ES2918375T3

ES2918375T3 - Tratamientos contra el cáncer usando combinaciones de inhibidores de la ruta de PI3K/Akt y ERK

Info

Publication number: ES2918375T3
Application number: ES14871139T
Authority: ES
Inventors: Saurabh Saha; Dean Welsch; Gary Decrescenzo; Jeffrey James Roix
Original assignee: Biomed Valley Discoveries Inc
Current assignee: Biomed Valley Discoveries Inc
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: EP4062917A1; JP2017502014A; US20160317517A1; JP6727127B2; WO2015095829A1; EP3082957B1; AU2014368916A1; AU2014368916B2; EP3082957A1; EP3082957A4; US11007183B2

Abstract

La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos, kits y composiciones para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Este método incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor del PI3K /Vía Akt o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. También se proporcionan métodos para tratar o mejorar los efectos de un sujeto con cáncer en el que el sujeto tiene una KRAS somática y una mutación somática PIK3CA o en la que el cáncer es refractario a una terapia seleccionada de la terapia con inhibidores de la RAF, la terapia con inhibidores de MEK y la RAF y terapia con inhibidores de MEK. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamientos contra el cáncer usando combinaciones de inhibidores de la ruta de PI3K/Akt y ERK

Campo de la invención

La presente invención proporciona, entre otros, métodos, kits y composiciones farmacéuticas para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto usando un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Antecedentes de la invención

Se observan mutaciones que afectan a las rutas de señalización de MAPK y PI3K/Akt a altas frecuencias en una variedad de cánceres. Los inhibidores farmacológicos que seleccionan como diana componentes de la ruta de señalización de MAPK muestran eficacia clínica en muchos cánceres, particularmente aquellos que llevan mutaciones en la proteína quinasa BRAF. Tanto inhibidores de RAF como de MEK quinasa están aprobados para su uso como agente individual en melanoma metastásico avanzado mutante para BRAF, y la combinación de dabrafenib y trametinib está sometiéndose actualmente a revisión por la Food and Drug Administration (FDA) para esta indicación. Además, recientemente se ha sugerido que la combinación de un inhibidor de MEK y un inhibidor de PI3K puede ser eficaz en la terapia contra el cáncer (Hoeflich (2012), Cancer Res 72(1):210-9; Britten (2013), Cancer Chemother Pharmacol 71(6):1395-409; Sheppard (2013), Eur J Cancer 49(18):3936-44; y documento WO2013152165. Además, se han sintetizado y propuesto inhibidores de la proteína quinasa ERK, entre otros, como agentes anticancerígenos (documento WO2005113541).

Como con otras terapias dirigidas, los patrones de respuesta de la enfermedad a los inhibidores de la ruta de MAPK y de PI3K/Akt parecen estar influidos por la heterogeneidad genética intrínseca presente en los cánceres donde se usan los fármacos. Por ejemplo, ciertas alteraciones genéticas, incluyendo PTEN y otros cambios que activan la ruta de señalización del crecimiento celular de PI3K, pueden predecir una respuesta inicial deficiente, y/o una progresión relativamente rápida, en melanoma mutante para BRAF tratado con el inhibidor de RAF vemurafenib. Asimismo, parecen surgir mutaciones directas en los loci génicos de MEK en tumores que han progresado después del tratamiento farmacológico para BRAF, MEK o combinado. Varios ejemplos adicionales, a partir de la amplificación de los genes de RAS y RAF y mutaciones de corte y empalme, sugieren que se produce resistencia a fármacos adquirida cuando la pleiotropía oncogénica encuentra la presión selectiva del tratamiento farmacológico dirigido.

En particular, varios cánceres tratados que llevan mutaciones que afectan a la ruta de señalización de MAPK desarrollan lesiones adicionales, nacientes que afectan a la ruta de PI3K. Por ejemplo, las mutaciones activadoras de PIK3CA son una fuente frecuente de resistencia adquirida en estos cánceres. En este caso, inhibidores mecanísticamente distintos que seleccionan como diana solo la ruta de MAPK no son suficientes para una terapia eficaz.

En vista de las limitaciones anteriores, se necesitan agentes y terapias dirigidos novedosos para tratar tales cánceres. La presente invención está dirigida a satisfacer estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

En consecuencia, la invención se refiere a un primer agente anticancerígeno (i), que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo agente anticancerígeno (ii), que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto.

La invención se refiere además a un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Además, la invención también se refiere a una composición que comprende BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto.

Además, la invención se refiere a una composición que comprende un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto.

En el presente documento, se da a conocer además un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

También se da a conocer un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. En una realización de la invención, va a administrarse una cantidad eficaz de (i) BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) pictilisib (GDC-0941) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Una realización adicional de la presente invención es un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El kit comprende una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetado junto con instrucciones para su uso.

En el presente documento, se da a conocer además un método para tratar o mejorar los efectos de un sujeto con cáncer. El método comprende:

(a) identificar un sujeto con cáncer que tiene una mutación somática de KRAS y una mutación somática de PIK3CA; y

(b) administrar al sujeto con mutaciones somáticas de KRAS y PIK3CA una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

También se da a conocer un método para tratar o mejorar los efectos de un sujeto con cáncer. El método comprende:

(a) identificar un sujeto con cáncer que es refractario a una terapia seleccionada del grupo que consiste en terapia con inhibidor de RAF, terapia con inhibidor de MEK y terapia con inhibidores de RAF y MEK; y

(b) administrar al sujeto identificado en la etapa (a) una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Otra realización de la presente invención es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. La composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración de los agentes anticancerígenos primer y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

Una realización adicional de la presente invención es un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas. El método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra los tiempos individuales hasta el criterio de valoración para ratones tratados con diversas dosis de un inhibidor de PI3K (GDC-0941), un inhibidor de ERK (BVD-523), o una combinación de los dos en el estudio in vivo. El número entre paréntesis indica la dosis en mg/kg.

La figura 2A es un gráfico lineal que muestra el crecimiento tumoral medio en ratones tratados con diversas dosis de GDC-0941, BVD-523, o una combinación de los dos en el estudio in vivo. La figura 2B es un gráfico de Kaplan-Meier para el estudio in vivo. El número entre paréntesis indica la dosis en mg/kg.

La figura 3 es un gráfico lineal que muestra los porcentajes de cambio en el peso corporal medio (BW) desde el día 1 en el estudio in vivo.

La figura 4 muestra que tanto la fosforilación directa del sustrato de ERK como rutas efectoras conocidas se modulan después del tratamiento agudo y prolongado con BVD-523 in vitro. Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western usando una variedad de anticuerpos para detectar cambios en lisados de células completas de líneas de cáncer expuestas a BVD-523. En la línea celular mutante de BRAF A375 (una línea celular de melanoma humano) y en la línea celular muíante de KRAS HCT116 (una línea celular de carcinoma colorrectal humano), la fosforilación de residuos dependiente de ERK (T359/S363) en las proteínas RSK 1 y 2 se redujo después de 4 horas de tratamiento con BVD-523 a concentraciones micromolares. Después de 24 horas de tratamiento, se mantuvo la inhibición directa del sustrato en líneas celulares mutantes de BRAF, y la fosfatasa de retroalimentación de MAPK DUSP6 se redujo enormemente, lo que sugiere una inhibición duradera y casi completa de la ruta de MAPK. Por último, coherente con los efectos citostáticos de BVD-523 en múltiples antecedentes de líneas celulares, el efector de MAPK y el gen determinante del ciclo celular de G1/S ciclina-D1 se redujeron enormemente después de 24 horas de tratamiento. En la línea celular A375, mientras que el efector de la apoptosis y el sustrato de ERK Bim-EL aumentaron después de un tratamiento prolongado, no se observó aumento de la apoptosis, coherente con una falta de escisión de PARP, así como otras observaciones (no mostradas) de que factores adicionales influyen en la capacidad de BVD-523 para inducir la muerte celular.

La figura 5 muestra un esquema de la ruta de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

La figura 6 muestra los resultados de ensayos de proliferación de agente individual en células isogénicas HCT116 en 5A de McCoy que contiene o bien FBS al 10 % o bien FBS despojado de carbón al 1 % (CS-FBS). Los resultados de proliferación se muestran para el tratamiento con BYL719 (figura 6A), BKM120 (figura 6^b), INK128 (figura 6C), PF-004691502 (figura 6D), BVD-523 (figura 6E), SCH772984 (figura 6F), paclitaxel (figura 6G) y GDC-0941 (figura 6H).

La figura 7 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y BYL719 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 7A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 7B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 7A y la figura 7C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 7A. La figura 7D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 7E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 7D y la figura 7F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 7D. La figura 7G - figura 7H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 7A. La figura 7I - figura 7J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 7D.

La figura 8 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y BYL719 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 8A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 8B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 8A y la figura 8C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 8A. La figura 8D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 8E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 8D y la figura 8F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 8D. La figura 8G - figura 8H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 8A. La figura 8I - figura 8J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 8D.

La figura 9 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y BKM120 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 9A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 9B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 9A y la figura 9C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 9A. La figura 9D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 9E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 9D y la figura 9F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 9D. La figura 9G - figura 9H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 9A. La figura 9I - figura 9J muestra los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 9D.

La figura 10 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y BKM120 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 10A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 10B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 10A y la figura 10C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 10A. La figura 10D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 10E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 10D y la figura 10F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 10D. La figura 10G - figura 10H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 10A. La figura 10I - figura 10J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 10D.

La figura 11 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 e INK128 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 11A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 11B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 11A y la figura 11C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 11A. La figura 11D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 11E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 11D y la figura 11F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 11D. La figura 11G - figura 11H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 11A. La figura 11I - figura 11J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 11D.

La figura 12 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 e INK128 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 12A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 12B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 12A y la figura 12C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 12A. La figura 12D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 12E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 12D y la figura 12F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 12D. La figura 12G - figura 12H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 12A. La figura 12I - figura 12J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 12D.

La figura 13 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y PF-004691502 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 13A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 13B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 13A y la figura 13C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 13A. La figura 13D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 13E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 13D y la figura 13F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 13D. La figura 13G - figura 13H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 13A. La figura 13I - figura 13J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 13D.

La figura 14 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y PF-004691502 en células HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. La figura 14A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 parentales. La figura 14B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 14A y la figura 14C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 14A. La figura 14D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 14E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 14D y la figura 14F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 14D. La figura 14G - figura 14H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 14A. La figura 14I - figura 14J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 14D.

La figura 15 muestra una comparación de respuestas de proliferación de agente individual en HCT116 PIK3CA (+/-) y HCT116 parentales. Los resultados de proliferación se muestran para el tratamiento con BYL719 (figura 15A), BKM120 (figura 15B), INK128 (figura 15C), PF-004691502 (figura 15D), BVD-523 (figura 15E) y SCH772984 (figura 15F).

La figura 16 muestra los resultados de ensayos de combinación de concentración enfocada en el par de líneas celulares isogénicas HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 16A muestra la viabilidad y las puntuaciones de Bliss para combinaciones con BVD-523 en células HCT116 parentales. La figura 16B muestra la viabilidad y las puntuaciones de Bliss para combinaciones con BVD-523 en células HCT116 PIK3CA (+/-). La figura 16C muestra la viabilidad y las puntuaciones de Bliss para combinaciones con SCH772984 en células HCT116 parentales. La figura 16D muestra la viabilidad y las puntuaciones de Bliss para combinaciones con SCH772984 en células HCT116 PIK3CA (+/-).

La figura 17 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y BYL719 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 17A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 17B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 17A y la figura 17C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 17A. La figura 17D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 17E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 17D y la figura 17F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 17D. La figura 17G - figura 17H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 17A. La figura 17I - figura 17J muestra los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 17D.

La figura 18 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y BYL719 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 18A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 18B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 18A y la figura 18C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 18A. La figura 18D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 18E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 18D y la figura 18F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 18D. La figura 18G - figura 18H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 18A. La figura 18I - figura 18J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 18D.

La figura 19 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y BKM120 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 19A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 19B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 19A y la figura 19C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 19A. La figura 19D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 19E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 19D y la figura 19F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 19D. La figura 19G - figura 19H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 19A. La figura 19I - figura 19J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 19D.

La figura 20 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y BKM120 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 20A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 20B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 20A y la figura 20C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 20A. La figura 20D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 20E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 20D y la figura 20F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 20D. La figura 20G - figura 20H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 20A. La figura 20I - figura 20J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 20D.

La figura 21 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 e INK128 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 21A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 21B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 21A y la figura 21C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 21A. La figura 21D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 21E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 21D y la figura 21F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 21D. La figura 21G - figura 21H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 21A. La figura 211 - figura 21J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 21D.

La figura 22 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 e INK128 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 22A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 22B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 22A y la figura 22C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 22A. La figura 22D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 22E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 22D y la figura 22F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 22D. La figura 22G - figura 22H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 22A. La figura 22I - figura 22J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 22D.

La figura 23 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y PF-004691502 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 23A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 23B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 23A y la figura 23C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 23A. La figura 23D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 23E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 23D y la figura 23F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 23D. La figura 23G - figura 23H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 23A. La figura 23I - figura 23J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 23D.

La figura 24 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y PF-004691502 en células DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. La figura 24A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 parentales. La figura 24B muestra el exceso de Loewe para la combinación en 24A y la figura 24C muestra el exceso de Bliss para la combinación en 24A. La figura 24D muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células DLD-1 PIK3CA (+/-). La figura 24E muestra el exceso de Loewe para la combinación en 24D y la figura 24F muestra el exceso de Bliss para la combinación en 24D. La figura 24G - figura 24H muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 24A. La figura 24I - figura 24J muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 24D.

