PT1967594E - Deteção de ácidos nucleicos por um método de captura híbrida tipo-específica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DETEÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR UM MÉTODO DE CAPTURA HÍBRIDA

TIPO-ESPECÍFICA

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao campo dos métodos de deteção de ácidos nucleicos, em geral, e refere-se, mais especificamente, à deteção de ácidos nucleicos por métodos de captura híbrida alvo-específica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A deteção de sequências de ácidos nucleicos específicas presentes numa amostra biológica é importante para identificar e classificar microrganismos, diagnosticar doenças infeciosas, detetar e caracterizar anomalias genéticas, identificar alterações genéticas associadas ao cancro, estudar a susceptibilidade genética a doenças, e medir a resposta a vários tipos de tratamento. Uma técnica comum para detetar e quantificar sequências de ácidos nucleicos específicas é a hibridação de ácidos nucleicos.

Encontram-se disponíveis vários métodos de hibridação para a deteção e estudo de ácidos nucleicos. Num método tradicional de hibridação, os ácidos nucleicos a ser identificados estão numa solução ou fixos num suporte sólido. Os ácidos nucleicos são detetados usando-se sondas de ácidos nucleicos marcadas que são capazes de hibridar com os ácidos nucleicos. Recentemente, foram desenvolvidos novos métodos de hibridação para aumentar a sensibilidade e especificidade da deteção. Embora esses novos métodos de hibridação apresentem melhorias significativas em relação aos métodos tradicionais, ainda não têm a capacidade de discriminar completamente entre sequências de ácidos nucleicos com uma homologia muito elevada. É, portanto, um objectivo da presente invenção fornecer um método de hibridação que é não só rápido e sensível, mas também é extremamente específico e capaz de discriminar entre sequências alvo de ácidos nucleicos com uma homologia muito elevada. 0 documento US 5641630 revela um método para a deteção de uma sequência alvo de ácido nucleico selecionada que envolve a hibridação da sequência alvo de ácidos nucleicos com uma primeira sonda de ácido nucleico de cadeia simples, em que a sequência da primeira sonda está ligada covalentemente a um primeiro agente de complexação. Uma segunda sonda de ácido nucleico de cadeia simples, que tem uma sequência complementar a uma porção selecionada da sequência alvo que é diferente daquela que é complementar à primeira sonda, híbrida com o alvo e um grupo repórter detetável é ligado à sequência da segunda sonda.

O documento US 5681697 revela um método para detetar analitos de ácido nucleico numa amostra. O método usa duas ou mais moléculas distintas de captura, denominadas "extender", cada uma das quais se deve ligar tanto ao analito como às sondas de captura ligadas ao suporte. Isto permite a ligação de uma maior quantidade de marcador no complexo analito-sonda. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um novo método de deteção de ácidos nucleicos, referido no presente documento como captura híbrida alvo-específica ("TSHC", do inglês, target-specific hybrid capture). A TSHC é um método extremamente específico e sensível que é capaz de discriminar e detetar sequências alvo de ácidos nucleicos com um homologia extremamente elevada.

Numa forma de realização, o método refere-se à deteção de um ácido nucleico alvo, em que o ácido nucleico alvo, que é de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples, é hibridado simultaneamente ou sequencialmente com uma sonda de sequência de captura e uma sonda de sequência de sinal não marcada. Estas sondas hidridam com regiões do ácido nucleico alvo que não se sobrepõem e não hibridam entre si, formando-se desta forma híbridos de cadeia dupla. Os híbridos são capturados numa fase sólida e detetados. Numa forma de realização preferida, forma-se um híbrido de ADN/ARN entre o ácido nucleico alvo e a sonda de sequência de sinal. A utilização deste método permite a deteção, por exemplo, através da ligação de um anticorpo marcado capaz de reconhecer o híbrido de ADN/ARN ao híbrido de cadeia dupla, detetando-se, dessa forma, o híbrido.

Noutra forma de realização, a sonda da sequência de sinal usada no método de deteção é uma molécula de ácido nucleico que compreende um duplex de ADN/ARN e uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples que é capaz de hibridar com o ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples. A deteção pode ser conseguida, por exemplo, por meio da ligação de um anticorpo marcado capaz de reconhecer a porção duplex ADN/ARN da sonda de sequência de sinal, detetando-se, assim, o híbrido formado entre o ácido nucleico alvo, a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal.

Ainda noutra forma de realização, a sonda de sequência de sinal usada no método de deteção é uma molécula que não contém sequências que sejam capazes de hibridar com o ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples. Utilizam-se sondas "ponte" (bridge) que conseguem hibridar tanto com o ácido nucleico alvo bem como com sequências que são capazes de hibridar com a sonda de sequência de sinal. Nesta forma de realização, a sonda de sequência de sinal compreende uma porção de duplex ADN/ARN e uma porção de uma sequência de ADN de cadeia simples que contém sequências complementares às sequências presentes na sonda "ponte". A sonda "ponte", que híbrida com o ácido nucleico alvo e com a sonda de sequência de sinal, funciona, portanto, como um intermediário para ligar a sonda de sequência de sinal ao ácido nucleico alvo e à sonda de sequência de captura hibridada com o ácido nucleico alvo.

Noutra forma de realização do método de TSHC da invenção, usam-se no método sondas de bloqueio (do inglês, blocker probes) que compreendem oligonucleótidos complementares às sondas de sequência de captura para eliminar sonda de sequência de captura em excesso, reduzindo dessa forma o sinal de ruído de fundo na deteção e aumentando a especificidade do ensaio. A presente invenção refere-se igualmente a novas sondas. Estas sondas são sequências de ácidos nucleicos que podem funcionar em vários ensaios de hibridação, incluindo, por exemplo, o ensaio de TSHC.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um diagrama esquemático que exemplifica uma forma de realização do método de captura híbrida alvo-específica. A Figura 2 é um diagrama esquemático que exemplifica uma forma de realização do método de captura híbrida alvo-específica. A Figura 3 é um diagrama esquemático que apresenta possíveis mecanismos de ação de uma forma de realização que utiliza sondas de sequência de captura fundidas na deteção por captura híbrida alvo-específica. A Figura 4 mostra a sensibilidade e especificidade analítica da deteção de HSV-1 por captura híbrida alvo-específica. A Figura 5 mostra a sensibilidade e especificidade analítica da deteção de HSV-2 por captura híbrida alvo-específica.

As Figuras 6A a 6D mostram várias formas de realização do método de captura híbrida- alvo-específica-plus.

A Figura 7 mostra a forma de realização com a sonda de deleção do método de captura híbrida alvo-específica. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para detectar a presença de ácidos nucleicos em amostras de teste. Mais especif icamente, a invenção proporciona um método extremamente específico e sensível que é capaz de discriminar e detetar sequências de ácidos nucleicos com um homologia extremamente elevada. Usos preferidos para esta invenção são bem conhecidos do especialista na área e podem ser aplicados à deteção e discriminação de uma variedade de mutações incluindo, mas sem que isso constitua uma limitação, inserções, deleções, inversões, sequências repetidas, e polimorfismos de nucleótidos múltiplos bem como polimorfismos de nucleótido único (SNP). Adicionalmente, a presente invenção pode também ser especifica em termos de grupos para a deteção de alvos de ácidos nucleicos que partilham elementos semelhantes na sequência.

Pode usar-se como amostra de teste qualquer fonte de ácido nucleico, na sua forma purifica ou não purificada. Por exemplo, a amostra de teste pode ser um produto alimentar ou agrícola ou um espécime clínico veterinário ou humano. Tipicamente, a amostra de teste é um fluído biológico como urina, sangue, plasma, soro, expetoração, ou afins. Alternativamente, a amostra de teste pode ser um espécime de tecido que se suspeita conter um ácido nucleico de interesse. 0 ácido nucleico alvo na amostra de teste pode estar inicialmente presente como uma molécula discreta, constituindo a sequência a detetar um ácido nucleico inteiro, ou ser apenas um componente de uma molécula maior. Não é necessário que a sequência de ácido nucleico a ser detetada esteja inicialmente presente numa forma pura. A amostra de teste pode conter uma mistura complexa de ácidos nucleicos, dos quais o ácido nucleico alvo pode corresponder a uma gene de interesse presente no ADN ou ARN genómico humano total ou uma porção da sequência de ácido nucleico de um organismo patogénico, organismo esse que é um componente menor de uma amostra clínica. 0 ácido nucleico alvo numa amostra de teste pode ser ADN ou ARN, como ARN mensageiro, proveniente de qualquer fonte, incluindo, bactérias, leveduras, vírus, e células ou tecidos de organismos superiores como plantas ou animais. Métodos par aa extração e /ou purificação desses ácidos nucleicos são bem conhecidos na área. Os ácidos nucleicos alvo podem ser de cadeia simples ou dupla. No presente método, prefere-se que os ácidos nucleicos alvo sejam de cadeia simples ou que sejam transformados em cadeia simples por técnicas convencionais de desnaturação antes das etapas de hibridação do método. Numa forma de realização preferida, a técnica de desnaturação alcalina é usada para desnaturar o ADN alvo de cadeia dupla. 0 termo "oligonucleótido" conforme é utilizado no presente documento refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende dois ou mais desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos. Um oligonucleótido desejado pode ser purificado por qualquer método adequado, como purificação a partir de um ácido nucleico de ocorrência natural, por métodos de biologia molecular, ou por síntese de novo. As sondas de ácido nucleico descritas no presente documento constituem exemplos de oligonucleótidos.

As sondas de ácido nucleico são sequências detetáveis de ácido nucleico que hibridam com as sequências complementares de ARN ou ADN presentes numa amostra de teste. Deteção da sonda indica a presença de uma determinada sequência de ácido nucleico na amostra de teste. Numa forma de realização, o método de captura híbrida alvo-específica utiliza dois tipos de sondas de ácidos nucleicos: sonda de sequência de captura (CSP, do inglês capture sequence probe) e sonda de sequência de sinal (SSP, do inglês signal sequence probe) . Uma sonda de sequência de captura compreende uma sequência de ácido nucleico que é capaz de hibridar com uma ou mais regiões únicas num ácido nucleico alvo e de ser capturada numa fase sólida. Uma sonda de sequência de sinal compreende uma sequência de ácido nucleico que é capaz de hibridar com regiões num ácido nucleico alvo que são adjacentes às regiões únicas reconhecidas pela CSP. As sequências das CSP e SSP são selecionadas de modo a que não hibridem com a mesma região de um ácido nucleico alvo ou entre si.

Adicionalmente, a CSP e a SSP são selecionadas para hibridar com regiões do alvo a uma distância de 50 000 bases uma da outra. A distância entre a sequência com que a CSP híbrida no ácido nucleico alvo e a sequência com que a SSP híbrida é preferencialmente entre 1 a 50 000 bases, mais preferivelmente, a distância é inferior a 3000 bases. Mais preferivelmente, a distância é inferior a 1000 bases. A CSP usada no método de deteção pode ser ADN, ARN, ácidos nucleicos peptidicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA, do inglês locked nuclei acid) , ou outros análogos de ácido nucleico. Um "ácido nucleico bloqueado" conforme se define no presente documento é uma nova classe de análogos oligonucleotidicos que formam duplexes com ADN e ARN complementares com uma estabilidade térmica e seletividade elevadas. A liberdade conformacional normal do anel de furanose nos nucleosidos convencionais é restrita nos LAN por um linker de metileno que liga a posição 2 '-O à posição 4 ' -C. Os PNA são oligonucleotidos em que a estrutura açúcar-fosfato é substituída por uma estrutura em poliamida ou "pseudopéptido". Numa forma de realização preferida, a CSP é ADN. A CSP tem um comprimento mínimo de 6 bases, de preferência entre 15 a 100 bases, e mais preferencialmente entre 20 a 40 bases. A CSP é substancialmente complementar à sequência presente num ácido nucleico alvo com o qual híbrida. A sequência de uma CSP é preferencialmente pelo menos 75% complementar à região de hibridação alvo, mais preferencialmente, 100% complementar a esta sequência. Também se prefere que a CSP contenha uma identidade de sequência igual ou inferior a 75%, mais preferencialmente uma identidade de sequência inferior a 50%, com sequências não desejadas que se pensa estarem presentes numa amostra de teste. A sequência presente no ácido nucleico alvo ao qual a CSP se liga tem um comprimento preferencialmente de 6 bases, mais preferencialmente de 20 a 40 bases. Também pode ser preferível que as sequências com as quais a CSP híbrida sejam sequências únicas ou sequências grupo-específicas. As sequências grupo-específicas são várias sequências aparentadas que formam grupos discretos.

Numa forma de realização, a CSP usada no método de deteção pode conter uma ou mais modificações no ácido nucleico que permite a captura específica da sonda numa fase sólida. Por exemplo, a CSP pode ser modificada por adição de um ligando como etiqueta por métodos bem conhecidos dos especialistas na área incluindo, por exemplo, por nick-translation, ou por incorporação química ou fotoquímica. Além disso, a CSP pode ser "etiquetada" em várias posições com um ou vários tipos de marcadores. Por exemplo, a CSP pode ser etiquetada com biotina, que se liga à estreptavidina, ou digoxigenina que se liga à anti-digoxigenina; ou 2,4-dinitrofenol (DNP), que se liga a anti-DNP. Também se pode usar fluorogéneos para modificar as sondas. Exemplos de fluorogéneos incluem fluoresceína e derivados, ficoeritrina, aloficocianina, ficocianina, rodamina, Texas Red ou outros flurogéneos proprietários. Os flurogéneos são geralmente ligados por modificação química e ligam-se a um anticorpo específico para o flurogéneo como anti-f luoresceína. Será evidente para os especialistas na área que as CSP também podem ser etiquetadas por incorporação de uma base modificada contendo qualquer groupo químico que possa ser reconhecido por anticorpos específicos. Outras etiquetas e métodos de etiquetar sequências nucleotidicas para captura numa fase sólida revestida com substrato são bem conhecidos dos especialistas na área. Para um artigo de revisão sobre os marcadores de ácidos nucleicos veja-se Landegren, et al., "ADN Diagnostics-Molecular Techniques and Automation", Science, 242:229-237 (1988) .

