoito. Geeniterapia voi myös mahdollistaa sairauden varsinaisen syyn hoitamisen pikemmin * 30 kuin seurausten ja oireiden.

Viraalinen ja nonviraalinen geenien siirto ovat olleet kaksi perustavaa menetelmää 111014 -2- terapeuttisten geenien siirtämiseksi isäntäsoluihin. Yleisesti, nonviraaliset vektorit ovat olleet tehottomampia kuin viraaliset vektorit. Viraalisten vektorien käyttö on ollut , tehokasta, mutta ongelmana on ollut immunogeenisten ja sytotoksisten sivuvaikutusten 5 esiintyminen2. Nonviraalisessa geeniterapiassa voidaan käyttää modifioituja plasmideja virusvektorien sijasta. Kuitenkin, nämä plasmidit ovat usein suuria ja negatiivisesti varautuneita, mikä pienentää niiden kykyä päästä kohdesolujen sisälle. Tämän vuoksi on kehitetty erilaisia synteettisiä vektoreita, esim. polylysiini ja sen konjukaatit3, polyetyleeni-imiinit (PEI)4, dendrimeerit5 ja kationiset lipidit1’6, jotta transfektiotehoa 10 voitaisiin lisätä.

Kationisia lipidejä on kokeiltu geenisiirrossa. Esim. me olemme käyttäneet yhdistettä nimeltä Dosper Liposomal Transfection Reagent (1,3-di-oleoyloxy-2-(6-carboxyspermylj-propylamid, Boehringer Mannheim, Germany), joka on 15 polykationinen liposomi. Yleisesti, kationiset liposomit muodostavat elektrostaattisia komplekseja negatiivisesti varautuneen DNA:n kanssa, ja nämä kompleksit voivat päästä solun sisälle endosytoottisesti7. Liposomi-DNA kompleksi destabiloi endosomaalisen membraanin, ja aiheuttaa anionisten lipidien flip-flop-ilmiön sytoplasman puoleisessa membraanissa. Nämä anioniset lipidit diffundoituvat 20 lateraalisesti liposomi-DNA kompleksiin ja muodostavat varaukseltaan neutraalin ioniparin liposomien kanssa (kationiset lipidit). Tällä tavalla liposomi-DNA kompleksi „, hajoaa ja DNA vapautuu sytoplasmaan8.

PEI:t ovat kationisia polymeerisiä molekyylejä, ja erityisesti niiden haarautuneet 25 muodot ovat tehokkaita plasmidien siirtämisessä soluihin4. Joka kolmas atomi PEI-molekyylissä on protonoitavissa oleva aminonitrogeeni. PEI pystyy kondensoimaan DNA:ta9, Lisäksi PEI omaa huomattavan puskurointikapasiteetin käytännöllisesti • * katsoen missä tahansa pH:ssa, suojaa DNA:ta endosomaaliselta hajoamiselta4 ja kohdistaa DNA:n tumaan11. Transfektiotehon kannalta PEI:n nitrogeenien ja DNA:n 30 fosfaattien suhde (N/P) on tärkeä, ja maksimaaliset transfektiotehot on saatu N/P-suhteilla 5-13.512. PEI:n transfektioteho kasvaa molekyylipainon kasvaessa.

-3- 111014

Pienimolekyyliset PEI:t (600, 1200, 1800) ovat olleet käytännöllisesti katsoen , tehottomia13. Suurimolekyyliset PEI:t, kuten PEI 25K (keskimääräinen MW 25 000)io,11,14,is Ja pEI 800K (keskimääräinen MW goO OOO)4’10’14 ovat olleet 5 menestyksellisiä transfektiotutkimuksissa. Suuria ja pieniä PEI:a on käytetty myös yhdessä transfektiotehon lisäämiseksi15.

Yleisesti kationisia liposomeja ja polyetyleeni-imiinejä (PEI) on käytetty menestyksellisesti in vitro non-viraalisessa geenien siirrossa. Näillä yhdisteillä on 10 erilaiset vaikutusmekanismit. Polykationiset liposomit muodostavat komplekseja DNA:n kanssa, ja kompleksit pääsevät sitten endosytoottisesti sisälle soluihin. PEI:t kondensoivat DNA:ta ja suojaavat sitä endosomaaliselta hajoamiselta, ja parantavat siten transfektiotehoa. Aikaisemmissa raporteissa, vain suuret PEI-molekyylit (MW>20 000) ovat olleet tehokkaita geenien siirrossa.