La figura 25 muestra una comparación de respuestas de proliferación de agente individual en DLD-1 PIK3CA (+/-) y DLD-1 parentales. Los resultados de proliferación se muestran para el tratamiento con BYL719 (figura 25A), BKM120 (figura 25B), INK128 (figura 25C), PF-004691502 (figura 25D), BVD-523 (figura 25E) y SCH772984 (figura 25F).

La figura 26A muestra volúmenes de Loewe para las combinaciones sometidas a prueba. La figura 26B muestra los volúmenes Bliss para las combinaciones probadas. La figura 26C muestra puntuaciones de sinergia para las combinaciones sometidas a prueba.

La figura 27 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y SCH772984. La figura 27A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A375. La figura 27B - figura 27C muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 27A. La figura 27D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 27A y la figura 27E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 27A.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento, se da a conocer un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Como se usan en el presente documento, los términos “tratar”, “que trata”, “tratamiento” y variaciones gramaticales de los mismos significan someter a un individuo a un protocolo, régimen, proceso o remedio, en el que se desea obtener un resultado o una respuesta fisiológica en ese sujeto, por ejemplo, un paciente. En particular, los métodos y composiciones de la presente invención pueden usarse para ralentizar el desarrollo de síntomas de la enfermedad o retrasar la aparición de la enfermedad o afección, o detener la progresión del desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, debido a que cada sujeto tratado puede no responder a un protocolo, régimen, proceso o remedio de tratamiento particular, el tratamiento no requiere que se logre el resultado o la respuesta fisiológica deseados en todos y cada uno de los sujetos o la población de sujetos, por ejemplo, población de pacientes. En consecuencia, un sujeto o población de sujetos dada, por ejemplo, población de pacientes, puede no responder o responder inadecuadamente al tratamiento.

Como se usa en el presente documento, los términos “mejorar”, “que mejora” y variaciones gramaticales de los mismos significan disminuir la gravedad de los síntomas de una enfermedad en un sujeto.

Como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un mamífero, preferiblemente, un ser humano. Además de los seres humanos, que es un mamífero preferido en la presente invención, otras categorías de mamíferos dentro del alcance de la presente invención incluyen, por ejemplo, animales de granja, animales domésticos, animales de laboratorio, etc. Algunos ejemplos de animales de granja incluyen vacas, cerdos, caballos, cabras, etc. Algunos ejemplos de animales domésticos incluyen perros, gatos, etc. Algunos ejemplos de animales de laboratorio incluyen primates, ratas, ratones, conejos, cobayas, etc.

En la presente invención, los cánceres incluyen cánceres tanto sólidos como hematológicos. Los ejemplos no limitantes de cánceres sólidos incluyen carcinoma suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vejiga, cáncer de huesos (tal como osteosarcoma), cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer carcinoide, carcinoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer esofágico, cáncer de conducto biliar extrahepático, familia de cánceres de Ewing, cáncer de células germinales extracraneales, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hipofaríngeo, carcinoma de células de islotes, cáncer de riñón, cáncer de intestino grueso, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de labios y de la cavidad bucal, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, mesotelioma maligno, carcinoma de células de Merkel, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer epitelial de ovario, cáncer de células germinales de ovario, cáncer pancreático, cáncer de seno paranasal y de cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer de hipófisis, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sezary, cánceres de piel (tales como linfoma cutáneo de células T, sarcoma de Kaposi, tumor de mastocitos y melanoma), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar y tumor de Wilms.

Los ejemplos de tumores/cánceres hematológicos incluyen, pero no se limitan a, leucemias, tales como leucemia linfoblástica aguda de adultos/infantil, leucemia mieloide aguda de adultos/infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica y tricoleucemia, linfomas, tal como linfoma relacionado con el SIDA, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin de adultos/infantil, micosis fungoide, linfoma no Hodgkin de adultos/infantil, linfoma primario del sistema nervioso central, síndrome de Sezary, linfoma cutáneo de células T y macroglobulinemia de Waldenstrom, así como otros trastornos proliferativos tales como trastornos mieloproliferativos crónicos, histiocitosis de células de Langerhans, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndromes mielodisplásicos y neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas.

Preferiblemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un cáncer del intestino grueso, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer pancreático, cánceres de endometrio, cáncer de estómago, cáncer de pulmón y leucemia. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de colon.

En la presente invención, BVD-523 corresponde a un compuesto según la fórmula (I):

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. BVD-523 puede sintetizarse según los métodos dados a conocer, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.354.939. También se contemplan enantiómeros y mezclas racémicas de ambos enantiómeros de BVD-523 dentro del alcance de la presente invención. BVD-523 es un inhibidor de ERK1/2 con un mecanismo de acción que se cree que es, por ejemplo, único y distinto de ciertos otros inhibidores de ERK1/2, tales como SCH772984. Por ejemplo, otros inhibidores de ERK1/2, tales como SCH772984, inhiben la autofosforilación de ERK (Morris et al., 2013), mientras que BVD-523 permite la autofosforilación de ERK mientras todavía inhibe ERK. (Véase, por ejemplo, la figura 4).

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor” de la ruta de PI3K/Akt es cualquier sustancia que disminuya la expresión o la actividad de fosfatidilinositol-3 quinasas (PI3K) o proteínas aguas abajo, tales como Akt. Las PI3K, cuando se activan, fosforilan el grupo 3'-OH del anillo de inositol en fosfolípidos de inositol generando el segundo mensajero fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato (PI-3,4,5-P(3)). Akt interacciona con estos fosfolípidos, haciendo que se transloquen a la membrana interna, donde se fosforila y se activa. La Akt activada modula la función de numerosos sustratos implicados en la regulación de la supervivencia celular, la progresión del ciclo celular y el crecimiento celular.

Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la ruta de PI3K/Akt según la presente invención incluyen A-674563 (n.° CAS 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, CA), AS-041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilentiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluoro-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetileno)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), AT7867 (n.° CAS 857531-00-1), serie de bencimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.° CAS 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.° CAS 612847-09-3, n.° CAS 681281-88-9, n.° CAS 75747-14-7, n.° CAS 925681-41-0, n.° CAS 98510 80-6, CCT128930 (n.° CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.° CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, Reino Unido), FPA 124 (n.° CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (n.° CAS 937174-76-0), H-89 (n.° CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, Reino Unido), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (n.° CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.° CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.° CAS 105637-50-1), clorhidrato de naltrindol, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.° CAS 1191951-57-1), inhibidor de PI3 quinasa delta, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ), inhibidores de PI3 quinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa delta, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 quinasa delta 2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 quinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), pictilisib (GDC-0941) (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (n.° CAS 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidrocurcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el inhibidor de la ruta de PI3K/Akt es pictilisib (GDC-0941) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un aspecto de esta realización, el sujeto con cáncer tiene una mutación somática de KRAS o es refractario al tratamiento con inhibidor de la ruta de MAPK. En otro aspecto de esta realización, el sujeto con cáncer tiene una mutación somática de KRAS y una mutación somática de PIK3CA.

Como se usa en el presente documento, “mutación somática” significa un cambio que se produce en cualquier célula que no está destinada a convertirse en una célula germinal. La mutación puede ser una sustitución, deleción, inserción o una fusión. En la técnica se conocen métodos para identificar mutaciones en ácidos nucleicos, tales como los genes de RAS enumerados anteriormente. Los ejemplos no limitantes incluyen PCR, secuenciación, captura de híbridos, captura en disolución, sondas de inversión molecular, ensayos de hibridación in situ fluorescente (FISH), y combinaciones de los mismos.

En la técnica se conocen diversos métodos de secuenciación. Estos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación de Sanger (también denominada secuenciación didesoxi) y diversos métodos de secuenciación por síntesis (SBS) como se describe en, por ejemplo, Metzker 2005, secuenciación por hibridación, por ligamiento (por ejemplo, documento WO 2005021786), por degradación (por ejemplo, patentes estadounidenses n.os 5.622.824 y 6.140.053) y secuenciación de nanoporos (que está disponible comercialmente de Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido). En técnicas de secuenciación profunda, un nucleótido dado en la secuencia se lee más de una vez durante el proceso de secuenciación. Se dan a conocer técnicas de secuenciación profunda en, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 20120264632 y la publicación de patente internacional n.° WO2012125848.

En la técnica se conocen métodos basados en PCR para detectar mutaciones y emplean amplificación por PCR, donde cada secuencia diana en la muestra tiene un par correspondiente de cebadores específicos de secuencia únicos. Por ejemplo, el método de reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismos de longitud de fragmentos restricción (PCR-RFLP) permite la detección rápida de mutaciones después de que las secuencias genómicas se amplifiquen por PCR. La mutación se discrimina por digestión con endonucleasas de restricción específicas y se identifica por electroforesis. Véase, por ejemplo, Ota et al., 2007. Las mutaciones también pueden detectarse usando PCR en tiempo real. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO2012046981.

Se conocen métodos de captura de híbridos en la técnica y se dan a conocer en, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 20130203632 y las patentes estadounidenses n.os 8.389.219 y 8.288.520. Estos métodos se basan en la hibridación selectiva de las regiones genómicas diana con oligonucleótidos diseñados por el usuario. La hibridación puede ser con oligonucleótidos inmovilizados sobre micromatrices de alta o baja densidad (captura en matriz), o hibridación en fase de disolución con oligonucleótidos modificados con un ligando (por ejemplo, biotina) que posteriormente puede inmovilizarse en una superficie sólida, tal como una perla (captura en disolución).

En la técnica se conocen técnicas de sondas de inversión molecular (MIP) y se dan a conocer en, por ejemplo, Absalan et al., 2008. Este método usa moléculas de MIP, que son sondas de “candado” especiales (Nilsson et al., 1994) para el genotipado. Una molécula de MIP es un oligonucleótido lineal que contiene regiones específicas, secuencias universales, sitios de restricción y una secuencia Tag (índice) (16-22 pb). Una MIP se hibrida directamente alrededor del marcador genético/SNP de interés. El método de MIP también puede usar varios conjuntos de sondas “de candado” que se hibridan con el ADN genómico en paralelo (Hardenbol et al., 2003). En caso de una coincidencia perfecta, se ligan las regiones de homología genómica experimentando una inversión en la configuración (como se sugiere por el nombre de la técnica) y creando una molécula circular. Después de la primera restricción, todas las moléculas se amplifican con cebadores universales. Los amplicones se restringen nuevamente para garantizar fragmentos cortos para la hibridación en una micromatriz. Los fragmentos cortos generados se marcan y, a través de una secuencia Tag, se hibridan con una cTag (cadena complementaria para el índice) en una matriz. Después de la formación del dúplex Tag-cTag, se detecta una señal.

Las siguientes tablas 1 y 2 muestran las SEQ ID No. de secuencias representativas de ácido nucleico y aminoácidos de K-RAS y PIK3CA de tipo silvestre de diversas fuentes animales, respectivamente, en el listado de secuencias. Estas secuencias pueden usarse en métodos para identificar sujetos con un genotipo de K-RAS y/o PIK3CA mutante (tal como en los métodos expuestos a continuación).

Tabla 1: Secuencias K-RAS

Tabla 2: Secuencias de PIK3CA

Como se usa en el presente documento, ser “refractario” a un tratamiento con inhibidor de la ruta de MAPK significa que el inhibidor de la ruta de MAPK tiene una eficacia reducida en el tratamiento del cáncer.

Como se usa en el presente documento, “inhibidor de la ruta de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK)” significa cualquier sustancia que reduce la actividad, expresión o fosforilación de proteínas en la ruta de MAPK que da como resultado una reducción del crecimiento celular o un aumento en la muerte celular.

En la figura 5 se muestra una visión general de las cascadas de MAPK de mamíferos. Los detalles de las rutas de MAPK se revisan en, por ejemplo, Akinleye et al., 2013. Brevemente, con respecto al módulo de ERK1/2 en la figura 5 (recuadro púrpura claro), la cascada de señalización de MAPK 1/2 se activa mediante la unión del ligando a tirosina quinasas receptoras (RTK). Los receptores activados reclutan y fosforilan las proteínas adaptadoras Grb2 y SOS, que luego interaccionan con la GTPasa Ras unida a la membrana y provocan su activación. En su forma unida a GTP activada, Ras recluta y activa quinasas Raf (A-Raf, B-Raf y C-Raf/RaF-1). Las quinasas Raf activadas activan MAPK 1/2 (MKK1/2), que a su vez cataliza la fosforilación de residuos de treonina y tirosina en la secuencia de activación Thr-Glu-Tyr de ERK1/2. Con respecto al módulo JNK/p38 (recuadro amarillo en la figura 5), quinasas aguas arriba, MAP3K, tales como MEKK1/4, ASK1/2 y MLK1/2/3, activan MAP2K3/6 (MKK3/6), MAP2K4 (MKK4) y MAP2K7 (MKK7). Estas MAP2K luego activan las proteínas quinasas JNK, incluyendo JNK1, JNK2 y ^jN^k3, así como p38 a/p/y/8. Para ejecutar sus funciones, las JNK activan varios factores de transcripción, incluyendo c-Jun, ATF-2, NF-ATc1, HSF-1 y STAT3. Con respecto al módulo ERK5 (recuadro azul en la figura 5), las quinasas aguas arriba de MAP2K5 (MKK5) son MEKK2 y MEKK3. La diana aguas abajo mejor caracterizada de Me K5 es ERK5, también conocida como MAP quinasa 1 grande (BMK1) porque tiene el doble del tamaño de otras MAPK.

Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la ruta de MAPK según la presente invención incluyen inhibidores de RAS, inhibidores de RAF, inhibidores de MEK, inhibidores de ERK1/2, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de RAS” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con RAS, por ejemplo, mediante la unión a RAS y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de RAS. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de RAS según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de farnesil transferasa (tales como, por ejemplo, tipifarnib y lonafarnib), moléculas pequeñas que contienen grupos farnesilo (tales como, por ejemplo, salirasib y TLN-4601), DCAI, como se describe por Maurer (Maurer, et al., 2012), Kobe0065 y Kobe2602, como se describe por Shima (Shima, et al., 2013), y HBS 3 (Patgiri, et al., 2011), y AIK-4 (Allinky).

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de RAF” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con RAF, por ejemplo, mediante la unión a RAF y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de RAF, tales como, por ejemplo, A-RAF, B-RAF y C-RAF (Raf-1). Los inhibidores de RAF a modo de ejemplo no limitantes incluyen:

Compuesto 7

Compuesto 9 Compuesto

Compuesto 1

Compuesto 14 Compueesto

Compuesto 1

Compuesto 18

Compuesto 19

Compuesto 2

Compuesto 21

Compuesto 22

Compuesto

Compuesto

Compuesto



Compuesto 33

Compuesto

Compuesto 35 (Id.).

Compuesto 36

Compuesto 39 (Id.),

Compuesto

AAL881 (Novartis); AB-024 (Ambit Biosciences), ARQ-736 (ArQuIe), ARQ-761 (ArQuIe), AZ628 (Axon Medchem BV), BeiGene-283 (BeiGene), BIIB-024 (MLN 2480) (Sunesis & Amp; Takeda), inhibidor de b-raf (Sareum), inhibidor de quinasa BRAF (Selexagen Therapeutics), ARNip de BRAF 313 (tacacagcaagctagatgca) y 523 (cctatcgttagagtcttcctg) (Liu et al., 2007), CTT239065 (Institute of Cancer Research), dabrafenib (GSK2118436), DP-4978 (Deciphera Pharmaceuticals), HM-95573 (Hanmi), GDC-0879 (Genentech), GW-5074 (Sigma Aldrich), ISIS 5132 (Novartis), L779450 (Merck), LBT613 (Novartis), LErafON (NeoPharm, Inc.), LGX-818 (Novartis), pazopanib (GlaxoSmithKline), PLX3202 (Plexxikon), PLX4720 (Plexxikon), PLX5568 (Plexxikon), RAF-265 (Novartis), RAF-365 (Novartis), regorafenib (Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Inc.), RO 5126766 (Hoffmann-La Roche), SB-590885 (GlaxoSmithKline), SB699393 (GlaxoSmithKline), sorafenib (Onyx Pharmaceuticals), TAK 632 (Takeda), TL-241 (Teligeno), vemurafenib (RG7204 o PLX4032) (Daiichi Sankyo), XL-281 (Exelixis), ZM-336372 (AstraZeneca), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de MEK” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con ^mE^k, por ejemplo, mediante la unión a MEK y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de MEK. Por lo tanto, los inhibidores que actúan aguas arriba de MEK, tales como inhibidores de RAS e inhibidores de RAF, no son inhibidores de MEK según la presente invención. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de MEK según la presente invención incluyen toxina del carbunco, antroquinonol (Golden Biotechnology), ARRY-142886 (2-hidroxietoxi)-amida) del ácido (2-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (Array BioPharma), ARRY-438162 (Array BioPharma), AS-1940477 (Astellas), AS-703988 (Merck KGaA), bentamapimod (Merck KGaA), BI-847325 (Boehringer Ingelheim), E-6201 (Eisai), GDC-0623 (Hoffmann-La Roche), GDC-0973 (cobimetinib) (Hoffmann-La Roche), L783277 (Merck), porción del factor letal de la toxina del carbunco, MEK162 (Array BioPharma), PD 098059 (2-(2'-amino-3'-metoxifenil)-oxanaftalen-4-ona) (Pfizer), PD 184352 (CI-1040) (Pfizer), PD-0325901 (Pfizer), pimasertib (Santhera Pharmaceuticals), RDEA119 (Ardea Biosciences/Bayer), refametinib (AstraZeneca), Rg 422 (Chugai Pharmaceutical Co.), RO092210 (Roche), RO4987655 (Hoffmann-La Roche), RO5126766 (Hoffmann-La Roche), selumetinib (AZD6244) (AstraZeneca), SL327 (Sigma), TAK-733 (Takeda), trametinib (Japan Tobacco), U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis(2-aminofeniltio)butadieno) (Sigma), WX-554 (Wilex), polipéptido YopJ (Mittal et al., 2010), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de ERK1/2” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con e RK1 y/o ERK2, por ejemplo, mediante la unión a ERK1/2 y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de las proteína quinasas ERK1 y/o ERK2. Por lo tanto, inhibidores que actúan aguas arriba de ERK1/2, tales como inhibidores de MEK e inhibidores de RAF, no son inhibidores de ERK1/2 según la presente invención. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de ERK1/2 según la presente invención incluyen AEZS-131 (Aeterna Zentaris), AEZS-136 (Aeterna Zentaris), BVD-523 (BioMed Valley Discoveries, Inc.), SCH-722984 (Merck & Co.), SCH-772984 (Merck & Co.), SCH-900353 (MK-8353) (Merck & Co.), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

En un aspecto adicional de esta realización, va a administrarse al menos un agente terapéutico adicional seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo, un agente citotóxico, un fármaco, una toxina, un radionúclido, un inmunomodulador, un agente terapéutico fotoactivo, un agente radiosensibilizante, una hormona, un agente antiangiogénico, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” abarca inmunoglobulinas que se producen de manera natural, así como inmunoglobulinas que no se producen de manera natural, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Los fragmentos de anticuerpos incluyen aquellos que se unen al antígeno (por ejemplo, Fab', F(ab')², Fab, Fv y rlgG). Véase también, por ejemplo, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, III.); Kuby, J., Inmmunology, 3a ed., W.H. Freeman & amp; Co., Nueva York (1998). El término anticuerpo también incluye moléculas bivalentes o biespecíficas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. El término “anticuerpo” incluye además anticuerpos tanto policlonales como monoclonales.

Los ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse en la presente invención incluyen rituximab (Rituxan), Cetuximab (Erbitux), bevacizumab (Avastin) e Ibritumomab (Zevalin).

Los agentes citotóxicos según la presente invención incluyen agentes que dañan el ADN, antimetabolitos, agentes antimicrotúbulos, agentes antibióticos, etc. Los agentes que dañan el ADN incluyen agentes alquilantes, agentes basados en platino, agentes intercalantes e inhibidores de la replicación del ADN. Los ejemplos no limitantes de agentes alquilantes de ADN incluyen ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalán, clorambucilo, ifosfamida, carmustina, lomustina, estreptozocina, busulfano, temozolomida, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de agentes basados en platino incluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, satraplatino, tetranitrato de triplatino, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de agentes intercalantes incluyen doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, mitoxantrona, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de la replicación del ADN incluyen irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los antimetabolitos incluyen antagonistas de folato tales como metotrexato y premetrexed, antagonistas de purina tales como 6-mercaptopurina, dacarbazina y fludarabina, y antagonistas de pirimidina tales como 5-fluorouracilo, arabinosilcitosina, capecitabina, gemcitabina, decitabina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los agentes antimicrotúbulos incluyen, sin limitación, alcaloides de la vinca, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®) e ixabepilona (Ixempra®). Los agentes antibióticos incluyen, sin limitación, actinomicina, antraciclinas, valrubicina, epirubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos.

Los agentes citotóxicos según la presente invención también incluyen inhibidores de la ruta de mTOR. Los ejemplos no limitantes de tales inhibidores incluyen zotarolimus (AbbVie), umirolimus (biosensors), temsirolimus (Pfizer), sirolimus (Pfizer), sirolimus NanoCrystal (Elan Pharmaceutical Technologies), sirolimus TransDerm (TransDerm), sirolimus-PNP (Samyang), everolimus (Novartis), biolimus A9 (biosensors), ridaforolimus (Ariad), rapamicina, TCD-10023 (Terumo), DE-109 (MacuSight), MS-R001 (MacuSight), MS-R002 (MacuSight), MS-R003 (MacuSight), Perceiva (MacuSight), ^xL-765 (Exelixis), quinacrina (Cleveland BioLabs), PKI-587 (Pfizer), PF-04691502 (Pfizer), G^dC-0980 (Genentech y Piramed), dactolisib (Novartis), CC-223 (Celgene), PWT-33597 (Pathway Therapeutics), P-7170 (Piramal Life Sciences), LY-3023414 (Eli Lilly), INK-128 (Takeda), GDC-0084 (Genentech), DS-7423 (Daiichi Sankyo), DS-3078 (Daiichi Sankyo), CC-115 (Celgene), CBLC-137 (Cleveland BioLabs), AZD-2014 (AstraZeneca), X-480 (Xcovery), X-414 (Xcovery), EC-0371 (Endocyte), VS-5584 (Verastem), PQR-401 (Piqur), PQR-316 (Piqur), PQR-311 (Piqur), PQR-309 (Piqur), PF-06465603 (Pfizer), NV-128 (Novogen), nPT-MTOR (Biotica Technology), BC-210 (Biotica Technology), Wa Y-600 (Biotica Technology), WYE-354 (Biotica Technology), W y E-687 (Biotica Technology), LOR-220 (Lorus Therapeutics), HMPL-518 (Hutchison China MediTech), GNE-317 (Genentech), EC-0565 (Endocyte), CC-214 (Celgene), ABTL-0812 (Ability Pharmaceuticals), y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

En la presente invención, el término “toxina” significa un veneno o veneno antigénico de origen vegetal o animal. Un ejemplo es la toxina diftérica o porciones de la misma.

En la presente invención, el término “radionúclido” significa una sustancia radiactiva administrada al paciente, por ejemplo, por vía intravenosa u oral, después de lo cual penetra a través del metabolismo normal del paciente en el órgano o tejido diana, donde suministra radiación local durante un corto tiempo. Los ejemplos de radionúclidos incluyen, pero no se limitan a, I-125, At-211, Lu-177, Cu-67, I-131, Sm-153, Re-186, P-32, Re-188, In-114m y Y-90.

En la presente invención, el término “ inmunomodulador” significa una sustancia que altera la respuesta inmunitaria aumentando o reduciendo la capacidad del sistema inmunitario para producir anticuerpos o células sensibilizadas que reconocen y reaccionan con el antígeno que inició su producción. Los inmunomoduladores pueden ser preparaciones recombinantes, sintéticas o naturales e incluyen citocinas, corticosteroides, agentes citotóxicos, timosina e inmunoglobulinas. Algunos inmunomoduladores están presentes de manera natural en el cuerpo, y algunos de estos están disponibles en preparaciones farmacológicas. Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interferones, imiquimod y fracciones de membrana celular de bacterias, IL-2, IL-7, IL-12, CCL3, CCL26, Cx Cl7 y fosfato de citosina-guanosina sintética (CpG).

En la presente invención, “agente terapéutico fotoactivo” significa compuestos y composiciones que se vuelven activos tras la exposición a la luz. Ciertos ejemplos de agentes terapéuticos fotoactivos se describen en la solicitud de patente estadounidense n.° 2011/0152230 A1, “Photoactive Metal Nitrosyls For Blood Pressure Regulation And Cancer Therapy”.

En la presente invención, “agente radiosensibilizante” significa un compuesto que hace que las células tumorales sean más sensibles a la radioterapia. Los ejemplos de agentes radiosensibilizantes incluyen misonidazol, metronidazol, tirapazamina y trans-crocetinato de sodio.

En la presente invención, el término “hormona” significa una sustancia liberada por células en una parte de un cuerpo que afecta a células en otra parte del cuerpo. Los ejemplos de hormonas incluyen, pero no se limitan a, prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, amilina, hormona antimuleriana, adiponectina, hormona adrenocorticotropa, angiotensinógeno, angiotensina, vasopresina, atriopeptina, péptido natriurético cerebral, calcitonina, colecistoquinina, hormona liberadora de corticotropina, encefalina, endotelina, eritropoyetina, hormona foliculoestimulante, galanina, gastrina, grelina, glucagón, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, gonadotropina coriónica humana, lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, somatomedina, leptina, lipotropina, hormona luteinizante, hormona estimulante de melanocitos, motilina, orexina, oxitocina, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, prolactina, hormona liberadora de prolactina, relaxina, renina, secretina, somatostina, trombopoyetina, hormona estimulante del tiroides, testosterona, deshidroepiandrosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, aldosterona, estradiol, estrona, estriol, cortisol, progesterona, calcitriol y calcidiol.

Algunos compuestos interfieren con la actividad de ciertas hormonas o detienen la producción de ciertas hormonas. Estos compuestos que interfieren con hormonas incluyen, pero no se limitan a, tamoxifeno (Nolvadex®), anastrozol (Arimidex®), letrozol (Femara®) y fulvestrant (Faslodex®). Tales compuestos también están dentro del significado de hormona en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, un agente “antiangiogénico” significa una sustancia que reduce o inhibe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, tal como, por ejemplo, un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y un inhibidor de la migración de células endoteliales. Los agentes antiangiogénicos incluyen, sin limitación, 2-metoxiestradiol, angiostatina, bevacizumab, factor inhibidor de la angiogénesis derivado de cartílago, endostatina, IFN-a, IL-12, itraconazol, linomida, factor 4 de plaquetas, prolactina, SU5416, suramina, tasquinimod, tecogalano, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina, trombospondina, TNP-470, ziv-aflibercept, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos.