Numa forma de realização preferida, a CSP é etiquetada com biotina em ambas as extremidades 5' e 3' da sequência nucleotidica. Noutra forma de realização, a CSP não é modificada, mas é capturada numa matriz sólida devido às sequências contidas na CSP que são capazes de hibridar com a matriz. A SSP usada no método de deteção pode ser um ADN ou ARN. Numa forma de realização particular da invenção, a SSP e o ácido nucleico alvo formam um híbrido de ADN/ARN. Por conseguinte, nesta forma de realização, se o ácido nucleico alvo é ADN, então a SSP preferida é um ARN. De igual modo, se o ácido nucleico alvo é ARN, então a SSP preferida é um ADN. A SSP tem geralmente um comprimento de 15 bases. Porém, a SSP pode ter um comprimento de até 1000 bases ou superior. Preferem-se as SSP de maior comprimento. A SSP pode compreender um único fragmento de ácido nucleico ou múltiplos fragmentos de ácido nucleicos de menor comprimento, fragmentos esses que têm preferencialmente um comprimento entre 15 e 100 bases.

Noutra forma de realização, a SSP usada no método de deteção compreende um duplex de ADN/ARN e uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples capaz de hibridar com o ácido nucleico alvo (Fig. 6A) . A SSP pode ser preparada clonando-se, primeiro, uma sequência de ADN de cadeia simples complementar a sequências presentes no ácido nucleico alvo num vetor de ADN de cadeia simples, hibridando-se a seguir o ARN complementar com a sequência do vetor de ADN para gerar um duplex ADN/ARN. Por exemplo, caso se utilize M13 como o vetor de ADN, ARN de M13 é hibridado com a sequência de ADN de M13 no vetor para gerar um duplex ADN/RNA. A SSP resultante vai conter uma porção de duplex ADN/ARN bem como uma porção de cadeia simples capaz de hibridar com sequências presentes no ácido nucleico alvo. O ADN de cadeia simples deverá ter um comprimento de pelo menos 10 bases, podendo atingir 1000 ou mais bases. Alternativamente, a porção duplex ADN/ARN da SSP pode ser formada durante ou após a reação em que a porção de cadeia simples da SSP é hibridada com o ácido nucleico alvo. A SSP pode ser linear, circular ou uma combinação de duas ou mais formas. A porção do duplex ADN/ARN da SSP proporciona sinais amplificados para a deteção de híbridos capturados usando-se anticorpos anti-ADN/ARN, conforme se descreve no presente documento.

Ainda noutra forma de realização, a SSP usada no método de deteção é uma molécula que não contém sequências que sejam capazes de hibridar com o ácido nucleico alvo. Nesta forma de realização, utilizam-se sondas "ponte" (do inglês, bridge probes) que conseguem hibridar tanto com o ácido nucleico alvo como com as sequências que são capazes de hibridar com a SSP. As sondas "ponte" podem ser ADN, ARN, ácidos nucleicos peptidicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA, do inglês locked nuclei acid), ou outros análogos de ácido nucleico. Numa forma de realização (Fig. 6B), a SSP compreende uma porção de duplex ADN/ARN e uma porção de cadeia simples que contém sequências complementares às sequências presentes na sonda "ponte". A sonda "ponte", que é capaz de hibridar com o ácido nucleico alvo e com a SSP, funciona, portanto, como um intermediário para ligar a SSP ao ácido nucleico alvo e à CSP hibridada com o ácido nucleico alvo. A SSP pode ser preparada conforme se descreveu acima. Noutra forma de realização (Fig. 6C) , a SSP usada no método de deteção compreende múltiplos conjuntos de sequências repetidas bem como uma sequência de ARN de cadeia simples capaz de hibridar com a sonda "ponte". Pode usar-se uma sonda oligonucleotidica de ADN contendo sequências complementares às sequências repetidas para hibridar com a SSP de modo a gerar o duplex ARN/ADN necessário para a amplificação de sinal. Ainda noutra forma de realização (Fig. 6D), a sonda "ponte" contém uma cauda poli-A para além das sequências que conseguem hibridar com o ácido nucleico alvo. A SSP usada neste exemplo contém sequências de ADN com poli-dT. A sonda "ponte" é, portanto, capaz de hibridar com a SSP através da sua cauda poli-A. Uma sonda de ARN contendo sequências com poli-A pode ser usada para hibridar com as restantes sequências de ADN com poly-dT presentes na SSP para formar um duplex ARN/ADN. A SSP que contém as sequências com poli-dT e a sonda de ARN que contém sequências com poli-A têm preferencialmente um comprimento de 100 a 5000 bases. A SSP usada no método de deteção da invenção pode ser ou não modificada, tal como a CSP, com os métodos acima descritos e/ou conhecidos da área. Numa forma de realização preferida, a SSP é uma sonda não modificada covalentemente.

Deve ficar claro que se podem utilizar múltiplas CSP e/ou SSP no método de deteção da invenção.

Noutra forma de realização, uma sonda oligonucleotídica contendo sequências complementares a duas ou mais regiões distintas do ácido nucleico alvo são fundidas entre si e usadas como a sonda de sequência de captura no método da invenção. Alternativamente, uma única sonda pode ser concebida e produzida que contenha sequências complementares a um ou vários ácidos nucleicos alvo. Este tipo de sonda é referida no presente documento como CSP "fundida". Conforme descrito no Exemplo 5, a sonda de sequência de captura fundida funciona de forma tão eficaz como a combinação das duas CSP não fundidas quando usada à mesma concentração.

Numa outra forma de realização da presente invenção, pode usar-se na TSHCsondas de ácidos nucleicos de deleção". Para minimizar o número de moldes de transcrição que é necessário construir, sondas de ácido nucleico de deleção, por exemplo de ARN, são concebidas de modo a que 1) o comprimento da sonda seja maximizado e 2) as sondas não apresentem sobreposição com a região que é o alvo da CSP. Estas sondas de deleção contêm deleções internas no molde de ácido nucleico usado para gerar as sondas. Além disso, estas sondas de deleção hibridam com os alvos de ácido nucleico criando "bolhas" de ácido nucleico não hibridado acessíveis para hibridação com a CSP. Este método proporciona também um modo muito conveniente para produzir sondas uma vez que o ácido nucleico para a totalidade do alvo pode ser clonada num vetor de transcrição e, a seguir, após terem sido identificadas como regiões úteis para hibridação com CSP, podem ser removidas. Adicionalmente, este método permite a utilização de sondas genómicas completas e de comprimento quase completo que não se sobrepõem (i.e. não hibridam com a mesma região) em relação às CSP. Pode utilizar-se qualquer kit de mutagénese disponível comercialmente para desenhar deleções alvo num molde de transcrição. Tipicamente, as deleções do molde de ácido nucleico usadas para a síntese de SSP são efetuadas diretamente com o molde clonado no vetor de transcrição. As deleções no molde são efetuadas de modo a que as sequências com sobreposição à região hibridada pela CSP sejam removidas. As deleções pode ser pequenas, por exemplo a própria região CSP, mas geralmente e mais preferencialmente as deleções abrangem aproximadamente 100 a 300 nucleótidos nas extremidades 5' e 3' da região hibridada pela CSP. (Veja-se a Figura 7).

As sondas de ácido nucleico da invenção podem ser produzidas por qualquer método adequado conhecido na área, incluindo, por exemplo, síntese química, isolamento a partir de uma fonte de ocorrência natural, produção recombinante e PCR assimétrico (McCabe, 1990 In: PCR Protocols : A guide to methods and applications. San Diego, CA., Academic Press, 76-83) . Poderá ser preferível sintetizar-se quimicamente as sondas em um ou mais segmentos e, subsequentemente, ligar-se os segmentos. Vários métodos de síntese química são descritos em Narang et al. (1979 Meth. Enzymol. 68:90), Brown et al. (1979 Meth. Enzymol. 68:109) e Caruthers et al. (1985 Meth. Enzymol. 154:287) . Alternativamente, os métodos de clonagem podem produzir um fragmento de ácido nucleico conveniente que pode ser isolado para utilização como um iniciador do promotor. Uma sonda de ADN de cadeia dupla é inicialmente transformada numa sonda de cadeia simples usando-se, por exemplo, métodos convencionais de desnaturação antes da hibridação com os ácidos nucleicos alvo. A hibridação é realizada sob condições padrão de hibridação bem conhecidas dos especialistas na área. As condições de reação para a hibridação de uma sonda com uma sequência de ácido nucleico são diferentes de sonda para sonda, dependendo de fatores como o comprimento da sonda, o número de nucleótidos de G e de C na sequência, e a composição do tampão utilizado na reação de hibridação. Condições de hibridação moderadamente restringentes são geralmente compreendidas pelos especialistas na área como condições aproximadamente 25°C abaixo do ponto de fusão de um ADN de cadeia dupla perfeitamente emparelhado. Uma maior especificidade é geralmente obtida quando se usa condições de incubação de maior temperatura, por outras palavras, sob condições mais restringentes. No capítulo 11 do conhecido manual de laboratório de Sambrook et al. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque (1990) são descritas as condições de hibridação pra sondas oligonucleotídicas em grande pormenor, incluindo uma descrição dos fatores envolvidos e o nível de restringência necessário para garantir uma hibridação com especificidade. A hibridação é tipicamente efetuada numa solução aquosa tamponada, em que as condições como temperatura, concentração salina e pH são selecionadas para proporcionar uma restringência suficiente para que as sondas hibridem especificamente com as suas respetivas sequências alvo de ácido nucleico, e não hibridem com nenhuma outra sequência.

Geralmente, a eficiência de hibridação entre a sonda e o alvo melhora sob condições em que a quantidade da sonda adicionada está em excesso molar em relação ao molde, preferencialmente um excesso molar de 2 a 106, mais preferencialmente um excesso molar de 103 a 106. A concentração de cada CSP fornecida para uma captura eficiente é pelo menos de 25 fmoles/ml (25 pM) na solução final de hibridação, preferencialmente entre 25 fmoles a 104 fmoles/ml (10 nM) . A concentração de cada SSP é de pelo menos 15 ng/ml na solução final de hibridação, preferencialmente 150 ng/ml. O Quadro A apresenta a conversão das concentrações de SSP expressas em ng/ml para uma base molar.

A hibridação da CSP e da SSP com o ácido nucleico alvo pode ser realizada simultaneamente ou sequencialmente e em ambas as ordens. Numa forma de realização, a hibridação da CSP e a hibridação da SSP com o ácido nucleico alvo são efetuadas simultaneamente. 0 híbrido formado é, a seguir, capturado numa fase sólida revestida com um substrato ao qual o ligando que está ligado à CSP se liga com especificidade. Noutra forma de realização, a hibridação da SSP com o ácido nucleico alvo é realizada após a hibridação da CSP com o ácido nucleico alvo. Neste caso, a CSP pode ser imobilizada numa fase sólida antes ou depois da hibridação. Nesta forma de realização, tanto a CSP como o alvo podem estar ligados à fase sólida durante a reação de hibridação da SSP. Mais preferencialmente, a CSP e a SSP hibridam com o ácido nucleico alvo, formando um complexo hibridado, em que esse complexo é então capturado numa fase sólida revestida com um substrato ao qual o ligando que está ligado à CSP se liga com especificidade.

Para identificar e detetar sequências polinucleotídicas específicas com uma maior especificidade e sensibilidade, podem desenhar-se ensaios de modo a que as condições sejam ótimas para uma maior deteção do sinal e para reduzir a interferência de fundo. Métodos preferidos para se obter essa restringência adicional incluem a etapa de captura aquecida na TSHC e/ou recorrendo ao uso de sondas de bloqueio. Uma vez que a eficiência da captura do complexo hibridado que contém a CSP, a SSP, e o ácido nucleico alvo é influenciada por várias condiçoes de ensaio, uma captura aquecida pode ser útil para reduzir a reatividade falsa e detetar mutações de pelo menos um nucleótido. Preferencialmente, o método de captura aquecida é usado para a deteção de polimorfismos de nucleótido único. Em resumo, o método de captura aquecida para a captura ou ligação de complexos hibridados a uma fase sólida usa um intervalo de temperaturas elevadas. Para imobilizar alvos hibridados com a CSP após a hibridação, a solução de hibridação é colocada em poços de uma placa de 96 poços, por exemplo, e a placa é agitada durante 15 minutos a 2 horas a temperaturas compreendidas entre os 20°C e os 90°C, com agitação a 1100 rpms . Opcionalmente, pode ser preferível uma hibridação à temperatura ambiente durante 1 hora de agitação a 1100 rpms. Temperaturas de captura acima da temperatura ambiente podem ser preferidas para se obter um nível adicional de restringência uma vez que ocorre hibridação (e "hibridação promíscua") durante a etapa de captura na placa. Outra modo de obter uma nível mais elevado de especificidade e sensibilidade é através da utilização das sondas de bloqueio.