15 Tässä kuvattu transfektiomenetelmä perustuu kationisten lipidien ja kationisten polymeerien edullliseen synergiaan transfektiotehon potentoimiseksi. Tämä synergia voi syntyä kuvattujen yhdisteiden erilaisista mekanismeista, ja tuottaa siten geenejä ekspressoivilla plasmideilla suuremman transfektiotehon. Synergistinen PEI:n ja 20 kationisen liposomin vaikutus on uusi ennalta odottamaton keksintö geenisiirrossa.

« 9

Keksinnön yhteenveto 25 Me olemme identifioineet ja karakterisoineet uuden geenien siirron menetelmän, joka perustuu kationisten lipidien (esim. Dosper liposomit) ja kationisten polymeerien (esim. polyetyleeni-imiinit) yhdistelmän käyttöön. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, · * . että kun PEI ja polykationinen liposomi, Dosper Liposomal Transfection Reagent, on yhdistetty, transfektiotehoa voidaan parantaa huomattavasti, mikä näkyy viljellyissä ’ 30 apinan fibroblastisoluissa lisääntyneenä beetagalaktosidaasin aktiivisuutena ja X-gal värjäyksenä. Tämä synergia on löydetty kaikilla kolmella tutkitulla PEI:lla -4- 111014 (keskimääräinen MW 700, 2000 ja 25 000) ja jopa pienillä Dosper/DNA suhteilla. Kuvatun keksinnön yleinen tavoite on esitellä menetelmä käytettäväksi in vitro ja in vivo geenisiirroissa.

5

Kuvatun keksinnön erityinen ominaisuus on käyttää kationisten polymeerien ja lipopolyamiinien yhdistelmää geenien siirrossa, erityisesti Dosperia ja polyetyleeni-imiinejä.

10 Lisäksi kuvatun keksinnön erityinen ominaisuus on käyttää pieniä polyetyleeni-imiinejä (esim. PEI 700 ja PEI 2000) kationisten lipidien ja kationisten polymeerien yhdistelmänä geenien siirrossa.

Edelleen erityinen ominaisuus on käyttää sellaisia määriä i^eagensseja, jotka yksin 15 käytettyinä ovat tehottomia geenisiirrossa. Kokeissa määrät vaihtelevat matalasta ja tehottomasta suureen ja tehokkaaseen. Erityisesti Dosperin ja PEI:n synergia tapahtuu pitoisuuksissa, joissa molemmat ovat tehottomia yksin käytettyinä.

Edelleen erityinen ominaisuus on terapeuttisen geenin ekspressio yksilön 20 kohdesoluissa. Ekspressio saavutetaan transfektoimalla kohdesolut kuvatun menetelmän avulla.

♦ <

Kuvatun keksinnön erityinen ominaisuus on myös terapeuttisen geenin sisältävän plasmidin ja vektorin transfektio ja ekspressio käytettäväksi humaanien sairauksien 25 geeniterapiassa.

i«<

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä 30 Keksintö kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavassa hakemuksen kokeellisessa osassa, ja referoiden oheen liitettyihin kuviin, joissa -5- 111014

Kuva 1 esittää Dosperin ja PEI-DNA kompleksin lisäämisen vaikutuksen beetagalaktosidaasin aktiivisuuteen. Solut transfektoitiin TkBPVlacZ plasmidilla (lpg), joka kompleksoitiin kolmella eri PEIrllä (keskimääräinen MW 700,2000 ja 25 000) eri ' 5 N/P-suhteissa (1-50). Transfektiot tehtiin ilman Dosperia (A) tai Dosperin kanssa (B), jolloin Dosper (Dosper/DNA-suhde 1) lisättiin PEI/DNA-kompleksiin. Soluja inkuboitiin transfektioliuoksessa 6 tuntia ja sitten viljely liuoksessa 42 tuntia. Beetagalaktosidaasin aktiivisuus mitattiin ONPG määrityksellä. Arvot ovat beetagalaktosidaasin aktiivisuuden keskiarvoja per mg proteiinia ± SE, n=6. Kun 10 Dosperia käytettiin yksin, beetagalaktosidaasin aktiivisuus oli 0.36 ± 0.53 mU/mg proteiinia.