En otro aspecto de esta realización, la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo. Como se usa en el presente documento, “sinérgico” significa más que aditivo. Los efectos sinérgicos pueden medirse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los dados a conocer en el presente documento, tal como el ensayo de exceso sobre Bliss.

También se da a conocer un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. En una realización de la invención, va a administrarse una cantidad eficaz de (i) BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) pictilisib (GDC-0941) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

En el presente documento se dan a conocer sujetos adecuados y preferidos. Los métodos pueden usarse para tratar los cánceres descritos anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se expusieron anteriormente.

En un aspecto de esta realización, el BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en forma de una composición farmacéutica que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional de esta realización, el pictilisib (GDC-0941) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en forma de una composición farmacéutica que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de esta realización, va a administrarse al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de mTOR, como se da a conocer en el presente documento.

En un aspecto adicional de esta realización, la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

Los kits pueden incluir recipientes de almacenamiento adecuados, por ejemplo, ampollas, viales, tubos, etc., para cada agente anticancerígeno de la presente invención (que puede estar, por ejemplo, en forma de composiciones farmacéuticas) y otros reactivos, por ejemplo, tampones, soluciones salinas equilibradas, etc., para su uso en la administración de los agentes anticancerígenos a sujetos. Los agentes anticancerígenos de la invención y otros reactivos pueden estar presentes en los kits en cualquier forma conveniente, tal como, por ejemplo, en una disolución o en forma de polvo. Los kits pueden incluir además un recipiente de envasado, que tiene opcionalmente una o más particiones para alojar los agentes anticancerígenos o composiciones farmacéuticas que los contienen y otros reactivos opcionales.

Los inhibidores de PI3K/Akt y sujetos adecuados y preferidos son como se expusieron anteriormente. En esta realización, el kit puede usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones son como se expusieron anteriormente.

En un aspecto adicional de esta realización, el kit comprende además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de mTOR, como se da a conocer en el presente documento.

En otro aspecto de esta realización, la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

También se da a conocer un método para tratar o mejorar los efectos de un sujeto con cáncer que comprende:

Los inhibidores de PI3K/Akt y sujetos adecuados y preferidos son como se expusieron anteriormente. Los métodos pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se expusieron anteriormente.

La identificación de un sujeto con cáncer que tiene mutaciones somáticas de KRAS y PIK3CA puede comprender:

(a) obtener una muestra biológica del sujeto; y

(b) cribar la muestra para determinar si el sujeto tiene mutaciones somáticas de KRAS y PIK3CA.

En la presente invención, las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, plasma, orina, piel, saliva y biopsias. Las muestras biológicas se obtienen de un sujeto mediante procedimientos y métodos rutinarios que se conocen en la técnica.

El cribado puede comprender la detección de al menos una de las mutaciones de KRAS y PIK3CA usando un método como se da a conocer en el presente documento. Preferiblemente, el método de cribado se selecciona de PCR, secuenciación, captura de híbridos, captura en disolución, MIP, y combinaciones de los mismos. Otros métodos preferidos incluyen FISH, secuenciación de Sanger, secuenciación profunda, y combinaciones de los mismos. En otro aspecto de esta realización, va a administrarse al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de mTOR, como se da a conocer en el presente documento.

En un aspecto adicional de esta realización, la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo. También se da a conocer en el presente documento un método para tratar o mejorar los efectos de un sujeto con cáncer. El método comprende:

(a) identificar un sujeto con cáncer que es refractario a una terapia seleccionada del grupo que consiste en terapia con inhibidor de RAF, terapia con inhibidor de MEK y terapia con inhibidores de RAF y MEK; y (b) administrar al sujeto identificado en la etapa (a) una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Los inhibidores de RAF y los inhibidores de MEK son como se dan a conocer en el presente documento. Los inhibidores de PI3K/Akt y sujetos adecuados y preferidos también son como se expusieron anteriormente. Los métodos pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se expusieron anteriormente.

La identificación de un sujeto con cáncer que es refractario a una terapia seleccionada del grupo que consiste en terapia con inhibidor de RAF, terapia con inhibidor de MEK y terapia con inhibidores de RAF y MEK puede comprender:

(a) obtener una muestra biológica del sujeto; y

(b) cribar la muestra para determinar si el sujeto tiene una mutación somática de BRAF.

El cribado puede comprender la detección de una mutación somática de BRAF usando un método como se da a conocer en el presente documento. Preferiblemente, el método de cribado se selecciona de PCR, secuenciación, captura de híbridos, captura en disolución, MIP, y combinaciones de los mismos. Otros métodos de cribado preferidos incluyen FISH, secuenciación de Sanger, secuenciación profunda, y combinaciones de los mismos. La siguiente tabla 3 muestra las SEQ ID No. de secuencias representativas de ácido nucleico y aminoácidos de BRAF de tipo silvestre de diversas fuentes animales del listado de secuencias. Estas secuencias pueden usarse en métodos para identificar sujetos con un genotipo de BRAF mutante (tal como en los métodos dados a conocer en el presente documento).

Tabla 3: Secuencias de B-RAF

El método puede comprender además administrar al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de mTOR, como se da a conocer en el presente documento.

La administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo puede proporcionar un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

Otra realización de la presente invención es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. La composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es bVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

Los inhibidores de PI3K/Akt y sujetos adecuados y preferidos también son como se expusieron anteriormente. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se expusieron anteriormente.

En un aspecto de esta realización, la composición farmacéutica comprende además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de mTOR, como se da a conocer en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención pueden estar en una forma de dosificación unitaria que comprende ambos agentes anticancerígenos. En otro aspecto de esta realización, el primer agente anticancerígeno está en una primera forma de dosificación unitaria y el segundo agente anticancerígeno está en una segunda forma de dosificación unitaria, separado del primero.

Los agentes anticancerígenos primero y segundo pueden coadministrarse al sujeto, o bien simultáneamente o bien en diferentes momentos, según lo considere más apropiado un médico. Si los agentes anticancerígenos primero y segundo se administran en momentos diferentes, por ejemplo, mediante administración en serie, el primer agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del segundo agente anticancerígeno. Alternativamente, el segundo agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del primer agente anticancerígeno.

Una realización adicional de la presente invención es un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas. El método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En esta realización, “poner en contacto” significa llevar BVD-523, un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, a proximidad estrecha con las células cancerosas. Esto puede lograrse usando técnicas convencionales de administración de fármacos a mamíferos o en la situación in vitro, por ejemplo, proporcionando BVD-523, un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt y opcionalmente otros agentes terapéuticos a un medio de cultivo en el que se encuentran las células cancerosas.

Los inhibidores de PI3K/Akt adecuados y preferidos también son como se expusieron anteriormente. En esta realización, efectuar la muerte de células cancerosas puede lograrse en células cancerosas que tienen diversos antecedentes mutacionales y/o que se caracterizan como se dio a conocer anteriormente. Los métodos de identificación de tales mutaciones también son como se expusieron anteriormente.

Los métodos de esta realización, que pueden llevarse a cabo in vitro, pueden usarse para efectuar la muerte de células cancerosas, por ejemplo, destruyendo células cancerosas, en células de los tipos de cáncer dados a conocer en el presente documento.

En un aspecto de esta realización, la célula cancerosa es una célula cancerosa de mamífero. Preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero se obtiene de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, primates, animales de granja y animales domésticos. Más preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero es una célula cancerosa humana.

En otro aspecto de esta realización, el método comprende además poner en contacto la célula cancerosa con al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de mTOR, como se da a conocer en el presente documento.

Poner en contacto la célula cancerosa con los agentes anticancerígenos primero y segundo puede proporcionar un efecto sinérgico en comparación con la puesta en contacto con cualquiera de los agentes anticancerígenos solos.

En la presente invención, una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente anticancerígeno de la invención incluyendo composiciones farmacéuticas que contienen el mismo que se dan a conocer en el presente documento es una cantidad de tal agente o composición que es suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados como se da a conocer en el presente documento cuando se administra a un sujeto. Formas de dosificación, modos de administración y las cantidades de dosificación eficaces pueden determinarse empíricamente, y realizar tales determinaciones está dentro de la habilidad de la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que la cantidad de dosificación variará con la vía de administración, la velocidad de excreción, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier otro fármaco que se administre, la edad, el tamaño y la especie de mamíferos, por ejemplo, paciente humano, y factores similares bien conocidos en las técnicas de medicina y medicina veterinaria. En general, una dosis adecuada de un agente o composición según la invención será la cantidad del agente o composición que es la dosis más baja eficaz para producir el efecto deseado. La dosis eficaz de un agente o composición de la presente invención puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

Un ejemplo no limitante adecuado de una dosificación de BVD-523, un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, u otro agente anticancerígeno dado a conocer en el presente documento, es de desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 2400 mg/kg al día, tal como de desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 1200 mg/kg al día, de 75 mg/kg al día a aproximadamente 300 mg/kg al día, incluyendo de desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg al día. Otras dosificaciones representativas de tales agentes incluyen aproximadamente 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, 2000 mg/kg, 2100 mg/kg, 2200 mg/kg y 2300 mg/kg al día. La dosis eficaz de BVD-523, un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, u otro agente anticancerígeno dado a conocer en el presente documento puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

BVD-523, inhibidores de la ruta de PI3K/Akt, otros agentes anticancerígenos, o las composiciones farmacéuticas que los contienen de la presente invención pueden administrarse de cualquier manera deseada y eficaz: para ingestión oral, o como una pomada o gota para administración local a los ojos, o para administración parenteral u otra administración de cualquier manera apropiada tal como intraperitoneal, subcutánea, tópica, intradérmica, inhalación, intrapulmonar, rectal, vaginal, sublingual, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal o intralinfática. Además, BVD-523, inhibidores de la ruta de PI3K/Akt, otros agentes anticancerígenos, o las composiciones farmacéuticas que los contienen de la presente invención pueden administrarse junto con otros tratamientos. BVD-523, inhibidores de la ruta de PI3K/Akt, otros agentes anticancerígenos, o las composiciones farmacéuticas que los contienen de la presente invención pueden encapsularse o protegerse de otro modo contra secreciones gástricas u otras, si se desea.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden uno o más principios activos, por ejemplo, agentes anticancerígenos, en mezcla con uno o más diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros compuestos, fármacos, componentes y/o materiales. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los agentes/compuestos de la presente invención se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a edición, Lippincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA.).

En la técnica se conocen bien diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables (véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a edición, Lippincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA.) y The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.) e incluyen azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol), almidones, preparaciones de celulosa, fosfatos de calcio (por ejemplo, fosfato dicálcico, fosfato tricálcico e hidrogenofosfato cálcico), citrato de sodio, agua, disoluciones acuosas (por ejemplo, solución salina, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer con lactato), alcoholes (por ejemplo, alcohol etílico, alcohol propílico y alcohol bencílico), polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol), ésteres orgánicos (por ejemplo, oleato de etilo y triplicéridos), polímeros biodegradables (por ejemplo, polilactida-poliglicolida, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos)), matrices elastoméricas, liposomas, microesferas, aceites (por ejemplo, maíz, germen, oliva, ricino, sésamo, semilla de algodón y cacahuete), manteca de cacao, ceras (por ejemplo, ceras de supositorio), parafinas, siliconas, talco, silicilato, etc. Cada diluyente o portador farmacéuticamente aceptable usado en una composición farmacéutica de la invención debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no perjudicial para el sujeto. Los diluyentes o portadores adecuados para una forma de dosificación seleccionada y la vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y pueden determinarse diluyentes o portadores aceptables para una forma de dosificación y método de administración elegidos usando la habilidad habitual en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener, opcionalmente, componentes y/o materiales adicionales comúnmente usados en composiciones farmacéuticas. Estos componentes y materiales se conocen bien en la técnica e incluyen (1) cargas o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, glicolato sódico de almidón, carboximetilcelulosa de sodio reticulada y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos y laurilsulfato de sodio; (10) agentes de suspensión, tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto; (11) agentes tamponantes; (12) excipientes, tal como lactosa, azúcares de la leche, polietilenglicoles, grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, manteca de cacao, almidones, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicol, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, salicilato, óxido de zinc, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida; (13) diluyentes inertes, tales como agua u otros disolventes; (14) conservantes; (15) agentes tensioactivos; (16) agentes dispersantes; (17) agentes de liberación de control o retardantes de la absorción, tales como hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, polímeros biodegradables, liposomas, microesferas, monoestearato de aluminio, gelatina y ceras; (18) agentes opacificantes; (19) adyuvantes; (20) agentes humectantes; (21) agentes emulsionantes y de suspensión; (22), agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitano; (23) propelentes, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano; (24) antioxidantes; (25) agentes que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, tales como azúcares y cloruro de sodio; (26) agentes espesantes; (27) materiales de recubrimiento, tales como lecitina; (28) agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Cada uno de tales componentes o materiales debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no ser perjudicial para el sujeto. Los ingredientes y materiales adecuados para una forma de dosificación seleccionada y la vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y los componentes y materiales aceptables para una forma de dosificación y método de administración elegidos pueden determinarse usando la habilidad habitual en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, obleas, píldoras, comprimidos, polvos, gránulos, una disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, un elixir o jarabe, una pastilla, un bolo, un electuario o una pasta. Estas formulaciones pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos de recubrimiento en bandeja, mezclado, granulación o liofilización convencionales.