Uma forma de realização desta invenção proporciona um método de captura aquecida que usa temperaturas elevadas para capturar um complexo SSP e ácido nucleico alvo hibridado com uma CSP imobilizada numa fase sólida, quer simultaneamente ou sequencialmente, sendo que as temperaturas elevadas evitam que ocorra a hibridação não específica da CSP durante a etapa de captura na placa. A temperatura elevada também afeta a especificidade da hidridação da SSP. A CSP usada na TSHC pode ser um ácido nucleico ou um ácido nucleico modificado, preferencialmente ADN, que contém uma modificação que permite a captura numa fase sólida. Um exemplo de uma modificação desse tipo consiste num marcador de biotina e mais preferencialmente múltiplos marcadores de biotina. A CSP contém um mínimo de 6 pares de bases, preferencialmente 16 a 50 bases com uma temperatura de fusão (Tm) preferida superior a 65°C. As CSP preferidas podem compreender sequências complementares a sequências únicas presentes na molécula alvo de ácidos nucleicos presente na amostra, embora isto não seja necessário quando o alvo são múltiplas espécies de ácido nucleico. Por exemplo, se o alvo é uma família de genes, a CSP pode preferencialmente compreender um elemento de sequência comum a um ou mais membros da família de genes. Para a maioria das aplicações, a CSP contém preferencialmente um máximo de 75% de identidade de sequência e mais preferencialmente menos do que 50%, com alvos não desejados da amostra que se pensa poderem estar presentes na amostra. 0 ensaio pode utilizar CSP que diferem apenas num único nucleótido e que detetam alvos seletivamente que diferem apenas num único nucleótido. Este grau de discriminação pode ser facilitado usando-se a etapa de captura em placa aquecida. Quando a hibridação da CSP é realizada em solução, as amostras são subsequentemente submetidas a uma reação com uma fase sólida para a captura. Por exemplo, se é usada uma CSP marcada com biotina, pode usar-se avidina ou outra proteína de ligação à biotina para revestir a fase sólida para a captura. Outra forma de realização desta invenção envolve a hibridação e captura simultâneas, sendo que a hibridação é realizada diretamente na fase sólida de captura, por exemplo, numa placa de captura.

Ainda noutra forma de realização da presente invenção, o método de TSHC pode ser usado para distinguir e detetar alvos de ácidos nucleicos com SNP. Este método de deteção de Captura Híbrida-Polimorfismo de Nucleótido Único (HC-SNP) pode detetar SNP com uma sensibilidade e especificidade elevadas. No presente documento é descrito um exemplo que ilustra a capacidade adicional da TSHC para distinguir e detetar alvos de ácidos nucleico com SNS, em que se usa, para alén das sondas de sequência de sinal (SSP), oligonucleótidos de captura (CSP) marcados e uma molécula de ácido nucleico alvo. As CSP podem hibridar e capturar alvos de ácido nucleico numa fase ou superfície sólida (por exemplo, uma placa de 96 poços) . Métodos de marcação são bem conhecidas na área e também podem ser usados para facilitar a imobilização do ácido nucleico alvo.

Num exemplo, a captura de um ácido nucleico alvo é alcançada por meio de interação de afinidade elevada entre uma biotina na CSP e uma estreptavidina na superfície sólida. Simultaneamente, uma sonda de sequência de sinal (SSP) de ARN complementar a um ADN alvo e sem sobreposição com a região de captura é hibridada com o ADN alvo. Os híbridos de ARN/ADN são reconhecidos por um anticorpo dirigido contra híbridos de ARN/ADN marcado com fosfatase alcalina. Neste exemplo, um substrato fosforilado quimioluminiscente é, a seguir, adicionado e subsequentemente o substrato ativado pode ser detetado e medido por um luminómetro. As razões de sinal/ruido são determinadas usando-se um controlo negativo conhecido. Além disso, a concentração do alvo pode ser determinada usando-se concentrações conhecidas das moléculas alvo como calibradores. A especificidade da ligação e captura do híbrido numa fase sólida é modulada, regulada, ou ajustada por temperaturas superiores à temperatura ambiente, pela adição de sondas de bloqueio, ou por temperaturas superiores à temperatura ambiente juntamente com a adição de sondas de bloqueio. Para uma maior restringência, pode usar-se as sondas de bloqueio com ou sem o método de captura aquecida. Alternativamente, a etapa de captura pode ser realizada à temperatura ambiente e pode opcionalmente usar sondas de bloqueio.

Outra forma de realização desta invenção proporciona ainda um método de oligonucleótido de bloqueio em que, em muitos casos, não é necessária a etapa de captura aquecida. Isto pode ser alcançado por meio da hibridação de oligonucleótidos de bloqueio para capturar oligonucleótidos à temperatura ambiente, impedindo dessa forma a hibridação adicional da CSP com alvos não desejados durante a etapa de captura. As sondas de captura podem preferencialmente necessitar da presença de sondas de bloqueio, que são complementares às sondas de captura. 0 comprimento das sondas de bloqueio pode variar desde sondas de bloqueio complementares à CSP de comprimento completo ou a pequenas sondas de bloqueio complementares a apenas uma pequena porção da CSP. Por exemplo, as sondas de bloqueio podem ter menos 4 a 10 pares de bases do que o comprimento da CSP. A presença das sondas de bloqueio reduz o ruído de fundo e permite uma grau mais elevado de sensibilidade. A etapa de captura aquecida e as sondas de bloqueio podem ser usadas separadamente ou em conjunto, em que a especificidade da ligação e captura do híbrido numa fase sólida é modulada, regulada, ou ajustada por temperaturas superiores à temperatura ambiente e a adição de sondas de bloqueio.

Será evidente para os especialistas na área que uma fase ou matriz sólida incluem por exemplo poliestireno, polietileno, polipropileno, policarbonato ou qualquer material plástico sólido sob a forma de placas, lâminas, pratos, esferas, partículas, micropartícuias, copos, cadeias, chips e tiras. Uma fase sólida inclui também esferas de vidro, tubos de ensaio de vidro, e outros produtos de vidro adequados. Também se pode usar um fase sólida funcionalizada como plástico ou vidro que tenha sido modificado de modo a que a superfície contenha grupos carboxilo, amino, hidrazida, aldeído, ácido nucleico ou derivados de nucleótidos. Pode usar-se qualquer fase sólida como micropartícuias, esferas, tiras, tubos de ensaio, lâminas, cadeias, chips ou placas de microtitulação de plástico ou vidro.

Numa forma de realização preferida, a CSP é marcada com biotina e utiliza-se uma fase sólida revestida com estreptavidina ou avidina para capturar o híbrido.

Mais preferencialmente, usam-se placas de microtitulação revestidas com estreptavidina. Estas placas podem ser revestidas de modo passivo ou covalente. 0 híbrido capturado pode ser detetado por meios convencionais conhecidos na área, como por meio de um anticorpo monoclonal ou policlonal marcado específico para o híbrido, um anticorpo específico para um ou mais ligandos ligados à SSP, um anticorpo marcado, ou uma modificação detetável na própria SSP .

Um método preferido de deteção deteta o híbrido capturado usando um anticorpo capaz de se ligar ao híbrido de ARN/ADN (referido no presente documento como anticorpo "ARN/ADN"). Nesta forma de realização, o anticorpo anti-ARN/ADN é preferencialmente marcado com uma enzima, uma molécula fluorescente, ou um conjugado de avidina-biotina e é não radioativo. 0 marcador pode ser detetado direta ou indiretamente por meios convencionais conhecidos na área como um colorimetro, luminómetro ou um detetor de fluorescência. Um marcador preferido é, por exemplo, a fosfatase alcalina. Podem também usar-se outros marcadores conhecidos dos especialistas na área como meio de detetar o híbrido de cadeia dupla ligado. A deteção do híbrido capturado é obtida preferencialmente por meio da ligação do anticorpo conjugado ao híbrido durante uma etapa de incubação. As superfícies são lavadas para remover qualquer possível excesso de conjugado. Estas técnicas são conhecidas na área. Por exemplo, podem efetuar-se lavagens manuais usando um dispensador repetitivo de mão Eppendorf™ Repeat Pipettor com ponteiras de dispensação de 50 ml Combitip™ (Eppendorf, Hamburg, Germany), uma seringa repetitiva Corning (Corning, Coming, NY) , uma bomba simples regulada por um controlador Variostat, ou por fluxo gravitacional a partir de um reservatório com tubagens acopladas. Também se podem usar sistemas de lavagens de tubos comercialmente disponíveis na Source Scientific Systems (Garden Grove, CA). O conjugado ligado é subsequentemente detetado por um método convencionalmente usado na área, por exemplo, colorimetria ou quimioluminiscência conforme descrito por Coutlee, et al, J. Clin. Microbiol. 27:1002-1007 (1989). Preferencialmente, conjugado de fosfatase alcalina ligado é detetado por quimioluminiscência pela adição de um substrato que pode ser ativado pela fosfatase alcalina. Substratos quimioluminiscentes que são ativados pela fosfatase alcalina são conhecidos na área.

Noutra forma de realização, o método de captura híbrida alvo-específico da invenção utiliza sondas de bloqueio, para além das sondas CSP e SSP. Uma sonda de bloqueio compreende sequências complementares às sequências da CSP. A sequência de uma sonda de bloqueio é preferencialmente pelo menos 75% complementar à CSP, mais preferencialmente, 100% complementar à CSP. A adição de sondas de bloqueio à mistura da reacção de hibridação impede a CSP não hibridada de hibridar com sequências de ácidos nucleicos com reatividade cruzada presentes no alvo e aumenta, dessa forma, a especificidade da deteção. A sonda de bloqueio tem geralmente um comprimento de 5 bases, preferencialmente de 12 bases. A concentração da sonda de bloqueio na reação de hibridação é preferencialmente em excesso em relação à concentração da CSP e da SSP. Preferencialmente, a sonda de bloqueio está presente num excesso molar de 2 vezes, embora possa estar presente até um excesso molar de 10 000 vezes. As sondas de bloqueio podem ser ADN, ARN, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , ou outros análogos de ácido nucleico.

Numa forma de realização, usam-se sondas de bloqueio complementares à CSP de comprimento completo ou quase de comprimento completo. Após a reação em que se forma o híbrido entre a CSP, a SSP e o ácido nucleico alvo, podem ser adicionadas à reação uma ou mais sondas de bloqueio e a hibridação continua por um período de tempo desejado.

Os produtos de hibridação são então detetados como acima descrito.

Noutra forma de realização, usam-se sondas de bloqueio complementares apenas a uma porção da CSP e de menor comprimento do que a CSP. Estas sondas de bloqueio têm uma temperatura de fusão inferior à da CSP. Preferencialmente, a temperatura de fusão da sonda de bloqueio é inferior em 10 graus à temperatura de fusão da CSP. Neste caso, a sonda de bloqueio é preferencialmente adicionada aos ácidos nucleicos alvo simultaneamente com a CSP e a SSP. Como a sonda de bloqueio tem uma temperatura de fusão menor do que a CSP, a temperatura inicial para a hibridação é escolhida de modo a que a sonda de bloqueio não interfira com a hibridação da CSP com as suas sequências alvo. Porém, quando a temperatura das misturas de hibridação é ajustada para um valor abaixo das temperaturas usadas para a hibridação do alvo, a sonda de bloqueio híbrida com a CSP e bloqueia, de modo eficaz, a hibridação da CSP com sequências de ácidos nucleicos com reatividade cruzada. Por exemplo, quando os produtos de hibridação são incubados à temperatura ambiente numa placa de microtitulação revestida com estreptavidina durante a captura híbrida, podem ser adicionadas as sondas de bloqueio.

Os seguintes exemplos ilustram a utilização do presente método de amplificação e ensaio e kit de deteção. Os exemplos são apresentados apenas para fins exemplificativos e não se destinam a limitar de nenhuma forma o âmbito da presente invenção. EXEMPLO 1

Protocolo do Ensaio de Captura Híbrida Alvo-Específica (TSHC)

Partículas virais do vírus herpes simplex de tipo 1 (HSV-1) e do vírus herpes simplex de tipo 2 (HSV-2) de concentrações conhecidas (Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia, MD) ou amostras clinicas foram diluídas usando meio de controlo negativo (Digene Corp., Gaithersburg, MD) ou espécimes cervicais negativos (Digene) . Foram efetuadas várias diluições e dividiu-se em alíquotas em tubos individuais de microcentrífuga. Adicionou-se uma metade do volume do reagente de desnaturação 5100-0431 (Digene). As amostras de teste foram incubadas a 65°C durante 45 minutos para a desnaturação dos ácidos nucleicos presentes nas amostras.

Após a desnaturação adicionou-se a solução de hibridação contendo as sondas de sequência de sinal (SSP) (600 ng/ml cada) e as sondas de sequência de captura (CSP) (2,5 pmoles/ml cada) e incubou-se a 74°C durante 1 hora. Adicionou-se, então, sondas de bloqueio numa solução com um volume de 4x Diluente de Sondas (Digene), um reagente de desnaturação, e dois volumes de meio de controlo negativo à mistura de hidridação e incubou-se a 74°C durante 15 minutos.

Numa segunda série de experiências, após a desnaturação dos ácidos nucleicos, adicionou-se uma mistura contendo as SSP (600 ng/ml cada), as CSP (2,5 pmoles/ml cada), e sondas de bloqueio (250 pmoles/ml cada) às amostras durante uma hora a 74 0C.

Os tubos com as misturas de reação foram arrefecidos à temperatura ambiente durante 5 minutos, e retiraram-se alíquotas de cada tubo que foram transferidas para poços individuais numa placa de captura com estreptavidina de 96 poços (Digene) . As placas foram agitadas a 1100 rpms durante 1 hora à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram então decantados e as placas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem da Captura Híbrida II (Digene) e invertidas rapidamente para remover o tampão de lavagem residual. Adicionou-se, a seguir, a cada poço, reagente de deteção (DR-1; Digene) de anticorpo anti-ARN/ADN-fosfatase alcalina e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente (aproximadamente de 20°C a 25°C). Os poços foram então submetidos a várias etapas de lavagem que incluíram: 1) três lavagens com tampão de lavagem Sharp (Digene) à temperatura ambiente; 2) incubação da placa com o tampão de lavagem Sharp durante 10 minutos a 60°C numa placa térmica; 3) duas lavagens com o tampão de lavagem Sharp à temperatura ambiente; e 4) uma lavagem com o tampão de lavagem SNM (Digene) à temperatura ambiente. Após a remoção do líquido residual, adicionou-se substrato luminiscente 5100-0350 (Digene) a cada poço e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente. Os poços individuais foram, então, lidos num luminómetro de placas para se obter um sinal em unidades de luz relativa (RLU).

