KR100305715B1

KR100305715B1 - 유전자전이방법을이용한형질전환조류의생산방법

Info

Publication number: KR100305715B1
Application number: KR1019980018635A
Authority: KR
Inventors: 한재용; 홍영호
Original assignee: 이기준; 대한민국
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2001-11-30
Also published as: US20020138864A1; KR19990085933A

Abstract

본 발명은 배지에 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가하고 전기충격을 가하는 단계를 포함하는 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법 및 전기 방법에 의하여 유전자가 전이된 원시생식세포를 수용체 배자내로 주입하는 단계를 포함하는 형질전환 조류의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 화이트 레그혼(White Leghorn)의 수정란으로부터 배자를 채취하여 생식기세포(gonadal cell)와 섬유아세포(fibroblast)를 분리한 다음, 전기 두 가지 세포 각각에 적합한 전기충격의 조건을 확립한 데 이어, DMSO의 첨가가 전기충격법에 의한 유전자 전이효율에 미치는 영향을 조사한 결과, DMSO가 세포특이적 방식으로 생식기 유래 원시생식세포 내로의 유전자 전이효율을 증가시킴을 확인하였다. 본 발명의 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법은 종래의 유전자 전이방법들에 비하여 안전하고, 비교적 수월하며, 유전자 전이 효율이 높아, 외래 유전자가 전이된 원시생식세포의 다량제조를 가능케함으로써, 전기 유전자가 전이된 원시생식세포를 수용체 배자 내로 주입하는 방식으로 형질전환 조류의 생산까지도 실현시킬 수 있을 것이다.

Description

조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법

본 발명은 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 배지에 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)를 첨가하고 전기충격을 가하는 단계를 포함하는 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법 및 전기 방법에 의하여 유전자가 전이된 원시생식세포를 수용체 배자내로 주입하는 단계를 포함하는 형질전환 조류의 생산방법에 관한 것이다.

최근 10여년 동안 형질전환 조류 생산을 위한 여러가지 시도들이 이루어져 왔으며(참조: Bosselman, R. A., et al., Science, 243:533-535, 1989; Perry, M. M. and Sang, H. M., Transgenic Res., 2:125-133, 1993; Love, J., et al., Biotech., 12:60-63, 1994), 특히, 원시생식세포(primordial germ cell, PGC)를 이용한 형질전환 조류의 생산방법에 대하여 활발한 연구가 이루어져 왔다. 원시생식세포는 배 발달의 특성상 조작 시점이 다양하다는 장점을 가지고 있다. 닭 배자(embryo)의 경우, 원시생식세포는 배 발달 단계 X에 체세포로부터 분리되는 것으로 보이는데(참조: Eyal-Giladi, H. and Kochav, S., Dev. Biol., 49:321-337, 1976), 이는 원시생식세포-특이적 탄수화물 항원결정기(epitope)의 발현시기와 일치한다(참조: Karagenc, L., et al., Dev. Gen., 19:290-301, 1996). 배 발달 단계 X의 배자는 체세포(somatic) 또는 생식선(germline) 카이메라 생산을 위하여 많이 사용되어 왔다(참조: Thoraval, P., Poult, Sci., 73:1897-1905, 1994). 원시생식세포는 원시선조(primitive streak)의 발달에 따라 생식반월(germinal crescent)에서 발견되며, 혈관계가 발달하면서 활발하게 이동하기 시작하여 배 발달 단계 15의 혈액에서 관찰이 가능하다(참조: Hamburger, V. and Hamilton, H. L., J. Morphol., 88:49-92, 1951). 혈관계를 통한 이러한 수동적인 이동이 이루어진 후에 성세포(germ cell)는 배측장간막(dorsal mesentery)을 따라서 능동적으로 혈관계로부터 원시생식선(germinal ridge)으로 이동한다. 이러한 원시생식세포의 독특한 이동경로 때문에 생식반월, 배자혈액(embryonic blood), 배자생식기 등에서 분리한 원시생식세포를 이용하여 생식선 카이메라(germ line chimera)를 개발하고자 하는 노력이 있어 왔다. 이와 관련하여, 배자의 생식기로부터 유래한 원시생식세포를 약 5일간 배양하는데 성공하였다는 보고가 있었으며(Chang, I. K., et al., Cell Biol. Int., 19:143-149, 1995a), 유전자 전이 후 수용체 배자 내로 주입된 원시생식세포가 생식기 조직 내에서 발견되었다는 보고도 있다(Allioli, N., et al., Dev. Biol., 165:30-37, 1994).