Pueden prepararse formas de dosificación sólidas para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), por ejemplo, mezclando el/los principio(s) activo(s) con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, una o más cargas, extendedores, aglutinantes, humectantes, agentes disgregantes, agentes retardantes de la disolución, aceleradores de la absorción, agentes humectantes, absorbentes, lubricantes y/o agentes colorantes. Pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando un excipiente adecuado. Puede prepararse un comprimido por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes accesorios. Pueden prepararse comprimidos sometidos a compresión usando un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante, agente tensioactivo o dispersante adecuado. Pueden prepararse comprimidos moldeados mediante moldeo en una máquina adecuada. Los comprimidos, y otras formas de dosificación sólidas, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, opcionalmente pueden ranurarse o prepararse con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del principio activo en los mismos. Pueden esterilizarse mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición tal que liberen solo el principio activo, o preferentemente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes adecuados comúnmente usados en la técnica. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Las suspensiones pueden contener agentes de suspensión.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más principios activos con uno o más diluyentes o portadores no irritantes adecuados que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a la temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirán en el recto o la cavidad vaginal y liberarán el compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen tales diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables como se sabe en la técnica que son apropiados.

Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica incluyen polvos, aerosoles, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches, gotas e inhalantes. El/los agente(s)/compuesto(s) activo(s) puede(n) mezclarse en condiciones estériles con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Las pomadas, pastas, las cremas y los geles pueden contener excipientes. Los polvos y aerosoles pueden contener excipientes y propelentes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para administraciones parenterales pueden comprender uno o más agentes/compuestos en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, solutos adecuados que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, o agentes de suspensión o espesantes. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener adyuvantes adecuados, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos. Además, la absorción prolongada de la forma de dosificación inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco (por ejemplo, formulación farmacéutica), es deseable ralentizar su absorción de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua.

La velocidad de absorción del principio activo/fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un agente/fármaco administrado por vía parenteral puede lograrse disolviendo o suspendiendo el agente/fármaco activo en un vehículo oleoso. Pueden prepararse formas de depósito inyectables formando matrices microencapsuladas del principio activo en polímeros biodegradables. Dependiendo de la razón del principio activo con respecto al polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación del principio activo. También pueden prepararse formulaciones inyectables de depósito atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias.

Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada que requiere solo la adición del diluyente o portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

La presente invención proporciona combinaciones que se muestra que potencian los efectos de los inhibidores de ERK. En el presente documento, los solicitantes también han demostrado que la combinación de diferentes inhibidores de ERK es asimismo sinérgica. Por lo tanto, se contempla que los efectos de las combinaciones descritas en el presente documento pueden mejorarse adicionalmente mediante el uso de uno o más inhibidores de ERK adicionales. En consecuencia, algunas realizaciones de la presente invención incluyen uno o más inhibidores de ERK adicionales.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente los métodos de la presente invención. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y métodos para el estudio in vivo

Ratones

Ratones desnudos atímicos hembra (Crl:NU(Ncr)-Foxn7nu, Charles River) tenían ocho semanas de edad con un intervalo de peso corporal (BW) de 14,6 a 25,7 gramos el día 1 del estudio. Los animales se alimentaron con agua a voluntad (ósmosis inversa, 1 ppm de CI), y NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet® que consiste en el 18,0 % de proteína en bruto, el 5,0 % de grasa en bruto y el 5,0 % de fibra en bruto. Los ratones se alojaron en lechos para animales de laboratorio irradiados Enrich-o'cobs™ en microaisladores estáticos en un ciclo de luz de 12 horas a 20 22 °C (68-72 °F) y el 40-60 % de humedad.

Cultivo de células tumorales

Se cultivaron células de carcinoma de colon humano HCT116 en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10 %, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina G sódica, sulfato de estreptomicina 100 pg/ml y gentamicina 25 pg/ml. Las células tumorales se cultivaron en frascos de cultivo tisular en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera del 5 % de CO²y el 95 % de aire.

Implantación in vivo y crecimiento tumoral

Las células HCT116 usadas para la implantación se recogieron durante el crecimiento exponencial y se resuspendieron en el 50 % de Matrigel (BD Biosciences):el 50 % de solución salina tamponada con fosfato a una concentración de 2,5 x 107 células/ml. El día del implante tumoral, a cada ratón de prueba se le inyectaron por vía subcutánea en el costado derecho 5 x 106 células (0,2 ml de suspensión celular), y se monitorizó el crecimiento tumoral a medida que el tamaño promedio se aproximaba al intervalo objetivo de 100 a 150 mm3. Los tumores se midieron en dos dimensiones usando calibres, y el volumen se calculó usando la fórmula:

Volumen tumoral (mm3) = (w2 x l) / 2

donde w = ancho y I = largo, en mm, del tumor. El peso tumoral puede estimarse con la suposición de que 1 mg es equivalente a 1 mm3 de volumen tumoral.

Diez días después de la implantación tumoral, designado como día 1 del estudio, los animales se clasificaron en nueve grupos (grupos 1-9) consistiendo cada uno en quince ratones y consistiendo un grupo (grupo 10) en diez ratones. Los volúmenes tumorales individuales oscilaron entre 88 y 172 mm3 y los volúmenes tumorales medios grupales fueron de 130 o 131 mm3.

Agentes terapéuticos

Se suministraron BVD-523 y GDC-0941 como polvos secos y se almacenaron a temperatura ambiente.

Las dosis de BVD-523 se prepararon suspendiendo la cantidad requerida de polvo de BVD-523 en carboximetilcelulosa (CMC) al 1 % en agua desionizada (“vehículo”). Se preparó una disolución madre de BVD-523 de 10 mg/ml, y se usó para dosificar el grupo de 100 mg/kg de BVD-523. Se diluyeron alícuotas de la disolución madre con el vehículo hasta una concentración de 5,0 mg/ml, que proporcionó una dosificación de 50 mg/kg de BVD-523 en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. Las dosis de BVD-523 se almacenaron a 4 °C durante hasta una semana. Se usó el vehículo de CMC al 1 % para dosificar el grupo de control.

Las dosis de GDC-0941 se formularon en metilcelulosa al 0,5 %:Tween 80 al 0,2 % en agua desionizada. Se preparó una disolución madre de GDC-0941 12 mg/ml, y se usó para dosificar el grupo de 120 mg/kg de GDC-0941. Se diluyeron alícuotas de la disolución madre con el vehículo hasta una concentración de 6,0 mg/ml para proporcionar la dosificación de 60 mg/kg de GDC-0941 en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. Las dosis de ^gDC-0941 se almacenaron a 4 °C durante hasta una semana.

Se adquirió paclitaxel (lote CP2N10007) como un polvo seco de Phyton Biotech, LLC (Fort Worth, TX). Se preparó una disolución madre de paclitaxel (30 mg/ml) en el 50 % de etanol:el 50 % de Cremophor EL y se almacenó a temperatura ambiente protegido de la luz durante el período de dosificación. En cada día de dosificación, se diluyó una alícuota de la disolución madre de paclitaxel con dextrosa al 5 % en agua (D5W) para producir una disolución de dosificación de paclitaxel 3,0 mg/ml en un vehículo que consiste en el 5 % de etanol:el 5 % de Cremophor EL:el 90 % de D5W.

Tratamiento

El día 1 del estudio, los ratones se clasificaron en nueve grupos (grupos 1-9) consistiendo cada uno en quince ratones y consistiendo un grupo (grupo 10) en diez ratones, y se inició la dosificación según el plan de tratamiento resumido en la tabla 4 a continuación. Todas las dosis se administraron por sonda oral (por v.o.) excepto paclitaxel, que se administró por vía i.v. Para cada agente, el volumen de dosificación de 10 ml/kg (0,2 ml por 20 gramos de peso corporal) se escaló al peso corporal del animal individual. Las dosis de GDC-0941 se administraron una vez al día (qd) hasta el final del estudio (qd hasta el final), mientras que las dosis de vehículo y BVD-523 se administraron dos veces al día (bid) hasta el final del estudio (bid hasta el final). Para la dosificación bid, la dosificación se inició la tarde del día 1, de modo que se administró una dosis el primer día (“primer día 1 dosis”). Debido a toxicidad, la dosificación en los grupos de combinación de 100 mg/kg de BVD-523 se modificó durante el estudio, como se describe a continuación.

Controles

El grupo 1 recibió vehículo de CMC al 1 % por v.o. bid hasta el final, y sirvió como grupo de control para el cálculo del % de TGD. El grupo 10 recibió paclitaxel i.v. a 30 mg/kg una vez cada dos días (qod) durante cinco dosis (qod x 5), y sirvió como control positivo para el modelo.

Tratamientos de monoterapia

Los grupos 2 y 3 recibieron 60 y 120 mg/kg de GDC-0941, respectivamente, por v.o. qd hasta el final. Los grupos 4 y 5 recibieron 50 y 100 mg/kg de BVD-523, respectivamente, por v.o. bid hasta el final.

Tratamientos de combinación

Los grupos 6 y 7 recibieron las combinaciones de 50 mg/kg de BVD-523 con 60 o 120 mg/kg de GDC-0941, respectivamente. Los grupos 8 y 9 se programaron para recibir las combinaciones de 100 mg/kg de BVD-523 con 60 o 120 mg/kg de GDC-0941, respectivamente. Sin embargo, debido a toxicidad emergente, la dosificación en el grupo 9 terminó el día 29 y se dio un descanso de la dosificación los días 31 y 32 en el grupo 8. Los programas de dosificación finales se muestran en la tabla 5.

Análisis del criterio de valoración y el retraso del crecimiento tumoral (TGD)

Los tumores se midieron usando calibres dos veces a la semana, y cada animal se sacrificó cuando su tumor alcanzó el criterio de valoración de volumen tumoral predeterminado de 2000 mm3 o el día final, lo que ocurriera primero. Los animales que dejaron el estudio por el criterio de valoración del volumen tumoral se documentaron como sacrificados para la progresión tumoral (TP), con la fecha de eutanasia. El tiempo hasta el criterio de valoración (TTE) para el análisis se calculó para cada ratón mediante la siguiente ecuación:

TTE = [log¹ü(volumen de criterio de valoración) - b] / m

donde TTE se expresa en días, el volumen de criterio de valoración se expresa en mm3, b es la ordenada en el origen y m es la pendiente de la línea obtenida por regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento tumoral transformados logarítmicamente. El conjunto de datos consiste en la primera observación que excedió el volumen de criterio de valoración usado en el análisis y las tres observaciones consecutivas que precedieron inmediatamente a la consecución de este volumen de criterio de valoración. El TTE calculado habitualmente es menor que la fecha de TP, el día en que se sacrificó al animal por el tamaño tumoral. A los animales con tumores que no alcanzaron el volumen de criterio de valoración se les asignó un valor de TTE igual al último día del estudio. Cualquier animal clasificado como que ha muerto por causas NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a un accidente (NTRa) o debido a una etiología desconocida (NTRu) se excluyó de los cálculos de TTE (y todos los análisis adicionales). A los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debido a metástasis) se les asignó un valor de TTE igual al día de la muerte.

El resultado del tratamiento se evaluó a partir de TGD, definido como el aumento en la mediana del TTE en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control:

expresado en días, o como un porcentaje de la mediana del TTE del grupo de control:

% T G D = [ (T -C ) / C ] x 100

donde:

T = mediana de TTE para un grupo de tratamiento, y

C = mediana de TTE para el grupo de control designado.

Criterios para las respuestas de regresión

La eficacia del tratamiento puede determinarse a partir de la incidencia y magnitud de las respuestas de regresión observadas durante el estudio. El tratamiento puede provocar regresión parcial (PR) o regresión completa (CR) del tumor en un animal. En una respuesta de PR, el volumen tumoral fue el 50 % o menos de su volumen del día 1 durante tres mediciones consecutivas durante el transcurso del estudio, e igual o mayor de 13,5 mm3 durante una o más de estas tres mediciones. En una respuesta de CR, el volumen tumoral fue inferior a 13,5 mm3 durante tres mediciones consecutivas durante el transcurso del estudio. Un animal con una respuesta de CR al finalizar el estudio se clasificó adicionalmente como superviviente libre de tumor (TFS). Los animales se monitorizaron para detectar respuestas de regresión.

Toxicidad

Los animales se pesaron diariamente los días 1-5, luego dos veces a la semana hasta la finalización del estudio. Los ratones se observaron con frecuencia para detectar signos manifiestos de cualquier efecto secundario TR adverso y los signos clínicos se registraron cuando se observaron. La pérdida de BW individual se controló según el protocolo, y se sacrificó cualquier animal cuyo peso excedía los límites para una pérdida aceptable de BW. La pérdida de BW media del grupo también se controló según el protocolo. La dosificación debía suspenderse en cualquier grupo que excediera los límites de una pérdida de BW media aceptable. Si se recuperó el BW medio, entonces la dosificación debía reanudarse en ese grupo, pero a una dosificación más baja o programa de dosificación menos frecuente. La toxicidad aceptable para la dosis máxima tolerada (MTD) se definió como una pérdida de BW media del grupo de menos del 20 % durante el estudio y no más del 10 % de muertes TR. Una muerte se clasificó como TR si era atribuible a los efectos secundarios del tratamiento como lo demuestran los signos clínicos y/o la necropsia, o también puede clasificarse como TR si se debe a causas desconocidas durante el período de dosificación o en el plazo de los 14 días posteriores a la última dosis. Una muerte se clasificó como NTR si no había evidencia de que la muerte estuviera relacionada con los efectos secundarios del tratamiento. Las muertes NTR pueden caracterizarse adicionalmente basándose en la causa de la muerte. Una muerte se clasificó como NTRa si resultó de un accidente o error humano.