Soluções contendo meio de controlo negativo ou espécimes cervicais negativos para HSV conhecidos foram usados como controlos negativos para as amostras de teste. A razão sinal/ruido (S/N) foi calculada como a razão entre a RLU média obtida numa amostra de teste e a RLU média do controlo negativo. A razão sinal/ruído foi usada como a base para determinar a eficiência da captura e a deteção de ácidos nucleicos alvo. A um valor de S/N igual ou superior a 2 atribuiu-se arbitrariamente um sinal positivo, enquanto que um valor de S/N inferior a 2 foi considerado negativo. 0 coeficiente de variação (CV) que consiste numa determinação da variabilidade da experiência num conjunto de amostras foi calculada determinando-se o desvio padrão dos replicados, dividindo-se pela média e multiplicando esse valor por 100 para se obter uma valor em percentagem.

As sondas de sequência de captura e as sondas de bloqueio usadas nas experiências descritas nos Exemplos 2 a 13 foram sintetizadas usando o método descrito por Cook et al. (1988 Nucl. Acid. Res., 16: 4077-95) . Exceto quando indicado em contrário, as sondas de sequência de captura usadas nas experiências descritas no presente documento foram marcadas com biotinas nas suas extremidades 5' e 3'.

As sondas de sequência de sinal usadas nas experiências descritas nos Exemplos 2 a 13 são sondas de ARN, mas esta invenção não se limita às SSP que compreendem ARN. Estas sondas foram preparadas usando-se o método descrito por Yisraeli et al. (1989, Methods in Enzymol., 180: 42-50) .

EXEMPLO 3

Efeito da quantidade de marcação com biotina na eficiência da captura

Realizaram-se testes para determinar o número ótimo de marcadores de biotina por sonda de sequência de captura para a deteção por TSHC. Utilizou-se o método geral de TSHC descrito no Exemplo 1. Testou-se a eficiência de captura da sonda de sequência de captura F15R marcada com uma, duas, ou três biotinas, medida pela razão sinal/ruido (S/N). Usou-se a sonda de sequência de sinal H19. Conforme se pode ver no Quadro 9, duas biotinas por sonda de sequência de captura foram suficientes para se atingir uma eficiência de captura ótima. Observou-se um aumento no S/N superior a 50% quando se usou a sonda de sequência de captura com dois marcadores de biotina em comparação com a sonda de sequência de captura marcada com uma única biotina. A adição de um terceiro marcador de biotina à sonda de sequência de captura resultou numa diminuição no S/N em relação à sonda de sequência de captura marcada com duas biotinas.

EXEMPLO 4

Efeito da distância entre os locais alvos da csp e da ssp na eficiência de captura

Avaliou-se o efeito da distância entre os locais de hibridação da sonda de sequência de captura (CSP) e da sonda de sequência de sinal (SSP) num ácido nucleico alvo de HSV-1 na eficiência de captura. Testaram-se CSP que hibridam com sequências de ácido nucleico do HSV-1 localizadas a 0,2kb, 3kb, 18kb, 36kb e 46kb de distância do local de hibridação da SSP. Utilizou-se o método geral de TSHC descrito no Exemplo 1. As eficiências de captura foram 100%, 50%, 30%, 19% e 7%, respetivamente (Quadro 10) . Observou-se um declínio constante nas eficiências de captura quando a distância aumentou de 0,2 Kb até 46 Kb.

EXEMPLO 5

Efeito da sonda de sequência de captura fundida na deteção de hsv-1 por tshc A capacidade de ligação de placas com estreptavidina foi determinada como sendo aproximadamente de 2 pmoles de CSP duplamente marcada com biotina por poço. Como as CSP estão duplamente marcadas com biotina, é preferível um máximo de 8 CSP (2 CSP por SSP) para não exceder a capacidade de ligação dos poços. Qualquer aumento na sonda de sequência de captura marcada com biotina acima da capacidade indicada resultou numa diminuição do sinal, o denominado "efeito hook" (gancho) . Para evitar este "efeito hook" e possibilitar ainda a utilização de mais do que quatro combinações SSP-CSP, testou-se o efeito da sintetização de oligonucleótidos que contêm as sequências de duas CSP fundidas uma com a outra (locais 5' e 3'). As sondas de sequência de captura fundidas podem funcionar independentemente para dirigir a hibridação com os locais alvo únicos. Noutra forma de realização, as sondas fundidas podem ligar-se a dois locais de ligação favorecendo a segunda hibridação, uma vez que após a sonda ter hibridado com o primeiro local, se trata essencialmente de uma reação uni-molecular de cinética de ordem zero. A hibridação pode ser determinada por um ou por ambos os mecanismos. Experiências anteriores mostraram que a utilização em conjunto de duas CSP, VH3 e NC-1, resultou em aproximadamente o dobro do S/N, em comparação com as CSP isoladamente. Usaram-se as sondas de sequência de captura não fundidas VH-3 e NC-1 a um concentração de 2,5 pmoles/ml cada para uma concentração total de 5 pmoles/ml, a sonda fundida VH-4 (fusão de VH-3 com NC-1) foi usada a uma concentração de 2,5 pmole/ml. Como se pode ver no Quadro 11, a sonda fundida foi tão eficaz como a combinação das duas sondas não fundidas. Portanto, a deteção por TSHC com sondas de sequência de captura fundidas permite que o número de sequências de ácidos nucleicos alvo da sonda de sequência de sinal seja pelo menos duplicado sem que se exceda a capacidade de ligação à biotina da placa. A experiência também demonstra a ausência de reatividade cruzada do HSV-2 a 107 genomas como se pode observar pelo S/N inferior a 2,0.

EXEMPLO 6

Eficiência de captura de várias csp e ssp na deteção de hsv-1 por tshc

Avaliou-se a eficiência de captura de sondas de sequência de captura (CSP) para cada um das quatro sondas de sequência de sinal (SSP) específicas para HSV-1, as H19, RH5B, RH3 e RIO, na deteção do HSV-1 por TSHC. Usaram-se os seguintes critérios no desenho das sondas de captura de sequência: 1) o local de hibridação da CSP está a uma distância de até 1 kb, 5' ou 3', do local de hibridação da SSP na sequência de ácido nucleico do HSV-1, preferencialmente a uma distância de 0,5 kb; e 2) as CSP contêm sequências que são únicas para o HSV-1, sem zonas com homologia ao nível da sequência com HSV-2 que sejam superiores a 10 bases. As CSP foram concebidas para terem como alvo as regiões 3' e 5' adjacentes ao local de hibridação da SSP, preferencialmente com uma CSP 5' e uma CSP 3' para cada SSP. O software Omiga (Oxford Molecular Group, Campbell, CA) foi essencial na identificação desses locais. A temperatura de fusão (Tm) das CSP foi concebida de modo a se situar entre 70°C e 85°C, para estar de acordo com a temperatura de hibridação situada entre 70°C e 75°C usada no ensaio de Captura Híbrida II (HCII) para o HSV (Digene) . Utilizou-se o método geral TSHC descrito no Exemplo 1. Testaram-se 11 CSP (que se ligam a 6 locais diferentes) para H19, seis CSP (que se ligam a três locais únicos) para RH5B, seis CSP (que se ligam a seis locais únicos) para RH3, e duas CSP para RIO. Como se pode ver no Quadro 12, descobriram-se sondas de sequência de captura para as sondas de sequência de sinal H19, RH5B e RIO.

EXEMPLO 7

Eficiência de capturas de vários csp e ssp na deteção de hsv-2 por tshc

Avaliou-se a eficiência de captura de sondas de sequência de captura (CSP) para cada um das quatro sondas de sequência de sinal (SSP) específicas para HSV-2, as E4A, E4B, Ei8, e i8, na deteção do HSV-2 por TSHC. Foram produzidas sondas de sequência de captura (CSP) específicas para HSV-2 com base nos mesmos critérios usados nas CSP específicas para HSV-1, exceto em relação à necessidade de terem de ser específicas para HSV-2 . Testaram-se quatro CSP para E4A, três CSP para E4B, e duas CSP para cada Ei8 e i8. Utilizou-se o método geral de TSHC descrito no Exemplo 1. Como se pode ver no Quadro 13, encontraram-se sondas de sequência de captura para i8 e Ei8.

EXEMPLO 8

Efeito das sondas de bloqueio na deteção de hsv-1 e hsv-2

Foram desenvolvidos métodos que usam sondas de bloqueio numa tentativa de reduzir a reatividade cruzada da TSHC, mas permitindo que a etapa de captura decorra à temperatura ambiente. As sondas de bloqueio compreendem sequências que são complementares às zonas de sequência de captura usadas na deteção. Estas experiências foram desenhadas para evitar a hibridação não especifica das CSP com ácidos nucleicos não alvo presentes na amostra sob condições de restringência reduzida, uma situação que ocorre frequentemente durante a etapa de captura à temperatura ambiente.

Num método, usam-se sondas de bloqueio que são complementares à sonda de sequência de captura de comprimento completo ou quase de comprimento completo. As sondas de bloqueio foram adicionadas à mistura de reação num excesso de 10 vezes em relação à CSP após ter ocorrido a hibridação da CSP e da SSP com a molécula de ADN alvo. Como as sondas de bloqueio têm um temperatura de fusão semelhantes à das CSP, primeiro hibridou-se as CSP com os ácidos nucleicos alvo para evitar a hibridação das sondas de bloqueio com as CSP antes que tivesse ocorrido a hibridação das CSP com os ácidos nucleicos alvo. Conforme se pode ver no Quadro 14, a adição de sondas de bloqueio não só resultou numa redução dramática da reatividade cruzada, como essas sondas não tiveram nenhum efeito na sensibilidade da deteção do HSV-1. O S/N para a deteção da reatividade cruzada do HSV-2 (107 partículas virais/ml) diminuiu de 5,0 para 0,8 quando se usaram as sondas de bloqueio.

Noutro método, usaram-se sondas de bloqueio que são complementares apenas a uma porção das CSP e que são de menor comprimento do que as CSP. As sondas de bloqueio foram desenhadas para ter temperaturas de fusão acima da temperatura ambiente, mas pelo menos 10 °C abaixo da temperatura de hibridação das CSP com os ácidos nucleicos alvo. Como estas sondas de bloqueio hibridam com as CSP a uma temperatura abaixo da temperatura de hibridação das CSP com os ácidos nucleicos alvo, as sondas de bloqueio podem ser adicionadas à reação ao mesmo tempo do que as CSP e as SSP sem afetar a eficiência de hibridação das CSP com o ácido nucleico alvo. Estas sondas de bloqueio de menor comprimento funcionam durante a etapa de captura à temperatura ambiente por hibridarem com as CSP a temperaturas mais baixas do que as observadas durante a etapa de captura à temperatura ambiente. Conforme se pode ver no Quadro 15, a adição de sondas de bloqueio de menor comprimento individuais ou em pares em excesso de 100 vezes em relação às CSP resultou numa redução dramática da reatividade cruzada, mas não teve nenhum efeito na sensibilidade da deteção do HSV-1. O S/N para detetar a reatividade cruzada do HSV-2 (107 partículas virais/ml) sem as sondas de bloqueio foi de 10,6, mas com a adição das sondas de bloqueio foi reduzido para um valor igual ou inferior a 1,5.

Portanto, ambos os métodos que utilizam sondas de bloqueio proporcionam uma redução substancial na reatividade cruzada. O segundo método, que utiliza sondas de bloqueio com uma temperatura de fusão mais baixa, pode ser preferível porque a adição das sondas de bloqueio ao mesmo tempo do que a sonda de sequência de captura elimina a necessidade de uma etapa adicional no método de deteção.

EXEMPLO 9

Deteção por tshc reduz o ruído de fundo do vetor 0 ensaio de TSHC elimina o problema da contaminação do vetor frequentemente associado ao ensaio de deteção Captura Híbrida II (HC II) (Digene). Como as sondas de sequência de sinal de ARN usadas na HC II são geradas a partir de moldes de vetor linearizados, qualquer ADN plasmídico não linearizado resulta na produção de sequências de sonda de ARN específicas para as sequências do vetor. No ensaio de HC II, os híbridos de ARN/ADN que se formam em resultado destes trascritos read-through são capturados nas placas revestidas de anticorpo e geram um sinal. Em contraste, no método de TSHC, apenas são detetados os híbridos que também hibridam com as sondas de sequência de captura. Por conseguinte, elimina-se toda a deteção de sequências relacionadas com o vetor. Testaram-se os plasmidios SK+, pBR322, DgZ, e 1066 que se sabia serem detetáveis no teste de HC II para HSV (Digene) no ensaio de TSHC usando duas sondas de sequência de sinal de ARN (H19 e RH5b) e duas sondas de sequência de captura (VH-2 e VH-4). Conjuntos idênticos de sondas de ARN foram então usados no método de HC II e no método de TSHC para a deteção do HSV-1. Utilizou-se o método geral TSHC descrito no Exemplo 1. Conforme se pode ver no Quadro 16, enquanto que a razão sinal/ruido no ensaio padrão HC II estavam compreendida entre 14 e 48, a razão sinal/ruido para o método de TSCH foi inferior a 2 para todos os plasmideos testados.