한편, 원시생식세포를 이용한 형질전환 조류의 생산을 위하여 반드시 선행되어야 할 과제 중 하나는 유전자 전이(transfection) 효율의 증대라 할 수 있다. 지금까지 보고된 원시생식세포 내로의 유전자 전이방법으로는 레트로바이러스 벡터에 의한 감염법, 리포좀(liposome) 방법 또는 발사체에 의한 침투법(ballistic penetration) 등이 있으나(참조: Allioli, N., et al., Dev. Biol., 165:30-37, 1994; Li, Y., et al., Transgenic Res., 4:26-29, 1995; Watanabe, M., et al., Mol. Reprod. and Dev., 38:268-274, 1994), 이들 방법은 나름대로의 한계점을 지니고 있다. 즉, 레트로바이러스 백터를 이용한 유전자 전이방법은 외래 유전자의 안정적인 삽입에는 성공하였으나, 상업용 닭의 생산을 위해서는 병원성 및 벡터 크기의 제한성 등의 문제 때문에 부적합하다는 단점이 있다. 또한, 리포좀을 이용한 조류 원시생식세포 내로의 유전자 전이효율은 낮게는 1.5%에서 높게는 26%로 비교적 낮은 것으로 알려져 있다(참조: Han, J. Y., et al., AJAS, 7:427-434, 1994; Wentworth, B., et al., Beltsville Symposium in Agricultural Research, pp.202-227, 1996). 한편, 진핵세포 내로의 유전자 전이방법으로 많이 사용되고 있는 전기충격법(electroporation)은 조류의 원시생식세포에서의 사용에 관해서는 전혀 보고된 바가 없다. 따라서, 높은 효율로 조류의 원시생식세포 내로 유전자를 전이할 수 있는 유전자 전이방법의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 조류의 생식기 유래 원시생식세포에 적절한 전기충격의 조건을 확립한 데 이어, 전기충격시 배지에 적절한 농도로 디메틸설폭사이드를 첨가함으로써 생식기 유래 원시생식세포 내로의 유전자 전이효율을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 방법에 의하여 유전자가 전이된 원시생식세포를 이용한 형질전환 조류의 생산방법에 관한 것이다.

도 1은 전기충격 조건에 따른 닭의 생식기 유래 원시생식세포 내로의 유전자 전이효율을 보여주는 그래프이다.

도 2a는 리포좀 방법에 의하여 lacZ 유전자가 전이된 닭의 생식기 유래 원시생식세포를 X-gal 염색한 결과를 보여주는 사진이다.

도 2b는 디메틸설폭사이드를 사용하는 전기충격법에 의하여 lacZ 유전자가 전이된 닭의 생식기 유래 원시생식세포를 X-gal 염색한 결과를 보여주는 사진이다.

도 3은 lacZ 유전자가 전이된 생식기 원시생식세포가 주입된 배자로부터 부화된 병아리의 각 조직에서 lacZ 유전자의 발현여부를 PCR로 분석한 결과를 보여주는 아가로오스 젤 사진이다.

본 발명자들은 화이트 레그혼(White Leghorn)의 수정란으로부터 배자를 채취하여 생식기세포(gonadal cell)와 섬유아세포(fibroblast)를 분리한 다음, 전기 두 가지 세포 각각에 적합한 전기충격의 조건을 확립한 데 이어, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, 이하, 'DMSO'라 약함)의 첨가가 전기충격법에 의한 유전자 전이효율에 미치는 영향을 조사한 결과, DMSO가 세포특이적 방식으로 생식기 유래 원시생식세포 내로의 유전자 전이효율을 증가시킴을 확인하였다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명자들은 화이트 레그혼(White Leghorn)의 수정란으로부터 6일령 배자를 채취하여 생식기세포와 섬유아세포를 분리한 다음, 전기 두 가지 세포 각각에 적합한 전기충격 조건을 확립하기 위하여, lacZ 유전자를 포함하는 pCMVβ 벡터를 리포터 벡터로 사용하여 일련의 전기충격법에 의한 유전자 전이 실험을 수행하였다. 전기 유전자가 전이된 생식기세포로부터 생식기 유래 원시생식세포(gonadal primordial germ cell, 이하, 'gPGC'라 약함)만을 분리하고, 전기 생식기 유래 원시생식세포와 유전자가 전이된 섬유아세포 각각에 대하여 X-gal 염색법으로 유전자 전이효율을 측정한 결과, 생식기 유래 원시생식세포는 바람직하게는 230 내지 270V, 900 내지 950㎌의 조건에서, 가장 바람직하게는 250V, 950㎌의 조건에서 높은 유전자 전이효율을 보였으며, 닭 섬유아세포는 바람직하게는 230 내지 270V, 250 내지 350㎌의 조건에서, 가장 바람직하게는 250V, 300㎌의 조건에서 높은 유전자 전이효율을 보였다.

