JP2012024090A - 型特異的ハイブリッド捕捉法による核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして二本鎖ハイブリッド(DNA/RNAハイブリッド)を形成し、ブロッカープローブを加えて過剰の捕捉配列にハイブリダイズさせ、固相に結合させたハイブリッドを検出する、標的核酸の検出方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的には、核酸の検出方法の分野に関連し、より詳しくは、標的特異的ハイブリッド捕捉法による核酸の検出に関連する。
生物学的試料に存在する特定の核酸配列の検出は、微生物の同定および分類、感染性疾患の診断、遺伝的異常の検出および特性化、癌に関連する遺伝子変化の同定、疾患に対する遺伝的感受性の研究、ならびに様々な治療の型に対する反応の測定にとって重要である。特定の核酸配列を検出することおよび定量することについての共通の技術は、核酸ハイブリダイゼーションである。
本発明は、試験試料において核酸の存在を検出するための方法を提供する。より詳しくは、本発明は、高い相同性をもつ核酸配列を識別および検出できる高特異性および高感度の方法を提供する。本発明についての好ましい使用は、当業者によく知られており、限定されるものではないが、挿入、欠失、逆位、反復配列、および一塩基多型(SNP)と同様に複数のものも含む様々な突然変異の検出および識別に適用されうる。さらに、本発明は、類似の配列エレメントを共有する核酸標的の検出のための群特異的でもありうる。
標的特異的ハイブリッド捕捉(TSHC)アッセイ法プロトコール
既知の濃度の単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)および単純ヘルペスウイルス2(HSV-2)ウイルス粒子(アドバンスドバイオテクノロジーズ社(Advanced Biotechnologies, Inc.)、コロンビア、MD)または臨床試料を陰性対照培養液(Negative Control Media)(ダイジーン社(Digene Corp.)、ゲーサーズバーグ、MD)または陰性子宮頸検体(Negative Cervical Specimens)(ダイジーン(Digene))のいずれかを用いて、希釈した。様々な希釈溶液を作製し、個々のミクロチューブへ等分した。変性試薬5100-0431(Denaturation Reagent 5100-0431)(ダイジーン)の半量を添加した。試験試料を試料中の核酸の変性のために65℃で45分間インキュベートした。
以下の表は、実施例3〜実施例13に記載されている実験において使用される様々なプローブを記載する。
捕捉効率へのビオチン標識の大きさの影響
試験は、TSHC検出にとって捕捉配列プローブあたりのビオチン標識の最適な数を決定するために行われた。実施例1に記載されている一般的なTSHC法を用いた。シグナルノイズ比(S/N)により測定される、1個、2個、または3個のビオチンで標識された捕捉配列プローブF15Rの捕捉効率を試験した。使用されるシグナル配列プローブはH19であった。表9に示されるように、捕捉配列プローブあたり2個のビオチンが最適の捕捉効率として十分であった。2個のビオチン標識を有する捕捉配列プローブを使用する場合、単一のビオチン標識された捕捉配列プローブと比較して、S/Nにおいて50 %以上の増加が観察された。捕捉配列プローブに3個目のビオチン標識を付加することにより、2個のビオチン標識捕捉配列プローブと比較してS/Nにおいて減少が生じた。
捕捉効率へのCSPおよびSSPの標的部位間の距離の影響
捕捉効率への、HSV-1標的核酸上の捕捉配列プローブ(CSP)およびシグナル配列プローブ(SSP)のハイブリダイゼーション部位間の距離の影響を評価した。SSPハイブリダイゼーション部位から0.2 kb、3 kb、18 kb、36 kb、および46 kbの位置にあるHSV-1標的核酸配列にハイブリダイズするCSPを試験した。実施例1に記載されている一般的なTSHC法を用いた。捕捉効率は、それぞれ、100 %、50 %、30 %、19 %および7 %であった(表10)。0.2 kbから46 kbへ距離が増加するにつれて、相対的捕捉効率において一定の低下が観察された。
HSV-1のTSHC検出への融合化捕捉配列プローブの効果