EXEMPLO 10

Sensibilidade e especificidade da deteção de hsv-1 e hsv-2 por tshc A sensibilidade e a discriminação no tipo na deteção de HSV-1 e HSV-2 por TSHC foram avaliadas usando-se a TSHC descrita no Exemplo 1. No ensaio de TSHC para HSV-1, usaram-se as sondas de sequência de sinal H19 e RH5B, as sondas de sequência de captura HZ-1, VH-2 e VH-4, e as sondas de bloqueio NG-7, NG-8, GP-3, GP-4, e GP-1. No ensaio de TSHC para HSV-2, usaram-se as sondas de sequência de sinal il8 e Eil8, as sondas de sequência de captura NF-1 e NF-2, e as sondas de bloqueio HX-4, HX-5, e GP-8. As partículas virais de HSV-1 e HSV-2 foram diluídas de modo a se obter várias concentrações usando-se solução de controlo negativo. Como se pode ver nas Figuras 4 e 5, embora tenham sido detetadas 104 cópias do HSV-1 ou do HSV-2 (450 cópias/poço) nos respetivos ensaios, não ocorreu praticamente nenhuma deteção de reatividade cruzada do outro tipo de HSV a concentrações que foram até ao valor, incluindo, de 108 cópias/ml (4,500,000 cópias/poço). Portanto, os ensaios para HSV-1 e para HSV-2 conseguem distinguir entre os dois tipos de HSV a um intervalo de discriminação de 10.000 vezes, mantendo uma excelente sensibilidade (450 PV/poço). O ensaio de TSHC para HSV-1 apresenta um intervalo linear de deteção compreendido entre pelo menos 2 x 103 e 5 x 103 PV/ml (Quadro 17). A especificidade do ensaio é excelente visto não ter sido detetada nenhuma reatividade cruzada (o S/N é inferior ou igual a 2) nas amostras contendo HSV-2 a uma concentração que atingiu 2 x 107 a 5 x 107 partículas virais/ml. Do mesmo modo, o ensaio de TSHC para HSV-2 também apresentou uma excelente especificidade, não se tendo detetado nenhuma reatividade cruzada nas amostras que continham HSV-1 a um concentração que atingiu 5 x 107 partículas virais/ml (Quadro 18) . Foram obtidos resultados semelhantes na deteção do HSV-2 por TSHC usando-se uma série de diluição dos vírus HSV-2 e HSV-1 (Quadro 19).

EXEMPLO 11

Teste de espécimes clinicos

Um painel com 64 espécimes clinicos foi testado para HSV-1 e HSV-2 usando-se ambos os métodos TSHC e HCII. 0 painel incluía 15 amostras contendo quantidades conhecidas de HSV-1 ou HSV-2, e 49 amostras que tinham testado negativo para HSV-1 e HSV-2 por teste de PCR. Por conseguinte, o resultado "Esperado" para as 15 amostras positivas eram que testassem positivo tanto no ensaio de HCII como de TSHC, e o resultado "Esperado" para as 49 amostras negativas era que testassem negativo tanto no teste de HCII como de TSHC. Usou-se o método geral de TSHC descrito no Exemplo 1. Os resultados obtidos com o método de HCII e o método de TSHC são apresentados nos Quadros 20 e 21, repetivamente. Das 49 amostras cujo resultado "Esperado" era negativo, 5 amostras deram positivo e 44 amostras deram negativo quando se usou o método de HCII. Em comparação, todas as 4 9 amostras deram negativo quando se usou o método de TSHC. Portanto, o método de TSHC é superior em termos de especificidade ao método de HCII na deteção do HSV-1 e do HSV-2.

EXEMPLO 12

Efeito de se combinar as sondas na deteção de hsv por tshc

Avaliou-se o efeito na deteção de HSV-1 de se combinar conjuntos de sondas da sequência de sinal e de sondas de sequência de captura específicos para HSV-1 . A deteção por TSHC da reatividade cruzada de HSV-1 e HSV-2 foi realizada separadamente com dois conjuntos diferentes de combinações de sonda de sequência de sinal de ARN / sonda de sequência de captura marcada com biotina (Conjunto n.° 1: H19 + HZ-11 e Conjunto n.°2: RH5b + TS-1 e TS-2) . Também se efetuou a TSHC com ambos os conjuntos de sonda de sequência de sinal de ARN / sonda de sequência de captura marcada com biotina combinados para avaliar o efeito de se combinar os dois conjuntos de sondas na sensibilidade e reatividade cruzada. Utilizou-se o método geral de TSHC descrito no Exemplo 1. Os resultados apresentados no Quadro 22 mostram claramente que a combinação dos dois conjuntos de sondas para a deteção do HSV-1 resulta num efeito aditivo, sem um aumento visível na reatividade cruzada do HSV-2.

EXEMPLO 13

Deteção de hpvl8 e hpv45 por tshc

Comparou-se a sensibilidade e especificidade relativa da deteção por TSHC e HCII do Vírus do Papiloma Humano 18 (HPV18) e do Virus do Papiloma Humano 45 (HPV45). Estudos anteriores estabeleceram que o HPV45 é o tipo de HPV que apresenta maior reatividade cruzada com HPV18 e, vice versa, ou seja, o HPV18 é o tipo que apresenta maior reatividade cruzada com HPV54. Neste estudo, avaliou-se a capacidade dos dois métodos para detetar HVP18 e HVP45 usando-se ADN plasmídico de HPV18 5 HPV45.

Desenharam-se sondas de sequência de captura (CSP) para quatro tipos de Vírus do Papiloma Humano 18: HPV16, HPV18, HPV31, e HPV45. Usaram-se os seguintes critérios no desenho das sondas de captura de sequência: 1) os locais de hibridação da CSP não se sobrepõem com os locais da SSP; 2) as CSP contêm sequências para um tipo único de HPV sem porções de homologia de sequência com outros tipos de HPV que sejam superiores a 12 bases; e 3) o comprimento das CSP é suficiente para que estas consigam hibridar de modo eficiente a 70°C.

As sondas de bloqueio para cada CSP foram desenhadas de modo a que pudessem ser adicionadas simultaneamente com a CSP durante a hibridação do ácido nucleico alvo. As sondas de bloqueio têm uma temperatura de fusão de pelo menos 37°C mas não superior a 60°C, conforme calculado pelo programa Oligo 5.0 (National Biosciences, Inc., Plymouth, MN) . Usaram-se duas sondas de bloqueio para cada oligonucleótido de captura para maximizar o efeito de bloqueio durante a etapa de captura na placa à temperatura ambiente. Também se pretendeu que as sondas de bloqueio para cada CSP tivessem temperaturas de fusão semelhantes.

As CSP para cada um dos tipos de HPV foram testadas em termos da eficiência de captura e reatividade cruzada em relação aos outros tipos de HPV. As CSP que resultaram na melhor combinação de sensibilidade e baixa reatividade cruzada foram usadas na deteção de HPV por TSHC.

Na deteção por TSHC e por HCII de HPV18, usou-se ADN de HPV18 a uma concentração de 10 pg/ml. O HPV45, usado para testar a reactividade cruzada, foi utilizado a uma concentração de 4 ng/ml. Utilizou-se o método geral de TSHC descrito no Exemplo 1. Como se pode ver no Quadro 23, obteve-se uma razão de sinal/ruído de 16,9 na deteção de HPV18 por TSHC em comparação com uma razão de 7,6 obtida na deteção de HPV18 por HCII. Por outro lado, a reatividade cruzada com HPV45 foi significativamente reduzinda quando se usou o método de TSHC (S/N de 1,3 para TSHC em comparação com um S/N de 393,3 para HCII) . Os resultados mostram claramente que na comparação com o método de HCII, o método de TSHC para a deteção de HPV18 se revelou superior, tanto ao nível da sensibilidade como da especificidade. Os resultados obtidos nas experiências de comparação entre a deteção de HPV45 por TSHC e por HCII demonstram que o método de TSHC para a deteção de HPV45 é superior tanto ao nível da sensibilidade como da especificidade (Quadro 24).

EXAMPLO 14

Protocolo de ensaio de captura híbrida alvo-específica-plus

Usou-se o vírus da hepatite B (HBV) como sistema modelo para o desenvolvimento do ensaio de captura híbrida alvo-específica-plus (TSHC-plus) para a deteção de ácidos nucleicos alvo. A hibridação no método de TSHC-plus (Fig. 6A a 6D) pode ser realizada numa única étapa. No método de uma única etapa, adicionam-se simultaneamente aos ácidos nucleicos alvo as SSP contendo duplex ADN/ARN pré-hibridado, as sondas "ponte" (Fig. 6B a 6D) e as sondas de bloqueio. Se a hibridação for efetuada em duas etapas, as CSP, SSP sem o duplex de ADN/ARN pré-hibridado, sondas "ponte" e as sondas de bloqueio são primeiro hibridadas com o ácido nucleico alvo. Sondas oligonucleotídicas complementares à sequência de ácido nucleico de cadeia simples na SSP são então adicionadas à reação para formar os duplexes de ADN/ARN. Os híbridos são, a seguir, detetados usando-se o anticorpo anti-ARN/ADN conforme descrito no Exemplo 1.

Foram efetuadas experiências para se detetar HBV usando a TSHC-plus (Exemplos 15 a 18). Usou-se o método apresentado na Figura 6A. Diluiu-se ADN plasmídico do vírus da hepatite B humano (HBV adw2) de concentração conhecida (Digene Corp) usando-se o diluente de amostras negativas de HBV (Digene). Foram efetuadas várias diluições e dividiu-se em alíquotas em tubos individuais. 0 diluente de amostras negativas foi usado como controlo negativo. Adicionou-se uma metade do volume do reagente de desnaturação 5100-0431 (Digene) às amostras de teste. As amostras de teste foram incubadas a 65°C durante 45 minutos para a desnaturação dos ácidos nucleicos presentes nas amostras.

Após a desnaturação da amostra de HBV, adicionou-se à amostra uma solução de hibridação que continha sonda de sequência de captura (CSP), sondas de bloqueio, sondas de sequência de sinal compreendendo um duplex de ARN de M13/ADN de M13, e uma sonda "ponte" de uma sequência de ADN de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples capaz de hibridar tanto com sequências de SSP como de HBV, e incubou-se a 65° C durante 1-2 horas. Alternativamente, as amostras desnaturadas foram incubadas durante 1 hora com uma solução de hibridação que continha sondas de sequência de captura (CSP), sondas de bloqueio e ADN plamidico de M13 contendo sequências complementares a HBV durante 1 hora. Após a incubação, adicionou-se o ARN de M13 à reação e a incubação prosseguiu durante mais uma hora a 65° C.

Os tubos com as misturas de reação foram arrefecidos à temperatura ambiente durante 5 minutos, e retiraram-se aliquotas de cada tubo que foram transferidas para poços individuais numa placa de 96 poços com estreptavidina. As placas foram aqitadas a 1100 rpms durante 1 hora à temperatura ambiente. A solução foi então decantada e as placas foram lavadas quatro vezes com tampão de lavagem SNM (Digene). Adicionou-se, a seguir, a cada poço anticorpo anti-ARN/ADN (DR-1; Digene) e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. O DR-1 (Digene) foi então decantado e as placas foram lavadas quatro vezes com tampão de lavagem SNM (Digene). Após a remoção do tampão de lavagem residual, adicionou-se substrato luminescente (CDP-Star, Tropix Inc.) a cada poço e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente. Os poços individuais foram lidos num luminómetro de placas para se obter sinais em unidades de luz relativa (RLU). EXEMPLO 15

Os quadros a seguir apresentados descrevem as diferentes sondas testadas nas experiências descritas nos Exemplos 16 a 18 .

EXEMPLO 16

Efeito das sondas de bloqueio na deteção de hbv por tshc-plus

Durantes a etapa de captura à temperatura ambiente, as SSP em excesso (duplex de ARN de M13/ADN de HBV-M13) que não hidridaram especificamente com a CSP são imobilizadas na placa, o que resulta em sinais de ruído de fundo elevados. Numa tentativa de reduzir o sinal de ruído de fundo, usaram-se sondas de bloqueio na deteção de HBV por TSHC-Plus. As sondas de bloqueio foram desenhadas de modo a terem um comprimento muito menor do que o das CSP, para que só consigam hibridar com as sondas de captura bem abaixo das temperaturas de hibridação usadas no ensaio.

Usaram-se conjuntos de sondas de bloqueio que consistiam em dois oligonucleótidos separados que são complementares às CSP. Adicionaram-se as sondas de bloqueio à mistura de hibridação num excesso de 10 vezes em relação às CSP. Como as sondas de bloqueio têm um comprimento muito menor do que o das CSP, não hibridam com as CSP à temperatura de hibridação com o alvo e, portanto, não interferem com a hibridação das CSP com os ácidos nucleicos alvo. Após a hibridação da CSP com os ácidos nucleicos alvo, as amostras foram submetidas a uma etapa de captura à temperatura ambiente, durante a qual as sondas de bloqueio hibridaram com as CSP em excesso, impedindo assim que estas hibridassem com as SSP. Como se pode ver no Quadro 28, a utilização de sondas de bloqueio na reação de hibridação resultou numa redução acentuada dos sinais de ruído de fundo do ensaio.

EXEMPLO 17

Efeito do comprimento da ssp na deteção de hbv por tshc-plus

Estudou-se o efeito na deteção de HBV por TSCH-PLus do comprimento da sequência de ADN inserida no vetor M13 para gerar a SSP. Usou-se um controlo positivo contendo 20 pg/ml de ADN plasmídico de HBV. Como se pode ver no Quadro 29, a utilização de uma sequências complementar a HBV de maior comprimento na SSP (87 pares de bases) resultou num aumento substancial na deteção do sinal. É pouco provável que o efeito se deva a uma condição de temperatura de hibridação sub-ótima, uma vez que a Tm das sondas de menor comprimento é 15 graus acima da temperatura de hibridação. Como o duplex de ARN/ADN de M13 formado na SSP pode atuar de modo a bloquear parcialmente a hibridação da sequência de ADN complementar na sonda com as sequências de HBV nos ácidos nucleicos alvo, as sequências complementares mais longas na SSP podem ultrapassar este bloqueio.

EXEMPLO 18

Deteção de hbv por tshc e por hc ii

Comparou-se a sensibilidade relativa da deteção de HBV por TSHC-Plus e HC II (Hybrid Capture II, Digene). Testaram-se nas experiências padrões de HBV positivos de três concentrações diferentes. Como se pode ver no Quadro 30, os sinais obtidos com o método de deteção por TSHC-Plus foram aproximadamente superiores em cerca do dobro aos obtidos com o método de deteção por HC II.

