KR101334645B1 - 표적-특이적 하이브리드 포획 방법에 의한 핵산의 검출 - Google Patents

표적-특이적 하이브리드 포획 방법에 의한 핵산의 검출 Download PDF

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Abstract

표적-특이적 하이브리드 포획 (TSHC)이 신속하고 민감할 뿐 아니라 고도로 특이적이고 매우 상동인 핵산 서열을 구별할 수 있는 핵산 검출 방법을 제공한다. 이 방법은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있는 DNA:RNA 하이브리드를 생성한다.
표적-특이적 하이브리드, 포획, 핵산, 서열, 검출, 올리고뉴클레오티드

Description

표적-특이적 하이브리드 포획 방법에 의한 핵산의 검출{DETECTION OF NUCLEIC ACIDS BY TARGET-SPECIFIC HYBRID CAPTURE METHOD}
본 출원은 35 U.S.C.§120하에 2004년 12월 6일 출원된 미국특허출원 11/005,617호[명칭 "Detection Of Nucleic Acids By Target-Specific Hybrid Capture Method"]의 일부 계속 출원이고, 지금은 포기된 2004년 10월 20일 출원된 미국특허출원 10/971,251호의 일부 계속 출원이며, 2000년 6월 15일 출원된 미국특허출원 09/594,839호의 일부 계속 출원이고, 이들 모두는 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 일반적으로 핵산 검출 방법의 분야에 관한 것이고 보다 특히 표적-특이적 하이브리드 포획 방법에 의한 핵산의 검출에 관한 것이다.
생물학적 샘플에 존재하는 특이적 핵산 서열의 검출은 미생물을 동정 및 분류하고, 감염증을 진단하고, 유전자 이상을 검출하고 이의 특성을 규정하고, 암과 관련된 유전자 변화를 동정하고, 질병에 대한 유전자 감수성을 연구하고, 다양한 유형의 치료에 대한 반응을 측정하는데 중요하다. 특정 핵산 서열을 검출하고 정량하는 일반적인 기술은 핵산 하이브리드화 및 표적 증폭이다.
다양한 하이브리드화 방법을 핵산을 검출하고 연구하는데 이용할 수 있다. 전통적인 하이브리드화 방법에서, 동정하고자 하는 핵산은 용액 중에 있거나 고체 담체에 첨가된다. 핵산은 핵산에 하이브리드화될 수 있는 표지된 핵산 프로브를 이용하여 검출된다. 최근에, 검출의 민감성 및 특이성을 증가시키는 새로운 하이브리드화 방법이 개발되었다. 한 예가 미국특허 출원 제 07/792,585 및 미국특허 제 6,228,578에 기재된 하이브리드 포획방법이다. 이러한 신규한 하이브리드화 방법이 전통적인 방법들에 비해 현저한 개선을 제공하지만, 이들은 여전히 고도로 상동인 핵산 서열들을 완전히 구별해 내는 능력이 부족하다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 가장 일반적으로 사용되는 표적 핵산 증폭 방법이다. 그러나, PCR은 다수의 상이한 표적이 동시에 증폭될 때, 즉 프라이머-이량체와 같은 PCR 인공물뿐만 아니라 의사 표적 증폭을 야기할 수 있는 다중 반응일 때 일정 한도로 제한된다. 이러한 제한을 극복하기 위한 시도에서, 다수의 표적이 상동인 영역을 지니는 경우 일치 프라이머를 이용할 수 있다. 그러나, 종들 간의 상동성이 결코 100%가 아니므로, 프라이머는 상이한 표적과 수 개의 미스매치를 지닐 것이고, 균일하지 않은 증폭을 야기할 것이다. 상이한 양의 표적이 샘플에 존재할 때, 상이한 PCR의 증폭 효율도 변화되며, 이는 상이한 표적의 균일하지 않고 비특이적인 증폭을 초래한다.
따라서 본 발명의 목적은 증가된 신속성 및 민감성을 제공할 뿐만 아니라 다수의 고도로 상동인 핵산 표적 서열에 매우 특이적이고 이들을 구별해 낼 수 있는 표적 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 본원에서 표적-특이적 하이브리드 포획 ("TSHC")이라 언급되는, 신규한 핵산 검출 방법을 제공한다. TSHC는 고도로 상동인 핵산 표적 서열을 구별해 내고 검출할 수 있는 신속하고, 고도로 특이적이며, 민감한 방법이다.
본 발명의 일 구체예는 표적 핵산 서열의 신속하고 민감한 검출을 위하여 표적 부화, 증폭, 및 검출시키는 단계를 포함하여, 하나 이상의 표적 핵산을 검출하고/거나 정량하는 방법에 관한 것이다.
청구된 발명의 일 구체예에서, 하나 이상의 표적 핵산은, 표적 핵산, 표적 핵산에 상보적인 핵산 프로브 (여기에서, 하나는 RNA이고 다른 하나는 DNA이다), 및 고체 지지체를 혼합시켜 표적 핵산을 고체 지지체로 포획시키고; 결합되지 않은 표적 핵산 및 핵산 프로브를 제거하고; 포획된 표적 핵산 또는 핵산 프로브를 증폭시켜 다수의 암플리콘을 형성하고, 이 때 암플리콘의 존재는 표적 핵산의 존재를 나타내며; 표적 핵산을 표적 핵산의 일부와 하이브리드화되는 선택가능하고 구별가능한 올리고뉴클레오티드 (즉, 포획 서열 프로브; CSP) 및 표적 핵산의 상이한 부분에 상보적인 핵산 프로브 (즉, 시그널 서열 프로브; SSP)와 혼합시킴에 의해 표적 핵산을 검출함에 의해 검출되며, 여기서 프로브 또는 표적 중 어느 하나는 RNA이고 다른 하나는 DNA이며, DNA:RNA 하이브리드는 직간접적으로 표지되는 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제에 의해 검출되고, 이로써 표적 핵산을 검출한다. SSP는 검출을 위해 시그널을 제공하는 수단으로서만 기능하는 것은 아니며; 표적 핵산에 하이브리드화되어 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제로의 포획을 가능하게 함에 의해 표적 부화 단계에 이용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 다수의 표적 핵산은, 다수의 표적 핵산을 표적 핵산에 상보적인 핵산 프로브에 하이브리드화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 형성하고; 고체 지지체에 컨쥬게이션된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체로 DNA:RNA 하이브리드를 포획하고; 결합되지 않은 표적 핵산 및 핵산 프로브를 제거하고; 포획된 표적 핵산 또는 핵산 프로브를 증폭시켜, 랜덤 프라이머 및 DNA 중합효소를 이용하여 다수의 암플리콘을 형성하고, 이 때 복수의 암플리콘의 존재는 표적 핵산의 존재를 나타내며; 표적 핵산 서열의 일부에 상보적인 핵산 프로브를 하이브리드화시켜 표적 및 프로브간에 DNA:RNA 하이브리드를 형성하고; 고체 지지체에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산의 상이한 부분에 하이브리드화시키고, 이 때 고체 지지체는 선택가능하며; 올리고뉴클레오티드 복합체를 선택하고; DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제를 DNA:RNA 하이브리드에 결합시켜 복수의 표적 핵산을 검출함에 의해 검출된다.
추가의 구체예에서, 하나 이상의 표적 DNA는, 다수의 표적 DNA를 표적 DNA에 상보적인 RNA 프로브에 하이브리드화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는 단계; 비드에 컨쥬게이션된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체로 DNA:RNA 하이브리드를 포획하는 단계; 결합되지 않은 핵산 및 핵산 프로브를 과량의 핵산 및 프로브를 세척함에 의해 제거하는 단계; 랜덤 프라이머 및 DNA 중합효소를 이용하여 표적 DNA를 등온적으로 증폭시켜, 다수의 암플리콘을 형성하는 단계; 표적 DNA의 일부에 상보적인 RNA 프로브 (즉, SSP)를 하이브리드화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는 단계; 특이적 DNA 올리고뉴클레오티드를 표적 DNA의 상이한 부분에 하이브리드화시키는 단계로서, 이 때 DNA 올리고뉴클레오티드는 선택가능한 비드에 컨쥬게이션되는 단계; 검출가능하게 표지된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체를 DNA:RNA 하이브리드에 결합시키고 선택가능한 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이션된 비드 (즉, CSP)를 이용하여 표적 DNA를 선택함에 의해 복수의 표적 DNA를 검출하는 단계로서, 이 때 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체는 검출가능하고 구별가능하게 표지되어 있는 단계를 갖는 다중 방법에 의해 검출된다. 각 표적의 존재는 표적을 지니는 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는 SSP를 통해 표지된 DNA:RNA 항체에 의해 검출되는 한편, 다양한 표적은 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이션된 비드 (즉, CSP)에 기초하여 분리되거나 선택된다. 암플리콘 및 DNA:RNA 하이브리드의 존재는 표적 DNA의 존재를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 시험 샘플에서 핵산 또는 다수의 핵산을 부화, 증폭시키고 그 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고도로 상동인 핵산 서열들을 구별해 내고 검출할 수 있는 매우 특이적이고 민감한 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는 표적 핵산 서열의 다중 검출을 위한 신속하고 민감한 방법에 관한 것이며, 여기서 다수의 상이한 표적 핵산 서열은 동시에 검출될 수 있다. 이 방법은 자동화될 수 있다. 이 방법은 필수적으로 표적 부화; 표적 증폭; 및 표적 검출의 3 단계를 포함하며, 핵산 진단을 위한 반정량적이거나 정성적인 접근법을 제공한다. 본 발명의 상기 구체예는 정제되거나 비정제된 샘플에서 표적 핵산 서열을 검출하는 다중 포맷으로 수행될 수 있고, 여기서 표적의 농도는 샘플 1 밀리리터에 대하여 약 50 복사체만큼 낮거나 그 보다 적은 농도 내지 약 100 복사체의 표적일 수 있고, 밀리리터 당 108 복사체만큼 클 수 있다. HSV 및 HPV 유형을 들 수 있으나 이로 제한되지 않는 생물학적 샘플에서 개별적인 병원체 또는 표적의 검출은 다중으로, 바람직하게는 50-중으로 수행될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
유리하게도, 다수의 표적 핵산 서열을 검출하는 본 발명의 다중 방법은 임상 검정에서 이로운 특징인 2 수준의 특이성을 지니는 비교적 신속하고, 민감하며 정확한 방법이다. 2 수준의 특이성은 표적에 대한 서열 특이성을 이용함에 의해 표적 부화 및 검출 단계에서 달성된다.
표적 부화는 비특이적 핵산 및 오염물을 특정 표적으로부터 분리함에 의해 증폭을 위한 샘플을 제조하는 제1 단계이다. 비특이적이거나 바람직하지 않은 핵산 서열의 존재는 증폭 및 검출을 방해함에 의해 표적 증폭의 민감성을 감소시킨다. 표적 부화 단계에서 샘플을 가능한 억제제로부터 정제하고 비특이적 핵산을 제거함으로써 첫 번째 수준의 특이성을 제공한다. 비특이적 핵산의 제거는 등온 증폭 단계에서 효과적인 증폭을 가능하게 하므로 상동인 표적들간의 경쟁을 최소화한다. 표적 부화는 이중 가닥 표적도 변성시켜서 효과적인 증폭을 위한 단일 가닥 DNA를 생성한다. 다양한 시약이 표적 포획을 개선시키기 위해 표적 부화 단계에 이용될 수 있다. 예를 들어, 서브틸리신이, 특히 출혈 임상 샘플에서 표적 포획을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 서브틸리신, 또는 카르보닐 히드롤라아제는 바실러스(Bacillus) 속의 멤버에 의해 분비되는 알칼리 프로테아제이다. 표적 핵산이 비드에 의해 포획될 때, 서브틸리신의 존재는 비드가 단단한 펠렛을 형성하도록 하여 결합되지 않거나 바람직하지 않은 재료의 세척의 용이성을 개선시킨다. 더욱이, 표적 부화 단계는 표적 핵산을 소부피로도 농축시킨다.
표적의 부화는, 표적 핵산, DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제, 예컨대 표적 핵산에 상보적인 핵산 프로브, 예를 들어 시그널 서열 프로브, 및 고체 지지체를 혼합시키고, 이 때 표적 핵산 및 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제가 하이브리드화되어 고체 지지체상에 DNA:RNA 하이브리드를 형성하며, DNA:RNA 하이브리드를 형성하지 않거나 고체 지지체에 의해 포획되지 않은 임의의 핵산을 제거함에 의해 달성된다.
특히, 요망되는 표적 핵산 및 비특이적 핵산의 분리는 예를 들어 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제로 개질된 상자체 비드와 같은 고체상 또는 고체 지지체 상에 포획된 DNA:RNA 하이브리드의 형성에 의해 달성되며, DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제로는 예컨대 DNA:RNA 하이브리드에 특이적인 항체 (예컨대, 하이브리드 포획 항체, HC-Ab), 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 이의 단편, 단백질, 촉매적으로 비활성인 RNase H, 핵산, 핵산 아프타머, 또는 결합하여 삼중 구조를 형성하는 능력을 지닌 올리고뉴클레오티드가 있으나, 이로 제한되지 않는다. 표면 플라스몬 공명에 의하여 Mg2+ 및 촉매의 부재하에 DNA:RNA 하이브리드에 대한 RNase H의 결합 친화력은 하루끼(Haruki) 등에 의해 보고된 바 있다["Kinetic and stoichiometric analysis for the binding of Escherichia coli ribonuclease HI to RNA-DNA hybrids using surface plasmon resonance" J. Biol. Chem. 272:22015-22022, 1997, 참조로서 포함됨]. 상기 표적 부화 단계는 미세역가 플레이트, 마이크로칩, 비드, 상자체/비상자체 비드 또는 임의의 이전에 언급된 고체상과 같은 임의의 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 DNA, RNA 프로브, 또는 일련의 상이한 RNA 프로브 (다중 반응일 경우), 및 컨쥬게이션된 DNA:RNA HC-항체에 결합된 비드를 혼합한다. 표적 DNA 및 RNA 프로브가 DNA:RNA 하이브리드를 형성한다. DNA:RNA HC-항체를 상자체 비드와 같은 고체 지지체에 컨쥬게이션시킨다. 일단 DNA:RNA 하이브리드가 고체 지지체상에 포획되면, 모든 결합되지 않은 핵산 서열 및 오염물을, 바람직하게는 하이브리드를 분해하지 않거나 이에 영향을 주지 않는 완충액을 이용하여 반복 세척함에 의해 씻어낸다.
DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체를 이용하는 것에 대안적으로 또는 추가로, 고체상에 컨쥬게이션된 표적에 상보적인 임의의 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 표적 핵산 서열을 포획하는데 이용할 수 있다. 예를 들어, 특정 HPV 유형을 인식하는 올리고뉴클레오티드 또는 프로브를 플레이트, 칩 또는 비드와 같은 고체상에 컨쥬게이션할 수 있다. 공지된 특정 프로브에 컨쥬게이션된 여러 비드가 비드 셋을 형성한다. 예를 들어, 각각의 비드 셋은 한 HPV 유형에 특이적이다. 다중 포맷에서, 하나의 비드 셋에 대하여 하나의 HPV 유형으로서, 다양한 HPV 유형을 동정하는 다수의 비드 셋을 이용할 수 있다. 표적 핵산을 포획하는데 유용한 올리고뉴클레오티드는 일부 또는 완전히M 로킹된(locked) 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA)일 수 있거나, 다른 개질을 지닐 수 있다[Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Eds. Serge L. Beaucage, et al., John Wiley & Sons ⓒ 2004]. 핵산 프로브의 길이는 표적 핵산 길이의 약 100% 이하일 수 있고, 그 길이는 약 50 염기 내지 약 10 킬로염기의 범위이다. 표적 핵산은 DNA이거나 RNA일 수 있다. 표적 핵산이 RNA인 경우, cDNA는 임의의 일반적으로 공지된 방법에 의해 RNA 표적으로부터 생성될 수 있거나, 표적 RNA가 DNA 프로브에 의해 포획될 수 있으며, 하이브리드화된 DNA 프로브가 증폭되고 검출될 것이다.
표적 부화 단계는 본원에 개시된 구체예에 의해 제한되지 않는다. 당업자는 오염물, 억제제 또는 다른 비특이적 핵산이 본원에 개시된 원리에 기초하여 샘플로부터 제거되거나 배제될 수 있도록 샘플에서 표적 핵산을 어떻게 정제할지를 이해할 것이다. 샘플 제조법은 시판되는 방법 및 키트를 통해 당 분야에 공지되고 이해되어 있으며, 예로는 플라스미드 미니- 또는 맥시-제조 키트, 겔 추출 키트, 및 DNA 및 RNA 정제 키트가 있다. 이들을 이용하여 더 낮은 민감성이 허용될 수 있는 특정 상황에서 표적 부화 단계를 촉진시킬 수 있다.