ストレプトアビジンプレートの結合能力は、ウェルにつき二倍ビオチン化CSPで約2 pモルであることが測定された。CSPは二倍にビオチン標識されているので、ウェルの結合能力を超えないためには最大限8つのCSP(1つのSSPにつき2つのCSP)が好ましい。提示された能力を上回るビオチン標識化捕捉配列プローブにおける少しの増加でも、いわゆる「フック効果」と呼ばれる、シグナルにおける減少を引き起こした。この「フック効果」を避けて、かつ4つ以上のSSP-CSPの組合わせの使用をなお可能にするために、(5'末端および3'末端を)いっしょに融合した2つのCSPの配列を含む合成オリゴヌクレオチドの効果を試験した。融合化捕捉配列プローブは、独立的に機能して、固有の標的部位へのハイブリダイゼーションを行いうる。もう一つの態様において、融合化プローブは、いったんプローブが第一の部位にハイブリダイズすれば、本質的にゼロ次速度論での単分子反応であるため、恵まれた第二のハイブリダイゼーションでもって2つの標的部位へ結合しうる。ハイブリダイゼーションは1つまたは両方の機構により決定されてもよい。以前の実験では、2つのCSPである、VH3およびNC-1が、いっしょに使用される場合、個々のCSPの約2倍のS/Nを与えることが示された。非融合化捕捉配列プローブVH-3およびNC-1は、5 pモル/mlの全濃度に対して各2.5 pモル/mlで使用され、融合化プローブVH-4(VH-3およびNC-1の融合)は2.5 pモル/mlで使用された。表11に示されるように、融合化プローブは2つの非融合化プローブの組合わせと同じくらいに効果的であった。それゆえ、融合化捕捉配列プローブを使用するTSHC検出は、プレートのビオチン結合能力を超えることなく、シグナル配列プローブにより標的される核酸配列の数を少なくとも2倍にすることを可能にする。実験はまた、2.0未満のS/N値により示されているように、107ゲノムでHSV-2の交差反応性はないことを証明している。
HSV-1のTSHC検出における様々なCSPおよびSSPの捕捉効率
TSHCによるHSV-1の検出において、4つのHSV-1特異的シグナル配列プローブ(SSP)である、H19、RH5B、RH3およびR10のそれぞれについて捕捉配列プローブ(CSP)の捕捉効率を評価した。捕捉配列プローブを設計するために用いられる基準は以下のとおりである:1)CSPハイブリダイゼーション部位は、HSV-1核酸配列上においてSSPハイブリダイゼーション部位の5'または3'のいずれかの1 kb以内、好ましくは0.5 kb以内である;および2)CSPは、10塩基以上のHSV-2に相同的な配列のひと続きをもたず、HSV-1に固有の配列を含む。CSPは、SSPハイブリダイゼーション部位に隣接する5'領域および3'領域を、好ましくは各SSPに対して5'CSPおよび3'CSPで標的するように設計された。オミガソフトウェア(Omiga software)(オックスフォードモレキュラーグループ(Oxford Molecular Group)、キャンベル、CA)をそのような部位の同定における手段とした。CSPの融解温度(Tm)は、HSVについてのハイブリッド捕捉II(Hybrid Capture II(HC II))アッセイ法(ダイジーン)において用いられる70℃〜75℃のハイブリダイゼーション温度と同じになるように、70℃〜85℃の間であるように設計された。実施例1に記載されている一般的なTSHC法を用いた。H19について11個のCSP(6つの異なる部位に結合する)、RH5Bについて6個のCSP(3つの固有の部位に結合する)、RH3について6個のCSP(6つの固有の部位に結合する)、およびR10について2個のCSPを試験した。表12に示されるように、シグナル配列プローブH19、RH5BおよびR10について、効率的な捕捉配列プローブが見出された。
HSV-2のTSHC検出における様々なCSPおよびSSPの捕捉効率
TSHCによるHSV-2の検出において、4つのHSV-2特異的シグナル配列プローブ(SSP)、E4A、E4B、Ei8およびi8のそれぞれについて捕捉配列プローブ(CSP)の捕捉効率を評価した。HSV-2特異的捕捉配列プローブ(CSP)は、それらがHSV-2特異的であるという必要条件を除いては、HSV-1のCSPと同じ基準に基づいて設計された。E4Aについては4個のCSP、E4Bについては3個のCSP、ならびにEi8およびi8については各2個のCSPを試験した。実施例1に記載されている一般的なTSHC法を用いた。表13に示されるように、i8およびEi8について、効率的な捕捉配列プローブが見出された。
HSV-1およびHSV-2の検出へのブロッカープローブの効果