EXEMPLO 19

Preparação da amostra para deteção de snp por captura híbrida alvo-específica

Uma forma de realização do método de TSHC para detetar SNP proporciona o método de Captura Híbrida para SNP (HC-SNP) que é demonstrado no presente documento usando-se ADN de p53 como a molécula alvo e discriminando-se polimorfismos ou SNP no codão 73 da região codificante de p53. (Kawajiri et al. Carcinogenesis. 14:1085-1089, 1993). Os dois polimorfismos de p53 na cadeia anti-sense no codão 72, são gCg, que codifica Arginina (Arg) , e no codão 72 de p53, na cadeia anti-sense, gGg, que codifica Prolina (Pro). Os dois polimorfismos são designados por p53Arg e p53Pro. Trata-se de um SNP onde o método de HC-SNP é usado para a deteção especifica do nucleótido. Deve ficar claro que o método de HC-SNP não se limita a estes tipos específicos de sondas, marcadores de sondas e alvos, podendo também abranger o âmbito total das variações descritas para o método de TSHC.

Amostras compreendendo amplicões de PCR ou ADN genómico foram usadas como um alvo na deteção de polimorfismos na foram de realização da HC-SNP. A utilização de ADN genómico pode ser particularmente útil em aplicações de diagnóstico. Para a preparação dos amplicões de PCR, usaram-se dois iniciadores, por exemplo, o iniciador upper-5'-AAGACCCAGGTCCAGAT- GAAG-3' (SEQ ID NO:161) e o iniciador lower-5'-AGAATGCAAGAAGCCCAGAC-3' (SEQ ID NO:162) (descritos por Klaes et al. , L Mol. Med. 77:299-302, 1999) . Estes iniciadores são escolhidos especificamente para a amplificação de uma região exão 4 de p53 (182 pares de bases), utilizando-se um programa que consiste em: a) 95°C durante 4 minutos; b) 94°C durante 40 segundos; c) 62°C durante 40 segundos; d) 72°C durante 40 segundos; e) 72°C durante 6 minutos; e f) 4°C durante o armazenamento ou antes da utilização, em que as etapas b-d são repetidas durante 25 a 45 ciclos dependendo da qualidade do molde de ADN. Os amplicões do PCR foram, a seguir, diluídos 1:1000 ou 1:100 em TE (Tris 10 mM; EDTA 1 mM) , pH 7,4, antes de se efetuar o ensaio. Exemplos não limitantes de amostras de ADN genómico para a preparação de ADN genómico incluem, mas sem que isso constitua uma limitação, fluídos humanos, células, tecidos, e tecidos em blocos de parafina guardados em arquivo. O isolamento de ADN genómico foi realizado usando-se os kits adequados (Qiagen). Aproximadamente, necessitou-se de 10-20 pg de ADN genómico isolado por par de teste para deteção direta de polimorfismos, sem se efetuar a etapa de amplificação do alvo.

Cada alvo de ADN foi testado separadamente com oligonucleótidos de captura específicos para p53-Arg e p53-Pro. Calcularam-se as razões de sinal/ruído (S/N) e a razão entre o S/N específico para p53-Arg e o S/N específico para p53-Pro foi usado para identificar o genótipo da amostra. No Quadro 31 apresenta-se um exemplo dos resultados do teste de SNP para determinar se as amostras são homozigóticas (Arg/Arg ou Pro/Pro) ou heterozigóticas (Arg/Pro). Os resultados destes testes foram confirmados por análise por meio de Wave (Transgenomic; Santa Clara, CA) e análise da sequência de ADN. EXEMPLO 20 Método de captura híbrida alvo-específica para detetar snp

Preparou-se ADN plasmídico (p53-Arg e p53-Pro) a partir de culturas bacterianas usando-se o kit Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Inc.; Valencia, CA) . O ADN genómico (HeLa, SiHa, e Jurkat) foi preparado a partir de linhas de células usando o kit DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Inc.). O ADN plasmídico e o ADN das amostras clínicas foram amplificados usando o método de PCR previamente descrito (45 ciclos) . Antes da utilização, o ADN amplificado por PCR foi diluído 1:1000 em TE, pH 7,4, e as amostras de ADN plasmídico foram diluídas para se obter uma concentração de 100 pg/ml em TE, pH 7,4. Por teste usaram-se cinco microlitros de ADN plasmídico ou amplificado por PCR diluído. Usaram-se por teste cinquenta microlitros de amostras de ADN genómico extraído que continham 5 pg, 7 pg, e 10 pg de ADN genómico de HeLa, Jurkat, e SiHa, respetivamente. Cada amostra foi testada de modo independente duas vezes para cada ensaio. O primeiro teste foi efetuado usando-se a CSP para p53-Arg e a SSP para p53. O segundo teste foi efetuado usando-se a CSP para p53-Pro e a SSP para p53.

Uma mistura de água e alvo de ADN num volume final de 50 pl por poço foi adicionada à microplaca de hibridação. Adicionou-se reagente de desnaturação 5100-0431 (Digene) (25 pl) por poço. A placa foi coberta com selante de placas e agitada durante 10 a 30 segundos a 1000 rpm num agitador de placas. As reações foram desnaturadas a 65°C durante 25 minutos no aquecedor de placas microplate heater I (Robbins Dcientific Corp.; Sunnyvale, CA) . Durante a etapa de desnaturação, prepararam-se as misturas com as sondas. A mistura da sonda específica para p53-Arg continha 15 pmoles/ml da CSP de 16 bases específica para Arg, 600 ng/ml de SSP para p53, e 4X Diluente para Sondas (Digene). A mistura da sonda específica para p53-Pro continha 15 pmoles/ml da CSP de 16 bases específica para Pro, 600 ng/ml de SSP para p53, e 4X Diluentes para Sondas (Digene) . Cada uma das misturas de sonda (25 μΐ cada) foi adicionada à amostra desnaturada. A placa foi coberta com selante de placas e agitada durante 10 a 30 segundos a 1000 rpm num agitador de placas. Deixaram-se as amostras a hibridar a 65°C durante 1 hora no aquecedor de microplacas. As amostras hibridadas foram incubadas à temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos (para diminuir a temperatura da placa). As reações de hibridação foram transferidas para uma placa de 96 poços com estreptavidina (SA) (Digene) e a placa foi coberta com um selante de placas . Os híbridos foram capturados na placa SA a 45°C durante 45 minutos com uma agitação a 900 rpm. A imobilização de alvos hibridados com a CSP pode ser efetuada na solução de hibridação colocada nos poços de uma placa de 96 poços, por exemplo, e a placa é agitada durante 15 minutos a 2 horas a temperaturas compreendidas entre os 20°C e os 90°C, preferencialmente à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação a 1100 rpms. Temperaturas de captura acima da temperatura ambiente podem ser preferidas para se obter níveis adicionais de restringência uma vez que ocorre hibridação (e "hibridação promíscua") durante a etapa de captura na placa. O sobrenadante foi decantado e adicionou-se 100 μΐ por poço de DR-1 (Digene) para a deteção de híbridos de ARN/ADN capturados. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos sem agitação. O sobrenadante foi eliminado e a placa foi lavada duas vezes com tampão de lavagem Sharp à temperatura ambiente. Os poços foram então novamente enchidos com solução de lavagem Sharp e a placa foi incubada a 60 °C durante 10 minutos. A seguir, a placa foi lavada duas vezes com tampão de lavagem Sharp à temperatura ambiente e uma vez com tampão de lavagem Captura Híbrida 2. Secou-se o tampão residual da placa com toalhas absorventes (kimtowels). Adicionou-se um substrato quimioluminiscente fosforilado, DR-2 (100 μΐ/ poço) e as reações foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos sem agitação. O substrato ativado foi medido e analisado usando-se um luminómetro de placas (veja-se o Quadro 31) .

1. Um método para detetar um ácido nucleico alvo que compreende : a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda de sequência de captura e uma sonda de sequência de sinal para formar híbridos de cadeia dupla entre as ditas sondas e o ácido nucleico alvo, em que a sonda de sequência de captura e a sonda da sequência de sinal são capazes de hibridar com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não se hibridam entre si; b) a adição de uma sonda de bloqueio à reação de hibridação, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sondas de sequência de captura não hibridadas; c) a ligação do híbrido numa fase sólida para formar o híbrido ligado; e d) a deteção do híbrido ligado. 2. Um método para detetar um ácido nucleico alvo que compreende: a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda de sequência de captura imobilizada e uma sonda de sequência de sinal para formar híbridos de cadeia dupla entre as ditas sondas e o ácido nucleico alvo, em que a sonda de sequência de captura e a sonda da sequência de sinal hibridam com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não hibridam entre si; b) a adição de uma sonda de bloqueio à reação de hibridação, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sondas de sequência de captura não hibridadas; c) a deteção do híbrido ligado. 3. 0 método do item 1 ou 2 em que a sonda da sequência de captura é de cadeia simples. 4. 0 método do item 1 ou 2 em que a sonda da sequência de captura é modificada com pelo menos um ligando. 5. 0 método do item 4, em que o ligando é a biotina. 6. 0 método do item 5, em que a sonda de sequência de captura é linear com uma extremidade 5' e 3', em que ambas as extremidades 5' e 3' são biotiniladas. 7. 0 método do item 1 ou 2, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 3 quilobases. 8. 0 método do item 1 ou 2, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 500 bases. 9. O método do item 1 ou 2, em que a sonda de sequência de captura é uma fusão de duas ou mais sequências complementares a diferentes regiões do ácido nucleico alvo ou a diferentes moléculas alvo. 10. O método do item 1 ou 2, em que o híbrido de cadeia dupla formado é um híbrido de ADN/ARN. 11. O método do item 1 ou 2, que compreende ainda a etapa de formação do ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples antes da etapa da hibridação. 12. O método do item 1 ou 2, em que a hibridação da sonda de sequência de captura e da sonda de sequência de sinal com o ácido nucleico alvo são efetuadas sequencialmente. 13. O método do item 1, em que a etapa a) e a etapa b) são realizadas simultaneamente. 14. O método do item 1, em que a etapa a) e a etapa c) são realizadas simultaneamente. 15. O método do item 1, em que as etapas a), b) , e c) são realizadas simultaneamente. 16. O método do item 2, em que a etapa a) e a etapa b) são realizadas simultaneamente. 17. O método do item 1 ou 2, em que a sonda de bloqueio tem uma temperatura de fusão inferior à da sonda de sequência de captura. 18. O método de acordo com o item 1, em que o híbrido é capturado numa fase sólida. 19. O método do item 17, em que a fase sólida é revestida com estreptavidina. 20 . O método do item 17, em que a fase sólida é uma microplaca. 21. O método do item 1 em que a etapa c) é efetuada à temperatura ambiente. 22 . O método de acordo com o item 1 ou 2, em que o híbrido ligado é detetado usando-se um anticorpo que reconhece o híbrido. 23. O método de acordo com o item 22, em que o híbrido é um híbrido de ADN/ARN. 24. O método de acordo com o item 22, em que o anticorpo que reconhece o híbrido de ADN/ARN está marcado com uma fosfatase alcalina. 25. Um método para detetar um ácido nucleico alvo que compreende: a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda de sequência de captura e uma sonda da sequência de sinal, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não hibridam entre si, em que a dita hibridação forma um híbrido de ARN/ADN entre a dita sonda de sequência de sinal e o ácido nucleico alvo; e b) a deteção do híbrido de ARN/ADN por meio da ligação ao dito híbrido de um anticorpo que reconhece o híbrido de ARN/ADN, em que o dito anticorpo é marcado de modo a ser detetável. 26. O método do item 25, que compreende ainda a ligação do híbrido formado na etapa a) a uma fase sólida para formar um híbrido ligado. 27. O método do item 25, em que a sonda da sequência de sinal é de cadeia simples. 28. O método do item 25, em que a sonda de sequência de captura é modificada com pelo menos um ligando. 29. O método do item 28, em que a sonda da sequência de sinal é biotinilada. 30. O método do item 29, em que a sonda de sequência de captura é linear com uma extremidade 5' e 3', em que ambas as extremidades 5' e 3' são biotiniladas. 31. 0 método do item 25, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 3 quilobases. 32. 0 método do item 25, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 500 bases. 33. O método do item 25, que compreende ainda a etapa de formação do ácido nucleico alvo de cadeia simples antes da etapa da hibridação. 34. O método do item 25, em que as hibridações da sonda de sequência de captura e da sonda de sequência de sinal com o ácido nucleico alvo são efetuadas sequencialmente. 35. O método do item 25, em que o híbrido formado na etapa a) é ligado a uma fase sólida para formar um híbrido ligado. 36. O método do item 35, em que o híbrido ligado é formado à temperatura ambiente. 37. O método do item 35, em que a fase sólida é revestida com estreptavidina. 38. O método do item 35, em que a fase sólida é uma microplaca. 39. O método de acordo com o item 25, em que o anticorpo é marcado com uma fosfatase alcalina. 40. O método do item 25 que compreende ainda a adição de uma sonda de bloqueio à etapa de hibridação, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sondas de sequência de captura não hibridadas. 41. O método do item 40, em que as sondas de bloqueio são adicionadas à reação de hibridação após a hibridação das sondas de sequência de captura com o ácido nucleico alvo. 42. O método do item 40, em que a sonda de bloqueio tem uma temperatura de fusão inferior à da sonda de sequência de captura. 43. Um método para detetar um ácido nucleico alvo que compreende: a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda de sequência de captura e uma sonda da sequência de sinal, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não hibridam entre si, em que a dita sonda de sequência de sinal compreende uma região híbrida de ARN/ADN; em que a dita hibridação forma uma complexo; e b) a deteção do dito complexo. 44. 0 método do item 43, em que a sonda da sequência de sinal tem um comprimento de pelo menos 40 pares de bases. 45. O método do item 43, em que a sonda da sequência de captura tem um comprimento de pelo menos 6 pares de bases. 46. O método do item 45, em que a sonda da sequência de captura é imobilizada numa fase sólida. 47. O método do item 43, em que o dito complexo é detetado pela ligação de um anticorpo que reconhece a região do híbrido de ADN/ARN à dita região, em que o anticorpo é marcado de forma detetável. 48. O método do item 43, em que a sequência de captura é modificada com pelo menos um ligando. 49. O método do item 48, em que o ligando é a biotina. 50. O método do item 49, em que a sonda de sequência de captura é linear com uma extremidade 5' e 3', em que ambas as extremidades 5' e 3' são biotiniladas. 51. O método do item 43 que compreende ainda a adição de uma sonda de bloqueio após a etapa de hibridação, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sonda de sequência de captura não hibridada. 52. O método do item 51, em que a sonda de bloqueio tem um comprimento que é 4 a 10 pares mais curto do que o comprimento da sonda de sequência de captura. 53. Uma sonda de ácido nucleico que consiste numa sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID ID NO: 1 até à SEQ ID NO:160. 54 . O método de acordo com o item 1, em que a sonda de sequência de sinal compreende uma primeira região que possui uma estrutura duplex de ADN/ARN e uma segunda região que possui uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples. 55. O método de acordo com o item 54, em que o duplex de ADN/ARN é um duplex de ADN de M13-ARN de M13. 56. Um método para detetar um ácido nucleico alvo que compreende: a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda de sequência de captura, uma sonda "ponte" e uma sonda da sequência de sinal para formar híbridos de cadeia dupla, em que a sonda de sequência de captura e a sonda "ponte" hibridam com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não hibridam entre si, em que a sonda de sequência de sinal híbrida com a sonda "ponte" e não com o ácido nucleico alvo e a sonda de sequência de captura; b) a adição de uma sonda de bloqueio à reação de hibridação, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sondas de sequência de captura não hibridadas; c) a ligação do híbrido numa fase sólida para formar o híbrido ligado; e d) a deteção do híbrido ligado. 57. O método de acordo com o item 56, em que a sonda de sequência de sinal compreende uma primeira região que possui uma estrutura duplex de ADN/ARN e uma segunda região que possui um ácido nucleico de cadeia simples. 58 . O método de acordo com o item 57, em que o duplex de ADN/ARN é um duplex de ADN de M13-ARN de M13. 59. O método de acordo com o item 57, em que o duplex de ADN/ARN é um híbrido formado entre sequências repetidas na sonda de sequência de sinal e uma molécula de ácido nucleico com sequências complementares às sequências repetidas. 60 . O método de acordo com o item 56, caracterizado por a sonda "ponte" compreender ainda uma cauda poli-A. 61. O método de acordo com o item 60, em que a sonda de sequência de sinal compreende uma sequência de ADN poli-dT de cadeia simples que híbrida com a cauda poli-A da sonda "ponte", e um duplex de ADN/ARN formado entre as sequências de poli-dT na sonda de sequência de sinal e uma molécula de ácido nucleico que possui sequências poli-A. 62. Um método para detetar um ácido nucleico alvo que compreende: a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda de sequência de captura e uma sonda de sequência de sinal para formar híbridos de cadeia dupla entre as ditas sondas e o ácido nucleico alvo; b) a ligação do híbrido numa fase sólida para formar o híbrido ligado; e c) a deteção do híbrido ligado, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não entre si. 63. O método do item 62, em que a hibridação da sonda de sequência de captura e da sonda de sequência de sinal com o ácido nucleico alvo são efetuadas sequencialmente. 64. O método do item 62, em que a etapa a) e a etapa b) são realizadas simultaneamente. 65. O método do item 62 que compreende ainda a adição de uma sonda de bloqueio, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sondas de sequência de captura não hibridadas; 66. O método do item 65, em que a adição da sonda de bloqueio e a etapa de hibridação são realizadas simultaneamente. 67. O método do item 65, em que a adição da sonda de bloqueio e a etapa de ligação são realizadas simultaneamente. 68. O método do item 62, em que a sonda da sequência de sinal é de cadeia simples. 69. 0 método do item 62, em que a sonda de sequência de captura é modificada com pelo menos um ligando. 70. O método do item 62, em que o ligando é a biotina. 71. O método do item 70, em que a sonda de sequência de captura é linear com uma extremidade 5' e 3', em que ambas as extremidades 5' e 3' são biotiniladas. 72. O método do item 62, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 3 quilobases. 73. O método do item 62, em que a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridam com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 500 bases. 74. O método do item 62, em que a sonda de sequência de captura é uma fusão de duas ou mais sequências complementares a diferentes regiões do ácido nucleico alvo ou a diferentes moléculas alvo. 75. O método do item 62, em que o híbrido de cadeia dupla formado é um híbrido de ADN/ARN. 76. O método do item 62, que compreende ainda a etapa de formação do ADN de cadeia simples antes da etapa da hibridação. 77. O método do item 62, em que a hibridação da sonda de sequência de captura e da sonda de sequência de sinal com o ácido nucleico alvo são efetuadas sequencialmente. 78. O método do item 62, em que a etapa a) e a etapa b) são realizadas simultaneamente. 79. O método do item 63, em que a sonda de bloqueio tem uma temperatura de fusão inferior à da sonda de sequência de captura. 80. O método do item 63, em que a fase sólida é revestida com estreptavidina. 81. O método do item 73, em que a fase sólida é uma microplaca. 82. O método do item 62 em que a etapa c) é efetuada a cerca de 2 0 0 C a 90°C. 83. 0 método do item 82, em que a sonda da sequência de captura tem um comprimento de pelo menos 6 bases. 84. 0 método do item 62 em que a etapa b) é efetuada à temperatura ambiente. 85. 0 método de acordo com o item 62, em que o híbrido ligado é detetado usando-se um anticorpo que reconhece um híbrido. 86. 0 método de acordo com o item 85, em que o híbrido é um híbrido de ADN/ARN. 87. 0 método de acordo com o item 85, em que o anticorpo que reconhece o híbrido de ADN/ARN está marcado com uma fosfatase alcalina. 88. 0 método de acordo com o item 62, em que a sonda de sequência de sinal compreende uma região da sonda de sequência de captura que sofreu deleção e é complementar ao ácido nucleico alvo. 89. 0 método de acordo com o item 62, em que o ácido nucleico alvo é um polimorfismo de nucleótido único. 90. O método de acordo com o item 89, em que a especificidade da ligação do híbrido a uma fase sólida é modulada por temperaturas superiores à temperatura ambiente. 91. O método de acordo com o item 89, em que a especificidade da ligação do híbrido a uma fase sólida é modulada pela adição de sondas de bloqueio. 92. O método de acordo com o item 89, em que a especificidade da ligação do híbrido a uma fase sólida é modulada por temperaturas superiores à temperatura ambiente e a adição de sondas de bloqueio.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Digene Corporation