표적 부화 이후에, 샘플의 핵산 증폭이 진행된다. 가닥-변위 활성을 지니는 DNA 중합효소 및 랜덤 서열의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 핵산의 등온 표적 증폭은 제한된 다중 용량 및 다중 PCR의 균일하지 않은 증폭과 같은 일체를 포함하지 않은 많은 제한점을 드러낸다. 증폭된 서열 또는 암플리콘은 서열 특이적 올리고뉴클레오티드에 대한 하이브리드화를 통해 동정된다. 증폭은 다중 포맷이 아닌 개별적인 표적을 이용하여 수행될 수도 있고 암플리콘은 하이브리드화 검정을 위해 조합될 수 있다.
DNA 중합효소를 이용하여 프라이머를 연장하고 가닥 변위를 활성화시킬 수 있다. 대안적으로, DNA 프로브를 이용하여 표적 RNA를 포획하는 경우, 하이브리드화된 DNA 프로브가 증폭되고 검출된다. 또 다른 구체예는 상기 기술된 대로 포획될 수 있는 DNA 표적으로서 cDNA를 생성하기 위해 표적 RNA를 역전사시키는 것을 수반한다. 상기 두 번째 단계는 표적 핵산의 등온 증폭을 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 가닥-변위 활성을 지니는 DNA 중합효소 및 랜덤 서열의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 등온 증폭에 유용할 수 있다. 일 구체예에서, 비제한적으로 상자체 비드와 같은 포획된 표적 핵산을 지니는 고체상 또는 고체 지지체를 증폭 혼합물에 직접 이용할 수 있다. DNA 표적은 랜덤 프라이머로 프라이밍된 임의의 DNA 중합효소 (phi29 DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 및 DNA 중합효소 I를 포함하나, 이로 제한되지 않음)를 이용하여 증폭될 수 있다.
랜덤 프라이머는 최적의 효율을 위해 dG, dC, dT 및 dA 단량체를 특정 비율로 지닐 수 있다. 하나 또는 두 뉴클레오티드 염기가 최적 성능을 위해 완전히 생략될 수 있었다. 랜덤 프라이머 푸울(pool)이 가능한 모든 서열을 포함할 필요는 없다. 푸울에 포함된 서열이 동일몰 농도일 필요도 없다. 살제로, 랜덤 프라이머 푸울은 특정 질병에 선택적인 프라이머 서열의 서브셋을 포함할 수 있다. 길이는 약 4 내지 약 20 뉴클레오티드로 다양할 수 있고, 바람직하게는 약 5 내지 약 8 뉴클레오티드다. 길이는 프라이머 내에서 단량체의 비율에 의존적일 수 있다. 최적의 증폭 온도는 약 25℃ 내지 약 70℃에서 변화되며, 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 40℃이고, 이것은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있는 프라이머의 길이에 의존적이다. 최적 온도는 올리고뉴클레오티드의 어닐링 온도를 예상하는 시판되는 소프트웨어를 이용하여 산정될 수 있었다. 상기 시판되는 소프트웨어 중 한 예는 OLIGO™ sVersion 6.0 또는 6.41 (Molecular Biology Insights; Cascade, CO)이다. 예를 들어, 표적 DNA를 phi29 DNA 중합효소와 함께 오량체 프라이머를 이용하여 2시간 동안 증폭시킬 수 있다.
오량체 프라이머는 예를 들어 개질에 의해 엑소누클레아제 분해로부터 보호된다. 포스포로티오에이트 결합 또는 2'-O-메틸기를 프라이머의 구조에 포함시킬 수 있다. 증폭 반응은 요구되는 민감성에 따라 1-3시간에 걸쳐 일어나는 것이 바람직하며, 이것은 phi29 DNA 중합효소 반응을 위해 공개된 프로토콜의 지속시간 보다 실제로 짧은 것이다[Gary J. Vora, et al., Applied and Environmental Microbiology, 70(5): 3047-3054, 2004, 참조로서 포함됨]. 선택된 표적 부화 단계 및 표적 검출 단계와 조합된 독특한 포뮬러의 시약은 비교적 짧은 증폭시간을 가능하게 한다.
본 발명의 표적 증폭 단계는, 균일한 효율로 제한되지 않은 수의 표적의 증폭; 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 흔히 있는 단편이 아닌, 전체 서열의 증폭을 가능하게 하고 생물학적 샘플 중 표적 서열의 일부가 제거된 경우라도 표적 검출을 허가하는 등온 증폭을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, L1 영역이 HPV에서 종종 결실되나; L1 및 E 영역에 대한 하이브리드화 프로브를 이용하여[MH Einstein and GN Goldberg, Cancer Invest. 20:1080-1085, 2002], 결실된 서열이 여전히 동일한 수준의 민감성으로 검출될 수 있으므로, 서열의 일부가 부재하는 경우라도 표적의 검출이 가능하다. 다중 등온 증폭은 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 1 내지 3시간의 반응시간으로 수행될 수 있다. 등온 증폭의 비제한적인 예로는 롤링 써클 증폭[Lizardi P., Huang X., Zhu Z., Bray-Ward P., Thomas D., Ward D. "Mutation detection and single molecule counting using isothermal rolling circle amplification" Nat. Genet. 1998, 19:225-232]; 다중 변위 증폭[Little M., et al. "Strand displacement amplification and homogenous real-time detection incorporated in a second generation probe system" Clin. Chem. 1999, 45:777-784]; 및 단백질-프라이밍된 DNA 증폭[Blanco M., Lazaro J., de Vega M., Bonnin A., Salas M "Terminal protein-primed DNA amplification" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91:12198-12202]이 있다. 다른 표적 증폭 구체예로는 표적이 이것을 증폭 혼합물에 첨가하기 전에 고체 지지체로부터 방출되는 것들이 있다. 표적 핵산을 방출시키는 비제한적인 수단으로는 알칼리 처리, 고온 인큐베이션, 및 RNase H 처리가 있다. 선택된 표적 부화 단계 및 표적 검출 단계와 조합된 독특한 포뮬러의 시약은 비교적 짧은 증폭시간을 가능하게 한다. 등온 증폭에 대한 시약은 표적 DNA 상의 프라이밍 부위의 수를 증가시킬, RNase H를 임의로 포함하는 표적 증폭과 동시에 동작할 수 있다. 이러한 방법은 변성 및 고체 지지체의 방출을 허용하여 보다 효과적인 표적 증폭을 가능하게 한다.
다음 단계는 증폭된 핵산 내에서 개별적인 표적 핵산 서열의 검출을 수반한다. 이 단계의 민감성 및 특이성은 일반적으로 증폭 효율에 의존적이다. 표적 핵산의 검출 및 규정은, 증폭된 표적 생성물의 상이한 부분 또는 암플리콘을 고체 지지체에 컨쥬게이션된 개별적인 포획 서열 프로브 및 표적 복합체를 형성하는 표적 서열에 상보적인 특정 프로브에 하이브리드화시킴에 의해 수행된다. 표적 핵산 서열의 상이한 부분과 두 프로브의 하이브리드화는 2 수준의 특이성을 제공하고, 이것은 샘플 중 특정 표적의 검출 및 동정을 보장한다.
고체 지지체, 바람직하게는 선택가능한 비드에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드 또는 포획 서열 프로브는 한 수준의 특이성을 얻는데 유용하다. 증폭된 표적 핵산에 CSP를 하이브리드화시킨 후 비드의 후속적인 선택으로 결합되지 않거나 부분적으로 결합된 실체로부터 표적 복합체를 분리할 수 있다. CSP는 결합을 확보하기 위해 과량으로 첨가되는 것이 일반적이다. 바람직하게는 CSP 및 SSP가 중복 서열을 지니지 않으나; CSP 및 SSP가 표적 핵산 서열에 상보적인 중복 서열을 지니는 일 구체예에서 이 방법을 수행할 수 있다.
포획 서열 프로브 (CSP) 또는 올리고뉴클레오티드를 고체상, 고체 지지체, 또는 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트M 또는 플레이트, 슬라이드, 디시, 비드, 입자, 컵, 가닥, 칩, 스트립, 마이크로플레이트 및 마이크로어레이 형상의 임의의 고체 플라스틱 재료를 포함하는 고체 매트릭스에 컨쥬게이션하거나 부착시킬 수 있다. 고체상은 유리 비드, 유리 시험 튜브 및 임의의 다른 적합한 유리 제품을 포함하기도 한다. 표면이 카르복실, 아미노, 히드라지드, 알데히드기, 핵산 또는 뉴클레오티드 유도체를 함유하도록 개질된 플라스틱 또는 유리와 같은 작용기화된 고체상을 이용할 수도 있다. 플라스틱, 금속, 마그네틱 또는 유리 마이크로입자, 비드, 스트립, 시험 튜브, 슬라이드, 가닥, 칩, 마이크로칩 또는 미세역가 플레이트와 같은 임의의 고체상을 이용할 수 있다.
포획 서열 프로브 또는 올리고뉴클레오티드는 8개 이상의 염기, 바람직하게는 15개 내지 100개의 염기, 및 보다 바람직하게는 20개 내지 40개의 염기를 포함하는 핵산 프로브이다. 포획 서열 프로브는 서브-웰 플레이트와 같은 고체 지지체 상에서 이들의 공지된 위치에 의해 동정될 수 있거나, 예를 들어 비드에 컨쥬게이션된 경우, 식별가능한 착색된 염료에 의해 동정될 수 있는 것이 바람직하다. 포획 서열 프로브를 동정하기 위한 수단은 당 분야에 공지되어 있고, 본 명세서에 예시되어 있다.
고체 지지체에 부착될 수 있는 서열 특이적 프로브와의 하이브리드화는 특정 표적의 동정을 가능하게 할 뿐만 아니라 검정에 대한 두 번째 수준의 특이성을 제공하여, 이것을 더욱 신뢰할 수 있는 임상적 검정으로 만든다. 낮은 민감성이 요구되는 경우, 시그널 증폭은 필요치 않으며 리포터 (비오틴, 플루오로포어, 효소 등)에 부착된 (시그널) 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용한 검출을 이용할 수 있다. 하나의 표적에 대하여 하나를 초과하는 검출 올리고뉴클레오티드가 존재할 수 있다. 포획 및 검출 올리고뉴클레오티드 둘 모두는 PNA, LNA 등과 같이 추가로 개질될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 프로브의 길이는 약 15개 염기 내지 약 10000개 염기의 범위일 수 있거나, 표적 길이의 100% 이하일 수 있다.
시그널 서열 프로브 (SSP)는 검출 단계 동안, 예를 들어 표지된 하이브리드-특이적 결합제에 의해 인식되는 DNA:RNA 하이브리드를 형성하기 위해 이용되는 비표지된 RNA일 수 있다. SSP가 비표지되기 때문에, 이것은 표적에 결합되지 않을 때 배경 잡음을 생성하지 않으므로 더 큰 특이성을 초래한다. 예를 들어, RNA 시그널 프로브의 크기가 8 킬로염기 (kb)이고 각 항체가 20 염기에 결합되는 경우, 대략 400배로 증폭된 시그널이 달성될 수 있다. 이전에 기술한 대로, 일반적으로, 시그널 서열 프로브는 적어도 15 염기를 포함하나, 약 1000 염기 이하이거나 이를 초과할 수 있고, 바람직하게는 약 15 내지 100 염기이다. 시그널 서열 프로브의 다른 비제한적인 예로는 표지된 RNA 프로브 및 표지된 DNA 프로브가 있다. 하이브리드화는 비-중복 영역에 제한되지 않으나, 실제로 중복 영역을 포함할 수 있다. 고체 지지체에 결합된 RNA:DNA 하이브리드 복합체의 검출은, 예를 들어 PE-표지된 항체, 카르복실화된 식별가능한 비드를 이용한 다중 방식으로 수행될 수 있고, 흐름-세포계수기에 의해 검출될 수 있다.
표적 (또는 암플리콘) 검출의 일 구체예는 액체-기재 어레이를 이용한다. 비드 어레이는 시판되며, 이 구체예에서, 카르복실화된 폴리스티렌 비드 어레이가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트의 각 웰은 비드 셋의 혼합물을 지닌다. 13-중은 13 비드 셋을 지니며, 각 비드 셋은 특이적 "서명"을 지니고 서명은 각 비드 내부에 있는 염료에 의해 제공된다. 이들 염료의 비율은 각 비드 셋에 대해 특이적이며, 각 비드 셋간의 차별을 가능하게 한다. 하나의 표적 핵산에 특이적인 포획 서열 프로브 (CSP) 또는 올리고뉴클레오티드를 하나의 특정 비드 셋에 적용하거나 컨쥬게이션한다. 표적이 비드 컨쥬게이션된 CSP 또는 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화될 때, 특정 비드 셋의 선택에 이어 검출이 상보적인 핵산 프로브 및 표지된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제를 이용하여 일어난다. 선택 또는 분리는 흐름-세포계수기에서 수행될 수 있고, 여기에서 비드가 두 레이저를 통해 하나씩 지나가는데; 이들 중 하나는 비드 상의 서명을 선택하는 한편, 다른 하나는 표지된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제에 의해 동정되는 표적을 검출한다. 이러한 방식으로, 다수의 표적이 구별되고 검출될 수 있다. 추가로, 표지된 DNA:RNA 시약은 개선된 시그널 검출을 가능하게 하므로 검정의 특이성 및 민감성 둘 모두를 증가시킨다.
본 발명의 액체-기재 비드 어레이에 대한 추가의 구체예는 서브-웰 플레이트를 이용한다. 서브-웰 플레이트는, 예를 들어 96 최초 웰을 지니는 미세역가 플레이트이며, 여기서 각 개별적인 최초 웰은 다수의 서브-웰로 세분된다. 다중을 위한 플랫폼으로서 서브-웰 플레이트는 문헌[A. Roda, et al. Clin. Chem. 46:1654-1660, 2002, 참조로서 포함됨]에 이미 개시되었다. 그러나, 이전에 사용되고 개시된 서브웰 플랫폼은 상이한 서브-웰간의 "혼선(cross-talk)" 문제로 인해 제한된 용도를 지닌다. 반면, 본원에 개시된 개질된 서브-웰 플랫폼은 마스크의 용도에 의한 상이한 서브웰간의 혼선의 문제를 본질적으로 제거한다. 각 서브-웰은 웰에 부착된 공지된 표적-특이적 포획 서열 프로브를 지니는 것이 바람직하다. 표적 핵산은 최초 웰에 첨가될 수 있고, 여기서 표적 핵산이 이의 상보적인 핵산 프로브, 즉 시그널 서열 프로브에 하이브리드화된다. DNA:RNA 하이브리드가 표적 핵산의 일부 및 시그널 서열 프로브 사이에 형성된다. 포획 서열 프로브는 표적 핵산의 상이한 부분에 결합함으로써, DNA:RNA 하이브리드를 고체상에 포획시킨다. 표적 핵산의 검출은 이전에 기술된 대로 표적 핵산에 하이브리드화된 상보적인 핵산 프로브, 및 예를 들어 표지된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체를 이용하여 공지된 포획 서열 프로브에 의해 발생한다. 시그널 증폭 및 서브-웰간의 혼선을 제거하기 위해 리드(lid)로서 기능하는 마스크의 사용 둘 모두는 배경 잡음을 최소화하면서 표적 핵산의 특이적이고 민감한 검출을 가능하게 한다.
표적 서열을 검출하고 동정하기 위해 사용될 수 있는 광범한 방법을 이용할 수 있으며, 비제한적으로 도트 블롯 하이브리드화, 나일론 막상에서의 역 블롯 하이브리드화, 슬라이드 어레이의 하이브리드화, 칩 어레이, 비드 어레이, 다중-웰 플레이트의 바닥상의 어레이 등을 포함한다. 하이브리드화를 위한 고체 지지체의 비제한적인 예로는 비드 어레이 (예를 들어, 시판원으로부터의 비드 어레이 제품), 슬라이드 어레이, 플레이트 어레이 (예컨대, 미세역가 플레이트의 각 웰의 바닥상의 어레이), 서브-웰 플레이트 (각 웰 내에 16-64개의 소형 서브-웰을 지니는 미세역가 플레이트), 및 GenOHM 시스템과 같은 전극의 어레이가 있다. [Drummond, et al., Nature Biotech, 21: 1192-1199 (2003)]. 상이한 유형의 리포터가 실행될 수 있는데, 예를 들어 형광, 화학발광, 및 금 나노입자를 통한 검출을 위해 시그널을 생성한다. 이전에 논의된 대로, 검출기 수단은 형광, 임의의 효소-기재 시그널, 화학발광 또는 비색 시그널, 금 입자를 이용한 빛 산란 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 리포터는 하이브리드-특이적 결합제, 예컨대 이로 제한되지는 않지만 RNA:DNA 하이브리드에 특이적인 항체 (HC-Ab), 단백질, 촉매적으로 비활성인 RNase H, 핵산, 핵산 아프타머, 또는 결합하여 삼중 구조를 형성하는 능력을 지닌 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 각 표지된 결합제는, 예를 들어 길이가 적어도 20개 뉴클레오티드인 DNA:RNA 하이브리드의 뉴클레오티드 세그먼트에 결합하여 시그널 증폭을 제공한다.