捕捉段階を室温で起こるようにさせておきながら、TSHCの交差反応性を低下させる試みにおいて、ブロッカープローブを使用する方法を開発した。ブロッカープローブは、検出のために使用される捕捉配列プローブ(CSP)に相補的である配列を含む。これらの実験は、より低いストリンジェンシー条件、室温捕捉段階の間にしばしば遭遇する状況下において、CSPの試料中に存在する非標的核酸への非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐために設計された。
TSHC検出がベクターバックグラウンドを低下させる
TSHCアッセイ法は、ハイブリッド捕捉II(HC II)検出アッセイ法(ダイジーン)に関連することが多いベクター混入問題を排除する。HC IIに使用されるRNAシグナル配列プローブは線状化ベクター鋳型から作成されるので、いくらか残存している非線状化プラスミドDNAによりベクター配列に特異的な追加的RNAプローブ配列の産生が生じる。HC IIアッセイ法において、これらの読み過ごし(read-through)転写の結果として形成するRNA/DNAハイブリッドが抗体コーティング化プレート上に捕捉されて、シグナルを生じる。対照的に、TSHC法において、捕捉配列プローブにもまたハイブリダイズするそれらのRNA/DNAのみが検出される。したがって、ベクター関連配列のどの検出も排除される。HSV HC II試験(ダイジーン)において検出可能であることが知られているプラスミドSK+、pBR322、DgZ、および1066を2つのRNAシグナル配列プローブ(H19およびRH5b)および2つの捕捉配列プローブ(VH-2およびVH-4)を使用するTSHCアッセイ法において試験した。その後、RNAプローブの同一の組をHSV-1の検出についてのHC II法およびTSHC法に使用した。実施例1に記載されている一般的なTSHC法を用いた。表16に示されるように、標準HC IIにおけるシグナルノイズ比は14〜48の範囲であったが、TSHC法についてのシグナルノイズ比は試験されたすべてのプラスミドについて2未満であった。
TSHCによりHSV-1およびHSV-2を検出することの感度および特異性
HSV-1およびHSV-2のTSHC検出についての感度および分類識別力を実施例1に記載されているTSHCを用いて評価した。HSV-1のTSHCアッセイ法において、シグナル配列プローブH19およびRH5B、捕捉配列プローブHZ-1、VH-2およびVH-4、ならびにブロッカープローブNG-7、NG-8、GP-3、GP-4およびGP-1を使用した。HSV-2のTSHCアッセイ法において、シグナル配列プローブi8およびEi8、捕捉配列プローブNF-1およびNF-2、ならびにブロッカープローブHX-4、HX-5およびGP-8を使用した。HSV-1およびHSV-2のウイルス粒子は、陰性対照溶液を用いて様々な濃度に希釈された。図4および図5に示されるように、104のコピーのHSV-1またはHSV-2のどちらも(450コピー/ウェル)、それぞれのアッセイにおいて検出されたが、108コピー/ml(4,500,000コピー/ウェル)までの濃度(108コピー/mlを含める)で、交差反応性型のHSVの検出は事実上なかった。このように、HSV-1およびHSV-2のTSHCアッセイ法は、優れた感度(450 VP(ウイルス粒子)/ウェル)を維持しながら、10,000倍以上の識別範囲で2つのHSV型を区別することができる。
臨床検体試験
TSHC法およびHC II法の両方を用いて、64人の臨床検体パネルをHSV-1およびHSV-2について検査した。パネルは、既知量のHSV-1またはHSV-2を含む15試料、およびPCR試験によりHSV-1およびHSV-2について陰性であることがわかっている49試料を含んだ。したがって、15個の陽性試料はHC IIおよびTSHCのアッセイ法の両方において、陽性の試験結果となることが「予想」され、かつ49個の陰性試料はHC IIおよびTSHCの試験の両方において陰性の試験結果となることが「予想」された。実施例1に記載されている一般的なTSHC法を用いた。HC II法およびTSHC法を用いての結果は、それぞれ、表20および表21に示されている。陰性結果が生じることを「予想」されている49試料のうち、HC II法を用いた場合、5試料が陽性の試験結果となり、かつ44試料が陰性の試験結果となった。対照的に、TSHC法を用いた場合、すべての49試料が陰性の試験結果となった。それゆえ、TSHC法は、HSV-1およびHSV-2の検出において、HC II法よりも特異性について優れている。