이어서, 디메틸설폭사이드의 첨가가 전기충격법에 의한 유전자 전이효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 생식기 유래 원시생식세포와 섬유아세포 각각에 대하여 전기에서 확립한 전기충격 조건 하에서, 배지에 DMSO를 첨가하거나 첨가하지 않고 유전자 전이를 실시한 다음, 세포질 추출물을 제조하여 β-갈락토시다아제 활성을 조사한 결과, DMSO를 세포배양 배지에 바람직하게는 1 내지 1.5%(v/v)의 농도로, 가장 바람직하게는 1.25%(v/v)의 농도로 첨가함으로써 세포-특이적 방식으로 생식기 유래 원시생식세포 내로의 유전자 전이효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 전기 DMSO의 첨가를 특징으로 하는 전기충격법에 의하여 외부유전자가 전이된 생식기 유래 원시생식세포를 수용체 배자내로 주입하고 배양함으로써, 생식기에서 전기 외부유전자를 발현하는 형질전환 조류를 생산할 수 있음을 확인하였다.

한편, 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 조류로서는 화이트 레그혼 닭을 사용하고, 원시생식세포로서는 생식기 유래 원시생식세포를 사용하였으나. 조류는 닭 이외에 메추리, 꿩, 칠면조, 또는 오리를 사용할 수도 있으며, 원시생식세포는 생식기 유래 원시생식세포 이외에 혈액 또는 생식반월(germinal crescent)로부터 유래된 원시생식세포를 사용할 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 생식기 유래 원시생식세포와 닭 섬유아세포의 분리 및 배양

생식기 유래 원시생식세포(gonadal primordial germ cell, gPGC)를 포함하는 생식기세포(gonadal cell)는 다음과 같은 방법으로 원시생식기로부터 분리되었다: 화이트 레그혼(White Leghorn)으로부터 수정란을 얻어, 37℃ 부화기에서 배양한 다음, 약 6일령의 배자로부터 원시생식기를 분리하였다. 전기 원시생식기에 0.25% 트립신(trypsin)-0.02% EDTA를 처리하고, 10분간 배양한 다음, 피펫을 이용하여 기계적으로 생식기 유래 원시생식세포 및 기저세포(stroma cell)를 포함하는 생식기세포(gonadal cell)를 분리하였다. 한편, 닭 섬유아세포(chick embryonic fibroblast, CEF)는 6일령 배자로부터 채취하여 절편화한 피부조직으로부터 전기와 동일한 방법으로 분리되었으며, 분리된 섬유아세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 100unit/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신 등이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco BRL, U.S.A.)에서 12시간 동안 배양한 다음, 유전자 전이 직전에 계대배양하였다.