정제되지 않은 샘플에서 다수의 표적 DNA를 다중 검출하기 위한 본 발명의 추가의 구체예는 하기 단계를 포함한다: 1) 표적 DNA를 변성시켜 단일 가닥 표적 서열을 생성하는 단계; 2) RNA 프로브 및 자기 비드를 첨가하는 단계로서, 이 때 비드는 하이브리드에 특이적인 항체에 미리 컨쥬게이션되어 있는 단계; 3)세척에 의해 임의의 결합되지 않은 표적 및 오염물을 제거하는 단계; 4) 비교적 단기간 동안, 예컨대 1-3시간 동안 DNA 중합효소 및 증폭 및 암플리콘의 형성을 개시하는 다른 시약의 존재하에 포획된 표적의 등온 증폭을 수행하는 단계; 5) 암플리콘을 변성시켜 단일 가닥 서열을 생성하는 단계; 6) 증폭된 표적을 비드 또는 미세역가 플레이트와 같은 고체 지지체 (포획 프로브)에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드, 및 시그널 서열 프로브에 하이브리드화시키는 단계; 및 7) 포획 프로브 특징에 기초하여 표적을 구별하고 시그널 서열 프로브 복합체를 검출함에 의해 각 표적 DNA의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
본 발명의 일 구체예에서, 표적 및 프로브의 하이브리드화는 하이브리드-결합제에 의한 포획 단계와 동시에 동일한 혼합물 및 상승된 온도에서 발생할 수 있다. 전체 공정 동안의 상승된 온도는 표적 포획의 특이성을 증가시키는 동시에 반응시간을 감소시킬 수 있다. 당업자에게 널리 공지되고 실시되는 다양한 성분, 완충액 및 온도를 이용하여 낮은, 중간의 및 매우 엄격한 하이브리드화/세척 조건을 변화시킬 수 있음이 이해되어야 한다. 추가의 엄격한 조건에 관해서는 문헌[T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1982)]을 참조한다. 한 단계의 하이브리드화 및 포획이, 전제적인 검정 조건에 따라서, 하이브리드화 및 포획을 순차로 수행하는 것보다 효과적일 수도 있다.
표적 부화; 표적 증폭; 및 표적 검출에 의해, 다른 핵산의 존재하에 관심있는 표적 핵산을 검출하는 방법은 동일한 반응 샘플에서 다중 표적을 동시에 검출하는 신속하고 민감한 방법을 제공한다. 이 방법은 여러 질병 상태, 예를 들어 환자가 인간 파필로마바이러스(HPV)에 감염되었는지 아닌지를 확인하고 환자가 어떠한 특정 HPV 유형 또는 유형들을 지녔는지를 결정하는 임상적 진단 적용에서 유용하며, 이로써 환자를 더 잘 진단하고 치료할 수 있다. 특정 핵산과 관련된 다른 질병이 당 분야에 널리 공지되어 있고 본 발명에 개시된 검출 방법을 이용하여 확인할 수 있을 것이다.
정제되거나 비정제된 형태의 핵산의 임의의 공급원을 시험 샘플로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 시험 샘플은 식품 또는 농산물, 또는 인간 또는 수의학의 임상적 견본일 수 있다. 통상적으로, 시험 샘플은 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 가래 등과 같은 생물학적 유체이다. 대안적으로, 시험 샘플은 관심있는 핵산을 지니는 것으로 의심되는 조직 견본일 수 있다. 시험 샘플 중의 표적 핵산은 별개의 분자로서 초기에 제공될 수 있어서, 검출되는 서열은 전체 핵산을 구성하거나, 단지 더 큰 분자의 구성 요소일 수 있다. 검출하려는 핵산 서열이 초기에 순수한 형태로 제공될 필요는 없다. 시험 샘플은 핵산의 복수 혼합물을 함유할 수 있으며, 이의 표적 핵산은 전체 인간 게놈 DNA 또는 RNA에 함유된 관심있는 유전자 또는 병원성 유기체의 핵산 서열의 일부에 상응할 수 있으며, 유기체는 임상 샘플의 부 성분이다.
시험 샘플 중의 표적 핵산은 세균, 효모, 바이러스, 및 식물 또는 동물과 같은 고등 유기체의 세포 또는 조직을 포함하는 임의의 공급원으로부터의 DNA 또는 RNA, 예컨대 메신저 RNA일 수 있다. 표적은 역 전사에 의해 RNA로부터 합성된 cDNA일 수도 있었다. 상기 핵산의 추출 및/또는 정제 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 표적 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 본 방법의 일 구체예에서, 표적 핵산은 단일 가닥이거나 상기 방법의 하이브리드화 및 증폭 단계 이전에 통상적인 변성 기술에 의해 제조된 이중 가닥이다. 일 구체예에서, 염기 변성 기술 또는 고온을 이용하여 이중 가닥 표적 DNA를 변성시킨다.
본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 둘 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 이루어진 핵산 분자를 언급한다. 요망되는 올리고뉴클레오티드는 천연 발생 핵산으로부터의 정제, 분자 생물학 방법 또는 새로운 합성과 같은 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 핵산 프로브의 비제한적인 예가 본원에 개시되어 있다.
핵산 프로브는 시험 샘플에서 상보적인 RNA 또는 DNA 서열에 하이브리드화되는 핵산 서열이다. 프로브의 검출은 시험 샘플 중 특정 핵산 서열의 존재를 나타낸다. 핵산 프로브는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 일 구체예에서, 표적-특이적 하이브리드 포획 방법은 포획 서열 프로브 (CSP) 및 시그널 서열 프로브 (SSP)의 두 유형의 핵산 서열 프로브를 이용한다.
포획 서열 프로브 또는 올리고뉴클레오티드는, 표적 핵산의 독특한 영역(들)에 하이브리드화될 수 있고 고체상 위로 포획될 수 있거나 표적 핵산 서열의 포획을 가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다. 검출 방법에 이용된 CSP는 DNA, RNA, 펩티드 핵산 (PNA) 또는 다른 핵산 유사체일 수 있다. PNA는 당-포스페이트 백본이 폴리아미드 또는 "슈도펩티드" 백본으로 교체된 올리고뉴클레오티드다. 바람직한 구체예에서, CSP는 DNA이다. CSP는 적어도 8개 염기의 최소 길이를 지니며, 바람직하게는 15 내지 100개 염기, 및 보다 바람직하게는 20 내지 40개 염기이다. CSP는 CSP가 하이브리드화되는 표적 핵산 서열에 실질적으로 상보적이다. CSP의 서열은 표적 하이브리드화 영역에 75% 이상 상보적인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 이 서열에 100% 상보적이다. CSP는 시험 샘플에 존재하는 것으로 여겨지는 바람직하지 않은 비-표적 서열에 대해 75% 미만 또는 이와 동일한 서열 동일성을 함유하고, 보다 바람직하게는 50% 미만의 서열 동일성을 함유하는 것이 바람직하다. CSP가 결합되는 표적 핵산 내의 서열은 바람직하게 적어도 약 12개 염기이고, 보다 바람직하게는 20-40개 염기이다. CSP가 하이브리드화되는 표적 핵산 서열은 유일한 서열이거나 그룹-특이적 서열인 것이 바람직하다. 그룹-특이적 서열은 별개의 그룹을 형성하는 다중 관련 서열이다. 예를 들어, CSP는 이로 제한되지 않으나 HPV-16, HPV-18 및 HPV-31과 같은 특이적 인간 파필로마바이러스 유형을 인식하는 서열을 함유할 수 있다.
일 구체예에서, 검출 방법에 사용된 CSP는 핵산 서열에 하나 이상의 개질을 함유할 수 있어서 고체상으로의 프로브의 특이적 포획을 가능하게 한다. 예를 들어, CSP는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 이를 하나 이상의 리간드로 태깅(tagging)함에 개질될 수 있으며, 그 방법으로는 예를 들어 닉-번역(nick-translation), 화학적 또는 광화학적 혼입이 있다. 또한, CSP는 하나 또는 다수 유형의 표지로 다수의 위치에서 태깅될 수 있다. 예를 들어, CSP는 스트렙타비딘에 결합되는 비오틴; 또는 항-디곡시제닌에 결합되는 디곡시제닌; 또는 항-디니트로페놀 (DNP)에 결합되는 2,4-DNP로 태깅될 수 있다. 프로브를 개질시키기 위해 플루오로겐도 사용될 수 있다. 플루오로겐의 예로는 플루오레세인 및 유도체, 피코에리트린, 알로-피코시아닌, 피코시아닌, 로다민, 텍사스 레드 또는 다른 전매 플루오로겐이 있다. 플루오로겐은 일반적으로 화학적 개질에 의해 부착되며 항-플루오레세인과 같은 플루오로겐-특이적 항체에 결합된다. 당업자라면 CSP가 특이적 항체에 의해 인식될 수 있는 임의의 화학기를 함유하는 개질된 염기의 혼입에 의해 태깅될 수도 있음을 이해할 것이다. 기질로 코팅된 고체상으로의 포획을 위한 기타 태그 및 뉴클레오티드 서열을 태깅시키는 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 핵산 표지에 대한 검토는 란데그렌(Landegren) 등에 의한 논문["DNA Diagnostics-Molecular Techniques and Automation", Science, 242:229-237 (1998), 본원에 참조로서 포함됨]에서 찾아볼 수 있다. 추가의 구체예에서, CSP는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단 둘 모두에서 비오틴으로 태깅된다. 또 다른 구체예에서, CSP는 개질되지 않으나, 매트릭스에 하이브리드화될 수 있는 CSP에 함유된 서열에 의해 고체 매트릭스상에 포획된다.
검출 방법에 사용된 SSP는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 시그널 서열 프로브는 CSP에 의해 인식되는 독특한 영역에 인접한 표적 핵산 영역에 하이브리드화될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 일 구체예에서, SSP 및 표적 핵산은 DNA:RNA 하이브리드를 형성한다. 따라서, 이 구체예에서, 표적 핵산이 DNA이면, 바람직한 SSP는 RNA이다. 유사하게, 표적 핵산이 RNA이면, 바람직한 SSP는 DNA이다. SSP의 길이는 일반적으로 적어도 15개 염기이다. 그러나, SSP의 길이는 1000개 염기 이하이거나 이를 초과할 수 있다. 더 긴 SSP가 바람직하다. SSP는 단일 핵산 단편, 또는 다수의 더 작은 핵산 단편을 포함할 수 있는데, 이들 각각의 길이는 15 내지 100개 염기인 것이 바람직하다.
CSP 및 SSP의 서열은, 이들이 표적 핵산의 동일한 영역 또는 서로에게 하이브리드화되지 않도록 선택된다. 표적 핵산 서열의 영역들에 상응하는 SSP 서열 및 CSP 서열이, CSP 및 SSP간의 경쟁을 제거하기 위해 개질될 수 있다. 예를 들어, SSP는 CSP가 포함하지 않는 결실을 지닐 수 있다. 또한, CSP 및 SSP는, 예를 들어 서로 50,000개 염기 내에서 표적 영역에 하이브리드화 되도록 선택된다. 표적 핵산 내에서 CSP가 하이브리드화되는 서열 및 SSP가 하이브리드화되는 서열간의 거리는 약 1 내지 50,000개 염기인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 표적 핵산 위의 CSP 및 SSP간의 거리가 3,000개 염기 미만이고, 가장 바람직하게는 이 거리가 1,000개 염기 미만이다.
또 다른 구체예에서, 검출 방법에 이용된 SSP의 부분이 단일 가닥 표적 핵산 서열과 DNA:RNA 하이브리드를 형성하며, 이것은 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제에 의해 검출되고, SSP의 또 다른 부분이 표적 핵산에 하이브리드화될 수 있다. SSP는, 표적 핵산 내에서 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 서열을 단일 가닥 DNA 벡터로 먼저 클로닝시킨 다음, DNA 벡터 서열에 상보적인 RNA를 하이브리드화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 생성하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, M13을 DNA 벡터로서 이용하는 경우, M13 RNA를 벡터에서 M13 DNA 서열에 하이브리드화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 생성한다. 생성된 SSP는 DNA:RNA 하이브리드 부분 뿐만 아니라 표적 핵산 내에서 서열에 하이브리드화될 수 있는 단일 가닥 부분을 형성한다. 단일 가닥 DNA는 적어도 10개 염기의 길이여야 하고, 1000개 염기 이하이거나 이를 초과할 수 있다. 대안적으로 SSP의 DNA:RNA 하이브리드 부분을 반응 동안 또는 반응 이후에 형성시킬 수 있고, 이 때 SSP의 단일 가닥 부분이 표적 핵산에 하이브리드화된다. SSP는 선형, 원형, 또는 둘 이상의 형태의 조합일 수 있다. SSP의 DNA:RNA 하이브리드 부분은, 예를 들어 본원에 기술된 대로 표지되거나 표지된 실체에 의해 인식되는 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체를 이용하여 포획된 하이브리드의 검출을 위한 증폭된 시그널을 제공한다.
추가로 또 다른 구체예에서, 검출 방법에 이용된 SSP는 표적 핵산에 하이브리드화될 수 있는 서열을 함유하지 않는 분자이다. 이 구체예에서, 표적 핵산에 하이브리드화될 수 있는 서열뿐 아니라 SSP에 하이브리드화될 수 있는 서열을 포함하는 브릿지(bridge) 프로브를 사용한다. 브릿지 프로브는 DNA, RNA, 펩티드 핵산 (PNA) 또는 다른 핵산 유사체일 수 있다.
추가의 구체예에서, SSP의 일부 및 상보적인 핵산 프로브는 DNA:RNA 하이브리드를 형성하고 SSP의 단일 가닥 부분은 브릿지 프로브 내의 서열에 상보적인 서열을 함유한다. 표적 핵산 및 SSP 둘 모두에 하이브리드화될 수 있는 브릿지 프로브는 SSP를 표적 핵산에 연결시키는 중간체로서 기능한다. DNA:RNA 하이브리드는 표지될 수 있거나 표지된 실체에 의해 검출되는 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제에 의해 검출된다. CSP는 표적 핵산 서열의 상이한 부분에 하이브리드화됨으로써 표적, 브릿지 프로브, 및 DNA:RNA 하이브리드 복합체를 고체상 또는 지지체로 포획한다. SSP는 상기 기술된 대로 제조될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 하나의 표적 핵산 검출 방법에 사용된 SSP는 브릿지 프로브에 하이브리드화될 수 있는 단일 가닥 RNA 서열에 상보적인 반복 서열의 다중 셋을 포함한다. 반복 서열에 상보적인 서열들을 함유하는 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 SSP에 하이브리드화하는데 이용하여 시그널 증폭을 위해 요구되는 이중 DNA:RNA를 생성한다.
여전히 또 다른 구체예에서, 브릿지 프로브는 표적 핵산에 하이브리드화될 수 있는 서열에 추가하여 폴리(A) 테일을 함유한다. 이 실시예에 사용된 SSP는 폴리(dT) DNA 서열을 포함한다. 따라서 브릿지 프로브는 이의 폴리(A) 테일을 통해 SSP에 하이브리드화될 수 있다. 폴리(A) 서열을 포함하는 RNA 프로브는 SSP 내의 남아 있는 폴리(dT) DNA 서열에 하이브리드화되어 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는데 사용될 수 있다. 폴리(dT) 서열을 포함하는 SSP 및 폴리(A) 서열을 포함하는 RNA 프로브의 길이는 100 내지 5,000개 염기인 것이 바람직하다.
본 발명의 표적 핵산 서열을 검출하는 방법에 이용된 SSP는 상기 기술되고/거나 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 CSP와 같이 개질되거나 개질되지 않을 수 있다. 바람직한 구체예에서, SSP는 공유적으로 개질되지 않은 프로브이다.
본 발명의 검출 방법에 다수의 CSP 및/또는 SSP가 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
또 다른 구체예에서, 표적 핵산의 둘 이상의 별개 영역의 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 함께 융합시켜 본 발명의 방법에서 포획 서열 프로브로서 이용한다. 대안적으로, 단일 또는 다수의 표적 핵산에 상보적인 서열들을 함유하는 단일 프로브가 설계되고 제조될 수 있다. 이러한 유형의 프로브는 본원에서 "융합된" 프로브로서 언급되기도 한다. 융합된 포획 서열 프로브는 동일한 농도로 사용된 두 융합되지 않은 CSP의 조합만큼 효과적으로 기능한다.