HSVのTSHC検出におけるプローブを組み合わせることの効果
HSV-1検出におけるHSV-1特異的シグナル配列プローブおよび捕捉配列プローブの組を組み合わせることの効果を評価した。HSV-1およびHSV-2交差反応性のTSHC検出をRNAシグナル配列プローブ/ビオチン化捕捉配列プローブの組合わせの2つの異なる組(組1番:H19プラスHZ-1;および組2番:RH5bプラスTS-1およびTS-2)で別々に行った。TSHCはまた、両方のRNAシグナル配列プローブ/ビオチン化捕捉配列プローブの組を組み合わせて、2つのプローブ組を組み合わせることの感度および交差反応性への効果を評価するために行われた。実施例1に記載されている一般的なTSHC法を用いた。表22に示される結果より、HSV-2交差反応性に明らかな増加もなく、HSV-1検出についての2つのプローブ組を組み合わせることの相加作用が明らかに示されている。
HPV18およびHPV45のTSHC検出
ヒトパピローマウイルス18(HPV18)およびヒトパピローマウイルス45(HPV45)のTSHCおよびHC II検出の相対的感度および特異性を比較した。以前の研究より、HPV18に対する最も交差反応性が高いHPV型としてHPV45が、かつ逆に、HPV45に対する最も交差反応性が高いHPV型としてHPV18が確立されている。この研究において、HPV18およびHPV45を検出する2つの方法の能力をHPV18およびHPV45のプラスミドDNAを使用して評価した。
標的特異的ハイブリッド捕捉プラスアッセイ法プロトコール
B型肝炎ウイルス(HBV)は、標的核酸の検出についての標的特異的ハイブリッド捕捉プラス(TSHCプラス)アッセイ法の開発のためのモデル系として使用された。
以下の表は、実施例16〜実施例18に記載した実験において試験される様々なプローブを記載する。
HBVのTSHCプラス検出へのブロッカープローブの効果
室温捕捉段階の間、CSPへ非特異的にハイブリダイズする過剰SSP(M13 RNA/HBV-M13 DNA二重鎖)は、プレート上へ固定化され、その結果として高バックグラウンドシグナルを生じる。バックグラウンドシグナルを低下させる試みにおいて、ブロッカープローブをHBVのTSHCプラス検出に使用した。ブロッカープローブは、アッセイ法で用いられるハイブリダイゼーション温度より十分に低い温度で捕捉プローブにハイブリダイズすることしかできないように、CSPよりかなり短く設計された。
HBVのTSHCプラス検出へのSSPの長さの影響
SSPを産生するためのM13ベクターへ挿入されるDNA配列の長さのHBVのTSCH-プラス検出への影響を研究した。20 pg/mlのHBVプラスミドDNAを含む陽性対照を使用した。表29に示されるように、SSPにおいて長い方のHBV相補的配列(87塩基対)の使用が、検出のシグナルに実質的な増加を生じた。短い方のプローブのTm(融解温度)はハイブリダイゼーション温度より15度上であるため、最適状態に及ばないハイブリダイゼーション温度条件のせいである可能性は低い。SSPに形成されるM13 RNA/DNA二重鎖は、そのプローブにおける相補的DNA配列が標的核酸中のHBV配列にハイブリダイズすることを部分的に妨害するように作用するため、SSPにおいて相補的配列の長い方がこの妨害に打ち勝つのかもしれない。
HBVのTSHCプラスおよびHC II検出
HBVのTSHCプラスおよびHC II(ハイブリッド捕捉II、ダイジーン)検出の相対的感度を比較した。3つの異なる濃度のHBV陽性標準を実験において試験した。表30に示されるように、TSHCプラス検出方法を用いて得られたシグナルは、HC II検出方法を用いて得られたものより約2倍高かった。
SNPの標的特異的ハイブリッド捕捉検出のための試料調製
SNPを検出するためのTSHC法の態様として、標的分子としてp53 DNAを用い、かつp53コード領域のコドン72での多型またはSNP(Kawajiriら、Carcinogenesis. 14:1085〜1089, 1993)を識別することを本明細書において実証されているハイブリッド捕捉SNP(HC-SNP)法を提供する。アンチセンス鎖上のコドン72での2つのp53多型は、アルギニン(Arg)をコードするgCg、およびプロリン(Pro)をコードするアンチセンス鎖上のp53コドン72、gGgである。2つの多型をp53Argおよびp53Proと呼ぶ。これはHC-SNP法がヌクレオチドの特異的検出として用いられるSNPである。HC-SNP法がプローブ、プローブ標識、および標的のこれらの特定の型に限定されるのではなく、TSHC法として記載される変形の全範囲をも含むことができることは理解される。