실시예 2: 전기충격법에 의한 유전자 전이를 위한 조건설정

실시예 2-1: 전기충격법에 의한 유전자 전이

생식기 유래 원시생식세포 및 섬유아세포 내로의 유전자 전이효율을 용이하게 확인하기 위하여, CMV 프로모터에 의하여 발현되는 박테리아 lacZ 유전자를 포함하는 pCMVβ 벡터(Clontech, U.S.A.)를 리포터 벡터로 사용하였다. 전기 pCMVβ 벡터는 라지 스케일 매트릭스-베이스드 퓨리피케이션 킷트(Large scale matrix-based purification kit, Quigen, Inc., U.S.A.)를 이용하여 순수정제하였다. 전기충격법(electroporation)의 기본적인 조건은 멜코니안(Melkonyan) 등의 방법을 따랐으며(참조: Melkonyan, H., et al., Nucleic Acids Res., 24:4356-4357, 1996), 최적의 전기충격 조건을 잡기 위하여 200 내지 300V의 전압과 250 내지 950 ㎌의 전류(capacitance)의 조건으로 일련의 전기충격법에 의한 유전자 전이실험을 수행하였다. 즉, 생식기 유래 윈시생식세포(gPGC)와 기질세포(stroma cell)가 혼합된 1.6×10⁵개의 생식기세포 또는 2.3×10⁶의 닭 섬유아세포를 각각 400㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco BRL, U.S.A.)와 혼합한 다음, 20㎍의 플라스미드 DNA를 가하고, 잘 혼합하여 실온에서 약 1분간 정치하였다. 이어서, 200 내지 300V, 250 내지 950㎌의 조건으로 전기충격법에 의한 유전자 전이를 수행하였다. 그런 다음, 생식기세포는 10% 우태아혈청, 10ng/ml IGF-1(insulin-like growth factor-1, Sigma, U.S.A.), 10ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor, Sigma, U.S.A.) 및 10units/ml murine LIF(leukemia inhibitory factor, Sigma, U.S.A.)가 첨가된 DMEM 배지(Gibco BRL, U.S.A.)에서 24 시간 동안 배양하였으며, 닭 섬유아세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 100unit/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신 등이 첨가된 DMEM 배지(Gibco BRL, U.S.A.)에서 24시간 동안 배양하였다.

실시예 2-2: X-gal 염색에 의한 유전자 전이효율 측정

전기 실시예 2-1로부터 수득한 유전자가 전이된 생식기세포로부터 피콜 밀도구배 분리방법(ficoll gradient density centrifugation)을 이용하여 생식기 유래 원시생식세포만을 분리하고(참조: Chang, I. K., et al., Cell Biol. Int. Rep., 16:853-857, 1992), PAS(periodic acid shiff's) 염색법으로 생식기 유래 원시생식세포인지 여부를 판별한 결과, 분리된 생식기 유래 원시생식세포의 순수도는 평균 약 80%로 확인되었다. 전기 생식기 유래 원시생식세포 (gPGC)와 전기 실시예 2-1로부터 수득한 유전자가 전이된 닭 섬유아세포를 각각 PBS로 세척하여 5분 동안 1% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정하고, PBS로 2회 세척한 다음, X-gal 염색을 실시하였다. 생식기 유래 원시생식세포에서의 유전자 전이효율은 총 생식기 유래 원시생식세포 중 X-gal 염색시 양성반응을 나타내는 생식기 유래 원시생식세포의 비율로서 나타내었으며, 닭 섬유아세포에서의 유전자 전이효율은 총 닭 섬유아세포 중 X-gal 염색시 양성반응을 나타내는 닭 섬유아세포의 비율로서 나타내었다. 그 결과, 원시생식세포는 250V, 950㎌의 조건에서(참조: 도 1), 그리고 닭 섬유아세포는 250V, 300㎌의 조건에서 유전자 전이효율이 극대화됨을 확인하였다.

실시예 3: DMSO가 전기충격법에 의한 유전자 전이효율에 미치는 영향

생식기세포는 250V, 950㎌의 조건에서, 그리고 닭 섬유아세포는 250V, 300㎌의 조건에서 Opti-MEM 배지에 1.25%(v/v)의 농도로 DMSO를 첨가하거나 첨가하지 않고, 상기 실시예 2-1에 기술한 것과 동일한 방법으로 전기충격법에 의한 유전자 전이를 수행하고, 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 피콜 밀도구배 분리방법으로 전기 유전자가 전이된 생식기세포로부터 생식기 유래 원시생식세포만을 분리하였다. 유전자가 전이된 생식기 유래 원시생식세포(gPGC)와 닭 섬유아세포(CEF)에 각각 0.2% 트리톤 X-100(triton X-100), 100mM 인산칼륨완충액(pH 7.8) 및 1mM DTT(dithiothreitol)가 포함된 100㎕의 세포용해(lysis) 완충액을 가하여, 세포를 용해시켜 세포질 추출물(cytosolic extract)을 제조하였다. 이어서, 전기 세포질 추출물 내의 β-갈락토시다아제 활성도를 측정하였으며, 세포질 추출물의 단백질 농도는 우혈청알부민(BSA)을 기준으로 하여 브래드포드(Bradford)의 방법으로 측정하였다. 그 결과, 하기 표 1에서 보듯이, 생식기 유래 원시생식세포의 세포질 추출물의 β-갈락토시다아제 활성은 DMSO 첨가시에 2.2배 정도 증가한 반면, 닭 섬유아세포에서는 DMSO 첨가에 의한 효과가 유의적으로 나타나지 않았다.