본 발명의 핵산 프로브는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이로는 예를 들어 화학적 합성, 천연 발생 공급원으로부터의 단리, 재조합 생성 및 비대칭 PCR (McCabe, 1990 In: PCR Protocols: A guide to methods and applications. San Diego, CA., Academic Press, 76-83)이 있다. 프로브를 하나 이상의 세그먼트로 화학적으로 합성한 후, 세그먼트를 결합시키는 것이 바람직할 수 있으며, 이것은 마이크로칩 상에서 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 제조하는 경우일 수 있다. 여러 화학적 합성 방법이 문헌[Narang et al. (1979 Meth. Enzymol. 68-90), Brown et al. (1979 Meth. Enzymol. 68:109) and Caruthers et al. (1985 Meth. Enzymol. 154:287), 이들 모두가 본원에 참조로서 포함됨]에 개시되어 있다. 대안적으로, 클로닝 방법이 프로모터 프라이머로서의 사용을 위해 단리될 수 있는 편리한 핵산 단편을 제공할 수 있다. 이중 가닥 프로브를, 예를 들어 표적 핵산에 하이브리드화시키기 전에 통상적인 변성 방법을 이용하여 먼저 단일 가닥으로 만든다.
하이브리드화는 당업자에게 널리 공지된 표준 하이브리드화 조건하에 수행된다. 프로브를 핵산 서열에 하이브리드화시키는 반응 조건은 프로브 길이, 서열 중 G 및 C 뉴클레오티드의 수, 및 하이브리드화 반응에 이용된 완충 조성물과 같은 인자에 따라서, 프로브마다 변화된다. 알맞게 엄격한 하이브리드화 조건이란 완전한 염기쌍 이중 가닥 DNA의 용융 온도 미만 대략 25℃의 조건으로서 당업자에게 일반적으로 이해되어 있다. 보다 높은 특이성은, 더 높은 온도, 다시 말해 보다 엄격한 조건을 지니는 인큐베이션 조건을 적용함에 의해 일반적으로 달성된다. 샘브륵(Sambrrok) 등의 널리 공지된 실험실 매뉴얼[MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1990) (본원에 참조로서 포함됨)] 11장에는, 관련 인자의 설명 및 특이성이 있는 하이브리드화를 보장하는데 필요한 엄격함의 정도를 포함하여, 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 하이브리드화 조건이 매우 상세하게 기재되어 있다. 하이브리드화는 완충된 수용액에서 수행되는 것이 통상적이며, 이를 위해 온도, 염 농도, 및 pH와 같은 조건들은, 충분한 엄격함을 제공하여 프로브가 임의의 다른 서열이 아닌 이들 개개의 표적 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화되도록 선택된다.
일반적으로, 프로브 및 표적간의 하이브리드화의 효율은 첨가된 프로브의 양이 주형에 대해 몰 과량일 때, 바람직하게는 2 내지 106 몰 과량이고, 보다 바람직하게는 103 내지 106 몰 과량인 조건하에 개선된다. 유효한 포획을 위해 제공된 각 CSP의 농도는 최종 하이브리드화 용액 중 적어도 25 fmoles/ml (25 pM)이고, 바람직하게는 25 내지 104 fmoles/ml (10 nM)이다. 각 SSP의 농도는 최종 하이브리드화 용액에서 적어도 15 ng/ml이고, 바람직하게는 150 ng/ml이다. 표 A는 몰에 기초하여 ng/ml로 표시되는 SSP 농도의 환산을 나타낸다.
표 A
Figure 112008038823062-pct00001
검출 단계에서 표적 핵산에 대한 CSP 및 SSP의 하이브리드화는 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 표적 핵산에 대한 CSP의 하이브리드화 및 SSP의 하이브리드화는 동시에 수행된다. 일 구체예에서, 형성된 DNA:RNA 하이브리드를 이후 고체상으로 포획시킬 수 있다. 고체상이 기질로 코팅될 수 있으며, CSP에 부착된 리간드가 특이성을 지니며 이에 결합된다. 표적 핵산 서열의 일부 및 SSP가 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는 한편, 표적 핵산 서열의 또 다른 일부가 고체상에 부착된 CSP에 하이브리드화된다. 또 다른 구체예에서, 표적 핵산에 대한 SSP의 하이브리드화는 표적 핵산에 대한 CSP의 하이브리드화 이후에 수행된다. 이 경우에, CSP는 하이브리드화 이전 또는 이후에 고체상에 고정될 수 있다. CSP 및 표적 핵산 서열 둘 모두는 SSP 하이브리드화 반응 동안 고체상에 결합될 수 있다.
고체상, 고체 지지체 또는 고체 매트릭스가 상호교환적으로 이용될 수 있고, 예를 들어 유리, 실리콘, 금속, 니트로셀룰로오스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 또는 플레이트, 슬라이드, 디시, 비드, 마이크로비드, 입자, 마이크로입자, 컵, 시험 튜브, 슬라이드, 가닥, 칩, 마이크로칩, 스트립, 막, 마이크로플레이트, 서브웰을 지니는 미세역가 플레이트 및 마이크로어레이 형상의 임의의 고체 플라스틱 재료를 포함함이 당업자에 의해 이해될 것이다. 고체상은 유리 비드, 유리 시험 튜브 및 임의의 다른 적합한 유리 제품도 포함한다. 표면이 카르복실, 아미노, 히드라지드, 알데히드기, 핵산 또는 뉴클레오티드 유사체를 함유하도록 개질된 플라스틱 또는 유리와 같은 작용기화된 고체상도 이용할 수 있다.
일 구체예에서, CSP는 비오틴으로 표지되며, 스트렙타비딘-코팅되거나 아비딘-코팅된 고체상을 이용하여 하이브리드를 포획한다. 또 다른 구체예에서, 스트렙타비딘-코팅된 미세역가 플레이트 또는 마이크로플레이트를 사용한다. 이러한 플레이는 피동적으로 또는 공유적으로 코팅될 수 있다. 추가의 구체예는 각 개개 웰이 수 개의 서브-웰을 지니고, CSP가 각 서브-웰에 개별적으로 부착되는 미세역가 플레이트를 이용한다. 또 다른 구체예는 임의의 공지되고 일반적으로 사용되는 결합 방법에 의해, 예컨대 스페이서 및 링커를 이용하여 비드에 결합된 CSP를 사용한다. CSP가 고체 지지체에 컨쥬게이션될 때, CSP는 이에 상보적인 표적 핵산을 포획하고/거나 선별하는데 이용될 수 있다.
포획된 DNA:RNA 하이브리드는 당 분야에 널리 공지된 통상적인 수단에 의해 검출될 수 있다. DNA:RNA 하이브리드는 표지되거나 식별가능한 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제, 예컨대 DNA:RNA 하이브리드에 특이적인 표지된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 이의 단편, SSP에 부착된 하나 이상의 리간드에 특이적인 항체, 표지된 항체, 또는 SSP 자체의 검출가능한 개질을 이용하여 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다.
한 바람직한 방법은 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체를 이용하여 포획된 하이브리드를 검출한다. 이 구체예에서, DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체는 효소, 형광 분자 또는 비오틴-아비딘 컨쥬게이트로 표지되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 비-방사성이다. 표지는 비색계, 광도계, 또는 형광 검출기와 같은 당 분야에 공지된 통상의 수단에 의해 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 한 바람직한 표지는, 예를 들어 알칼리 포스파타아제이다. 당업자에게 공지된 다른 표지도 결합된 이중 가닥 하이브리드를 검출하는 수단으로서 이용될 수 있다. 검출은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어 문헌[Coutlee, et al., J. Clin. Mircrobiol. 27:1002-1007 (1989), 참조로서 포함됨]에 개시된 비색법 또는 화학발광에 의해 수행된다. 바람직하게는, 결합된 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이트가 알칼리 포스파타아제에 의해 활성화될 수 있는 기질을 첨가함에 의해 화학발광에 의해 검출된다. 알칼리 포스파타아제에 의해 활성화되는 화학발광 기질은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
포획된 DNA:RNA 하이브리드의 검출은 바람직하게 컨쥬게이션된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제, 예컨대 비제한적으로 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체를 인큐베이션 단계 동안 DNA:RNA 하이브리드에 결합시킴에 의해 달성된다. 일 구체예에서, DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체는 고체상, 예를 들어 상자체 비드에 컨쥬게이션된다. DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체에 컨쥬게이션된 상자체 비드를 자기력하에 두어 DNA:RNA 하이브리드를 포획함으로써, 이후 표면을 세척하여 임의의 과량의 항체 및 다른 하이브리드화되지 않은 재료를 제거한다. 이 단계로 표적 핵산 서열을 부화시키거나 정제한다. 이러한 표적 부화 기술이 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 반복 피펫터(pipettors) 또는 주사기, 배리오스태트(variostat)에 의해 조절되는 단순 펌프를 이용하거나, 부착된 튜브를 지니는 저장기로부터의 중력 흐름에 의해 수동 세척을 수행할 수 있다. 사용가능한 시판되는 튜브 세척 시스템도 이용할 수 있다.
본 발명에 유용한 포획 서열 프로브의 비제한적인 예로는 HSV-1에 대한 서열; HSV-2에 대한 서열을 지니는 것들이 있다. HPV에 대한 CSP로는 SEQ ID NO: 1-64를 지니는 것들이 있다. 이들 서열에 포함되는 HPV 유형으로는 HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 및 HPV82가 있고, 이들 중 여러 개가 고위험 HPV이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 CSP 및 SSP에 추가하여 블로커(blocker) 프로브를 적용한다. 블로커 프로브는 CSP의 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 블로커 프로브의 서열은 CSP의 서열에 약 75% 이상 상보적인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 CSP에 100% 상보적이다. 하이브리드화 반응 혼합물에 불로커 프로브를 첨가하는 것은 하이브리드화되지 않은 CSP가 표적에 존재하는 교차-반응성 핵산 서열과 하이브리드화되는 것을 억제하므로 검출의 특이성을 증가시킨다. 블로커 프로브는 일반적으로 적어도 약 5개 염기 내지 약 12개 염기이다. 본 발명의 일 구체예에서, 하이브리드화 반응물 중 블로커 프로브의 농도는 CSP 및 SSP의 농도 보다 과량인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 블로커 프로브가 약 2배 몰 과량으로 존재하나, 이것은 10,000배 몰 과량 이하로 존재할 수 있다. 블로커 프로브는 DNA, RNA, 펩티드, 비-특이적 핵산 (PNA) 또는 다른 핵산 유사체일 수 있다.
일 구체예에서, CSP의 전장 또는 거의 전장에 상보적인 블로커 프로브를 사용한다. CSP, SSP 및 표적 핵산간의 하이브리드가 형성되는 반응 이후에, 하나 이상의 블로커 프로브를 반응물에 첨가하고 하이브리드화를 요망되는시간 동안 지속한다. 이후 하이브리드화 생성물을 상기 기술된 대로 검출한다.
또 다른 구체예에서, CSP 보다 짧은 CSP의 일부에만 상보적인 블로커 프로브를 이용한다. 이러한 블로커 프로브는 CSP 보다 낮은 용융 온도를 지닌다. 바람직하게는, 블로커 프로브의 용융 온도가 CSP의 용융 온도 보다 10도 더 낮다. 이 구체예에서, 블로커 프로브는 CSP 및 SSP와 동시에 표적 핵산에 첨가되는 것이 바람직하다. 블로커 프로브가 CSP 보다 낮은 용융 온도를 갖기 때문에, 하이브리드화의 개시 온도는 블로커 프로브가 CSP의 표적 서열에 대한 CSP의 하이브리드화를 방해하지 않도록 선택된다. 그러나, 하이브리드화 혼합물의 온도가 표적 하이브리드화에 사용된 온도 미만으로 조정될 때, 블로커 프로브는 CSP와 하이브리드화되어 CSP가 교차-반응성 핵산 서열과 하이브리드화되는 것을 효과적으로 차단한다. 예를 들어, 하이브리드화 생성물을 스트렙타비딘-코팅된 미세역가 플레이트에서 하이브리드 포획 동안 실온에서 인큐베이션시킬 때, 블로커 프로브를 첨가할 수 있다. 블로커 프로브의 비제한적인 예를 표 2에 제시한다.
하기 실시예는 본 증폭 방법 및 검출 검정의 이용 및 키트를 설명한다. 이러한 실시예는 예시를 위해 제공된 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본원에 개시된 모든 참조문헌은 명백히 전체로서 참조로 포함된다.
실시예 1
표적-특이적 하이브리드 포획 (TSHC) 검정 프로토콜
공지된 농도의 단순 헤르페스 바이러스 1 (HSV-1) 및 단순 헤르페스 바이러스 2 (HSV-2) 바이러스 입자 (메릴랜드 콜럼비아에 소재한 어드밴스드 바이오테크 놀로지스, 인코포레이티드) 또는 임상 샘플을 음성 대조 매질 (메릴랜드 게이더스버그 디진 코포레이션) 또는 음성 자궁경부 견본 (디진 코포레이션)을 이용하여 희석하였다. 다양한 희석물을 제조하고 개별 마이크로퓨즈 (microfuge) 튜브로 분취하였다. 1/2 부피의 변성 시약 5100-0431 (디진 코포레이션)을 첨가하였다. 시험 샘플에서 핵산이 변성될 수 있도록 시험 샘플을 65℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다.
변성 후에, 시그널 서열 프로브 (SSP)(600 ng/ml 각각) 및 포획 서열 프로브 (CSP)(2.5 pmol/ml 각각)를 함유하는 하이브리드화 용액을 샘플에 첨가하고, 74℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1 부피의 4x 프로브 희석제 (디진 코포레이션), 1 부피의 변성 시약 및 2 부피의 음성 대조 매질을 함유하는 용액 중의 블로커 프로브를 이후 하이브리드화 혼합물에 첨가하고, 74℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
제2의 일련의 실험에서, 핵산을 변성시킨 후에, SSP (600 ng/ml 각각), CSP (2.5 pmole/ml 각각) 및 블로커 프로브 (250 pmole/ml 각각)를 함유하는 하이브리드화 혼합물을 샘플에 첨가하고, 74℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실온에서 5분 동안 냉각시키고, 분취액을 각 튜브로부터 취하고 이것을 96-웰 스트렙타비딘 포획 플레이트의 개별 웰 (디진 코포레이션)로 옮겼다. 이 플레이트들을 실온에서 1시간 동안 1100 rpm에서 진탕시켰다. 이후, 상청액을 경사분리시키고, 플레이트를 SNM 세척용 완충액 (디진 코포레이션)으로 2회 세척하고, 간단히 뒤집어서 남아있는 세척용 완충액을 제거하였 다. 이후, 알칼리-포스파타아제 항-RNA/DNA 항체 DR-1 시약 (디진 코포레이션)을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 웰에 하기 과정을 포함하는 다수의 세척 단계를 실시하였다: 1) 실온에서 샤프 세척용 완충액 (Sharp wash buffer)을 사용한 3회의 세척; 2) 히트 블럭 (heat block) 상에서 60℃에서 10분 동안 샤프 세척용 완충액을 사용한 플레이트의 인큐베이션; 3) 실온에서 샤프 세척용 완충액을 사용한 2회의 세척; 및 4) 실온에서 SNM 세척용 완충액 (디진 코포레이션)을 사용한 1회의 세척. 잔류하는 액체를 제거한 후, 발광 기질 5100-0350 (디진 코포레이션)을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 개별의 웰을 플레이트 광도계 상에서 판독하여 상대적인 광 유닛 (RLU) 시그널을 얻었다.
음성 대조 매질 또는 공지된 HSV 음성 자궁경부 견본을 함유하는 용액을 시험 샘플에 대한 음성 대조로서 사용하였다. 신호 대 잡음 비 (S/N)를, 시험 샘플로부터 얻은 평균 RLU 대 음성 대조의 평균 RLU의 비로 계산하였다. 이 신호 대 잡음 비를 포획 효율을 결정하고 표적 핵산의 검출을 위한 기초값으로 사용하였다. 2 또는 이를 초과하는 S/N 값을 포지티브 시그널로서 임의로 할당하는 한편, 2 미만의 S/N 값은 네거티브한 것으로 간주하였다. 하나의 샘플 셋 내에서 실험의 변동성의 측정치인 변동 효율 (CV)은, 복제물의 표준 편차를 취하고, 이것을 평균으로 나누어, 그 값에 100을 곱하여 퍼센트 값을 얻음으로써 계산하였다.
실험에 사용된 포획 서열 프로브 및 블로커 프로브는 쿡 등 (Cook et al.,)에 의해 기술된 방법 (1988 Nucl. Acid. Res., 16: 4077-95)을 이용하여 합성하였 다. 다르게 언급되지 않는 경우, 본원에 기술된 실험에 사용된 포획 서열 프로브는 이들의 5' 및 3' 말단에서 비오틴으로 표지되었다.