および下流プライマー
を使用した(クラエス(klaes)ら、J. Mol. Med. 77:299〜302, 1999により記載)。これらのプライマーは、以下を含むプログラムを利用して、p53エキソン4領域(182塩基対)の増幅のために特に選択された:a)95℃で4分間;b)94℃で40秒間;c)62℃で40秒間;d)72℃で40秒間;e)72℃で6分間;およびf)保管のためまたは使用前は4℃であり、段階b)〜d)はDNA鋳型の質しだいで25〜45サイクル繰り返される。その後、PCR単位複製配列は、試験前に、TE(10 mM トリス;1 mM EDTA)、pH 7.4中で1:1000または1:100に希釈された。ゲノムDNAの調製のためのゲノムDNA試料の無制限な例には、限定されるものではないが、ヒト体液、細胞、組織、およびパラフィンブロック中の保管用組織を含む。ゲノムDNAの単離は、適切なキット(キアゲン(Qiagen))を使用して行われた。標的の増幅段階を迂回して直接的に多型を検出するためには、およそ、試験一組につき10 μg〜20 μgの単離されたゲノムDNAが必要とされた。
SNPを検出するための標的特異的ハイブリッド捕捉法
プラスミドDNA(p53-Argおよびp53-Pro)をキアプレップスピンミニプレップキット(Qiaprep Spin Miniprep Kit)(キアゲン社(Qiagen, Inc.);バレンシア、CA)を使用して細菌培養から調製した。ゲノムDNA(HeLa、SiHa、およびジャーカット)をDNイージー組織キット(DNeasy Tissue Kit)(キアゲン社)を使用して細胞系から調製した。プラスミドDNAおよび臨床試料DNAを前に記載されているPCR法(45サイクル)を用いて増幅した。使用前に、PCR増幅されたDNAをTE、pH 7.4中で1:1000に希釈し、プラスミドDNA試料をTE、pH 7.4中で100 pg/mlに希釈した。試験につき、希釈されたPCR増幅DNAまたはプラスミドDNAの5マイクロリットルを使用した。試験につきHeLa、ジャーカット、およびSiHaのゲノムDNAそれぞれについて、5 μg、7 μg、および10 μgを含む50マイクロリットルの抽出されたゲノムDNA試料をを使用した。各試料は各アッセイ法について独立して2回試験された。第一試験はp53-Arg CSPおよびp53 SSPを使用して行われた。第二試験はp53-Pro CSPおよびp53 SSPを使用して行われた。
Claims (92)
- 以下の段階を含む標的核酸を検出する方法:
a) 一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、該プローブと標的核酸との間に二本鎖ハイブリッドを形成する段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズすることができ、かつ相互にハイブリダイズしない段階;
b) ハイブリダイゼーション反応にブロッカープローブを加える段階であり、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする段階;
c) ハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階;および
d) 結合ハイブリッドを検出する段階。 - 以下の段階を含む標的核酸を検出する方法:
a) 一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を固定化捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、該プローブと標的核酸との間に二本鎖ハイブリッドを形成する段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズしない段階;
b) ハイブリダイゼーション反応にブロッカープローブを加える段階であり、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする段階;
c) 結合ハイブリッドを検出する段階。 - シグナル配列プローブが一本鎖である、請求項1または請求項2記載の方法。