<120> DETEÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR UM MÉTODO DE CAPTURA HÍBRIDA TIPO-ESPECÍFICA <13Ο> 21-87Τ1 <140> ΕΡ 08 007 108.7 <141> 10-04-2008 <150> US 09/594 839 <151> 15-06-2000 <16 0 > 162 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> TS-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 1 ttattattac gttcatgtcg gcaaacagct cgtttattat ta 42

<210> 2 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> TS-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 2 ttattattac gtcctggatg gcgatacggc ttattatta 39

<210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VH-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 3 cgtcctggat ggcgatacgg c 21 <210> 4'

<211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NC-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 4 cgttcatgtc ggcaaacagc tcgt 24

<210> 5 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VH-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 5 cgttcatgtc ggcaaacagc tcgtcgtcct ggatggcgat acggc 45

<210> 6 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> HZ-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 6 gatggggtta tttttcctaa gatggggcgg gtcc 34

<210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VH-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 7 taccccgatc atcagttatc cttaaggt 28

<210> 8 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> FD-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 8 aaaccgttcc atgaccgga 19

<210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> RA-2 <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <22 0> <400> 9 atcgcgtgtt ccagagacag gc 22

<210> 10 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NC-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 10 caacgcccaa aataata 17

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> FD-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 11 gtccccgaac cgatctagcg 20

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> RA-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 12 cgaaccataa accattcccc at 22

<210> 13 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ON-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 13 cacgcccgtg gttctggaat tcgac 25

<210> 14 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> HZ-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 14 tttattagat ggggttattt ttcctaagat ggggcgggtc c 41

<210> 15 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZD-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 15 ggttattttt cctaag 16

<210> 16 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZD-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 16 attattggtt atttttccta agattatt 28

<210> 17 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> F6R <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 17 acgacgccct tgactccgat tcgtcatcgg atgactccct 40

<210> 18 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> BRH19 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 18 atgcgccagt gtatcaatca gctgtttcgg gt 32

<210> 19 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> F15R <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 19 caaaacgtcc tggagacggg tgagtgtcgg cgaggacg 38

<210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VH-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 20 gtccccgacc cgatctagcg 20

<210> 21 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <22 0> <223> ON-4 <22 0> <400> 21 gcagactgcg ccaggaacga gta 23

<210> 22 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 22 gtgcccacgc ccgtggttct ggaattcgac agcga 35

<210> 23 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 23 gcagactgcg ccaggaacga gtagttggag tactg 35

<210> 24 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> FG-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 24 aagaggtcca ttgggtgggg ttgatacggg aaagac 36

<210> 25 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> FG-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 25 cgtaatgcgg cggtgcagac tcccctg 27

<210> 26 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> FG-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 26 ccaactaccc cgatcatcag ttatccttaa ggtctcttg 39

<210> 27 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Hsvl-LF15R <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 27 aaaaaaaaac aaaacgtcct ggagacgggt gagtgtcggc gaggacg 47

<210> 28 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <22 0> <223> Hsvl-f15-2B <22 0> <400> 28 caaaacgtcc tggagacggg tgagtgtcgg cgaggacg 38

<210> 29 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Hsvl-F15-3B <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 29 caaaacgtcc ggagacgggt gagtgcggcg aggacg 36

<210> 30 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EA-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 30 aggaaaaata accccatc 18

<210> 31 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EA-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 31 gacccgcccc atctt 15

<210> 32 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZD-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 32 ggacccgccc catcttagga aaaataaccc catc 34

<210> 33 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NG-7 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 33 aaaaataacc cca 13

<210> 34 <211> 11 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NG-8 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 34 cgccccatct t 11

<210> 35 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <223> NG-4 <22 0> <400> 35 ccatcttagg aaaaa 15

<210> 36 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GP-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 36 ataactgatg atcgg 15

<210> 37 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EA-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4Ο0> 37 ccacccaatg gacctc 16

<210> 38 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EA-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 38 gtctttcccg tatcaacc 18

<210> 39 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EB-7 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 39 cgccgcatta eg 12 <210> 40 <211> 12

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EB-8 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 40 aqqqqaqtct qc 12

<210> 41 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GP-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 41 ctgtttgccg aca 13

<210> 42 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GP-4 <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <22 0> <400> 42 tatcgccatc cag 13

<210> 43 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EB-9 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 43 atgatcgggg tagt 14

<210> 44 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> EB-10 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 44 agagacctta aggata 16

<210> 45 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NG-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 45 attccagaac cacgg 15

<210> 46 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NG-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 46 ttccagaacc acg 13

<210> 47 <211> 11 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NG-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 47 tccagaacca c 11

<210> 48 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GP-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 48 gttcctggcg cag 13

<210> 49 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GP-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 49 ttcctggcgc ag 12

<210> 50 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NF-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 50 gcccgcgccg ccagcactac tttc 24

<210> 51 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> FG-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 51 aaacgttggg aggtgtgtgc gtcatcctgg agcta 35

<210> 52 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> LE-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 52 gccaaaaccg agtgaggttc tgtgt 25

<210> 53 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NF-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 53 aaacgttggg aggtgtgtgc gtca 24

<210> 54 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> RA-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 54 tgctcgtcac gaagtcactc atg 23

<210> 55 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ON-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 55 cattactgcc cgcaccggac c 21

<210> 56 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> LE-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 56 gccgtggtgt tcctgaacac cagg 24

<210> 57 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> LE-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 57 agtcagggtt gcccgacttc gtcac 25

<210> 58 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> NF-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 58. caggcgtcct cggtctcggg cggggc 26 <210> 59

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> LE-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 59 cccacgtcac cgggggcccc 20

<210> 60 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> LE-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 6 0 gccggtcgcg tgcgacgccc aaggc 25

<210> 61 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <223> SG-3 <22 0> <400> 61 ccgacgcgtg ggtatctagg gggtcg 26

<210> 62 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SG-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 62 cgggacggcg agcggaaagt caacgt 26

<210> 63 <211> 9 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> HX-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 Ο Ο> 63 ggcgcgggc 9

<210> 64 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ΗΧ-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 64 gaaagtagtg ctggc 15

<210> 65 <211> 11 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GP-7 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 65 tgctggcggc g 11

<210> 66 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AZ-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 6 6 acacctccca acg 13

<210> 67 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AZ-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 67 ctccaggatg acg 13

<210> 68 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GR-1 <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <22 0> <400> 6 8 tcggttttgg tc 12

<210> 69 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GR-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 6 9 acacagaacc tea 13

<210> 70 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> GP-8 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 70 cacacacctc cca 13

<210> 71 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> BR-10 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 71 cgacccccta gata 14

<210> 72 <211> 11 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> BR-11 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 72 ccacgcgtcg g 11

<210> 73 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> HX-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 73 acgttgactt tccgc 15

<210> 74 <211> 10 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> BR-15 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 74 cgccgtcccg 10

<210> 75 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZL-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 75 gtacagatgg taccggggtt gtagaagtat ctg 33

<210> 76 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZL-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 76 ctgcaacaag acatacatcg accggtccac c 31

<210> 77 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DP-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 77 gaagtaggtg aggctgcatg tgaagtggta g 31

<210> 78 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DP-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 78 cagctctgtg cataactgtg gtaactttct ggg 33

<210> 79 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SH-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 79 gaggtcttct ccaacatgct atgcaacgtc ctg 33

<210> 80 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <223> SH-4 <22 0> <400> 80 gtgtaggtgc atgctctata ggtacatcag gcc 33

<210> 81 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VS-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 81 caatgccgag cttagttcat gcaatttccg agg 33

<210> 82 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VS-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4Ο0> 82 gaagtagtag ttgcagacgc ccctaaaggt tgc 33

<210> 83 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AH-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 83 gaacgcgatg gtacaggcac tgcagggtcc 30

<210> 84 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AG-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 84 gaacgcgatg gtacaggcac tgca 24 <210> 85 <211> 24

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AL-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 85 acqcccaccc aatqqaatqt accc 24

<210> 86 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PA-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 8 6 tctgcgtcgt tggagtcgtt cctgtcgtgc tc 32

<210> 87 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> 18-1AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 87 ttattattac tacatacatt gccgccatgt tcgcca 36

<210> 88 <211> 46 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 18-2AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 88 ttattattat gttgccctct gtgcccccgt tgtctatagc ctccgt 46

<210> 89 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 18-3AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 89 ttattattag gagcagtgcc caaaagatta aagtttgc 38

<210> 90 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 18-4AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 90 ttattattac acggtgctgg aatacggtga gggggtg 37

<210> 91 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 18-5AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 91 ttattattaa cgcccaccca atggaatgta ccc 33

<210> 92 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 18-6AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 92 ttattattaa tagtattgtg gtgtgtttct cacat 35

<210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 18-7AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 93 ttattattag ttggagtcgt tcctgtcgtg 30

<210> 94 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> 18-8AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 94 ttattattac ggaatttcat tttggggctc t 31

<210> 95 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PE-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 95 gctcgaaggt cgtctgctga gctttctact act 33

<210> 96 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 9 6 gcgccatcct gtaatgcact tttccacaaa gc 32

<210> 97 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 97 tagtgctagg tgtagtggac gcaggaggtg g 31 <210> 98.