실험에 사용된 시그널 서열 프로브는 RNA 프로브이다. 이들 프로브는 이스라엘리 등 (Yisraeli et al.)에 의해 기술된 방법 (1989, Methods in Enzymol., 180: 42-50)을 이용하여 제조되었다.
모든 CSP를, 본원에 기술된 유형 특이적인 하이브리드 포획 검정에서 이들의 유형 특이적인 능력에 대해서 검정하였다. 하기되는 CSP, 즉 SEQ ID NO: 36-56는 다른 유형과 교차-반응 특성을 나타내지 않았으며, 본 검정에 사용하도록 허용되었다.
표 1: HPV를 위한 포획 서열 프로브
Figure 112008038823062-pct00002
Figure 112008038823062-pct00003
Figure 112008038823062-pct00004
Figure 112008038823062-pct00005
*: 괄호 안의 서열은 HSV에서 지시되지 않은 "테일" 서열이다.
표 2: HPV에 대한 블로커 프로브
Figure 112008038823062-pct00006
Figure 112008038823062-pct00007
실시예 2
포획 효율에 대한, CSP와 SSP 표적 부위 간 거리의 효과
포획 효율에 대한, HSV-1 표적 핵산 상의 포획 서열 프로브 (CSP)와 시그널 서열 프로브 (SSP) 하이브리드화 부위 간 거리의 효과를 평가하였다. SSP 하이브리드화 부위로부터 0.2 kb, 3 kb, 18 kb, 36 kb 및 46 kb에 위치한 HSV-1 핵산 서열에 하이브리드화하는 CSP를 시험하였다. 실시예 1에 기재된 일반적인 TSHC 방법을 사용하였다. 포획 효율은 각각 100%, 50%, 30%, 19% 및 7%이었다 (표 3). 거리가 0.2 Kb에서 46 Kb로 증가함에 따라 상대적인 포획 효율에서 꾸준한 감소가 확인되었다.
표 3: 포획 효율에 대한, 표적 부위 간 거리의 효과
Figure 112008038823062-pct00008
실시예 3
HSV-1의 TSHC 검출에서 다양한 CSP 및 SSP의 포획 효율
TSHC에 의한 HSV-1의 검출에서, 4개의 HSV-1 특정 시그널 서열 프로브 (SSP)인, H19, RH5B, RH3 및 R10의 각각에 대한 포획 서열 프로브 (CSP)의 포획 효율을 평가하였다. 포획 서열 프로브를 설계하는데 사용된 기준은 다음과 같았다: 1) CSP 하이브리드화 부위가 HSV-1 핵산 서열 상의 SSP 하이브리드화 부위의 5' 또는 3'의 1 kb 이내이며, 바람직하게는 0.5 kb 이내이다; 및 2) CSP는 HSV-1에 독특한 서열을 함유하며, 이 HSV-1은 HSV-2과의 서열 상동성에 대해 10 초과의 염기로 확장되지 않는다. CSP를, 바람직하게는 각각의 SSP에 대해 5' CSP 및 3' CSP로, SSP 하이브리드화 부위에 인접한 5' 및 3' 영역을 표적화하도록 설계하였다. 시판되는 OMIGA 소프트웨어 (캘리포니아 캠프벨에 소재한 옥스포드 모레큘러 그룹)가 상기한 부위의 동정에 효과적이었다. CSP의 용융점 (Tm)은 70℃ 내지 85℃가 되도록 설계되었다. 실시예 1에 기재된 일반적인 TSHC 방법을 사용하였다. H19에 대해서는 11개의 CSP (이것은 6개의 상이한 부위에 결합함), RH5B에 대해서는 6개의 CSP (이 것은 3개의 독특한 부위에 결합함), RH3에 대해서는 6개의 CSP (이것은 6개의 독특한 부위에 결합함), 및 R10에 대해서는 2개의 CSP를 시험하였다. 표 4에 기재된 바와 같이, 시그널 서열 프로브 H19, RH5B 및 R10에 대해서는 효율적인 포획 서열 프로브가 확인되었다.
표 4: HSV-1의 TSHC 검출을 위한 CSP 및 SSP
Figure 112008038823062-pct00009
실시예 4
임상 견본 시험
TSHC 및 하이브리드 포획 2 (hc2TM; 디진 코포레이션) 방법 둘 모두를 사용하여 HSV-1 및 HSV-2에 대해 64-원으로 된 임상 견본 패널을 시험하였다. 상기 패널에는 알려진 양의 HSV-1 또는 HSV-2를 함유하는 15개의 샘플, 및 PCR 시험에 의해 HSV-1 및 HSV-2에 대해 네거티브한 것으로 알려진 49개의 샘플이 포함되었다. 따라서, 15개의 포지티브한 샘플은 HC2 및 TSHC 검정 둘 모두에서 포지티브하게 시험될 것으로 "예상"되었고, 49개의 네거티브한 샘플은 HC2 및 TSHC 시험 둘 모두에서 네거티브하게 시험될 것으로 "예상"되었다.
실시예 1에 기재된 일반적인 TSHC 방법을 사용하였다. HC2 방법 및 TSHC 방 법을 사용하여 얻어진 결과가 각각 표 5 및 6에 기재되어 있다. 네거티브한 결과를 나타낼 것으로 "예상"된 49개의 샘플 중에서, HC2 방법을 사용하여 5개의 샘플이 포지티브한 것으로 시험되었고, 44개의 샘플은 네거티브한 것으로 시험되었다. 비교에서, 49개의 모든 샘플은 TSHC 방법을 사용하여 네거티브한 것으로 시험되었다. 따라서, TSHC 방법이 HSV-1 및 HSV-2의 검출에 있어서 HC2 방법 보다 특이성에서 우수하다.
표 5: HSV1 및 HSV2의 HC2 검출에 대해 확인된 결과 대 예상된 결과
Figure 112008038823062-pct00010
표 6: HSV1 및 HSV2의 TSHC 검출에 대해 확인된 결과 대 예상된 결과
Figure 112008038823062-pct00011
실시예 5
HSV의 TSHC 검출에서 프로브 조합의 효과
HSV-1 검출에 대한 HSV-1 특이적인 시그널 서열 프로브 및 포획 서열 프로브 셋의 조합의 효과를 검정하였다. HSV-1 및 HSV-2 교차-반응성의 TSHC 검출을, 2개 의 상이한 셋의 RNA 시그널 서열 프로브/비오티닐화된 포획 서열 프로브 조합물을 사용하여 개별적으로 수행하였다 (셋 #1: H19 플러스 HZ-1; 및 셋 #2: RH5b 플러스 TS-1 및 TS-2). TSHC를 또한, 민감성 및 교차-반응성에 대해 2개의 프로브 셋을 조합시키는 경우의 효과를 평가하기 위해 조합된 양 RNA 시그널 서열 프로브/비오티닐화된 포획 서열 프로브 셋을 사용하여 수행하였다. 실시예 1에 기재된 일반적인 TSHC 방법을 사용하였다. 표 7에 기재된 결과로부터, HSV-1 검출에 대해 2개의 프로브 셋을 조합시키는 경우의 부가적인 효과가 명확하게 입증되는데, 이 경우 HSV-2의 교차-반응성에서는 어떠한 확인가능한 정도의 증가도 없었다.
표 7: HSV-1 특이적인 CSP 및 SSP를 조합시킴에 의해 증가되는 민감성
Figure 112008038823062-pct00012
실시예 6
다중 포맷에서의 HPV 유형의 검출
단일의 생물학적 샘플에서 다양한 유형의 사람 파필로마바이러스 (HPV)를 나 타내는 13개 서열의 신속하고 민감하며 특이적인 검출을 다중 포맷으로 실시하였다. 이러한 검정으로, 5시간의 주기 내에서 96웰 마이크로플레이트 포맷 중의 96개 이하의 샘플을 분석할 수 있다. 한 유형의 바이러스의 적어도 500개 복사체를 검정 개시 후 5시간 내에 검출할 수 있다.
단백질 G-상자체 비드 (와이오밍 브라운 디어에 소재한 디날 코포레이션) 및 루미넥스 (Luminex) 100TM 카르복실화된 비드 (텍사스 오스틴에 소재한 루미넥스 코포레이션)를 고체 지지체로 사용하였다. HPV RNA를 당업계에서 일반적으로 인식된 바대로 HPV 플라스미드의 시험관내 전사에 의해 제조하였는데, 이것은 문헌에 기재되어 있다 [참조: Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, Wiley Publishing, 1993]. 신규한 검정법은 1) 표적 부화; 2) 표적 증폭; 및 3) 표적 검출을 포함하는 3 단계를 지닌다:
표적 부화:
샘플을, 사전 선택된 특정 표적으로부터 원치않거나 비-특이적인 DNA 및 오염물을 분리함으로써 증폭을 위해 준비하였다. 이 단계에 의해 원치않는 DNA가 제거되고, 이러한 원치않는 DNA의 존재에 의해 표적 증폭의 민감성이 실질적으로 감소된다. 표적 부화는 서열 특이적 RNA: DNA 하이브리드를 상자체 비드 상으로 포획시킴으로써 실시되었다. 비드를 먼저 RNA:DNA 하이브리드 또는 하이브리드 포획 항체 (디진, 코포레이션)에 대해 특이적인 항체를 사용하여 개질시켰다. 더욱 구체적으로, 1 mL의 단백질 G 자기 비드 (2.7 ×109 비드/ml; 디날, 코포레이션)를 375 ㎍의 HC-Ab와 혼합시키고, 비드-항체 (비드-Ab) 복합체가 형성되도록 실온에서 40분 동안 PBS 중에서 인큐베이션시킴에 의해, HC-Ab 상자체 비드를 제조하였다. 플레이트를 자기 그리드 (디날, 코포레이션) 상에 위치시켜 상기 비드-Ab 복합체를 웰 바닥에 축적시키고, 0.2 M 트리에탄올 아민, pH 8.2로 1회 세척하였다. 항체를 30분 동안 20 mM DMP/0.2M 트리에탄올아민, pH 8.2의 시약 중에서 단백질 G에 가교시켰다. 이 비드-Ab 복합체를 1 mL의 PBS-0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 이후, 비드를 1 mL의 PBS-트윈 중에 재현탁하고 4℃에서 저장하였다.
샘플을, 탈이온수 중의 100 ㎍/ml의 청어 정자 DNA, 1 M 구아니딘-HCl, 10 mM의 트리스-HCl (pH 8.0), 10 mM의 EDTA, 0.05% 아지드화나트륨으로 구성된 용액중에서 준비된 다양한 HPV 플라스미드 (10 kb)로 연속적으로 희석하였다. 희석된 샘플의 각각 (50 ㎕)을 웰당 25 ㎕의 1.75 M NaOH를 함유하는 96-웰 마이크로플레이트 중에서 혼합하고, 샘플이 변성되도록 50℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 표 1로부터 선택된 13개 유형의 HPV RNA의 칵테일 (검정 당 각각 15 ng)을 하기 성분으로 구성되는 중화 용액 중의 변성된 샘플에 첨가하였다: 25 ㎕의 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M의 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 BES, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨, 및 0.4% 트윈-20 (pH 3.6-4.1). 이후, 하이브리드 포획 항체 (HC-Ab)-컨쥬게이션된 상자체 비드 (검정 당 5.4 ×106 비드)를 중화된 샘플에 즉시 첨가하였다. HPV RNA 및 상자체 비드-항체의 컨쥬게이트를 1100 rpm에서 진탕시키면서, 65℃에서 30분 동안 샘플 표적 서 열로 하이브리드화하였다. 플레이트를 자기 그리드 (디날, 코포레이션) 상에 위치시켜서 자기 비드-표적 복합체를 웰의 바닥에 축적시켰다. 상청액을 피펫으로 흡출시키고, 비드를 세척용 완충액 (40 mM 트리스 pH 8.2, 100 mM 염화나트륨, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.05% 트윈-20)을 사용하여 3회 세척하여, 임의의 오염물을 제거하였다.
표적 증폭:
랜덤 프라이머, 및 가닥 변위 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용하여 샘플 표적 DNA의 등온 증폭을 실시하였다. DNA 표적을 랜덤 오량체로 프라이밍된 phi29 DNA 중합효소를 사용하여 증폭시켰다. 오량체 프라이머를, 누클레아제에 의한 분해를 방지하기 위해 3' 말단에 2개의 포스포로티오에이트 결합을 지니도록 합성하였다. 기타 개질에는, 이들에 한정되는 것은 아니나 프라이머 구조 내로 혼입되는 2'O-메틸기가 포함될 수 있다. 표적 DNA를 2시간 증폭시켰다. 표적 부화 단계에서 수득한 포획된 표적 핵산을 보유하는 상자체 비드를 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, 200 ㎍/ml 아세틸화된 BSA, 400 μM의 각각 dNTP, 125 μM 랜덤 오량체 및 1U의 phi29 DNA 중합효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)로 구성된 20 ㎕의 반응액 중에 재현탁시키고, 30℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
증폭 단계에 유용할 수 있는 프라이머가 하기 기재되어 있다:
Figure 112008038823062-pct00013
*: 이중-표지된 프로브 및 프라이머 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인코포레이티드; 유타 솔트레이크 시티에 소재함).
*: FAM-형광 리포터; BHQ-블랙 홀 켄쳐
표적 검출:
증폭된 서열을 다중 용량을 부여하는 광학, 유체 공학 및 시그널 처리를 통합한 액체-기재 비드 어레이 시스템(루미넥스 기술, Luminex technology)을 이용하여 검출하였다. 루미넥스 기술은 동일한 검정 웰에서 여러 표적을 검출할 수 있는 형광 마이크로비드 및 리포터 분자를 기초로 한 매우 민감한 검정 시스템을 사용한다[참조, 미국특허번호 5,981,180; 6,524,793; 5,736,330; 6,449,562; 6,592,822; 6,632,526; 6,514,295; 6,599,331; 6,046,807; 및 6,366,354]. 루미넥스 검출 기기는 두개의 레이저를 사용한다: 하나는 형광 비드 자체의 검출을 위한 것이며, 다른 하나는 형광 리포터를 위한 것이다. 2-칼라 형광비드는 약 100개 이하의 상이한 표적을 다중 검출할 수 있다. 루미넥스 기술은 본 실시예에서 HPV 검사(typing)에 적용되었다. 본 방법은 플랫폼의 민감성 및 견고성을 증가시켰다.
특정 HPV 유형에 대한 후기(late) (L)- 및 조기(early) (E)-영역[MH Einstein and GN Goldberg, Cancer Invest. 20: 1080-1085, 2002, 참조문헌으로 포함됨]에 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오티드 서열을 제조자 프로토콜을 이용하여 시판되는 상이한 칼라의 루미넥스 카르복실화된 비드에 컨쥬게이션시켰다. 포획 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 1에 나타내었다. 하나의 특정된 HPV 유형의 두 개의 올리고뉴클레오티드를 동일한 비드 셋에 부착시키고, 이에 의해 암 세포에서 일어날 수 있는 HPV L-영역의 결실에 의해 야기되는 네가티브 오류 결과를 제거하였다. 암플리콘 정제 단계는, 제1 표적 부화 단계 동안에 도입된 상자체 비드를 보유하는 동일한 튜브에서 하이브리드화가 수행되었기 때문에 검출 단계 전에 요구되지 않았다.
상기 검정의 검출 단계는 70℃에서 15분 동안 75 ㎕의 438 mM NaOH에서 암플리콘 변성으로 개시되었다. 13개의 상이한 유형의 HPV RNA(검정 당 각각 15 ng)의 칵테일을 25 ㎕의 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 BES, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.4% 트윈-20(pH 3.6-4.1) 중의 변성된 샘플에 첨가하였다. 이후, 13개 유형의 올리고뉴클레오티드를 각각 카르복실화된 루미넥스 폴리스티렌 비드(검정 당 5×103 비드)에 컨쥬게이션시킨 직후, 중화된 샘플에 첨가하였다. RNA 및 비드-올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트를 1100 rpm으로 진탕시키면서 65℃에서 30분 동안 표적에 하이브리드화하였다. 샘플을 이후 96-웰 필터 플레이트(Whatman)를 통해 여과하고, 비드를 100 ㎕의 1× 포스페이트-완충 염수(PBS), 0.05% 트윈-20, 10% 염소 혈청, 및 10 ng의 피코에리트린으로 표지된 마우스 모노클로날 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체(PE-HC-Ab)에 재현탁하였다. 샘플을 1100 rpm으로 진탕시키면서 실온(18 내지 25℃)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 과량의 항체를 진공 여과에 의해 제거하고, 표적 복합체를 지닌 비드를 0.05% 트윈-20을 지닌 PBS 100 ㎕에 재현탁하였다. 이후 광전자 배증관의 게인(gain)을 700 볼트로 조절한 후 루미넥스 흐름세포계수기로 샘플을 분석하였다.