Kuva 2 esittää eri Dosper/DNA-suhteiden vaikutuksen beetagalaktosidaasin aktiivisuuteen. Solut transfektoitiin TkBPVlacZ plasmidilla (1 pg) Dosper/DNA-15 suhteessa 0-7.5 (A) ja DNA kondensoitiin PEI:llä N/P-suhteessa 1 (B) ja 30 (C) ennen kuin Dosper lisättiin. Soluja inkuboitiin transfektioliuoksessa 6 tuntia ja sitten viljelyliuoksessa 42 tuntia. Beetagalaktosidaasin aktiivisuus määritettiin ONPG-määrityksellä. Arvot ovat beetagalaktosidaasin aktiivisuuden keskiarvoja per mg proteiinia ± SE, n=6.

20

Kuva 3 esittää transfektiotehon analyysiä X-gal väijäyksen avulla. Solut transfektoitiin TkBPVlacZ plasmidilla (1 pg), joka kompleksoitiin PEI700:lla ja PEI2K:lla N/P-suhteessa 30 ja/tai Dosperilla Dosper/DNA-suhteessa 0, 2.5 ja 5. Soluja inkuboitiin transfektioliuoksessa 6 tuntia ja sitten viljelyliuoksessa 42 tuntia. Tämän jälkeen solut 25 pestiin PBS:ssa ja fiksattiin 4% paraformaldehydillä 15 min ajan. Sitten solut värjättiin X-gal liuoksella (1 mg/ml) 3 tuntia 37 asteessa ja pestiin PBS:lla.

• · * Kuva 4 esittää kompleksin muodostumisen analyysiä geelielektroforeesin avulla. TkBPVlacZ plasmidi on kompleksoitu PEI:lla (MW 700, 2000 ja 25 000) N/P- * 30 suhteessa 1, 2.5 ja 5. Kaikki DNA kompleksoitui N/P-suhteella >1 ja pysyi kaivossa.

TkBPVlacZ plasmidi (2pg) laimennettiin 150 mM NaCkiin kokonaistilavuuteen 30 pl. Eri määrät PEI:ä laimennettin myös NaCkiin kokonaistilavuuteen 30 pl. 10 min 111014 -6- inkubaation jälkeen liuokset yhdistettiin ja PEI/DNA kompleksien annettiin muodostua edelleen 10 min ajan. Sitten 14 μΐ geelipuskuria lisättiin ja 17.5 μΐ (0.5 μg DNA) kustakin liuoksesta siirrettiin geelin kaivoon ajettavaksi ja erotettavaksi 5 geelielektroforeesissa (0.6% agaroosi, lxTris-Asetaatti-EDTA puskuri, elektroforeesi 28 V ja 6 tuntia). DNA visualisoitiin etidiumbromidilla.

Kokeellinen osa 10

Kemikaalit

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Foetal Bovine Serum ja Penisilliini-Streptomysiini ovat hankittu Gibcosta (Gibco BRL (U.K.), Dosper Liposomal Transfection Reagent ja X-gal (5-bromo-4-choro-3-indolyl-B-D-galactosidaside) ovat 15 Boehringeriltä (Boehringer Mannheim, Germany) ja polyetyleeni-imiini ja ONPG (o-nitrophenol-B-D-galaktopyranoside) Sigmalta (Sigma-Aldrich, USA). TkBPVlacZ plasmidin on syntetisoinut prof. Mart Ustav, (Tarton yliopisto, Viro). Plasmidi on tuotettu E. coli bakteerissa (DH5a) ja puhdistettu kaupallista kittiä käyttäen (Qiagen, Germany). Kaikki muut kemikaalit olivat soluviljelyn ja molekyylibiologian 20 edellyttämää laatua.

Geenitransfektio

TkBPVlacZ ekspressioplasmidia (1 pg/kaivo) transfektoitiin subkonfluentteihin CV1-P soluviljelmiin (apinan fibroblastooma solulinja). Soluja kasvatettiin 24 kuopan 25 viljelylevyillä 5% CO2 atmosfäärissä ja 37 asteessa. Bakteerin beetagalaktosidaasin entsyymiä koodaavaa IacZ geeniä käytettiin merkkigeeninä. Transfektioliuokset valmistettiin erikseen PEI.n, Dosperin ja PEI/Dosper kombinaatioiden osalta. Ensin, 10 pg TkBPVlacZ plasmidia laimennettiin lopulliseen tilavuuteen 150 μΐ 150 mM NaCl:a.