- 捕捉配列プローブが少なくとも1つのリガンドで修飾されている、請求項1または請求項2記載の方法。
- リガンドがビオチンである、請求項4記載の方法。
- 捕捉配列プローブが5'末端および3'末端を有する線状であり、その5'末端および3'末端の両方がビオチン化されている、請求項5記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが3キロベース未満である、請求項1または請求項2記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが500ベース未満である、請求項1または請求項2記載の方法。
- 捕捉配列プローブが、標的核酸の異なる領域または異なる標的分子に相補的な2つまたはそれ以上の配列の融合体である、請求項1または請求項2記載の方法。
- 形成される二本鎖ハイブリッドがDNA/RNAハイブリッドである、請求項1または請求項2記載の方法。
- ハイブリダイゼーション段階の前に一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を形成する段階をさらに含む、請求項1または請求項2記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項1または請求項2記載の方法。
- 段階a)および段階b)が同時に行われる、請求項1記載の方法。
- 段階a)および段階c)が同時に行われる、請求項1記載の方法。
- 段階a)、段階b)および段階c)が同時に行われる、請求項1記載の方法。
- 段階a)および段階b)が同時に行われる、請求項2記載の方法。
- ブロッカープローブが捕捉配列プローブの融解温度より低い融解温度を有する、請求項1または請求項2記載の方法。
- ハイブリッドが固相上へ捕捉される、請求項1記載の方法。
- 固相がストレプトアビジンでコーティングされている、請求項17記載の方法。
- 固相がマイクロプレートである、請求項17記載の方法。
- 段階c)が室温で実行される、請求項1記載の方法。
- 結合ハイブリッドがそのハイブリッドを認識する抗体を使用して検出される、請求項1または請求項2記載の方法。
- ハイブリッドがDNA/RNA-ハイブリッドである、請求項22記載の方法。
- DNA/RNAハイブリッドを認識する抗体がアルカリホスファターゼで標識されている、請求項22記載の方法。
- 以下の段階を含む標的核酸を検出する方法:
a) 一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズする段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズせず、該ハイブリダイゼーションにより該シグナル配列プローブと標的核酸との間にRNA/DNAハイブリッドが形成される段階;および
b) RNA/DNAハイブリッドが、そのRNA/DNAハイブリッドを認識する抗体を該ハイブリッドに結合することにより検出される段階であり、該抗体は検出可能に標識されている段階。 - 段階a)において形成されるハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- シグナル配列プローブが一本鎖である、請求項25記載の方法。
- 捕捉配列プローブが少なくとも1つのリガンドで修飾されている、請求項25記載の方法。
- 捕捉配列プローブがビオチン化されている、請求項28記載の方法。
- 捕捉配列プローブが5'末端および3'末端を有する線状であり、その5'末端および3'末端の両方がビオチン化されている、請求項29記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが3キロベース未満である、請求項25記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが500ベース未満である、請求項25記載の方法。
- ハイブリダイゼーション段階の前に一本鎖の標的核酸を形成する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項25記載の方法。
- 段階a)において形成されるハイブリッドを固相上へ結合して、結合ハイブリッドを形成する、請求項25記載の方法。
- 結合ハイブリッドが室温で形成される、請求項35記載の方法。
- 固相がストレプトアビジンでコーティングされている、請求項35記載の方法。