본 단계의 개선된 민감성은 다수의 피코에리트린 항체(PE-Ab)의 결합을 허용하는 긴 RNA 시그널 서열 프로브(6500 bp, 대략 길이)로부터 초래되며, 이에 의해 다른 검출 기술, 예를 들어 짧은 하이브리드 프로브에 컨쥬게이션된 플루오로포어를 사용하는 검출 기술과 비교하여 약 500배의 시그널 증폭을 초래한다. RNA 시그널 서열 프로브의 길이는 약 500개의 염기 내지 약 10,000개의 염기, 또는 단지 표적 핵산 길이의 100% 미만의 범위를 가질 수 있다.
표 8에 나타낸 결과는 총 13개의 HPV 유형 비드 셋의 존재하에 HPV 16의 검출의 민감성을 입증한다. 플라스미드에 대한 검출의 민감성은 잡음에 대한 로버스트(robust) 시그널의 비율에 의해 지시되는 바와 같이 검정 당 500 복사체를 초과하였다. 초기 샘플 부피는 50 ㎕이었지만, 500 ㎕ 또는 심지어 전체 샘플(튜브-기재 검정에서 사용하기 위함; 미도시됨)로 증가될 수 있으며, 이는 검정 민감성을 심지어 보다 큰 정도로 증가시킬 것이다. 이러한 결과는 또한 HPV 16 검출에 대한 특이성을 나타내었다. HPV 16 이외의 HPV 표적에 특이적인 비드 셋에 대해 본래 어떠한 시그널도 검출되지 않았다. 표 8의 시그널(평균, n=4 복제물, 3 내지 31% 의 CV%)는 흐름세포계수기에 의해 계수된 샘플 당 100개의 비드(사건)에 대해 중간의 형광세기(MFI)이다. 배경 또는 잡음 값은 표적을 함유하지 않은 샘플의 MFI이다.
표 9는 총 13개의 HPV 유형의 검출 민감성 및 특이성을 기술한 것이다. 표적 HPV 유형은 X-축에 따라 기재되어 있으며, 핵산 프로브는 y-축에 따라 기재되어 있다. 각 유형에 대한 동일한 HPV 표적 및 HPV 프로브는 표를 횡단하여 대각선으로 강조하여 나타내었다(포지티브 결과). 이러한 박스는 프로브의 HPV 표적에 대한 프로브의 높은 수준의 특이성을 나타낸다. 이러한 실험은 프로브가 상응하는 HPV 유형 표적에 대해 특이적인 것임을 확증한다. 표 9의 결과는, 예를 들어 HPV 16 표적이 단지 상응하는 HPV 16 프로브에 결합하고(포지티브 결과) 다른 HPV 유형에 대한 프로브에 결합하지 않음(네가티브 결과)을 나타낸다.
표 8: HPV 16의 검출 민감성
Figure 112008038823062-pct00014
표 9: HPV 유형의 특이성
Figure 112008038823062-pct00015
실시예 7
HPV 16, HPV 58 및 HPV 33의 검출
실시예 6에 지시된 샘플 완충액 중 상이한 유형의 HPV 서열 (10 kb)이 각각 삽입된 세 개의 플라스미드를 혼합하여 여러 유형의 HPV로 감염된 자궁경부 샘플을 모델링하였다. 본 실시예는, 1개를 초과하는 HPV 유형이 샘플에 존재하는 경우, 다중 감염을 검출하기 위한 검정 능력을 기술한 것이다.
다중 표적 샘플의 검정을 실시예 21에 기술된 바와 같이 수행하였다. 샘플은 1×102 복사체의 HPV 16, 1×104 복사체의 HPV 58 및 1×106 복사체의 HPV 33으로 이루어졌다. 도 7의 결과는 낮은 존재비의 HPV 16 표적이 다른 HPV 유형의 매우 풍부한 존재 하에서도 검출되었음을 나타내고 있다. 도 7은, HPV 16이 잡음에 대한 낮은 시그널의 비율을 지님을 나타낸 것으로, 여기서 시그널(평균, n=4 복제 물, 3% 내지 31%의 CV %(변동 계수))는 흐름세포계수기에 의해 계수된 샘플 당 100개 비드(사건)에 대한 중간 형광세기(MFI)이다. 잡음 값은 표적 플라스미드를 함유하지 않는 샘플의 MFI이다.
실시예 8
임상 샘플에서 HPV의 검출
HPV를 자궁경부 샘플에서 검출하였으며, 여기서 자궁경부 샘플을 견본 운반 매질(STM; Digene Corp., Gaithersburg, MD)에서 수집하였으며, 시판되는 HC2 고위험성 HPV DNA 테스트™ 검정(Digene Corp.)을 이용하여 고위험성 HPV 유형에 대해 초기에 스크리닝하였다. HC2 검정 결과를 본 발명에 기술된 HPV 검사 검정의 결과와 비교하였다.
자궁경부 샘플을 브러시를 이용하여 수집하고, 사용할 때까지 저장 매질(1M 구아니딘-HCl, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA 및 탈이온수 중 0.05% 아지드화나트륨) 중에 보존하였다. 자궁경부 샘플의 분취액(50 ㎕)을 제조자의 권고에 따라 HC2 (Digene Corp)로, 또는 실시예 6에 기술된 방법으로 분석하였다. 두 검정의 민감성을 비교하기 위하여, 포지티브 샘플을 HPV 감염 없이 자궁경부 샘플에 연속적으로 희석시켰다.
표 10: 임상 샘플의 검출 민감성의 비교
Figure 112008038823062-pct00016
임상 샘플에 대한 HC2의 민감성이 표 10에 보고되었으며 검정 당 대략 10,000 HPV 표적에 상응하는 2.3의 시그널/컷오프(Cutoff)(100배 희석된 샘플)를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 HPV 검사 검정의 민감성을 비교할 때, 본 발명은 약 43의 잡음에 대한 시그널 비율(S/N)을 지니면서 검정 당 적어도 100 배를 초과하고 100개 복사체와 동일하다.
실시예 9
HPV DNA의 환형, 선형 및 통합 형태의 검출
본 발명의 검정은 선형 및 환형인 DNA 서열을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 검정에서 발생하는 증폭은 반드시 "롤링-서클(rolling circle)" 현상에 의해 일어나는 것이 아니다. 그러므로, 본 발명의 검정의 표적은 환형일 필요가 없다. 이는 선형일 수 있는데, 이는 환형 병원성 DNA가 변성에 의해 골이 형성되기(nicked) 때문이거나, 병원성 (바이러스) DNA 표적이 선형 숙주(인간) 게놈으로 통합되기 때문이거나 병원성 DNA가 선형 게놈이기 때문이다.
CaSki 세포로부터의 정제된 DNA의 선형 또는 환형 또는 연속 희석액인 HPV 16 플라스미드의 연속 희석액을 포함하는 샘플을 TE 완충액 중에 희석시켰다. 선 형 플라스미드를 표준 기술을 이용하여 환형 플라스미드의 제한 엔도누클레아제 소화에 의해 형성하였다. CaSki 세포 DNA는 인간 게놈 당 500개 복사체의 통합형 HPV 16 바이러스 게놈을 함유하는 인간 게놈 DNA이다. CaSki 세포 DNA에 대한 검정 당 HPV 16 복사체의 농도를 두개의 게놈, 인간 및 HPV의 크기 및 비율, 및 정제된 CaSki DNA의 광학 밀도 측정으로부터 계산하였다.
표적을 랜덤 프라이머의 존재하에 95℃에서 3 분 동안 열변성시킨 직후에, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 0.5 mM EDTA 및 50 μM 랜덤 육량체 프라이머(가장 먼 3' 결합에서 포소포로티오에이트화됨)에서 증폭시켰다. 단일-가닥 표적을 이후 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, 0.2 mg/ml 아세틸화된 BSA, 각각 400 μM dNTP, 0.13 mM 랜덤 육량체 및 10U의 phi29 DNA 중합효소(Epicentre, Inc)로 이루어진 20 ㎕ 반응물 중에서 30℃에서 120 분 동안 증폭시켰다.
증폭된 표적을 하기를 제외하고 실시예 6에 기술된 바와 같이 검출하였다. RNA:DNA 하이브리드 복합체를 먼저 마우스 모노클로날 항-RNA:DNA 1차 항체(10 ㎍/검정)로 태깅하고, 이후 피코에리트린(1.6 ㎍/검정)과 컨쥬게이션된 염소-항-마우스 IgG 2차 항체로 태깅하였다.
표 11의 결과는 본 발명의 검정이 로버스트 시그널/잡음 비율을 갖는 환형, 선형 및 통합형 DNA를 검출함을 나타내며, 이에 의해 본 검정의 유효성이 "롤링-서클" 메커니즘에 의존적이지 않음을 나타낸다. 그러나, "롤링 서클" 메커니즘은 반 응을 가속시킬 수 있었는데, 이는 환형 표적이 선형 표적 보다 더욱 효과적으로 증폭되기 때문이다.
표 11: 제안된 방법으로 환형, 선형 및 퉁합형 표적의 검출
Figure 112008038823062-pct00017
시그널은 흐름세포계수기에 의해 계수된 샘플 당 100개의 비드(사건)에 대한 중간 형광세기(MFI)의 평균(n=2)이다. 잡음 값은 표적 플라스미드를 함유하지 않은 샘플의 평균 MFI이다.
실시예 10
랜덤 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PHI29 DNA 중합효소에 의해 촉매화된 등온 증폭
표적 증폭 단계의 다른 구체예는 랜덤 프라이머의 길이에서 최적화된 개질된 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 랜덤 오량체, 5'-NpNpNpsNpsN-3'는 IDT, Inc에서 제조된 것이다. 본 실시예에서 데이타를 산출하기 위하여, HPV 16 플라스미드를 30℃에서 2시간 동안 등온 증폭으로 20 ㎕의 총 반응 부피에서 증폭하였다. DNA 표적을 10 ㎕의 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 50 μM의 프라이머에서 95℃로 3분 동안 열변성하였다. 20㎕의 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, 200 ㎍/ml 아세틸화된 BSA, 각각 400 μM dNTP, 125 μM 랜덤 오량체 및 1U의 phi29 DNA 중합효소(New England Biolabs, Inc)에서 등온 증폭을 30℃로 2시간 동안 수행하였다. 증폭 후에, 암플리콘의 절반의 부피(10 ㎕)를 실시예 11에 기술된 바와 같이 "1차/2차" 항체 검출 프로토콜을 이용하여 루미넥스 흐름-세포계수 시스템에서 검출하였다.
표 12: 랜덤 DNA 오량체는 최적의 프라이머 길이를 지닌다. 모든 프라이머는 3' 말단에 포스포로티오에이트 개질을 지닌다.
Figure 112008038823062-pct00018
표 13: 상이한 랜덤 프라이머 길이 및 개질의 비교
Figure 112008038823062-pct00019
표 12 및 13은 랜덤 DNA 육량체 프라이머가 하나의 포스포로티오에이트 개질을 갖는 것이 최적이며, 랜덤 DNA 오량체인 프라이머가 두 개의 포스포로티오에이트 개질을 갖는 것이 최적임을 나타낸다.
실시예 11
증폭된 표적을 검출하는 다른 방법
증폭된 표적을 검출하는 세 개의 상이한 프로토콜을 비교하였다. 하나의 수단은 5' 말단에 비오틴으로 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드인 비오티닐화된 프로브를 사용하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 Integrated DNA Technology, Inc.(Salt Lake City, UT)에 의한 화학적 합성으로 제조하였다. 2개의 다른 방법은 표지된 1차 HC-Ab(Digene Corp.)을 사용하였으며, 순차적으로 1차 HC-Ab 및 표지된 2차 항체(Digene Corp.)를 사용하였고, 이는 본 발명의 두 개의 구체예를 나타낸다. 항체-표지되거나 착색된 비드의 흐름세포계수 검출과, 시그널 증폭의 조합은 시그널을 증가시키며, 이에 따라 검정의 민감성이 10배가 넘게 증가하였다. 시그널 증폭은 비드 상에 큰 복합체가 존재를 나타낼, 검정의 배경을 대개 증가시키며, 이에 따라 민감성을 감소시키거나 떨어뜨릴 것이다. 그러나, 기술된 본 발명의 방법은 시그널 및 민감성의 증가를 제공한다. 비드 상의 큰 복합체는 루미넥스 흐름-세포계수 시스템에서 특정 크기의 비드에 따라 검출 모드를 방해할 수 있었다. 이러한 문제점 둘 모두는 본 발명의 방법에 의해 극복되었다.
A. 제1 방법에서, 표적 핵산에 상보적인 비오티닐화된 프로브를 피코에티트린에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘(SA-PE; Pierce)에 적용하였다. 증폭된 HPV 16 플라스미드를 75 ㎕의 438 mM NaOH에서 70℃로 15분 동안 변성시켰다. 각각 2 나노그램의 두 개의 5'-비오티닐화된 프로브(5'-비오틴-TATTTTATATGACACAATGT-3' (SEQ ID NO:128); 5'-비오틴-GGTTTGTGCTAACAATAAATGTATCCATAG-3' (SEQ ID NO:129)를 25 ㎕의 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 BES, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.4% 트윈-20(pH 3.6-4.1) 중의 변성된 표적 핵산 샘플에 첨가하였다. 대략 1000개의 폴리스티렌 비드를 HPV 16 L- 및 E-영역에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션하였으며(표 1 참조), 직후에 중화된 샘플에 첨가하였다. 하이브리드화를 1100 rpm으로 진탕시키면서 50℃에서 30분 동안 수행하였다. 100 ㎕의 438 mM NaOH, 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 BES, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.4% 트윈-20 중 SA-PE(100 ng)를 각 반응물에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 이후 필터 플레이트로 옮기고, 여기서 결합되지 않은 물질을 진공 여과로 제거하였다. 비드를 100 ㎕의 PBS-0.05% 트윈-20에 재현탁하고, 광전자 배증관의 게인을 700 볼트로 조정한 후 루미넥스 흐름세포계수기로 분석하였다.
B. 제2 방법에서, 증폭된 HPV 16 플라스미드를 75 ㎕의 438 mM NaOH에서, 70℃로 15분 동안 변성시켰다. 13개의 상이한 유형의 HPV RNA의 칵테일(검정 당 각각 15 ng, 실시예 6에 기술된 바와 같이 수득됨)을 25 ㎕의 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 BES, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.4% 트윈-20(pH 3.6-4.1) 중의 변성된 샘플에 첨가하였다. 13개 셋의 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이션된 폴리스티렌 비드(검정 당 5×103 비드)를 즉시 중화된 샘플에 첨가하였다. 각 비드 셋은 특정 HPV 유형 상의 후기 (L)- 및 조기 (E)-영역에 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오티드 서열을 지녔다. 포획 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 1에 나타내었다. RNA 및 비드-올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트를 1100 rpm으로 진탕시키면서 65℃에서 30분 동안 표적 핵산에 하이브리드화하였다. 샘플을 이후 96-웰 필터 플레이트(Whatman)에서 여과하고, 100 ㎕의 PBS-0.05% 트윈-20 중의 1 ㎍의 1차 HC-Ab를 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 진탕시킨 후에, 반응물을 여과하고, 100 ㎕의 PBS, 0.05% 트윈-20 및 10% 염소 혈청 중의 8 ㎍의 PE-표지된 2차 (염소-항마우스) 항체를 첨가하였다. 실온에서 진탕시키면서 20분 동안 계속 인큐베이션하였다. 과량의 항체를 진공 여과로 제거하고, 표적 복합체를 지닌 비드를 0.05% 트윈-20와 함께 100 ㎕ PBS에 재현탁하였다. 이후 광전자 배증관의 게인을 700 볼트로 조정한 후 루미넥스 흐름세포계수기로 샘플을 분석하였다.
C. 제3 방법에서, 증폭된 HPV 16 플라스미드를 75 ㎕의 438 mM NaOH에서, 70℃로 15분 동안 변성시켰다. 13개의 상이한 유형의 HPV RNA의 칵테일(검정 당 각각 15 ng, 실시예 6에 기술된 바와 같이 수득됨)을 25 ㎕의 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 BES, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.4% 트윈-20(pH 3.6-4.1) 중의 변성된 샘플에 첨가하였다. 13개 셋의 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이션된 폴리스티렌 비드(검정 당 5×103 비드)를 즉시 중화된 샘플에 첨가하였다. 각 비드 셋은 특정 HPV 유형 상의 후기 (L)- 및 조기 (E)-영역에 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오티드 서열을 지녔다. 포획 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 1에 나타내었다. RNA 및 비드-올리고 컨쥬게이트를 1100 rpm으로 진탕시키면서 65℃에서 30분 동안 표적 에 하이브리드화시켰다. 샘플을 이후 96-웰 필터 플레이트(Whatman)에서 여과하고, 비드를 100 ㎕의 PBS, 0.05% 트윈-20, 10% 염소 혈청 및 10 ng의 피코에리트린으로 표지된 마우스 모노클로날 RNA:DNA 특이적 항체(PE-HC-Ab)에 재현탁하였다. 샘플을 이후 1100 rpm으로 진탕시키면서 실온(18 내지 25℃)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 과량의 항체를 진공 여과로 제거하고, 표적 복합체를 지니는 비드를 0.05% 트윈-20과 함께 100 ㎕ PBS에 재현탁하였다. 이후 광전자 배증관의 게인을 700 볼트로 조정한 후 루미넥스 흐름세포계수기로 샘플을 분석하였다.