30 PEI:n transfektioliukselle, 10 mM PEI laimennettiin lopulliseen tilavuuteen 150 mM NaCk.a, inkuboitiin 10 min, lisättiin plasmidi DNA liuokseen ja inkuboitiin edelleen 10 min ennen geenitransfektiota. Dosperin transfektioliuokseen, Dosper laimennettiin -7- 111014 suhteessa 1/5 150 mM NaCl:ssa ja inkuboitiin 15 min ennen geenitransfektiota.

PEI/Dosper kombinaation transfektioliuokseen, Dosper liuos lisättiin DNA-PEI

* 5 seokseen, ja sitten inkuboitiin edelleen 15 min. Geenitransfektiossa, transfektioliuokset pipetoitiin pisaroittain soluviljelmiin, joihin oli lisätty 1 ml tuoretta DMEM viljelyliuosta ilman seerumia ja antibiootteja. 6 tunnin inkubaation jälkeen transfektioliuos vaihdettiin 1 ml tuoretta DMEM:a (9% Foetal Bovine Serum ja 90 mU Penisilliini-Sterptomysiini). Soluja inkuboitiin edelleen 42 tuntiin ennen 10 beetagalaktosidaasin analyysiä.

ONPG määritys

Kokeiden lopussa solut pestiin PBS:lla, hajotettiin 150 μΐ lyysausreagenssia (25 mM glycylglycine, 15 mM MgS04, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, ImM DTT, 1 mM 15 PMSF), ja sentrifugoitiin 13 000 rpm 5 min ajan (Eppendorf sentrifuugi 5415C, Eppendorf-Netheler-Hinz, Germany). Beetagalaktosidaasin aktiivisuus mitattiin ONPG määrityksellä supematantista: 20 μΐ supematanttia, 80 μΐ H2O ja 100 μΐ 2x beetagal liuosta (2 mM MgCb, 1 mM β-merkaptoetanoli, 1.33 mg/ml ONPG

natriumfosfaattipuskurissa (0.2 M) 96-kuoppalevyllä ja inkuboitiin 1 tunti 20 huonelämmössä. ONPG määrityksessä detektio perustuu β-sidoksen katkaisuun ONPGista beetagaktosidaasientsyymin vaikutuksesta ja tuloksena on keltainen o-nitrofenoli, joka anioituu ja absorboi valoa aallonpituudella 405 nm. Näytteet analysoitiin mittaamalla absorbanssia 405 nm aallonpituudella Bio-Tek Elx-800 mikrolevylukijalla (Bio-Tek Instruments, USA) ja tulokset käsiteltiin KC-3 PC 25 ohjelmalla.

Proteiinin määritys • ·

Proteiinipitoisuudet mitattiin Bio-Rad Protein määrityksellä (Coomassie Brilliant Blue, Bio-Rad laboratories, USA). 15 μΐ supematanttia laimennettiin 800 μΐ H2O, ja 200 μΐ * 30 Protein Assay Dry Reagent konsentraattia lisättiin. Absorbanssi luettiin 595 nm aallonpituudella Hitachi U-2000 spektrofotometrin avulla.

-8- ;iijoh

Histokemia X-gal värjäystä käytettiin beetagalaktosidaasin histokemialliseen määrittämiseen.

Solut pestiin PBS:ssa, fiksattiin 4 % paraformaldehydillä (15 min, RT) ja pestiin 5 kahdesti PBS:lla. Sitten soluja inkuboitiin X-gal väijäysliuoksessa (X-gal 1 mg/ml, MgCl2 2 mM, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6x3H20, 0.01 % natriumdeoksikolaatti, 0.02% Nonidet P-40, kolmen tunnin ajan 37 asteessa. Beetagalaktosidaasin aktiivisuus detektoitiin 3,5'-dichromo-4,4'-dichloroindigo molekyylin sinisenä värinä, joka muodostuu beetagalaktosidaasin pilkkoessa X-gal 10 substraattia transfektoiduissa soluissa. X-gal värjäyksen jälkeen solut pestiin PBS:lla ja valokuvattiin Nikon Diaphot 300 mikroskoopin ja Nikon F-601 kameran avulla.