DMSO의 첨가가 유전자 전이효율에 미치는 영향(단위: β-galactosidase 활성도/mg 단백질)

처 리	세포종류
처 리	생식기 원시생식세포	닭 섬유아세포
대조구	0.243±0.01	0.353±0.04
DMSO 첨가구	0.538±0.18	0.440±0.06

이러한 결과는 DMSO가 외래 유전자의 세포막 내로의 투과를 증가시키거나, 또는 전기충격후 세포막의 안정성을 증가시킴으로써, 전기충격법에 의한 유전자 전이효율을 증가시킬 수 있으며, DMSO의 이러한 효과는 세포-특이적임을 제시하였다.

실시예 4: 생식기 유래 원시생식세포에서 전기충격법에 의한 유전자 전이효율과 리포좀 방법에 의한 유전자 전이효율의 비교

원시생식기로부터 전기 실시예 1에 기술한 것과 동일한 방법으로 생식기세포를 분리하여, 10% 우태아혈청, 10ng/ml IGF-1(insulin-like growth factor-1, Sigma, U.S.A.), 10ng/ml bFGF(Fibroblast Growth Factor, Sigma, U.S.A.) 및 10units/ml murine LIF(leukemia inhibitory factor, Sigma, U.S.A.)가 첨가된 DMEM에 배지에서 96웰 플레이트를 사용하여 약 24시간 동안 배양한 다음, 리포펙타민(lipofectAMINE, Gibco BRL, U.S.A.)을 이용하여 제조사가 제공하는 다음과 같은 방법에 따라 유전자를 전이시켰다: 먼저, 약 400ng의 pCMVβ 벡터와 4.8㎍의 리포펙타민을 각각 20㎕의 Opti-MEM 배지에 희석한 다음, 전기 두 가지 희석액을 잘 혼합하고 30분간 실온에서 정치시켜, DNA:리포좀 혼합체(comoplex)가 형성되도록 하였다. 이어서, 전기 배양된 생식기세포를 PBS로 1회 세척하여 혈청을 제거하고, 전기 DNA:리포좀 혼합체를 첨가한 다음, 약 3시간 동안 배양하여 유전자가 전이되도록 하였다. 한편, 전기충격법에 의한 유전자 전이는 상기 실시예 3에 기술한 것과 동일한 방법으로 수행되었다. 전기 유전자가 전이된 생식기세포를 10% 우태아혈청, 10ng/ml IGF-1(Sigma, U.S.A.), 10ng/ml bFGF(Sigma, U.S.A.) 및 10units/ml murine LIF(Sigma, U.S.A.)가 첨가된 DMEM 배지 중에서 24시간 동안 배양하고, 피콜 밀도구배 분리방법을 이용하여 전기 유전자가 전이된 생식기세포로부터 생식기 유래 원시생식세포만을 분리한 다음, X-gal 염색법으로 유전자 전이효율을 측정, 비교분석하였다. 그 결과, 도 2a, 도 2b 및 하기 표 2에서 보듯이, 리포좀 방법을 이용한 경우의 유전자 전이효율은 약 17.5%인 반면, 전기충격법을 이용한 경우의 유전자 전이효율은 약 80.3%로, 리포좀을 이용한 경우에 비하여 약 4.6배 정도 높은 것으로 확인되었다.