HPV 16 표적의 등온 증폭을 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다. 증폭된 표적을 상기 프로토콜 A, B 또는 C에 기술된 바와 같이 세 개의 프로토콜 중 하나를 이용하여 검출하였다. 결과를 표 14에 나타내었다. 세 개의 기술된 프로토콜 중, 비오티닐화된 프로브로의 검출(프로토콜 A)은 본 방법을 수행하는데 최소의시간을 필요로 하였다. 그러나, 이러한 검출 방법은 또한 가장 낮은 시그널 세기를 형성하였다. 가장 큰 시그널 세기 및 S/N 비율은 표지된 1차 항체 검출식(표 14)을 사용하여 달성되었으며, 이는 HC-Ab 시그널 증폭을 실행하였다(프로토콜 B 및 C). 프로토콜 C는 프로토콜 B에서 보다 하나 적은 단계를 사용하며, 이는 바람직할 것이다.
표 14: 등온 증폭 후 HPV 16 검출의 비교
Figure 112008038823062-pct00020
실시예 12
96-웰 뉴클레오링크 플레이트에서의 HPV 검사
대안적인 구체예에서, 서열 검출을 위한 고체 지지체로서 비드 대신에 미세역가 플레이트를 사용할 수 있다. 개개의 HPV 유형에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 웰의 바닥에 컨쥬게이트시켰다. 표적 핵산을 포획 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화시키고, 이후 화학발광으로 검출하였다.
뉴클레오링크(NecleoLink™) 다중-웰 플레이트(Nalge Nunc International; New York)의 제조에서, 특정 HPV 유형에 대한 후기 (L)- 및 조기 (E)-영역에 대해 상보적인 두 올리고뉴클레오티드 서열을 하기 기술되는 프로토콜을 이용하여 뉴클레오링크 플레이트에 컨쥬게이션시켰다. 포획 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 1에 나타내었다. 각 웰에서 두 개의 올리고뉴클레오티드를 정위시킴으로써, 암 세포에서 일반적인 HPV L-영역의 결실의 의해 야기되는 네가티브 오류 결과는 제거될 수 있다. 5'-C12-아미노 링커를 함유한 유형 특이적 포획 올리고뉴클레오티드(각 HPV 유형 당 두 개)를 10 mM 1-메틸이미다졸, pH 7을 함유한 10 mM 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드의 새롭게 제조된 용액 중에 100 nM(0.1 pmole/ ㎕)의 최종 농도로 제조하였다. 이러한 용액을 뉴클레오링크 96-웰 플레이트에 웰 당 100 ㎕(웰 당 하나의 유형)로 첨가하고, 내열성 테이프로 밀봉하고, 50℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 용액을 경사분리시키고, 웰을 3회 세척하고, 5분 동안 적시고, 실온에서 100 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 및 0.1% 트윈-20으로 모두 3회 세척하였다. 웰을 이후 3회 세척하고, 5분 동안 적시고, 분자생물학 등급수로 3회 세척하였다. 플레이트를 이후 실온에서 30분 동안 건조시켰다. 플레이트를 필요할 때까지 건조제를 구비한 에틸렌 백(bag)에서 4℃로 저장하였다.
공유결합된 올리고뉴클레오티드를 구비한 뉴클레오링크 플레이트를 저장 후에 실온으로 유지시켰다. 플레이트를 실온에서 30분 동안, 100 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 0.05% 아지드화나트륨 중의 웰 당 290 ㎕ 6% 카제인으로 블로킹하였다. HPV 플라스미드(10 kb)의 희석액의 모델 샘플(100 pg/ml)을 100 ㎍/ml 청어 정자 DNA, 1M 구아니딘-HCl, 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 탈이온수 중 0.05% 아지드화나트륨으로 이루어진 용액에서 제조하였다. 샘플(50 ㎕)을 96-웰 마이크로플레이트에서 25 ㎕의 1.75 M NaOH와 혼합하고, 70℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄 설폰산, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.4% 트윈-20(pH 3.6-4.1) 중의 표지되지 않은 RNA 프로브(검정 당 15 ng)를 하이브리드 플레이트에서 각 웰에 첨가하였다. 용액은 맑거나 엷은 황색이 되었다. 각 웰의 내용물을 뉴클레오링크 플레이트에서 이의 개개 웰로 옮겼다. 플레이트를 1시간 동안 1150 rpm으로 진탕시키면서 65℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 실온으로 냉각시키고, 용액을 경사분리시켰다. 0.1 M mM 트리스-pH 7.4, 0.6 M 염화나트륨, 0.1 mM 아연 클로라이드, 1 mM 마그네슘 클로라이드 0.05% 아지드화나트륨, 0.25% 트윈-20, 0.2 mg/ml RNase, 4% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 0.05% 염소 IgG, 0.0008% 설포르호다민(Sulforhodamine) B 중의 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이션된 마우스 모노클로날 항-RNA:DNA 항체의 용액(100 ㎕/웰)을 30% 블로킹 용액(100 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 0.05% 아지드화나트륨 중 6% 카제인)과 함께 각 웰에 첨가하였으며, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 경사분리시키고, 플레이트를 128 mM 트리스 pH 7.2; 0.6 M 염화나트륨; 0.05% 아지드화나트륨; 0.24% 트윈으로 2회 세척하고, 이후 250 ㎕의 128 mM 트리스 pH 7.2; 0.6 M 염화나트륨; 0.05% 아지드화나트륨; 0.24% 트윈을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 내열성 테이프로 밀봉하고, 60℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 경사분리시키고 플레이트를 128 mM 트리스 pH 7.2; 0.6 M 염화나트륨; 0.05% 아지드화나트륨으로 2회 이상 세척하였다. 플레이트를 이후 40 mM 트리스 pH 8.2, 100 mM 염화나트륨, 0.05% 아지드화나트륨으로 2회 세척하였다. 용액을 경사분리시키고, 100 ㎕의 CDP-스타(Star) 기질을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 20분 동안 인큐베이션하고, DML 광도계 상에서 판독하였다. 표 15는 상술된 방법에 의해 검출된 바와 같이 100 pg/ml의 7개의 상이한 HPV 클로닝된 표적으로부터 수득된 잡음에 대한 시그널의 비율을 나타낸 것이다.
표 15: 96 웰 플레이트 상에서의 HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 및 52의 검사
Figure 112008038823062-pct00021
실시예 13
서브-웰 플레이트와 함께 마스크 사용의 효과
알칼리 포스파타아제의 용액을 CDP-스타 기질에 첨가하였다. 이러한 용액(20 ㎕)을 384 웰 플레이트(Digene Corp.)의 지시된 서브-웰에 첨가하고 20분 동안 인큐베이션하였다. 이후 마스크(mask, Digene Corp.)를 첨가하고 첨가하지 않은 플레이트를 384 웰 플레이트 광도계 상에서 약 450 nm에서 판독하였다. 표 16은 각 웰/서브웰을 덮는 마스크가 S/N 비율을 100배 넘게 증가시킴을 나타낸다. 마스크를 지닌 서브-웰 플레이트는 서브웰 간의 종래 공지된 혼선을 극복하는데 유리하다. 표 16의 각 박스는 단일 서브-웰을 나타낸 것이다. 단지 두개의 서브웰만이 화학발광 기질을 가지며, 이를 진하게 나타내었다.
표 16: 이웃 서브웰 간의 혼선
Figure 112008038823062-pct00022
실시예 14
384-서브-웰 플레이트에서의 HPV 검사
서브-웰 플레이트 포맷에서 개개 또는 다중 유형의 HPV의 검출을 수행하였다. 본 실시예에서, 샘플을 각 웰에 첨가하고, 개개 표적을 이동시키고 상응하는 포획 서열 프로브에 하이브리드화하였다. 검출 시약을 웰에 첨가하고, 여기서 이는 포지티브 서브-웰에서 표적에 결합하였다. 화학발광을 검출을 위하여 사용하였다.
5'-C12-아미노 링커를 함유한 유형 특이적 포획 올리고뉴클레오티드(각 HPV 유형 당 두 개의 올리고뉴클레오티드)를 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨 염을 함유한 500 mM 인산수소 나트륨, pH 8.5의 용액에 5 μM(5 pmole/㎕)의 최종 농도로 제조하였다. 이러한 용액을 서브-웰 플레이트의 각 서브-웰에 웰당 20 ㎕로 첨가하고(서브-웰 당 하나의 유형), 내열성 테이프로 밀봉하고 42℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 용액을 경사분리시키고, 웰을 TBS로 3회 세척하였다. 플레이트를 이후 HPV 검사 검정에 즉시 사용하였다.
플레이트를 실온에서 30분 동안, 100 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 0.05% 아지드화나트륨(큰 웰 당 1 mL) 중의 6% 카제인으로 블로킹하였다. 모델 샘플(100 pg/ml)은 100 ㎍/ml 청어 정자 DNA, 1M 구아니딘-HCl, 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 탈이온수 중 0.05% 아지드화나트륨으로 이루어진 용액에서 제조된 HPV 플라스미드(10 kb)의 희석액으로 이루어진다. 샘플(500 ㎕)을 에펜도르프 튜브에서 250 ㎕의 1.75 M NaOH와 혼합하고 70℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음, 0.125 M 시트르산 나트륨, 0.125 M 인산 나트륨, 0.6 M 트리에탄올아민, 0.6 N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄 설폰산, 0.83 M 빙초산, 3% 폴리아크릴산, 5 mM EDTA, 0.05% 아지드화나트륨 및 0.4% 트윈-20(pH 3.6-4.1) 중의 RNA 프로브(검정 당 15 ng)을 각 튜브에 첨가하였다. 용액은 맑거나 엷은 황색을 나타낸다. 각 튜브의 내용물(1 ml)을 서브웰 플레이트의 개개의 웰로 옮겼다. 플레이트를 1150 rpm으로 1시간 동안 진탕시키면서 65℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 실온으로 냉각시키고, 용액을 경사분리시켰다. 100 mM 트리스-pH 7.4, 0.6 M 염화나트륨, 0.1 mM 아연 클로라이드, 1 mM 마그네슘 클로라이드 0.05% 아지드화나트륨, 0.25% 트윈-20, 0.2 mg/ml RNase, 4% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 0.05% 염소 IgG, 0.0008% 설포르호다민(Sulforhodamine) B 중의 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이션된 마우스 모노클로날 항-RNA:DNA 항체의 용액(큰 웰 당 1 ml)을 30% 블로킹 용액(100 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 0.05% 아지드화나트륨 중 6% 카제인)과 함께 각 웰에 첨가하였으며, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 경사분리시키고, 플레이트를 128 mM 트리스 pH 7.2; 0.6 M 염화나트륨; 0.05% 아지드화나트륨; 0.24% 트윈으로 2회 세척하고, 이후 1 ml의 128 mM 트리스 pH 7.2; 0.6 M 염화나트륨; 0.05% 아지드화나트륨; 0.24% 트윈을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 내열성 테이프로 밀봉하고, 60℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 경사분리시키고 플레이트를 128 mM 트리스 pH 7.2; 0.6 M 염화나트륨; 0.05% 아지드화나트륨으로 2회 이상 세척하였다. 플레이트를 이후 40 mM 트리스 pH 8.2, 100 mM 염화나트륨, 0.05% 아지드화나트륨으로 2회 세척하였다. 용액을 경사분리시키고, 20 ㎕의 CDP-스타(Star) 기질(Applera Corp.)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 20분 동안 인큐베이션하고, 실시예 13에 기술된 바와 같이 약 450 nm에서 마스크를 구비한 384-광도계 상에서 판독하였다.
표 17의 결과는 서브웰 플레이트에서 개개 및 다중 HPV 유형의 검출의 특이성을 나타낸 것이다. 진하게 표시된 시그널은 검출의 특이성을 나타낸 것이다. 예를 들어, HPV 16 표적은, 단지 HPV 16 프로브와 함께 존재할 때 포지티브 시그널을 제공하며, 다른 HPV 유형에 대한 프로브와 함께 존재하는 경우 시그널을 제공하지 않는다. 그러나, 다중 감염은 다중 시그널을 제공한다.
표 17: 384-서브-웰 플레이트에서 패시브(passive) 결합을 사용한 HPV 검사
Figure 112008038823062-pct00023
실시예 15
미세역가 플레이트 및 비드를 사용한 HPV 검출 방법의 비교
검출 단계가 미세역가 플레이트(화학발광에 의해 검출되는 바와 같음) 또는 루미넥스 카르복실화된 비드(형광에 의해 검출되는 바와 같음) 상에서 수행되는 본 발명의 두 개의 검정 포맷을 비교하였다.
표적 부화 및 표적 증폭 단계를 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다. 하이브리드화 및 검출을 수반하는 제3 단계를 두 개의 포맷으로 수행하였다: 하나는 실시예 6에 기술된 바와 같이 루미넥스 카르복실화된 비드 상에서 수행하였으며, 다른 하나는 실시예 14에 기술된 바와 같이 미세역가 플레이트 상에서 수행하였다.
표 18의 결과는 플레이트 검정이 9의 S/N 비율로 30분의 증폭시 500개의 투입 복사체를 검출할 수 있음을 나타낸다. 1시간의 증폭시, 플레이트 검정은 루미 넥스 포맷 보다 10배 이상 더욱 민감하다.
표 18: 비드 및 플레이트 검출 포맷을 사용한 HPV 검출
Figure 112008038823062-pct00024
실시예 16
등온 증폭의 효율에 대한 랜덤 프라이머에서의 뉴클레오티드 비율의 효과
랜덤 프라이머를 실시예 6에 기술된 방법의 표적 증폭 단계에서 뉴클레오티드의 상이한 조합 및 비율을 이용하여 화학적으로 합성하였다. 표 19의 결과는 dG 및 T가 효과적인 증폭을 달성하는데 중요한 역할을 함을 나타낸다. dA의 생략은 보다 덜 표명된 효과를 가지며, dC의 생략은 전혀 효과를 가지지 않는다. 등온 증폭을 2시간 동안 오량체 프라이머와 함께 수행하였다. 완전 검정을 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다. 상대적 효율을 잡음에 대한 시그널로서 계산하였으며, 여기서 표준 프라이머 조성물의 효율은 (1.0)이었다.
표 19: 랜덤 프라이머의 조성에 따른 표적 검출의 상대적 효율
Figure 112008038823062-pct00025
실시예 17
마이크로칩 어레이 상에서 HPV 검사
마이크로칩 어레이 포맷 상에서 HPV 유형, 개개 및 다중 유형의 HPV의 검출을 수행하였다. 표적 핵산 포획 및 증폭을 실시예 6에 따라 수행하였다. 시약 및 세척 프로토콜을 세척 슬라이드, 막, 칩 등에 대한 시판되는 제품 및 설명서에 따라 수행하였다. 표적 검출 단계는 실시예 6에 따라 RNA 프로브, 또는 시그널 서열 프로브, 또는 둘 모두에 대한 표적 변성 및 하이브리드화를 포함한다.
본 실시예에서, 서열 특이적 포획 서열 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 표적의 하이브리드화는 실시예 6에 기술된 바와 같이, 비드 상에서가 아닌 스포팅된(spotted) 올리고뉴클레오티드 어레이 상에서 일어난다. 용어 "스포팅 된(spotted) 어레이"는 고체 지지체의 표면에 2차원적 일련의 성분을 언급하는 것으로, 여기서 각 성분은 특정 위치에 증착된 올리고뉴클레오티드의 분취액이다. 이러한 포맷에 대한 고체 지지체는 유리 슬라이드, 나일론막, 또는 마이크로칩(유리 또는 실리콘)을 포함한다. 또다른 예 및 설명은 문헌["Microarrays And Cancer Research" Ed. J. Warrington, Eaton Publishing, 2002]에서 확인된다.