Una muerte se clasificó como NTRm si la necropsia indicaba que puede haber resultado de la diseminación tumoral por invasión y/o metástasis. Una muerte se clasificó como NTRu si la causa de la muerte era desconocida y no había evidencia disponible de muerte relacionada con los efectos secundarios del tratamiento, metástasis, accidente o error humano, aunque no puede excluirse la muerte debida a efectos secundarios del tratamiento.

Muestreo

Cuando estaban disponibles, se sacrificaron cinco ratones por grupo mediante punción cardíaca terminal bajo anestesia con dióxido de carbono a las 3, 6 y 12 horas después de la dosis final, y se recogieron los volúmenes sanguíneos completos. Para cada muestra, se separó el suero y se almacenó congelado a -80 °C hasta su envío. Además, los tumores de estos ratones se recogieron y dividieron en dos partes. Una parte se congeló rápidamente y se almacenó a -80 °C. La otra parte se fijó durante de 16 a 24 horas en formalina tamponada neutra al 10 %, y después se transfirieron a etanol al 70 %.

Análisis estadísticos y gráficos

Se usó Prism (GraphPad) para Windows 3.03 para presentaciones gráficas y análisis estadísticos.

Se usó la prueba de rangos logarítmicos, que evalúa la experiencia de supervivencia global, para analizar la significación de las diferencias entre los valores de TTE de dos grupos. El análisis de rangos logarítmicos incluye los datos para todos los animales en un grupo, excepto los evaluados como muertes NTR. Se realizaron análisis estadísticos de dos colas a nivel de significación P = 0,05. Las pruebas estadísticas no se ajustaron para comparaciones múltiples. Prism resume los resultados de prueba como no significativos (ns) a P > 0,05, significativos (simbolizado por “*”) a 0,01 < P < 0,05, muy significativos (“**”) a 0,001 < P < 0,01 y extremadamente significativos (“***”) a P < 0,001. Debido a que las pruebas de significación estadística no proporcionan una estimación de la magnitud de la diferencia entre grupos, todos los niveles de significación se describieron como o bien significativos o bien no significativos dentro del texto de este ejemplo. Los grupos con regímenes por encima de la MTD no se evaluaron estadísticamente.

Se construyó un diagrama de dispersión para mostrar los valores de TTE para ratones individuales, por grupo. Los volúmenes tumorales medios del grupo se representaron gráficamente en función del tiempo. Cuando un animal dejó el estudio debido al tamaño del tumor, el volumen tumoral final registrado para el animal se incluyó con los datos usados para calcular el volumen medio en puntos de tiempo posteriores. Las barras de error (cuando están presentes) indican un error estándar de la media (e Em ). Los gráficos de crecimiento tumoral excluyeron los datos de muertes NTR, y se truncaron después de que el 50 % de los animales evaluables en un grupo hubiera dejado el estudio o después de la segunda muerte TR en un grupo, lo que ocurriera primero. Los gráficos de Kaplan-Meier muestran el porcentaje de animales en cada grupo que permanece en el estudio frente al tiempo. El gráfico de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos comparten los mismos conjuntos de datos de TTE. Se calcularon los porcentajes de cambio de BW medios del día 1 para cada grupo para cada día de medición de BW, y se representaron gráficamente en función del tiempo. Los gráficos de BW excluyeron los datos de muertes NTR, y se truncaron después de que el 50 % de los animales evaluables en un grupo hubiera dejado el estudio.

Ejemplo 2

Resultados del estudio in vivo

Los grupos en el estudio in vivo se trataron según el protocolo modificado como se expone en la tabla 4. El experimento se terminó el día 45. La tabla 5 presenta un resumen de las respuestas al tratamiento para cada grupo.

Tabla 4 - Diseño del protocolo para el estudio HCT116-e399.

Vehículo = CMC al 1 % en agua desionizada

Nota: Todas las dosis bid se iniciaron en la tarde del primer día de dosificación, de modo que se administró una sola dosis el primer y último día (“bid primer día 1 dosis”).

aDescanso de la dosificación del grupo 8 los días 31-32. Programa de BVD-523 final = bid x 30 dosis primer día 1 dosis/2/bid hasta el final primer día 1 dosis, y programa de GDC-0941 = 31/1/qd hasta el final.

bLa dosificación de grupo 9 terminó el día 29. Programa de BVD-523 final = bid x28 primer día 1 dosis, y programa de GDC-0941 = qd x 29

La figura 1 es un diagrama de dispersión que muestra los TTE individuales para cada grupo. La figura 2 presenta gráficos de crecimiento tumoral medio (2A) y supervivencia de Kaplan-Meier (2B) para cada grupo en el estudio. La figura 3 presenta gráficos de los porcentajes de cambio de BW medio desde el día 1 para cada grupo. La tabla 6 a continuación muestra las observaciones clínicas y los eventos del estudio registrados durante el estudio.

Tabla 6 - Observaciones clínicas de HCT116-e399 y eventos del estudio

Las observaciones clínicas incluyeron notas ocasionales de ulceración tumoral, se sabe que se producen en ausencia de tratamiento. Se consideró que los tumores ulcerados no afectaban a la interpretación global de la actividad y, por lo tanto, todos los ratones con tumores ulcerados se incluyeron en el conjunto de datos para el análisis. Los resultados detallados de los análisis estadísticos se encuentran en las tablas 7 y 8.

Tabla 7 - Análisis estadístico

___ ___ ___ ___

Tabla 8 - Análisis estadístico

Eficacia

Crecimiento de carcinomas colorrectales humanos HCT116 en ratones de control (grupo 1)

Los ratones del grupo 1 recibieron vehículo de CMC al 1 % por v.o. bid hasta el final y sirvió como grupo de control para el análisis de la eficacia. Todos los tumores de control alcanzaron el criterio de valoración de 2000 mm3 con una mediana de TTE de 32,7 días, estableciendo un TGD máximo posible de 12,3 días (38 %) para el estudio de 45 días (tabla 5). El gráfico de dispersión muestra una distribución relativamente amplia pero uniforme de los TTE del grupo 1 (figura 1). El crecimiento tumoral medio para los controles fue progresivo (figura 2A).

Respuesta a GDC-0941 como monoterapia (grupos 2 y 3)

Los grupos 2 y 3 recibieron GDC-0941 como monoterapia a 60 y 120 mg/kg, respectivamente, por v.o. qd hasta el final. La mediana de los TTE para los grupos 2 y 3 fueron de 35,3 y 39,0 días, respectivamente, correspondiente a TGD de 2,6 días (8 %) y 6,3 días (19 %), con una diferencia de supervivencia significativa solo para el grupo de 120 mg/kg de GDC-0941 en comparación con los controles (grupo 1 frente a 2, P > 0,05; grupo 1 frente a 3, P < 0,01). No se registraron regresiones (tabla 5). El grupo 2 tuvo un superviviente de 45 días, mientras que el grupo 3 tuvo dos supervivientes de 45 días, y todos los demás tumores en estos grupos alcanzaron el volumen de criterio de valoración de 2000 mm3 (tabla 5). Los gráficos de crecimiento tumoral medio para los grupos 2 y 3 indicaron retrasos insignificantes relacionados con la dosis consecuentes con los TGD (figura 2A).

Respuesta a BVD-523 como monoterapia (grupos 4 y 5)

Los grupos 4 y 5 recibieron BVD-523 como monoterapia a 50 y 100 mg/kg, respectivamente, por v.o. bid hasta el final. La mediana de los TTE para los grupos 4 y 5 fue de 43,5 y 45,0 días, respectivamente, correspondiente a TGD de 10,8 días (33 %) para el grupo de 50 mg/kg de BVD-523 y el Tg D máximo (12,3 días, 38 %) para el grupo de 100 mg/kg de BVD-523 (tabla 5). Sin embargo, el grupo 5 tuvo cuatro muertes TR durante los días finales del estudio (días 42 45) y, por lo tanto, este régimen estaba por encima de la MTD y no se evaluó estadísticamente (figura 1 y tabla 5). El análisis de rangos logarítmicos detectó un beneficio de supervivencia significativo para el tratamiento de 50 mg/kg de BVD-523 (grupo 1 frente a 4, P < 0,001). No se registraron regresiones en ninguno de los grupos (tabla 5). El grupo 4 tuvo cinco supervivientes de 45 días, y todos los demás tumores en este grupo alcanzaron el volumen de criterio de valoración de 2000 mm3, mientras que los once ratones del grupo 5 que no murieron debido al tratamiento fueron supervivientes de 45 días (tabla 5). Los gráficos de crecimiento tumoral medio para los grupos de 50 y 100 mg/kg de BVD-523 ilustraron retrasos relacionados con la dosis (figura 2A).

Respuesta al tratamiento con BVD-523 combinado con GDC-0941 (grupos 6-9)

Los grupos 6 y 7 recibieron 50 mg/kg de BVD-523 con 60 o 120 mg/kg de GDC-0941, respectivamente, en los programas planificados (tabla 5). La mediana de los TTE para los grupos 6 y 7 fue cada una de 45,0 días, correspondiente al TGD máximo (12,3 días, 38 %), con un beneficio de supervivencia global significativo en comparación con los controles (grupo 1 frente a 6 o 7, P < 0,001). No se registraron respuestas de regresión en ninguno de los grupos (tabla 5). El grupo 6 tenía cinco tumores que alcanzaron el criterio de valoración de 2000 mm3 y diez supervivientes de 45 días, mientras que catorce ratones del grupo 7 fueron supervivientes de 45 días (tabla 5). Ambas combinaciones produjeron una supervivencia superior al tratamiento con GDC-0941 correspondiente (grupo 2 frente a 6 o 3 frente a 7, P < 0,001). La combinación del grupo 7 también fue superior al régimen de BVD-523 correspondiente (grupo 4 frente a 6, P > 0,05; grupo 4 frente a 7, P < 0,001). El crecimiento tumoral medio para el grupo 6 fue similar al de la monoterapia con 50 mg/kg de BVD-523 (grupo 4), mientras que el crecimiento tumoral medio para el grupo 7 mostró un mayor retraso en comparación con ambos grupos 3 y 4 (figura 2A).

Los grupos 8 y 9 recibieron 100 mg/kg de BVD-523 con 60 o 120 mg/kg de GDC-0941, respectivamente, en programas modificados debido a toxicidad (tabla 5). Como se indica en la tabla 5, el grupo 8 recibió un descanso de la dosificación de 2 días los días 31-32, mientras que la dosificación del grupo 9 se terminó el día 29 (tabla 5). La mediana del TTE para el grupo 8 fue de 45,0 días, correspondiente al TGD máximo (12,3 días, 38 %). Sin embargo, se registraron 5/15 muertes t R (cuatro los días 31-32 y una el día 44), y este régimen estaba por encima de la MTD y no se evaluó estadísticamente (figura 1 y tabla 5). Los otros diez ratones del grupo 8 fueron supervivientes de 45 días. El grupo 9 tuvo una muerte NTRu el día 26 y doce muertes TR de los días 28-30, y este régimen también estaba por encima de la MTD y no se evaluó estadísticamente (figura 1 y tabla 5). Los dos ratones restantes del grupo 9 fueron supervivientes de 45 días. Los gráficos de crecimiento tumoral medio para los grupos 8 y 9 fueron comparables con el gráfico para el grupo 5, la monoterapia de 100 mg/kg de BVD-523 (figura 2A).

Respuesta al tratamiento con paclitaxel (grupo 10)

El tratamiento con paclitaxel dio como resultado una mediana del TTE de 45,0 días, correspondiente al TGD máximo (12,3 días, 38 %), y un beneficio de supervivencia global significativo en comparación con los controles (grupo 1 frente a 10, P < 0,001). El grupo 10 tuvo 8/10 respuestas PR, que fueron las únicas regresiones registradas en el estudio (tabla 5). El gráfico de crecimiento tumoral medio para este grupo indicó una actividad notable (figura 2A).

Efectos secundarios

La tabla 5 proporciona un resumen de las pérdidas de BW medias máximas, muertes TR y NTR. La figura 3 presenta gráficos de los porcentajes de cambio de B^wmedio desde el día 1 para cada grupo.

Los grupos de 60 y 120 mg/kg de GDC-0941 (grupos 2 y 3) y el grupo de 50 mg/kg de BVD-523 (grupo 4) no tuvieron muertes TR o NTR, ni pérdidas de BW medio y ni signos clínicos adversos notables. Asimismo, las combinaciones de dos fármacos de estos regímenes (grupos 6 y 7) no tuvieron muertes TR o NTR, ni pérdidas de BW medio y ni signos clínicos adversos notables.