<211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> CS-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 98 ggtcacaaca tgtattacac tgccctcggt ac 32

<210> 99 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <22 0> <223> CS-4 <22 0> <400> 99 cctacgtctg cgaagtcttt cttgccgtgc c 31

<210> 100 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PF-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 100 ctgcattgtc actactatcc ccaccactac tttg 34

<210> 101 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PF-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 101 ccacaaggca cattcataca tacacgcacg ca 32

<210> 102 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PA-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 102 gttctaaggt cctctgccga gctctctact gta 33

<210> 103 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 45-5AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 103 ttattattat gcggttttgg gggtcgacgt ggaggc 36

<210> 104 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 45-6AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 104 ttattattaa gacctgcccc ctaagggtac atagcc 36

<210> 105 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 45-8AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 105 ttattattac agcattgcag cctttttgtt acttgcttgt aatagctcc 49

<210> 106 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <22 0> <223> 45-9AB <22 0> <4 0 0> 106 ttattattaa tcctgtaatg cacttttcca caaa 34

<210> 107 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 45-10AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 107 ttattattag cctggtcaca acatgtatta c 31

<210> 108 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> 45-11AB <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 108 ttattattac aggatctaat tcattctgag gtt 33

<210> 109 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ON-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 109 tgcggttttg ggggtcgacg tggaggc 27

<210> 110 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PV-FD-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 110 gcctccacgt cgac 14

<210> 111 <211> 11 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PV-FD-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 111 ccccaaaacc g 11

<210> 112 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PV-FD-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 112 ggtacattcc attggg 16

<210> 113 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <223> PV-FD-4 <22 0> <4 0 0> 113 tgggcgttaa taataa 16

<210> 114 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AH-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 114 accatcgcgt tc 12

<210> 115 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AH-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 Ο 0> 115 ggaccctgca gtgc 14

<210> 116 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AH-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 116 ctgtaccatc gcgtt 15

<210> 117 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> AH-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 117 tgcagtgcct gt 12

<210> 118 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-1 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 118 ccacctcctg cgt 13

<210> 119 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 119 attacaggat ggcgc 15

<210> 120 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 120 gctttctgga aaagtg 16

<210> 121 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PZ-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 121 ccactacacc tagcacta 18

<210> 122 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZL-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 122 cagatacttc tacaacc 17

<210> 123 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZL-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 123 ccggtaccat ctgtac 16

<210> 124 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZL-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 124 ggtggaccgg teg 13

<210> 125 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> ZL-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 125 atgtatgtct tgttgcag 18

<210> 126 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DP-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 126 ctaccacttc acatgc 16

<210> 127 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DP-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 127 agcctcacct acttc 15

<210> 128 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DP-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 128 cccagaaagt taccac 16

<210> 129 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> DP-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 129 agttatgcac agagct 16

<210> 130 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SH-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 130 caggacgttg catagc 16

<210> 131 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SH-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 131 atgttggaga agacctc 17

<210> 132 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SH-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 132 ggcctgatgt acctata 17

<210> 133 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223>"SH-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 133 gagcatgcac ctacac 16

<210> 134 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VS-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 134 ctcggaaatt gcatg 15

<210> 135 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VS-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 135 aactaagctc ggcatt 16

<210> 136 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VS-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 136 gcaaccttta gggg 14

<210> 137 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> VS-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 137 cgtctgcaac tactacttc 19

<210> 138 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> CS-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 138 gtaccgaggg cagt 14

<210> 139 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> CS-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 139 gtaatacatg ttgtgacc 18

<210> 140 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> CS-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 140 ggcacggcaa gaaa 14

<210> 141 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> CS-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 Ο 0> 141 gacttcgcag acgtagg 17

<210> 142 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PF-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 142 caaagtagtg gtggg 15

<210> 143 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PF-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 143 gatagtagtg acaatgcag 19

<210> 144 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PF-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 144 tgcgtgcgtg tatgta 16

<210> 145 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PF-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 145 tgaatgtgcc ttgtgg 16

<210> 146 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PE-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 146 agtagtagaa agctcagc 18

<210> 147 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PE-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 147 agacgacctt cgagc 15

<210> 148 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PA-2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 148 tacagtagag agctcgg 17

<210> 149 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PA-3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 149 cagaggacct tagaac 16

<210> 150 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PA-5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 150 gagcacgaca ggaacg 16

<210> 151 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PA-6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 151 actccaacga cgcaga 16

<210> 152 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> HBV Cl <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 152 gctggatgtg tctgcggcgt tttatcat 28

<210> 153 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> HBV C2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 153 actgttcaag cctccaagct gcgcctt 27

<210> 154 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> HBV C3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 154 atgataaaac gccgcagaca catccagcga ta 32

<210> 155 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> BI <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 155 atgataaaac gccg 14

<210> 156 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> B2 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 156 cagacacatc cage 14

<210> 157 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> B3 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <400> 157 aaggcacagc ttg 13

<210> 158 <211> 14 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> B4 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 158 gaggcttgaa cagt 14

<210> 159 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> B5 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 159 tatcgctgga tgtgtc 16

<210> 160 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> B6 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sonda de ácido nucleico <4 0 0> 160 tcggcgtttt atcatg 16

<210> 161 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR SINTÉTICO <300> <301> KLEAS et al., <303> Medicina Molecular <304> 77 <306> 299-302 <307> 1999 <4 0 0> 161 aagacccagg tccagatgaa g 21

<210> 162 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: INICIADOR SINTÉTICO <300> <301> KLEAS et al., <303> Medicina Molecular <304> 77 <306> 299-302 <307> 1999 <4 Ο 0> 162 agaatgcaag aagcccagac 20

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5641630 A [0005] • US 5681697 A [0006] • EP 08007108 A [0091] • US 09594839 B [0091]

Documentos de não patente citados na descrição • LANDEGREN et al. DNA Diagnostics-Molecular Techniques and Automation. Science, 1988, vol. 242, 229-237 [0021] • MCCABE. PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, 1990, 76-83 [0029] • NARANG et al. Meth. Enzymol., 1979, vol. 68, 90 [0029] • BROWN et al. Meth. Enzymol., 1979, vol. 68, 109 [0029] • CARUTHERS et al. Meth. Enzymol., 1985, vol. 154, 287 [0029] • SAMBROOK et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990 [0030] • COUTLEE et al. J. Clin. Microbiol., 1989, vol. 27, 1002-1007 [0043] • COOK et al. Nucl. Acid. Res., 1988, vol. 16, 4077-95 [0054] • YISRAELI et al. Methods in Enzymol., 1989, vol. 180, 42-50 [0055] • KAWAJIRI et al. Carcinogenesis, 1993, vol. 14, 1085-1089 [0086] • KLAES et al. L Mol. Med., 1999, vol. 77, 299-302 [0087]

Lisboa, 12 de Agosto de 2015

Claims (35)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para detetar um ácido nucleico alvo caracterizado por compreender: a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda de sequência de captura e uma sonda de sequência de sinal para formar híbridos de cadeia dupla entre as ditas sondas e o ácido nucleico alvo, em que a sonda de sequência de captura e a sonda da sequência de sinal são capazes de hibridar com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não hibridam entre si; b) a adição de uma sonda de bloqueio à reação de hibridação, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sondas de sequência de captura não hibridadas; c) a ligação do híbrido numa fase sólida para formar o híbrido ligado; e d) a deteção do híbrido ligado.
2. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sonda da sequência de sinal ser biotinilada.
3. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sonda da sequência de sinal ser de cadeia simples.
4. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridarem com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 3 quilobases.
5. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sonda de sequência de captura e a sonda de sequência de sinal hibridarem com regiões do ácido nucleico alvo, em que as regiões estão a uma distância inferior a 500 bases.
6. 6. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sonda de sequência de captura ser uma fusão de duas ou mais sequências complementares a diferentes regiões do ácido nucleico alvo ou a diferentes moléculas alvo.
7. 7. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o híbrido de cadeia dupla formado ser um híbrido de ADN/ARN.
8. 8. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender ainda a etapa de formação do ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples antes da etapa da hibridação.
9. 9. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a hibridação da sonda de sequência de captura e da sonda de sequência de sinal com o ácido nucleico alvo serem efetuadas sequencialmente.
10. 10. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a etapa a) e a etapa b) serem realizadas simultaneamente.
11. 11. O método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sonda de bloqueio ter uma temperatura de fusão inferior à da sonda de sequência de captura.
12. 12. O método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a fase sólida ser revestida com estreptavidina.
13. 13. O método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a fase sólida ser uma microplaca.
14. 14. 0 método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a etapa c) ser efetuada à temperatura ambiente.
15. 15. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o híbrido ligado ser detetado usando-se um anticorpo que reconhece o híbrido.
16. 16. 0 método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o híbrido ser um híbrido de ADN/ARN.
17. 17. 0 método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o anticorpo que reconhece o híbrido de ADN/ARN estar marcado com uma fosfatase alcalina.
18. 18. 0 método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sonda de sequência de sinal compreender uma região híbrida de ADN/ARN, em que a dita hibridação forma um complexo.
19. 19. 0 método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a sonda da sequência de sinal ter um comprimento de pelo menos 40 pares de bases.
20. 20. O método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a sonda da sequência de captura ter um comprimento de pelo menos 6 pares de bases.
21. 21. O método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a sonda da sequência de captura ser imobilizada numa fase sólida.
22. 22. O método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o dito complexo ser detetado pela ligação de um anticorpo que reconhece a região do híbrido de ADN/ARN à dita região, em que o anticorpo é marcado de forma detetável.
23. 23. 0 método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a sonda de bloqueio possuir um comprimento que é 4 a 10 pares mais curto do que o comprimento da sonda de sequência de captura.
24. 24. O método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sonda de sequência de sinal compreender uma primeira região que possui uma estrutura duplex de ADN/ARN e uma segunda região que possui uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples.
25. 25. O método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o duplex de ADN/ARN ser um duplex de ADN de M13-ARN de M13.
26. 26. Um método para detetar um ácido nucleico alvo caracterizado por compreender: a) a hibridação de um ácido nucleico alvo de cadeia simples ou parcialmente de cadeia simples com uma sonda "ponte", uma sonda de sequência de captura, e uma sonda da sequência de sinal, em que o ácido nucleico alvo e a sonda "ponte" quando hibridados formam híbridos de cadeia dupla, e em que a sonda de sequência de captura e a sonda "ponte" hibridam com regiões não sobrepostas no ácido nucleico alvo e não hibridam entre si, e a sonda de sequência de sinal híbrida com a sonda "ponte" e não com o ácido nucleico alvo e a sonda de sequência de captura; b) a adição de uma sonda de bloqueio à reação de hibridação, em que a dita sonda de bloqueio híbrida com o excesso de sondas de sequência de captura não hibridadas; c) a ligação do híbrido numa fase sólida para formar o híbrido ligado; e d) a deteção do híbrido ligado.
27. 27. O método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a sonda de sequência de sinal compreender uma primeira região que possui uma estrutura duplex de ADN/ARN e uma segunda região que possui um ácido nucleico de cadeia simples.
28. 28. 0 método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o duplex de ADN/ARN ser um duplex de ADN de M13-ARN de M13.
29. 29. 0 método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o duplex de ADN/ARN ser um híbrido formado entre sequências repetidas na sonda de sequência de sinal e uma molécula de ácido nucleico com sequências complementares às sequências repetidas.
30. 30. O método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a sonda "ponte" compreender ainda uma cauda poli-A.
31. 31. O método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a sonda de sequência de sinal compreender uma sequência de ADN poli-dT de cadeia simples que híbrida com a cauda poli-A da sonda "ponte", e um duplex de ADN/ARN formado entre as sequências de poli-dT na sonda de sequência de sinal e uma molécula de ácido nucleico que possui sequências poli-A.
32. 32. O método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ácido nucleico alvo ser um polimorfismo de nucleótido único.
33. 33. O método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a especificidade da ligação do híbrido a uma fase sólida ser modulada por temperaturas superiores à temperatura ambiente.
34. 34. O método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a especificidade da ligação do híbrido a uma fase sólida ser modulada pela adição de sondas de bloqueio.
35. 35. 0 método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a especificidade da ligação do híbrido a uma fase sólida ser modulada por temperaturas superiores à temperatura ambiente e a adição de sondas de bloqueio. Lisboa, 12 de Agosto de 2015