5'-C12-아미노 링커로 개질된 유형-특이적 포획 서열 올리고뉴클레오티드 프로브(각 HPV 유형 당 두 개의 올리고뉴클레오티드)를 고체 지지체, 예를 들어 마이크로어레이에 스포팅하고, 각 스폿(spot)은 특정 HPV 유형에 상응한다. 올리고뉴클레오티드를, 예를 들어 1차 아미노기를 통해 부착시켰다. 고체 지지체는 실온에서 10분 동안, 2X SSC(염화나트륨 및 시트르산 나트륨) 완충액으로 평형을 유지한 후, 이후 사전-하이브리드화 완충액(2X SSC/0.05% 블로킹 시약/5% 덱스트란 설페이트/0.1% SDS)에서 1 ml 당 50 마이크로그램의 변성된 연어 정자 DNA와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션되었다. 이후 하이브리드화를 동일한 사전-하이브리드화 완충액에서 증폭된 표적 핵산 및 RNA 시그널 서열 프로브를 첨가하면서 수행하였다. 표적 핵산, RNA 시그널 서열 프로브, 및 유형-특이적 포획 서열 올리고뉴클레오티드 프로브의 하이브리드화는 재하이브리드화 용액에서 3시간 동안 진탕시키면서 37%로 인큐베이션하는 동안 발생한다.
암플리콘을 함유한 스폿의 검출을 두 가지 방식으로 수행할 수 있다: a) Cy-형광 염료로 표지된 하이브리드 포획 항체(HC-Ab)를 사용하고, 이후 시판되는 스캐너를 이용하여 스캔; 또는 b) 알칼리 포스파타아제 표지된 HC-Ab를 사용하고 이후 기질(예를 들어, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트 및 니트로블루 테트라졸륨: NBT/BCIP)을 침전시키는 후속 적용. 후자의 경우에서, 시그널은 기기적 도움없이 검출가능하다.
다양한 구체예의 상기 설명들은 예시 및 설명을 목적으로 기술된 것이다. 이는 모두 규명되거나 기술된 정확한 형태로 제한되도록 의도되지 않는다. 상기 교시에 비추어 자명한 개질 또는 변형이 가능하다. 논의된 구체예는 예시 및 이의 실제적 적용을 제공하고 이에 따라 당업자가 고려되는 특정 용도에 적합하도록 다양한 개질 및 다양한 구체예를 이용할 수 있도록 선택되고 기술되었다. 이러한 모든 개질 및 변형은 명료하고, 합법적으로, 및 공정하게 권리를 받게 되는 범위에 따라 해석되는 경우 첨부된 청구항에 의해 결정된 시스템 내에 존재한다.
SEQUENCE LISTING <110> Nazarenko, Irina Lorincz, Attila Eder, Paul Lowe, Brian Mallonee, Richard Thai, Ha <120> DETECTION OF NUCLEIC ACIDS BY TARGET-SPECIFIC HYBRID CAPTURE METHOD <130> 2629-4066 <140> TBD <141> 2005-11-07 <150> US 11/005,617 <151> 2004-12-06 <150> US 10/971,251 <151> 2004-10-20 <150> US 09/594,839 <151> 2000-06-15 <160> 129 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 1 gtacagatgg taccggggtt gtagaagtat ctg 33 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 2 ctgcaacaag acatacatcg accggtccac c 31 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 3 gaagtaggtg aggctgcatg tgaagtggta g 31 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 4 cagctctgtg cataactgtg gtaactttct ggg 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 5 gaggtcttct ccaacatgct atgcaacgtc ctg 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 6 gtgtaggtgc atgctctata ggtacatcag gcc 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 7 caatgccgag cttagttcat gcaatttccg agg 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> HPV 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30 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 20 ttattattac ggaatttcat tttggggctc t 31 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 21 gctcgaaggt cgtctgctga gctttctact act 33 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 22 gcgccatcct gtaatgcact tttccacaaa gc 32 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 23 tagtgctagg tgtagtggac gcaggaggtg g 31 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 24 ggtcacaaca tgtattacac tgccctcggt ac 32 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 25 cctacgtctg cgaagtcttt cttgccgtgc c 31 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> HPV <400> 26 ctgcattgtc actactatcc ccaccactac tttg 34 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 27 ccacaaggca cattcataca tacacgcacg ca 32 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 28 gttctaaggt cctctgccga gctctctact gta 33 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> HPV <400> 29 ttattattat gcggttttgg gggtcgacgt ggaggc 36 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> HPV <400> 30 ttattattaa gacctgcccc ctaagggtac atagcc 36 <210> 31 <211> 49 <212> DNA <213> HPV 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ccc 33 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 43 ccacctcctg cgtccactac acctagcact a 31 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 44 tgcgtgcgtg tatgtatgaa tgtgccttgt gg 32 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> HPV <400> 45 aattagcgca ttgccccgtc caacgtcccg 30 <210> 46 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 46 cgccgtgcac gtgtagccac catatttaat cac 33 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 47 cgaattgtgt gaggtgctgg aagaatcggt gc 32 <210> 48 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 48 gatcgttcac aacttttacc tgcaccggat cc 32 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 49 ctaggttctc tagatgtttg tctccagcac ccc 33 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 50 ctgtcggtat tgtctgtgtc gctgatgtgt g 31 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 51 gatacacaca catttgcagc ccggtccaca ca 32 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> HPV <400> 52 ggtggcaaag gacgtatgtg agtgcagagg ac 32 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> HPV <400> 53 gcgttgcgga ggggtatgat agttgctcag aag 33 <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> HPV <400> 54 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actccaacga cgcaga 16 <210> 66 <211> 17 <212> DNA <213> HPV <400> 66 ttttgtggtt ctgtgtg 17 <210> 67 <211> 14 <212> DNA <213> HPV <400> 67 ttatgtggtt gcgc 14 <210> 68 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 68 cgttgttgat cgtgc 15 <210> 69 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 69 tgcaaacccg tgtag 15 <210> 70 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 70 cagacaacga taaccg 16 <210> 71 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 71 accaccacaa gcagc 15 <210> 72 <211> 17 <212> DNA <213> HPV <400> 72 gtcctgttgt aaatgtg 17 <210> 73 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 73 aggcgacact acgtc 15 <210> 74 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 74 cgagctcccc tacaa 15 <210> 75 <211> 13 <212> DNA <213> HPV <400> 75 ccccaccaag cga 13 <210> 76 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 76 cctcacggga tactc 15 <210> 77 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 77 tgcgacaact acagc 15 <210> 78 <211> 14 <212> DNA <213> HPV <400> 78 ggattcgggc acta 14 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> HPV <400> 79 catataacac aggctcac 18 <210> 80 <211> 18 <212> DNA <213> HPV <400> 80 tagtgctagg tgtagtgg 18 <210> 81 <211> 13 <212> DNA <213> HPV <400> 81 acgcaggagg tgg 13 <210> 82 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 82 tacatacacg cacgca 16 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 83 ccacaaggca cattca 16 <210> 84 <211> 17 <212> DNA <213> HPV <400> 84 gctacacgtg cacggcg 17 <210> 85 <211> 17 <212> DNA <213> HPV <400> 85 gtgattaaat atggtgg 17 <210> 86 <211> 13 <212> DNA <213> HPV <400> 86 gggacgttgg acg 13 <210> 87 <211> 14 <212> DNA <213> HPV <400> 87 ggcaatgcgc taat 14 <210> 88 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 88 caccgattct tccag 15 <210> 89 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 89 cacctcacac aattcg 16 <210> 90 <211> 13 <212> DNA <213> HPV <400> 90 ggatccggtg cag 13 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> HPV <400> 91 gtaaaagttg tgaacgatc 19 <210> 92 <211> 14 <212> DNA <213> HPV <400> 92 ggtgctggag acaa 14 <210> 93 <211> 17 <212> DNA <213> HPV <400> 93 acatctagag aacctag 17 <210> 94 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 94 cacacatcag cgaca 15 <210> 95 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 95 cagacaatac cgacag 16 <210> 96 <211> 13 <212> DNA <213> HPV <400> 96 tgtgtggacc ggg 13 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> HPV <400> 97 ctgcaaatgt gtgtgtat 18 <210> 98 <211> 17 <212> DNA <213> HPV <400> 98 gtcctctgca ctcacat 17 <210> 99 <211> 14 <212> DNA <213> HPV <400> 99 acgtcctttg ccac 14 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> HPV <400> 100 ttctgagcaa ctatcatac 19 <210> 101 <211> 12 <212> DNA <213> HPV <400> 101 ccctccgcaa cg 12 <210> 102 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 102 ccccatcttg tttcc 15 <210> 103 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 103 tcctacacgc ctagac 16 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> HPV <400> 104 tatagagaac tgctgtgttc 20 <210> 105 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 105 gaaatagcgc cattg 15 <210> 106 <211> 14 <212> DNA <213> HPV <400> 106 ctcaggggca acca 14 <210> 107 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 107 atccataggg tccgac 16 <210> 108 <211> 11 <212> DNA <213> HPV <400> 108 caatgcggcg c 11 <210> 109 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 109 tataaacgag gtgcag 16 <210> 110 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 110 gaaaatgccc tgcta 15 <210> 111 <211> 12 <212> DNA <213> HPV <400> 111 acatgcgcca gg 12 <210> 112 <211> 19 <212> DNA <213> HPV <400> 112 gagtaatgtg gtgtgtatg 19 <210> 113 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 113 gcaaggcata ctgtg 15 <210> 114 <211> 15 <212> DNA <213> HPV <400> 114 cactgacact tcgtg 15 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> HPV <400> 115 ggacaatcac cagtatta 18 <210> 116 <211> 18 <212> DNA <213> HPV <400> 116 agtttgtgaa gtacatgg 18 <210> 117 <211> 12 <212> DNA <213> HPV <400> 117 cgggtgatgg cc 12 <210> 118 <211> 18 <212> DNA <213> HPV <400> 118 ccacttgtac tgtgtagg 18 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> HPV <400> 119 ctgtgtttaa ctatgggt 18 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> HPV <400> 120 tacaacagta tgtgtcagac 20 <210> 121 <211> 16 <212> DNA <213> HPV <400> 121 aagacaggga gacagc 16 <210> 122 <211> 19 <212> DNA <213> HPV <400> 122 cttataaaca atacacagg 19 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> HPV <400> 123 atgcactata gtaacacacc 20 <210> 124 <211> 19 <212> DNA <213> HPV <400> 124 actccatttt agtgctgta 19 <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> HPV <400> 125 tcaggaccca caggagcgac ccag 24 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 126 gcaccaaaag agaactgcaa tgt 23 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Synthetic primer <400> 127 catatacctc acgtcgcagt aact 24 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> HPV <400> 128 tattttatat gacacaatgt 20 <210> 129 <211> 30 <212> DNA <213> HPV <400> 129 ggtttgtgct aacaataaat gtatccatag 30

Claims (24)

  1. a) 표적(target) 핵산과 표적 핵산의 일부에 상보적인 핵산 프로브를 혼합시킨 샘플을 고체 지지체 상에 고정화시켜 표적 핵산을 포획하는 단계에 있어서, 상기 표적 핵산이 DNA이면 핵산 프로브는 RNA이며, 상기 표적 핵산이 RNA이면 핵산 프로브는 DNA이며, 고체 지지체 상에 고정화되지 않은 표적 핵산과 핵산 프로브는 제거함을 특징으로 하는 표적 핵산의 포획 단계;
    b) 증폭된 표적을 형성하기 위해 상기 단계 a)로부터 수득된 핵산 또는 핵산 프로브를 증폭시키는 단계; 및
    c) 상기 증폭된 표적; 증폭된 표적의 일부분에 혼성화되는 선택 가능한 올리고뉴클레오티드; 및 증폭된 표적의 또다른 일부에 상보적인 핵산 프로브를 혼합시켜 DNA:RNA 하이브리드 올리고뉴클레오티드 복합체를 형성함으로써 증폭된 표적으로부터 표적 핵산을 검출하는 단계에 있어서, 상기 표적 핵산이 DNA이면 핵산 프로브는 RNA이며, 상기 표적 핵산이 RNA이면 핵산 프로브는 DNA임을 특징으로 하는 표적 핵산의 검출 단계;
    로 이루어진 표적 핵산을 검출하는 방법에 있어서,
    상기 DNA:RNA 하이브리드는 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제에 의해 검출가능하고, 올리고뉴클레오티드 복합체 분리에 의해 선별 가능하며 이에 따라 표적 핵산을 검출시킴을 특징으로 하는 표적 핵산의 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 표적 핵산의 포획 단계는 고체 지지체에 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제에 컨쥬게이션시켜 표적 핵산을 고체 지지체로 포획시킴을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제는 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단백질, 비활성 RNase H, 핵산, 핵산 아프타머(aptamer) 또는 삼중 구조를 형성하기 위해 DNA:RNA 하이브리드에 결합된 올리고뉴클레오티드에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제는 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제는 표적 핵산에 상보적인 핵산 프로브임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제는 검출 가능하게 표지됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 표지는 비색법, 화학발광, 형광 또는 빛-산란 방법에 의해 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 포획된 표적 핵산 또는 핵산 프로브는 등온 증폭에 의해 증폭됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 등온 증폭은 DNA 중합효소를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 등온 증폭은 랜덤 프라이머를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 랜덤 프라이머는 오량체임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 랜덤 프라이머는 질병 특이적인 프라이머 서열의 서브세트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 선택 가능한 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 플레이트, 마이크로플레이트, 미세역가 플레이트, 슬라이드, 접시, 비드, 입자, 마이크로입자, 컵, 가닥, 칩, 마이크로칩, 스트립, 막, 마이크로어레이 또는 테스트 튜브에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 고체 지지체의 재질은 유리, 실리콘, 플라스틱, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리카르보네이트에서 선택된 1종 이상의 재질임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 고체 지지체의 표면은 카르복실 그룹, 아미노 그룹, 히드라지드 그룹, 알데히드 그룹, 핵산 유도체, 뉴클레오티드 유도체, 일차 아미노 그룹 또는 염료로 개질(modification)된 것임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 블로커(blocker) 프로브를 첨가하는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. a) 표적 핵산과 표적 핵산의 일부에 상보적인 핵산 프로브를 혼성화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는 단계;
    b) 상기 DNA:RNA 하이브리드를 고체 지지체에 컨쥬게이션된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체로 포획하는 단계;
    c) 결합되지 않은 표적 핵산을 DNA:RNA 하이브리드로부터 분리시키는 단계;
    d) 증폭된 표적을 형성하기 위해 포획된 표적 핵산 또는 핵산 프로브를 랜덤 프라이머와 DNA 중합효소를 이용하여 증폭시키는 단계;
    e) 증폭된 표적의 일부분에 상보적인 핵산 프로브를 혼성화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는 단계;
    f) 선택 가능한 고체 지지체에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드를 증폭된 표적의 또다른 일부에 혼성화시키는 단계;
    g) 선택 가능한 고체 지지체에 의해 증폭된 표적을 선별하는 단계; 및
    h) DNA:RNA 하이브리드-특이적 결합제를 DNA:RNA 하이브리드에 결합시켜 증폭된 표적을 검출하고, 이 때 암플리콘의 존재는 표적 핵산의 존재를 나타내는 지표로 사용하는 증폭된 표적의 검출 단계;
    로 이루어진 다수의 표적 핵산 각각의 검출 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된 고체 지지체는 식별 가능한 비드임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 식별 가능한 비드는 형광 표지, 금 표지 또는 효소 표지에서 선택된 식별 가능한 표지를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. a) 표적 DNA를 표적 DNA의 일부에 상보적인 RNA 프로브에 혼성화시켜 DNA:RNA 하이브리드를 형성하는 단계;
    b) DNA:RNA 하이브리드를 비드에 컨쥬게이션된 DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체로 포획하는 단계;
    c) 표적 DNA를 형성하기 위해 결합되지 않은 핵산을 DNA:RNA 하이브리드로부터 분리시키는 단계;
    d) 증폭된 표적 DNA를 형성하기 위해 표적 DNA를 랜덤 프라이머 및 DNA 중합효소를 이용하여 증폭시키는 단계;
    e) DNA:RNA 하이브리드를 형성하기 위해 증폭된 표적 DNA의 일부분에 상보적인 RNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
    f) DNA 올리고뉴클레오티드를 표적 DNA의 또다른 일부에 혼성화시키는 단계에서 DNA 올리고뉴클레오티드는 선택 가능한 비드에 컨쥬게이션시킴을 포함하는 혼성화시키는 단계; 및
    g) DNA:RNA 하이브리드-특이적 항체를 DNA:RNA 하이브리드에 결합시키고 선택 가능한 특정 비드를 근거로 증폭된 표적을 각각 선별함으로써 증폭된 표적 DNA를 검출하는 단계;
    로 이루어진 다수의 표적 DNA의 멀티플렉스 검출 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산의 일부에 상보적인 핵산 프로브 및 올리고뉴클레오티드 서열은 하기로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112013067674749-pct00036
    Figure 112013067674749-pct00037
    Figure 112013067674749-pct00038
    Figure 112013067674749-pct00039
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