El grupo de 100 mg/kg de BVD-523 (grupo 5) no tuvo pérdida de BW medio, pero cuatro ratones del grupo 5 se encontraron muertos cerca del final del estudio los días 42, 43, 44 y 45, respectivamente. El grupo 5 no tenía signos clínicos adversos notificados hasta el día 43, cuando se observó que dos ratones estaban deshidratados y fríos al tacto (tabla 6). Las combinaciones de 100 mg/kg de BVD-523 con 60 o 120 mg/kg de GDC-0941 (grupos 8 y 9) dieron como resultado cinco y doce muertes TR, respectivamente (tabla 5). El grupo 8 tuvo dos muertes TR el día 31, y se inició un descanso de la dosificación. Se registraron dos muertes TR adicionales el día 32. La dosificación se reanudó el día 33, sin efectos adversos observados hasta el día 44, cuando se registró una muerte TR adicional (tabla 6). El grupo 8 tenía un BW medio nadir de -6,7 % el día 45 (tabla 5). El grupo 9 tuvo una muerte debida a etiología desconocida (NTRu) el día 26, seguido de una muerte TR el día 28 y dos muertes TR el día 29, cuando se terminó la dosificación. Se encontraron nueve animales del grupo 9 adicionalmente muertos el día 30, y estas muertes también se evaluaron como TR. Por lo tanto, las terapias mono y de combinación de 100 mg/kg de BVD-523 estaban por encima de la MTD.

El presente estudio también evaluó combinaciones de BVD-523 con GDC-0941 para determinar la eficacia en el modelo de xenoinjerto de carcinoma colorrectal humano HCT116. BVD-523 se administró por v.o. a 50 o 100 mg/kg en un programa bid y GDC-0941 se administró por v.o. a 60 o 120 mg/kg en un programa diario, solo y en combinación.

BVD-523 a 100 mg/kg por v.o. bid hasta el final, o bien solo o bien combinado con GDC-0941, estaba por encima de la MTD. La monoterapia de 100 mg/kg de BVD-523 se toleró de manera aceptable hasta el día 42, cuando se produjo la primera de las cuatro muertes TR. La combinación de 100 mg/kg de BVD-523/60 mg/kg de GDC-0941 tuvo la primera muerte el día 31, y un total de cinco muertes TR; mientras que la combinación de 100 mg/kg de BVD-523/120 mg/kg de GDC-0941 tuvo la primera muerte el día 26, y un total de doce muertes TR. Por lo tanto, la adición de GDC-0941 acortó el inicio de la toxicidad y aumentó el grado de toxicidad de una manera relacionada con la dosis. Todos los demás regímenes en el estudio se toleraron bien, y podrían evaluarse para determinar su eficacia.

La mediana del TTE para los controles fue de 32,7 días, estableciendo un TGD máximo posible de 12,3 días (38 %) para el estudio de 45 días. El tratamiento de control positivo de paclitaxel dio como resultado la TGD máxima y ocho PR, coherente con la actividad esperada en este modelo tumoral (datos internos de DRS-NC).

La monoterapia de 50 mg/kg de BVD-523 dio como resultado una TGD marginal de 10,8 días (33 %), pero una diferencia de supervivencia significativa frente a los controles (P< 0,001). Las monoterapias de 60 y 120 mg/k de GDC-0941 produjeron pequeños TGD relacionados con la dosis de 2,6 días (8 %) y 6,3 días (19 %), y significancia frente a los controles para la dosis de GDC-0941 más alta (P < 0,01). Sin embargo, GDC-0941 mostró un retraso insignificante en el gráfico de crecimiento tumoral (figura 2A).

Las combinaciones de 50 mg/kg de BVD-523/60 o 120 mg/kg de GDC-0941 produjeron cada una el TGD máximo, aunque fueron distintos en los números de supervivientes de 45 días (10/15 frente a 14/15). Ambos regímenes fueron estadísticamente superiores a la monoterapia con GDC-0941 correspondiente, y la combinación de 50 mg/kg de BVD-523/120 mg/kg de GDC-0941 también fue estadísticamente superior a la monoterapia de 50 mg/kg de BVD-523.

En resumen, BVD-523 a 50 mg/kg por v.o. bid hasta el final fue activo. GDC-0941 fue inactivo a 60 mg/kg por v.o. qd hasta el final, y activo de manera insignificante a 120 mg/kg. BVD-523 a 100 mg/kg por v.o. bid hasta el final, solo o combinado, estaba por encima de la dosis máxima tolerada (MTD). La combinación de 50 mg/kg de BVD-523/120 mg/kg de GDC-0941 fue estadísticamente superior a cualquiera de las monoterapias solas.

Ejemplo 3

BVD-523 alteró los marcadores de actividad de MAPK quinasa y función efectora

Para los estudios de inmunotransferencia de tipo Western, se sembraron células HCT116 (5 x 106) en placas de 10 cm en 5A de McCoy más FBS al 10 %. Se sembraron células A375 (2,5 x 106) en placas de 10 cm en DMEM más FBS al 10 %. Se permitió que las células se adhirieran durante la noche antes de la adición de la cantidad indicada de compuesto de prueba (BVD-523) o control de vehículo. Las células se trataron durante 4 o 24 horas antes del aislamiento de lisados de proteínas de células completas, como se especifica a continuación. Las células se recogieron mediante tripsinización, se granularon y se congelaron inmediatamente. Los lisados se prepararon con tampón RIPA (ensayo de radioinmunoprecipitación, Radio-immunoprecipitation Assay), se clarificaron por centrifugación y se cuantificaron por ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Se resolvieron 20-50 pg de proteína mediante electroforesis de SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se estudiaron con sonda usando los anticuerpos detallados en la tabla 9 (para el tratamiento de 4 horas) y la tabla 10 (para el tratamiento de 24 horas) a continuación.

Tabla 9 - Detalles de anticuerpos

Tabla 10 - Detalles de anticuerpos

La figura 4 muestra los análisis de inmunotransferencia tipo Western de células tratadas con BVD-523 a diversas concentraciones para lo siguiente: 1) componentes de señalización de MAPK en células A375 después de 4 horas; 2) señalización del ciclo celular y la apoptosis en A375, 24 horas de tratamiento con diversas cantidades de BVD-523; y 3) señalización de MAPK en células HCT-116 tratadas durante 4 horas. Los resultados muestran que el tratamiento agudo y prolongado con BVD-523 en células cancerosas mutantes para RAF y RAS in vitro afecta tanto a la fosforilación del sustrato como a las dianas efectoras de las quinasas ERK. Las concentraciones de BVD-523 requeridas para inducir estos cambios están normalmente en el intervalo micromolar bajo.

Los cambios en varios marcadores de actividad específicos son notables. En primer lugar, la abundancia de isoformas de migración lenta de la quinasa ERK aumenta después del tratamiento con BVD-523; pueden observarse cambios modestos de manera aguda, y aumentan después de un tratamiento prolongado. Si bien esto podría indicar un aumento en formas enzimáticamente activa, fosforiladas de ERK, sigue siendo notable que múltiples proteínas sujetas a regulación tanto directa como indirecta por ERK permanecen “apagadas” después del tratamiento con BVD-523. En primer lugar, las proteínas RSK1/2 presentan fosforilación reducida en residuos que dependen estrictamente de ERK para la modificación de proteínas (T359/S363). En segundo lugar, el tratamiento con BVD-523 induce cambios complejos en la fosfatasa de retroalimentación de MAPK, DUSP6: las isoformas de proteínas de migración lenta se reducen después del tratamiento agudo, mientras que los niveles de proteína total se reducen enormemente después del tratamiento prolongado con BVD-523. Ambos de estos hallazgos son consecuentes con la actividad reducida de las quinasas ERK, que controlan la función de DUSP6 a través de mecanismos tanto postraduccionales como transcripcionales. Globalmente, a pesar de los aumentos en las formas celulares de ERK que normalmente se cree que son activas, parece probable que la actividad enzimática de ERK celular se inhibe completamente después de un tratamiento agudo o prolongado con BVD-523.

Consecuente con estas observaciones, los genes efectores que requieren señalización de la ruta de MAPK están alterados después del tratamiento con BVD-523. El aparato de ciclo celular G1/S está regulado tanto a nivel postraduccional como transcripcional por la señalización de MAPK, y los niveles de proteína ciclina-D1 se reducen enormemente después del tratamiento prolongado con BVD-523. De manera similar, la expresión génica y la abundancia de proteínas de los efectores de la apoptosis a menudo requieren señalización de MAPK intacta, y los niveles totales de Bim-EL aumentan después del tratamiento prolongado con BVD-523. Como se indicó anteriormente, sin embargo, no se observaron escisión de la proteína PARP y aumento de la apoptosis en el antecedente celular A375; esto sugiere que factores adicionales pueden influir en si los cambios en la señalización efectora dependiente de BVD-523/ERK se traducen en eventos definitivos tales como muerte celular y detención del ciclo celular.

Consecuente con la actividad celular de BVD-523, el análisis de marcadores sugiere que la inhibición de ERK altera una variedad de eventos de señalización molecular en células cancerosas, haciéndolas susceptibles tanto a la disminución de la proliferación celular como de la supervivencia.

En resumen, la figura 4 muestra que BVD-523 inhibe la ruta de señalización de MAPK y puede ser más favorable en comparación con la inhibición de RAF o MEK en este entorno.

Finalmente, las propiedades de BVD-523 pueden hacer que este sea un agente preferido para su uso como inhibidor de ERK, en comparación con otros agentes con una actividad similar. Se sabe que los fármacos inhibidores de quinasas muestran interacciones únicas y específicas con sus dianas enzimáticas, y que la eficacia del fármaco está fuertemente influenciada tanto por el modo de inhibición directa, así como la susceptibilidad a los cambios adaptativos que se producen después del tratamiento. Por ejemplo, los inhibidores de las quinasas ABL, KIT, EGFR y ALK son efectivos solo cuando su diana relacionada se encuentra en configuraciones activas o inactivas. Asimismo, algunos de estos inhibidores son excepcionalmente sensibles a cualquier mutación genética secundaria, o cambios adaptativos postraduccionales, de la proteína diana. Finalmente, los inhibidores de RAF muestran potencia diferencial a las quinasas RAF presentes en ciertos complejos proteicos y/o localizaciones subcelulares. En resumen, puesto que se sabe de manera similar que las quinasas ^eR^kexisten en estadios bioquímicos diversos, variables y complejos, parece probable que BVD-523 pueda interaccionar e inhibir estas dianas de una manera que sea distinta y altamente preferible a otros agentes.

Ejemplo 4

Estudios de cultivo celular de inhibidores de PI3K-MTOR y ERK

Ensayo de proliferación de agente individual

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a las densidades y condiciones del medio indicadas en la tabla 11 en 5A de McCoy que contenía o bien FBS al 10 % o bien FBS despojado de carbón al 1 % (CS-FBS), y se permitió que se adhirieran durante la noche antes de la adición del compuesto o el control de vehículo. Los compuestos se prepararon a partir de soluciones madre en DMSO para dar las concentraciones finales deseadas. La concentración final de DMSO fue constante al 0,1 %. Los compuestos de prueba se incubaron con las células durante 72 h a 37 °C, el 5 % de CO²en una atmósfera humidificada. Se añadió reactivo CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Se dedujo el valor promedio del fondo solo con medio y los datos se analizaron usando una ecuación logística de 4 parámetros en GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Ensayo de proliferación de combinación

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado a las densidades indicadas en la tabla 11 en medios 5A de McCoy que contenían FBS al 2,5 % y se permitió que se adhirieran durante la noche antes de la adición del compuesto de prueba o el control de vehículo. Las combinaciones se sometieron a prueba usando una matriz de dosis de 10x8 o, para el estudio de seguimiento de HCT116, una matriz de dosis de 3x1.

Los compuestos de prueba se incubaron con las células durante 72 h a 37 °C, el 5 % de CO²en una atmósfera humidificada. Se añadió reactivo CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Se dedujo valor promedio del fondo solo con medio y se analizaron los datos.

Para los ensayos de combinación 10x8, se determinaron las interacciones de combinación a través de la matriz de dosis mediante los modelos de aditividad de Loewe e independencia de Bliss usando el software Chalice™ Combination Analysis (Horizon Discovery Group, Cambridge, ^mA) como se describe resumidamente en el manual de usuario (disponible en chalice.horizontaldiscovery.com/chalice-portal/documentation/analyzer/home.jsp). La sinergia se determina comparando el nivel de inhibición observado experimentalmente en cada punto de combinación con el valor esperado para la aditividad, que se deriva de las respuestas de agente individual a lo largo de los bordes de la matriz. Se identificaron posibles interacciones sinérgicas mostrando el exceso de inhibición calculado con respecto al predicho como aditivo a través de la matriz de dosis como un mapa de calor, y notificando una 'puntuación de sinergia' cuantitativa basada en el modelo de Loewe. Los datos de agente individual derivados de las placas de ensayo de combinación se presentaron como curvas de dosis-respuesta generadas en GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) (representadas gráficamente usando el porcentaje de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO).

El experimento de seguimiento del ensayo de combinación 3x1 se analizó usando el modelo de aditividad de Bliss en Microsoft Excel de la siguiente manera: en primer lugar, se calcularon los valores de inhibición fraccionaria predichos para la inhibición combinada usando la ecuación Cbliss = A B -(A x B) donde A y B son las inhibiciones fraccionarias obtenidas por el fármaco A solo o el fármaco B solo a concentraciones específicas. (Cbliss es la inhibición fraccionaria que se esperaría si la combinación de los dos fármacos fuera exactamente aditiva). Los valores de Cbliss se restaron entonces de los valores de inhibición fraccionarios observados experimentalmente para dar un valor de “exceso sobre Bliss” que se representaron gráficamente como mapas de calor DE. Los valores de exceso sobre Bliss mayores de 0 indican sinergia, mientras que los valores menores de 0 indican antagonismo.