Geetielektroforeesi PEI-DNA kompleksit valmistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu. Elektroforeesia 15 varten 0.5 pg DNA:ta pipetoitiin agaroosigeeliin (0.6% agaroosi, lxTris-Asetaatti-EDTA puskuri, elektroforeesi 28 V ja 6 tuntia). Geelit värjättiin etidiumbromidi liuoksessa (0.5 mg EtBr/1 litra H20) 30 min huonelämmössä DNA:n visualisoimiseksi elektroforeesin jälkeen, 20

Tulokset • PEI/DNA suhteen merkitys PEl/Dosper kombinaation transfektioteholle

Ensimmäisissä kokeissa tutkittiin eri N/P suhteiden vaikutusta PEI/DNA 25 komplekseihin. Transfektioteho määritettiin beetagalaktosidaasin koko aktiivisuutena soluekstrakteissa kolorimetrisen ONPG määrityksen avulla.

» ·

Aluksi tutkittiin Dosperin vaikutusta (yksin), kolmea eri PEI:n (700, 2K, 25K) vaikutusta (yksin) ja niiden eri kombinaatioiden vaikutusta transfektiotehoon CV1-P 30 soluviljelmissä (Kuva 1). Jokaista PEI:a tutkittiin eri N/P suhteissa ilman Dosperia ja Dosperin kanssa käyttämällä samaa Dosper/DNA suhdetta mahdollisen kombinaation tuottaman potentiaation löytämiseksi transfektiotehossa. Dosperia käytettiin yksin -9- 111014

Dosper/DNA suhteessa 1, jokaista PEI:a yksin kuudessa N/P suhteessa vaihdellen 1-50, tai vastaavia Dosperin ja PEI:n yhdistelmiä.

• 5 Näissä kokeissa Dosper, PEI 700 ja PEI 2K olivat kaikki tehottomia, kun niitä käytettiin yksin geenitransfektiossa, kun taas PEI 25K sai aikaan merkittävän transfektiotehon. Kuitenkin, PEI 700:n transfektioteho potentoitui jonkin verran, kun mukana oli Dosperia (N/P suhde 30 ja 50). Edelleen, kun PEI 2K:ta käytettiin yhdessä Dosperin kanssa, transfektioteho kasvoi merkittävästi erityisesti N/P suhteessa 30, kun 10 taas pienemmät suhteet 1 ja 5 eivät lisänneet tai lisäsivät vain vähän beetagalaktosidaasin aktiivisuutta. Tämä vaikutus oli jopa suurempi kuin vaikutus PEI 25K:lla, joka tuotti yksinään merkittävän beetagalaktosidaasin aktiivisuuden erityisesti N/P suhteella 10. Kun Dosperia lisättiin PEI25K/DNA kompleksiin, transfektioteho nousi edelleen, ja korkein vaikutus nähtiin N/P suhteella 5.

15

Dosper/DNA suhteen merkitys PEI/Dosper kombinaation transfektioteholle

Toisessa kokeessa, eri Dosper/DNA suhteiden vaikutusta tutkittiin PEI/Dosper kombinaatioiden transfektiotehoon (Kuva 2). Jokaiselle PEI:lle valittiin N/P suhteet 1 ja 30, ja eri määrät Dosperia (Dosper/DNA suhteet 0-7.5) lisättiin PEI/DNA 20 komplekseihin.

, - · Kun solut transfektoitiin Dosperilla yksin (so. ilman PEI:a), paras beetagalaktosidaasin 4 « aktiivisuus saatiin Dosper/DNA suhteella 7.5. Kun käytettiin PEI/Dosper kombinaatiota PEI/DNA suhteella 1, ei saatu merkittävää muutosta transfektiotehossa millään PEI.lla 25 (700, 2K ja 25K) verrattuna Dosperiin yksin. Kuitenkin, PEI 700 N/P suhteella 30 lisäsi merkittävästi transfektiotehoa PEI/Dosper kombinaatiota käytettäessä. Korkein potentiaatio saatiin Dosper/DNA suhteella 5, ja tämä oli 3-kertainen verrattuna « . parhaisiin yksin Dosperilla saatuihin tuloksiin. Toisaalta, PEI 2K N/P suhteella 30 ei lisännyt transfektiotehoa PEI/Dosper kombinaatiota käytettäessä, kun verrattiin ' 30 pelkkään Dosperiin. Kuitenkin, nyt maksimaalinen beetagaktosidaasin aktiivisuus saavutettiin jonkin verran matalammilla Dosper/DNA suhteilla (2.5 ja 5) kuin Dosperilla yksin (7.5). PEI 25K käyttö N/P suhteella 30 ei lisännyt transfektiotehoa -10- 111014 PEI/Dosper kombinaatiota käytettäessä verrattuna Dosperin tai PEI25K:n tehoon yksin.