- 固相がマイクロプレートである、請求項35記載の方法。
- 抗体がアルカリホスファターゼで標識されている、請求項25記載の方法。
- ブロッカープローブをハイブリダイゼーション段階に加える段階をさらに含み、該ブロッカープローブがハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする、請求項25記載の方法。
- ブロッカープローブが、捕捉配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションに続いてハイブリダイゼーション反応に加えられる、請求項40記載の方法。
- ブロッカープローブが捕捉配列プローブの融解温度より低い融解温度を有する、請求項40記載の方法。
- 以下の段階を含む標的核酸を検出する方法:
a) 一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズする段階であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズせず、シグナル配列プローブはDNA/RNAハイブリッド領域を含み、該ハイブリダイゼーションにより複合体が形成される段階;および
b) 該複合体を検出する段階。 - シグナル配列プローブが少なくとも40塩基対の長さを含む、請求項43記載の方法。
- 捕捉配列プローブが少なくとも6塩基対の長さを含む、請求項43記載の方法。
- 捕捉配列プローブが固相上に固定化されている、請求項45記載の方法。
- 複合体が、DNA/RNAハイブリッド領域を認識する抗体を該領域に結合することにより検出され、その抗体が検出可能に標識されている、請求項43記載の方法。
- 捕捉配列プローブが少なくとも1つのリガンドで修飾されている、請求項43記載の方法。
- リガンドがビオチンである、請求項48記載の方法。
- 捕捉配列プローブが5'末端および3'末端を有する線状であり、その5'末端および3'末端の両方がビオチン化されている、請求項49記載の方法。
- ブロッカープローブをハイブリダイゼーション段階後に加える段階をさらに含み、該ブロッカープローブがハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする、請求項43記載の方法。
- ブロッカープローブが捕捉配列プローブの長さより4塩基対〜10塩基対短い長さを含む、請求項51記載の方法。
- 配列番号:1から配列番号:160までからなる群より選択される配列からなる核酸プローブ。
- シグナル配列プローブがDNA/RNA二重鎖構造を有する第一の領域と一本鎖の核酸配列を有する第二の領域とを含む、請求項1記載の方法。
- DNA/RNA二重鎖がM13 DNA-M13 RNA二重鎖である、請求項54記載の方法。
- 以下の段階を含む標的核酸を検出する方法:
a) 一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブ、架橋プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、二本鎖ハイブリッドを形成する段階であり、捕捉配列プローブおよび架橋プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズせず、ならびにシグナル配列プローブは架橋プローブにハイブリダイズし、かつ標的核酸および捕捉配列プローブにハイブリダイズしない段階;
b) ブロッカープローブをハイブリダイゼーション反応に加える段階であり、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする段階;
c) ハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階;および
d) 結合ハイブリッドを検出する段階。 - シグナル配列プローブがDNA/RNA二重鎖構造を有する第一の領域および一本鎖の核酸を有する第二の領域を含む、請求項56記載の方法。
- DNA/RNA二重鎖がM13 DNA-M13 RNA二重鎖である、請求項57記載の方法。
- DNA/RNA二重鎖がシグナル配列プローブ内の反復配列とその反復配列に相補的な配列を有する核酸分子との間に形成されるハイブリッドである、請求項57記載の方法。
- 架橋プローブがポリ(A)テールをさらに含む、請求項56記載の方法。