Tabla 11 - Densidad de siembra de la línea celular y medios de crecimiento

El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos sobre la viabilidad celular de la combinación de inhibidores de ERK con un panel de inhibidores de PI3K-MTOR (tabla 12) en pares de líneas celulares HCT116 y DLD1 que son isogénicas para la presencia o ausencia de mutaciones activadoras de PIK3CA. (Tabla 13).

Tabla 12 - Descripción de inhibidores de PI3K-MTOR estudiados

Tabla 13 - Descripción de líneas celulares estudiadas

Se realizaron ensayos iniciales de agente individual en las células isogénicas HCT116 para seleccionar los intervalos de concentración apropiados para su uso en los ensayos de combinación (figura 6, tabla 14). Como los altos niveles de suero pueden enmascarar potencialmente las interacciones entre agentes seleccionados como diana y genotipos mutantes específicos, debido a un exceso de factores de crecimiento, estos ensayos se realizaron tanto en condiciones convencionales (FBS al 10 %) como reducidas en suero (FBS despojado de carbón al 1 %).

Tabla 14 - Valores de CI50 de agente individual (pM) para cada compuesto en el par de líneas celulares isogénicas

HCT116 PIK3CA (+/-)

Sin embargo, hubo diferencias evidentes en los valores calculados de CI⁵⁰entre las dos condiciones de suero, una interpretación fiable de estas diferencias se confundió por los bajos niveles de crecimiento celular y la salud celular comprometida (observaciones microscópicas) en las condiciones reducidas en suero. Como intermedio a estas condiciones, todos los ensayos de combinación se realizaron, por lo tanto, en medio que contenía suero al 2,5 %.

Las interacciones de combinación entre dos compuestos se evaluaron a través de una matriz de concentraciones usando los modelos de aditividad de Loewe e independencia de Bliss con el software Chalice™ Bioinformatics (Horizon Discovery Group, Cambridge, MA). Chalice™ permite identificar posibles interacciones sinérgicas mostrando el exceso de inhibición calculado sobre el predicho como aditivo a través de la matriz de dosis como un mapa de calor, y notificando una “puntuación de sinergia” cuantitativa basada en el modelo de Loewe.

BVD-523 mostró fuertes interacciones sinérgicas con BYL719, BKM120 y PF04691502, y modestamente sinérgicas con BKM120, en la línea celular HCT116 parental, que lleva la mutación de PIK3CA. También se observaron potenciales sinergias en la línea celular isogénica HCT116 que carece de la mutación de PIK3CA, sin embargo, la fuerza y/o ventanas de sinergia tendían a ser más pequeñas en relación con la línea parental.

Se observó un patrón similar de resultados con un segundo inhibidor de ERK de referencia, SCH772984, en este par isogénico de HCT116, lo que respalda la noción de que estas sinergias están específicamente relacionadas con la inhibición de ERK y no se deben a un efecto fuera de diana. (Figura 7 - figura 15)

Estos resultados se confirmaron en la línea isogénica HCT116 en un experimento repetido usando un intervalo más estrecho de concentraciones de inhibidor. (Figura 16). BVD-523 y SCH772984 también mostraron un patrón similar de interacciones potencialmente sinérgicas en las células isogénicas para DLD-1. (Figura 17 - figura 25). Sin embargo, en contraste con las células HCT116, las sinergias fueron más débiles y hubo poca diferencia en la magnitud de la sinergia entre la línea celular que carece de la mutación de PIK3CA en relación con la línea parental. (Figura 26)

En resumen, estos resultados sugieren interacciones sinérgicas entre BVD-523 e inhibidores de la ruta de PI3K-MTOR en líneas celulares cancerosas que son o bien de tipo silvestre o bien mutadas para PIK3CA.

Se derivaron curvas de dosis-respuesta de agente individual en suero al 2,5 % de las placas de ensayo de combinación. Los valores de CI⁵⁰son una media derivada de n = 4 combinaciones separadas. Una comparación de las respuestas a la dosis de agente individual derivadas de los datos del ensayo de combinación en la línea isogénica HCT116 mostró que la línea celular que carecía de la mutación de PIK3CA era más sensible a BVD-523 en relación con la línea parental que contenía la mutación. Se observó un resultado similar con SCH772984. Esto puede indicar que el estado de mutación de PIK3CA es un biomarcador potencial para predecir la respuesta al tratamiento con un B^vD-523 de agente individual. (Tabla 15)

Tabla 15 - Sensibilidad diferencial a la inhibición de ERK en la línea isogénica HCT116

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un primer agente anticancerígeno (i), que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y segundo agente anticancerígeno (ii), que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto.

2. Un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que comprende una cantidad eficaz del primer y segundo agente anticancerígeno según la reivindicación 1, empaquetado junto con instrucciones para su uso.

3. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según la reivindicación 1, en los que

(i) se ha identificado que el sujeto tiene una mutación somática de KRAS y una mutación somática de PIK3CA; o

(ii) se ha identificado que el sujeto tiene un cáncer que es refractario a una terapia seleccionada del grupo que consiste en terapia con inhibidor de rA f , terapia con inhibidor de MEK y terapia con inhibidores de RAF y MEK.

4. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, comprendiendo la composición farmacéutica un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz del primer y segundo agente anticancerígeno según la reivindicación 1, en la que la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

5. Un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, el kit para el uso según la reivindicación 2, la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 4, o el método in vitro según la reivindicación 5, en donde

(i) el sujeto es un mamífero, o en donde la célula cancerosa se ha obtenido de un sujeto, que es un mamífero; y en donde el mamífero puede seleccionarse del grupo que consiste en seres humanos, primates, animales de granja y animales domésticos; y/o

(ii) el sujeto con cáncer, o el sujeto del que se ha obtenido la célula cancerosa

(ii-1) tiene una mutación somática de KRAS o es refractario al tratamiento con inhibidor de la ruta de MAPK; y/o

(ii-2) tiene una mutación somática de KRAS y una mutación somática de PIK3CA.

7. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 6, el kit para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 6, la composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6, o el método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en donde el inhibidor de la ruta de PI3K/Akt se selecciona del grupo que consiste en pictilisib (GDC-0941) (Roche Holdings Inc.), A-674563 (n.° CAS 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, ^cA), AS-041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-tiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluoro-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetileno)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), AT7867 (n.° CAS 857531-00-1), serie de bencimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.° CAS 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.° CAS 612847-09-3, n.° CAS 681281-88-9, n.° CAS 75747-14-7, n.° CAS 925681-41-0, n.° CAS 98510-80-6, CCT128930 (n.° CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.° CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, Reino Unido), FPA 124 (n.° CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (n.° CAS 937174-76-0), H-89 (n.° CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, Reino Unido), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (n.° CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.° CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.° CAS 105637-50-1), clorhidrato de naltrindol, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.° CAS 1191951-57-1), inhibidor de PI3 quinasa delta, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ), inhibidores de PI3 quinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa delta, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 quinasa delta-2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 quinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K delta/gamma, lntellikine-1 (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3K delta/gamma, lntellikine-1 (Intellikine Inc.), PIK-90 (n.° CAS 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidrocurcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 6 y 7, el kit para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 6 y 7, la composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 6 y 7, o el método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de colon, un cáncer del intestino grueso, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cánceres de endometrio, cáncer de estómago, cáncer de pulmón y leucemia.

El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 6-8, el kit para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 6-8, la composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6-8, o el método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8,

en donde al menos un agente terapéutico adicional va a administrarse al sujeto o a la célula cancerosa, o en donde el kit comprende al menos un agente terapéutico adicional;

en donde el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo, un agente citotóxico, un fármaco, una toxina, un radionúclido, un inmunomodulador, un agente terapéutico fotoactivo, un agente radiosensibilizante, una hormona, un agente antiangiogénico y combinaciones de los mismos;

en donde el agente terapéutico adicional puede ser un inhibidor de la ruta de mTOR, tal como un inhibidor de la ruta de mTOR que se selecciona del grupo que consiste en zotarolimus (AbbVie), umirolimus (Biosensors), temsirolimus (Pfizer), sirolimus (Pfizer), sirolimus NanoCrystal (Elan Pharmaceutical Technologies), sirolimus TransDerm (TransDerm), sirolimus-PNP (Samyang), everolimus (Novartis), biolimus A9 (Biosensors), ridaforolimus (Ariad), rapamicina, TCD-10023 (Terumo), DE-109 (MacuSight), MS-R001 (MacuSight), MS-R002 (MacuSight), MS-R003 (MacuSight), Perceiva (MacuSight), XL-765 (Exelixis), quinacrina (Cleveland BioLabs), PKI-587 (Pfizer), PF-04691502 (Pfizer), GDC-0980 (Genentech y Piramed), dactolisib (Novartis), CC-223 (Celgene), PWT-33597 (Pathway Therapeutics), P-7170 (Piramal Life Sciences), LY-3023414 (Eli Lilly), INK-128 (Takeda), GDC-0084 (Genentech), DS-7423 (Daiichi Sankyo), DS-3078 (Daiichi Sankyo), CC-115 (Celgene), CBLC-137 (Cleveland BioLabs), AZD-2014 (AstraZeneca), X-480 (Xcovery), X-414 (Xcovery), EC-0371 (Endocyte), VS-5584 (Verastem), PQR-401 (Piqur), PQR-316 (Piqur), PQR-311 (Piqur), PQR-309 (Piqur), PF-06465603 (Pfizer), NV-128 (Novogen), nPT-MTOR (Biotica Technology), BC-210 (Biotica Technology), WAY-600 (Biotica Technology), WYE-354 (Biotica Technology), WYE-687 (Biotica Technology), LOR-220 (Lorus Therapeutics), HMPL-518 (Hutchison China MediTech), GNE-317 (Genentech), EC-0565 (Endocyte), CC-214 (Celgene), ABTL-0812 (Ability Pharmaceuticals), y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 6-9, el kit para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 6-9, o el método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde el segundo agente anticancerígeno es pictilisib (GDC-0941) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo; o en donde poner en contacto la célula cancerosa con los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con poner en contacto la célula cancerosa con cualquier agente anticancerígeno solo.

El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 6-10, en donde el segundo agente anticancerígeno es pictilisib (GDC-0941) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y/o pictilisib (GDC-0941) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo van a administrarse en forma de una composición farmacéutica, que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según la reivindicación 3, en donde identificar a un sujeto con cáncer que tiene mutaciones somáticas de KRAS y PIK3CA comprende cribar una muestra biológica obtenida del sujeto para determinar si el sujeto tiene una mutación somática de KRAS y PIK3CA; en donde el cribado puede comprender la detección de al menos una de las mutaciones de KRAS y PIK3CA usando

(i) un método seleccionado del grupo que consiste en PCR, secuenciación, captura de híbridos, captura en disolución, sondas de inversión molecular, y combinaciones de los mismos; o

(ii) un método seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH), secuenciación de Sanger, secuenciación profunda y combinaciones de los mismos.

13. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según la reivindicación 3, en donde identificar a un sujeto con cáncer que es refractario a una terapia seleccionada del grupo que consiste en terapia con inhibidor de RAF, terapia con inhibidor de MEK y terapia con inhibidores de RAF y MEK comprende el cribado de una muestra biológica obtenida del sujeto para determinar si el sujeto tiene una mutación somática de BRAF;

en donde el cribado puede comprender la detección de una mutación de BRAF usando

(i) un método seleccionado del grupo que consiste en PCR, secuenciación, captura de híbridos, captura en disolución, sondas de inversión molecular, y combinaciones de los mismos; o

(ii) un método seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH), secuenciación de Sanger, secuenciación profunda y combinaciones de los mismos.

14. La composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6-9, en donde

(i) la composición farmacéutica está en una forma de dosificación unitaria que comprende ambos agentes anticancerígenos; o

(ii) el primer agente anticancerígeno está en una primera forma de dosificación unitaria y el segundo agente anticancerígeno está en una segunda forma de dosificación unitaria, separado del primero.

15. La composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 6-9, en la que

(i) los agentes anticancerígenos primero y segundo van a coadministrarse al sujeto; o

(ii) en la que los agentes anticancerígenos primero y segundo van a administrarse al sujeto en serie; en la que el primer agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del segundo agente anticancerígeno; o en la que el segundo agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del primer agente anticancerígeno.

16. Una composición que comprende BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto.

17. Una composición que comprende un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto.

18. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, en la que el inhibidor de la ruta de PI3K/Akt se selecciona del grupo que consiste en pictilisib (GDC-0941) (Roche Holdings Inc.), A-674563 (n.° CAS 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, CA), AS-041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-tiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluoro-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetileno)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), AT7867 (n.° CAS 857531 00-1), serie de bencimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.° CAS 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), Ca L-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.° CAS 612847-09-3, n.° CAS 681281 88-9, n.° CAS 75747-14-7, n.° CAS 925681-41-0, n.° CAS 98510-80-6, CCT128930 (n.° CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.° CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, Reino Unido), FPA 124 (n.° CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (n.° CAS 937174-76-0), H-89 (n.° CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, Reino Unido), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (n.° CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.° CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.° CAS 105637-50-1), clorhidrato de naltrindol, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.° CAS 1191951-57-1), inhibidor de PI3 quinasa delta, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, Nj ), inhibidores de PI3 quinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa delta, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 quinasa delta-2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 quinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (Cellzome Ag ), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K delta/gamma, lntellikine-1 (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3K delta/gamma, lntellikine-1 (Intellikine Inc.), PIK-90 (n.° CAS 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidrocurcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.