PEI/Dosper kombinaation vaikutus transfektoitujen solujen määrään 5 Transfektoituneiden solujen lukumäärää mitattiin histokemiallisen X-gal väijäyksen ’ avulla. Kun Dosperia lisättiin PEI/Dosper komplekseihin, siniseksi värjäytyneiden solujen lukumäärä (IacZ geenin onnistuneen transfektion ja ekspression seurauksena) kasvoi verrattuna PEI tai Dosper vaikutukseen yksin (Kuva 3). Värjäytymistä ei tapahtunut sellaisissa soluissa, jotka oli transfektoitu vain PEI 700:11a tai PEI 2K:lla 10 N/P suhteella 30. Dosperin välittämässä geenitransfektossa Dosper/DNA suhteella 5 oli vähemmän kuin 1% värjäytyneitä soluja. Värjäytyneiden solujen määrä kasvoi merkittävästi, kun PEI 700 tai PEI 2K N/P suhteella 30 oli käytetty plasmidi DNA:n kondensoimiseen ennen Dosperin lisäämistä, ja oli keskimäärin 4.8 ±0.8% PEI 700:lle ja 4.3±1% PEI 2K:lle (ei näytetty).

15 PEI/DNA kompleksin (eri N/P suhteilla) muodostumisen analyysi

Agaroosigeelielektroforeesia käytettiin analysoitaessa PEI:n kykyä kondensoida DNA:ta, ja kompleksin muodostumisen ja transfektiotehon potentoitumiseen suhdetta selvitettiin PEI/Dosper kombinaatioilla. Jokainen PEI N/P suhteella >2.5 pystyi 20 kompleksoimaan DNA:n, koska kaikki DNA jäi kaivoihin, kun taas N/P suhteella 1, DNA ei ollut täysin kompleksoitunut, mikä näkyi DNA:n liikkumisena geelielektroforeesissa (Kuva 4).

* < « · *

Claims (9)

1. Menetelmä geenisiirtoon tarkoitetun transfektioreagenssi seoksen 5 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että - transfektioreagenssiseos sisältää aina sekä kationisen lipidin tai liposomin että kationisen polymeerin, 10. transfektioreagenssiseosta käytetään DNA/transfektioreagenssiseoksen valmistamiseksi siten, että syntyy transfektiomekanismiin perustuva transfektiotehon synergia tai potentiaatio, - transfektioreagenssiseos valmistetaan tietyllä tavalla ja tietyssä 15 järjestyksessä siten, että valmistetaan ensin plasmidi DNA:n ja kationisen polymeerin kuten polyetyleeni-imiinin seos, johon seokseen sitten lisätään kationisia liposomeja kuten Dosper.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transfektioreagenssiseoksen valmistus- 20 menetelmä, tunnettu siitä, että kationisena liposomina on Dosper (Dosper Liposomal Transfection Reagent) ja kationisena polymeerinä polyetyleeni-imiini (MW 700,2000 ja 25000). • ·

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transfektioreagenssiseoksen valmistus- 25 menetelmä, tunnettu siitä, että kationisena polymeerinä on pienimolekyylinen polyetyleeni-imiini (MW 700 ja 2000). u .

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transfektioreagenssiseoksen valmistus menetelmä, tunnettu siitä, että kationisen liposomin tai lipidin määrä * 30 riippuu sen varauksesta suhteessa plasmidi DNA:han.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen transfektioreagenssiseoksen valmistus- 111014 -12- menetelmä, tunnettu siitä, että kationisen polymeerin määrä riippuu sen ekvivalenssista suhteessa plasmidi DNA:han.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen transfektioreagenssiseoksen valmistus- ' menetelmä, tunnettu siitä, että Dosper liposomin varaus on 1-10 suhteessa plasmidi DNA:n varaukseen.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen transfektioreagenssiseoksen valmistus- 10 menetelmä, tunnettu siitä, että polyetyleeni-imiinin ekvivalenssi on 1-50 N/P suhteessa plasmidi DNA:han.

8. Jonkin patenttivaatimuksien 1-7 mukaisen valmistusmenetelmän käyttö valmistettaessa sairauksien hoitoon tarkoitettua transfektioreagenssiseosta. 15

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että sairauksien hoitomenetelmä on geeniterapia.