- シグナル配列プローブが、架橋プローブのポリ(A)テールにハイブリダイズする一本鎖ポリ(dT)DNA配列、およびシグナル配列プローブのポリ(dT)配列とポリ(A)配列を有する核酸分子との間に形成されるDNA/RNA二重鎖を含む、請求項60記載の方法。
- 以下の段階:
a) 一本鎖または部分的一本鎖の標的核酸を捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブにハイブリダイズして、該プローブと標的核酸との間に二本鎖ハイブリッドを形成する段階;
b) ハイブリッドを固相に結合して、結合ハイブリッドを形成する段階;および
c) 結合ハイブリッドを検出する段階、
を含む標的核酸を検出する方法であり、捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブは標的核酸内の重複しない領域にハイブリダイズし、かつ相互にハイブリダイズしない方法。 - 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項62記載の方法。
- 段階a)および段階b)が同時に行われる、請求項62記載の方法。
- ブロッカープローブを加える段階をさらに含み、該ブロッカープローブはハイブリダイズされていない過剰の捕捉配列プローブにハイブリダイズする、請求項62記載の方法。
- ブロッカープローブの添加およびハイブリダイゼーション段階が同時に行われる、請求項65記載の方法。
- ブロッカープローブの添加および結合段階が同時に行われる、請求項65記載の方法。
- シグナル配列プローブが一本鎖である、請求項62記載の方法。
- 捕捉配列プローブが少なくとも1つのリガンドで修飾されている、請求項62記載の方法。
- リガンドがビオチンである、請求項62記載の方法。
- 捕捉配列プローブが5'末端および3'末端を有する線状であり、その5'末端および3'末端の両方がビオチン化されている、請求項70記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが3キロベース未満である、請求項62記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブが標的核酸の領域にハイブリダイズし、その領域の隔たりが500ベース未満である、請求項62記載の方法。
- 捕捉配列プローブが、標的核酸の異なる領域または異なる標的分子に相補的な2つまたはそれ以上の配列の融合体である、請求項62記載の方法。
- 形成される二本鎖ハイブリッドがDNA/RNAハイブリッドである、請求項62記載の方法。
- ハイブリダイゼーション段階の前に一本鎖DNAを形成する段階をさらに含む、請求項62記載の方法。
- 捕捉配列プローブおよびシグナル配列プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションが連続的に行われる、請求項62記載の方法。
- 段階a)および段階b)が同時に行われる、請求項62記載の方法。
- ブロッカープローブが捕捉配列プローブの融解温度より低い融解温度を有する、請求項63記載の方法。
- 固相がストレプトアビジンでコーティングされている、請求項63記載の方法。
- 固相がマイクロプレートである、請求項73記載の方法。
- 段階b)が約20℃〜90℃で実行される、請求項62記載の方法。
- 捕捉配列プローブが少なくとも6ベースの長さを含む、請求項82記載の方法。
- 段階b)が室温で実行される、請求項62記載の方法。
- 結合ハイブリッドが、ハイブリッドを認識する抗体を使用して検出される、請求項62記載の方法。
- ハイブリッドがDNA/RNAハイブリッドである、請求項85記載の方法。
- DNA/RNAハイブリッドを認識する抗体がアルカリホスファターゼで標識されている、請求項85記載の方法。
- シグナル配列プローブが欠失した捕捉配列プローブ領域を含み、かつ標的核酸に相補的である、請求項62記載の方法。
- 標的核酸が一塩基多型である、請求項62記載の方法。
- ハイブリッドの固相への結合の特異性が、室温より高い温度によって調節される、請求項89記載の方法。
- ハイブリッドの固相への結合の特異性が、ブロッカープローブの添加によって調節される、請求項89記載の方法。
- ハイブリッドの固相への結合の特異性が、室温より高い温度およびブロッカープローブの添加によって調節される、請求項89記載の方法。
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