생식기 유래 원시생식세포에서 전기충격법에 의한 유전자 전이효율과 리포좀 방법에 의한 유전자 전이효율의 비교

유전자 전이방법	유전자 전이 효율(%)
LipofectAMINE	17.5 ± 1.8
전기 충격법	80.3 ± 14.8

실시예 5: 유전자가 전이된 생식기 유래 원시생식세포의 수용체 배자 내로의 주입 및 PCR 분석

250V, 950㎌의 조건에서 DMSO를 사용하는 전기충격법으로 pCMVβ 벡터를 전이시킨 약 200여개의 생식기 유래 원시생식세포를 2.5일령 배자의 배동맥(dorsal aorta)을 통하여 주입하였다. 그런 다음, 파각된 부위를 파라핀 필름(Whatman Co., U.S.A.)으로 밀봉하고, 전기 배자를 추가로 3.5일(즉, 배발달 단계 29까지), 7.5일(즉, 배발달 단계 36까지) 또는 부화할 때까지 배양하였다. 이어서, 전기 배발달 단계 29 즉, 6일령 배자와 배발달 단계 36 즉, 10일령 배자의 생식기와 전기 부화된 병아리의 생식기, 간 및 심장으로부터 각각 클린턴의 방법에 따라 단백질분해효소 K(proteinase K)를 이용하여 DNA를 추출하고(참조: Clinton, M., Animal Gen., 25:361-362, 1994), 전기 DNA를 주형(template)으로 다음과 같은 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여, PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 pCMVβ 벡터가 포함하는 lacZ 유전자의 존재 여부를 검색하였다:

primer 1: 5'- AGA TGC ACG GTT ACG ATG C -3'

primer 2: 5'- GGT CAA ATT CAG ACG GCA AAC G -3'

이때, 대조군으로서는 유전자가 전이된 생식기 유래 원시생식세포를 주입하지 않은 배자의 생식기를 사용하였다. PCR로 증폭된 유전자 산물을 2%(w/v) 아가로오스 젤 전기영동으로 분석한 결과, 하기 표 3에서 보듯이 전기 6일령 배자는 100%, 10일령 배자는 약 67%, 그리고 부화한 병아리는 약 41%가 생식기에서 외래 유전자 즉, lacZ 유전자를 발현함을 확인하였다. 한편, 생식기에서 lacZ 유전자를 발현하는 병아리도 간과 심장 조직에서는 lacZ 유전자가 전혀 검출되지 않았다(참조: 도 3, 레인 1: 247bp lacZ 유전자; 레인 2: 닭의 게놈 DNA; 레인 3: lacZ 유전자가 전이된 원시생식세포를 주입하지 않은 배자의 생식기 DNA; 레인 4, 7, 10, 13; lacZ 유전자가 전이된 원시생식세포가 주입된 배자의 생식기 DNA; 레인 5, 8, 11, 14; lacZ 유전자가 전이된 원시생식세포가 주입된 배자의 간 DNA; 레인 6, 9, 12, 15; lacZ 유전자가 전이된 원시생식세포가 주입된 배자의 심장 DNA).

외래 유전자가 전이된 원시생식세포를 주입후 생식기 내에서 lacZ 유전자를 발현하는 배자의 비율

배자의 발육단계(부화일수)	주입한 배자의 수	생식선 내에서 lac Z 유전자를 발현하는 배자의 수(비율%)
Stage 29 (6일령)	9	9 (100%)
Stage 36 (10 일령)	6	4 (67%)
부화된 병아리	27	11 (41%)

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법 및 전기 방법에 의하여 유전자가 전이된 원시생식세포를 이용한 형질전환 조류의 생산방법을 제공한다. 본 발명자들은 종래의 전기충격법을 조류의 원시생식세포에 적합하도록 변형하고, 전기충격시 배지에 디메틸설폭사이드를 첨가함으로써, 원시생식세포 내로의 유전자 전이효율을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 조류 원시생식세포 내로의 효율적 유전자 전이방법은 종래의 유전자 전이방법들에 비하여 안전하고, 비교적 수월하며, 유전자 전이 효율이 높아, 외래 유전자가 전이된 원시생식세포의 다량제조를 가능케함으로써, 전기 유전자가 전이된 원시생식세포를 수용체 배자 내로 주입하는 방식으로 형질전환 조류의 생산까지도 실현시킬 수 있을 것이다.

Claims

다음과 같은 단계를 포함하는 형질전환 조류의 생산방법;

(ⅰ) 조류의 배자생식기, 배자혈액 또는 생식반월로부터 원시생식세포를 분리하는 단계;

(ⅱ) 상기 분리된 원시생식세포를 포함하는 배지에 1 내지 1.5%(v/v)의 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide) 및 외래 유전자를 첨가하고 230 내지 270 V 및 900 내지 950 ㎌의 조건하에서 전기 충격을 가하여 상기 원시생식세포내로 상기 외래 유전자를 전이하는 단계;

(ⅲ) 상기 전기 충격을 가한 원시생식세포를 디메틸설폭사이드가 결여된 배지에서 배양하여 유전자 전이를 완료시키는 단계; 및

(ⅳ) 상기 유전자 전이가 완료된 원시생식세포를 배자의 배동맥을 통하여 수용체 배자에 주입하고 배양하는 단계.